Peg化的重组人生长激素化合物的制作方法
专利名称：Peg化的重组人生长激素化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含临床 有效量的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药，其比可获得的人生长激素产品可以更少 频率地施用，并且可能不引起注射副作用脂肪萎缩。本发明还涉及此类前药。
背景技术：
生长激素(GH)是在人和其它动物中刺激生长和细胞繁殖的激素。其是191个 氨基酸、单链多肽激素，其是前叶垂体侧翼中促生长素细胞合成、贮存并且分泌的。当 涉及重组DNA技术生产的生长激素时，该激素也称为促生长素并且缩写为“rhGh”。生长激素在体内具有多种功能，最显著的功能是增加儿童期的身高，并且数种 疾病可以通过GH的治疗应用来治疗。生长激素缺乏的作用取决于他们发生的年龄而不同。在儿童期，生长不足和身 材矮小症是GH缺乏的主要现象。其还可能引起性不成熟。在成年期，缺乏的作用更加 明显，并且可能包括力量、精力和骨量的不足，以及心血管风险的增加。GH缺乏存在很多原因，包括特定基因的突变、涉及下丘脑和/或垂体的先天畸 形，以及损伤、手术或疾病引起的垂体损害。缺乏是通过补充外源GH来治疗的。在目前应用中的所有GH是生物合成的人 GH,通过重组DNA技术制备。在儿童期发作(在完成生长期后)或成人发作(通常是 后天垂体肿瘤的结果)的GH缺乏的儿童和成年人中，GH用作替代治疗。在这些患者 中，优势包括减少脂肪量、增加瘦肉量、增加骨密度、改善脂质分布、减少心血管风险 因素和改善心理社会健康。Genentech Inc (US)第一个克隆了 rhGH，并且其描述于专利 EP-B22242 中。2006年，在美国和欧洲(以及它们的生产商)可获得的合成的生长激素包括 Nutropin (Genentech)、 Humatrope (Eli Lilly)、 Genotropin (Pfizer)、 Norditropin (Novo Nordisk)、Saizen (Merck Serono)禾口 Omnitrope (Sandoz)。尽管分子生物学技术已经显著地增加了很多蛋白质和/或多肽(下文称为蛋白 质)的利用度，但是所述蛋白质的治疗用途时常受到其它因素的阻碍，例如由于肾和受 体介导的清除引起的短的血浆半衰期、聚集、蛋白质降解、较差的生物利用度和物理性 质(预先排除有效的制剂)。增加蛋白质利用度的原理是通过将蛋白质与衍生化的化合物的缀合，所述的衍 生的化合物包括但不限于聚乙二醇和聚丙二醇。公认的某些优点包括降低免疫原性 和抗原性，增加作用持续时间和改变药物动力学性质。[Veronese，F.M. "Enzymes for Human Therapy Surface StructureModifications (用于人类治疗的酶表面结构修饰)”， Chimica Oggi, 7 53-56 (1989)](本文参考文献 5)。对于医学用途，通过PEG化的rhGH可能通过增加其体内半衰期(从而实现剂量 减少或给药频率降低)、改善其稳定性和降低其抗原性或它们的组合来改善分子特性。
通常，对分子进行该类型的修饰是本领域众所周知的并且专利文献中可获得很 多专利，这些专利描述了这种概念。例如EP-B 1196443中描述了 Hoftnann La Roche的 PEG化的促红细胞生成素(EPO)，其要求包含与EPO共价键合的PEG的特别的连接体， 在Nektar/La Roche公司的EP-B975369中描述了 PEG化的干扰素α，并且在Hoftnann La Roche公司的EP-B 1562634中描述了另一种PEG化的干扰素α。rhGH的体内清除被认为是通过下面两种机理发生的。第一种是肾清除，其中 rhGH是从循环中通过肾小球过滤清除的。rhGH的肾清除已被很好地证明，并且因此 合成的rhGH的PEG化是解决该问题的一个明显的选择。肾清除占rhGH总清除的约 25-53% (Girard，J.Mehls，O.J.Clin.Invest.1994 年 3 月；93(3) 1163-1171，本文参考文 献3) ο第二种机理是肝清除(肝脏)。GH的肝摄取是通过溶酶体降解后的受体介导的 胞吞作用而发生的。第三种机理是在其它组织(例如软骨的软骨细胞)中的受体介导的清除。通过 PEG化降低GH对GH受体的结合亲和力，从而减少受体介导的清除。但是，对于施用rhGH存在特有的问题。皮下施用rhGH的一个主要缺点是在接 受治疗的患者中发生脂肪萎缩。脂肪萎缩是用于脂肪组织局部丢失的医学术语。皮下施用rhGH制剂已经出现脂 肪萎缩问题，其被认为是由注射部位局部高浓度的生长激素复合物引起的。Bayakgebiz A.等人在 J.Pediatr.Endocrinol.Metab，1999 年 1-2 月；12(1) 95-7 中描述了此类医学记录(本文参考文献1)。这是一个由于6.7kb基因缺失引起单独GH 缺乏的患者的记录，该患者接受高剂量rhGH治疗并且在治疗6年后在注射部位发生了局 部脂肪萎缩，而没有任何抗体检测。人们怀疑脂肪萎缩的病因学是高剂量rhGH的直接脂 解作用。与施用rhGh相关的脂肪萎缩被认为是由于rhGH活性本身、更高浓度和延长的 暴露引起的。这些更高浓度发生在注射部位附近。在rhGH被PEG化的情况中，由于增加停留时间，高生长激素活性在注射部位附 近聚集的机会甚至更高。在PEG化的rhGH制剂的情况中，组织将经历持续并且增加暴 露于生长激素活性，这是由于这样一个事实PEG化的缀合物具有药理学活性所需的活 性，并且缀合物由于缀合物的大小而扩散有限。结果是增加了注射部位的脂解作用。WO-A 2005/079838描述了 PEG化的hGH，其中hGH部分通过氨基官能团连 接至聚乙二醇聚合物上，由于氨基的稳定性，其可以认为是永久的结合。此类PEG化的 hGH化合物的实例(其出现脂肪萎缩)是化合物PHA-794428。化合物PHA-794428是 PEG化的rhGH，并且还在Pharmacia公司(被Pfizer获得)的W0_A 2005/079838中描 述，并且进一步在 Horm.Res.2006 ； 65 (增刊 4): 1-213，CF1-98GH/IGF Treatment with title "Firstin-human study of PEGylated recombinant human growth hormone”(题为"PEG 化的重组人生长激素的首次在人类中的研究”的CF1-98GH/IGF治疗)，Philip Harris等 人(本文参考文献4)中描述。根据www.clinicaltrials.gov上公开的临床试验信息，该试验于2007年12月10日
结束。Pfizer决定终止该计划是由于在2期临床研究中在单独注射PHA 794428后报道注射部位脂肪萎缩的病例。WO-A 2006/102659 (Nektar)也描述并且提出了通过酰胺键形成的rhGH_PEG缀 合物(线性和分支类型)。在WO-A 2006/102659中所解决的问题描述于第2页第
段。根据该申请人，所解决的问题是减少给药频率。因为rhGH治疗典型地需要每天注 射，患者特别是儿科患者不喜欢这种不便和与该治疗有关的不适。Nektar的WO-A中描 述的方案是提供新的PEG-rhGH缀合物。在W0-A
的表6中，可以看出与没有PEG的天然生长激素相比， PEG-rhGH缀合物具有相对低的体外活性。尽管低的体外活性，PEG化的rhGH缀合物 在体内被活化。与阅读部分
相关“尽管初步的体外结果表明增加与hGH连接 的PEG的量降低其刺激hGH受体的能力，基于初步的体内结果，其表明生物活性的降低 超出增加半衰期和/或血浆利用度的平衡，因此得到一个结论当在相同的给药方案中 与未修饰的rhGH相比，本文提供的缀合物具有优良的药效学作用”。WO-A 2006/102659 (Nektar)没有描述可自动裂解的连接体_即简单观察到 PEG-rhGH缀合物在体内被活化，尽管它们的体外活性显著降低。脂肪萎缩的问题没有 解决。为了实现将所需的性质(降低脂肪萎缩和减少注射频率)设计到hGH的PEG化 的缀合物中，一种解决方法是应用前药方法。前药是在表现其药理学作用前经受生物转 化的任何化合物。因此，前药可以被视为是包含特别的无毒保护基的药物，这些保护基 是以暂时(transient)的方式用于改变或消除母体分子中不希望的性质。在这种情况下， 聚合物载体将暂时降低生长激素的活性，从而减少组织脂解作用的可能性。同时暂时缀 合至聚合物载体上将延长缀合物的半衰期，从而提供长效递送的hGH。文献中描述了很多大分子前药，其中大分子载体是通过不稳定的酯基连接至药 物上的(例如 Y.Luo，MR Ziebell，GD Prestwich，"A HyaluronicAcid-Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells (靶向癌细胞的透明质酸-紫杉醇抗肿瘤生物缀合 物)”，Biomacromolecules 2000，1，208-218 ； J Cheng 等人，Synthesis of Linear， beta-Cyclodextrin BasedPolymers and Their Camptothecin Conjugates (基于线性 β -环糊精 的聚合物和它们的喜树碱缀合物的合成)，Bioconjugate Chem.2003, 14，1007-1017 ； R.Bhatt 等人，Synthesis and in Vivo Antitumor Activity ofPoly (L-glutamic acid) Conjugates of 20 (S)-Campththecin(20 (S)-喜树碱的聚(L_谷氨酸)缀合物的合成与体内抗肿瘤活性)， J.Med.Chem.2003, 46，190-193 ； R.B.Greenwald, A.Pendri, C.D.Conover, H.Zhao, Y.H.Choe, A.Martinez, K.Shum, S.Guan, J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667 ； B.Testa, J.M Mayer, Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism (药物和前药代谢中的水 解)，Wiley-VCH, 2003，第8章)。在这些情况中，生物活性实体的缀合的官能团是羟 基或羧酸。特别是对于生物大分子但也对于小分子聚合物前药，希望将大分子载体连接至 生物活性实体的氨基(即N-末端或蛋白质的赖氨酸氨基)上。这将是一种情况，如果掩 蔽药物生物活性需要缀合生物活性实体的某个氨基，例如位于受体结合中涉及的活性中 心或区域或表位的氨基。同时，在制备前药的过程中，氨基可能是更具有化学选择性并 且用作缀合载体和药物的更好的柄，因为它们比羟基或酚基具有更大的亲核性。对于可能包含大量不同反应官能度的蛋白质而言，这特别正确。在这种情况中，无选择性的缀 合反应引起不希望的产物混合物，其需要广泛的表征或纯化并且可能降低反应产率和产 品的治疗功效。前药活化可以通过酶或非酶裂解载体和药物分子间的不稳定桥来实现，或两者 的连续组合，即酶解步骤之后进行非酶重排。在WO-A 2005/099768中描述了含有自动裂解的连接体的PEG化的连接体分 子，用于大量的生物分子，包括促生长素(权利要求6)。在W0-A2005/099768中，所解 决的问题是患者间的变异性，以及当涉及酶解机理时，前药活化的不可预知的作用(第 12页，第17-30行)。该申请描述了作为一种解决方法的芳族连接体，其可以基于PEG。 该连接体-PEG以显著降低药物活性的方式与药物结合。只有在释放药物时它才被活化， 其是通过水解开始的。水解速率可以以化学方法来控制。对于GH和相关问题、例如脂 肪萎缩没有具体强调。综上所述，以上提及的引文均没有描述基于前药缀合物来开发长效rhGH的方 法，所述的缀合物可以更少频率地施用而不增加脂肪萎缩的频率。因此，本发明的目的是提供前药或包含所述前药的药物组合物，应用与rhGH缀 合的PEG减少施用频率而不显著诱导脂肪萎缩。发明_既述因此，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还 包含人体内临床有效量的重组人生长激素rhGH PEG化的前药缀合物，其中PEG通过自 身可水解的(自动裂解的)暂时连接体与rhGH连接；所述的前药缀合物的特征在于(1)缀合物的GH活性小于不含PEG的天然生长激素的5% ；和(2)连接体自动水解速率是体内半衰期为10小时至600小时的速率。性质(1)确保前药具有低的脂肪萎缩发病率，尽管具有显著延长的体内作用时 间。不受理论限制，本发明人认为如果前药具有更高的GH活性，该产品将仍会以比目 前市售的rhGH产品更高的频率诱导脂肪萎缩。性质⑵确保rhGH(不含PEG)随时间逐渐释放，从而可以施用比人生长激素更 少频率的rhGH药物产品，例如仅每周一次或每月一次代替每天施用，而与rhGH相比仍 能保持全部功效。优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多 5倍，例如2、3、4或5倍。更优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合 物的体外半衰期短至多3倍。最优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合 物的体外半衰期短至多2倍或几乎相同。本发明应用于rhGH PEG化的前药，特别是rhGH PEG化的载体前药，包括级联
载体前药。前药可以定义为本身没有活性但是可预计转化为活性代谢物的治疗药物(参见 B.Testa, J.M Mayer Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism (药物和前药代谢中的水 解)，Wiley-VCH, 2003，第4页)。在载体前药系统中，当聚合物共价缀合至药物分子 时，很多药物是没有活性的或表现出降低的生物活性。在这些情况中，应用药物和载体 间暂时的连接，在这种方式中，药物在体内从聚合物载体上释放以恢复其生物活性。如果需要缓慢或可控释放药物，与释放的药物相比，降低生物活性的前药具有优势。在该 情况中，可以施用相对大量的前药而没有伴随的副作用和过量给药的风险。药物释放是 随时间发生的，从而减少重复且频繁施用药物的需要。在聚合物载体的前药中，生物活性部分通常是通过载体部分和药物分子的官能 团之间形成的不稳定的桥连接到聚合物载体部分的。载体前药的裂解产生增加生物活 性的分子实体(药物)和至少一种副产物，载体。该副产物可以是生物惰性的(例如 PEG)。裂解后，生物活性实体将露出至少一个之前缀合而掩蔽或保护的官能团，并且该 基团的存在典型地有助于生物活性。GH活性可以应用本领域已知的方法来测量。在这个方面，强调实施例1。基于 这样一个事实可用于本发明的某些暂时连接体可以具有小于3000小时的体外半衰期， 各自GH活性测量是通过测量包含替代暂时连接体的永久连接体的各自PEG缀合物的GH 活性来间接进行的。其可以如WO 2006102659第74页第0240段描述的那样进行，本 文描述的rhGH和缀合物的生物活性将应用NB2-II大鼠淋巴瘤细胞增殖分析进行体外评 价。简而言之，将衍生自大鼠淋巴瘤的NB2-II细胞与rhGH温育，其引起rhGH分子与 细胞表面的受体结合。受体结合诱导信号转导级联，从而引起细胞增殖。分析结果是基 于测定的蛋白质浓度和未修饰的rhGH的100%生物活性。优选的是，对于测量GH活性，应用实施例24中描述的方案。体外半衰期可以应用本领域已知的方法来测量。在这个方面，强调实施例2。因此，本发明的第二方面涉及临床有效量的包含第一方面的rhGHPEG化的前药 的药物组合物，其用于治疗人GH相关疾病的方法中。第二方面可以选择性地描述为治疗人GH相关疾病的方法，该方法包括给人施用 临床有效量的包含第一方面的rhGH PEG化的前药的药物组合物。在一种情况中，其中与天然的人GH相比，前药的剩余活性(对于暂时PEG缀 合的rhGH的情况)被显著降低，脂解作用可能不会发生，甚至在延长暴露时。本文描述称为rhGH PEG化的前药的化合物是缀合物，其与人GH相比具有显著 降低的剩余活性。为了显示治疗有用的活性，rhGH必须从前药缀合物中释放，对于这一 点，本文描述的前药需要经历活化步骤(例如1，6-释放机理)，本文称为自动裂解，将 PEG基团从药物中裂解。1，6-释放机理在WO-A 2005/099768中有很好的描述。不受理论的限制，本发明人认为本文公开的暂时PEG化的rhGH缀合物显著减少 了脂肪萎缩，因为在PEG通过可自动裂解的连接体逐渐裂解之前，PEG化的rhGH缀合 物具有低活性。这可以确保前药不会比人GH或上述的其它永久PEG化的rhGH化合物 更频繁地诱导脂肪萎缩。本发明潜在的问题也是通过包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AA)的人生长 激素ChGH)的前药缀合物的药物组合物来解决的hGH-NH-La-S° (AA)其中hGH-NH 表示 hGH 残基；La表示官能团，其是通过自动裂解诱导基团Ga而自身可水解的(可自动裂解)； 并且
