减少细菌中接合型质粒的制作方法
专利名称：减少细菌中接合型质粒的制作方法
减少细菌中接合型质粒
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本申请要求2008年3月10日提交的美国申请第61/035,304号的优先权。 发明领域
本发明提供方法和组合物，以减少见于包括细菌感染的微生物菌落中的各种质 粒的数量上(numerical)或质量上(mass)的量，并且本发明包括用于菌落处理的组合物、 方法以及用于鉴定其他此类组合物的方法。在多种实施方案中，本发明提供显著地减少 携带于靶细菌培养物中的抗生素抗性标记的流行。
发明背景
细菌是普遍存在的并且见于之前被认为不适于居住的环境中。它们是常见的且 生态学多样的，并且发现对于生存不寻常的和共同的生态位。它们遍布于环境存在，并 且存在于土壤、灰尘、水以及几乎所有天然表面上。许多是正常的和有益的细菌株，其 提供与宿主的协同关系。其他的不是这样有益的，或在特定条件下伴随益处造成问题。
致病细菌可以在人类、其他动物以及植物中导致感染性疾病或明显症状。一 些细菌只可以影响特定宿主；其他的在许多宿主中导致问题，这取决于细菌的宿主特异 性。其他的在某些情况下可以是无害的或休眠的，并且在其他环境或情况下可以作为问 题出现。无论是细菌单独或联合导致的疾病，都几乎与细菌本身一样的多样并且包括食 物中毒、蛀牙、炭疽、普通感染性疾病以及甚至某些类型的癌症。这些临床问题通常是 临床微生物学领域的主题。
细菌是某些病毒的天然靶标，所述病毒例如噬菌体(bacteriophiige)或噬菌体 (phiige)。噬菌体已在其天然宿主上进化并且具有非常快的复制和进化速率。噬菌体可 以利用其宿主生理学或生物学所表现出的最小的易损性(vulnerability)。同样地，噬菌体 结构、生理学和要素的适当利用应当对于最小化或控制细菌导致的问题是有用的。
某些细菌通常是无害的，在合适的机会存在时变为致病的或在被引入异常位置 或环境时变为可导致问题的。此外，某些细菌组合共同进化并且可以协同运作以补充在 菌落个体成员中缺乏的功能。但是，例如在多细胞生物体中，存在许多各种各样的机制 来处理不同量的细菌激发，细菌培养物的完全根除通常不是必需的。在许多情况下，细 菌群体的不完全根除会降低感染的作用，以允许系统通过例如免疫系统的可选机制来解 决问题。
统计上，感染性疾病是主要的医学问题。参见，例如Watsteta和 Jovanovic (2003) Statistical Handbook on Infectious Diseases (感染性疾病统计手册) Greenwood, ISBN 1573563757。在美国，每年大约40-70K的死亡来自于医院(医院 来源的)血流感染。
特别是，在过去的半个世纪，抗生素使临床医学产生革命性变化。自从抗生 素现象的最初发现，作用机制和这类突出的治疗实体的开发得到了巨大的进展。参 见，例如 Therrien 和 Levesque(2000)FEMS Microbiol.Rev.24 251-62 ； Durgess(1999)Chest Il5(3Suppl) 19S-23S ； Medeiros(1997)Clin.Infect.Dis.24(Suppl 1) S19-45 ； Jones (1996) Am.J.Med.l00(6A) 3S-12S ； Ford 禾口 Hait (1993) Cytotechnology 12: 171-212 ；以及 Liu(1992) Compr.Ther.18 35-42。2002 年，抗生素具有约 $320 亿的世界范围的销售额。
抗生素抗性细菌的广泛出现突出了现有抗菌治疗对于细菌适应的易损性。参 见，例如 Wise (2007) “ An overview of the Specialist AdvisoryCommittee on Antimicrobial Resistance (SACAR)(抗菌剂抗性专家顾问委员会概述)“J.Antimicrob.Chemother.60 Suppl 1 i5-7.PMID 17656382 ； Finch (2007) “ Innovation-drags and diagnostics (革新 _ 药物和 诊断学)“J.Antimicrob.Chemother.60Suppl 1 79-82, PMID 17656390 ； Walsh(1992) Antibiotics Actions, Origins, Resistance(抗生素作用、起源、抗'性)Amer.Soc. Microbiol., ISBN 1555812546 ； Cunha (1992) Antibiotic Essentiala (抗生素要素) Physicians Press, ISBN 1890114413 ； Amyes (2003) MagicBullets, Lost Horizons The Rise and Fall of Antibiotics (神奇的子弹，失落的地平线抗生素的兴衰)T^aylor&Francis， ISBN 0415272033 ； Axelsen (2001) Essentials of Antimicrobial Pharmacology A Guide to Fundamentalsfor Practice (抗菌剂药理学要素实践基础指南)Humana Press, ISBN 0896038424 ；以及 Mainous 禾口 Pomeroy (eds.2001) Management ofAntimicrobials in Infectious Diseases Impact of Antibiotic Resistance(感染性疾病中抗菌剂的管理抗生素抗性的影 响)Humana Press，ISBN 0896038211。
此外，抗生素抗性的机构在最低选择条件下发展(例如在低浓度的抗生素下)， 并且这些机构经常在宿主之间转移。因此，机构在不同生物中进化，并且经常被引入 新的宿主，在新的宿主中这些相同的机构被进一步完善和优化。经常，机构的组合被生 成、被遗传上连接在一起，并且在细菌宿主之间一起转移。这些组合经常导致编码连接 的多药物抗性标记的DNA节段的基因聚类(clustering)。
因此，用于减少抗性编码质粒的流行、生长或存活，或用于限制细菌毒力或致 病性的改进的方法会具有巨大的功用。该功用可以适用于环境的、局部的(local)、局部 的(topical)或特别是体内的定殖(colonization)。本发明致力于这些和其他重要的问题。
发明概述
本发明部分地基于以下认识存在可以感染很多不同宿主的多种宽宿主范围 噬菌体。参见，例如 Grahn，et al. (2006) “ PRDl Dissecting theGenome，Structure and Entry “ (PRD1 剖析基因组、结构和进入)in Calendar (ed.) The Bacteriophages (噬 菌体)Od ed.)Oxford Univ.Press, ISBN-13 9780195148503。PRDl 是复层噬菌体科 CTectiviridae)属的示例性成员，其在结构上和功能上被定义。但是，分类方案在演变并 且认识到噬菌体与高等动物腺病毒功能的相似性。这表明某些基本结构特征是共享的， 这些噬菌体利用所述基本结构特征以达到在广泛多种的宿主细菌种中感染和复制的共同 目的。特别是，这些宽宿主范围跨越革兰氏阴性和革兰氏阳性的区别，这提示某些结构 特征在结合和感染进程中是共享的。编码抗生素抗性机构的很多遗传元件也可以包含针 对含有那些遗传元件的细胞的易损性的装置。例如，某些编码抗生素抗性基因的细菌质 粒也编码使宿主细胞易受损于噬菌体结合(以及杀死)的受体。可选地，质粒可以编码 可以被转移到缺乏所述质粒的其他细胞中的基因或结构，从而导致抗性基因和连接的易损性标记的转移。该机构可以用作抗性或毒力编码质粒向相似的缺乏抗性标记的宿主的 横向传递的装置。如果易损性基因也被转移，那么这些宿主对于清除装置变为敏感的。
本发明提供有效地靶向于含有编码抗生素抗性或毒力的某些遗传元件、特别地 可传递形式的遗传元件的细胞的装置。在其他实施方案中，提供将噬菌体结合和/或杀 死易感性转移到广泛多种靶宿主细菌的装置。
本发明提供减少异质细菌培养物中编码例如复层病毒(tectivirus)的噬菌体的受体的接合型质粒的流行的方法。所述方法使用生物系统(以噬菌体或其部分为例)的其对 于含有遗传元件的靶细胞的抗菌活性(根除/减少携带如抗生素抗性、毒力等不希望性质 的细菌的数量)，所述生物系统取决于细菌交配对形成系统(mating pair formation system) (以接合型菌毛或其部分为例)。
作为任选的第一步骤，通过以下产生包含接合型质粒并表达噬菌体受体的宿主 细菌将细菌培养物暴露于提供编码噬菌体受体的接合型质粒从所述细菌培养物的供体 成员到接受体(recipient)成员的转移的交配对形成系统，并且允许所述系统实现所述接 合型质粒从所述细菌培养物的所述供体成员到所述接受体成员的转移。作为第二步骤 (或者第一步骤，如果未进行之前的步骤)，一旦表达噬菌体受体的宿主细胞存在，将细 菌培养物暴露于结合所述受体的合适的噬菌体。作为噬菌体生命周期的部分，其杀死宿 主细菌，因而减少异质细菌培养物中编码所述噬菌体受体的接合型质粒的流行。
在一实施方案中，流行的减少是所述细菌培养物中所述接合型质粒的相对或绝 对数量的减少；或每所述细菌培养物成员的所述接合型质粒的相对或绝对数量的减少， 或异质细菌培养物中发现的含有所述质粒的宿主的相对或绝对数量的减少。在其他实施 方案中，流行的减少为比暴露于交配对系统之前的流行至少少2倍。
在一实施方案中，噬菌体是，例如宽宿主范围的含有脂质的噬菌体，包括复层 病毒；PRDl噬菌体群(group)的成员；质粒依赖性宽宿主范围噬菌体；复层噬菌体科， 以二十面体形态、脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个或多个 为特征的噬菌体；或选自以下命名为PRD1、PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GILOU pGILOl、BAM!35 或 GIL16 的噬菌体。
在一实施方案中，接合型质粒，例如选自不相容性群N、P或W质粒；编码在 噬菌体复制中重要的一种或多种其他蛋白(例如质粒上功能是结合、感染、复制或裂解 的蛋白)；编码一种或多种抗生素抗性、选择或毒力标记；是以与所述成员的染色体分 开的DNA的形式；或编码一种或多种菌毛基因。
在一实施方案中，异质细菌培养物是，例如处于对数生长阶段；处于稳定状态 生长阶段；乳酸杆菌或乳制品加工培养物；在水处理设施中；在真核细胞或器官培养物 中；在真核宿主中；在脊椎生物体中或脊椎生物体上；或在哺乳动物中或哺乳动物上。
在一实施方案中，交配对形成系统包括，例如至少一个菌毛接合基因；或另一 个可移动元件转移系统，例如转导或电穿孔。用于引入合适质粒的可选的系统包括基于 噬菌体的DNA递送系统。
在其他实施方案中，遗传物质的转移是，例如在至少30°C的温度；在多种菌毛 基因表达的温度。另一个可以变化的条件是转移时间，例如2至12或更多小时，优选地 2小时。在一实施方案中，供体细胞是F+细菌细胞。在另一实施方案中，接受体细胞是F-细菌细胞。在优选的实施方案中，遗传物质的转移导致包含所述接合型质粒的所述 细菌培养物的成员的增加。在另一优选的实施方案中，供体细胞与接受体细胞的比例在 1 1的两个对数单位以内，例如100 1至1 100。
关于将复层病毒噬菌体添加到异质细菌培养物，在一实施方案中，对于每一包 含编码所述受体的所述接合型质粒的细菌细胞，即对于每一易感于包括复层病毒的噬菌 体感染的细胞，添加至少10个噬菌体。在一实施方案中，噬菌体减少所述接合型质粒的 数量。在另一实施方案中，噬菌体在宿主细菌中不能复制，例如由于有缺陷的感染、复 制或裂解，其包括不相容性机构，包括包含所述接合型质粒的宿主细胞。在其他实施方 案中，噬菌体在包含所述接合型质粒的宿主细菌中不能复制其基因组。因此，在宿主细 菌中有复制能力的噬菌体不是本发明的方法所需要的。
一方面，本发明提供在异质细菌培养物内转移赋予对例如复层病毒的噬菌体附 着的易感性的可移动遗传元件的方法。所述异质细菌培养物包括易感于噬菌体结合的供 体细菌细胞和不易感于噬菌体结合的接受体细菌细胞。遗传元件的转移在合适的条件下 发生在供体细菌细胞与接受体细菌细胞之间。伴随遗传元件转移到接受体细菌细胞，所 述接受体细菌细胞变为易感于噬菌体结合，这通常导致所述接受体细胞的死亡。
可移动元件通常是编码例如复层病毒噬菌体受体基因或菌毛基因的质粒。所述 质粒可以选自于以下任何质粒F、R386、RU ColB-K99、ColB_K166、R124、R62、 R64、R483、R391、R46、R724、RP4、RK2、R751、RSF1010、R401、R388 或 S_a ； 在:tnc群N、P或W中；或在:Inc群D、M、X、PU U、C或J中。
易感于复层病毒噬菌体的供体细菌细胞的实例是，例如F+细胞；来自革兰氏阴 性细菌种；来自例如埃希氏菌属CEscherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属 (Salmonella)、变形杆菌属(Proteus) > 弧菌属(Vibrio)、不动细菌属(Acinetobacter) > 芽 胞杆菌属(Bacillus)或微球菌属(Micrococcus)的属。
接受体细菌细胞的实例是F-细胞；来自革兰氏阴性细菌种；来自例如埃希氏菌 属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细菌属、芽胞杆菌属或微球 菌属的属；或抗生素抗性基因或毒力基因的载体；
复层病毒噬菌体的实例包括PRD1、AP50、Bam35, NSlU PR3、PR4、PR5、 PR722、L17 或 P37-14。
在一实施方案中，所述供体细菌细胞和所述接受体细菌细胞来自不同细菌种或 不同细菌属。
在其他实施方案中，方法包括以下步骤给予例如复层病毒的噬菌体以感染表 达受体的、噬菌体易感的宿主细胞，从而导致异源细菌培养物中所述易感宿主细胞的死 亡或编码抗生素抗性或细菌毒力基因的可移动元件的数量的减少。抗生素也可以伴随噬 菌体给予，例如连续或同时给予。
一方面，本发明提供重组遗传构建体，其包含编码例如复层病毒的噬菌体的受 体组分的核酸。所述噬菌体受体组分的表达可以由在宿主细菌细胞中有功能的强异源启 动子驱动。在一优选实施方案中，启动子是诱导型启动子，所述诱导型启动子相比诱导 状态，在诱导状态中可以驱动所述受体基因的表达到至少2、4、5、10或更多倍的更高 水平。所述重组遗传构建体还可以包含连接到编码复层病毒受体的核酸的选择标记。宿主细菌可以是例如革兰氏阴性细菌。
另一方面，本发明提供包含可传递的DNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合 物，所述可传递的DNA编码与裂解性噬菌体结合的噬菌体受体，其中所述裂解性噬菌体 会杀死表达所述噬菌体受体的细菌细胞。在某些实施方案中，可传递的DNA是选自N、 P、W、D、M、X、PU U、W、C或J的:Inc质粒；或裂解性噬菌体是命名为PRDl、 PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GILOU pGILOl、BAM35 或 GIL16 的噬菌体。 还提供了包含具有所述裂解性噬菌体和所述药物组合物的一个或多个室的试剂盒。
本发明提供减少异质细菌群体中编码抗生素抗性和/或毒力因子的接合型质粒 的流行的方法。所述方法包含将所述异质细菌群体与例如复层病毒的噬菌体接触的步 骤，所述噬菌体通过与由所述接合型质粒的核酸组分编码的受体蛋白的相互作用，结合 或进入携带所述接合型质粒的细菌宿主细胞。一旦所述噬菌体已接触并将其基因组插入 到所述细菌宿主细胞中，所述宿主细胞可以表达合适的受体。与该受体结合的噬菌体可 以停止或减少宿主细菌细胞以及其中含有的相关质粒的复制。另一方面，所述方法包 括用编码抗生素抗性和/或毒力因子和噬菌体受体的质粒转化增加比例的细菌群体的步 骤。因此，在被适当的噬菌体感染后，感染性的或致病性的细菌群体可以转变为易感于 杀死或增殖减少的细菌群体。
在一实施方案中，异质细菌群体中这些携带质粒的细菌的绝对数量降低例如起 始总数的10%、20%, 25%, 40%, 50%, 75%, 80%或90%。存在的细菌数量可以通 过以下测定，例如使用血细胞计数器的细胞计数或在合适的培养基上连续稀释，包括在 合适的选择条件下。
在另一实施方案中，噬菌体是宽宿主范围噬菌体。宽宿主范围噬菌体的实 例包括噬菌体的复层噬菌体科；质粒依赖性的宽宿主范围噬菌体；以二十面体形态、 脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个或多个为特征的噬 菌体；以及选自以下的噬菌体PRD1、PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GILOU Bam35、PhiNSll 或 GIL16、AP50、P23-62、-65、-65H、-71、-72、-77、 P37-2、-4、-4A、-4B、-6、-6A、-7A、-8、-8B、-9、-9A、-3、-13B、-13C 、-13L、-14A、-21、-21C、-21T、-26、-26S、-28、-36、-41、-41A、-41B、-43、-4 5、-50、-50L、-61、61L、-62、-63、-64、-64C、_64L、-64T、-71、-72、-72 L、-73、-74、-76、-77、-81、-82、-83、-84、-87、-88、P78-76。
在另一实施方案中，接合型质粒具有一个或多个以下特征不相容性群中的成 员资格，例如 N、P、W、L/M、T、U、W、Y、B/O、FIK II、K、com9、FK HIU HI2、X、A/C、D、FIV> FV/FO、FVK H13、HIK 12、Igamma> J、V 等，包括其例 如展现出基本的序列和或功能关系的变体；编码一种或多种在复层病毒噬菌体复制中重 要的其他基因；编码一种或多种抗生素抗性、选择或毒力标记；是与宿主细菌细胞染色 体分离的DNA的形式；或染色体的部分；编码一种或多种用于细菌接合的菌毛基因。
在另一实施方案中，异质细菌群体处于对数或稳定状态生长阶段。所述细菌群 体可以见于多种环境中，例如食物加工单位；或水处理设施中；污水处理厂；医疗单位 中；例如海洋环境、河口水或温泉的环境中。所述细菌群体可以在协同菌落中，其中不 同种相互作用以制造有活力的菌落，正如在生物膜中或白蚁的肠中。在这些菌落中，关10键成员的去除可以去除群体的活力。所述细菌群体可以见于真核细胞或器官培养物中。 在其他实施方案中，所述细菌群体见于，例如真核宿主中；脊椎生物体中或脊椎生物体 上；或哺乳动物中或哺乳动物上。 在另一实施方案中，细菌宿主细胞和噬菌体之间的接触发生在细菌细胞表面上 的或例如菌毛的细菌细胞的附器(appendage)上的接合复合物处。所述接合复合物可以与 接合型或可移动质粒相关联。接触还可以通过噬菌体相关蛋白发生，所述噬菌体相关蛋 白识别并结合上述接合复合物。对于噬菌体和宿主细菌细胞之间的接触，37°C是优选的 温度，尽管在其他较低或较高的温度接触会发生。用于接触的优选的最适pH是7.0，但 是在较高或较低的pH值下接触会发生。在另一实施方案中，使用能够在有或无噬菌体扩增的多种多重感染下与宿主细 菌细胞结合的噬菌体，发生细菌宿主细胞和噬菌体的接触。另一方面，本发明提供将可传递遗传元件中编码的噬菌体结合易感性，从易感 于噬菌体结合的供体细菌细胞转移到非易感于所述噬菌体结合的接受体细菌细胞的方 法。所述方法包括在可传递遗传元件被从供体细胞转移到接受体细胞的条件下，将非易 感的细菌细胞暴露于易感的细胞的步骤。在一实施方案中，可传递遗传元件是质粒或染色体片段。所述可传递遗传元 件优选地编码复层病毒噬菌体受体；或菌毛；或细菌接合复合物的组分。在其他实施 方案中，可传递遗传元件是质粒。优选的质粒的实例包括，例如F、R386、RU Col B-K99、Col B-K166, R124、R62、R64、R483、R391、R46、R724、RP4、RK2、 R751、RSF1010、R401、R388或S_a。所述质粒可以在不相容性群(Inc群)中，例如 N、P、W、L/M、T、U、W、Y、B/O、FIK II、K、com9、FK HIl、HI2、X、A/ C、D、FIV> FV/FO、FVK H13、HIK 12、Igamma、J 禾Π V，或其变体。噬菌体易感 供体可以是，例如F+细胞；或来自例如埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆 菌属、弧菌属、不云力细菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、 芽胞杆菌属或微球菌属的属；或抗生素抗性基因或毒力基因的载体。非噬菌体易感的 接受体细菌细胞可以是，例如F-细胞；或来自例如埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏 菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细菌属、葡萄球菌属、链球菌属、芽胞杆菌属或微球 菌属的属。如果在本方法中使用复层病毒噬菌体，优选的复层病毒包括，例如PRD1、 PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GILOU Bam35、PhiNSll 或 GIL16、AP50、 P23-62、-65、-65H、-71、-72、-77、P37-2、-4、-4A、-4B、-6、-6A、-7A、-8、 -8B、"9、"9A、-3、-13B、-13C、_13L、-14A、-21、-21C、-21T、-26、-26S、-28、-36、-4 1、-41A、-41B、-43、-45、-50、-50L、-61、61L、-62、-63、-64、-64C、-64L、-64 T、 -71、 -72、 -72L、 -73、 -74、 -76、 -77、 -81、 -82、 -83、 -84、 -87、 -88、 P78-76。 在优选的实施方案中，复层病毒噬菌体易感细胞的比例在细菌菌落或感染中增加。在另一实施方案中，例如复层病毒的噬菌体被用于感染致使表达受体的细胞， 并且优选地发生以下结果噬菌体感染导致易感细胞的死亡；在易感细胞群体中编码抗 生素抗性或细菌毒力基因的其他可移动元件的传递减少；抗生素抗性和噬菌体抗性的以 及有毒力的细菌群体减少。在本发明的另一方面，在上述任何方法中，合适的一种或多种抗生素与噬菌体一起给予。在优选的实施方案中，噬菌体和抗生素的联合给予引起异质细菌群体中的易 感细菌细胞的协同减少或群体中发现的质粒DNA拷贝的数量减少。发明详述I 前言 从世界不同地方分离的噬菌体的特别的群已经被表征为感染携带接合型质粒的 革兰氏阴性细菌。参见 Grahn，et al.(2006) “ PRDl Dissectingthe Genome, Structure and Entry" (PRD 1 剖析基因组、结构和进入)inCalendar(ed.) The Bacteriophages (噬菌 体)(2ded.)OxfordUniv.Press，ISBN-13 9780195148503。非常相似的分离物也感染革
