用于多种检测体系的酶底物的制作方法
专利名称：用于多种检测体系的酶底物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于使用例如质谱、免疫测定和高效液相色谱等检测方法检测酶活 性的分析试剂。在一个方面中，本发明涉及用于检测溶酶体酶活性的底物。
背景技术：
溶酶体贮积症是一种遗传病，其特征在于体内缺乏特异性酶，从而导致身体无 法分解代谢物。例如，法布里病是一种每40000人中就有一人患有的溶酶体贮积症。它 是由于缺乏α-半乳糖苷酶造成的，这种缺乏导致人体无法分解称为神经酰胺三己糖苷 (globotriaosylceramides)的特定脂肪类物质。第二个实例为戈谢病，其为一种由于无法分 解称为葡糖苷酰鞘氨醇(也称为葡糖脑苷脂)的脂肪类物质或类脂类物质而引起的溶酶体 贮积症。患有戈谢病的个体不产生分解这些脂肪类物质所需的葡糖脑苷脂酶。因而这些 脂肪类物质就蓄积在肝、脾和骨髓细胞中。第三个实例是庞皮病，其为一种由于缺乏分 解称为糖原的特定糖类所需的酸性α-葡萄糖苷酶而引起的溶酶体贮积症。当酸性α-葡 萄糖苷酶缺失时，糖原就会蓄积在体内的各种组织和器官中。溶酶体贮积症大多是儿童期疾病，但也有一些显露于成年期。在大部分这些疾 病中，患者出生时是正常的，之后才开始渐进性神经系统恶化。其临床表型取决于生化 缺陷的类型及严重程度。一些溶酶体症，例如庞皮病及克拉伯病，主要显露于婴儿期。 在出现临床症状之前检测这类疾病以便能够开始介入治疗的方法正在努力研发中。在过去的十年中，检测代谢疾病的试验室人员已将串联质谱引入其新生儿筛查 程序中。串联质谱法在临床中不断普及，因为这项技术能对单一样品中的多种代谢物进 行测定。例如，这项技术已成为利用干燥血斑样品检测新生儿遗传性代谢异常的常规临 床方法而被采用(Schulze Aetal.，Pediatrics, 2003 ； 111 1399-406)。虽然溶酶体酶 活性可使用串联质谱进行定量(Gelb MH et al.，Clinical Chemistry 50 10，1785-1796， 2004)，但是由于繁琐的过程和苛刻的测定成分，例如氯仿，所公开的测定方法还不能容 易地适应临床环境。第二个常用的临床测定方案是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。目前使用一些 生物标记物来检测并监控戈谢病(参见例如Aerts，JM, andHollack, CD, Bailliere' s Clin.Haematol, 1997 ； 10: 691-709; Deegan PB，etal.，Blood Cells Mol Dis, 2005 ； 35: 259-67 ； Beutler，Ε, etal., J ExpMed，1976 ； 143 975-80)。用于检测其中活性 成分为修饰葡糖脑苷脂酶的阿糖苷酶的抗体的ELISA法也有报道(Richards SM, et al., Blood, 1993 ； 82: 1402 ； Rosenberg, M.，etal., Blood, 1999 ； 93: 2081-2088)。然 而，这些测定方法并不直接检测溶酶体酶的活性，而是检测疾病间接标志物的水平。
因此，仍需改进检测溶酶体疾病的方法及组合物。
发明内容
本发明实施方案提供了用于使用例如质谱、免疫测定和高效液相色谱等检测系 统检测酶反应的改进的组合物及方法。本发明提供了可用于评估样品中溶酶体酶活性水平的化学化合物。溶酶体酶 活性测试可用于例如对新生儿的代谢疾病进行筛查，以及对处于影响酶活性的病症中的 个体或接受例如酶替代疗法、基因疗法、或骨髓移植等医学治疗的个体进行评估。此处 所述化学化合物包括用于目标酶的底物以及可在酶测定中用作对照物或标准物的相关分子。本发明的底物具有通式A-CB1-B2-B3-B4),其中A为单糖或二糖；B1SC1-C2tl 烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C2P含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环；B2为氨 基酸、2，6-二氨基己酸或
权利要求