S°是聚合物链，其分子量为至少5kDa并且包含至少第一个分支结构BS1，至少 第一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合物链S1，其中S°、BS1、 S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中分支结构BS1进一步包含至少 第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S2，或者S°、S1中至少一个包含至少第二个分支 结构BS2，所述的BS2包含至少第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S2，并且其中不含 hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa、优选至少25kDa并且 最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且最 大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更优选至少40kDa并且最大 90kDa。令人惊讶地发现，通过提供具有某最小长度(如它们分子量所定义的)的至少3 条链的聚合物载体，本发明的前药的剩余活性可以被有效地降低，从而与本文描述的暂 时连接体组合解决了提供hGH前药的问题，其可以更少频率地施用并且没有增加脂肪萎 缩的风险。因此，前药应当是水溶性的。对于至少双_缀合的前药，问题可以通过包含适合的药物赋形剂并且还包含式 (AB)的人生长激素ChGH)的前药缀合物的药物组合物来解决hGH-(NH-L-S0)n (AB)其中η 是 2、3 或 4;优选 2;
hGH (-NH) n 表示 hGH 残基；L各自独立地是永久官能团Lp或官能团ΙΛ其是通过自动裂解诱导基团Ga而自 身可水解的(可自动裂解)；并且S°各自独立地是分子量为至少5kDa的聚合物链，其中S°任选是分支的，包含至 少第一个分支结构BS1，至少第一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的 聚合物链S1，其中S°、BS1、S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中 不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa、优选至少25kDa 并且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且 最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更优选至少40kDa并且最大 90kDa。本发明的另一方面是以上定义的前药缀合物。本发明优选的实施方案在下面仅通过实施例描述。定义在讨论本发明详述的实施方案之前，提供关于本发明主要方面的特别术语的定 义。通常，本文所用的所有特别的技术术语应当被理解为技术人员将在本技术背景 中理解它们。rhGH或hGH或GH或hGH残基指的是人生长激素。NH_hGH是hGH残基， 其中-NH-hGH的-NH-表示hGH的氨基。本文的术语“活性”应当被理解为生长激素或其缀合物当施用于哺乳动物、 例如在体内模型中诱发生物学响应或在实施例描述的体外模型中产生可测量的响应的能力。在前药系统中，测量的活性将具有两个贡献，一个来自释放的游离药物实体， 并且另一个来自仍未裂解的前药缀合物。为了区分前药缀合物的活性，本文的术语“剩 余活性”应当被理解为可归于前药缀合物的测量的前药活性的部分。本文的术语“自动裂解”应当被理解为暂时连接体和药物分子rhGH之间的键 在水性缓冲溶液中在pH 7.4和37°C的生理条件下限速的水解裂解。自动裂解不需要存在 酶。该自动裂解或自身水解是提供自动裂解诱导基团控制的，所述的基团是前药分子的 部分。该自动裂解诱导基团可以以本身存在或者以掩蔽形式存在，以便在自身水解机制 启动前需要暴露。连接体自动水解速率指的是hGH-PEG化的前药在体内的裂解速率。由于酶或 其它作用几乎经常引起前药连接体体内水解比体外进行更快，如果前药的体内半衰期比 相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多5倍，那么将其定义为hGH PEG前 药以自动水解方式裂解。本文的术语“暂时连接”或“暂时连接体”应当被理解为描述rhGH PEG化的 前药中PEG和rhGH之间连接的不稳定性。在这种暂时连接中，rhGH从相应的前药中 释放，其体内连接体半衰期为至多1200小时。本文的术语“缀合物”应当被理解为共价键合至本文的药物(人生长激素)的 一种或多种PEG分子。术语“暂时缀合物”指的是包含至少一个暂时连接的hGH PEG化的前药。术语“永久缀合物”指的是hGH PEG化的缀合物或前药，其中PEG聚合物是 通过具有体外半衰期为至少3000小时的连接结合到hGH上。体外半衰期或体外连接体半衰期是在pH 7.4和37°C的缓冲液中从hGH PEG化的 前药中释放50%的hGH。术语“体内半衰期”或“体内连接体半衰期”应当被理解为在施用于人体后其 中50%的最初比例的生长激素从hGH PEG化的前药中释放的时间间隔，其是通过考虑如 实施例2中描述的化合物相应的缀合物半衰期来计算的。术语“缀合物半衰期”应当被理解为其中50%的以上定义的hGHPEG化的永久 缀合物从血液循环中清除的时间间隔。本文的术语“脂肪萎缩”应当被理解为用于脂肪组织局部丢失的医学术语。在 本文中，“脂肪萎缩”指的是注射部位脂肪萎缩，这意味着组织脂解发生在靠近注射部 位。本文的术语“前药”应当被理解为在显示其全部药理学作用前经历转化的任 何化合物。IUPAC定义下给出了前体系统的分类(http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/ medchem，2004 年 3 月 8 日接入)前药前药是在显示其药理学作用前经历生物转化的任何化合物。因此，前药可以被 认为是包含特别的无毒保护基的药物，所述保护基以暂时的方式用于改变或消除母体分 子中不希望的性质。双重前药(或前_前药)
双重前药是在体内分两步(酶和/或化学方式)转化为活性物质的生物无活性分子。载体连接的前药(载体前药)载体连接的前药是包含给定的活性物质与暂时载体基团的暂时连接的前药，所 述的暂时载体基团产生改善的物理化学或药物动力学性质，并且其易于体内消除，通常 是通过水解裂解。级联前药级联前药是其中载体基团的裂解仅在暴露活化基团后变成有效的前药。生物转化生物转化是物质通过活有机体或酶制剂的化学转化。相应地，级联自动水解诱导基团仅在暴露某些自动水解诱导结构元件后变成有 作用。为了暴露自动水解诱导结构元件，需要一个或多个级联暴露步骤。至少一个暴露 步骤可以基于生物转化步骤。术语“包含人体内临床有效量的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药的药物组 合物”应当被理解为在将药物组合物施用于人后足够高以在人体内获得所需临床作用的 量，例如与治疗GH相关疾病有关的所需的临床作用。在本文中，技术人员通常能够调 整所施用的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药的量，以获得所需的临床作用。本文的术语“生理条件”应当被理解为与人体的pH和温度条件相同或相似的 任何体外或体内条件。更特别的是，生理条件指的是在约pH 7.4 (pH 6.8至pH 7.8)和约 370C (35°C至 40°C )的条件。术语“连接体”频繁地用于生物缀合领域的出版物中并且广义地描述用于连接 两个分子实体的化学结构。这种连接可以是永久的或暂时的。暂时连接体是其中药物与PEG分子的缀合是可逆的连接体。这意味着连接体的 裂解释放天然和活化形式的药物。对于载体前药，特别是如果聚合物是永久与连接体结 合并且因此连接体相关的降解产物不是作为前药裂解的结果而释放的，在结构上区分暂 时连接体单元和聚合物载体可能是困难的。如果连接体既是自动裂解诱导基团又是分支 单元，连接体的结构特征甚至更加具有挑战性。因此，在本发明的含义中，术语连接体 可以与官能团La和自动裂解诱导基团Ga的组合同义应用。在其中载体是分支的PEG的 所述的载体前药的情况中，优选应用基于La和Ga组合的结构描述。在这种情况下，裂 解诱导基团Ga被认为是载体聚合物的部分。Ga的化学性质的变化在很大程度上使相应的 载体连接的前药的自身裂解性质得以设计。术语“永久连接体”指的是PEG通过形成脂族酰胺或脂族氨基甲酸酯而与 hGH-提供的伯氨基缀合。如果应用常规的PEG化试剂，产生的缀合物通常对于水解是 非常稳定的，并且对于前药系统中的治疗用途而言，酰胺或氨基甲酸酯键的裂解速率将 非常缓慢。但是，这种永久连接体缀合物用于研究前药缀合物的治疗用途，因为它们可 用于评价剩余活性。如果这种稳定的连接被用于前药方法中，在治疗应用的时间内没有酶催化，官 能团的裂解是不可能的。术语“水溶性前药”指的是在生理条件下溶于水的前药。典型的是，水溶性前药将透射至少75%、更优选至少95%的相同溶液在过滤后透射的光。按重量计，水溶性 聚合物优选至少约35% (重量)溶于水，仍然更优选至少约50% (重量)，仍然更优选 至少约70% (重量)，仍然更优选至少约85% (重量)，仍然更优选至少约95% (重量) 或完全溶于水。本文所用的术语“PEG”或“PEG化残基”用于例证以重复单元为特征的适合 的水溶性聚合物。适合的聚合物可以选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙 烯醇、聚％唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯 酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰 基丙烯酸酯和聚酯。PEG链可以包含相互连接的部分、聚合物部分和末端基团。在hGH PEG化的前药的分支的单缀合物的情况中，临界距离规定为连接的原子 所测量的PEG链S°与La的连接部位与第一个分支结构BS1之间的最短距离。本文的术语“PEG载量”应当被理解为包含连接至hGH的多个重复单元的聚合 物链的分子质量的描述。总的PEG载量应当被理解为在分子基础上连接至hGH的所有 聚合物载体的总的分子质量。发明详述包含适合的药物赋形剂的药物组合物技术人员已知药物组合物包含可药用赋形剂和/或载体。“可药用的”指的是包括任何赋形剂和/或添加剂，其不干扰活性成分的生物学 活性的功效并且其对于所施用的宿主是无毒的。在优选的实施方案中，药物组合物是皮下施用、肌内施用或静脉内注射的组合 物。对于治疗本文描述的相关障碍/疾病，这是优选的施用途径的实例。药物组合物可以包含除本文描述的rhGH PEG化的前药之外的其它活性成分。重组人生长激素(rhGH)由于重组人GH在序列上与天然人GH是相同的，本文的术语重组人生长激素 (rhGH)还涉及所谓的生物仿制药(biogenerics)等同物。因此，术语rhGH和hGH在本 发明的含义中可以同义应用。本文的术语“生物仿制药”应当被理解为仿制形式的生物药物；应用生物方 法，通常通过现代生物技术活动开发的分子。仿制化学药物可以被定义为当与发明人产 品相比时，具有基本上类似活性、基本上化学等同于它们市售相似物、生物等价的、在 专利过期后通过简短的程序获得上市许可的那些分子。技术人员已知现在常规工作是制备例如较少氨基变化的感兴趣的生物制品(本 文是GH)而不显著影响生物制品的活性。除了重组人和生物仿制药，术语重组人生长激素(rhGH)在本文还涉及所有可能 的rhGH多肽。在Pharmacia Corporation 的 WO_A 2005/079838 第 15 页第 0043 段至且包括第 0053段中给出了可能的rhGH多肽的准确描述。本文所用的术语“hGH多肽或hGH蛋白质”包括所有的hGH多肽，优选来自哺 乳动物物种，更优选来自人和鼠科动物物种，以及它们的变体、类似物、直向同源物、同系物和衍生物以及其片段，其特征在于促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合 成代谢和脂质代谢。术语“hGH多肽或蛋白质”优选表示具有A丄.Grigorian等人， ProteinScience(2005), 14，902-913中公开的序列的22kDa hGH多肽以及其变体、同系
物和衍生物，其显示出基本上相同的生物活性(促进生长期的生长和维持正常的身体组 分、合成代谢和脂质代谢)。更优选的是，术语“hGH多肽或蛋白质”指的是具有准确 的上述序列的多肽。hGH的衍生物特别包括hGH前药缀合物，其包含永久连接的聚合物，例如 PEG,即本发明的前药可以包含除一种或多种暂时连接体聚合物缀合物之外的进一步的 永久连接体聚合物缀合物。本文所用的术语“hGH多肽变体”指的是来自相同物种但是与参考hGH多肽 不同的多肽。通常，差别是有限的，以致参考和变体的氨基酸序列整体是非常相似的并 且在很多区域是相同的。优选的是，hGH多肽至少70%、80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%等同于参考hGH多肽，优选hGH多肽具有A丄.Grigorian等人，Protein Science(2005), 14，902-913中所示的序列。由于多肽的氨基酸序列至少例如95% “等 同”于查询的氨基酸序列，可预期的是主题多肽的氨基酸序列等同于查询的序列，除 了主题多肽序列可能包括至多5个氨基酸改变(在查询的氨基酸序列的每100个氨基酸 中)。参考序列的这些改变可能发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端或这些末端位置 之间的任何地方，单独散布在参考序列的残基中或散布在参考序列的一个或多个邻近基 团中。查询的序列可以是参考序列的全部氨基酸序列或者本文描述的任何特别的片段。此类hGH多肽变体可以是天然存在的变体，例如天然存在的等位基因变体(其 是通过占据生物体的染色体的给定基因座的数个交替形式的hGH之一编码的)，或同种 型(其是通过天然存在的源于单个初级转录物的剪接变体编码的)。可选择的是，hGH 多肽变体可以是不确定是否天然存在并且可以用领域已知的诱变技术制备的变体。本领域已知一个或多个氨基酸可以从生物活性肽或蛋白质的N-末端或C-末 端删除，而基本上不丢失生物功能(参见例如Ron等人，(1993)，BiolChem.， 2682984-2988，将该公开的全部内容并入本文作为参考)。本领域技术人员还认为hGH多肽的某些氨基酸序列可以是不同的而不显著影响 蛋白质的结构或功能。此类突变包括根据本领域已知的通用规则所选的缺失、插入、 倒位、重复和取代，以便对活性产生较小影响。例如，在Bowie等人(1990)，Science 247 1306-1310中提供了关于如何制备表型沉默氨基酸取代的指南，将其全部内容并入 本文作为参考，其中作者指出了研究氨基酸序列对改变的耐受的两种主要方法。第一种方法依赖进化过程，其中突变是被天然选择接受的或拒绝的。第二种方 法应用基因工程，在克隆的hGH的特别位置引入氨基酸改变并且选择或筛选以鉴定维持 功能的序列。这些研究表明蛋白质令人惊讶地耐受氨基酸取代。作者进一步指出氨基酸 改变在蛋白质的某些位置可能是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性侧 链，但是表面侧链的一些特征通常是保守的。在上文的Bowie等人(1990)以及其中引用 的参考文献中描述了其它的此类表型沉默取代。典型地所见的保守取代是脂族氨基酸Ala、VaL Leu和Phe间的互相代替、残基Ser和Thr的羟基互换、酸性残基Asp和Glu的互换、酰胺残基Aot和Gln之间的取代、 碱性残基Lys和Arg的互换以及芳族残基Phe、Tyr之间的代替。另外，下列氨基酸组通 常表示等价改变(l)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn> Ser、Thr ； (2)Cys、Ser、 Tyr、Thr ； (3) VaL lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4)Lys、Arg> His ； (5) Phe、Tyr、 Trp、His。术语hGH多肽还包括由hGH类似物、直向同源物和/或物种同系物编码的所有 hGH多肽。本文所用的术语“hGH类似物”指的是不同的和不相关的有机体的hGH，其 在各自的有机体中表现出相同的功能，但是其不是源于有机体祖先共有的祖先结构。代 替地，类似的hGH单独出现，后来进化表现出相同的功能(或类似的功能)。换言之， 类似的hGH多肽是具有非常不同的氨基酸序列但是表现出相同的生物活性(即在促进生 长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代谢)的多肽。本文所用的术语