兰氏阳性宿主细菌。这些密切相关的噬菌体已经被共同划分到复层噬菌体科并且包括， 例如命名为 PR3、PR4、PR5、PR772、L17、AP50、NSll 和 P37-14 的噬菌体。在这 些噬菌体的各种感兴趣的特征中的是，复制机构、衣壳构造、主要外壳蛋白折叠和顶点 结构十分类似于人类腺病毒中的那些。这带来了以下提示，这些病毒属于具有先于细菌 和真核生命领域分叉的共同祖先的原始谱系。复层噬菌体科(下文称为复层病毒)的结 构特征提示了符合具有功能上适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性宿主细菌两者的结合和感 染机构的这些噬菌体的一些潜在的原理。因此，如所述，涉及宿主结合和感染中高选择 性的普通噬菌体生物学法则似乎不适用于这些特殊的宽宿主范围噬菌体，并且可能不适 用于其他的。复层病毒通常具有二十面体外部蛋白衣壳、脂膜双层和病毒DNA基因组。表 征最充分的PRDl噬菌体成员具有宽宿主范围，是供体特异性噬菌体，并且仅感染携带 IncP> IncN或IncW的宿主细胞，所述IncP、IncN或IncW是多抗药性接合型质粒。Inc 质粒是“不相容性”群质粒，其有效地防止相同不相容性群的其他质粒共享宿主，但似 乎是噬菌体感染所必需的。因此，该质粒似乎编码噬菌体感染所必需的一些功能，推测 地是噬菌体受体。不同不相容性群质粒似乎能共存于单一宿主，但是存在防止相同群的 多质粒共感染单一宿主的机构。质粒通常编码噬菌体受体，并赋予宿主细菌噬菌体结合 (以及最终感染)易感性。这意味着易感性可以被转移到最初不易感的宿主细胞。存在很多不同Inc群，群中有一个或多个已描述的质粒。例如，由质粒F和R386 所代表的群Fl ；由质粒Rl所代表的群FII ；由质粒Col B-K99和Col B-K166所代表的 群FIII ；由质粒Rl24所代表的群FIV ；由质粒R62、R64和R483 (至少5个亚群)所代 表的群I;由质粒R391所代表的群J;由质粒R46所代表的群N;由质粒R724所代表的 群O ；由质粒RP4、RK2和R751所代表的群P ；由质粒RSF1010所代表的群Q ；由质粒 R401所代表的群T ；以及由质粒R388和S_a所代表的群W。存在具有较少代表的其他 相似的群并且随着时间会被鉴定出来。II.定义“细菌培养物”是细胞的群体，其中的一些或全部是细菌。在实验室的情况 下，通常培养物是同质的并且经常是克隆的。在临床的情况下，经常存在“异质细菌培 养物”。所述培养物会经常包括多细菌种，每个细菌种经常含有遗传变体，并且这些可 以相互作用并展现出对集体群体的系统生物学效应。异质细菌培养物可以包括多于一个 细菌种。在一些实施方案中，异质细菌培养物中发现多于2、3、5或10个细菌种。异 质细菌培养物的不断变化的方面可以造成培养物内不同亚群体的相对量和流行的改变以及群体发展的作为结果的指向。在其他情况下，具体的分离物可以是克隆的，并且某些 亚群体可以是不同感染性疾病症状的病灶或原因。培养物的不同成员可以是克隆的，可 以是多克隆的或培养物可以包括混合种。群体可以具有协同群体组分，其经常形成生 物膜结构。参见，例如Talsma(2007) ‘‘ Biofilms on medical devices"(医学设备上的生 物膜)Home Healthc.Nurse 25(9) 589-94PMID 18049256 ； Paju 禾Π Scannapieco “ Oral Biofilms，periodontitis，and pulmonary infections “ ( 口腔生物膜、牙周炎和肺感染) Oral Dis. 13 (6) 508-512PMID 17944664 ； Visai, et al. (2007) “ Staphylococcus biofilm components as targets for vaccines anddrags “(葡萄球菌属生物膜组分作为疫 苗和药物的 IE 点)Int.J.Artif.Organs 30(9) 813-819PMID 17918127 ； del Pozo 禾口 Patel (2007) “ Thechallenge of treating biofilm—associated bacterial infections "(治疗生 物膜相关细菌感染的挑战)Clin.Pharmacol.Ther.82(2) 204-209PMID 17538551 ；禾口 Ryan (2007) “ Infection following soft tissue injury its role inwound healing “(软组织 损伤后的感染其在伤口愈合中的作用)CurrOpin.Infect.Dis.220(2) 124-128PMID 17496569，以及普通临床微生物学教科书。异质细菌培养物包括协同/共生生物培养 物，例如生物膜。对于此类型异质细菌培养物，去除培养物的一个组分可以使所述培养 物无法作为整体生存。参见，例如 Colin 和 Moran(2006) 〃 Molecular Interactionsbetween Bacterial Symbionts and Their Hosts 〃(细菌共生体及其宿主之间的分子相互作用)Cell 126 453-465。哺乳动物细菌感染的典型部位和见于感染中的异质细菌培养物的实例在下文列 出。感染的任何部位可以包括至少两个或更多的下文列出的种。人/动物肠埃希氏菌属的种、沙门氏菌属的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、 假单胞菌属的种、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)的种和变形菌属的种。人咽喉(以及吸入性肺炎、鼻窦感染、中耳感染等)葡萄球菌属的种、链球菌 属的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、棒状杆菌属(Comybacterium)的种和奈瑟氏菌 属(Neisseria)的种。皮肤伤口 /烧伤假单胞菌属的种、葡萄球菌属的种、克雷白氏杆菌属的种。 公路事故伤口感染主要是土壤生物体+厌氧微生物(梭菌属(Clostridium)的种、拟杆 菌属(bacterioides)的种)。 见于环境中的异质细菌培养物可以包括至少两个细菌种，包括以下种中的 一个埃希氏菌属的种、沙门氏菌属的种、志贺氏菌属的种、假单胞菌属的种、 克雷白氏杆菌属的种、变形菌属的种、芽孢杆菌属的种、土壤分支杆菌和链霉菌属 (Streptomyces)。此列表不排除可以存在于群体中的其他类型的细菌种。可以存在含有亚类或亚群体的质粒，例如一些细菌可以具有多种不同质粒或其 组合，这可以赋予在某些条件下多种选择性优势。某些质粒可以编码一个或多个抗生素 抗性或毒力基因。Inc群质粒通常用作防止不相容性群的其他质粒共存在相同宿主中。 参见，例如 Fem4ndez_L0pez, etal. (2006) “ Dynamics of the IncW genetic backbone imply general trends inconjugative plasmid evolution" (IncW基因骨架的动力学暗示接合型质粒进 化中的一般趋势)FEMS Microbiol.Rev.30(6) 942-66PMID 17026718 ；以及 Adamczyk 禾口 Jagura-Burdzy (2003) “ Spread and survival oipromiscuous IncP-1 plasmids “(杂 IncP-1质粒的扩散和存活)人(^3丨0(^111201.50(2): 425-53PMID 12833168。种中的异质性经 常可以反映出不同形式之间选择压力的缺乏或单一优选表型的不完全选择。
复层病毒，即复层噬菌体科的成员，是指某些宽宿主范围噬菌体。复层病毒 是宽宿主范围噬菌体的一种形式，而确实存在其他的，并且通过合适的表征或相关选 择标准会发现其他的。分类标准可以基于属或种的成员间共享的结构和功能特征的组 合。特别地，存在其他相似噬菌体，例如丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科 (Leviviridae)和短尾噬菌体科(Podoviridae)类别的其他相似噬菌体，它们的感染性是质 粒依赖性的。特别地，这些实例包括噬菌体，所述噬菌体的宿主范围是由具有特定质粒 的宿主所限定，所述特定质粒例如编码针对分别的噬菌体的受体。同样地，这些质粒赋 予与所述质粒相容的宿主的噬菌体结合和感染的能力。在其他质粒依赖性噬菌体中，包括有IncP质粒提供对于例如PR64FS和Ifl的 某些丝状噬菌体科噬菌体的易感性。如其他地方所述，IncP、IncN和IncW提供对于例 如PRD1、PR4、PR3、PR5、PR772和L17的某些复层噬菌体科噬菌体的易感性。IncD 质粒提供对于某些光滑噬菌体科或RNA噬菌体的易感性，所述某些光滑噬菌体科或RNA 噬菌体包括，例如噬菌体D ； R687、R711b、R778b和R840 ；质粒编码类似于噬菌体M 和pilHa的结构并且噬菌体附着于菌毛的侧面和末端。空斑形成表现出一些温度敏感 性，经常是较低温度时具有较高的敏感性。IncM提供对于例如噬菌体M的RNA噬菌 体的敏感性，并且似乎对很多含有该质粒的生物体有效。IncX、IncM> IncN、IncPl、 IncU、IncW和质粒R775似乎提供对于包括例如噬菌体X和R6K在内的吸附菌毛尖部的 丝状噬菌体的敏感性。IncC提供对于RNA噬菌体的易感性，所述RNA噬菌体包括例如 噬菌体C-I ；或包括例如噬菌体C-2在内的丝状噬菌体。IncC、IncD和IncJ提供对于包 括例如噬菌体J在内的长尾噬菌体科(siphoviridae)噬菌体的易感性。Folac质粒提供对 于噬菌体Folac的易感性。IncP质粒还提供对于丝状噬菌体Ρβ的易感性(参见Luiten， etal. (1985) J.Virol.56 (1)268-276)，并且其中的受体结合节段可以用于靶向于杀死剂，无 论是完整的噬菌体或连接到受体结合结构域的其他活性(参见，例如WO 2007/130655 ； PCT/US2007/010972)。同样地，IncI或IncN质粒提供对于丝状噬菌体Ike的易感性； 并且IncI、IncN和IncP质粒赋予对于丝状噬菌体12-2的易感性。参见，例如Bradley， etal.(1983)JBact.l54(l) 505-507。已述的各种复层噬菌体(tectiphage)影响不同革兰氏阳性生物，例如Bam35作用 于苏云金芽孢杆菌(B.thuringenesis) ； AP50作用于炭疽杆菌(B.antracis) ； PhiNSl作用于 B.adiocalarius ； GIL16和GILOl作用于苏云金芽孢杆菌；以及pBCLIN作用于仙人掌杆菌 (B.cereus)。宽宿主范围噬菌体会是其宿主范围通常比高特异性的细菌宿主特异性法则更 宽的噬菌体。参见，例如 Bamford，etal. (1995) “ BacteriophagePRDl a broad host range DSDNA tectivirus with an internal membrane “(噬菌体 PRDl 具有内膜的宽宿 主范围 DSDNA 复层病毒)Adv.Virus Res.45 281-319PMID 7793328 ；和 Saren，et al. (2005) “ A snapshot of viralevolution from genome analysis of the tectiviridae family "(来 自复层噬菌体科的基因组分析的病毒进化概要)J Mol.Biol.350 (3) 427-40PMID 15946683。通常，宽宿主范围噬菌体可以感染很多宿主，所述宿主表达合适的受体分子，但是可以来自于被归入分歧的属、科或目分类类别的宿主。受体可以在接合型质粒 上或其他地方编码，以便于按照需要提供结合、感染和/或杀死所必需的基因。接合型质粒通常编码其自身细胞间传递所需要的功能，所述细胞间传递优选地 通过接合。在本文使用的情况下，意指编码大部分必需基因的功能，所述功能留下选择 或改造可以弥补质粒自身上失去的组分的构建体的可能性。也存在通过添加或选择已表 现出宽宿主范围的质粒来拓宽质粒的宿主范围的手段，所述已表现出宽宿主范围的质粒 包含复制的低特异性原点或与所需的宿主范围相容的多原点。接合质粒是“可移动元 件”的一种形式，其通常是物理装置，通过该装置实现细菌种和致病型的多样化。例 如，多样的移动DNA元件的侧向基因转移(Iateralgenetransfer(LGT))可以借助质粒、噬 菌体、转座子和基因组岛发生。尽管最通常考虑的装置是质粒，但是相似的功能可以通 过噬菌体、转座子等中所描述的原理的类似应用来实现。接合型质粒的减少，无论是绝对数量或宿主细胞中的 流行，可以以很多方式实 现。携带大的质粒的选择劣势可以针对具有所述质粒的宿主而选择或造成所述宿主丢失 全部的或部分的质粒。相反，质粒可以赋予例如抗生素抗性的有利表型，并且所有细胞 可以具有所述质粒。在其他情况下，质粒可以编码噬菌体的受体，这使噬菌体成为杀死 或去除具有所述质粒的宿主的装置。在一些实施方案中，接合型质粒是重组质粒，其已 被改造以减小其大小(减少核苷酸总数)，但保持接合型质粒的功能，即细胞之间转移的 能力和核酸序列的存在，所述核酸序列在宿主细胞中表达时，编码复层病毒的受体。减 少可以是在质粒的绝对数量、培养物中具有所述质粒的相关宿主的数量或具有所述质粒 的宿主的相关部分。交配对形成系统是DNA从一个细胞被转移到另一个细胞所凭借的装置。这 区别于细胞分裂产生两个细胞，而是两个细胞彼此转移一些DNA组分。参见例 如，参见例如 Schaechter (2004) The Desk Encyclopedia ofMicrobiologv (微生物学案 头百科)(2d ed.) Academic Press，ISBN0126213615, 9780126213614 ； Funnell 和 Phillips (eds.2004) PlasmidBiologv (质粒生物学)ASM Press, ISBN-IO 1555812651， ISBN-13 978-1555812652 ； Streips 禾口 Yasbin (2003) Modern Microbial Genetics (现 代微生物遗传学)(2d ed.) Wilev-IEEE, 2003，ISBN 0471461083，9780471461081 ； Schrodera 禾口 Lankab (2005) “ The mating pair formationsystem of conjugative plasmids-A versatile secretion machinery for transferof proteins and DNA "(接合型质粒的交配对形 成系统-用于蛋白和DNA转移的多用途分泌机构)Plasmid 54(1) 1-25 ； Francia, et al. (2004) “ Aclassification scheme for mobilization regions of bacterial plasmids "(细菌质粒 移动区的分类方案)FEMS Microbiol Rev.28(l) 79-100 ； Frost, et al.(1994) “ Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the Fsex factor " (F '性因子 的转移区的序列和基因产物分析)Microbiol Rev.58 (2) 162-210 ； Novotny, et al. (1969) “ Functions of F Pili in Mating-PairFormation and Male Bacteriophage Infection Studied by Blending Spectraand Reappearance Kinetics “(通过调和光谱和复现动力学 研究F菌毛在交配对形成和雄性噬菌体感染中的功能)J.Bact.98 (3) : 1307-1319 ； Delmonte-Corrado， et al. (2007) “ Lectin-Binding Sites Involved inParamecium primaurelia Mating Pair Formation"(参与草履虫交配对形成的凝集素结合位点)Journal of EukaryoticMicrobiology 44 (6) 603—608; Murakami 禾口 Haga (1995) " Interpecific Pair Formation Induced by NaturalMating Reaction in Paramecium ‘‘(草履虫属中天然交配反应诱导的 种间对形成)Zoological Sci 12 219-223。革兰氏阳性细菌中的交配对形成Dale和 Park (2004) Molecular Genetics of Bacteria (细菌的分子遗传学)(4th ed.) John Wiley 禾口 Sons0通常，转移通过接合机构发生，但是其变体，包括转化、噬菌体或部分噬菌体基 因组转移、转导或其他相关过程，通常会实现所需目的。在接合过程中，系统通常包括 产生菌毛以及允许例如抗生素抗性、毒力或噬菌体受体标记 的相关遗传标记或盒的转移 和使用所必需的功能。存在增补(supplement)或弥补(complement)不完整系统的装置， 例如使用一个或多个辅助构建体(helper constructs)。“GMP条件”是指良好作业规范，例如美国政府食品与药品管理局(Foodand Drag Administration of the United States Government)所规定的。类似的规范和规定存在于
欧洲、日本和大部分发达国家。例如“基本上纯的(substantially pure)，，的以上定义中的术语“基本上 (substantially)”，通常表示至少约60%、至少约70%、至少约80%或更优选地至少约 90%和仍然更优选地至少约95%纯的，无论是蛋白、核酸或其他结构分子或其他种类的 分子。本发明的实践可以涉及重组核酸的构建和宿主细胞、优选地细菌宿主细胞中基 因的表达。对于特定宿主的优化的密码子使用通常会是合适的。实现这些结果的分子克 隆技术是本领域已知的。种类繁多的适于例如表达载体的重组核酸构建的克隆和体外扩 增方法是技术人员熟知的。足以指导技术人员通过很多克隆实践的这些技术和说明的实 例见于 Berger 和 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques (分子克隆技术指南)， Methods in Enzymology 卷 152 Academic Press，Inc., San Diego, CA(Berger)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，Ausubel, etal.，eds.，Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.禾口 John Wiley&Sons, Inc.的联合企业，(1999 补编)(Ausubel)。对于重组多肽的表达合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的，并且 包括，例如原核细胞，例如大肠杆菌(Exoli)和真核细胞，包括昆虫、哺乳动物和真菌细 胞(例如黑曲霉(Aspergillus niger))。足以指导技术人员通过包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、 复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术在内的体外扩增方法的操作步骤的实例见
于Berger，Sambrook和 Ausubel，以及Mullis，et al. (1987)美国专利第 4,683,202 号；PCR Protocols A Guide to Methods andApplications (PCR 操作方法方法和应用指南)(Innis, et al.eds) AcademicPress Inc.San Diego, CA (1990) (Innis) ； Arnheim 禾口 Levinson (1990 年 10 月 1 日)C&EN36-47; The Journal OfNIH Research (1991) 3 81-94; Kwoh, etal. (1989) Proc.Nat' 1 Acad.Sci USA 86 1173 ； Guatelli, et al. (1990)Proc.Nat' 1 Acad.Sci.USA 87 1874 ； Lomell, et al. (1989) J.Clin.Chem.35 : 1826 ； Landegren, et al. (1988) Science 241 : 1077-1080 ； Van Brant (1990) Biotechnology 8 291-294 ； Wu 禾Π Wallace (1989) Gene 4 560 ；以及Barringer，et al. (1990) Gene 89 117。体外克隆扩增的核酸的改进的方法描述 于 Wallace，et al.美国专利第 5,426,039 号。术语“核酸”是指以单链或双链的形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另作限制，其包括天然核苷酸的已知类似物，所述类似物与核酸杂交的方 式与天然存在的核苷酸相似。除非另作说明，特定的核酸序列包括其互补序列。“重组表达盒”或简单地“表达盒”是重组地或合成地生成的、具有能影响 与这些序列相容的宿主中结构基因表达的核酸元件的核酸构建体。表达盒至少包含启动 子和任选地包括转录终止信号。通常，重组表达盒包含待转录的核酸(例如编码所需多 肽的核酸)和启动子。如本文所述，也可以使用实现表达所必需的或有帮助的其他因 素。例如，表达盒还可以包含编码指导表达的蛋白从宿主细胞分泌的信号序列的核苷 酸序列。转录终止信号、增强子和影响基因表达的其他核酸序列也可以包含在表达盒 中。在优选的实施方案中，编码包含噬菌体受体的氨基酸序列的重组表达盒在细菌宿主 细胞中表达。在另一实施方案中，编码包含治疗性蛋白的氨基酸序列的重组表达盒在细 菌宿主细胞中表达。在其他实施方案中，编码包含噬菌体受体的氨基酸序列的多顺反子 (polycistranic)表达盒在细菌宿主细胞中表达。在其他实施方案中，为了产生多于一种蛋 白，例如噬菌体受体和治疗性蛋白，多顺反子表达盒在细菌细胞中表达。在另一多于重 组蛋白的表达的实例中，表达盒可以包括多于一个单顺反子表达盒。
如本文所用，“异源序列”或“异源核酸”是源自对于特定宿主细胞是外源的 来源，或者如果来自相同来源，对其最初的形式进行了修饰。因此，细菌宿主细胞中异 源噬菌体受体基因包括修饰过的对于特定宿主细胞是内源的受体编码基因。异源序列的 修饰还可以例如通过用限制性酶处理DNA以生成能被可操作地连接到启动子的DNA片 段而发生。例如定点诱变的技术对于修饰异源序列也是有用的。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录 因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列影响 对应于所述第二序列的核酸的转录和/或翻译。“蛋白”、“多肽”或“肽”是指聚合物，所述聚合物中的单体是氨基酸并且 通过酰胺键连接在一起，可选地，称为多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用左旋 异构体或右旋异构体。此外，还包括非天然氨基酸，例如丙氨酸、苯基甘氨酸和高 精氨酸。不是基因编码的氨基酸也可以用在本发明中。此外，已经被修饰为包括反应 基团的氨基酸也可以用在本发明中。本发明中使用的所有氨基酸可以是右旋或左旋异构 体。左旋异构体通常是优选的。此外，其他拟肽(peptidomimetics)在本发明中也是有 用的。对于大体的回顾，参见 Spatola，A.F., in CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS (氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学)， B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，NewYork, p.267(1983)。当用于涉及细胞时，术语“重组”表示所述细胞复制异源核酸，或表达由异源 核酸编码的肽或蛋白。重组细胞可以含有不见于细胞的天然(非重组)形式中的基因。 重组细胞还可以含有见于细胞的天然形式中的基因，其中所述基因是修饰过的并且通过 人工手段再引入到所述细胞中。该术语还包括含有对于细胞是内源的核酸的细胞，所述 核酸已被修饰但没有从细胞中移除所述核酸；这些修饰包括通过基因替换、位点特异性 突变和相关技术获得的那些。“重组蛋白”是由重组细胞产生的蛋白。在优选的实施方 案中，重组噬菌体受体由重组细菌细胞产生。III.普通抗生素抗性机制、MDR簇、毒力因子