1.一种用于分析酶的底物，具有下式A-(B1-B2-B3-B4) ⑴其中A为单糖或二糖；B1为C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-Cf含有 N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基；B2为氨基酸、2，6-二氨基己酸或-RV-XRz1(Y)n其中R/ SC1-C2tl烷基、C4-C2tl醚基、具有N、O或S取代基的C1-C2tl烷基、杂原 子C6-C2tl芳基、C1-C2tl羰基、C1-C2tl酰氨基、C1-C2tl醚基、C6-C2tl芳基、含有N、O或 S杂原子WC6-C2tl杂环基；X为不存在，或为氧、硫或氮；R2'为不存在，或为C1-C2tl 烷基、C4-C2tl醚基、含有N、O或S取代基的C1-C2tl烷基、C1-C2tl酯基、C1-C2tl醇基、 C1-C2tl烯基、杂原子C6-C2tl芳基、含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基；Y为碳、氮、 氧或硫亲核基团；η为1至30的整数。B3为~^l-(XR3)dR4——N+(R2)3其中R1 SC1-C2tl烷基、C4-C2tl醚基、具有N、O或S取代基WC1-C2tl烷基、杂原 子C6-C2tl芳基、C1-C2tl羰基、C1-C2tl酰氨基、C1-C2tl醚基、C6-C2tl芳基、含有N、O或 S杂原子WC6-C2tl杂环基；R2各自独立地为H、C1-C2tl烷基、具有C1-C2tl烷基取代基的 C2-C2tl烷基；X各自独立地为不存在的基团、氧、硫或氮；R3各自独立地为不存在的基 团、C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C,含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂 环基；η为0至30的整数，包括0和30; R4各自独立地为不存在的基团、C1-C2tl烷基、 具有取代的C6-C2tl芳基的CfQ。、C1-C2tl羰基、C1-C2tl酰氨基、C1-C2tl醚基、C6-C2tl芳 基、含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基；B4为不存在的基团或C1-C2tl烷基、C4-C2tl 醚基、含有N、O或S取代基的C1-C2tl烷基、C1-C2tl酯基、C1-C2tl醇基、C「C2Q烯基、 杂原子C6-C2tl芳基、含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基。
2.权利要求1的底物，其中A和(B1-B2-B3-B4)通过所述酶的作用而分离。
3.权利要求1的底物，其中A为己醛糖或己酮糖。
4.权利要求1的底物，其中A为D-葡萄糖或D-半乳糖。
5.权利要求1的底物，其中B1为具有从环延伸出的取代基的C6芳基。
6.权利要求1的底物，其中B2为赖氨酸。
7.权利要求1的底物，其中B2通过加入荧光团衍生。
8.权利要求1的底物，其中B3为肉碱基。
9.权利要求8的底物，其中B4为具有一个以羰基形式存在的O取代基的C2-C2tl烷基。
10.权利要求1的底物，其中A和(B1-B2-B3-B4)部分各自包含一种元素的稳定二级 同位素。
11.权利要求10的底物，其中所述稳定二级同位素各自选自2D、13C、15N、170、 180、31P 和 34s。
12.—种具有下式的分子B1-B2-B3-B4 (I)其中B1 SC1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-Cf含有N、O或S杂原子的C6-C2tl杂环基；B2为氨基酸、2，6-二氨基己酸或
13.权利要求12的分子，其中B1为具有从环延伸出的取代基的C6芳基。
14.权利要求12的分子，其中B2为赖氨酸。
15.权利要求12的分子，其中B2通过加入荧光团衍生。
16.权利要求12的分子，其中B3为肉碱基。
17.权利要求12的分子，其中B4为具有一个以羰基形式存在的O取代基的C2-C2tl烷基。
18.权利要求12的分子，其中(B1-B2-B3-B4)包含一种元素的稳定二级同位素。
19.权利要求18的分子，其中所述稳定二级同位素各自选自2D、13C、15N、170、 180、31P 和 34s。
20.—种检测酶活性的方法，包括将含有目标酶的样品与权利要求1的底物在所述 目标酶能作用于所述底物从而生成一种酶产物的条件下接触，其中所述底物连接在一个 固体载体上；以及检测残留在所述固体载体上的底物的量。
全文摘要
提供了一种本发明的底物，其包括一种式A-B1-B2-B3-B4的底物化合物，其中A为糖部分；B1为能使A部分与底物的剩余结构连接的连接部分；B2为含有反应性自由氨基的连接部分，以便与羧酸或可测标记反应；B3含有一种永久带电元素，例如季铵基团，以便增加质谱分析的灵敏性；B4具有在检测方法中赋予各个底物特异性的不同碳链。还提供了一种式B1-B2-B3-B4的分子，其与通过将目标酶作用于本发明底物而生成的酶产物具有相似的结构特征。此外还提供了用本发明底物检测酶活性的方法。
文档编号A61K31/7042GK102014929SQ200980116727
公开日2011年4月13日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者B·瑟达, M·N·鲍勃饶 申请人:珀金埃尔默健康科学有限公司