“hGH直向同源物”指的是两种不同的物种内的hGH，其序列通过祖先物种中共有的同 源hGH而互相关联，但是其已经进化变成互相不同。本文所用的术语“hGH同系物”指 的是不同有机体的hGH，其在各自的有机体内表现出相同的功能，并且其源于有机体祖 先共有的祖先结构。换言之，同系hGH多肽是具有非常相似的氨基酸序列的多肽，其表 现出相同的生物活性，即促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代 谢。优选的是，hGH多肽同系物可以定义为多肽表现出至少40%、50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%等同于参考hGH多肽，优选具有以上提及 的序列的hGH多肽。因此，hGH多肽可以是例如(i)其中一个或多个氨基酸残基是用保守的或非保 守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的，并且这种取代的氨基酸残基可能是或 可能不是由遗传密码编码的；或Gi)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基；或Gii)其 中hGH多肽是与另一种化合物融合的，所述的化合物例如增加多肽半衰期的化合物(例 如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸是融合到以上形式的多肽上的，例如IgG Fc融 合区肽或者前导或分泌序列或者用于纯化以上形式的多肽的序列或者蛋白质序列。hGH多肽可以是单体或多聚体。多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体或包含 至少5个单体多肽单元的多聚体。多聚体还可以是同二聚体或异二聚体。多聚体可以是 疏水、亲水、离子和/或共价联合的结果，和/或可以是间接连接的，通过例如脂质体形 成。在一个实例中，共价联合是在包含hGH多肽或其片段的融合蛋白中所包含的异源序 列之间(参见例如美国专利号5,478,925，将该公开的全部内容并入本文作为参考)。在 另一个实例中，hGH多肽或其片段是连接到一种或多个多肽上，所述的多肽可以是hGH 多肽或通过肽连接体形成的异源多肽，例如US.5,073,627中描述的那些(将其并入本文作 为参考)。制备多聚体hGH多肽的另一种方法涉及应用融合到已知促进蛋白质的多聚化的 亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列上的hGH多肽，其中发现应用本领域技术人员已知 的技术包括WO 94/10308的教导。在另一个实例中，hGH多肽可以通过含有f^ag
多肽序列的融合hGH多肽中所含的F丨ag 多肽序列之间的相互作用而联合。hGH多聚 体还可以应用本领域已知的化学技术来产生，例如应用连接分子交联和本领域已知的连接体分子长度优化技术(参见例如US 5,478,925)、本领域已知的在位于多聚体中包含的 所需的多肽序列内的半胱氨酸残基间形成一个或多个分子内交联的技术(参见例如US 5,478,925，将半胱氨酸或生物素添加到hGH多肽的C_末端或N_末端)，以及产生包含一 个或多个这些修饰的多肽的多聚体的技术(参见例如US 5,478,925)，或者产生包含hGH 多聚体的脂质体的30种技术中的任何一种(参见例如美国专利号5,478,925)，将该公开的 全部内容并入本文作为参考。本文所用的术语“hGH多肽片段”指的是包含hGH多肽的连续跨度的部分氨基 酸序列的任何肽或多肽，优选具有以上提及的序列的多肽。rhGH PEG化的前药_优诜的PEG,聚合物链如上所述，本文描述的rhGH PEG化的前药应该具有相对低的活性。因此，在一个优选的实施方案中，每个生长激素分子的总的PEG载量总计至少 25kDa。通常，总的PEG载量将小于lOOOkDa。优选的是，PEG载量为至少25kDa并 且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且 最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更优选至少40kDa并且最大 90kDa。PEG可以通过一个或多个锚定点与hGH连接。在一个锚定点的情况中，hGH PEG前药单缀合物中的相应PEG将是分支的并且包含至少3条链。在多于一个锚定点的 情况中，例如双缀合物，hGHPEG前药中的相应PEG可以是分支的或线性的。双缀合 物可以包含一个或两个暂时连接，并且PEG可以是线性的或分支的或者包含一个线性链 和一个分支链的混合物。在这种情况中，双缀合物包含一个暂时连接以及一个线性链和 一个分支链，暂时连接可以在其中任一链上。在这种情况中，应用分支的PEG链，可以 存在一个或多个分支单元。分支的PEG是包含连接两条或多条PEG链的分支点的PEG分子，从而与连接 生长激素的一个锚定点形成分子。其可以是两条20kDa的PEG链，连接形成一条分支的 40kDa的PEG分子。在其中分子包含两个或三个分支点的情况中，该分子分别表示具有 3和4个臂的PEG。总之并且在以上提及的限制内，PEG聚合物不限于特别的结构并且可以是线性 的、分支的或多个臂的(例如叉状PEG或与多元醇核连接的PEG)、树枝状的或含有可降 解的连接体。不受理论的限制，PEG载量旨在提供适合的分子质量，从而获得所需的相对低 的活性，并且不含有太高分子质量的PEG，太高分子质量的PEG可能导致其它问题。对天然人GH进行PEG化可以发生在数个赖氨酸基团上或者发生在N-末端胺 上(Fl)，如Clark等人(本文参考文献2)的第21973页表III所描述的。高度反应性是 位点Fl和LYS-140。中度反应位点是LYS-115、LYS-38和LYS-70。弱反应性是位点 LYS-172、LYS-41、LYS-158 和 LYS-168。在更通用的术语中，在本文中与暂时连接体组合应用的PEG可以通过适合选择 所述的聚合物来降低脂肪萎缩的风险。但是，本发明的原理还适用于除PEG之外的聚合 物。因此，术语PEG在本文中仅用作适合聚合物的实例。因此，在优选的实施方案中，hGH PEG前药是伯胺基团之一与聚合物链S°的可
23自动裂解的官能团La缀合的单缀合物。该聚合物链S°的分子量为至少5kDa并且包含至 少一个分支结构BS1。分支结构BS1包含第二个聚合物链S1，其分子量为至少4kDa。如上所述，需要至少第三个聚合物链S2，其分子量为至少4kDa。聚合物链S2可 以是BS1的部分或者可以是S°或S1的进一步的分支，从而引起进一步的分支结构BS2， 其包含S2。在本发明的前药缀合物中存在任选多于3条聚合物链，例如4、5、6、7或8 条。但是，每条进一步的聚合物链的分子量为至少4kDa。聚合物链的总数是受前药缀 合物的总重量(最大IOOODa(不包含hGH-NH))限制。因此，本发明优选的实施方案涉及组合物，其中分支结构BS1、BS2中至少一个 包含进一步的第四条聚合物链S3，其分子量为至少4kDa，或者S°、S1、S2之一包含第三 个分支结构BS3，其包含至少第四条聚合物链S3，其分子量为至少4kDa。分支结构或聚合物链之一包含自动裂解诱导基团G%其是La的自动裂解所必需 的。任选的是，分支结构之一用作基团G%从而分支结构包含Ga(代替包含所述的 基团)，其也包括在术语“包括”中。前药缀合物(AA)的制备通常产生缀合物的混合物，其中hGH的数个伯胺基团 缀合，引起不同的单缀合的、不同的双缀合的、不同的三缀合的等前药。相应的单缀 合、双缀合或三缀合的hGH PEG前药可以通过本领域已知的标准方法来分离，例如柱色
；並妹绝 te広寸。在hGH PEG前药的单缀合物中，至少三条聚合物链S°、S1、S2包含“聚合物 部分”，其特征在于一个或多个重复单元，这些重复单元可以是随机的、嵌段的(block wise)或交替分布的。另外，至少三条聚合物链S°、S1、S2显示末端基团，其典型的是 氢原子或具有1至6个碳原子的烷基，其可以是分支的或不分支的，例如甲基，特别是对 于基于PEG的聚合物链，弓丨起所谓的mPEG。需要指出的是，在至少三条聚合物链S°、S1、S2中的聚合物部分可以进一步含 有链样取代基，其源于重复单元并且引起具有小于4kDa分子量的链，并且不认为该链是 聚合物链S°、S1、S2等。优选的是，至少三条聚合物链S°、S1、S2具有小于IOOODa分 子量的取代基。S0的相关结构特征是其临界距离。临界距离定义了连接的原子所测量的S°与 La的连接位点与第一个分支结构BS1之间的最短距离。临界距离的长度对剩余活性有影 响，如化合物33所讨论的。临界距离优选小于50、更优选小于20、最优选小于10。至少三条聚合物链S°、S1、S2典型地各自含有互连部分。在至少一个互连部分 中存在Ga。对于除S°之外的聚合物链，互连部分是连接例如S1的聚合物部分与BS1以及 S2的聚合物部分与BS2的结构元件。对于S°，互连部分是连接La和BS1的结构元件。互连部分可以包括CV5tl烷基链，其是分支的或不分支的并且其任选被杂原子 或官能团间断或终止，所述的杂原子或官能团选自-O-、-S-、N(R), C(O), C(O) N(R), N(R)C(O), 一个或多个碳环或杂环，其中R是氢或CV2tl烷基链，其任选被一个 或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步含有氢作为末端原子；并且其中碳环是苯 基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3,环烷基；并且其中杂环是4至7元杂环基
24或9至11元杂二环基。“C3_1(l环烷基”或“C3_1(l环烷基环”表示含有3至10个碳原子的环烷基链， 其可以含有至少部分饱和的碳-碳双键，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己 烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。环烷基碳上的每个氢可以被取代基代替。术 语“C3_1(1环烷基”或“C3_1(1环烷基环”还包括桥连的二环，例如降冰片烷(norbonane) 或降冰片烯(norbonene)。“4至7元杂环基”或“4至7元杂环”表示含有4、5、6或7个环原子的环， 其可以含有至多最大数量的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不 饱和的)，其中至少一个环原子至至多4个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫 (包括-S(O)-、-S(O)2-),氧和氮(包括=N(O)-)，并且其中环是通过碳或氮原子与分 子的其它部分连接的。4至7元杂环的实例是氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、 呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、唑、，悉唑啉、异％ 唑、异％唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四 氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、巧 1、唑烷、异^1、唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑 烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、 哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂革或高哌嗪。“9至11元杂二环基”或“9至11元杂二环”表示含有9至11个环原子的两 个环的杂环系统，其中至少一个环原子被两个环共享并且其可以包含至多最大数量的双 键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原 子至至多6个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-),氧 和氮(包括=N(O)-),并且其中环通过碳或氮原子与分子的其它部分连接。9至11元 杂二环的实例是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并异&恩唑、苯 并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二 氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并 氮杂革、嘌呤或蝶啶。术语9至11元杂二环还包括两个环的螺环结构，例如1，4-二氧 杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷，或者桥连的杂环，例如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。碳环、杂环和杂二环可以被CV2tl烷基取代，任选被杂原子或官能团间断或终 止，所述的杂原子或官能团选自-O-、-S-、N(R)、C(O)、C (O) N (R) > N(R)C(O), 其中R是氢或C1,烷基链，其任选被一个或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步 含有氢作为末端原子。至少三条链S°、S1、S2的聚合物部分形成链的主要部分，优选至少90%的每条 链的分子量、更优选至少95%、甚至更优选至少97.5%、甚至更优选至少99%。因此， 链的主要部分是由聚合物部分来表示的。优选的是，至少三条链S°、S1、S2独立地基于聚合物，所述的聚合物选自聚烷 氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚P恶唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳 酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机 磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。优选的是，至少三条链S°、S1、S2是基于相同的聚合物。优选的是，至少三条
25链S°、S1、S2是基于聚烷氧基聚合物。甚至更优选的是，至少三条链S°、S1、S2基于聚
乙二醇。相应地，也适用于进一步的链S3、S4、S5等。链S°包含分支结构BS1，从而S1与S°连接。对于S2的连接，可以应用分支结 构BS1或存在进一步的分支结构BS2，其可以是S°或S1的部分。因此，当存在进一步的 链时，可以存在进一步的分支结构。例如，在存在链S3的情况中，其可以与BS1、BS2 或分支结构BS3连接。分支结构BS3，如果存在，可以是S°、S1或S2的部分。通常，可以应用允许分支的链的任何化学实体。优选的是，分支结构独立地选 自至少3-倍取代的碳环、至少3-倍取代的杂环、叔碳原子、季碳原子和叔氮原子，其中 术语碳环和杂环如上面所定义的。rhGH PEG化的前药-晳时连接体结构，La、Ga在本领域的出版物中，自动裂解诱导基团有时被称为连接体，以区分它们与载 体的结构。但是，通常难以清楚地分离这些结构特征。因此，在本发明的含义中，裂解 诱导基团Ga被认为是载体S的部分，所述的载体S包含至少S°、S1、S2、BS1和任选的 BS2。Ga化学性质的变化在很大程度上使得相应载体连接的前药的自我裂解性质得以设 计。如上面所讨论的，PEG化的前药，其中药物是例如专利申请W0-A2005/099768 中描述的rhGH，并且具有释放特征，其中其被描述为1，6裂解系统，而没有产生有毒 的芳族化合物。在该文献中，广泛描述了很多相关的适合的暂时连接体结构，以获得感 兴趣的相关释放分布。其它暂时连接体结构通常/广泛描述于例如其它复杂生物系统 GmbH 申请中，例如 WO-A 2005/034909、WO-A 2005/099768、WO-A 2006/003014 和 W0-A2006/136586 ο在例如WO-A 99/30727 (Enzon Inc)中广泛描述了更多的暂时连接体结构。为了解决本文讨论的GH的问题，本发明已经选择了适合的优选的暂时连接体结 构，以获得本文描述的rhGH PEG化的前药的相关的功能性质。基于本文详述的优选的 连接体结构，在技术人员的知识范围内可以制备其它适合的优选的暂时连接体结构，其 可以得到具有本文描述的相关功能性质的rhGH PEG化的前药。特别的是，可以选择适合的暂时连接体结构(其是可自身水解的(可自动裂解)) 掺入至s°。下面详细描述本文所选的连接体结构。理想的是，本发明的缀合物将具有一种或多种以下特征和/或优于目前rhGH缀 合物或制剂的优点可以易于以高产率合成、半衰期在优选的范围内、可以纯化以提供 均勻的缀合物组合物、在自动裂解后表现出活性，例如体外和体内活性，并且具有优于 未修饰的rhGH和先前描述的rhGH缀合物的药效学作用并且不引起脂肪萎缩。本文描述 的结构表现出本文所需的释放性质。通常，载体连接的前药需要存在连接药物和载体的可裂解的官能团。在缺乏自 动水解诱导基团的情况中，涉及药物提供的氨基(例如脂族酰胺或氨基甲酸酯键La)的官 能团通常对于水解是非常稳定的，并且酰胺键的裂解速率对于前药系统中的治疗用途将 非常缓慢。如果此类稳定连接被用于载体连接的前药中，在没有生物转化的治疗应用期间，官能团的裂解是不可能的。在这些情况中，连接体显示出结构基序，其作为底物被 相应的内源性酶识别。在这种情况中，官能键La的裂解涉及包含酶的复合物。实例是 肽连接体，其被内源性蛋白酶识别并且酶解。酶的水平在个体间显著不同，这导致通过酶裂解引起的前药活化的生物学差 异。酶的水平还取决于施用部位而不同。例如已知在皮下注射的情况中，身体的某些区 域产生比其它区域更可预料的治疗作用。这种高水平的患者间变异性是不希望的。另 外，对于这种酶-依赖的载体连接的前药，难以建立体内-体外药物动力学性质的对应关 系。在缺乏可靠的体内-体外对应关系时，优化释放分布变成一项麻烦的工作。