如上文所示，抗生素已经使用于避免感染性疾病带来的很多问题的医学实践发 生革命性变化。青霉素的发现启动了该途径，并且已经开发出很多不同的防止菌丛生长 的作用机制。作为响应，很多细菌机制已经进化为躲避抗生素的活性，并且几乎所有的 抗生素都导致了宿主靶标所采取的抗性策略。在很多作用机制中，已经开发了破坏细胞 壁合成、细胞膜功能、蛋白合成、核酸合成和代谢作用的抗生素。此外，很多抗性装 置经常是基因上成簇的或连接在一起，经常在染色体外，以便能以有效的方式在宿主之 间转移。通常，染色体外簇在R质粒上，但是可能在其他相关遗传形式上，例如F质 粒或噬菌体。参见，例如 Torres, et al. (2007) ‘‘ Current concepts in antibiotic-resistant gram-negative bacteria “(抗生素抗性革兰氏阴性细菌中的现代概念)Expert Rev.Anti Infect.Ther.5 (5) 833-43。毒力因子是提供微生物致病性中重要功能的结构。参见，例如Finlay和 Falkow (1997) “ Common themes in microbial pathogenicity revisited “(微生物至文病性中 常见主体再探讨)Microb.Mol.Biol.Rev.16 136-169。存在多种微生物致病性的定义， 并且凭借这些毒力基因的存在，病原体可以区别于其非毒性相应物。一些群体已经探 索了究竟是什么构成毒力因子的难题。已有提示，被认为是致病性所必需的蛋白落入 3个类别(1) “真(true)”毒力基因，(2)与毒力有关的、例如“真”因子的表达调 节基因(regulators)的那些，和(3)细菌为了能进行宿主定殖而需要的毒力“生活方式 (life-style)"基因。本质上，毒力因子是由病原体产生的对于在宿主中导致疾病必要的 任何部分。参见，例如 Wassenaar 禾口 Gaastra (2001) ‘‘ Bacterial virulence can we draw the line ？“(细菌毒力:我们可以划界吗？ )FEMS Microbiol.Lett.9995 1-7。
基于毒力和功能的机制，细菌毒力因子可以粗略地被分为几组。这些通常包括 粘附和定殖因子、侵袭素、荚膜和表面组分、内毒素、外毒素、铁载体(siderophores)和 毒素转运体(transporters)。对于很多侵袭病原体，第一宿主屏障通常是粘膜表面，例如肠或呼吸管道。 因为在这些环境中上皮细胞更新是约48小时，细菌必须充分地附着和复制以避免被清 除。因此，很多已经进化出如鞭毛和菌毛/纤毛(fimbriae)的能动的或附着元件以通过 屏障并进行侵袭。简单的附着是通过宿主细胞表面上的受体和细菌细胞表面上的粘附 素介导。一些可以是种或甚至菌株特异性的，而其他表现出组织向性，即变形链球菌 (Streptococcus mutans)会定殖牙齿，但不会在舌上皮。其他实例包括弧菌属、奈瑟氏 菌属和假单胞菌属的种的纤毛蛋白亚基，其结合宿主细胞表面的D-甘露糖。大肠杆菌 (Escherichia coli)也采用该策略，但可以改变纤毛尖部蛋白以结合其他受体例如唾液酸 (S-纤毛(S-fimbriae))。侵袭素与粘附因子的不同在于以下事实，它们在胞外作用，在局部水平破坏宿 主防御并且便于感染通道。大部分是酶，其影响如组织基质和细胞膜的物理屏障。如 此，细菌可以快速通过细胞间空隙扩散。一些外毒素还可以具有短期存在的侵袭性质， 但是与真的侵袭有区别，即来自博代氏杆菌属(Bordetella)的百日咳毒素。存在一些种 类的侵袭性酶。一些溶解例如结缔组织的透明质组分的困难的(hardy)组织(透明质酸 酶梭菌(Clostridial hyaluronidase))。其他蛋白在细胞膜上打孔并且导致细胞裂解(来自 梭菌属(Clostridium)和革兰氏阳性球菌的卵磷脂酶和磷脂酶)。其他固性胞内细菌蛋白(例如来自李斯特菌属(Listeria))已被称为“侵袭素”，但这些专门作用于宿主肌动蛋白 丝并且诱导用于定殖的微生物吞噬(engulftnent)。荚膜和表面组分可以用于避免吞噬作用。很多病原体已经进化出防止巨噬细胞 的附着和吞噬和其他宿主细胞免疫应答的表面组分。这可以采取膜结合蛋白、粘滑的多 糖荚膜或由微生物清除的并结合在其细胞表面的“自身(self)”部分的形式。后者的实 例是梅毒螺旋体(Treponemapallidum)，梅毒的病因体。细菌清除宿主纤连蛋白并使该部 分结合到其外部细胞膜。革兰氏阳性细菌天然地被具有对于周围环境的低通 透性的厚细胞壁包围，而革 兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)或“内毒素”可以针对补体介导的裂解进行保护。此外，两 类都产生的数种抗原可以抑制吸附，如链球菌蛋白M、葡萄球菌蛋白A和伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi)的 Vi 抗原。一些化脓性胞内球菌也具有杀死吞噬细胞的能力。化脓性链球菌和致病性葡萄 球菌(Staphlyococci)都分泌裂解性酶，其导致嗜中性溶酶体破裂到胞质中并杀死宿主细 胞。革兰氏阴性绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)内毒素A通过停止胞内蛋白合成 体系也可以杀死吞噬细胞。内毒素几乎仅为革兰氏阴性生物体所具有。内毒素或脂多糖(LPS)激活宿主补 体途径，并且是炎症的潜在诱导者。它是由3部分组成的外膜化学部分锚定于外膜中 的毒性脂质(脂质A)、免疫原性多糖核心和位于胞外表面的寡糖的抗原O-连接系列。 它被认为是革兰氏阴性细菌病理学的部分。如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides) —样多样的种在细胞表面表达LPS。内毒素对于大部分哺乳动物是有毒的，并且如果遇到过高的剂量，可以是致死 的。具体地，LPS释放进入宿主循环促进某蛋白的结合，其称为“LPS-结合复合物”。 这与多种单核细胞和巨噬细胞上的CD14受体相互作用，触发炎症细胞因子释放以及补体 和凝血级联的活化。包括致热性和丝裂原活性(mitogenicity)的生理不良应激(distress) 最终导致血液脓毒症和死亡。但是，例如作为佐剂使用的低水平的LPS有利地增加宿主 的微生物抗性，并且诱导T-细胞产生更多抗病毒增强Y干扰素。LPS的脂质A组分是 强生物增强剂，可以促进免疫系统。外毒素由有活力的致病细胞分泌。细菌蛋白外毒素是已知最强毒素之一。通常 由噬菌体或质粒编码，存在很多种类并且所有的都是强抗原性的但固有地不稳定。一些 作用在宿主细胞表面，而多数(A/B毒素)与具有受体(B亚基)的靶膜结合并且将第二 部分(A亚基)直接递送到胞质中。更专门的毒素涉及通过特有的“III型”分泌系统将 蛋白“注射”入宿主。后者仅见于一些革兰氏阴性肠病原。毒素也可以按照其在某些 细胞中的生物活性分类，例如白细胞毒素、神经毒素等。充分研究的典型的A/B毒素是来自白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)的 白喉外毒素(DT)。使用的特异性受体是肝素结合表皮生长因子；A-亚基停止宿主蛋白 合成并导致细胞死亡。但是，该毒素也可以利用宿主的受体介导的内吞(RME)，来通过 内涵体进入细胞。胞质中的一个A-亚基足以杀死，并且该细菌一小时可以释放高达5000 个分子。表面作用毒素通常通过与靶细胞分子结合或形成膜孔而引发其效应，细胞裂解通过所述膜孔发生。此类包括幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的空泡毒素、大肠杆菌 溶血素和属于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的“超抗原”。从晶体结构的阐明中，可以明确这类蛋白在分子水平的功能。凭 借通过MHC-II复合物的非特异性结合未致敏(naive) T-细胞受体，触发大量炎症细胞因 子释放，从而导致化脓性发热例如中毒性休克综合症。一些革兰氏阴性肠病原的III型分泌系统是外毒素不常见的类。它们由两类蛋白 组成；在细菌染色体上大的致病岛(pathogenicity islands)上共同编码的结构部分和效应 物。尽管大部分TTSS蛋白结构组分显示出序列同源性，但是效应物以不同方式影响宿主 细胞以便于细菌扩散。例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的6个分泌Yop外毒素强 力地影响肌动蛋白细胞骨架，从而干扰整联蛋白介导的吞噬作用并允许兼性胞内细菌的 摄取。来自弗氏志贺菌(S.flexneri)的Ipa蛋白有助于通过坏死杀死嗜中性粒细胞，从而 允许病原体通过破坏上皮屏障而进入宿主细胞。这些效应物共享的一些特征包括缺乏 如一些其他分泌外毒素中见到的传统sec信号，细菌胞质中附属蛋白(accessory proteins) (也在TTSS致病岛中编码)广泛伴随(chaperoning)，以及编码每种毒素的mRNA中可能 的易位信号。通常，宿主环境在每方面对于细菌都是理想的，除了一方面；铁是丰富的，但 紧密地结合在血红素、铁蛋白、铁转移蛋白或乳铁蛋白中。这可能是感染中的限制因 素。因此，一些病原体已进化出铁载体毒力因子，其介导宿主铁的释放用于寄生消耗。 实例包括来自埃希氏菌属和沙门氏菌属的种的肠螯合素(enterochelin)，其通过高结合常 数从宿主中清除结合铁。涉及从沙门氏菌属中缺失7个肠螯合素基因的实验已表明，当 病原体被注射入小鼠模型时，所述病原体失去其毒力。因此，铁载体对于毒力是必要 的。大部分革兰氏阴性细菌病原体使用4个分泌系统来将蛋白毒素从其胞质转运到 宿主或胞外基质。分别编号为I-IV型，所述系统用于不同类的外毒素，例如大肠杆菌溶 血素通过周质的1型分泌。尽管1型蛋白具有分泌信号，但转运时没有东西被切割，并 且整个过程以涉及穿过内和外膜的孔的一步机制运作。很多特异分泌外毒素基因在致病 岛上是成簇的，与其各自的分泌器基因(secretion apparatus genes)相邻。大部分Α/Β外毒素，例如白喉棒状杆菌和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的外毒素， 通过两步II型系统被转运到细菌细胞表面。在细菌胞质中氨基末端的切割和通过sec体 系的蛋白转运后，形成了周质中间体。然后这穿过第二套跨膜蛋白。IV型分泌外毒素 也利用内膜sec蛋白，但是通过其羧基末端穿过外膜，所述末端例如幽门螺杆菌的CagA 部分。上文已述的III型分泌系统通过将外毒素直接注射进宿主细胞胞质的专门的大分子 (macromolecular) “针(needle) ” 来分泌效应物。很多这些毒力因子通常在质粒上编码，所述质粒在宿主细菌菌株之间转移。减 少具有这些质粒的群体中宿主或质粒的数量的手段可以使用本文所述的方法实现。质粒 或可移动元件靶标可以比仅仅抗菌抗性质粒宽得多，但包括编码一些或全部这些多种不 同毒力特征的那些。 IV.接合系统；可移动元件；DNA转移质粒通常是复制子，或DNA的复制部件(replicating piece)，其以染色体外状态稳定遗传。在较早的文献中，术语附加体(episome)用于能整合到染色体中的质粒，但 是该术语已经很大程度上被弃用了。质粒通常以具有自主复制能力的双链DNA的共价闭 合环状部件存在，并且正是该性质引出其分离和物理识别。其结构的闭合共价性质允许 它们通过凝胶电泳或氯化铯浮力密度梯度与染色体DNA分开。参见，例如bact.wisc.edu 或基础教科书或微生物学或分子生物学专著。两个特征是几乎所有质粒所共有的，它们具有复制功能并且通常落入不相容性 群，所述不相容性群限制哪些质粒可以共存于单一宿主中。最简单的情况下，复制功能源自一个或多个具有复制必需的反式作用蛋白的复 制原点，所述反式作用蛋白是由质粒自身编码的或“借”自正常宿主复制体系。一些质 粒的宽宿主范围至少部分地用允许它们在多种不相似的宿主中发挥功能的它们的多重复 制系统来解释，例如杂(promiscuous)复制原点、多重可选原点、组合等。
质粒通常仅落入很多存在的不相容性群中的一个。如果两个质粒中任意一个在 另一个存在的情况下比其自身存在的情况下较不稳定，那么两个质粒是不相容的。存在 多于30个不相容性群，迄今为止的描述还未见到上限。不相容性的基因型名称为inc， 不相容性通常是质粒为了保持细胞中一定拷贝数的要求的必然结果。如果给定的不相容 性群的质粒具有其试图保持的一定拷贝数，那么当在同一细胞中发现同一不相容性群的 两个质粒时，就会发生竞争。能更快地复制或具有一些其他优势的质粒会表现出不相容 性系统所允许的在拷贝中不成比例的程度。出人意料的是，当两个质粒都具有分配它们 自身到子代细胞中的相同功能时，所述质粒也可以是不相容的。质粒中经常发现多种其他特征。很多质粒含有不参与复制或不相容性的基因。 这些基因可以编码以下性质如抗生素抗性(并因此引出术语“抗性”或“R”因子)、 复合物大分子的降解、细菌素的产生、对于多种重金属的抗性、抗生素的合成或动物或 植物宿主的感染所必需的毒力因子。第二个常见的性质是促进质粒自身从一个细胞转移到另一个细胞的能力，称为 接合能力。接合是通过细胞与细胞接触在细胞间遗传信息的单向转移。同样地，其并不 限于质粒，而可以发生在任何DNA，只要关键元件存在于细胞中。对于细胞接触的这个 要求将接合区别于转导和转化。术语“单向的”是指质粒拷贝从一个称为“供体”的 细胞转移到另一个称为“接受体”的细胞的事实。有两个不相似的功能参与接合能力 第一个是称为OriT或mob的转移起始位点。前面的术语是用于记忆“转移原点(origin of transfer)"，第二个是缩写的“移动性”。每种情况下，它们是指DNA上的位点而不 是指可散播的产物。第二类的功能是由作用于这些位点并且造成发生移动所必需的功能 范围的蛋白提供。这些是由tra基因编码并且具有包括菌毛形成在内的多种功能，所述菌 毛与接受体细胞接触并且似乎参与到将供体和接受体细胞拉到一起。这带来膜接触的区 域并且似乎形成了某种接合桥。tra基因的产物参与到这些事件的调节和物理构建。该 序列中的一些事件触发通过特异性单链核酸酶的、称为OriT的、位点的切口以及一个或 多个“先导(pilot)”蛋白与DNA的游离5'末端的后续结合。这些蛋白似乎在转移的 DNA的后续复制中发挥功能，其中一个用作“引发酶(primase)”。然后单链被从该末 端转移到接受体，同时供体中发生“滚环”形式的复制。如果被转移的DNA是质粒， 那么在接受体中它成为双链的和环状的(circularized)，借此它推测地可以复制。如果转移DNA是染色体的，环化不会发生，但是以某种方式生成互补的链并且可以发生与染色 体的同源重组(无论如何，如果进来的DNA将被遗传，那么其变为与复制子相关联)。 质粒可能是非接合型的并仍然是可移动的(如果tra产物由另一质粒供给)，只要OriT位 点是在质粒上编码的(具有OriT位点的被转移)。最后，缺乏tra功能和oriT功能两者 的质粒会是非接合型的和不可移动的。反向遗传学中很多应用使用含有OriT区的小的质 粒，其中tra功能由细胞中另一质粒供给。 质粒通常具有增加细胞分裂后两个子代细胞都会含有所述质粒的拷贝的可能性 的机制。负责此工作的分配功能(通常称为par)是通过多种机制包括质粒多体的单体 化(具有很多单体比具有一些多体更好)和使质粒与膜关联(其显然有助于物理上脱离质 粒)。当我们指细胞“丢失”的质粒，实际的机制几乎一定是所述细胞在之前的细胞分 裂中由于不合适的分配而从未接受到所述质粒。该丢失称为分离(segregation)。对于低 和高拷贝数的质粒两者，该“丢失”以(非常粗略地的频率发生，但是已发现一些 格外稳定的质粒，这推测是由于一套不同的par功能。一些质粒已进化出效果类似于par 系统的系统，其通过杀死未接收到质粒的任何子代细胞以“防止”分离。它们做到这样 是通过产生相对长期的杀死功能(kil)和短期的杀死覆盖(kill override) (kor)功能。没有 质粒的子代会具有kil产物，但不能保持必需量的kor产物存活。对于实验人员，这些系 统会看似分配系统，因为在缺乏这些的突变体中，会更频繁地检测到无质粒的分离体。 它们也可以表现出inc功能。偶尔，分离菌株的无质粒衍生体是必要的，所述菌株当前含有质粒，其称为治 愈的步骤。这些可以通过以下找到ω自发地(可能地复制体印在分离的菌落上，如 果所述质粒赋予可评分的表型)；Gi)富集后(同样地，如果所述质粒赋予生长表型)； (iii)选择不同的但不相容的质粒进入细胞；或Gv)用升高的温度或化学品处理，所述化 学品例如吖啶、溴化乙锭、十二烷基磺酸钠和新生霉素(因为前两个化学品已知为突变 齐U，所以它们应该有限制地使用)。特别地，本发明通过去除那些具有赋予噬菌体结合或 感染敏感性的质粒的细胞来提供“治愈”的形式。具有接合能力的性质的不相容性群中，F因子是研究得最充分的。在其染色体外 状态，所述因子具有约62kb的分子量并且编码至少20个tra基因。其还含有3个IS3拷 贝、1个IS2拷贝和1个人序列拷贝以及用于不相容性和复制的基因。F因子可以以3种 不同状态存在“F+”是指自主的、染色体外的状态的、仅含有上述遗传信息的因子。
"Hfr"(指“高频率重组”)状态描述的是所述因子已将自身整合入染色体中的情况， 这可能由于其多个插入序列。最后，“F' ”或(F首要的(Fprime))状态是指因子，当 其以染色体外元件存在时，却具有所述因子含有共价地连接到其上的一些部分的染色体 DNA的其他需求。不含F因子的菌株被认为是“F-”。将F+与F-菌株交配时，发现快速的、有效的F+的转移(一小时约50%的转 移)，而染色体的转移只处于每供体细胞10E-5至10E-7的水平。这可能是由于稀少的、 自发的Hfr形成。如上文提及，由于质粒上的插入序列，Hfr' s通过整合到染色体中发 生。这些似乎引起优选位点上的整合，这样发现多种不同的Hfr' s,所述Hfr' s由于 其转移原点和转移方向而不同。当实施Hfr菌株和F-菌株之间的杂交时，见到高频率的 (10E-2至10E-5)染色体标记的转移。该转移既是定向的也是时间依赖的。因为转移始于F因子中的oriT位点，所以部分的F因子先被转移，然后是染色体的剩余部分。如果 整个染色体被转移，那么其余部分的F因子被转移。F因子自身不整合入接受体，因为 没有对于此整合的同源性，但已被转移的染色体DNA可以通过同源重组进行重组。整个 大肠杆菌染色体的转移花费约100分钟，但是会非常经常地得到交配对的自发破坏。该 破坏表示后期转移的标记通常是完全不转移的，产生趋势为10E3级别(即早期的标记转 移比最远的标记更频繁约10E3倍)的转移梯度。最终结果通常是未能转移整个染色体。 在F'和F-菌株之间的杂交中，取决于供体的基因型，两个可能的提供事件可以发生。 如果供体菌株是Rec_，那么质粒在供体中会仍作为染色体外元件并且会是接合事件中转 移的仅有的遗传信息。但是，如果供体细胞是Rec+，那么同源重组会导致F' s中的一 些整合入供体的染色体并因此像Hfr' s—样作用。通常，由于该原因，R ec-供体用于 此类分析。典型F因子的“局限性”是其用途通常受限于大肠杆菌及其近亲。在这些生物 中，F' s是大的、低拷贝的、能够染色体移动的接合型质粒，但是过大以至于不能物理 上轻易地处理。例如改造版本的新的变体会被创造出以用于所述方法，或为了转移的效 率、表达或靶噬菌体的易感性而进行优化。一些优选的新的变体比天然存在的F因子更 小，例如包含更少的核苷酸。典型F因子的其他新的变体提供例如复制原点和编码复层 病毒受体的核酸之间更紧密的连接。具有范围广泛的性质的多种其他不相容性群的质粒已用于遗传分析中。天然分 离物在拷贝数(从每细胞约一个至数百个)、大小(数kB至数百kB)、稳定性、接合能 力、宿主范围和药物抗性中有所不同。此外，因为这些性质中的很多是一个或小套基因 的产物，所以质粒的巨大阵列已被改造为具有特定套的有用性质，包括很多用于体外操 作的特有的克隆位点。专门的手册描述通用选择并且新的版本在文献中不断描述。术语“交配对形成系统”适用于用于接合的质粒，以及允许例如通过转导或 转化的有效的DNA转移的其他系统。参见，例如SchrSdera和Lankab (2005) “ The mating pair formation system of conjugative plasmids-A versatile secretion machinery for transfer of proteins and DNA“(接合型质粒的交配对形成系统-用于蛋白和DNA转移的 多用途分泌机构)Plasmid54 1-25 ； Dale 和 Park (2004) Molecular Genetics of Bacteria (细 菌的分子遗传学)(4th ed.) Wiley ISBN-10 047085085X, ISBN-13 978-0470850855 ； Brooks (2007) Medical Microbiology (医学微生物学)(24th ed.) McGraw-Hill Medical, ISBN-10 0071476660，ISBN—13 : 978—0071476669; Demuch 禾口 Lamont (eds.2006) Bacterial CeU-to-Cell Communication Rolein Virulence and Pathogenesis (细菌的细胞间 通信毒力和发病机制中的作用)(Advances in Molecular and Cellular Microbiology (分子 和细胞微生物学进展))Cambridge University Press, ISBN-10 0521846382，ISBN-13 978-0521846387 ； Phillips (ed.2004) Plasmid Biology ASM Press ; ISBN-10 1555812651， ISBN-13 978-1555812652 ； Thomas (2000) Horizontal GenePool Bacterial Plasmids and Gene Spread(横向基因池细菌质粒和基因扩散)CRC Press, ISBN-10 9057024624， ISBN-13 978-9057024627 ；以及其他微生物学和细菌学教科书。在接合机制的情况下，在群体中细胞可以从F-转变为F+。因为质粒通常还携 带抗性标记，抗生素方面的选择会确保含有质粒表型变为占主导的。在质粒还编码对于噬菌体的受体的情况下，抗性标记与噬菌体易感性标记的联接提供抗生素加噬菌体暴露 的组合，以显著地减少细菌群体，其足以使免疫或其他宿主细菌清除系统将群体减至最 低。在许多情况下，联合可以协同发挥功能，这样低于阈值量的抗生素和噬菌体可以有 效地控制感染。此外，用噬菌体和抗生素暂时的治疗可以重叠或分开。V.宽宿主范围噬菌体；复层噬菌体科属典型的噬菌体法则指出，噬菌体结合和感染是极其窄宿主范围过程，并且大部 分噬菌体缺乏在多样性的不同宿主中结合和/或复制的能力。噬菌体的复层噬菌体科 的描述提示特有的宽宿主范围的性质是不常见的。窄宿主范围的具体机制可能是由于选 择性观察和两个宿主细胞结合、感染、复制和裂解功能的通常高度专门的相互作用的组
I=I O 相反，意识到宽宿主范围噬菌体的潜在价值，表示可以实施对于宽选择性的性 状的选择。首先是具有相对宽宿主范围的噬菌体，可以应用拓宽其宿主特异性的选择 方法。可以进行噬菌体宿主特异性组分的诱变，例如位于尾部纤维末端的特异性结合蛋 白。赋予基因的结合特异性可以使用标准遗传手段进行鉴定，以辨别出涉及哪个噬菌体 蛋白。例如，在PRDl噬菌体中，P2蛋白已被鉴定为主要的靶细胞受体。对于噬菌体 受体和宿主蛋白两者的联合研究将能拓宽结合的范围，并且生物信息学分析也可以鉴定 表达相似噬菌体受体的其他种。受体_结合蛋白相互作用的结构分析将允许将被更少选 择性的结合蛋白识别的靶受体的诱变或设计。除了结合特异性，宿主范围限制中的一些可以与结合后的噬菌体感染中的稍后 步骤有关。因此，会修饰感染、复制和裂解功能来拓宽杂性(promiscuity)以成功地造成 宿主菌株的更宽的范围。可选地，这些功能的限制性调节可以通过诱变和选择过程来放 松。特别地，发现跨越革兰氏阴性和革兰氏阳性划分的限制性功能的手段将是理 想的，该划分反映了外细胞壁结构之间的结构差异。特别地，革兰氏阳性细菌的细胞 壁结构似乎相似于革兰氏阴性细菌的内细胞壁结构。同样地，革兰氏阴性细菌内宿主 的共同结构特征会易感于能到达那些结构的噬菌体。因此，联合或修饰噬菌体以并入 消化革兰氏阴性菌株的外细胞壁的局部区域的装置可能是有用的。做到这样的酶活 性会存在于正常噬菌体上，所述噬菌体从外细胞壁的外部攻击革兰氏阴性细菌。参见 Padmanabhan, et al. “ Phage Derived Antimicrobial Activities “(噬菌体来源的抗菌剂活性) W0/2007/130655。无论酶活性是附加到噬菌体还是单独给予，外细胞壁的消化可以为噬 菌体提供接触内细胞膜的可及性。应当注意到，在某些情况下，尽管是顿挫型感染，宿主细胞可能变得无能力。 感染进程可能由于复制或裂解功能的失败而失败，而DNA注射的感染过程自身可以使细 胞无能力并杀死细胞而不产生更多噬菌体。在某些情况下，这实现了使宿主细菌细胞免 于进一步生长或毒力功能或作为赋予细菌细胞噬菌体敏感性和/或抗生素抗性的质粒的 贮存体的有意的结果。非复层噬菌体科宽宿主范围病毒在此相似的方式中也会是有用的。其他噬菌 体的受体可以与编码毒力或抗性因子的质粒关联，则所述噬菌体将是可用的。生成将 相关的选择标记连接到对于合适的噬菌体的受体的组分的质粒会是特别有用的，所述的选择标记无论是抗生素抗性还是毒力。参见，例如Gaidelyte，et al.(2006) JBact. 188 5925-5934。在其他相关实施方案中，可以设计或生成来自不同来源的相关噬菌体可以结合 的杂的(例如更宽的噬菌体谱)或多重密切相关的受体。可以构建可结合很多不同宿主 细菌的“万能的(universal) ”噬菌体。适用于很多不同细菌宿主的感染机制可以与提供 的最初的结合或识别功能联合。
