经改进的斯达汀生产的制作方法
专利名称：经改进的斯达汀生产的制作方法
技术领域：
本发明 涉及斯达汀的发酵方法。
背景技术：
胆固醇和其它脂质在体液中由低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)转 运。执行降低LDL-胆固醇机制的物质可以作为有效的抗高胆固醇药剂，因为LDL水平 与冠心病风险正相关。斯达汀类的降胆固醇剂是医学上非常重要的药物，因为它们通过 抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一酶催化胆固醇生物合成中的限速步 骤，即(3S)_羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)))到甲羟戊酸的转化。从下图所 示，市场上存在若干种类型的斯达汀，其中阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羟酶素(1)、 洛伐他汀(Iovastatin) (3)、辛伐他汀(simvastatin)⑷和普伐他汀(6)。阿托伐他汀通过 化学合成制造，而上文提到的其它斯达汀或者通过直接发酵或者通过前体发酵生产。这 些(前体)发酵通过Penicillium、Aspergillus和Monascus属的真菌进行。在真菌中发酵这些化合物时存在一种常见的问题，因为最终产物除了降胆固醇 剂以外还有活性抗真菌剂(参阅例如Qiao，J.，Kontoyiannis, D.P., Wan, Z.，Li, R.and Liu, W., Med.Mycol.2007，45 589-593),因此限制了在真菌宿主中的生产力。该问 题的一种可能的解决方案可以是将代谢通路转移至可能对斯达汀较不敏感的细菌物种。 然而，这种解决方案并不容易，因为两种真菌聚酮化合物合酶是斯达汀代谢通路的一部 分，并且这些酶与细菌聚酮化合物合酶大不相同。事实上，跨界表达的例子限于单纯和 简单的真菌聚酮化合物合酶，如来自Penicillium patulum的6-甲基水杨酸(6-MSA)在 Streptomyces 中的合成(Bedford, D.J., Schweizer, E., Hopwood, D.A.and Khosla，C， J.Bacteriol.1995, 177 4544-4548)，并且仅产生60mg/升的非常低的效价，而真菌斯达 汀发酵则导致每升数克的效价。即便是细菌聚酮化合物在细菌中的异源生产也是困难 的，并且仅存在正确发挥功能的有限个例子(参阅例如Lauet al.，!.Biotechnology 2004, 110:95-103)。因此，由于斯达汀的抗真菌特性，需要改进真菌发酵的生产力。
权利要求
1.选自下组的具有HMG-CoA还原酶活性的多肽，所述组由以下组成SEQID 4， SEQ ID 12,具有与SEQ ID 4有至少80%同一性程度的氨基酸序列的多肽，和具有与SEQ ID 12有至少60%同一性程度的氨基酸序列的多肽。
2.选自下组的多核苷酸，所述组由以下组成SEQID1，SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 9，SEQID 10，SEQID 11，SEQ ID 21，SEQ ID 25，SEQ ID 29，具有与 SEQ ID 1 有 至少80%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 2有至少80%同一性程度的序列 的多核苷酸，具有与SEQID 3有至少85%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 9有至少60%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 10有至少60%同一性程度的 序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 11有至少60%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与 SEQ ID 21有至少80%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 25有至少85%同一 性程度的序列的多核苷酸，和具有与SEQ ID 29有至少80%同一性程度的序列的多核苷 酸。
3.用于生产斯达汀的方法，所述方法包括过表达选自下组的多肽，所述组由以下组 成SEQID4，SEQID 12，SEQ ID 26, SEQ ID 30，具有与 SEQ ID 4 有至少 80% 同一性程度的氨基酸序列的多肽，具有与SEQ ID 12有至少60%同一性程度的氨基酸序列的 多肽，具有与SEQ ID 26有至少70%同一性程度的氨基酸序列的多肽，和具有与SEQ ID 30有至少70%同一性程度的氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求3的方法，所述方法包括下述步骤ω用包含编码HMGR的感兴趣基因的多核苷酸转化感兴趣的宿主细胞；(ii)选择经转化的细胞的克隆；(iii)培养所述选择的细胞，和(iv)从所述培养中分离制甲羟酶素、普伐他汀、洛伐他汀和/或辛伐他汀。
5.根据权利要求3到4中任一项的方法，其中用一种或多种斯达汀生物合成基因转化 所述宿主细胞。
6.包含权利要求2的多核苷酸的宿主细胞。
7.根据权利要求6的宿主细胞，所述宿主细胞为来自Penicillium，Aspergillus, Monascus，Mucor 或 Saccharomyces 属的真菌。
8.根据权利要求6到7中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是Penicillium citrinum, Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans，Monascus ruber, Monascuspaxi, Mucor hiemalis 或 Saccharomyces cerevisiae。
9.宿主细胞，其为包含权利要求2的多核苷酸或选自下组的多核苷酸的Penicillium chrysogenum,所述组由 SEQID 19，SEQ ID 20，SEQID23，SEQ ID 24，SEQ ID 27 禾口 SEQ ID 28 组成。
10.在权利要求3到5中任一项中获得的普伐他汀、洛伐他汀和/或辛伐他汀在生产 药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有HMG-CoA还原酶活性的多肽，其多核苷酸同源物，和生产斯达汀的方法，所述方法包括过表达所述多肽。
文档编号A61K31/366GK102014894SQ200980115471
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月29日
发明者德 勃戈 马尔科·亚历山大·范, 马库斯·汉斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司