为了避免患者间和注射部位的变异性，需要应用载体连接的前药，其在治疗应 用时期内表现出裂解动力学而无需额外的酶帮助裂解。特别是对于高分子量载体，特别 是对于分支的聚合物载体，对于酶由于空间位阻，获得连接官能团La可能受到限制。因 此，需要设计表现自身裂解性质的载体连接的前药。自动裂解动力学可以例如通过在不含酶的缓冲溶液中记录水解速率来体外测定。为了将水解不稳定性引入到官能团L(例如酰胺或氨基甲酸酯)中，需要将结构 化学组分设计到载体中，以发挥作用，例如作为接近官能团的邻近基团。此类自动裂解 诱导化学结构(其对前药酰胺键的可裂解性产生控制)称为自动裂解诱导基团Ga。自动 裂解诱导基团可以对给定的官能团La的水解速率具有很强的作用。优选的La选自C (O)-O-和C(O) _，其与hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或 酰胺基团。因此，优选本发明的组合物，其中La选自C(O)-O-和C(O)-，其与hGH的伯 氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基团，产生式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (O) O-S0 (AAl)hGH-NH-C (O) -S0 (AA2)以下部分将列出多种结构组分，其可以用作裂解诱导基团Ga。基团Ga表示自动裂解诱导基团。Ga可以以本身存在或者作为级联自动裂解诱导 基团存在，其是暴露的以通过另外的水解或酶裂解步骤变得有效。如果Ga以本身存在， 其控制La的限速自动水解。Ga的实例A.J.Garman 等人(A.J.Garman，S.B.Kalindjan, FEBS Lett.1987, 223(2)， 361-3651987)将PEG5000-马来酸酐用于组织型纤溶酶原激活物和尿激酶中氨基的可逆 修饰。PEG-uPA缀合物的功能酶的再生是在pH7.4缓冲液中温育，通过裂解马来酰胺酸 连接，一级动力学半衰期为6.1小时。单一的芳族部分可能意味着连接的氨基甲酸酯键的不稳定性 (WO-AOl/47562)。例如，在前药方法中应用取代的或未取代的芴基甲基，使得氨基甲 酸酯连接对多种生物活性试剂不稳定(Tsubery等人，J Biol Chem 279 (2004) 38118-24)。 在WO-A 2007/075534中两条PEG链与芴基部分连接。因此，Ga是直接与氨基甲酸酯官能团La连接的芳族环或芴基甲基。因此，优选本发明的组合物，其中Ga是直接与由La和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯官能团连接的芳族环或芴基甲基。可选择的是，Ga的转化可以诱导S°内的分子重排，例如1，4或1，6-消除。该 重排使得La非常不稳定以至于被诱导裂解。Ga的转化是级联机制中的限速步骤。理想 的是，暂时连接的裂解速率等同于给定的治疗方案中药物分子预期释放速率。在这种基 于1，6-消除的级联系统中，需要La的裂解在其不稳定性被Ga的转化诱导后基本上是同 时发生的。另外，需要限速裂解动力学是在治疗应用期间进行，而无需另外的酶帮助， 从而避免以上讨论的与大部分酶裂解相关的缺点。R.B.Greenwald, A.Pendri, C.D.Conover, H.Zhao, Y.H.Choe, A.Martinez, K.Shum, S.Guan, J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667 和 PCT 专利申请 WO-A 99/30727 描述了合成含氨基小分子化合物(基于1，4-或1，6-苄基消除)的聚乙二醇前药的方 法。在该方法中，药物分子的氨基是通过氨基甲酸酯基团与PEG化的苄基部分连接的。 聚乙二醇通过酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键与苄基连接。药物分子中PEG的释放是 通过自动水解和酶裂解的组合来发生的。在该方法中，释放触发掩蔽基团的裂解之后是 经典的且快速的1，4-或1，6-苄基消除。该连接体系统还用于蛋白质的可释放的聚乙 二醇缀合物(S丄ee，R.B.Greenwald 等人.Bioconj.Chem.2001，12(2)，163-169)。将溶 菌酶用作模型蛋白，因为当PEG化发生在赖氨酸残基的氨基时其失去其活性。多 种量的PEG连接体与蛋白质缀合。PEG缀合物中天然蛋白质的再生发生在大鼠血浆中 或发生在非生理的高pH缓冲液中。还参见F.M.H.DeGroot等人(WO_A 2002/083180和 W0-A2004/043493)和 D.Shabat 等人(WO-A 2004/019993)。因此，La是氨基甲酸酯官能团，所述基团的裂解是通过Ga的羟基或氨基经S°的 1，4-或1，6-苄基消除来诱导的，其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经 历限速转化。事实上，Ga可以通过水解裂解。因此，优选本发明的组合物，其中La与hGH的氨基一起形成氨基甲酸酯官能 团，所述基团的裂解是通过Ga的羟基或氨基经S°的1，4-或1，6-苄基消除来诱导的， 其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经历限速转化。Ga可以包含由Ga组分激活的级联裂解系统，其包括代表上述前体的结构组合。 Ga的前体可以包含另外的暂时连接，例如酰胺、酯或氨基甲酸酯。前体的暂时连接(例 如氨基甲酸酯)对水解的稳定性或敏感性可以由自动水解性质控制或需要酶活性。Antczak 等人(Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48)描述了一种试剂，对于含胺的 药物分子，其形成了大分子级联前药系统的基础。在该方法中，抗体用作载体，稳定的 键将抗体与活化的基团连接，带有可裂解的掩蔽基团。在除去酯连接的掩蔽基团后，La 裂解并且释放药物化合物。D.Shabat等人(Chem.Eur.3.2004，10，2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基团的
聚合物前药系统。在该系统中，掩蔽基团是通过氨基甲酸酯键与活化基团连接的。活化 基团通过酰胺键与聚丙烯酰胺聚合物永久缀合。通过催化抗体活化掩蔽基团后，掩蔽基 团通过环化裂解并且释放药物。药物释放后，活化基团仍然与聚丙烯酰胺聚合物连接。M.-R丄ee 等人(Angew.Chem.2004，116，1707-1710)描述了基于扁桃酸活化基 团和酯连接的掩蔽基团的类似前药系统。但是，在这些连接中，1，6消除步骤仍然产生高活性芳族中间体。即使芳族部分与聚合物载体保持永久连接，也可能引起潜在毒性或免疫原性作用的副反应。Greenwald等人在2000年公开了基于三甲基锁合内酯化作用的含氨基的前药 的聚乙二醇药物递送系统(R.B.Greenwald 等人，J.Med.Chem.2000, 43(3)，457-487 ； WO-A 02/089789)。在该前药系统中，取代的邻-羟基苯基-二甲基丙酸通过酰胺键与 药物分子的氨基偶联。羟基通过酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团与PEG连接。药物释放 的速率确定步骤是内酯化作用(释放芳族内酯副产物)的快速酰胺裂解后的这些官能团的 酶裂解。最近，R.B.Greenwald等人(Greenwald 等人，J.Med.Chem.2004，47，726-734) 描述了基于双-(N-2-羟基乙基)对羟苯基甘氨酸酰胺(N-二(羟乙基)甘氨酸酰胺)连 接体的PEG前药系统。在该系统中，两个PEG分子与N-二(羟乙基)甘氨酸分子(其 与药物分子的氨基偶联)连接。在前药活化中第一个两步是两个PEG分子的酶裂解。所 述的PEG和N-二(羟乙基)甘氨酸之间不同的连接引起不同的前药活化动力学。该系 统的主要缺点是与药物分子缀合的N-二(羟乙基)甘氨酸的缓慢水解速率(在磷酸缓冲 液中t1/2 = 3小时)，这引起N-二(羟乙基)甘氨酸修饰的前药中间体的释放，与母体药 物分子相比，这可能表现出不同的药物动力学和药效学性质。更特别的是，对于S°，以下描述了具有特别间隔部分的优选的基团La和Ga。根据WO-A 2005/099768，优选的结构选自通式⑴和(II)
权利要求
1.药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含人体内临床有效量 的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药缀合物，其中PEG通过自身可水解(自动裂解) 的暂时连接体与rhGH连接；所述的前药缀合物的特征在于(1)缀合物的GH活性小于不含PEG的天然生长激素的5%；并且(2)连接体自动水解速率是体内半衰期为10小时至600小时的速率。
2.权利要求1的药物组合物，其中自动水解速率是体内半衰期比相应的hGHPEG化 的前药缀合物的体外半衰期短至多5倍的速率。
3.权利要求2的药物组合物，其中体内半衰期比相应的hGHPEG化的前药缀合物的 体外半衰期短至多3倍。
4.权利要求2或3的药物组合物，其中体内半衰期比相应的hGHPEG化的前药缀合 物的体外半衰期短至多2倍或几乎相同。
5.权利要求1至4中任意一项的药物组合物，其中组合物是用于皮下施用、肌内施用 或静脉内注射的组合物。
6.权利要求1至5中任意一项的药物组合物，其中PEG化的前药中每个生长激素分 子的总PEG载量总计至少25kDa。
7.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中前药缀合物具有化学结构(A)其中HN-rhGH表示与暂时连接体连接的rhGH残基；RU R2、R3、R4和R5独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁 基、叔丁基；PEG表示与暂时连接体连接的PEG化的残基； η = 1或2 ；并且X选自Cl至C8烷基或者Cl至C12杂烷基。
8.权利要求7的药物组合物，其中权利要求7的结构(A)中的式⑴的部分结构，其人选自
9.权利要求7的药物组合物，其中权利要求7的结构(A)中的式(II)的部分结构，其是
10.权利要求7的药物组合物，其中权利要求7的式(A)中的PEG-X是式III的 PEG-W
11.权利要求1至6中任意一项的药物组合物，其中前药缀合物结构是
12.权利要求1至6中任意一项的药物组合物，其中前药缀合物结构是
13.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为20至300小时的速率。
14.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为20至150小时的速率。
15.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为30至100小时的速率。
16.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为30至75小时的速率。
17.临床有效量的权利要求1至16中任意一项的药物组合物，其用于治疗人GH相关 疾病的方法。
18.药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AA)的人生长 激素ChGH)的前药缀合物hGH-NH-La-S° (AA)，其中hGH-NH表示hGH残基；La表示官能团，其是通过自动裂解诱导基团Ga自身可水解的(可自动裂解)；并且S°是聚合物链，其分子量为至少5kDa并且包含至少第一个分支结构BS1，至少第 一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合物链S1，其中S°、BS1、 S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中分支结构BS1进一步包含至少 第三条分子量为至少4kIDa的聚合物链S2，或者S°、S1中至少一个包含至少第二个分支 结构BS2，所述的BS2包含至少第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S2，并且其中不含 hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa。
19.权利要求18的组合物，其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少30kDa 并且最大120kDa。
20.权利要求18或19的组合物，其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少 40kDa并且最大lOOkDa。
21.权利要求18至20中任意一项的组合物，其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子 量为至少40kDa并且最大90kDa。
22.权利要求18至21中任意一项的组合物，其中La选自C(O)-O-和C(O)_，其与 hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基团，产生式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (O) O-S0 (AAl)，hGH-NH-C (O) -S0 (AA2)。
23.权利要求18至22中任意一项的组合物，其中La与hGH的氨基一起形成氨基甲 酸酯官能团，所述基团的裂解是通过Ga的羟基或氨基经S°的1，4-或1，6苄基消除来 诱导的，其中Ga包括酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经历限速转化。
24.权利要求18至21中任意一项的组合物，其中Ga是直接与La和hGH的伯氨基形 成的氨基甲酸酯官能团连接的芳族环或芴基甲基。
25.权利要求18至24中任意一项的组合物，其中分支结构BS1、BS2中至少一个包含 进一步的第四条分子量为至少4kDa的聚合物链S3，或者S°、S1、S2之一包含第三个分支 结构BS3，其包含至少第四条分子量为至少4kDa的聚合物链S3。
26.权利要求18至25中任意一项的组合物，其中至少三条链S°、S1、S2独立地基于 聚合物，所述的聚合物选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚巧1唑 啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸 酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚 酯。
27.权利要求26的组合物，其中至少三条链S°、S1、S2基于聚烷氧基聚合物。
28.权利要求18至27中任意一项的组合物，其中正如连接原子所测量的，S°至La的 连接位点与第一个分支结构BS1之间的最短距离小于50个原子。
29.权利要求28的组合物，其中最短距离小于20个原子。
30.权利要求18至29中任意一项的组合物，其中S°是式(AAAl)
31.权利要求30的组合物，其中Ga是OC(O)-R,并且R是权利要求6中所示的式 ⑴的部分结构，其中Rl、R4、R5和η如权利要求7所定义的。
32.权利要求18至22和25至26中任意一项的组合物，其中La_S°由式(AAA2)表示
33.药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AB)的人生长 激素ChGH)的前药缀合物hGH-(NH-L-S0)n (AB)，其中η是2、3或4 ；hGH (-NH) n 表示 hGH 残基；L各自独立地是永久官能团Lp或官能团ΙΛ其是通过自动裂解诱导基团Ga自身可水 解的(可自动裂解)；并且S°各自独立地是分子量为至少5kDa的聚合物链，其中S°任选是分支的，包含至少第 一个分支结构BS1，至少第一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合 物链S1，其中S°、BS1、S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中不含 hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa。
34.权利要求33的组合物，其中η是2。
35.权利要求18至34中任意一项所定义的前药。
36.前药，其选自
全文摘要
通过加入包含聚乙二醇的暂时连接体制备的化学修饰的人生长激素(rhGH)。化学修饰的蛋白质比未修饰的rhGH具有更长的rhGH活性持续期，从而能够降低剂量和施用机会，并且修饰的rhGH不会引起脂肪萎缩。本发明还包括治疗和/或预防其中应用生长激素是有利的疾病或障碍的应用方法。
文档编号A61K47/48GK102014965SQ200980115469
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月29日 优先权日2008年4月29日
发明者拉斯姆森 G·诺斯科夫, H·拉乌, K·斯普罗格, S·金德曼, T·莱斯曼, T·韦格, U·赫泽尔 申请人:阿森迪斯药物股份有限公司