在可选的实施方案中，在可移动元件转移可以用于标记接受体靶细胞的不同标 记的情况下，所述标记可以是，例如对于靶标部分的受体或用于杀死表达细胞的识别元 件。例如，所述受体可以是对于例如毒性偶联物的毒性实体的高亲和力受体，或可以是 对于另一杀死系统的受体，所述系统例如巨噬细胞吞噬作用或免疫组分。VI.人工可移动元件构建体；具有受体基因的质粒在许多情况下，通过生成人工构建体而不是使用天然分离物来实现结果可以更 有效地完成本发明的方法。例如，可以构建在质粒或噬菌体的天然分离物上改进的特殊 的版本。修饰可以并入抗性或毒力标记。来自天然进化以例如对抗治疗上有用的抗生素 的标记的变体改造形式可以用于将提供对可选的相关选择性装置抗性的升高的选择性。 例如相关化合物的不同的抗生素可以用于选择编码变体标记的质粒，所述变体标记可能 更紧密地连接到一个或多个用于表达的所需受体。细菌的群体可以经受可选的选择标 记，从而更有力地选择提供使用宽谱噬菌体的更好效率的宿主破坏的可移动元件的所需 版本。可选地，所述变体标记可以连接到更高表达水平受体或连接到表现出在通过对应 的噬菌体的宿主杀死中的更高亲和力或效率的受体。可以构建在杀死表达限定的受体的 宿主中具有更好的效率或特征的噬菌体。在其他实施方案中，可移动元件可以改造为具有对于所述方法的有利特征。质 粒可以设计为展现例如更高效率转移到新宿主、在宿主中更好的表达、改进的受体性 质、DNA甲基化中改变的效率(其导致编码核酸的改变的表达水平)、无关质粒大小或结 构的移除、其他可追踪的特征等。噬菌体或可移动元件可以设计为在使用条件下、例如 在使用的化学或物理条件下更有效地发挥功能。材料的剂型还可以为用途的具体环境设 计，无论是局部、表面、粘膜、溶液等。存在设计或鉴定不同噬菌体识别的更宽谱受体的装置。因此，从很多不同复层 病毒噬菌体等中可以筛选或选择受体。可以筛选和鉴定出选择变体或天然变体。修饰的 亲和力或选择性在合适的用途下将是重要的。在其他情况下，可以施加手段来改变给定 受体的特征，例如通过盐、pH、极性改变物理环境，并且这样可以造成影响配体-受体 相互作用的功能的构象改变。参见以上的质粒依赖性噬菌体和对应质粒的描述。在某些情况下，鉴定在相对于正常实验室条件的极端环境发挥功能的系统可能 是有用的。选择在低或高温度发挥作用的系统，例如在相对于实验室条件的极端环境条 件下，有效的菌毛表达，其允许更有效的到宽群体的转移。周围空间或环境温度可能是 本方法应用于环境矫正的方面。此外，所需噬菌体功能通常可以通过少于完整的噬菌体来实现。噬菌体片段 或部分，例如脓菌素、尾部、酶等，在有效地损害遗传功能方面可以取代完整的复层病 毒。可移动元件的功能可以用当细胞被破坏时发生的核酸的间接降解来损害。
VII.实践应用本发明的实践应用包括，例如公共健康水和废物处理、医院环境中细菌的处 理、食品加工、抗性或毒力编码质粒的治疗性或环境性清除、有效的致敏作用或感染的 评价/检出，以及为获取质粒的选择压力，然后是杀死含有质粒的细胞的步骤。其他应 用包括减少具有质粒的细菌种，其可以在动物设施上实施，例如在有害细菌的存在是不 希望的建筑物和设备的合适的表面上。此外，本方法可以应用于例如(奶牛和菜牛、 猪、鸡、鱼、虾等)的农业动物应用，以在含有不希望的质粒元件的细菌的总的存在上 减少。
一个重要的应用是可能在正常使用中被污染的物品的处理，所述物品例如导 管、医院监护系统、临床仪器以及设备。场所、设备、环境等靶细菌可能是公共健康危 害的地方可以使用提供的方法和组合物进行处理。目的场所包括公共设施，特别是公共 健康设施，其存在处理含有靶细菌的材料的目的或机会，尤其是具有毒力或抗生素抗性 标记的那些靶那些。这些材料可以包括废物产品、例如液体、固体或气体。被很多人触 摸的表面是重要的，包括门把手、水龙头、电梯按钮等。水性废物处理厂可以合并这些方法，来从排出物中清除靶宿主或可移动元件。 固体废物站可以引入这些方法来最小化感染爆发或可移动元件释放的可能性，所述可移 动元件可以将其基因传递到错误的地方。相反，食品制备区或设备需要定期清洁，并 且本发明提供有效地清除靶细菌，特别是携带可移动元件的最危险靶细菌的组合物和装 置。遭受污染的医疗和其他公共环境可以许可相似的手段，来最小化靶微生物的生长和 扩散以及选择的可移动元件的转移。本方法可以用于以下情况需要靶细菌的灭菌清 除，包括空气过滤系统，其例如用于重症监护病房或如飞机、潜艇等受限的循环环境。可选的应用包括兽医或医疗环境中的用途。确定特定细菌的存在或鉴定具体靶 标的手段可以鉴定出这些技术的用途的其他来源。将杀菌或抑菌活性包含到清洁剂(其 包括动物和宠物的清洗)可以与这些技术联合应用。噬菌体可以用于清除具有赋予易感性的质粒的宿主。在抗生素选择条件下(其 要求宿主具有含有抗性基因的质粒)，所述宿主也会表达使那些细胞对噬菌体感染敏感、 并从而杀死含有所述质粒的细胞的噬菌体受体。本发明的方法可以用于在通常不相互作用的细菌种之间转移噬菌体易感性。作 为实例，在通常具有例如脊椎动物或哺乳动物的动物宿主的细菌之间转移的接合型质粒 可以被转移到通常感染例如如昆虫的无脊椎动物或植物的不同宿主的细菌。可选地， 通常感染植物或无脊椎动物宿主的细菌可以要求作为用于转移到通常具有脊椎动物或 哺乳动物宿主的细菌的接合型质粒的来源。可服从这种转移的示例性的种是，例如沙 门氏菌属细菌和黄单胞杆菌属(Xanthomonas)细菌。在一实施方案中，编码复层病毒 PRDl噬菌体的受体的接合型质粒被从鼠伤寒沙门氏菌细菌细胞转移到野油菜黄单胞菌 (X.campestris)细菌细胞。接合型质粒的转移使野油菜黄单胞菌宿主细胞易感于复层病毒 的感染，并因此停止或降低细胞复制率。本文的实施例8提供了接合型质粒从沙门氏菌 属细菌到黄单胞杆菌属细菌的转移的示范。本方法学还可以用于清除携带抗生素抗性标记的群体中的质粒。因此，在某 些情况下，本方法可以用于减少限定的细菌群体或培养物中抗性基因的流行。这些方法可以与其他处理联合，例如用其他抗菌方法或组合物处理，或可以与诱导F菌毛形 成的化合物联合。参见，例如 Hergenrother，etal." Methods of Treating Drug-Resistant Bacterial Infections"(治疗药物抗性细菌感染的方法)美国专利公开第20030130169号， USSNlO/261,851和相关组合物。所述组合可以共同或连续给予。质粒还可以用于通过将编码受体基因转移到相反缺乏所述受体的细胞上，来赋 予对噬菌体感染的敏感性。如此，提供了将噬菌体非易感宿主转换为易感宿主的手段。VIII.治疗性给药应用的方法或给药途径和剂量会根据感染细菌菌株、感染部位和程度(例如局 部的或系统性的)、使用的标记或受体和治疗对象而有所不同。给药方法，无论对于质 粒或噬菌体，包括但不限于口服、气雾剂或用于递送到肺的其他装置、鼻喷雾、静脉 内(IV)、肌内、腹膜内、鞘内、眼内、阴道、直肠、局部(topical)、腰部穿刺、鞘内和 直接应用到脑和/或脑膜。可以用作用于递送治疗剂的媒介的赋形剂对于本领域技术人 员是显而易见的。例如，质粒或噬菌体可以是冻干的形式并且临在通过IV注射给药前 溶解。给药的剂量涉及宿主感染中的每个细菌约0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、 300、1000、3000、10000或更多质粒分子的范围。根据质粒的大小(其自身可以是串联 相关的)或以多拷贝形式(二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等)或与一个或多个其他实 体联合(例如片段或不同佐剂)，剂量可以是约100万至约10万亿/每公斤/每天，并且 优选地约1万亿/每公斤/每天。在噬菌体给药的稍后步骤中，剂量可以是宿主感染中 每个细菌约 0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000 或更多噬菌 体颗粒的范围，或从约10E6细菌杀死单位/公斤/天至约10E13杀死单位/公斤/天。评价杀死能力的方法可以相似于技术人员使用的评价完整的复制噬菌体的方 法，例如空斑形成单位(plaque forming units)或pfu，然而杀死单位可以通过在杀死单位 滴定后测定存活细菌数更好地评价。但是，杀死定量是更清晰的，因为非复制噬菌体颗 粒在细菌宿主菌苔上可能不会形成空斑。因此，评价“杀死(killing) ”单位的量的连续 稀释方法被方便地用于代替标准pfu。暴露于杀死组合物的细菌培养物的连续稀释可以对 杀死单位定量。可选地，将总细菌计数与有活力的菌落单位比较可以建立细菌的哪部分 是实际上有活力的，并暗示出，哪部分已经易感于杀死构建体。在人工或特别制备底物 的活性的其他测量通常可以用作杀死单位的替代测量。一种或多种治疗剂通常被给药或滴定直到实现成功清除致病质粒，尽管当确定 感染菌株的具体诊断时，可以使用宽谱制剂。因此，本发明涉及本发明的组合物的单一 剂型以及多重剂型，以及用于实现递送这些单一和多重剂型的持续释放手段的方法。杀 死噬菌体的延迟释放制剂可以与较早的或立即的质粒转移联合，所述转移例如可移动元 件系统的给药。 关于对肺或其他粘膜表面的气雾剂给药，本治疗剂组合物被并入为给药特别设 计的气雾剂制剂。很多这些气雾剂是本领域已知的，并且本发明不限于特定制剂。该气 雾剂的实例是Schering-Plough生产的沙丁胺醇吸入器(Proventil inhaler)，其推进物含有
三氯氟化甲烷、二氯二氟甲烷和油酸。其他实施方案包括设计用于对个体或患者的鼻和 鼻窦通道给药的吸入器。如果必要的话，根据治疗中使用的具体的组合物，调整推进物 成分和乳化剂的浓度。每次气雾剂治疗待给药的噬菌体杀死单位的数量通常会在约10E6至10E13杀死单位的范围并且优选地约10E12杀死单位。通常，杀死会降低宿主复制能力至少约3倍，并且可能影响其约10、30、100、 300等至很多数量级。但是，即使减缓宿主复制的速率而不杀死也可以具有显著的治疗或 商业价值。优选的遗传失活效率可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8或更多对数单位。 相似地，增长或绝对质粒流行的速率的减少或每宿主细菌细胞数量增加的减少可以是有 用的测量，并且会优选地导致相对于非治疗至少约3、10、30、100或300倍的减少。IX.制剂 本发明还涉及包含提供在药学可接受的赋形剂中的本发明的质粒和/或噬菌体 的药物组合物。本发明制剂和药物组合物从而涉及包含能被转移到特定细菌宿主的分离 的质粒节段的制剂；2、3、5、10或20或更多影响相同的或典型的细菌宿主的实体的混 合物；或编码2、3、5、10或20或更多影响不同细菌宿主或相同细菌宿主的不同菌株的 受体的质粒。可以有这样的实例，其中使用共同地抑制细菌多菌株生长的质粒的鸡尾酒 混合物是有用的，所述细菌例如金黄色葡萄球菌。如此，本发明的组合物可以适应计划 的用途的需要。化合物或组合物通常会是无菌的或接近无菌的。本文的“治疗有效量”是表示产生效果的剂量，所述效果例如抑菌或优选地 杀菌，所述剂量的给药是为了所述效果。在质粒清除的情况下，治疗有效量可以按照 细菌群体成员中数量或生长的降低的速率来测量。确切的量将取决于治疗的目的，并 且可以由本领域技术人员使用已知技术确定。参见，例如Ansel，et al.Pharmaceutical Dosage Forms and DragDelivery (药物剂型和药物递送)；Lieberman (1992) Pharmaceutical DosageForms (药物剂型)(vols.l-3)，Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692，0824716981 ； Lloyd (1999) The Art, Science and Technology ofPharmaceutical Compounding (药物化合的技艺、科学和技术)；和 Pickar (1999) Dosage Calculations (剂量 计算)。正如本领域所知，针对质粒或噬菌体降解、系统对局部递送和质粒转移速率、以 及年龄、体重、基本健康、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、菌落中细菌组分的 谱和状况的严重程度的调整可能是必需的，并且是本领域技术人员可以利用一些实验能 确定的。各种药学可接受的赋形剂是本领域熟知的。如本文使用，“药学可接受的赋形 齐U”包括如下的材料，当其与组合物的活性成分组合时，允许所述成分保留生物活性并 不引起与个体免疫系统的破坏性反应。这类可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖复合物或 晶体等。示例性的药学载体包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳剂。实例包括但不 限于，标准药学赋形剂例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、例如油/水乳剂的乳剂以及各种 类型的润湿剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油以及例如 油酸乙酯的可注射的有机酯类。水性载体包括水、醇的/水性溶液、乳剂或悬液，包括 盐水和缓冲介质。肠胃外媒介包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer' s dextrose)、葡 萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液(IactatedRinger' s)或不挥发性油。静脉内媒介包括流体 和营养补充物，电解质补充物(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。在其他实施方案中， 本组合物会被并入固体基质，包括缓释颗粒、玻璃珠、绷带、眼用插入物和局部形式。包含本发明的组合物的组合物还可以使用本领域熟知的手段冻干，例如用于按照本发明的后续复原和用途。 另外的感兴趣的是用于脂质体递送的剂型和包含微胶囊酶的剂型，包括糖 晶体。包含这些赋形剂的组合物通过公知常规方法配置(参见，例如Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学)，第 43 章，14thEd.，Mack Publishing Col， Easton PA 18042, USA)。用于噬菌体的延迟释放制剂可以在质粒移动步骤之后应用，这
可以允许单一联合的给药步骤。总体上，药物组合物可以以不同形式制备，所述形式例如颗粒剂、片剂、丸 齐IJ、栓剂、胶囊(例如适于口服递送)、微珠、微球、脂质体、悬液、药膏、洗剂等。适 于口服和局部使用的药学级有机或无机载体和/或稀释剂可以用于组成包含治疗活性化 合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物和动物油和脂肪。制剂可以合 并稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变渗透压的盐类或用于获得合适ρΗ值的缓冲液。本药物组合物在活性组合物之外可以包含其他组分。此外，本药物组合物可以 包含多于一种活性成分，例如2种或更多、3种或更多、5种或更多、或10种或更多不同 实体，其中不同质粒或噬菌体可以特异性针对相同的、不同的或伴随的细菌。例如，本 药物组合物可以含有多重(例如至少2个或更多)质粒，其中组合物中质粒的至少2个具 有不同的对于转移的细菌宿主特异性。如此，本治疗剂组合物可以适用于治疗不同细菌 的混合感染，或可以是为对常见于特定公共(institutional)环境的各种类型的感染有效而 选择的组合物。选择组合可以这样产生，例如通过选择不同群的质粒实体，以便含有至 少一种对怀疑存在于感染中(例如在感染部位中)的不同的或关键的细菌(例如菌株、种 等)有效的组分。如上文所述，本组合物可以与其他药剂联合给药，所述药剂例如常规 抗菌剂。在一些实施方案中，将质粒和噬菌体在同一制剂内给药可能是理想的，其可以 具有不同的质粒和噬菌体组分的释放速率。X.方法学实践本发明的一些方面涉及公知方法，普通临床微生物学、操作噬菌体的一般 方法和生物技术、原理和方法的一般基础。对于这些方法的参考在下文列出并且为了所 有目的通过引用将其并入本文。A.普通临床微生物学普通微生物学是微生物的研究。参见，例如Sonenshein，et al. (eds.2002) Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives From Genes to Cells (才古草芽孢杆菌及其近亲 从基因到细胞)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN 1555812058 ； Alexander 和 Strete (2001) Microbiology A Photographic Atlasfor the Laboratory(微生物学实验图集)Benjamin/ Cummings, ISBN 0805327320 ； Cann (2001) Principles of Molecular Virology (分子病毒学 原理)(带 CD-ROM 书；3ded.)，ISBN 0121585336 ； Garrity (ed.2005) Bergey' sManual of Systematic Bacteriology (伯杰氏系统细菌学手册)(2 vol.2d ed.) Plenum, ISBN 0387950400 ； Salyers 和 Whitt (2001) Bacterial Pathogenesis A Molecular Approach (细菌 致病机制分子途径)(2ded.)Amer. Soc.Microbiol.，ISBN 155581171X ； Tierno (2001) The Secret Life of Germs Observations and Lessons from a Microbe Hunter (微生物的神秘、 生活来自微生物猎人的观察和经验)Pocket Star，ISBN 0743421876 ； Block (ed.2000) Disinfection, Sterilization, and Preservation(消毒、灭菌禾口保存)(5th ed.)LippincottWilliams&Wilkins Publ., ISBN 0683307401 ； Cullimore (2000) Practical Atlas for Bacterial Identification(细菌鉴定实践图集)Lewis Pub.，ISBN 1566703921 ； Madigan, et al. (2000) Brock BiOlogy of Microorganisms (Brock 微生物生物学)(9th ed.) Prentice Hall, ASIN 0130819220 ； Maier, etal. (eds.2000) Environmental Microbiology (微生物 生物学)Academic Pr.，ISBN 0124975704 ； Tortora, et al. (2000)Microbiology An Introduction(微生物学引言)包括微生物学位置(TM)网站、学生辅导CD-ROM和 细菌 ID CD-ROM (7th ed.)，Benjamin/Cummings, ISBN 0805375546 ； Demain，etal. (eds. 1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (工业微生物学和生物技术 手册)(2ded.)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN 1555811280； Flint, et al. (eds. 1999) Principles of Virology : MolecularBiology，Pathogenesis, and Control (病毒学原理分子生物学、 致病机制和控制)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN 15558112 72 ； Murray, et al. (ed.1999) Manual of Clinical Microbiology (临床微生物学手册)(7th ed.) Amer.Soc.Microbiol., ISBN 1555811264 ； Burlage, et al. (eds. 1998) Techniques inMicrobial Ecology (微生物生 态学技术)Oxford Univ.Pr., ISBN 0195092236 ； Forbes, et al. (1998) Bailey&Scott' s Diagnostic Microbiology (Bailey 和 Scott ' s 诊断微生物学)(10th ed.) Mosby，ASIN 0815125356 ； Schaechter, et al. (ed.1998) Mechanisms of Microbial Disease (微生物疾病 机制)(3d ed.)Lippincott，Williams&Wilkins，ISBN 0683076051； Tomes(1998)The Gospel of Germs Men, Women, and the Microbe in American Life(微生物的福音男 人，女人，以及在美国生活的微生物)Harvard Univ.Pr.，ISBN 0674357078 ； Snyder和 Champness (1997) Molecular Genetics ofBacteria(细菌的分子遗传学)Amer.Soc.Microbiol, ISBN 1555811027 ； Karlen (1996) MAN AND MICROBES Disease and Plagues in History andModern Times (人类和微生物历史和现代的疾病和瘟疫)TouchstoneBooks，ISBN 0684822709 ；和 Bergey (ed. 1994) Bergey' s Manual ofDeterminative Bacteriology (伯杰氏鉴 定细菌学手册)(9th ed.) Lippincott，Williams&Wilkins，ISBN 0683006037。B.操作噬菌体的一般方法操作噬菌体的一般方法是公知的，参见，例如Snustad和Dean (2002) Genetics Experiments with Bacterial Viruses (利用细菌病毒的遗传学实验)Freeman ； O ‘ Brien 禾口 Aitken (eds.2002) Antiody Phage Display Methodsand Protocols (抗体噬菌体展示方法和 操作步骤)Humana ； Ring 和 Blair (eds.2000) Genetically Engineered Viruses (遗传改造病毒) BIOS Sci.Pub. ； Adolf(ed. 1995) Methods in Molecular Genetics Viral Gene Techniques (分 子遗传学方法病毒基因技术)vol.6, Elsevier ； Adolf (ed. 1995) Methods inMolecular Genetics Viral Gene Techniques(分子遗传学方法病毒基因技术)vol.7，Elsevier ；以 及 Hoban 和 Rott (eds. 1988) Molec.Biol，of BacterialVirus Systems (细菌病毒系统的分子生 物学)(Current Topics inMicrobiology and Immunology (微生物和免疫学当前主题)Νο.136) Springer-Verlag。