技术领域：
本发明 涉及斯达汀的发酵方法。
背景技术：
胆固醇和其它脂质在体液中由低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)转 运。执行降低LDL-胆固醇机制的物质可以作为有效的抗高胆固醇药剂，因为LDL水平 与冠心病风险正相关。斯达汀类的降胆固醇剂是医学上非常重要的药物，因为它们通过 抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一酶催化胆固醇生物合成中的限速步 骤，即(3S)_羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)))到甲羟戊酸的转化。从下图所 示，市场上存在若干种类型的斯达汀，其中阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羟酶素(1)、 洛伐他汀(Iovastatin) (3)、辛伐他汀(simvastatin)⑷和普伐他汀(6)。阿托伐他汀通过 化学合成制造，而上文提到的其它斯达汀或者通过直接发酵或者通过前体发酵生产。这 些(前体)发酵通过Penicillium、Aspergillus和Monascus属的真菌进行。在真菌中发酵这些化合物时存在一种常见的问题，因为最终产物除了降胆固醇 剂以外还有活性抗真菌剂(参阅例如Qiao，J.，Kontoyiannis, D.P., Wan, Z.，Li, R.and Liu, W., Med.Mycol.2007，45 589-593),因此限制了在真菌宿主中的生产力。该问 题的一种可能的解决方案可以是将代谢通路转移至可能对斯达汀较不敏感的细菌物种。 然而，这种解决方案并不容易，因为两种真菌聚酮化合物合酶是斯达汀代谢通路的一部 分，并且这些酶与细菌聚酮化合物合酶大不相同。事实上，跨界表达的例子限于单纯和 简单的真菌聚酮化合物合酶，如来自Penicillium patulum的6-甲基水杨酸(6-MSA)在 Streptomyces 中的合成(Bedford, D.J., Schweizer, E., Hopwood, D.A.and Khosla，C， J.Bacteriol.1995, 177 4544-4548)，并且仅产生60mg/升的非常低的效价，而真菌斯达 汀发酵则导致每升数克的效价。即便是细菌聚酮化合物在细菌中的异源生产也是困难 的，并且仅存在正确发挥功能的有限个例子(参阅例如Lauet al.，!.Biotechnology 2004, 110:95-103)。因此，由于斯达汀的抗真菌特性，需要改进真菌发酵的生产力。
权利要求
1.选自下组的具有HMG-CoA还原酶活性的多肽，所述组由以下组成SEQID 4， SEQ ID 12,具有与SEQ ID 4有至少80%同一性程度的氨基酸序列的多肽，和具有与SEQ ID 12有至少60%同一性程度的氨基酸序列的多肽。
2.选自下组的多核苷酸，所述组由以下组成SEQID1，SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 9，SEQID 10，SEQID 11，SEQ ID 21，SEQ ID 25，SEQ ID 29，具有与 SEQ ID 1 有 至少80%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 2有至少80%同一性程度的序列 的多核苷酸，具有与SEQID 3有至少85%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 9有至少60%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 10有至少60%同一性程度的 序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 11有至少60%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与 SEQ ID 21有至少80%同一性程度的序列的多核苷酸，具有与SEQ ID 25有至少85%同一 性程度的序列的多核苷酸，和具有与SEQ ID 29有至少80%同一性程度的序列的多核苷 酸。
3.用于生产斯达汀的方法，所述方法包括过表达选自下组的多肽，所述组由以下组 成SEQID4，SEQID 12，SEQ ID 26, SEQ ID 30，具有与 SEQ ID 4 有至少 80% 同一性程度的氨基酸序列的多肽，具有与SEQ ID 12有至少60%同一性程度的氨基酸序列的 多肽，具有与SEQ ID 26有至少70%同一性程度的氨基酸序列的多肽，和具有与SEQ ID 30有至少70%同一性程度的氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求3的方法，所述方法包括下述步骤ω用包含编码HMGR的感兴趣基因的多核苷酸转化感兴趣的宿主细胞；(ii)选择经转化的细胞的克隆；(iii)培养所述选择的细胞，和(iv)从所述培养中分离制甲羟酶素、普伐他汀、洛伐他汀和/或辛伐他汀。
5.根据权利要求3到4中任一项的方法，其中用一种或多种斯达汀生物合成基因转化 所述宿主细胞。
6.包含权利要求2的多核苷酸的宿主细胞。
7.根据权利要求6的宿主细胞，所述宿主细胞为来自Penicillium，Aspergillus, Monascus，Mucor 或 Saccharomyces 属的真菌。
8.根据权利要求6到7中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是Penicillium citrinum, Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans，Monascus ruber, Monascuspaxi, Mucor hiemalis 或 Saccharomyces cerevisiae。
9.宿主细胞，其为包含权利要求2的多核苷酸或选自下组的多核苷酸的Penicillium chrysogenum,所述组由 SEQID 19，SEQ ID 20，SEQID23，SEQ ID 24，SEQ ID 27 禾口 SEQ ID 28 组成。
10.在权利要求3到5中任一项中获得的普伐他汀、洛伐他汀和/或辛伐他汀在生产 药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有HMG-CoA还原酶活性的多肽，其多核苷酸同源物，和生产斯达汀的方法，所述方法包括过表达所述多肽。
文档编号A61K31/366GK102014894SQ200980115471
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月29日
发明者德 勃戈 马尔科·亚历山大·范, 马库斯·汉斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司
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