技术领域：
本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含临床 有效量的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药，其比可获得的人生长激素产品可以更少 频率地施用，并且可能不引起注射副作用脂肪萎缩。本发明还涉及此类前药。
背景技术：
生长激素(GH)是在人和其它动物中刺激生长和细胞繁殖的激素。其是191个 氨基酸、单链多肽激素，其是前叶垂体侧翼中促生长素细胞合成、贮存并且分泌的。当 涉及重组DNA技术生产的生长激素时，该激素也称为促生长素并且缩写为“rhGh”。生长激素在体内具有多种功能，最显著的功能是增加儿童期的身高，并且数种 疾病可以通过GH的治疗应用来治疗。生长激素缺乏的作用取决于他们发生的年龄而不同。在儿童期，生长不足和身 材矮小症是GH缺乏的主要现象。其还可能引起性不成熟。在成年期，缺乏的作用更加 明显，并且可能包括力量、精力和骨量的不足，以及心血管风险的增加。GH缺乏存在很多原因，包括特定基因的突变、涉及下丘脑和/或垂体的先天畸 形，以及损伤、手术或疾病引起的垂体损害。缺乏是通过补充外源GH来治疗的。在目前应用中的所有GH是生物合成的人 GH,通过重组DNA技术制备。在儿童期发作(在完成生长期后)或成人发作(通常是 后天垂体肿瘤的结果)的GH缺乏的儿童和成年人中，GH用作替代治疗。在这些患者 中，优势包括减少脂肪量、增加瘦肉量、增加骨密度、改善脂质分布、减少心血管风险 因素和改善心理社会健康。Genentech Inc (US)第一个克隆了 rhGH，并且其描述于专利 EP-B22242 中。2006年，在美国和欧洲(以及它们的生产商)可获得的合成的生长激素包括 Nutropin (Genentech)、 Humatrope (Eli Lilly)、 Genotropin (Pfizer)、 Norditropin (Novo Nordisk)、Saizen (Merck Serono)禾口 Omnitrope (Sandoz)。尽管分子生物学技术已经显著地增加了很多蛋白质和/或多肽(下文称为蛋白 质)的利用度，但是所述蛋白质的治疗用途时常受到其它因素的阻碍，例如由于肾和受 体介导的清除引起的短的血浆半衰期、聚集、蛋白质降解、较差的生物利用度和物理性 质(预先排除有效的制剂)。增加蛋白质利用度的原理是通过将蛋白质与衍生化的化合物的缀合，所述的衍 生的化合物包括但不限于聚乙二醇和聚丙二醇。公认的某些优点包括降低免疫原性 和抗原性，增加作用持续时间和改变药物动力学性质。[Veronese，F.M. "Enzymes for Human Therapy Surface StructureModifications (用于人类治疗的酶表面结构修饰)”， Chimica Oggi, 7 53-56 (1989)](本文参考文献 5)。对于医学用途，通过PEG化的rhGH可能通过增加其体内半衰期(从而实现剂量 减少或给药频率降低)、改善其稳定性和降低其抗原性或它们的组合来改善分子特性。
通常，对分子进行该类型的修饰是本领域众所周知的并且专利文献中可获得很 多专利，这些专利描述了这种概念。例如EP-B 1196443中描述了 Hoftnann La Roche的 PEG化的促红细胞生成素(EPO)，其要求包含与EPO共价键合的PEG的特别的连接体， 在Nektar/La Roche公司的EP-B975369中描述了 PEG化的干扰素α，并且在Hoftnann La Roche公司的EP-B 1562634中描述了另一种PEG化的干扰素α。rhGH的体内清除被认为是通过下面两种机理发生的。第一种是肾清除，其中 rhGH是从循环中通过肾小球过滤清除的。rhGH的肾清除已被很好地证明，并且因此 合成的rhGH的PEG化是解决该问题的一个明显的选择。肾清除占rhGH总清除的约 25-53% (Girard，J.Mehls，O.J.Clin.Invest.1994 年 3 月；93(3) 1163-1171，本文参考文 献3) ο第二种机理是肝清除(肝脏)。GH的肝摄取是通过溶酶体降解后的受体介导的 胞吞作用而发生的。第三种机理是在其它组织(例如软骨的软骨细胞)中的受体介导的清除。通过 PEG化降低GH对GH受体的结合亲和力，从而减少受体介导的清除。但是，对于施用rhGH存在特有的问题。皮下施用rhGH的一个主要缺点是在接 受治疗的患者中发生脂肪萎缩。脂肪萎缩是用于脂肪组织局部丢失的医学术语。皮下施用rhGH制剂已经出现脂 肪萎缩问题，其被认为是由注射部位局部高浓度的生长激素复合物引起的。Bayakgebiz A.等人在 J.Pediatr.Endocrinol.Metab，1999 年 1-2 月；12(1) 95-7 中描述了此类医学记录(本文参考文献1)。这是一个由于6.7kb基因缺失引起单独GH 缺乏的患者的记录，该患者接受高剂量rhGH治疗并且在治疗6年后在注射部位发生了局 部脂肪萎缩，而没有任何抗体检测。人们怀疑脂肪萎缩的病因学是高剂量rhGH的直接脂 解作用。与施用rhGh相关的脂肪萎缩被认为是由于rhGH活性本身、更高浓度和延长的 暴露引起的。这些更高浓度发生在注射部位附近。在rhGH被PEG化的情况中，由于增加停留时间，高生长激素活性在注射部位附 近聚集的机会甚至更高。在PEG化的rhGH制剂的情况中，组织将经历持续并且增加暴 露于生长激素活性，这是由于这样一个事实PEG化的缀合物具有药理学活性所需的活 性，并且缀合物由于缀合物的大小而扩散有限。结果是增加了注射部位的脂解作用。WO-A 2005/079838描述了 PEG化的hGH，其中hGH部分通过氨基官能团连 接至聚乙二醇聚合物上，由于氨基的稳定性，其可以认为是永久的结合。此类PEG化的 hGH化合物的实例(其出现脂肪萎缩)是化合物PHA-794428。化合物PHA-794428是 PEG化的rhGH，并且还在Pharmacia公司(被Pfizer获得)的W0_A 2005/079838中描 述，并且进一步在 Horm.Res.2006 ； 65 (增刊 4): 1-213，CF1-98GH/IGF Treatment with title "Firstin-human study of PEGylated recombinant human growth hormone”(题为"PEG 化的重组人生长激素的首次在人类中的研究”的CF1-98GH/IGF治疗)，Philip Harris等 人(本文参考文献4)中描述。根据www.clinicaltrials.gov上公开的临床试验信息，该试验于2007年12月10日
结束。Pfizer决定终止该计划是由于在2期临床研究中在单独注射PHA 794428后报道注射部位脂肪萎缩的病例。WO-A 2006/102659 (Nektar)也描述并且提出了通过酰胺键形成的rhGH_PEG缀 合物(线性和分支类型)。在WO-A 2006/102659中所解决的问题描述于第2页第
段。根据该申请人，所解决的问题是减少给药频率。因为rhGH治疗典型地需要每天注 射，患者特别是儿科患者不喜欢这种不便和与该治疗有关的不适。Nektar的WO-A中描 述的方案是提供新的PEG-rhGH缀合物。在W0-A
的表6中，可以看出与没有PEG的天然生长激素相比， PEG-rhGH缀合物具有相对低的体外活性。尽管低的体外活性，PEG化的rhGH缀合物 在体内被活化。与阅读部分
相关“尽管初步的体外结果表明增加与hGH连接 的PEG的量降低其刺激hGH受体的能力，基于初步的体内结果，其表明生物活性的降低 超出增加半衰期和/或血浆利用度的平衡，因此得到一个结论当在相同的给药方案中 与未修饰的rhGH相比，本文提供的缀合物具有优良的药效学作用”。WO-A 2006/102659 (Nektar)没有描述可自动裂解的连接体_即简单观察到 PEG-rhGH缀合物在体内被活化，尽管它们的体外活性显著降低。脂肪萎缩的问题没有 解决。为了实现将所需的性质(降低脂肪萎缩和减少注射频率)设计到hGH的PEG化 的缀合物中，一种解决方法是应用前药方法。前药是在表现其药理学作用前经受生物转 化的任何化合物。因此，前药可以被视为是包含特别的无毒保护基的药物，这些保护基 是以暂时(transient)的方式用于改变或消除母体分子中不希望的性质。在这种情况下， 聚合物载体将暂时降低生长激素的活性，从而减少组织脂解作用的可能性。同时暂时缀 合至聚合物载体上将延长缀合物的半衰期，从而提供长效递送的hGH。文献中描述了很多大分子前药，其中大分子载体是通过不稳定的酯基连接至药 物上的(例如 Y.Luo，MR Ziebell，GD Prestwich，"A HyaluronicAcid-Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells (靶向癌细胞的透明质酸-紫杉醇抗肿瘤生物缀合 物)”，Biomacromolecules 2000，1，208-218 ； J Cheng 等人，Synthesis of Linear， beta-Cyclodextrin BasedPolymers and Their Camptothecin Conjugates (基于线性 β -环糊精 的聚合物和它们的喜树碱缀合物的合成)，Bioconjugate Chem.2003, 14，1007-1017 ； R.Bhatt 等人，Synthesis and in Vivo Antitumor Activity ofPoly (L-glutamic acid) Conjugates of 20 (S)-Campththecin(20 (S)-喜树碱的聚(L_谷氨酸)缀合物的合成与体内抗肿瘤活性)， J.Med.Chem.2003, 46，190-193 ； R.B.Greenwald, A.Pendri, C.D.Conover, H.Zhao, Y.H.Choe, A.Martinez, K.Shum, S.Guan, J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667 ； B.Testa, J.M Mayer, Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism (药物和前药代谢中的水 解)，Wiley-VCH, 2003，第8章)。在这些情况中，生物活性实体的缀合的官能团是羟 基或羧酸。特别是对于生物大分子但也对于小分子聚合物前药，希望将大分子载体连接至 生物活性实体的氨基(即N-末端或蛋白质的赖氨酸氨基)上。这将是一种情况，如果掩 蔽药物生物活性需要缀合生物活性实体的某个氨基，例如位于受体结合中涉及的活性中 心或区域或表位的氨基。同时，在制备前药的过程中，氨基可能是更具有化学选择性并 且用作缀合载体和药物的更好的柄，因为它们比羟基或酚基具有更大的亲核性。对于可能包含大量不同反应官能度的蛋白质而言，这特别正确。在这种情况中，无选择性的缀 合反应引起不希望的产物混合物，其需要广泛的表征或纯化并且可能降低反应产率和产 品的治疗功效。前药活化可以通过酶或非酶裂解载体和药物分子间的不稳定桥来实现，或两者 的连续组合，即酶解步骤之后进行非酶重排。在WO-A 2005/099768中描述了含有自动裂解的连接体的PEG化的连接体分 子，用于大量的生物分子，包括促生长素(权利要求6)。在W0-A2005/099768中，所解 决的问题是患者间的变异性，以及当涉及酶解机理时，前药活化的不可预知的作用(第 12页，第17-30行)。该申请描述了作为一种解决方法的芳族连接体，其可以基于PEG。 该连接体-PEG以显著降低药物活性的方式与药物结合。只有在释放药物时它才被活化， 其是通过水解开始的。水解速率可以以化学方法来控制。对于GH和相关问题、例如脂 肪萎缩没有具体强调。综上所述，以上提及的引文均没有描述基于前药缀合物来开发长效rhGH的方 法，所述的缀合物可以更少频率地施用而不增加脂肪萎缩的频率。因此，本发明的目的是提供前药或包含所述前药的药物组合物，应用与rhGH缀 合的PEG减少施用频率而不显著诱导脂肪萎缩。发明_既述因此，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还 包含人体内临床有效量的重组人生长激素rhGH PEG化的前药缀合物，其中PEG通过自 身可水解的(自动裂解的)暂时连接体与rhGH连接；所述的前药缀合物的特征在于(1)缀合物的GH活性小于不含PEG的天然生长激素的5% ；和(2)连接体自动水解速率是体内半衰期为10小时至600小时的速率。性质(1)确保前药具有低的脂肪萎缩发病率，尽管具有显著延长的体内作用时 间。不受理论限制，本发明人认为如果前药具有更高的GH活性，该产品将仍会以比目 前市售的rhGH产品更高的频率诱导脂肪萎缩。性质⑵确保rhGH(不含PEG)随时间逐渐释放，从而可以施用比人生长激素更 少频率的rhGH药物产品，例如仅每周一次或每月一次代替每天施用，而与rhGH相比仍 能保持全部功效。优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多 5倍，例如2、3、4或5倍。更优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合 物的体外半衰期短至多3倍。最优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合 物的体外半衰期短至多2倍或几乎相同。本发明应用于rhGH PEG化的前药，特别是rhGH PEG化的载体前药，包括级联
载体前药。前药可以定义为本身没有活性但是可预计转化为活性代谢物的治疗药物(参见 B.Testa, J.M Mayer Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism (药物和前药代谢中的水 解)，Wiley-VCH, 2003，第4页)。在载体前药系统中，当聚合物共价缀合至药物分子 时，很多药物是没有活性的或表现出降低的生物活性。在这些情况中，应用药物和载体 间暂时的连接，在这种方式中，药物在体内从聚合物载体上释放以恢复其生物活性。如果需要缓慢或可控释放药物，与释放的药物相比，降低生物活性的前药具有优势。在该 情况中，可以施用相对大量的前药而没有伴随的副作用和过量给药的风险。药物释放是 随时间发生的，从而减少重复且频繁施用药物的需要。在聚合物载体的前药中，生物活性部分通常是通过载体部分和药物分子的官能 团之间形成的不稳定的桥连接到聚合物载体部分的。载体前药的裂解产生增加生物活 性的分子实体(药物)和至少一种副产物，载体。该副产物可以是生物惰性的(例如 PEG)。裂解后，生物活性实体将露出至少一个之前缀合而掩蔽或保护的官能团，并且该 基团的存在典型地有助于生物活性。GH活性可以应用本领域已知的方法来测量。在这个方面，强调实施例1。基于 这样一个事实可用于本发明的某些暂时连接体可以具有小于3000小时的体外半衰期， 各自GH活性测量是通过测量包含替代暂时连接体的永久连接体的各自PEG缀合物的GH 活性来间接进行的。其可以如WO 2006102659第74页第0240段描述的那样进行，本 文描述的rhGH和缀合物的生物活性将应用NB2-II大鼠淋巴瘤细胞增殖分析进行体外评 价。简而言之，将衍生自大鼠淋巴瘤的NB2-II细胞与rhGH温育，其引起rhGH分子与 细胞表面的受体结合。受体结合诱导信号转导级联，从而引起细胞增殖。分析结果是基 于测定的蛋白质浓度和未修饰的rhGH的100%生物活性。优选的是，对于测量GH活性，应用实施例24中描述的方案。体外半衰期可以应用本领域已知的方法来测量。在这个方面，强调实施例2。因此，本发明的第二方面涉及临床有效量的包含第一方面的rhGHPEG化的前药 的药物组合物，其用于治疗人GH相关疾病的方法中。第二方面可以选择性地描述为治疗人GH相关疾病的方法，该方法包括给人施用 临床有效量的包含第一方面的rhGH PEG化的前药的药物组合物。在一种情况中，其中与天然的人GH相比，前药的剩余活性(对于暂时PEG缀 合的rhGH的情况)被显著降低，脂解作用可能不会发生，甚至在延长暴露时。本文描述称为rhGH PEG化的前药的化合物是缀合物，其与人GH相比具有显著 降低的剩余活性。为了显示治疗有用的活性，rhGH必须从前药缀合物中释放，对于这一 点，本文描述的前药需要经历活化步骤(例如1，6-释放机理)，本文称为自动裂解，将 PEG基团从药物中裂解。1，6-释放机理在WO-A 2005/099768中有很好的描述。不受理论的限制，本发明人认为本文公开的暂时PEG化的rhGH缀合物显著减少 了脂肪萎缩，因为在PEG通过可自动裂解的连接体逐渐裂解之前，PEG化的rhGH缀合 物具有低活性。这可以确保前药不会比人GH或上述的其它永久PEG化的rhGH化合物 更频繁地诱导脂肪萎缩。本发明潜在的问题也是通过包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AA)的人生长 激素ChGH)的前药缀合物的药物组合物来解决的hGH-NH-La-S° (AA)其中hGH-NH 表示 hGH 残基；La表示官能团，其是通过自动裂解诱导基团Ga而自身可水解的(可自动裂解)； 并且