C.生物技术、原理和方法的一般基础生物技术、原理和方法的一般基础描述于例如Alberts，et al. (2002)Molecular Biology of the Cell (细胞的分子生物学)(4th ed.) Garland ISBN 0815332181 ； Lodish, et al. (1999) Molecular Cell Biology (分子细胞生物学)(4th ed.) Freeman,ISBN 071673706X ； Janeway, et al. (eds.2001) Immunobiology (免疫生物学)(5th ed.) Garland, ISBN 081533642X ； Flint, et al. (eds. 1999) Principles of Virology Molecular Biology, Pathogenesis, and Control (病毒学原理分子生物学、致病机制 禾口 控制)，Am.Soc.Microbiol.，ISBN 1555811272 ； Nelson, et al. (2000) Lehninger Principles offiiochemistry (Lehninger 生物化学原理)(3d ed.) Worth, ISBN 1572599316 ； Freshney (2000) Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (动物细胞培养基 础技术手册)(4th ed.) Wiley-Liss ； ISBN 0471348899 ； Arias 和 Stewart (2002) Molecular Principles of Animal Development (动物发育的分子原理)，Oxford University Press, ISBN 0198792840 ； Griffiths, et al. (2000) An Introduction to Genetic Analysis (遗传 学分析介绍)(7th ed.) Freeman，ISBN 071673771X ； Kierszenbaum (2001) Histology andCellBiology(组织学和细胞生物学)，Mosby, ISBN 0323016391 ； Weaver(2001) Molecular Biology (分子生物学)(2d ed.)McGraw_Hill，ISBN 0072345179 ； Barker (1998) At the Bench A Laboratory Navigator (分子生物学实验室工作手册) CSH Laboratory, ISBN 0879695234 ； Branden 禾Π Tooze (1999) Introduction to Protein Structure (蛋白质结构介绍)(2ded.)，GarlandPublishing ； ISBN 0815323050 ； Sambrook 禾口 Russell(2001)MolecularCloning A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)(3vol.， 3d ed.), CSHLab.Press, ISBN 0879695773 ；禾Π Scopes (1994) Protein Purification Principles and Practice (蛋白纯化原理和实践)(3d ed.) Springer Verlag, ISBN 0387940723。D.蛋白表达的转录调节 转录是过程，通过该过程，例如来自载体的DNA序列被RNA聚合酶拷贝而产生 产物RNA，例如信使RNA或mRNA。对于蛋白或肽表达，mRNA的转录是潜在调节步 骤并因此，最终影响重组蛋白或肽的表达水平。转录由RNA聚合酶与DNA序列中的启动子区的结合起始。启动子是对于DNA 表达的正向调节区，其位于待转录基因的上游(在5'区)。转录也可以通过例如抑制蛋 白与通常位于接近启动子序列的抑制DNA序列的结合以负向方式来调节。为了调节重组蛋白的转录，表达盒可以包含多启动子以及负向调节序列，例如 抑制蛋白结合位点。被认为是强启动子的tac启动子由de Boer和同事描述(deBoeretal， PNAS 80 21-25(1983)。一般来说，当启动子在数量和相对强度上都增加时，核酸表达 水平被认为会增加。可以使用的其他启动子包括Tac启动子。其他示例性启动子包括例 如T7启动子、T5启动子、Pr启动子、P^启动子、trp启动子、Iac启动子、araB启动子 和gal启动子。在本发明的一些实施方案中，Iac和tac启动子的任何数量和组合被设计入载体。E.诱变；位点特异性、随机、改组(shhffling)基于本文提供的结构的和功能的描述，可以分离或生成可以优化优选特征的同 源物和变体。因此，质粒转移、受体表达、噬菌体结合或靶宿主杀死功能的其他催化节 段可以通过结构同源性或通过评价在特征基因组织基序中发现的实体而发现。质粒、噬 菌体受体或宿主细胞识别基因通常见于特定基因排列，并且在对应排列中发现的其他实 体可以通过评价可用的序列信息例如通过生物信息学手段来发现。这些还可以作为筛选结构的变体的起点，例如诱变这些结构并筛选具有所需特征的那些，所述所需性质例如 更宽的质粒可传递性、更宽的噬菌体受体功能或更广泛的宿主靶特异性。可以使用诱变 的标准方法。可以应用基因或结构域改组技术来寻找合适的变体。可以相似地鉴定质粒宿主细胞相容性、噬菌体受体节段或噬菌体杀死功能，并 且为了对已述方法优化，可以鉴定流行的或特异性的靶基序。那些靶标中很多可能是在 各种潜在的靶菌株上发现的高表达的蛋白、碳水化合物或含有脂质的结构。在细菌细胞 外部发现的菌毛结构可能是另一蛋白靶向结合的结构。诱变可以拓宽结合选择性或增加 节段或整个构建体的稳定性，缺失策略可以清除无关节段。革兰氏阳性细菌细胞壁的组分可以与革兰氏阴性细胞壁的组分共享，或可能与 其他分支杆菌或孢子共享。但是，在革兰氏阴性中可能有也能作为对于噬菌体进入的另 外屏障的其他层的壁。来源于噬菌体或其他地方的其他活性可能被联合，以穿透更复杂 的革兰氏阴性细胞壁结构。特别地，多催化节段可以在单一构建体中提供多重活性，所 述多重活性可以协同地发挥功能，或当与另一例如抗生素或抗菌剂的治疗剂联合时，可 以提供协同效果。靶向部分可以增加催化片段的局 浓度，但是合适长度的连接子也可以局部增 加壁降解事件的数量。因此，与靶标和催化基序相容的具有合适长度的连接子可能是有 用的，并且增加导致靶细菌的停滞或杀死的催化穿透活性。技术人员会意识到，可以对多肽的催化或功能结构域进行某些修饰而不减少其 生物活性。可以进行一些修饰以便于克隆、表达或将催化结构域并入融合多肽。这些修 饰对本领域技术人员是熟知的并且包括，例如在编码催化结构域的多核苷酸的任一末端 添加密码子，例如添加在氨基末端以提供起始位点的甲硫氨酸，或置于任一末端以创造 方便定位的限制性酶位点或终止密码子或纯化序列的其他氨基酸(例如多聚His)。必须注意到，如本文所用，和在所附权利要求书中，除非上下文明确指示，否 则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“这/那(the)”包括复数指示物。 因此，例如涉及“噬菌体(a bacteriophage)”包括多个该噬菌体并且涉及〃宿主细菌(a host bacterium)"包括涉及一个或多个宿主细菌及其等同物，所述等同物是本领域技术人 员已知的，并诸如此类。提供本文所讨论的公开只出于其在本申请的申请日之前的公开。本文中没有地 方应解释为承认，借助在先发明，本发明无权先于这些公开。此外，提供的
公开日期可 能不同于实际的
公开日期，这可能需要单独地确认。引文通过引用其整体将其并入本 文。本说明书中引用的所有公开和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的公 开和专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。尽管为了清晰理解的目的，上述发明通过说明和举例的方式已经在一些细节上 进行了描述，但是根据本发明的教导，对于本领域常规技术人员显而易见的是，可以对 本发明进行某些改变和修饰而不偏离所附权利要求书的精神或范围。
实施例实施例1 F因子接合
对于特定质粒和宿主，应当优化的接合条件的重要参数包括，例如供体和接受 体细胞的对数期、接合的孵育时间以及其他条件。因此，可以影响接合频率或效率的各 种组分可以包括温度，并且可以滴定在合适的范围。对于温血动物的治疗性用途，很可 能在约25-45°C，而对于环境情况，温度范围可以是可能高于或低于周围温度20度的范 围。混合、搅拌、离子强度、离子浓度等方面也可以优化。会对于F+与F-宿主的摩尔 关系等测试优化。在某些情况下，接合可以不需要菌毛或此类结构的实际表达。接合可以依赖于 其他“接合相关”生物学，并且在可能不是菌毛依赖性的过程中可能有可选的特征。这 可以使用当前技术和方法进行研究。实施例2 转移质粒/将细胞从F-转换为F+F-宿主到F+宿主转换的证明可以使用标准接合实验来展示。参见，例如 Paranchych 和 Frost (1988) “ The Physiology and Biochemistry of Pili “(菌毛的生理学和 生物化学)Advances in Microbial Physiology 29 53-114 ； Low 和 Porter(1978) “ Modes of Gene Transfer and Recombination inBacteria “(细菌中基因转移和重组模式)Ann.Rev. Genetics 12 249-287 ； Rowbury (1977) “ Bacterial Plasmids with Particular Reference to theirReplication and Transfer Properties “(细菌质粒，特别关于其复制和转移性质) Progress in Biophysics&Molecular Biology 31 271-317; Simon, et al. (1983) " A Broad Host Ran ge Mobilization System for In Vivo GeneticEngineering Transposon Mutagenesis in Gram Negative Bacteria ".(用于体内遗传改造的宽宿主范围移动系统革兰氏 阴性细菌中转座子诱变)Nature Biotechnology 1 784-791 ； Clewell, et al(1993). BacterialConjugation (细菌接合).Plenum Press，New York.ISBN 0-306-44376-7 ； Grohmann, et al. (2003). " Conjugative Plasmid Transfer in Gram-PositiveBacteria "(革 兰氏阳性细菌中接合型质粒转移).Microbiology andMolecular Biology Reviews 67(2) 277-301。可以评价效率、转移速率、对于特定质粒和宿主的条件优化等。例如，方法学可以按照生长例如5ml的体积的供体和接受体细胞到达OD 0.5-0.7。从这些培养物中，混合例如100微升的小体积的供体和接受体培养物。(对照 100微升单独的供体和接受体细胞)。通常，有通过离心和洗涤的清洗，所述洗涤例如用 0.85%盐水两次。重悬沉淀例如于20微升的盐水，并且点在充分干燥的陪替氏平板例如 LB上。平板允许干燥并例如在30度孵育过夜。生长期后，将培养物刮到培养基例如500微升盐水中，涡旋以破坏交配对。悬 液以不同的适当稀释涂板在分别的选择平例如双抗生素平板上。可选地，可检测的标记 (GFP或类似物)可以用于避免抗生素的使用。通常确认合适菌落的接合，所述确认例如 使用PCR确认接合型质粒的存在。实施例3 并入质粒的标记选择合适的标记，其优选地是易于检测的。尽管在治疗性或公共健康实施方案 中毒力或抗性标记通常会是最感兴趣的，较容易的检出标记在建立方法学的确有效中是 有用的。因此，例如GFP的荧光标记可以用于显示标记确实被可检测的转移了，并可以 为所需系统而优化。标记被PCR扩增和克隆到质粒中合适的限制性位点。可以测定在目的质粒和宿主之间有效转移的速率和最适条件。这些可以包括质粒、转染条件、接合条件、动力 学、温度等方面。摄取和表达的速率的评价可以利用例如荧光激活细胞分选或相似方法学。实施例4 诜择缺乏标记的细胞的清除为了选择已获得质粒的细胞，使用质粒上的抗生素或其他选择标记会是理想 的，因为将细胞在抗生素平板上接种只会选择已获得所述质粒的那些细胞。选择标记可 以连接到所需标记，这样选择条件会优选地几乎直接选择标记。如果所述标记是可靶向 的，例如可被噬菌体靶向，那么在选择中存活的细胞应该是易感于由受体介导的噬菌体 感染过程。实施例5 将噬菌体警体标记连接到诜择标记噬菌体受体编码基因和选择标记会在同一质粒上并且优选地紧密地连接。可以 并入装置以最小化受体编码基因和标记不能被轻易分开的可能性。这些标记可以紧密地 连接到合适质粒的复制原点。实施例6 来自F因子的无关序列的检出通过生成单独基因缺失突变体和测试复层病毒易感性，方法可应用于在含有噬 菌体易感性的质粒上鉴定受体编码区。利用分子生物学方法、测序和生物信息学分析以 及操作方法，可以鉴定质粒的区，从而知道哪些是噬菌体易感性的功能转移所必需的。鉴定出的区可以通过弥补反式突变基因产物和测试复层病毒易感性进一步评 价。此后，可以使用方法移除质粒的无关部分以只获得连接到关键质粒接合节段的受体 编码区。实施例7 各种选择标记β-半乳糖苷酶、荧光素酶、GFP、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、 链霉素等是用于这些策略的好的选择标记。选择或检出装置是公知并且容易获得的。^mm8 m^mmmmi^mmmmmm^m^mMmmmmmmmmu使5毫升供体细菌(鼠伤寒沙门氏菌LT2 (pLM2)，其获得自Felixd ‘ Herelle Reference Center for Bacterial Viruses，Laval, Canada)和接受体细菌的培养物(野油菜黄 单胞菌 HER1103，其获得自 Felix De Herelle Center，Laval, Canada)生长在 LB 肉汤中、
37°C和30°C下、200rpm振摇。培养物的最终OD6tltl为0.5-0.7。100微升的供体和接受体培养物混合在一起。还制备了对照样品仅100微升 的供体细胞和仅100微升的接受体细胞。细胞通过离心而沉淀，并且用0.85%盐溶液洗 涤两次。沉淀在20微升的盐溶液中重悬，并且点在充分干燥的LB平板上。平板允许风 干，然后在30°C孵育过夜。 将下一天培养物刮到500微升盐溶液中。通过涡旋分开交配对。加入另外500微 升盐溶液。未稀释的和连续稀释的样品接种在双抗生素平板上，所述平板即具有25 μ g/ ml卡那霉素和100 μ g/ml链霉素的LB。因为鼠伤寒沙门氏菌LT2 (pLM20)是抗卡那霉 素的，并且野油菜黄单胞菌HER1103是抗链霉素的，所以只有已接受pLM2质粒和卡那 霉素抗性基因的野油菜黄单胞菌HER1103细胞生长在双抗生素平板上。使用PCR筛选 生长在双抗生素平板上的细菌的接合型质粒的存在。使用质粒特异性寡核苷酸引物用于 筛选。用接合型质粒转染的野油菜黄单胞菌细胞的单一菌落被接种到含有卡那霉素和链霉素的LB肉汤中，并且在30°C、200rpm振摇下，使其生长到0.5-0.7的最终0D_。细菌的菌苔接种在LB平板上，并且2微升的PRDl噬菌体被点到所述细菌菌苔上。平板在 30°C孵育过夜，并且第二天确认病毒空斑的存在，所述空斑表明PRDl噬菌体感染后，含 有质粒的细菌的死亡或减少的生长。实施例9 多种质粒与合适的噬菌体的配对以上描述提供了示例性的质粒依赖性噬菌体类型的教导，以及那些类别中的噬 菌体的具体实例。描述了不同靶种，并且质粒中的一些是种特异性的或稍差的特异性的 (可能是相关种的簇)。合适的质粒可以被引入靶种，无论是通过接合或其他方法学，包 括转化或电穿孔。一旦所述质粒被内化并且发现表达发生的合适条件，噬菌体易感性通 过标准方法容易地检测。检测可以通常在液体或平板培养物中，其适于所需评价。因 此，随着报告或测试新的配对，可以确认或筛选多种质粒类型(例如IncD质粒与噬菌体 D)的测试及其它。可以筛选提高所需受体的表达或噬菌体作用效率的培养条件。
权利要求
1.减少编码连接到噬菌体受体的抗生素或毒力标记的质粒流行的方法，所述质粒携 带于异质细菌培养物中的细胞内，所述方法包括a)使所述细菌培养物与足够的能够与所述受体结合的噬菌体受体特异性杀死剂接触，其中所述接触允许所述受体特异性杀死剂与所述噬菌体受体结合并杀死含有所述接 合型质粒的宿主细菌，从而减少异质细菌培养物内编码所述抗生素或毒力因子的接合型 质粒的流行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述流行的减少是a)所述细菌培养物中所述接合型质粒的绝对数量的减少；或b)每个所述细菌培养物的成员的所述接合型质粒数量的减少。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述流行的减少为至少2倍。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌培养物是a)处于对数生长阶段；b)处于稳定状态生长阶段；c)乳酸杆菌或乳制品加工培养物；d)在水处理设施中；e)在真核细胞或器官培养物中；f)在真核宿主中；g)在脊椎生物体中或脊椎生物体上；或h)在哺乳动物中或哺乳动物上。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体受体特异性杀死剂是a)复层病毒(tectiviras)；b)宽宿主范围的含有脂质的噬菌体；c)PRDl噬菌体群的成员；d)质粒依赖性宽宿主范围噬菌体；e)复层噬菌体科(tectiviridae)；f)以二十面体形态、脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个 或多个为特征的噬菌体；g)选自命名为PRD1、PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GIL01、pGILOl、 BAM35或GIL16的噬菌体。
6.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤将所述细菌培养物暴露于提供至少 一个编码所述受体的所述接合型质粒从所述细菌培养物的供体成员到接受体成员的转移 的交配对形成系统(mating pairformation system)，并且允许所述系统实现所述接合型质粒 从所述细菌培养物的所述供体成员到所述接受体成员的转移，从而产生包含所述接合型 质粒并表达所述噬菌体受体的宿主细菌。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述接合型质粒a)选自不相容性群N、P或W质粒；b)编码在所述噬菌体复制中重要的一个或多个其他基因；c)编码一个或多个抗生素抗性或毒力标记；d)是以与所述成员的染色体分离的DNA的形式；或e)编码一个或多个菌毛基因。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述交配对形成系统包含a)至少一个菌毛接合基因；b)另一可移动元件转移系统。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述a)允许是在至少30°C的温度下；b)允许是在其中多个菌毛基因被表达的温度下；c)实现是至少2小时的时间段；d)供体是F+细菌细胞；e)接受体是F-细菌细胞；f)允许导致包含所述接合型质粒的所述细菌培养物的成员的增加；g)供体是非致病性细菌菌株；或h)供体和接受体的比例在1 1的两个对数单位内。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述接触是与a)对于每个包含所述编码所述受体的接合型质粒的细菌细胞至少10个噬菌体；b)能够减少所述接合型质粒数量的噬菌体；c)不能在包含所述质粒的所述成员中复制的噬菌体；或d)不能在包含所述接合型质粒的所述培养物的成员中复制其核酸的噬菌体。
11.在异质细菌培养物中转移赋予结合噬菌体的易感性的可移动遗传元件的方法，其 中所述异质细菌培养物包含易感于所述噬菌体结合的供体细菌细胞和非易感于所述噬菌 体结合的接受体细菌细胞，所述供体细菌细胞处于如下条件，其中所述可移动遗传元件 可以从所述供体细胞转移到所述接受体细胞，从而将所述可移动元件转移到所述接受体 细胞并赋予对于结合所述供体细胞上的复层病毒(tectiviras)噬菌体的易感性。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述a)可移动元件是质粒，所述质粒编码至少一个i)复层病毒噬菌体受体基因；或 ii)菌毛基因；b)质粒为i)选自F、R386、RU ColB_K99、ColB_K166、R124、R62、R64、R483、R391、 R46、R724、RP4、RK2、R751、RSF1010、R401、R388 或 S_a ；或ii)在Inc群N、P或W中；或iii)在Inc 群 D、M、X、PU U、W、C 或 J 中；c)易感于所述噬菌体的供体细胞是i)F+细胞；或ii)来自革兰氏阴性细菌种；或iii)来自选自埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属 (Salmonella)、变形杆菌属(Proteus) > 弧菌属(Vibrio)、不动细菌属(Acinetobacter)、芽 胞杆菌属(Bacillus)或微球菌属(Micrococcus)的属；d)接受体细菌细胞是i)F-细胞；ii)来自革兰氏阴性细菌种；iii)来自选自埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细 菌属、芽胞杆菌属或微球菌属的属；或iv)抗生素抗性基因或毒力基因的载体；e)方法增加所述菌落或感染中所述结合噬菌体的细胞的比例；f)噬菌体是复层病毒，包括选自PRD1、AP50、Bam35、NS11、PR3、PR4、PR5、 PR722、L17或P37-14的复层病毒；或g)条件允许菌毛蛋白表达表型从供体到接受体细胞的转移。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述供体细胞和所述接受体细胞来自不同细菌种。
14.如权利要求11所述的方法，还包括给予噬菌体以感染表达受体的细胞的步骤，其 中所述a)感染导致所述易感细胞的死亡；b)方法导致编码抗生素抗性或细菌毒力基因的可移动元件数量的减少；或c)方法还包括将所述细菌细胞暴露于抗生素或诱导F菌毛形成的化合物的步骤。
15.包含编码复层病毒(tectiviras)受体组分的节段的遗传构建体，所述节段由在靶 细菌中有功能的强异源启动子驱动，所述靶细菌可以作为使用所述受体的复层病毒的宿主。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述a)强启动子诱导所述组分的高表达，其将复层病毒与所述宿主的结合增加至少5倍；b)启动子是诱导型启动子；c)构建体还包含紧密连接于所述受体组分的选择标记；d)靶细菌是革兰氏阴性细菌；或e)构建体可以转染感染中的细菌。
17.包含可传递DNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述可传递DNA编码 与裂解性噬菌体结合的噬菌体受体，其中所述裂解性噬菌体会杀死表达所述噬菌体受体 的细菌细胞。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述a)可传递DNA是选自N、P、W、D、M、X、PI、U、W、C或J的Inc质粒；或b)所述裂解性噬菌体是命名为PRD1、PRRUPR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GIL01、pGILOl、BAM35 或 GIL16 的噬菌体。