技术领域：
本发明涉及用于使用例如质谱、免疫测定和高效液相色谱等检测方法检测酶活 性的分析试剂。在一个方面中，本发明涉及用于检测溶酶体酶活性的底物。
背景技术：
溶酶体贮积症是一种遗传病，其特征在于体内缺乏特异性酶，从而导致身体无 法分解代谢物。例如，法布里病是一种每40000人中就有一人患有的溶酶体贮积症。它 是由于缺乏α-半乳糖苷酶造成的，这种缺乏导致人体无法分解称为神经酰胺三己糖苷 (globotriaosylceramides)的特定脂肪类物质。第二个实例为戈谢病，其为一种由于无法分 解称为葡糖苷酰鞘氨醇(也称为葡糖脑苷脂)的脂肪类物质或类脂类物质而引起的溶酶体 贮积症。患有戈谢病的个体不产生分解这些脂肪类物质所需的葡糖脑苷脂酶。因而这些 脂肪类物质就蓄积在肝、脾和骨髓细胞中。第三个实例是庞皮病，其为一种由于缺乏分 解称为糖原的特定糖类所需的酸性α-葡萄糖苷酶而引起的溶酶体贮积症。当酸性α-葡 萄糖苷酶缺失时，糖原就会蓄积在体内的各种组织和器官中。溶酶体贮积症大多是儿童期疾病，但也有一些显露于成年期。在大部分这些疾 病中，患者出生时是正常的，之后才开始渐进性神经系统恶化。其临床表型取决于生化 缺陷的类型及严重程度。一些溶酶体症，例如庞皮病及克拉伯病，主要显露于婴儿期。 在出现临床症状之前检测这类疾病以便能够开始介入治疗的方法正在努力研发中。在过去的十年中，检测代谢疾病的试验室人员已将串联质谱引入其新生儿筛查 程序中。串联质谱法在临床中不断普及，因为这项技术能对单一样品中的多种代谢物进 行测定。例如，这项技术已成为利用干燥血斑样品检测新生儿遗传性代谢异常的常规临 床方法而被采用(Schulze Aetal.，Pediatrics, 2003 ； 111 1399-406)。虽然溶酶体酶 活性可使用串联质谱进行定量(Gelb MH et al.，Clinical Chemistry 50 10，1785-1796， 2004)，但是由于繁琐的过程和苛刻的测定成分，例如氯仿，所公开的测定方法还不能容 易地适应临床环境。第二个常用的临床测定方案是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。目前使用一些 生物标记物来检测并监控戈谢病(参见例如Aerts，JM, andHollack, CD, Bailliere' s Clin.Haematol, 1997 ； 10: 691-709; Deegan PB，etal.，Blood Cells Mol Dis, 2005 ； 35: 259-67 ； Beutler，Ε, etal., J ExpMed，1976 ； 143 975-80)。用于检测其中活性 成分为修饰葡糖脑苷脂酶的阿糖苷酶的抗体的ELISA法也有报道(Richards SM, et al., Blood, 1993 ； 82: 1402 ； Rosenberg, M.，etal., Blood, 1999 ； 93: 2081-2088)。然 而，这些测定方法并不直接检测溶酶体酶的活性，而是检测疾病间接标志物的水平。
因此，仍需改进检测溶酶体疾病的方法及组合物。
发明内容
本发明实施方案提供了用于使用例如质谱、免疫测定和高效液相色谱等检测系 统检测酶反应的改进的组合物及方法。本发明提供了可用于评估样品中溶酶体酶活性水平的化学化合物。溶酶体酶 活性测试可用于例如对新生儿的代谢疾病进行筛查，以及对处于影响酶活性的病症中的 个体或接受例如酶替代疗法、基因疗法、或骨髓移植等医学治疗的个体进行评估。此处 所述化学化合物包括用于目标酶的底物以及可在酶测定中用作对照物或标准物的相关分子。本发明的底物具有通式A-CB1-B2-B3-B4),其中A为单糖或二糖；B1SC1-C2tl 烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C2P含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环；B2为氨 基酸、2，6-二氨基己酸或
权利要求
1.一种用于分析酶的底物，具有下式A-(B1-B2-B3-B4) ⑴其中A为单糖或二糖；B1为C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-Cf含有 N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基；B2为氨基酸、2，6-二氨基己酸或-RV-XRz1(Y)n其中R/ SC1-C2tl烷基、C4-C2tl醚基、具有N、O或S取代基的C1-C2tl烷基、杂原 子C6-C2tl芳基、C1-C2tl羰基、C1-C2tl酰氨基、C1-C2tl醚基、C6-C2tl芳基、含有N、O或 S杂原子WC6-C2tl杂环基；X为不存在，或为氧、硫或氮；R2'为不存在，或为C1-C2tl 烷基、C4-C2tl醚基、含有N、O或S取代基的C1-C2tl烷基、C1-C2tl酯基、C1-C2tl醇基、 C1-C2tl烯基、杂原子C6-C2tl芳基、含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基；Y为碳、氮、 氧或硫亲核基团；η为1至30的整数。