S°是聚合物链，其分子量为至少5kDa并且包含至少第一个分支结构BS1，至少 第一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合物链S1，其中S°、BS1、 S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中分支结构BS1进一步包含至少 第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S2，或者S°、S1中至少一个包含至少第二个分支 结构BS2，所述的BS2包含至少第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S2，并且其中不含 hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa、优选至少25kDa并且 最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且最 大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更优选至少40kDa并且最大 90kDa。令人惊讶地发现，通过提供具有某最小长度(如它们分子量所定义的)的至少3 条链的聚合物载体，本发明的前药的剩余活性可以被有效地降低，从而与本文描述的暂 时连接体组合解决了提供hGH前药的问题，其可以更少频率地施用并且没有增加脂肪萎 缩的风险。因此，前药应当是水溶性的。对于至少双_缀合的前药，问题可以通过包含适合的药物赋形剂并且还包含式 (AB)的人生长激素ChGH)的前药缀合物的药物组合物来解决hGH-(NH-L-S0)n (AB)其中η 是 2、3 或 4;优选 2;
hGH (-NH) n 表示 hGH 残基；L各自独立地是永久官能团Lp或官能团ΙΛ其是通过自动裂解诱导基团Ga而自 身可水解的(可自动裂解)；并且S°各自独立地是分子量为至少5kDa的聚合物链，其中S°任选是分支的，包含至 少第一个分支结构BS1，至少第一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的 聚合物链S1，其中S°、BS1、S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中 不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa、优选至少25kDa 并且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且 最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更优选至少40kDa并且最大 90kDa。本发明的另一方面是以上定义的前药缀合物。本发明优选的实施方案在下面仅通过实施例描述。定义在讨论本发明详述的实施方案之前，提供关于本发明主要方面的特别术语的定 义。通常，本文所用的所有特别的技术术语应当被理解为技术人员将在本技术背景 中理解它们。rhGH或hGH或GH或hGH残基指的是人生长激素。NH_hGH是hGH残基， 其中-NH-hGH的-NH-表示hGH的氨基。本文的术语“活性”应当被理解为生长激素或其缀合物当施用于哺乳动物、 例如在体内模型中诱发生物学响应或在实施例描述的体外模型中产生可测量的响应的能力。在前药系统中，测量的活性将具有两个贡献，一个来自释放的游离药物实体， 并且另一个来自仍未裂解的前药缀合物。为了区分前药缀合物的活性，本文的术语“剩 余活性”应当被理解为可归于前药缀合物的测量的前药活性的部分。本文的术语“自动裂解”应当被理解为暂时连接体和药物分子rhGH之间的键 在水性缓冲溶液中在pH 7.4和37°C的生理条件下限速的水解裂解。自动裂解不需要存在 酶。该自动裂解或自身水解是提供自动裂解诱导基团控制的，所述的基团是前药分子的 部分。该自动裂解诱导基团可以以本身存在或者以掩蔽形式存在，以便在自身水解机制 启动前需要暴露。连接体自动水解速率指的是hGH-PEG化的前药在体内的裂解速率。由于酶或 其它作用几乎经常引起前药连接体体内水解比体外进行更快，如果前药的体内半衰期比 相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多5倍，那么将其定义为hGH PEG前 药以自动水解方式裂解。本文的术语“暂时连接”或“暂时连接体”应当被理解为描述rhGH PEG化的 前药中PEG和rhGH之间连接的不稳定性。在这种暂时连接中，rhGH从相应的前药中 释放，其体内连接体半衰期为至多1200小时。本文的术语“缀合物”应当被理解为共价键合至本文的药物(人生长激素)的 一种或多种PEG分子。术语“暂时缀合物”指的是包含至少一个暂时连接的hGH PEG化的前药。术语“永久缀合物”指的是hGH PEG化的缀合物或前药，其中PEG聚合物是 通过具有体外半衰期为至少3000小时的连接结合到hGH上。体外半衰期或体外连接体半衰期是在pH 7.4和37°C的缓冲液中从hGH PEG化的 前药中释放50%的hGH。术语“体内半衰期”或“体内连接体半衰期”应当被理解为在施用于人体后其 中50%的最初比例的生长激素从hGH PEG化的前药中释放的时间间隔，其是通过考虑如 实施例2中描述的化合物相应的缀合物半衰期来计算的。术语“缀合物半衰期”应当被理解为其中50%的以上定义的hGHPEG化的永久 缀合物从血液循环中清除的时间间隔。本文的术语“脂肪萎缩”应当被理解为用于脂肪组织局部丢失的医学术语。在 本文中，“脂肪萎缩”指的是注射部位脂肪萎缩，这意味着组织脂解发生在靠近注射部 位。本文的术语“前药”应当被理解为在显示其全部药理学作用前经历转化的任 何化合物。IUPAC定义下给出了前体系统的分类(http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/ medchem，2004 年 3 月 8 日接入)前药前药是在显示其药理学作用前经历生物转化的任何化合物。因此，前药可以被 认为是包含特别的无毒保护基的药物，所述保护基以暂时的方式用于改变或消除母体分 子中不希望的性质。双重前药(或前_前药)
双重前药是在体内分两步(酶和/或化学方式)转化为活性物质的生物无活性分子。载体连接的前药(载体前药)载体连接的前药是包含给定的活性物质与暂时载体基团的暂时连接的前药，所 述的暂时载体基团产生改善的物理化学或药物动力学性质，并且其易于体内消除，通常 是通过水解裂解。级联前药级联前药是其中载体基团的裂解仅在暴露活化基团后变成有效的前药。生物转化生物转化是物质通过活有机体或酶制剂的化学转化。相应地，级联自动水解诱导基团仅在暴露某些自动水解诱导结构元件后变成有 作用。为了暴露自动水解诱导结构元件，需要一个或多个级联暴露步骤。至少一个暴露 步骤可以基于生物转化步骤。术语“包含人体内临床有效量的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药的药物组 合物”应当被理解为在将药物组合物施用于人后足够高以在人体内获得所需临床作用的 量，例如与治疗GH相关疾病有关的所需的临床作用。在本文中，技术人员通常能够调 整所施用的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药的量，以获得所需的临床作用。本文的术语“生理条件”应当被理解为与人体的pH和温度条件相同或相似的 任何体外或体内条件。更特别的是，生理条件指的是在约pH 7.4 (pH 6.8至pH 7.8)和约 370C (35°C至 40°C )的条件。术语“连接体”频繁地用于生物缀合领域的出版物中并且广义地描述用于连接 两个分子实体的化学结构。这种连接可以是永久的或暂时的。暂时连接体是其中药物与PEG分子的缀合是可逆的连接体。这意味着连接体的 裂解释放天然和活化形式的药物。对于载体前药，特别是如果聚合物是永久与连接体结 合并且因此连接体相关的降解产物不是作为前药裂解的结果而释放的，在结构上区分暂 时连接体单元和聚合物载体可能是困难的。如果连接体既是自动裂解诱导基团又是分支 单元，连接体的结构特征甚至更加具有挑战性。因此，在本发明的含义中，术语连接体 可以与官能团La和自动裂解诱导基团Ga的组合同义应用。在其中载体是分支的PEG的 所述的载体前药的情况中，优选应用基于La和Ga组合的结构描述。在这种情况下，裂 解诱导基团Ga被认为是载体聚合物的部分。Ga的化学性质的变化在很大程度上使相应的 载体连接的前药的自身裂解性质得以设计。术语“永久连接体”指的是PEG通过形成脂族酰胺或脂族氨基甲酸酯而与 hGH-提供的伯氨基缀合。如果应用常规的PEG化试剂，产生的缀合物通常对于水解是 非常稳定的，并且对于前药系统中的治疗用途而言，酰胺或氨基甲酸酯键的裂解速率将 非常缓慢。但是，这种永久连接体缀合物用于研究前药缀合物的治疗用途，因为它们可 用于评价剩余活性。如果这种稳定的连接被用于前药方法中，在治疗应用的时间内没有酶催化，官 能团的裂解是不可能的。术语“水溶性前药”指的是在生理条件下溶于水的前药。典型的是，水溶性前药将透射至少75%、更优选至少95%的相同溶液在过滤后透射的光。按重量计，水溶性 聚合物优选至少约35% (重量)溶于水，仍然更优选至少约50% (重量)，仍然更优选 至少约70% (重量)，仍然更优选至少约85% (重量)，仍然更优选至少约95% (重量) 或完全溶于水。本文所用的术语“PEG”或“PEG化残基”用于例证以重复单元为特征的适合 的水溶性聚合物。适合的聚合物可以选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙 烯醇、聚％唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯 酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰 基丙烯酸酯和聚酯。PEG链可以包含相互连接的部分、聚合物部分和末端基团。在hGH PEG化的前药的分支的单缀合物的情况中，临界距离规定为连接的原子 所测量的PEG链S°与La的连接部位与第一个分支结构BS1之间的最短距离。本文的术语“PEG载量”应当被理解为包含连接至hGH的多个重复单元的聚合 物链的分子质量的描述。总的PEG载量应当被理解为在分子基础上连接至hGH的所有 聚合物载体的总的分子质量。发明详述包含适合的药物赋形剂的药物组合物技术人员已知药物组合物包含可药用赋形剂和/或载体。“可药用的”指的是包括任何赋形剂和/或添加剂，其不干扰活性成分的生物学 活性的功效并且其对于所施用的宿主是无毒的。在优选的实施方案中，药物组合物是皮下施用、肌内施用或静脉内注射的组合 物。对于治疗本文描述的相关障碍/疾病，这是优选的施用途径的实例。药物组合物可以包含除本文描述的rhGH PEG化的前药之外的其它活性成分。重组人生长激素(rhGH)由于重组人GH在序列上与天然人GH是相同的，本文的术语重组人生长激素 (rhGH)还涉及所谓的生物仿制药(biogenerics)等同物。因此，术语rhGH和hGH在本 发明的含义中可以同义应用。本文的术语“生物仿制药”应当被理解为仿制形式的生物药物；应用生物方 法，通常通过现代生物技术活动开发的分子。仿制化学药物可以被定义为当与发明人产 品相比时，具有基本上类似活性、基本上化学等同于它们市售相似物、生物等价的、在 专利过期后通过简短的程序获得上市许可的那些分子。技术人员已知现在常规工作是制备例如较少氨基变化的感兴趣的生物制品(本 文是GH)而不显著影响生物制品的活性。除了重组人和生物仿制药，术语重组人生长激素(rhGH)在本文还涉及所有可能 的rhGH多肽。在Pharmacia Corporation 的 WO_A 2005/079838 第 15 页第 0043 段至且包括第 0053段中给出了可能的rhGH多肽的准确描述。本文所用的术语“hGH多肽或hGH蛋白质”包括所有的hGH多肽，优选来自哺 乳动物物种，更优选来自人和鼠科动物物种，以及它们的变体、类似物、直向同源物、同系物和衍生物以及其片段，其特征在于促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合 成代谢和脂质代谢。术语“hGH多肽或蛋白质”优选表示具有A丄.Grigorian等人， ProteinScience(2005), 14，902-913中公开的序列的22kDa hGH多肽以及其变体、同系
物和衍生物，其显示出基本上相同的生物活性(促进生长期的生长和维持正常的身体组 分、合成代谢和脂质代谢)。更优选的是，术语“hGH多肽或蛋白质”指的是具有准确 的上述序列的多肽。hGH的衍生物特别包括hGH前药缀合物，其包含永久连接的聚合物，例如 PEG,即本发明的前药可以包含除一种或多种暂时连接体聚合物缀合物之外的进一步的 永久连接体聚合物缀合物。本文所用的术语“hGH多肽变体”指的是来自相同物种但是与参考hGH多肽 不同的多肽。通常，差别是有限的，以致参考和变体的氨基酸序列整体是非常相似的并 且在很多区域是相同的。优选的是，hGH多肽至少70%、80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%等同于参考hGH多肽，优选hGH多肽具有A丄.Grigorian等人，Protein Science(2005), 14，902-913中所示的序列。由于多肽的氨基酸序列至少例如95% “等 同”于查询的氨基酸序列，可预期的是主题多肽的氨基酸序列等同于查询的序列，除 了主题多肽序列可能包括至多5个氨基酸改变(在查询的氨基酸序列的每100个氨基酸 中)。参考序列的这些改变可能发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端或这些末端位置 之间的任何地方，单独散布在参考序列的残基中或散布在参考序列的一个或多个邻近基 团中。查询的序列可以是参考序列的全部氨基酸序列或者本文描述的任何特别的片段。此类hGH多肽变体可以是天然存在的变体，例如天然存在的等位基因变体(其 是通过占据生物体的染色体的给定基因座的数个交替形式的hGH之一编码的)，或同种 型(其是通过天然存在的源于单个初级转录物的剪接变体编码的)。可选择的是，hGH 多肽变体可以是不确定是否天然存在并且可以用领域已知的诱变技术制备的变体。本领域已知一个或多个氨基酸可以从生物活性肽或蛋白质的N-末端或C-末 端删除，而基本上不丢失生物功能(参见例如Ron等人，(1993)，BiolChem.， 2682984-2988，将该公开的全部内容并入本文作为参考)。本领域技术人员还认为hGH多肽的某些氨基酸序列可以是不同的而不显著影响 蛋白质的结构或功能。此类突变包括根据本领域已知的通用规则所选的缺失、插入、 倒位、重复和取代，以便对活性产生较小影响。例如，在Bowie等人(1990)，Science 247 1306-1310中提供了关于如何制备表型沉默氨基酸取代的指南，将其全部内容并入 本文作为参考，其中作者指出了研究氨基酸序列对改变的耐受的两种主要方法。第一种方法依赖进化过程，其中突变是被天然选择接受的或拒绝的。第二种方 法应用基因工程，在克隆的hGH的特别位置引入氨基酸改变并且选择或筛选以鉴定维持 功能的序列。这些研究表明蛋白质令人惊讶地耐受氨基酸取代。作者进一步指出氨基酸 改变在蛋白质的某些位置可能是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性侧 链，但是表面侧链的一些特征通常是保守的。在上文的Bowie等人(1990)以及其中引用 的参考文献中描述了其它的此类表型沉默取代。典型地所见的保守取代是脂族氨基酸Ala、VaL Leu和Phe间的互相代替、残基Ser和Thr的羟基互换、酸性残基Asp和Glu的互换、酰胺残基Aot和Gln之间的取代、 碱性残基Lys和Arg的互换以及芳族残基Phe、Tyr之间的代替。另外，下列氨基酸组通 常表示等价改变(l)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn> Ser、Thr ； (2)Cys、Ser、 Tyr、Thr ； (3) VaL lie、Leu、Met、Ala、Phe ； (4)Lys、Arg> His ； (5) Phe、Tyr、 Trp、His。术语hGH多肽还包括由hGH类似物、直向同源物和/或物种同系物编码的所有 hGH多肽。本文所用的术语“hGH类似物”指的是不同的和不相关的有机体的hGH，其 在各自的有机体中表现出相同的功能，但是其不是源于有机体祖先共有的祖先结构。代 替地，类似的hGH单独出现，后来进化表现出相同的功能(或类似的功能)。换言之， 类似的hGH多肽是具有非常不同的氨基酸序列但是表现出相同的生物活性(即在促进生 长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代谢)的多肽。本文所用的术语