19.试剂盒，其包括具有权利要求16的所述裂解性噬菌体和所述药物组合物的一个或多个室。
20.将接合型质粒从供体细菌细胞转移到接受体细菌细胞的方法，其中所述接合型质 粒编码噬菌体受体组分，其中所述供体细菌细胞感染脊椎动物并且其中所述接受体细菌 细胞感染昆虫或植物，所述方法包括使所述接受体细菌细胞与所述供体细菌细胞接触，从而允许所述接合型质粒转移到所述接受体细菌细胞的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述噬菌体受体是复层病毒(tectivirus)受体。
22.如权利要求20所述的方法，还包括使包含所述接合型质粒的接受体细菌细胞与结 合所述受体组分的噬菌体接触的步骤，其中所述接触允许所述噬菌体与所述噬菌体受体 组分结合并杀死包含所述接合型质粒的接受体细菌细胞。
全文摘要
本发明提供减少包括感染在内的微生物菌落中质粒的流行的方法和组合物，并且包括治疗剂组合物、用于治疗感染的方法和用于鉴定其他此类组合物的方法。提供了减少抗生素抗性基因的拷贝数以及赋予噬菌体与缺乏那些噬菌体的受体的细胞结合的装置。
文档编号A61K35/76GK102027107SQ200980116840
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者C·B·阿巴艾亚, 巴拉希·西瑞兰姆, 贾亚希拉·马努尔 申请人:冈戈根股份有限公司
减少细菌中接合型质粒
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年3月10日提交的美国申请第61/035,304号的优先权。 发明领域
本发明提供方法和组合物，以减少见于包括细菌感染的微生物菌落中的各种质 粒的数量上(numerical)或质量上(mass)的量，并且本发明包括用于菌落处理的组合物、 方法以及用于鉴定其他此类组合物的方法。在多种实施方案中，本发明提供显著地减少 携带于靶细菌培养物中的抗生素抗性标记的流行。
发明背景
细菌是普遍存在的并且见于之前被认为不适于居住的环境中。它们是常见的且 生态学多样的，并且发现对于生存不寻常的和共同的生态位。它们遍布于环境存在，并 且存在于土壤、灰尘、水以及几乎所有天然表面上。许多是正常的和有益的细菌株，其 提供与宿主的协同关系。其他的不是这样有益的，或在特定条件下伴随益处造成问题。
致病细菌可以在人类、其他动物以及植物中导致感染性疾病或明显症状。一 些细菌只可以影响特定宿主；其他的在许多宿主中导致问题，这取决于细菌的宿主特异 性。其他的在某些情况下可以是无害的或休眠的，并且在其他环境或情况下可以作为问 题出现。无论是细菌单独或联合导致的疾病，都几乎与细菌本身一样的多样并且包括食 物中毒、蛀牙、炭疽、普通感染性疾病以及甚至某些类型的癌症。这些临床问题通常是 临床微生物学领域的主题。
细菌是某些病毒的天然靶标，所述病毒例如噬菌体(bacteriophiige)或噬菌体 (phiige)。噬菌体已在其天然宿主上进化并且具有非常快的复制和进化速率。噬菌体可 以利用其宿主生理学或生物学所表现出的最小的易损性(vulnerability)。同样地，噬菌体 结构、生理学和要素的适当利用应当对于最小化或控制细菌导致的问题是有用的。
某些细菌通常是无害的，在合适的机会存在时变为致病的或在被引入异常位置 或环境时变为可导致问题的。此外，某些细菌组合共同进化并且可以协同运作以补充在 菌落个体成员中缺乏的功能。但是，例如在多细胞生物体中，存在许多各种各样的机制 来处理不同量的细菌激发，细菌培养物的完全根除通常不是必需的。在许多情况下，细 菌群体的不完全根除会降低感染的作用，以允许系统通过例如免疫系统的可选机制来解 决问题。
统计上，感染性疾病是主要的医学问题。参见，例如Watsteta和 Jovanovic (2003) Statistical Handbook on Infectious Diseases (感染性疾病统计手册) Greenwood, ISBN 1573563757。在美国，每年大约40-70K的死亡来自于医院(医院 来源的)血流感染。
特别是，在过去的半个世纪，抗生素使临床医学产生革命性变化。自从抗生 素现象的最初发现，作用机制和这类突出的治疗实体的开发得到了巨大的进展。参 见，例如 Therrien 和 Levesque(2000)FEMS Microbiol.Rev.24 251-62 ； Durgess(1999)Chest Il5(3Suppl) 19S-23S ； Medeiros(1997)Clin.Infect.Dis.24(Suppl 1) S19-45 ； Jones (1996) Am.J.Med.l00(6A) 3S-12S ； Ford 禾口 Hait (1993) Cytotechnology 12: 171-212 ；以及 Liu(1992) Compr.Ther.18 35-42。2002 年，抗生素具有约 $320 亿的世界范围的销售额。
抗生素抗性细菌的广泛出现突出了现有抗菌治疗对于细菌适应的易损性。参 见，例如 Wise (2007) “ An overview of the Specialist AdvisoryCommittee on Antimicrobial Resistance (SACAR)(抗菌剂抗性专家顾问委员会概述)“J.Antimicrob.Chemother.60 Suppl 1 i5-7.PMID 17656382 ； Finch (2007) “ Innovation-drags and diagnostics (革新 _ 药物和 诊断学)“J.Antimicrob.Chemother.60Suppl 1 79-82, PMID 17656390 ； Walsh(1992) Antibiotics Actions, Origins, Resistance(抗生素作用、起源、抗'性)Amer.Soc. Microbiol., ISBN 1555812546 ； Cunha (1992) Antibiotic Essentiala (抗生素要素) Physicians Press, ISBN 1890114413 ； Amyes (2003) MagicBullets, Lost Horizons The Rise and Fall of Antibiotics (神奇的子弹，失落的地平线抗生素的兴衰)T^aylor&Francis， ISBN 0415272033 ； Axelsen (2001) Essentials of Antimicrobial Pharmacology A Guide to Fundamentalsfor Practice (抗菌剂药理学要素实践基础指南)Humana Press, ISBN 0896038424 ；以及 Mainous 禾口 Pomeroy (eds.2001) Management ofAntimicrobials in Infectious Diseases Impact of Antibiotic Resistance(感染性疾病中抗菌剂的管理抗生素抗性的影 响)Humana Press，ISBN 0896038211。
此外，抗生素抗性的机构在最低选择条件下发展(例如在低浓度的抗生素下)， 并且这些机构经常在宿主之间转移。因此，机构在不同生物中进化，并且经常被引入 新的宿主，在新的宿主中这些相同的机构被进一步完善和优化。经常，机构的组合被生 成、被遗传上连接在一起，并且在细菌宿主之间一起转移。这些组合经常导致编码连接 的多药物抗性标记的DNA节段的基因聚类(clustering)。
因此，用于减少抗性编码质粒的流行、生长或存活，或用于限制细菌毒力或致 病性的改进的方法会具有巨大的功用。该功用可以适用于环境的、局部的(local)、局部 的(topical)或特别是体内的定殖(colonization)。本发明致力于这些和其他重要的问题。
发明概述
本发明部分地基于以下认识存在可以感染很多不同宿主的多种宽宿主范围 噬菌体。参见，例如 Grahn，et al. (2006) “ PRDl Dissecting theGenome，Structure and Entry “ (PRD1 剖析基因组、结构和进入)in Calendar (ed.) The Bacteriophages (噬 菌体)Od ed.)Oxford Univ.Press, ISBN-13 9780195148503。PRDl 是复层噬菌体科 CTectiviridae)属的示例性成员，其在结构上和功能上被定义。但是，分类方案在演变并 且认识到噬菌体与高等动物腺病毒功能的相似性。这表明某些基本结构特征是共享的， 这些噬菌体利用所述基本结构特征以达到在广泛多种的宿主细菌种中感染和复制的共同 目的。特别是，这些宽宿主范围跨越革兰氏阴性和革兰氏阳性的区别，这提示某些结构 特征在结合和感染进程中是共享的。编码抗生素抗性机构的很多遗传元件也可以包含针 对含有那些遗传元件的细胞的易损性的装置。例如，某些编码抗生素抗性基因的细菌质 粒也编码使宿主细胞易受损于噬菌体结合(以及杀死)的受体。可选地，质粒可以编码 可以被转移到缺乏所述质粒的其他细胞中的基因或结构，从而导致抗性基因和连接的易损性标记的转移。该机构可以用作抗性或毒力编码质粒向相似的缺乏抗性标记的宿主的 横向传递的装置。如果易损性基因也被转移，那么这些宿主对于清除装置变为敏感的。
本发明提供有效地靶向于含有编码抗生素抗性或毒力的某些遗传元件、特别地 可传递形式的遗传元件的细胞的装置。在其他实施方案中，提供将噬菌体结合和/或杀 死易感性转移到广泛多种靶宿主细菌的装置。
本发明提供减少异质细菌培养物中编码例如复层病毒(tectivirus)的噬菌体的受体的接合型质粒的流行的方法。所述方法使用生物系统(以噬菌体或其部分为例)的其对 于含有遗传元件的靶细胞的抗菌活性(根除/减少携带如抗生素抗性、毒力等不希望性质 的细菌的数量)，所述生物系统取决于细菌交配对形成系统(mating pair formation system) (以接合型菌毛或其部分为例)。
作为任选的第一步骤，通过以下产生包含接合型质粒并表达噬菌体受体的宿主 细菌将细菌培养物暴露于提供编码噬菌体受体的接合型质粒从所述细菌培养物的供体 成员到接受体(recipient)成员的转移的交配对形成系统，并且允许所述系统实现所述接 合型质粒从所述细菌培养物的所述供体成员到所述接受体成员的转移。作为第二步骤 (或者第一步骤，如果未进行之前的步骤)，一旦表达噬菌体受体的宿主细胞存在，将细 菌培养物暴露于结合所述受体的合适的噬菌体。作为噬菌体生命周期的部分，其杀死宿 主细菌，因而减少异质细菌培养物中编码所述噬菌体受体的接合型质粒的流行。
在一实施方案中，流行的减少是所述细菌培养物中所述接合型质粒的相对或绝 对数量的减少；或每所述细菌培养物成员的所述接合型质粒的相对或绝对数量的减少， 或异质细菌培养物中发现的含有所述质粒的宿主的相对或绝对数量的减少。在其他实施 方案中，流行的减少为比暴露于交配对系统之前的流行至少少2倍。
在一实施方案中，噬菌体是，例如宽宿主范围的含有脂质的噬菌体，包括复层 病毒；PRDl噬菌体群(group)的成员；质粒依赖性宽宿主范围噬菌体；复层噬菌体科， 以二十面体形态、脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个或多个 为特征的噬菌体；或选自以下命名为PRD1、PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GILOU pGILOl、BAM!35 或 GIL16 的噬菌体。
在一实施方案中，接合型质粒，例如选自不相容性群N、P或W质粒；编码在 噬菌体复制中重要的一种或多种其他蛋白(例如质粒上功能是结合、感染、复制或裂解 的蛋白)；编码一种或多种抗生素抗性、选择或毒力标记；是以与所述成员的染色体分 开的DNA的形式；或编码一种或多种菌毛基因。
在一实施方案中，异质细菌培养物是，例如处于对数生长阶段；处于稳定状态 生长阶段；乳酸杆菌或乳制品加工培养物；在水处理设施中；在真核细胞或器官培养物 中；在真核宿主中；在脊椎生物体中或脊椎生物体上；或在哺乳动物中或哺乳动物上。
在一实施方案中，交配对形成系统包括，例如至少一个菌毛接合基因；或另一 个可移动元件转移系统，例如转导或电穿孔。用于引入合适质粒的可选的系统包括基于 噬菌体的DNA递送系统。
在其他实施方案中，遗传物质的转移是，例如在至少30°C的温度；在多种菌毛 基因表达的温度。另一个可以变化的条件是转移时间，例如2至12或更多小时，优选地 2小时。在一实施方案中，供体细胞是F+细菌细胞。在另一实施方案中，接受体细胞是F-细菌细胞。在优选的实施方案中，遗传物质的转移导致包含所述接合型质粒的所述 细菌培养物的成员的增加。在另一优选的实施方案中，供体细胞与接受体细胞的比例在 1 1的两个对数单位以内，例如100 1至1 100。
关于将复层病毒噬菌体添加到异质细菌培养物，在一实施方案中，对于每一包 含编码所述受体的所述接合型质粒的细菌细胞，即对于每一易感于包括复层病毒的噬菌 体感染的细胞，添加至少10个噬菌体。在一实施方案中，噬菌体减少所述接合型质粒的 数量。在另一实施方案中，噬菌体在宿主细菌中不能复制，例如由于有缺陷的感染、复 制或裂解，其包括不相容性机构，包括包含所述接合型质粒的宿主细胞。在其他实施方 案中，噬菌体在包含所述接合型质粒的宿主细菌中不能复制其基因组。因此，在宿主细 菌中有复制能力的噬菌体不是本发明的方法所需要的。
一方面，本发明提供在异质细菌培养物内转移赋予对例如复层病毒的噬菌体附 着的易感性的可移动遗传元件的方法。所述异质细菌培养物包括易感于噬菌体结合的供 体细菌细胞和不易感于噬菌体结合的接受体细菌细胞。遗传元件的转移在合适的条件下 发生在供体细菌细胞与接受体细菌细胞之间。伴随遗传元件转移到接受体细菌细胞，所 述接受体细菌细胞变为易感于噬菌体结合，这通常导致所述接受体细胞的死亡。
可移动元件通常是编码例如复层病毒噬菌体受体基因或菌毛基因的质粒。所述 质粒可以选自于以下任何质粒F、R386、RU ColB-K99、ColB_K166、R124、R62、 R64、R483、R391、R46、R724、RP4、RK2、R751、RSF1010、R401、R388 或 S_a ； 在:tnc群N、P或W中；或在:Inc群D、M、X、PU U、C或J中。
易感于复层病毒噬菌体的供体细菌细胞的实例是，例如F+细胞；来自革兰氏阴 性细菌种；来自例如埃希氏菌属CEscherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属 (Salmonella)、变形杆菌属(Proteus) > 弧菌属(Vibrio)、不动细菌属(Acinetobacter) > 芽 胞杆菌属(Bacillus)或微球菌属(Micrococcus)的属。
接受体细菌细胞的实例是F-细胞；来自革兰氏阴性细菌种；来自例如埃希氏菌 属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细菌属、芽胞杆菌属或微球 菌属的属；或抗生素抗性基因或毒力基因的载体；
复层病毒噬菌体的实例包括PRD1、AP50、Bam35, NSlU PR3、PR4、PR5、 PR722、L17 或 P37-14。
在一实施方案中，所述供体细菌细胞和所述接受体细菌细胞来自不同细菌种或 不同细菌属。
在其他实施方案中，方法包括以下步骤给予例如复层病毒的噬菌体以感染表 达受体的、噬菌体易感的宿主细胞，从而导致异源细菌培养物中所述易感宿主细胞的死 亡或编码抗生素抗性或细菌毒力基因的可移动元件的数量的减少。抗生素也可以伴随噬 菌体给予，例如连续或同时给予。
一方面，本发明提供重组遗传构建体，其包含编码例如复层病毒的噬菌体的受 体组分的核酸。所述噬菌体受体组分的表达可以由在宿主细菌细胞中有功能的强异源启 动子驱动。在一优选实施方案中，启动子是诱导型启动子，所述诱导型启动子相比诱导 状态，在诱导状态中可以驱动所述受体基因的表达到至少2、4、5、10或更多倍的更高 水平。所述重组遗传构建体还可以包含连接到编码复层病毒受体的核酸的选择标记。宿主细菌可以是例如革兰氏阴性细菌。
另一方面，本发明提供包含可传递的DNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合 物，所述可传递的DNA编码与裂解性噬菌体结合的噬菌体受体，其中所述裂解性噬菌体 会杀死表达所述噬菌体受体的细菌细胞。在某些实施方案中，可传递的DNA是选自N、 P、W、D、M、X、PU U、W、C或J的:Inc质粒；或裂解性噬菌体是命名为PRDl、 PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GILOU pGILOl、BAM35 或 GIL16 的噬菌体。 还提供了包含具有所述裂解性噬菌体和所述药物组合物的一个或多个室的试剂盒。
本发明提供减少异质细菌群体中编码抗生素抗性和/或毒力因子的接合型质粒 的流行的方法。所述方法包含将所述异质细菌群体与例如复层病毒的噬菌体接触的步 骤，所述噬菌体通过与由所述接合型质粒的核酸组分编码的受体蛋白的相互作用，结合 或进入携带所述接合型质粒的细菌宿主细胞。一旦所述噬菌体已接触并将其基因组插入 到所述细菌宿主细胞中，所述宿主细胞可以表达合适的受体。与该受体结合的噬菌体可 以停止或减少宿主细菌细胞以及其中含有的相关质粒的复制。另一方面，所述方法包 括用编码抗生素抗性和/或毒力因子和噬菌体受体的质粒转化增加比例的细菌群体的步 骤。因此，在被适当的噬菌体感染后，感染性的或致病性的细菌群体可以转变为易感于 杀死或增殖减少的细菌群体。
在一实施方案中，异质细菌群体中这些携带质粒的细菌的绝对数量降低例如起 始总数的10%、20%, 25%, 40%, 50%, 75%, 80%或90%。存在的细菌数量可以通 过以下测定，例如使用血细胞计数器的细胞计数或在合适的培养基上连续稀释，包括在 合适的选择条件下。
在另一实施方案中，噬菌体是宽宿主范围噬菌体。宽宿主范围噬菌体的实 例包括噬菌体的复层噬菌体科；质粒依赖性的宽宿主范围噬菌体；以二十面体形态、 脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个或多个为特征的噬 菌体；以及选自以下的噬菌体PRD1、PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GILOU Bam35、PhiNSll 或 GIL16、AP50、P23-62、-65、-65H、-71、-72、-77、 P37-2、-4、-4A、-4B、-6、-6A、-7A、-8、-8B、-9、-9A、-3、-13B、-13C 、-13L、-14A、-21、-21C、-21T、-26、-26S、-28、-36、-41、-41A、-41B、-43、-4 5、-50、-50L、-61、61L、-62、-63、-64、-64C、_64L、-64T、-71、-72、-72 L、-73、-74、-76、-77、-81、-82、-83、-84、-87、-88、P78-76。
在另一实施方案中，接合型质粒具有一个或多个以下特征不相容性群中的成 员资格，例如 N、P、W、L/M、T、U、W、Y、B/O、FIK II、K、com9、FK HIU HI2、X、A/C、D、FIV> FV/FO、FVK H13、HIK 12、Igamma> J、V 等，包括其例 如展现出基本的序列和或功能关系的变体；编码一种或多种在复层病毒噬菌体复制中重 要的其他基因；编码一种或多种抗生素抗性、选择或毒力标记；是与宿主细菌细胞染色 体分离的DNA的形式；或染色体的部分；编码一种或多种用于细菌接合的菌毛基因。
在另一实施方案中，异质细菌群体处于对数或稳定状态生长阶段。所述细菌群 体可以见于多种环境中，例如食物加工单位；或水处理设施中；污水处理厂；医疗单位 中；例如海洋环境、河口水或温泉的环境中。所述细菌群体可以在协同菌落中，其中不 同种相互作用以制造有活力的菌落，正如在生物膜中或白蚁的肠中。在这些菌落中，关10键成员的去除可以去除群体的活力。所述细菌群体可以见于真核细胞或器官培养物中。 在其他实施方案中，所述细菌群体见于，例如真核宿主中；脊椎生物体中或脊椎生物体 上；或哺乳动物中或哺乳动物上。 在另一实施方案中，细菌宿主细胞和噬菌体之间的接触发生在细菌细胞表面上 的或例如菌毛的细菌细胞的附器(appendage)上的接合复合物处。所述接合复合物可以与 接合型或可移动质粒相关联。接触还可以通过噬菌体相关蛋白发生，所述噬菌体相关蛋 白识别并结合上述接合复合物。对于噬菌体和宿主细菌细胞之间的接触，37°C是优选的 温度，尽管在其他较低或较高的温度接触会发生。用于接触的优选的最适pH是7.0，但 是在较高或较低的pH值下接触会发生。在另一实施方案中，使用能够在有或无噬菌体扩增的多种多重感染下与宿主细 菌细胞结合的噬菌体，发生细菌宿主细胞和噬菌体的接触。另一方面，本发明提供将可传递遗传元件中编码的噬菌体结合易感性，从易感 于噬菌体结合的供体细菌细胞转移到非易感于所述噬菌体结合的接受体细菌细胞的方 法。所述方法包括在可传递遗传元件被从供体细胞转移到接受体细胞的条件下，将非易 感的细菌细胞暴露于易感的细胞的步骤。在一实施方案中，可传递遗传元件是质粒或染色体片段。所述可传递遗传元 件优选地编码复层病毒噬菌体受体；或菌毛；或细菌接合复合物的组分。在其他实施 方案中，可传递遗传元件是质粒。优选的质粒的实例包括，例如F、R386、RU Col B-K99、Col B-K166, R124、R62、R64、R483、R391、R46、R724、RP4、RK2、 R751、RSF1010、R401、R388或S_a。所述质粒可以在不相容性群(Inc群)中，例如 N、P、W、L/M、T、U、W、Y、B/O、FIK II、K、com9、FK HIl、HI2、X、A/ C、D、FIV> FV/FO、FVK H13、HIK 12、Igamma、J 禾Π V，或其变体。噬菌体易感 供体可以是，例如F+细胞；或来自例如埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆 菌属、弧菌属、不云力细菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、 芽胞杆菌属或微球菌属的属；或抗生素抗性基因或毒力基因的载体。非噬菌体易感的 接受体细菌细胞可以是，例如F-细胞；或来自例如埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏 菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细菌属、葡萄球菌属、链球菌属、芽胞杆菌属或微球 菌属的属。如果在本方法中使用复层病毒噬菌体，优选的复层病毒包括，例如PRD1、 PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GILOU Bam35、PhiNSll 或 GIL16、AP50、 P23-62、-65、-65H、-71、-72、-77、P37-2、-4、-4A、-4B、-6、-6A、-7A、-8、 -8B、"9、"9A、-3、-13B、-13C、_13L、-14A、-21、-21C、-21T、-26、-26S、-28、-36、-4 1、-41A、-41B、-43、-45、-50、-50L、-61、61L、-62、-63、-64、-64C、-64L、-64 T、 -71、 -72、 -72L、 -73、 -74、 -76、 -77、 -81、 -82、 -83、 -84、 -87、 -88、 P78-76。 在优选的实施方案中，复层病毒噬菌体易感细胞的比例在细菌菌落或感染中增加。在另一实施方案中，例如复层病毒的噬菌体被用于感染致使表达受体的细胞， 并且优选地发生以下结果噬菌体感染导致易感细胞的死亡；在易感细胞群体中编码抗 生素抗性或细菌毒力基因的其他可移动元件的传递减少；抗生素抗性和噬菌体抗性的以 及有毒力的细菌群体减少。在本发明的另一方面，在上述任何方法中，合适的一种或多种抗生素与噬菌体一起给予。在优选的实施方案中，噬菌体和抗生素的联合给予引起异质细菌群体中的易 感细菌细胞的协同减少或群体中发现的质粒DNA拷贝的数量减少。发明详述I 前言 从世界不同地方分离的噬菌体的特别的群已经被表征为感染携带接合型质粒的 革兰氏阴性细菌。参见 Grahn，et al.(2006) “ PRDl Dissectingthe Genome, Structure and Entry" (PRD 1 剖析基因组、结构和进入)inCalendar(ed.) The Bacteriophages (噬菌 体)(2ded.)OxfordUniv.Press，ISBN-13 9780195148503。非常相似的分离物也感染革