B3为~^l-(XR3)dR4——N+(R2)3其中R1 SC1-C2tl烷基、C4-C2tl醚基、具有N、O或S取代基WC1-C2tl烷基、杂原 子C6-C2tl芳基、C1-C2tl羰基、C1-C2tl酰氨基、C1-C2tl醚基、C6-C2tl芳基、含有N、O或 S杂原子WC6-C2tl杂环基；R2各自独立地为H、C1-C2tl烷基、具有C1-C2tl烷基取代基的 C2-C2tl烷基；X各自独立地为不存在的基团、氧、硫或氮；R3各自独立地为不存在的基 团、C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C,含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂 环基；η为0至30的整数，包括0和30; R4各自独立地为不存在的基团、C1-C2tl烷基、 具有取代的C6-C2tl芳基的CfQ。、C1-C2tl羰基、C1-C2tl酰氨基、C1-C2tl醚基、C6-C2tl芳 基、含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基；B4为不存在的基团或C1-C2tl烷基、C4-C2tl 醚基、含有N、O或S取代基的C1-C2tl烷基、C1-C2tl酯基、C1-C2tl醇基、C「C2Q烯基、 杂原子C6-C2tl芳基、含有N、O或S杂原子WC6-C2tl杂环基。
2.权利要求1的底物，其中A和(B1-B2-B3-B4)通过所述酶的作用而分离。
3.权利要求1的底物，其中A为己醛糖或己酮糖。
4.权利要求1的底物，其中A为D-葡萄糖或D-半乳糖。
5.权利要求1的底物，其中B1为具有从环延伸出的取代基的C6芳基。
6.权利要求1的底物，其中B2为赖氨酸。
7.权利要求1的底物，其中B2通过加入荧光团衍生。
8.权利要求1的底物，其中B3为肉碱基。
9.权利要求8的底物，其中B4为具有一个以羰基形式存在的O取代基的C2-C2tl烷基。
10.权利要求1的底物，其中A和(B1-B2-B3-B4)部分各自包含一种元素的稳定二级 同位素。
11.权利要求10的底物，其中所述稳定二级同位素各自选自2D、13C、15N、170、 180、31P 和 34s。
12.—种具有下式的分子B1-B2-B3-B4 (I)其中B1 SC1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-Cf含有N、O或S杂原子的C6-C2tl杂环基；B2为氨基酸、2，6-二氨基己酸或
13.权利要求12的分子，其中B1为具有从环延伸出的取代基的C6芳基。
14.权利要求12的分子，其中B2为赖氨酸。
15.权利要求12的分子，其中B2通过加入荧光团衍生。
16.权利要求12的分子，其中B3为肉碱基。
17.权利要求12的分子，其中B4为具有一个以羰基形式存在的O取代基的C2-C2tl烷基。
18.权利要求12的分子，其中(B1-B2-B3-B4)包含一种元素的稳定二级同位素。
19.权利要求18的分子，其中所述稳定二级同位素各自选自2D、13C、15N、170、 180、31P 和 34s。
20.—种检测酶活性的方法，包括将含有目标酶的样品与权利要求1的底物在所述 目标酶能作用于所述底物从而生成一种酶产物的条件下接触，其中所述底物连接在一个 固体载体上；以及检测残留在所述固体载体上的底物的量。
全文摘要
提供了一种本发明的底物，其包括一种式A-B1-B2-B3-B4的底物化合物，其中A为糖部分；B1为能使A部分与底物的剩余结构连接的连接部分；B2为含有反应性自由氨基的连接部分，以便与羧酸或可测标记反应；B3含有一种永久带电元素，例如季铵基团，以便增加质谱分析的灵敏性；B4具有在检测方法中赋予各个底物特异性的不同碳链。还提供了一种式B1-B2-B3-B4的分子，其与通过将目标酶作用于本发明底物而生成的酶产物具有相似的结构特征。此外还提供了用本发明底物检测酶活性的方法。
文档编号A61K31/7042GK102014929SQ200980116727
公开日2011年4月13日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者B·瑟达, M·N·鲍勃饶 申请人:珀金埃尔默健康科学有限公司
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