“hGH直向同源物”指的是两种不同的物种内的hGH，其序列通过祖先物种中共有的同 源hGH而互相关联，但是其已经进化变成互相不同。本文所用的术语“hGH同系物”指 的是不同有机体的hGH，其在各自的有机体内表现出相同的功能，并且其源于有机体祖 先共有的祖先结构。换言之，同系hGH多肽是具有非常相似的氨基酸序列的多肽，其表 现出相同的生物活性，即促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代 谢。优选的是，hGH多肽同系物可以定义为多肽表现出至少40%、50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%等同于参考hGH多肽，优选具有以上提及 的序列的hGH多肽。因此，hGH多肽可以是例如(i)其中一个或多个氨基酸残基是用保守的或非保 守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的，并且这种取代的氨基酸残基可能是或 可能不是由遗传密码编码的；或Gi)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基；或Gii)其 中hGH多肽是与另一种化合物融合的，所述的化合物例如增加多肽半衰期的化合物(例 如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸是融合到以上形式的多肽上的，例如IgG Fc融 合区肽或者前导或分泌序列或者用于纯化以上形式的多肽的序列或者蛋白质序列。hGH多肽可以是单体或多聚体。多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体或包含 至少5个单体多肽单元的多聚体。多聚体还可以是同二聚体或异二聚体。多聚体可以是 疏水、亲水、离子和/或共价联合的结果，和/或可以是间接连接的，通过例如脂质体形 成。在一个实例中，共价联合是在包含hGH多肽或其片段的融合蛋白中所包含的异源序 列之间(参见例如美国专利号5,478,925，将该公开的全部内容并入本文作为参考)。在 另一个实例中，hGH多肽或其片段是连接到一种或多个多肽上，所述的多肽可以是hGH 多肽或通过肽连接体形成的异源多肽，例如US.5,073,627中描述的那些(将其并入本文作 为参考)。制备多聚体hGH多肽的另一种方法涉及应用融合到已知促进蛋白质的多聚化的 亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列上的hGH多肽，其中发现应用本领域技术人员已知 的技术包括WO 94/10308的教导。在另一个实例中，hGH多肽可以通过含有f^ag
多肽序列的融合hGH多肽中所含的F丨ag 多肽序列之间的相互作用而联合。hGH多聚 体还可以应用本领域已知的化学技术来产生，例如应用连接分子交联和本领域已知的连接体分子长度优化技术(参见例如US 5,478,925)、本领域已知的在位于多聚体中包含的 所需的多肽序列内的半胱氨酸残基间形成一个或多个分子内交联的技术(参见例如US 5,478,925，将半胱氨酸或生物素添加到hGH多肽的C_末端或N_末端)，以及产生包含一 个或多个这些修饰的多肽的多聚体的技术(参见例如US 5,478,925)，或者产生包含hGH 多聚体的脂质体的30种技术中的任何一种(参见例如美国专利号5,478,925)，将该公开的 全部内容并入本文作为参考。本文所用的术语“hGH多肽片段”指的是包含hGH多肽的连续跨度的部分氨基 酸序列的任何肽或多肽，优选具有以上提及的序列的多肽。rhGH PEG化的前药_优诜的PEG,聚合物链如上所述，本文描述的rhGH PEG化的前药应该具有相对低的活性。因此，在一个优选的实施方案中，每个生长激素分子的总的PEG载量总计至少 25kDa。通常，总的PEG载量将小于lOOOkDa。优选的是，PEG载量为至少25kDa并 且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且 最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大lOOkDa、甚至更优选至少40kDa并且最大 90kDa。PEG可以通过一个或多个锚定点与hGH连接。在一个锚定点的情况中，hGH PEG前药单缀合物中的相应PEG将是分支的并且包含至少3条链。在多于一个锚定点的 情况中，例如双缀合物，hGHPEG前药中的相应PEG可以是分支的或线性的。双缀合 物可以包含一个或两个暂时连接，并且PEG可以是线性的或分支的或者包含一个线性链 和一个分支链的混合物。在这种情况中，双缀合物包含一个暂时连接以及一个线性链和 一个分支链，暂时连接可以在其中任一链上。在这种情况中，应用分支的PEG链，可以 存在一个或多个分支单元。分支的PEG是包含连接两条或多条PEG链的分支点的PEG分子，从而与连接 生长激素的一个锚定点形成分子。其可以是两条20kDa的PEG链，连接形成一条分支的 40kDa的PEG分子。在其中分子包含两个或三个分支点的情况中，该分子分别表示具有 3和4个臂的PEG。总之并且在以上提及的限制内，PEG聚合物不限于特别的结构并且可以是线性 的、分支的或多个臂的(例如叉状PEG或与多元醇核连接的PEG)、树枝状的或含有可降 解的连接体。不受理论的限制，PEG载量旨在提供适合的分子质量，从而获得所需的相对低 的活性，并且不含有太高分子质量的PEG，太高分子质量的PEG可能导致其它问题。对天然人GH进行PEG化可以发生在数个赖氨酸基团上或者发生在N-末端胺 上(Fl)，如Clark等人(本文参考文献2)的第21973页表III所描述的。高度反应性是 位点Fl和LYS-140。中度反应位点是LYS-115、LYS-38和LYS-70。弱反应性是位点 LYS-172、LYS-41、LYS-158 和 LYS-168。在更通用的术语中，在本文中与暂时连接体组合应用的PEG可以通过适合选择 所述的聚合物来降低脂肪萎缩的风险。但是，本发明的原理还适用于除PEG之外的聚合 物。因此，术语PEG在本文中仅用作适合聚合物的实例。因此，在优选的实施方案中，hGH PEG前药是伯胺基团之一与聚合物链S°的可
23自动裂解的官能团La缀合的单缀合物。该聚合物链S°的分子量为至少5kDa并且包含至 少一个分支结构BS1。分支结构BS1包含第二个聚合物链S1，其分子量为至少4kDa。如上所述，需要至少第三个聚合物链S2，其分子量为至少4kDa。聚合物链S2可 以是BS1的部分或者可以是S°或S1的进一步的分支，从而引起进一步的分支结构BS2， 其包含S2。在本发明的前药缀合物中存在任选多于3条聚合物链，例如4、5、6、7或8 条。但是，每条进一步的聚合物链的分子量为至少4kDa。聚合物链的总数是受前药缀 合物的总重量(最大IOOODa(不包含hGH-NH))限制。因此，本发明优选的实施方案涉及组合物，其中分支结构BS1、BS2中至少一个 包含进一步的第四条聚合物链S3，其分子量为至少4kDa，或者S°、S1、S2之一包含第三 个分支结构BS3，其包含至少第四条聚合物链S3，其分子量为至少4kDa。分支结构或聚合物链之一包含自动裂解诱导基团G%其是La的自动裂解所必需 的。任选的是，分支结构之一用作基团G%从而分支结构包含Ga(代替包含所述的 基团)，其也包括在术语“包括”中。前药缀合物(AA)的制备通常产生缀合物的混合物，其中hGH的数个伯胺基团 缀合，引起不同的单缀合的、不同的双缀合的、不同的三缀合的等前药。相应的单缀 合、双缀合或三缀合的hGH PEG前药可以通过本领域已知的标准方法来分离，例如柱色
；並妹绝 te広寸。在hGH PEG前药的单缀合物中，至少三条聚合物链S°、S1、S2包含“聚合物 部分”，其特征在于一个或多个重复单元，这些重复单元可以是随机的、嵌段的(block wise)或交替分布的。另外，至少三条聚合物链S°、S1、S2显示末端基团，其典型的是 氢原子或具有1至6个碳原子的烷基，其可以是分支的或不分支的，例如甲基，特别是对 于基于PEG的聚合物链，弓丨起所谓的mPEG。需要指出的是，在至少三条聚合物链S°、S1、S2中的聚合物部分可以进一步含 有链样取代基，其源于重复单元并且引起具有小于4kDa分子量的链，并且不认为该链是 聚合物链S°、S1、S2等。优选的是，至少三条聚合物链S°、S1、S2具有小于IOOODa分 子量的取代基。S0的相关结构特征是其临界距离。临界距离定义了连接的原子所测量的S°与 La的连接位点与第一个分支结构BS1之间的最短距离。临界距离的长度对剩余活性有影 响，如化合物33所讨论的。临界距离优选小于50、更优选小于20、最优选小于10。至少三条聚合物链S°、S1、S2典型地各自含有互连部分。在至少一个互连部分 中存在Ga。对于除S°之外的聚合物链，互连部分是连接例如S1的聚合物部分与BS1以及 S2的聚合物部分与BS2的结构元件。对于S°，互连部分是连接La和BS1的结构元件。互连部分可以包括CV5tl烷基链，其是分支的或不分支的并且其任选被杂原子 或官能团间断或终止，所述的杂原子或官能团选自-O-、-S-、N(R), C(O), C(O) N(R), N(R)C(O), 一个或多个碳环或杂环，其中R是氢或CV2tl烷基链，其任选被一个 或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步含有氢作为末端原子；并且其中碳环是苯 基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3,环烷基；并且其中杂环是4至7元杂环基
24或9至11元杂二环基。“C3_1(l环烷基”或“C3_1(l环烷基环”表示含有3至10个碳原子的环烷基链， 其可以含有至少部分饱和的碳-碳双键，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己 烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。环烷基碳上的每个氢可以被取代基代替。术 语“C3_1(1环烷基”或“C3_1(1环烷基环”还包括桥连的二环，例如降冰片烷(norbonane) 或降冰片烯(norbonene)。“4至7元杂环基”或“4至7元杂环”表示含有4、5、6或7个环原子的环， 其可以含有至多最大数量的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不 饱和的)，其中至少一个环原子至至多4个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫 (包括-S(O)-、-S(O)2-),氧和氮(包括=N(O)-)，并且其中环是通过碳或氮原子与分 子的其它部分连接的。4至7元杂环的实例是氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、 呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、唑、，悉唑啉、异％ 唑、异％唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四 氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、巧 1、唑烷、异^1、唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑 烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、 哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂革或高哌嗪。“9至11元杂二环基”或“9至11元杂二环”表示含有9至11个环原子的两 个环的杂环系统，其中至少一个环原子被两个环共享并且其可以包含至多最大数量的双 键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原 子至至多6个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-),氧 和氮(包括=N(O)-),并且其中环通过碳或氮原子与分子的其它部分连接。9至11元 杂二环的实例是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并异&恩唑、苯 并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二 氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并 氮杂革、嘌呤或蝶啶。术语9至11元杂二环还包括两个环的螺环结构，例如1，4-二氧 杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷，或者桥连的杂环，例如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。碳环、杂环和杂二环可以被CV2tl烷基取代，任选被杂原子或官能团间断或终 止，所述的杂原子或官能团选自-O-、-S-、N(R)、C(O)、C (O) N (R) > N(R)C(O), 其中R是氢或C1,烷基链，其任选被一个或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步 含有氢作为末端原子。至少三条链S°、S1、S2的聚合物部分形成链的主要部分，优选至少90%的每条 链的分子量、更优选至少95%、甚至更优选至少97.5%、甚至更优选至少99%。因此， 链的主要部分是由聚合物部分来表示的。优选的是，至少三条链S°、S1、S2独立地基于聚合物，所述的聚合物选自聚烷 氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚P恶唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳 酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机 磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。优选的是，至少三条链S°、S1、S2是基于相同的聚合物。优选的是，至少三条
25链S°、S1、S2是基于聚烷氧基聚合物。甚至更优选的是，至少三条链S°、S1、S2基于聚
乙二醇。相应地，也适用于进一步的链S3、S4、S5等。链S°包含分支结构BS1，从而S1与S°连接。对于S2的连接，可以应用分支结 构BS1或存在进一步的分支结构BS2，其可以是S°或S1的部分。因此，当存在进一步的 链时，可以存在进一步的分支结构。例如，在存在链S3的情况中，其可以与BS1、BS2 或分支结构BS3连接。分支结构BS3，如果存在，可以是S°、S1或S2的部分。通常，可以应用允许分支的链的任何化学实体。优选的是，分支结构独立地选 自至少3-倍取代的碳环、至少3-倍取代的杂环、叔碳原子、季碳原子和叔氮原子，其中 术语碳环和杂环如上面所定义的。rhGH PEG化的前药-晳时连接体结构，La、Ga在本领域的出版物中，自动裂解诱导基团有时被称为连接体，以区分它们与载 体的结构。但是，通常难以清楚地分离这些结构特征。因此，在本发明的含义中，裂解 诱导基团Ga被认为是载体S的部分，所述的载体S包含至少S°、S1、S2、BS1和任选的 BS2。Ga化学性质的变化在很大程度上使得相应载体连接的前药的自我裂解性质得以设 计。如上面所讨论的，PEG化的前药，其中药物是例如专利申请W0-A2005/099768 中描述的rhGH，并且具有释放特征，其中其被描述为1，6裂解系统，而没有产生有毒 的芳族化合物。在该文献中，广泛描述了很多相关的适合的暂时连接体结构，以获得感 兴趣的相关释放分布。其它暂时连接体结构通常/广泛描述于例如其它复杂生物系统 GmbH 申请中，例如 WO-A 2005/034909、WO-A 2005/099768、WO-A 2006/003014 和 W0-A2006/136586 ο在例如WO-A 99/30727 (Enzon Inc)中广泛描述了更多的暂时连接体结构。为了解决本文讨论的GH的问题，本发明已经选择了适合的优选的暂时连接体结 构，以获得本文描述的rhGH PEG化的前药的相关的功能性质。基于本文详述的优选的 连接体结构，在技术人员的知识范围内可以制备其它适合的优选的暂时连接体结构，其 可以得到具有本文描述的相关功能性质的rhGH PEG化的前药。特别的是，可以选择适合的暂时连接体结构(其是可自身水解的(可自动裂解)) 掺入至s°。下面详细描述本文所选的连接体结构。理想的是，本发明的缀合物将具有一种或多种以下特征和/或优于目前rhGH缀 合物或制剂的优点可以易于以高产率合成、半衰期在优选的范围内、可以纯化以提供 均勻的缀合物组合物、在自动裂解后表现出活性，例如体外和体内活性，并且具有优于 未修饰的rhGH和先前描述的rhGH缀合物的药效学作用并且不引起脂肪萎缩。本文描述 的结构表现出本文所需的释放性质。通常，载体连接的前药需要存在连接药物和载体的可裂解的官能团。在缺乏自 动水解诱导基团的情况中，涉及药物提供的氨基(例如脂族酰胺或氨基甲酸酯键La)的官 能团通常对于水解是非常稳定的，并且酰胺键的裂解速率对于前药系统中的治疗用途将 非常缓慢。如果此类稳定连接被用于载体连接的前药中，在没有生物转化的治疗应用期间，官能团的裂解是不可能的。在这些情况中，连接体显示出结构基序，其作为底物被 相应的内源性酶识别。在这种情况中，官能键La的裂解涉及包含酶的复合物。实例是 肽连接体，其被内源性蛋白酶识别并且酶解。酶的水平在个体间显著不同，这导致通过酶裂解引起的前药活化的生物学差 异。酶的水平还取决于施用部位而不同。例如已知在皮下注射的情况中，身体的某些区 域产生比其它区域更可预料的治疗作用。这种高水平的患者间变异性是不希望的。另 外，对于这种酶-依赖的载体连接的前药，难以建立体内-体外药物动力学性质的对应关 系。在缺乏可靠的体内-体外对应关系时，优化释放分布变成一项麻烦的工作。为了避免患者间和注射部位的变异性，需要应用载体连接的前药，其在治疗应 用时期内表现出裂解动力学而无需额外的酶帮助裂解。