兰氏阳性宿主细菌。这些密切相关的噬菌体已经被共同划分到复层噬菌体科并且包括， 例如命名为 PR3、PR4、PR5、PR772、L17、AP50、NSll 和 P37-14 的噬菌体。在这 些噬菌体的各种感兴趣的特征中的是，复制机构、衣壳构造、主要外壳蛋白折叠和顶点 结构十分类似于人类腺病毒中的那些。这带来了以下提示，这些病毒属于具有先于细菌 和真核生命领域分叉的共同祖先的原始谱系。复层噬菌体科(下文称为复层病毒)的结 构特征提示了符合具有功能上适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性宿主细菌两者的结合和感 染机构的这些噬菌体的一些潜在的原理。因此，如所述，涉及宿主结合和感染中高选择 性的普通噬菌体生物学法则似乎不适用于这些特殊的宽宿主范围噬菌体，并且可能不适 用于其他的。复层病毒通常具有二十面体外部蛋白衣壳、脂膜双层和病毒DNA基因组。表 征最充分的PRDl噬菌体成员具有宽宿主范围，是供体特异性噬菌体，并且仅感染携带 IncP> IncN或IncW的宿主细胞，所述IncP、IncN或IncW是多抗药性接合型质粒。Inc 质粒是“不相容性”群质粒，其有效地防止相同不相容性群的其他质粒共享宿主，但似 乎是噬菌体感染所必需的。因此，该质粒似乎编码噬菌体感染所必需的一些功能，推测 地是噬菌体受体。不同不相容性群质粒似乎能共存于单一宿主，但是存在防止相同群的 多质粒共感染单一宿主的机构。质粒通常编码噬菌体受体，并赋予宿主细菌噬菌体结合 (以及最终感染)易感性。这意味着易感性可以被转移到最初不易感的宿主细胞。存在很多不同Inc群，群中有一个或多个已描述的质粒。例如，由质粒F和R386 所代表的群Fl ；由质粒Rl所代表的群FII ；由质粒Col B-K99和Col B-K166所代表的 群FIII ；由质粒Rl24所代表的群FIV ；由质粒R62、R64和R483 (至少5个亚群)所代 表的群I;由质粒R391所代表的群J;由质粒R46所代表的群N;由质粒R724所代表的 群O ；由质粒RP4、RK2和R751所代表的群P ；由质粒RSF1010所代表的群Q ；由质粒 R401所代表的群T ；以及由质粒R388和S_a所代表的群W。存在具有较少代表的其他 相似的群并且随着时间会被鉴定出来。II.定义“细菌培养物”是细胞的群体，其中的一些或全部是细菌。在实验室的情况 下，通常培养物是同质的并且经常是克隆的。在临床的情况下，经常存在“异质细菌培 养物”。所述培养物会经常包括多细菌种，每个细菌种经常含有遗传变体，并且这些可 以相互作用并展现出对集体群体的系统生物学效应。异质细菌培养物可以包括多于一个 细菌种。在一些实施方案中，异质细菌培养物中发现多于2、3、5或10个细菌种。异 质细菌培养物的不断变化的方面可以造成培养物内不同亚群体的相对量和流行的改变以及群体发展的作为结果的指向。在其他情况下，具体的分离物可以是克隆的，并且某些 亚群体可以是不同感染性疾病症状的病灶或原因。培养物的不同成员可以是克隆的，可 以是多克隆的或培养物可以包括混合种。群体可以具有协同群体组分，其经常形成生 物膜结构。参见，例如Talsma(2007) ‘‘ Biofilms on medical devices"(医学设备上的生 物膜)Home Healthc.Nurse 25(9) 589-94PMID 18049256 ； Paju 禾Π Scannapieco “ Oral Biofilms，periodontitis，and pulmonary infections “ ( 口腔生物膜、牙周炎和肺感染) Oral Dis. 13 (6) 508-512PMID 17944664 ； Visai, et al. (2007) “ Staphylococcus biofilm components as targets for vaccines anddrags “(葡萄球菌属生物膜组分作为疫 苗和药物的 IE 点)Int.J.Artif.Organs 30(9) 813-819PMID 17918127 ； del Pozo 禾口 Patel (2007) “ Thechallenge of treating biofilm—associated bacterial infections "(治疗生 物膜相关细菌感染的挑战)Clin.Pharmacol.Ther.82(2) 204-209PMID 17538551 ；禾口 Ryan (2007) “ Infection following soft tissue injury its role inwound healing “(软组织 损伤后的感染其在伤口愈合中的作用)CurrOpin.Infect.Dis.220(2) 124-128PMID 17496569，以及普通临床微生物学教科书。异质细菌培养物包括协同/共生生物培养 物，例如生物膜。对于此类型异质细菌培养物，去除培养物的一个组分可以使所述培养 物无法作为整体生存。参见，例如 Colin 和 Moran(2006) 〃 Molecular Interactionsbetween Bacterial Symbionts and Their Hosts 〃(细菌共生体及其宿主之间的分子相互作用)Cell 126 453-465。哺乳动物细菌感染的典型部位和见于感染中的异质细菌培养物的实例在下文列 出。感染的任何部位可以包括至少两个或更多的下文列出的种。人/动物肠埃希氏菌属的种、沙门氏菌属的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、 假单胞菌属的种、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)的种和变形菌属的种。人咽喉(以及吸入性肺炎、鼻窦感染、中耳感染等)葡萄球菌属的种、链球菌 属的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、棒状杆菌属(Comybacterium)的种和奈瑟氏菌 属(Neisseria)的种。皮肤伤口 /烧伤假单胞菌属的种、葡萄球菌属的种、克雷白氏杆菌属的种。 公路事故伤口感染主要是土壤生物体+厌氧微生物(梭菌属(Clostridium)的种、拟杆 菌属(bacterioides)的种)。 见于环境中的异质细菌培养物可以包括至少两个细菌种，包括以下种中的 一个埃希氏菌属的种、沙门氏菌属的种、志贺氏菌属的种、假单胞菌属的种、 克雷白氏杆菌属的种、变形菌属的种、芽孢杆菌属的种、土壤分支杆菌和链霉菌属 (Streptomyces)。此列表不排除可以存在于群体中的其他类型的细菌种。可以存在含有亚类或亚群体的质粒，例如一些细菌可以具有多种不同质粒或其 组合，这可以赋予在某些条件下多种选择性优势。某些质粒可以编码一个或多个抗生素 抗性或毒力基因。Inc群质粒通常用作防止不相容性群的其他质粒共存在相同宿主中。 参见，例如 Fem4ndez_L0pez, etal. (2006) “ Dynamics of the IncW genetic backbone imply general trends inconjugative plasmid evolution" (IncW基因骨架的动力学暗示接合型质粒进 化中的一般趋势)FEMS Microbiol.Rev.30(6) 942-66PMID 17026718 ；以及 Adamczyk 禾口 Jagura-Burdzy (2003) “ Spread and survival oipromiscuous IncP-1 plasmids “(杂 IncP-1质粒的扩散和存活)人(^3丨0(^111201.50(2): 425-53PMID 12833168。种中的异质性经 常可以反映出不同形式之间选择压力的缺乏或单一优选表型的不完全选择。
复层病毒，即复层噬菌体科的成员，是指某些宽宿主范围噬菌体。复层病毒 是宽宿主范围噬菌体的一种形式，而确实存在其他的，并且通过合适的表征或相关选 择标准会发现其他的。分类标准可以基于属或种的成员间共享的结构和功能特征的组 合。特别地，存在其他相似噬菌体，例如丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科 (Leviviridae)和短尾噬菌体科(Podoviridae)类别的其他相似噬菌体，它们的感染性是质 粒依赖性的。特别地，这些实例包括噬菌体，所述噬菌体的宿主范围是由具有特定质粒 的宿主所限定，所述特定质粒例如编码针对分别的噬菌体的受体。同样地，这些质粒赋 予与所述质粒相容的宿主的噬菌体结合和感染的能力。在其他质粒依赖性噬菌体中，包括有IncP质粒提供对于例如PR64FS和Ifl的 某些丝状噬菌体科噬菌体的易感性。如其他地方所述，IncP、IncN和IncW提供对于例 如PRD1、PR4、PR3、PR5、PR772和L17的某些复层噬菌体科噬菌体的易感性。IncD 质粒提供对于某些光滑噬菌体科或RNA噬菌体的易感性，所述某些光滑噬菌体科或RNA 噬菌体包括，例如噬菌体D ； R687、R711b、R778b和R840 ；质粒编码类似于噬菌体M 和pilHa的结构并且噬菌体附着于菌毛的侧面和末端。空斑形成表现出一些温度敏感 性，经常是较低温度时具有较高的敏感性。IncM提供对于例如噬菌体M的RNA噬菌 体的敏感性，并且似乎对很多含有该质粒的生物体有效。IncX、IncM> IncN、IncPl、 IncU、IncW和质粒R775似乎提供对于包括例如噬菌体X和R6K在内的吸附菌毛尖部的 丝状噬菌体的敏感性。IncC提供对于RNA噬菌体的易感性，所述RNA噬菌体包括例如 噬菌体C-I ；或包括例如噬菌体C-2在内的丝状噬菌体。IncC、IncD和IncJ提供对于包 括例如噬菌体J在内的长尾噬菌体科(siphoviridae)噬菌体的易感性。Folac质粒提供对 于噬菌体Folac的易感性。IncP质粒还提供对于丝状噬菌体Ρβ的易感性(参见Luiten， etal. (1985) J.Virol.56 (1)268-276)，并且其中的受体结合节段可以用于靶向于杀死剂，无 论是完整的噬菌体或连接到受体结合结构域的其他活性(参见，例如WO 2007/130655 ； PCT/US2007/010972)。同样地，IncI或IncN质粒提供对于丝状噬菌体Ike的易感性； 并且IncI、IncN和IncP质粒赋予对于丝状噬菌体12-2的易感性。参见，例如Bradley， etal.(1983)JBact.l54(l) 505-507。已述的各种复层噬菌体(tectiphage)影响不同革兰氏阳性生物，例如Bam35作用 于苏云金芽孢杆菌(B.thuringenesis) ； AP50作用于炭疽杆菌(B.antracis) ； PhiNSl作用于 B.adiocalarius ； GIL16和GILOl作用于苏云金芽孢杆菌；以及pBCLIN作用于仙人掌杆菌 (B.cereus)。宽宿主范围噬菌体会是其宿主范围通常比高特异性的细菌宿主特异性法则更 宽的噬菌体。参见，例如 Bamford，etal. (1995) “ BacteriophagePRDl a broad host range DSDNA tectivirus with an internal membrane “(噬菌体 PRDl 具有内膜的宽宿 主范围 DSDNA 复层病毒)Adv.Virus Res.45 281-319PMID 7793328 ；和 Saren，et al. (2005) “ A snapshot of viralevolution from genome analysis of the tectiviridae family "(来 自复层噬菌体科的基因组分析的病毒进化概要)J Mol.Biol.350 (3) 427-40PMID 15946683。通常，宽宿主范围噬菌体可以感染很多宿主，所述宿主表达合适的受体分子，但是可以来自于被归入分歧的属、科或目分类类别的宿主。受体可以在接合型质粒 上或其他地方编码，以便于按照需要提供结合、感染和/或杀死所必需的基因。接合型质粒通常编码其自身细胞间传递所需要的功能，所述细胞间传递优选地 通过接合。在本文使用的情况下，意指编码大部分必需基因的功能，所述功能留下选择 或改造可以弥补质粒自身上失去的组分的构建体的可能性。也存在通过添加或选择已表 现出宽宿主范围的质粒来拓宽质粒的宿主范围的手段，所述已表现出宽宿主范围的质粒 包含复制的低特异性原点或与所需的宿主范围相容的多原点。接合质粒是“可移动元 件”的一种形式，其通常是物理装置，通过该装置实现细菌种和致病型的多样化。例 如，多样的移动DNA元件的侧向基因转移(Iateralgenetransfer(LGT))可以借助质粒、噬 菌体、转座子和基因组岛发生。尽管最通常考虑的装置是质粒，但是相似的功能可以通 过噬菌体、转座子等中所描述的原理的类似应用来实现。接合型质粒的减少，无论是绝对数量或宿主细胞中的 流行，可以以很多方式实 现。携带大的质粒的选择劣势可以针对具有所述质粒的宿主而选择或造成所述宿主丢失 全部的或部分的质粒。相反，质粒可以赋予例如抗生素抗性的有利表型，并且所有细胞 可以具有所述质粒。在其他情况下，质粒可以编码噬菌体的受体，这使噬菌体成为杀死 或去除具有所述质粒的宿主的装置。在一些实施方案中，接合型质粒是重组质粒，其已 被改造以减小其大小(减少核苷酸总数)，但保持接合型质粒的功能，即细胞之间转移的 能力和核酸序列的存在，所述核酸序列在宿主细胞中表达时，编码复层病毒的受体。减 少可以是在质粒的绝对数量、培养物中具有所述质粒的相关宿主的数量或具有所述质粒 的宿主的相关部分。交配对形成系统是DNA从一个细胞被转移到另一个细胞所凭借的装置。这 区别于细胞分裂产生两个细胞，而是两个细胞彼此转移一些DNA组分。参见例 如，参见例如 Schaechter (2004) The Desk Encyclopedia ofMicrobiologv (微生物学案 头百科)(2d ed.) Academic Press，ISBN0126213615, 9780126213614 ； Funnell 和 Phillips (eds.2004) PlasmidBiologv (质粒生物学)ASM Press, ISBN-IO 1555812651， ISBN-13 978-1555812652 ； Streips 禾口 Yasbin (2003) Modern Microbial Genetics (现 代微生物遗传学)(2d ed.) Wilev-IEEE, 2003，ISBN 0471461083，9780471461081 ； Schrodera 禾口 Lankab (2005) “ The mating pair formationsystem of conjugative plasmids-A versatile secretion machinery for transferof proteins and DNA "(接合型质粒的交配对形 成系统-用于蛋白和DNA转移的多用途分泌机构)Plasmid 54(1) 1-25 ； Francia, et al. (2004) “ Aclassification scheme for mobilization regions of bacterial plasmids "(细菌质粒 移动区的分类方案)FEMS Microbiol Rev.28(l) 79-100 ； Frost, et al.(1994) “ Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the Fsex factor " (F '性因子 的转移区的序列和基因产物分析)Microbiol Rev.58 (2) 162-210 ； Novotny, et al. (1969) “ Functions of F Pili in Mating-PairFormation and Male Bacteriophage Infection Studied by Blending Spectraand Reappearance Kinetics “(通过调和光谱和复现动力学 研究F菌毛在交配对形成和雄性噬菌体感染中的功能)J.Bact.98 (3) : 1307-1319 ； Delmonte-Corrado， et al. (2007) “ Lectin-Binding Sites Involved inParamecium primaurelia Mating Pair Formation"(参与草履虫交配对形成的凝集素结合位点)Journal of EukaryoticMicrobiology 44 (6) 603—608; Murakami 禾口 Haga (1995) " Interpecific Pair Formation Induced by NaturalMating Reaction in Paramecium ‘‘(草履虫属中天然交配反应诱导的 种间对形成)Zoological Sci 12 219-223。革兰氏阳性细菌中的交配对形成Dale和 Park (2004) Molecular Genetics of Bacteria (细菌的分子遗传学)(4th ed.) John Wiley 禾口 Sons0通常，转移通过接合机构发生，但是其变体，包括转化、噬菌体或部分噬菌体基 因组转移、转导或其他相关过程，通常会实现所需目的。在接合过程中，系统通常包括 产生菌毛以及允许例如抗生素抗性、毒力或噬菌体受体标记 的相关遗传标记或盒的转移 和使用所必需的功能。存在增补(supplement)或弥补(complement)不完整系统的装置， 例如使用一个或多个辅助构建体(helper constructs)。“GMP条件”是指良好作业规范，例如美国政府食品与药品管理局(Foodand Drag Administration of the United States Government)所规定的。类似的规范和规定存在于
欧洲、日本和大部分发达国家。例如“基本上纯的(substantially pure)，，的以上定义中的术语“基本上 (substantially)”，通常表示至少约60%、至少约70%、至少约80%或更优选地至少约 90%和仍然更优选地至少约95%纯的，无论是蛋白、核酸或其他结构分子或其他种类的 分子。本发明的实践可以涉及重组核酸的构建和宿主细胞、优选地细菌宿主细胞中基 因的表达。对于特定宿主的优化的密码子使用通常会是合适的。实现这些结果的分子克 隆技术是本领域已知的。种类繁多的适于例如表达载体的重组核酸构建的克隆和体外扩 增方法是技术人员熟知的。足以指导技术人员通过很多克隆实践的这些技术和说明的实 例见于 Berger 和 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques (分子克隆技术指南)， Methods in Enzymology 卷 152 Academic Press，Inc., San Diego, CA(Berger)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，Ausubel, etal.，eds.，Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.禾口 John Wiley&Sons, Inc.的联合企业，(1999 补编)(Ausubel)。对于重组多肽的表达合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的，并且 包括，例如原核细胞，例如大肠杆菌(Exoli)和真核细胞，包括昆虫、哺乳动物和真菌细 胞(例如黑曲霉(Aspergillus niger))。足以指导技术人员通过包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、 复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术在内的体外扩增方法的操作步骤的实例见
于Berger，Sambrook和 Ausubel，以及Mullis，et al. (1987)美国专利第 4,683,202 号；PCR Protocols A Guide to Methods andApplications (PCR 操作方法方法和应用指南)(Innis, et al.eds) AcademicPress Inc.San Diego, CA (1990) (Innis) ； Arnheim 禾口 Levinson (1990 年 10 月 1 日)C&EN36-47; The Journal OfNIH Research (1991) 3 81-94; Kwoh, etal. (1989) Proc.Nat' 1 Acad.Sci USA 86 1173 ； Guatelli, et al. (1990)Proc.Nat' 1 Acad.Sci.USA 87 1874 ； Lomell, et al. (1989) J.Clin.Chem.35 : 1826 ； Landegren, et al. (1988) Science 241 : 1077-1080 ； Van Brant (1990) Biotechnology 8 291-294 ； Wu 禾Π Wallace (1989) Gene 4 560 ；以及Barringer，et al. (1990) Gene 89 117。体外克隆扩增的核酸的改进的方法描述 于 Wallace，et al.美国专利第 5,426,039 号。术语“核酸”是指以单链或双链的形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另作限制，其包括天然核苷酸的已知类似物，所述类似物与核酸杂交的方 式与天然存在的核苷酸相似。除非另作说明，特定的核酸序列包括其互补序列。“重组表达盒”或简单地“表达盒”是重组地或合成地生成的、具有能影响 与这些序列相容的宿主中结构基因表达的核酸元件的核酸构建体。表达盒至少包含启动 子和任选地包括转录终止信号。通常，重组表达盒包含待转录的核酸(例如编码所需多 肽的核酸)和启动子。如本文所述，也可以使用实现表达所必需的或有帮助的其他因 素。例如，表达盒还可以包含编码指导表达的蛋白从宿主细胞分泌的信号序列的核苷 酸序列。转录终止信号、增强子和影响基因表达的其他核酸序列也可以包含在表达盒 中。在优选的实施方案中，编码包含噬菌体受体的氨基酸序列的重组表达盒在细菌宿主 细胞中表达。在另一实施方案中，编码包含治疗性蛋白的氨基酸序列的重组表达盒在细 菌宿主细胞中表达。在其他实施方案中，编码包含噬菌体受体的氨基酸序列的多顺反子 (polycistranic)表达盒在细菌宿主细胞中表达。在其他实施方案中，为了产生多于一种蛋 白，例如噬菌体受体和治疗性蛋白，多顺反子表达盒在细菌细胞中表达。在另一多于重 组蛋白的表达的实例中，表达盒可以包括多于一个单顺反子表达盒。
如本文所用，“异源序列”或“异源核酸”是源自对于特定宿主细胞是外源的 来源，或者如果来自相同来源，对其最初的形式进行了修饰。因此，细菌宿主细胞中异 源噬菌体受体基因包括修饰过的对于特定宿主细胞是内源的受体编码基因。异源序列的 修饰还可以例如通过用限制性酶处理DNA以生成能被可操作地连接到启动子的DNA片 段而发生。例如定点诱变的技术对于修饰异源序列也是有用的。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录 因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列影响 对应于所述第二序列的核酸的转录和/或翻译。“蛋白”、“多肽”或“肽”是指聚合物，所述聚合物中的单体是氨基酸并且 通过酰胺键连接在一起，可选地，称为多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用左旋 异构体或右旋异构体。此外，还包括非天然氨基酸，例如丙氨酸、苯基甘氨酸和高 精氨酸。不是基因编码的氨基酸也可以用在本发明中。此外，已经被修饰为包括反应 基团的氨基酸也可以用在本发明中。本发明中使用的所有氨基酸可以是右旋或左旋异构 体。左旋异构体通常是优选的。此外，其他拟肽(peptidomimetics)在本发明中也是有 用的。对于大体的回顾，参见 Spatola，A.F., in CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS (氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学)， B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，NewYork, p.267(1983)。当用于涉及细胞时，术语“重组”表示所述细胞复制异源核酸，或表达由异源 核酸编码的肽或蛋白。重组细胞可以含有不见于细胞的天然(非重组)形式中的基因。 重组细胞还可以含有见于细胞的天然形式中的基因，其中所述基因是修饰过的并且通过 人工手段再引入到所述细胞中。该术语还包括含有对于细胞是内源的核酸的细胞，所述 核酸已被修饰但没有从细胞中移除所述核酸；这些修饰包括通过基因替换、位点特异性 突变和相关技术获得的那些。“重组蛋白”是由重组细胞产生的蛋白。在优选的实施方 案中，重组噬菌体受体由重组细菌细胞产生。III.普通抗生素抗性机制、MDR簇、毒力因子