特别是对于高分子量载体，特别 是对于分支的聚合物载体，对于酶由于空间位阻，获得连接官能团La可能受到限制。因 此，需要设计表现自身裂解性质的载体连接的前药。自动裂解动力学可以例如通过在不含酶的缓冲溶液中记录水解速率来体外测定。为了将水解不稳定性引入到官能团L(例如酰胺或氨基甲酸酯)中，需要将结构 化学组分设计到载体中，以发挥作用，例如作为接近官能团的邻近基团。此类自动裂解 诱导化学结构(其对前药酰胺键的可裂解性产生控制)称为自动裂解诱导基团Ga。自动 裂解诱导基团可以对给定的官能团La的水解速率具有很强的作用。优选的La选自C (O)-O-和C(O) _，其与hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或 酰胺基团。因此，优选本发明的组合物，其中La选自C(O)-O-和C(O)-，其与hGH的伯 氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基团，产生式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (O) O-S0 (AAl)hGH-NH-C (O) -S0 (AA2)以下部分将列出多种结构组分，其可以用作裂解诱导基团Ga。基团Ga表示自动裂解诱导基团。Ga可以以本身存在或者作为级联自动裂解诱导 基团存在，其是暴露的以通过另外的水解或酶裂解步骤变得有效。如果Ga以本身存在， 其控制La的限速自动水解。Ga的实例A.J.Garman 等人(A.J.Garman，S.B.Kalindjan, FEBS Lett.1987, 223(2)， 361-3651987)将PEG5000-马来酸酐用于组织型纤溶酶原激活物和尿激酶中氨基的可逆 修饰。PEG-uPA缀合物的功能酶的再生是在pH7.4缓冲液中温育，通过裂解马来酰胺酸 连接，一级动力学半衰期为6.1小时。单一的芳族部分可能意味着连接的氨基甲酸酯键的不稳定性 (WO-AOl/47562)。例如，在前药方法中应用取代的或未取代的芴基甲基，使得氨基甲 酸酯连接对多种生物活性试剂不稳定(Tsubery等人，J Biol Chem 279 (2004) 38118-24)。 在WO-A 2007/075534中两条PEG链与芴基部分连接。因此，Ga是直接与氨基甲酸酯官能团La连接的芳族环或芴基甲基。因此，优选本发明的组合物，其中Ga是直接与由La和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯官能团连接的芳族环或芴基甲基。可选择的是，Ga的转化可以诱导S°内的分子重排，例如1，4或1，6-消除。该 重排使得La非常不稳定以至于被诱导裂解。Ga的转化是级联机制中的限速步骤。理想 的是，暂时连接的裂解速率等同于给定的治疗方案中药物分子预期释放速率。在这种基 于1，6-消除的级联系统中，需要La的裂解在其不稳定性被Ga的转化诱导后基本上是同 时发生的。另外，需要限速裂解动力学是在治疗应用期间进行，而无需另外的酶帮助， 从而避免以上讨论的与大部分酶裂解相关的缺点。R.B.Greenwald, A.Pendri, C.D.Conover, H.Zhao, Y.H.Choe, A.Martinez, K.Shum, S.Guan, J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667 和 PCT 专利申请 WO-A 99/30727 描述了合成含氨基小分子化合物(基于1，4-或1，6-苄基消除)的聚乙二醇前药的方 法。在该方法中，药物分子的氨基是通过氨基甲酸酯基团与PEG化的苄基部分连接的。 聚乙二醇通过酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键与苄基连接。药物分子中PEG的释放是 通过自动水解和酶裂解的组合来发生的。在该方法中，释放触发掩蔽基团的裂解之后是 经典的且快速的1，4-或1，6-苄基消除。该连接体系统还用于蛋白质的可释放的聚乙 二醇缀合物(S丄ee，R.B.Greenwald 等人.Bioconj.Chem.2001，12(2)，163-169)。将溶 菌酶用作模型蛋白，因为当PEG化发生在赖氨酸残基的氨基时其失去其活性。多 种量的PEG连接体与蛋白质缀合。PEG缀合物中天然蛋白质的再生发生在大鼠血浆中 或发生在非生理的高pH缓冲液中。还参见F.M.H.DeGroot等人(WO_A 2002/083180和 W0-A2004/043493)和 D.Shabat 等人(WO-A 2004/019993)。因此，La是氨基甲酸酯官能团，所述基团的裂解是通过Ga的羟基或氨基经S°的 1，4-或1，6-苄基消除来诱导的，其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经 历限速转化。事实上，Ga可以通过水解裂解。因此，优选本发明的组合物，其中La与hGH的氨基一起形成氨基甲酸酯官能 团，所述基团的裂解是通过Ga的羟基或氨基经S°的1，4-或1，6-苄基消除来诱导的， 其中Ga包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经历限速转化。Ga可以包含由Ga组分激活的级联裂解系统，其包括代表上述前体的结构组合。 Ga的前体可以包含另外的暂时连接，例如酰胺、酯或氨基甲酸酯。前体的暂时连接(例 如氨基甲酸酯)对水解的稳定性或敏感性可以由自动水解性质控制或需要酶活性。Antczak 等人(Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48)描述了一种试剂，对于含胺的 药物分子，其形成了大分子级联前药系统的基础。在该方法中，抗体用作载体，稳定的 键将抗体与活化的基团连接，带有可裂解的掩蔽基团。在除去酯连接的掩蔽基团后，La 裂解并且释放药物化合物。D.Shabat等人(Chem.Eur.3.2004，10，2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基团的
聚合物前药系统。在该系统中，掩蔽基团是通过氨基甲酸酯键与活化基团连接的。活化 基团通过酰胺键与聚丙烯酰胺聚合物永久缀合。通过催化抗体活化掩蔽基团后，掩蔽基 团通过环化裂解并且释放药物。药物释放后，活化基团仍然与聚丙烯酰胺聚合物连接。M.-R丄ee 等人(Angew.Chem.2004，116，1707-1710)描述了基于扁桃酸活化基 团和酯连接的掩蔽基团的类似前药系统。但是，在这些连接中，1，6消除步骤仍然产生高活性芳族中间体。即使芳族部分与聚合物载体保持永久连接，也可能引起潜在毒性或免疫原性作用的副反应。Greenwald等人在2000年公开了基于三甲基锁合内酯化作用的含氨基的前药 的聚乙二醇药物递送系统(R.B.Greenwald 等人，J.Med.Chem.2000, 43(3)，457-487 ； WO-A 02/089789)。在该前药系统中，取代的邻-羟基苯基-二甲基丙酸通过酰胺键与 药物分子的氨基偶联。羟基通过酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团与PEG连接。药物释放 的速率确定步骤是内酯化作用(释放芳族内酯副产物)的快速酰胺裂解后的这些官能团的 酶裂解。最近，R.B.Greenwald等人(Greenwald 等人，J.Med.Chem.2004，47，726-734) 描述了基于双-(N-2-羟基乙基)对羟苯基甘氨酸酰胺(N-二(羟乙基)甘氨酸酰胺)连 接体的PEG前药系统。在该系统中，两个PEG分子与N-二(羟乙基)甘氨酸分子(其 与药物分子的氨基偶联)连接。在前药活化中第一个两步是两个PEG分子的酶裂解。所 述的PEG和N-二(羟乙基)甘氨酸之间不同的连接引起不同的前药活化动力学。该系 统的主要缺点是与药物分子缀合的N-二(羟乙基)甘氨酸的缓慢水解速率(在磷酸缓冲 液中t1/2 = 3小时)，这引起N-二(羟乙基)甘氨酸修饰的前药中间体的释放，与母体药 物分子相比，这可能表现出不同的药物动力学和药效学性质。更特别的是，对于S°，以下描述了具有特别间隔部分的优选的基团La和Ga。根据WO-A 2005/099768，优选的结构选自通式⑴和(II)
权利要求
1.药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含人体内临床有效量 的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药缀合物，其中PEG通过自身可水解(自动裂解) 的暂时连接体与rhGH连接；所述的前药缀合物的特征在于(1)缀合物的GH活性小于不含PEG的天然生长激素的5%；并且(2)连接体自动水解速率是体内半衰期为10小时至600小时的速率。
2.权利要求1的药物组合物，其中自动水解速率是体内半衰期比相应的hGHPEG化 的前药缀合物的体外半衰期短至多5倍的速率。
3.权利要求2的药物组合物，其中体内半衰期比相应的hGHPEG化的前药缀合物的 体外半衰期短至多3倍。
4.权利要求2或3的药物组合物，其中体内半衰期比相应的hGHPEG化的前药缀合 物的体外半衰期短至多2倍或几乎相同。
5.权利要求1至4中任意一项的药物组合物，其中组合物是用于皮下施用、肌内施用 或静脉内注射的组合物。
6.权利要求1至5中任意一项的药物组合物，其中PEG化的前药中每个生长激素分 子的总PEG载量总计至少25kDa。
7.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中前药缀合物具有化学结构(A)其中HN-rhGH表示与暂时连接体连接的rhGH残基；RU R2、R3、R4和R5独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁 基、叔丁基；PEG表示与暂时连接体连接的PEG化的残基； η = 1或2 ；并且X选自Cl至C8烷基或者Cl至C12杂烷基。
8.权利要求7的药物组合物，其中权利要求7的结构(A)中的式⑴的部分结构，其人选自
9.权利要求7的药物组合物，其中权利要求7的结构(A)中的式(II)的部分结构，其是
10.权利要求7的药物组合物，其中权利要求7的式(A)中的PEG-X是式III的 PEG-W
11.权利要求1至6中任意一项的药物组合物，其中前药缀合物结构是
12.权利要求1至6中任意一项的药物组合物，其中前药缀合物结构是
13.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为20至300小时的速率。
14.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为20至150小时的速率。
15.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为30至100小时的速率。
16.前述权利要求中任意一项的药物组合物，其中连接体体内自动裂解速率是体内半 衰期为30至75小时的速率。
17.临床有效量的权利要求1至16中任意一项的药物组合物，其用于治疗人GH相关 疾病的方法。
18.药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AA)的人生长 激素ChGH)的前药缀合物hGH-NH-La-S° (AA)，其中hGH-NH表示hGH残基；La表示官能团，其是通过自动裂解诱导基团Ga自身可水解的(可自动裂解)；并且S°是聚合物链，其分子量为至少5kDa并且包含至少第一个分支结构BS1，至少第 一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合物链S1，其中S°、BS1、 S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中分支结构BS1进一步包含至少 第三条分子量为至少4kIDa的聚合物链S2，或者S°、S1中至少一个包含至少第二个分支 结构BS2，所述的BS2包含至少第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S2，并且其中不含 hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa。
19.权利要求18的组合物，其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少30kDa 并且最大120kDa。
20.权利要求18或19的组合物，其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少 40kDa并且最大lOOkDa。
21.权利要求18至20中任意一项的组合物，其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子 量为至少40kDa并且最大90kDa。
22.权利要求18至21中任意一项的组合物，其中La选自C(O)-O-和C(O)_，其与 hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基团，产生式(AAl)或(AA2)hGH-NH-C (O) O-S0 (AAl)，hGH-NH-C (O) -S0 (AA2)。
23.权利要求18至22中任意一项的组合物，其中La与hGH的氨基一起形成氨基甲 酸酯官能团，所述基团的裂解是通过Ga的羟基或氨基经S°的1，4-或1，6苄基消除来 诱导的，其中Ga包括酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经历限速转化。
24.权利要求18至21中任意一项的组合物，其中Ga是直接与La和hGH的伯氨基形 成的氨基甲酸酯官能团连接的芳族环或芴基甲基。
25.权利要求18至24中任意一项的组合物，其中分支结构BS1、BS2中至少一个包含 进一步的第四条分子量为至少4kDa的聚合物链S3，或者S°、S1、S2之一包含第三个分支 结构BS3，其包含至少第四条分子量为至少4kDa的聚合物链S3。
26.权利要求18至25中任意一项的组合物，其中至少三条链S°、S1、S2独立地基于 聚合物，所述的聚合物选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚巧1唑 啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸 酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚 酯。
27.权利要求26的组合物，其中至少三条链S°、S1、S2基于聚烷氧基聚合物。
28.权利要求18至27中任意一项的组合物，其中正如连接原子所测量的，S°至La的 连接位点与第一个分支结构BS1之间的最短距离小于50个原子。
29.权利要求28的组合物，其中最短距离小于20个原子。
30.权利要求18至29中任意一项的组合物，其中S°是式(AAAl)
31.权利要求30的组合物，其中Ga是OC(O)-R,并且R是权利要求6中所示的式 ⑴的部分结构，其中Rl、R4、R5和η如权利要求7所定义的。
32.权利要求18至22和25至26中任意一项的组合物，其中La_S°由式(AAA2)表示
33.药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AB)的人生长 激素ChGH)的前药缀合物hGH-(NH-L-S0)n (AB)，其中η是2、3或4 ；hGH (-NH) n 表示 hGH 残基；L各自独立地是永久官能团Lp或官能团ΙΛ其是通过自动裂解诱导基团Ga自身可水 解的(可自动裂解)；并且S°各自独立地是分子量为至少5kDa的聚合物链，其中S°任选是分支的，包含至少第 一个分支结构BS1，至少第一个分支结构BS1包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合 物链S1，其中S°、BS1、S1中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G%并且其中不含 hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大lOOOkDa。
34.权利要求33的组合物，其中η是2。
35.权利要求18至34中任意一项所定义的前药。
36.前药，其选自
全文摘要
通过加入包含聚乙二醇的暂时连接体制备的化学修饰的人生长激素(rhGH)。化学修饰的蛋白质比未修饰的rhGH具有更长的rhGH活性持续期，从而能够降低剂量和施用机会，并且修饰的rhGH不会引起脂肪萎缩。本发明还包括治疗和/或预防其中应用生长激素是有利的疾病或障碍的应用方法。
文档编号A61K47/48GK102014965SQ200980115469
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月29日 优先权日2008年4月29日
发明者拉斯姆森 G·诺斯科夫, H·拉乌, K·斯普罗格, S·金德曼, T·莱斯曼, T·韦格, U·赫泽尔 申请人:阿森迪斯药物股份有限公司
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