如上文所示，抗生素已经使用于避免感染性疾病带来的很多问题的医学实践发 生革命性变化。青霉素的发现启动了该途径，并且已经开发出很多不同的防止菌丛生长 的作用机制。作为响应，很多细菌机制已经进化为躲避抗生素的活性，并且几乎所有的 抗生素都导致了宿主靶标所采取的抗性策略。在很多作用机制中，已经开发了破坏细胞 壁合成、细胞膜功能、蛋白合成、核酸合成和代谢作用的抗生素。此外，很多抗性装 置经常是基因上成簇的或连接在一起，经常在染色体外，以便能以有效的方式在宿主之 间转移。通常，染色体外簇在R质粒上，但是可能在其他相关遗传形式上，例如F质 粒或噬菌体。参见，例如 Torres, et al. (2007) ‘‘ Current concepts in antibiotic-resistant gram-negative bacteria “(抗生素抗性革兰氏阴性细菌中的现代概念)Expert Rev.Anti Infect.Ther.5 (5) 833-43。毒力因子是提供微生物致病性中重要功能的结构。参见，例如Finlay和 Falkow (1997) “ Common themes in microbial pathogenicity revisited “(微生物至文病性中 常见主体再探讨)Microb.Mol.Biol.Rev.16 136-169。存在多种微生物致病性的定义， 并且凭借这些毒力基因的存在，病原体可以区别于其非毒性相应物。一些群体已经探 索了究竟是什么构成毒力因子的难题。已有提示，被认为是致病性所必需的蛋白落入 3个类别(1) “真(true)”毒力基因，(2)与毒力有关的、例如“真”因子的表达调 节基因(regulators)的那些，和(3)细菌为了能进行宿主定殖而需要的毒力“生活方式 (life-style)"基因。本质上，毒力因子是由病原体产生的对于在宿主中导致疾病必要的 任何部分。参见，例如 Wassenaar 禾口 Gaastra (2001) ‘‘ Bacterial virulence can we draw the line ？“(细菌毒力:我们可以划界吗？ )FEMS Microbiol.Lett.9995 1-7。
基于毒力和功能的机制，细菌毒力因子可以粗略地被分为几组。这些通常包括 粘附和定殖因子、侵袭素、荚膜和表面组分、内毒素、外毒素、铁载体(siderophores)和 毒素转运体(transporters)。对于很多侵袭病原体，第一宿主屏障通常是粘膜表面，例如肠或呼吸管道。 因为在这些环境中上皮细胞更新是约48小时，细菌必须充分地附着和复制以避免被清 除。因此，很多已经进化出如鞭毛和菌毛/纤毛(fimbriae)的能动的或附着元件以通过 屏障并进行侵袭。简单的附着是通过宿主细胞表面上的受体和细菌细胞表面上的粘附 素介导。一些可以是种或甚至菌株特异性的，而其他表现出组织向性，即变形链球菌 (Streptococcus mutans)会定殖牙齿，但不会在舌上皮。其他实例包括弧菌属、奈瑟氏 菌属和假单胞菌属的种的纤毛蛋白亚基，其结合宿主细胞表面的D-甘露糖。大肠杆菌 (Escherichia coli)也采用该策略，但可以改变纤毛尖部蛋白以结合其他受体例如唾液酸 (S-纤毛(S-fimbriae))。侵袭素与粘附因子的不同在于以下事实，它们在胞外作用，在局部水平破坏宿 主防御并且便于感染通道。大部分是酶，其影响如组织基质和细胞膜的物理屏障。如 此，细菌可以快速通过细胞间空隙扩散。一些外毒素还可以具有短期存在的侵袭性质， 但是与真的侵袭有区别，即来自博代氏杆菌属(Bordetella)的百日咳毒素。存在一些种 类的侵袭性酶。一些溶解例如结缔组织的透明质组分的困难的(hardy)组织(透明质酸 酶梭菌(Clostridial hyaluronidase))。其他蛋白在细胞膜上打孔并且导致细胞裂解(来自 梭菌属(Clostridium)和革兰氏阳性球菌的卵磷脂酶和磷脂酶)。其他固性胞内细菌蛋白(例如来自李斯特菌属(Listeria))已被称为“侵袭素”，但这些专门作用于宿主肌动蛋白 丝并且诱导用于定殖的微生物吞噬(engulftnent)。荚膜和表面组分可以用于避免吞噬作用。很多病原体已经进化出防止巨噬细胞 的附着和吞噬和其他宿主细胞免疫应答的表面组分。这可以采取膜结合蛋白、粘滑的多 糖荚膜或由微生物清除的并结合在其细胞表面的“自身(self)”部分的形式。后者的实 例是梅毒螺旋体(Treponemapallidum)，梅毒的病因体。细菌清除宿主纤连蛋白并使该部 分结合到其外部细胞膜。革兰氏阳性细菌天然地被具有对于周围环境的低通 透性的厚细胞壁包围，而革 兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)或“内毒素”可以针对补体介导的裂解进行保护。此外，两 类都产生的数种抗原可以抑制吸附，如链球菌蛋白M、葡萄球菌蛋白A和伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi)的 Vi 抗原。一些化脓性胞内球菌也具有杀死吞噬细胞的能力。化脓性链球菌和致病性葡萄 球菌(Staphlyococci)都分泌裂解性酶，其导致嗜中性溶酶体破裂到胞质中并杀死宿主细 胞。革兰氏阴性绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)内毒素A通过停止胞内蛋白合成 体系也可以杀死吞噬细胞。内毒素几乎仅为革兰氏阴性生物体所具有。内毒素或脂多糖(LPS)激活宿主补 体途径，并且是炎症的潜在诱导者。它是由3部分组成的外膜化学部分锚定于外膜中 的毒性脂质(脂质A)、免疫原性多糖核心和位于胞外表面的寡糖的抗原O-连接系列。 它被认为是革兰氏阴性细菌病理学的部分。如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides) —样多样的种在细胞表面表达LPS。内毒素对于大部分哺乳动物是有毒的，并且如果遇到过高的剂量，可以是致死 的。具体地，LPS释放进入宿主循环促进某蛋白的结合，其称为“LPS-结合复合物”。 这与多种单核细胞和巨噬细胞上的CD14受体相互作用，触发炎症细胞因子释放以及补体 和凝血级联的活化。包括致热性和丝裂原活性(mitogenicity)的生理不良应激(distress) 最终导致血液脓毒症和死亡。但是，例如作为佐剂使用的低水平的LPS有利地增加宿主 的微生物抗性，并且诱导T-细胞产生更多抗病毒增强Y干扰素。LPS的脂质A组分是 强生物增强剂，可以促进免疫系统。外毒素由有活力的致病细胞分泌。细菌蛋白外毒素是已知最强毒素之一。通常 由噬菌体或质粒编码，存在很多种类并且所有的都是强抗原性的但固有地不稳定。一些 作用在宿主细胞表面，而多数(A/B毒素)与具有受体(B亚基)的靶膜结合并且将第二 部分(A亚基)直接递送到胞质中。更专门的毒素涉及通过特有的“III型”分泌系统将 蛋白“注射”入宿主。后者仅见于一些革兰氏阴性肠病原。毒素也可以按照其在某些 细胞中的生物活性分类，例如白细胞毒素、神经毒素等。充分研究的典型的A/B毒素是来自白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)的 白喉外毒素(DT)。使用的特异性受体是肝素结合表皮生长因子；A-亚基停止宿主蛋白 合成并导致细胞死亡。但是，该毒素也可以利用宿主的受体介导的内吞(RME)，来通过 内涵体进入细胞。胞质中的一个A-亚基足以杀死，并且该细菌一小时可以释放高达5000 个分子。表面作用毒素通常通过与靶细胞分子结合或形成膜孔而引发其效应，细胞裂解通过所述膜孔发生。此类包括幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的空泡毒素、大肠杆菌 溶血素和属于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的“超抗原”。从晶体结构的阐明中，可以明确这类蛋白在分子水平的功能。凭 借通过MHC-II复合物的非特异性结合未致敏(naive) T-细胞受体，触发大量炎症细胞因 子释放，从而导致化脓性发热例如中毒性休克综合症。一些革兰氏阴性肠病原的III型分泌系统是外毒素不常见的类。它们由两类蛋白 组成；在细菌染色体上大的致病岛(pathogenicity islands)上共同编码的结构部分和效应 物。尽管大部分TTSS蛋白结构组分显示出序列同源性，但是效应物以不同方式影响宿主 细胞以便于细菌扩散。例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的6个分泌Yop外毒素强 力地影响肌动蛋白细胞骨架，从而干扰整联蛋白介导的吞噬作用并允许兼性胞内细菌的 摄取。来自弗氏志贺菌(S.flexneri)的Ipa蛋白有助于通过坏死杀死嗜中性粒细胞，从而 允许病原体通过破坏上皮屏障而进入宿主细胞。这些效应物共享的一些特征包括缺乏 如一些其他分泌外毒素中见到的传统sec信号，细菌胞质中附属蛋白(accessory proteins) (也在TTSS致病岛中编码)广泛伴随(chaperoning)，以及编码每种毒素的mRNA中可能 的易位信号。通常，宿主环境在每方面对于细菌都是理想的，除了一方面；铁是丰富的，但 紧密地结合在血红素、铁蛋白、铁转移蛋白或乳铁蛋白中。这可能是感染中的限制因 素。因此，一些病原体已进化出铁载体毒力因子，其介导宿主铁的释放用于寄生消耗。 实例包括来自埃希氏菌属和沙门氏菌属的种的肠螯合素(enterochelin)，其通过高结合常 数从宿主中清除结合铁。涉及从沙门氏菌属中缺失7个肠螯合素基因的实验已表明，当 病原体被注射入小鼠模型时，所述病原体失去其毒力。因此，铁载体对于毒力是必要 的。大部分革兰氏阴性细菌病原体使用4个分泌系统来将蛋白毒素从其胞质转运到 宿主或胞外基质。分别编号为I-IV型，所述系统用于不同类的外毒素，例如大肠杆菌溶 血素通过周质的1型分泌。尽管1型蛋白具有分泌信号，但转运时没有东西被切割，并 且整个过程以涉及穿过内和外膜的孔的一步机制运作。很多特异分泌外毒素基因在致病 岛上是成簇的，与其各自的分泌器基因(secretion apparatus genes)相邻。大部分Α/Β外毒素，例如白喉棒状杆菌和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的外毒素， 通过两步II型系统被转运到细菌细胞表面。在细菌胞质中氨基末端的切割和通过sec体 系的蛋白转运后，形成了周质中间体。然后这穿过第二套跨膜蛋白。IV型分泌外毒素 也利用内膜sec蛋白，但是通过其羧基末端穿过外膜，所述末端例如幽门螺杆菌的CagA 部分。上文已述的III型分泌系统通过将外毒素直接注射进宿主细胞胞质的专门的大分子 (macromolecular) “针(needle) ” 来分泌效应物。很多这些毒力因子通常在质粒上编码，所述质粒在宿主细菌菌株之间转移。减 少具有这些质粒的群体中宿主或质粒的数量的手段可以使用本文所述的方法实现。质粒 或可移动元件靶标可以比仅仅抗菌抗性质粒宽得多，但包括编码一些或全部这些多种不 同毒力特征的那些。 IV.接合系统；可移动元件；DNA转移质粒通常是复制子，或DNA的复制部件(replicating piece)，其以染色体外状态稳定遗传。在较早的文献中，术语附加体(episome)用于能整合到染色体中的质粒，但 是该术语已经很大程度上被弃用了。质粒通常以具有自主复制能力的双链DNA的共价闭 合环状部件存在，并且正是该性质引出其分离和物理识别。其结构的闭合共价性质允许 它们通过凝胶电泳或氯化铯浮力密度梯度与染色体DNA分开。参见，例如bact.wisc.edu 或基础教科书或微生物学或分子生物学专著。两个特征是几乎所有质粒所共有的，它们具有复制功能并且通常落入不相容性 群，所述不相容性群限制哪些质粒可以共存于单一宿主中。最简单的情况下，复制功能源自一个或多个具有复制必需的反式作用蛋白的复 制原点，所述反式作用蛋白是由质粒自身编码的或“借”自正常宿主复制体系。一些质 粒的宽宿主范围至少部分地用允许它们在多种不相似的宿主中发挥功能的它们的多重复 制系统来解释，例如杂(promiscuous)复制原点、多重可选原点、组合等。
质粒通常仅落入很多存在的不相容性群中的一个。如果两个质粒中任意一个在 另一个存在的情况下比其自身存在的情况下较不稳定，那么两个质粒是不相容的。存在 多于30个不相容性群，迄今为止的描述还未见到上限。不相容性的基因型名称为inc， 不相容性通常是质粒为了保持细胞中一定拷贝数的要求的必然结果。如果给定的不相容 性群的质粒具有其试图保持的一定拷贝数，那么当在同一细胞中发现同一不相容性群的 两个质粒时，就会发生竞争。能更快地复制或具有一些其他优势的质粒会表现出不相容 性系统所允许的在拷贝中不成比例的程度。出人意料的是，当两个质粒都具有分配它们 自身到子代细胞中的相同功能时，所述质粒也可以是不相容的。质粒中经常发现多种其他特征。很多质粒含有不参与复制或不相容性的基因。 这些基因可以编码以下性质如抗生素抗性(并因此引出术语“抗性”或“R”因子)、 复合物大分子的降解、细菌素的产生、对于多种重金属的抗性、抗生素的合成或动物或 植物宿主的感染所必需的毒力因子。第二个常见的性质是促进质粒自身从一个细胞转移到另一个细胞的能力，称为 接合能力。接合是通过细胞与细胞接触在细胞间遗传信息的单向转移。同样地，其并不 限于质粒，而可以发生在任何DNA，只要关键元件存在于细胞中。对于细胞接触的这个 要求将接合区别于转导和转化。术语“单向的”是指质粒拷贝从一个称为“供体”的 细胞转移到另一个称为“接受体”的细胞的事实。有两个不相似的功能参与接合能力 第一个是称为OriT或mob的转移起始位点。前面的术语是用于记忆“转移原点(origin of transfer)"，第二个是缩写的“移动性”。每种情况下，它们是指DNA上的位点而不 是指可散播的产物。第二类的功能是由作用于这些位点并且造成发生移动所必需的功能 范围的蛋白提供。这些是由tra基因编码并且具有包括菌毛形成在内的多种功能，所述菌 毛与接受体细胞接触并且似乎参与到将供体和接受体细胞拉到一起。这带来膜接触的区 域并且似乎形成了某种接合桥。tra基因的产物参与到这些事件的调节和物理构建。该 序列中的一些事件触发通过特异性单链核酸酶的、称为OriT的、位点的切口以及一个或 多个“先导(pilot)”蛋白与DNA的游离5'末端的后续结合。这些蛋白似乎在转移的 DNA的后续复制中发挥功能，其中一个用作“引发酶(primase)”。然后单链被从该末 端转移到接受体，同时供体中发生“滚环”形式的复制。如果被转移的DNA是质粒， 那么在接受体中它成为双链的和环状的(circularized)，借此它推测地可以复制。如果转移DNA是染色体的，环化不会发生，但是以某种方式生成互补的链并且可以发生与染色 体的同源重组(无论如何，如果进来的DNA将被遗传，那么其变为与复制子相关联)。 质粒可能是非接合型的并仍然是可移动的(如果tra产物由另一质粒供给)，只要OriT位 点是在质粒上编码的(具有OriT位点的被转移)。最后，缺乏tra功能和oriT功能两者 的质粒会是非接合型的和不可移动的。反向遗传学中很多应用使用含有OriT区的小的质 粒，其中tra功能由细胞中另一质粒供给。 质粒通常具有增加细胞分裂后两个子代细胞都会含有所述质粒的拷贝的可能性 的机制。负责此工作的分配功能(通常称为par)是通过多种机制包括质粒多体的单体 化(具有很多单体比具有一些多体更好)和使质粒与膜关联(其显然有助于物理上脱离质 粒)。当我们指细胞“丢失”的质粒，实际的机制几乎一定是所述细胞在之前的细胞分 裂中由于不合适的分配而从未接受到所述质粒。该丢失称为分离(segregation)。对于低 和高拷贝数的质粒两者，该“丢失”以(非常粗略地的频率发生，但是已发现一些 格外稳定的质粒，这推测是由于一套不同的par功能。一些质粒已进化出效果类似于par 系统的系统，其通过杀死未接收到质粒的任何子代细胞以“防止”分离。它们做到这样 是通过产生相对长期的杀死功能(kil)和短期的杀死覆盖(kill override) (kor)功能。没有 质粒的子代会具有kil产物，但不能保持必需量的kor产物存活。对于实验人员，这些系 统会看似分配系统，因为在缺乏这些的突变体中，会更频繁地检测到无质粒的分离体。 它们也可以表现出inc功能。偶尔，分离菌株的无质粒衍生体是必要的，所述菌株当前含有质粒，其称为治 愈的步骤。这些可以通过以下找到ω自发地(可能地复制体印在分离的菌落上，如 果所述质粒赋予可评分的表型)；Gi)富集后(同样地，如果所述质粒赋予生长表型)； (iii)选择不同的但不相容的质粒进入细胞；或Gv)用升高的温度或化学品处理，所述化 学品例如吖啶、溴化乙锭、十二烷基磺酸钠和新生霉素(因为前两个化学品已知为突变 齐U，所以它们应该有限制地使用)。特别地，本发明通过去除那些具有赋予噬菌体结合或 感染敏感性的质粒的细胞来提供“治愈”的形式。具有接合能力的性质的不相容性群中，F因子是研究得最充分的。在其染色体外 状态，所述因子具有约62kb的分子量并且编码至少20个tra基因。其还含有3个IS3拷 贝、1个IS2拷贝和1个人序列拷贝以及用于不相容性和复制的基因。F因子可以以3种 不同状态存在“F+”是指自主的、染色体外的状态的、仅含有上述遗传信息的因子。
"Hfr"(指“高频率重组”)状态描述的是所述因子已将自身整合入染色体中的情况， 这可能由于其多个插入序列。最后，“F' ”或(F首要的(Fprime))状态是指因子，当 其以染色体外元件存在时，却具有所述因子含有共价地连接到其上的一些部分的染色体 DNA的其他需求。不含F因子的菌株被认为是“F-”。将F+与F-菌株交配时，发现快速的、有效的F+的转移(一小时约50%的转 移)，而染色体的转移只处于每供体细胞10E-5至10E-7的水平。这可能是由于稀少的、 自发的Hfr形成。如上文提及，由于质粒上的插入序列，Hfr' s通过整合到染色体中发 生。这些似乎引起优选位点上的整合，这样发现多种不同的Hfr' s,所述Hfr' s由于 其转移原点和转移方向而不同。当实施Hfr菌株和F-菌株之间的杂交时，见到高频率的 (10E-2至10E-5)染色体标记的转移。该转移既是定向的也是时间依赖的。因为转移始于F因子中的oriT位点，所以部分的F因子先被转移，然后是染色体的剩余部分。如果 整个染色体被转移，那么其余部分的F因子被转移。F因子自身不整合入接受体，因为 没有对于此整合的同源性，但已被转移的染色体DNA可以通过同源重组进行重组。整个 大肠杆菌染色体的转移花费约100分钟，但是会非常经常地得到交配对的自发破坏。该 破坏表示后期转移的标记通常是完全不转移的，产生趋势为10E3级别(即早期的标记转 移比最远的标记更频繁约10E3倍)的转移梯度。最终结果通常是未能转移整个染色体。 在F'和F-菌株之间的杂交中，取决于供体的基因型，两个可能的提供事件可以发生。 如果供体菌株是Rec_，那么质粒在供体中会仍作为染色体外元件并且会是接合事件中转 移的仅有的遗传信息。但是，如果供体细胞是Rec+，那么同源重组会导致F' s中的一 些整合入供体的染色体并因此像Hfr' s—样作用。通常，由于该原因，R ec-供体用于 此类分析。典型F因子的“局限性”是其用途通常受限于大肠杆菌及其近亲。在这些生物 中，F' s是大的、低拷贝的、能够染色体移动的接合型质粒，但是过大以至于不能物理 上轻易地处理。例如改造版本的新的变体会被创造出以用于所述方法，或为了转移的效 率、表达或靶噬菌体的易感性而进行优化。一些优选的新的变体比天然存在的F因子更 小，例如包含更少的核苷酸。典型F因子的其他新的变体提供例如复制原点和编码复层 病毒受体的核酸之间更紧密的连接。具有范围广泛的性质的多种其他不相容性群的质粒已用于遗传分析中。天然分 离物在拷贝数(从每细胞约一个至数百个)、大小(数kB至数百kB)、稳定性、接合能 力、宿主范围和药物抗性中有所不同。此外，因为这些性质中的很多是一个或小套基因 的产物，所以质粒的巨大阵列已被改造为具有特定套的有用性质，包括很多用于体外操 作的特有的克隆位点。专门的手册描述通用选择并且新的版本在文献中不断描述。术语“交配对形成系统”适用于用于接合的质粒，以及允许例如通过转导或 转化的有效的DNA转移的其他系统。参见，例如SchrSdera和Lankab (2005) “ The mating pair formation system of conjugative plasmids-A versatile secretion machinery for transfer of proteins and DNA“(接合型质粒的交配对形成系统-用于蛋白和DNA转移的 多用途分泌机构)Plasmid54 1-25 ； Dale 和 Park (2004) Molecular Genetics of Bacteria (细 菌的分子遗传学)(4th ed.) Wiley ISBN-10 047085085X, ISBN-13 978-0470850855 ； Brooks (2007) Medical Microbiology (医学微生物学)(24th ed.) McGraw-Hill Medical, ISBN-10 0071476660，ISBN—13 : 978—0071476669; Demuch 禾口 Lamont (eds.2006) Bacterial CeU-to-Cell Communication Rolein Virulence and Pathogenesis (细菌的细胞间 通信毒力和发病机制中的作用)(Advances in Molecular and Cellular Microbiology (分子 和细胞微生物学进展))Cambridge University Press, ISBN-10 0521846382，ISBN-13 978-0521846387 ； Phillips (ed.2004) Plasmid Biology ASM Press ; ISBN-10 1555812651， ISBN-13 978-1555812652 ； Thomas (2000) Horizontal GenePool Bacterial Plasmids and Gene Spread(横向基因池细菌质粒和基因扩散)CRC Press, ISBN-10 9057024624， ISBN-13 978-9057024627 ；以及其他微生物学和细菌学教科书。在接合机制的情况下，在群体中细胞可以从F-转变为F+。因为质粒通常还携 带抗性标记，抗生素方面的选择会确保含有质粒表型变为占主导的。在质粒还编码对于噬菌体的受体的情况下，抗性标记与噬菌体易感性标记的联接提供抗生素加噬菌体暴露 的组合，以显著地减少细菌群体，其足以使免疫或其他宿主细菌清除系统将群体减至最 低。在许多情况下，联合可以协同发挥功能，这样低于阈值量的抗生素和噬菌体可以有 效地控制感染。此外，用噬菌体和抗生素暂时的治疗可以重叠或分开。V.宽宿主范围噬菌体；复层噬菌体科属典型的噬菌体法则指出，噬菌体结合和感染是极其窄宿主范围过程，并且大部 分噬菌体缺乏在多样性的不同宿主中结合和/或复制的能力。噬菌体的复层噬菌体科 的描述提示特有的宽宿主范围的性质是不常见的。窄宿主范围的具体机制可能是由于选 择性观察和两个宿主细胞结合、感染、复制和裂解功能的通常高度专门的相互作用的组
I=I O 相反，意识到宽宿主范围噬菌体的潜在价值，表示可以实施对于宽选择性的性 状的选择。首先是具有相对宽宿主范围的噬菌体，可以应用拓宽其宿主特异性的选择 方法。可以进行噬菌体宿主特异性组分的诱变，例如位于尾部纤维末端的特异性结合蛋 白。赋予基因的结合特异性可以使用标准遗传手段进行鉴定，以辨别出涉及哪个噬菌体 蛋白。例如，在PRDl噬菌体中，P2蛋白已被鉴定为主要的靶细胞受体。对于噬菌体 受体和宿主蛋白两者的联合研究将能拓宽结合的范围，并且生物信息学分析也可以鉴定 表达相似噬菌体受体的其他种。受体_结合蛋白相互作用的结构分析将允许将被更少选 择性的结合蛋白识别的靶受体的诱变或设计。除了结合特异性，宿主范围限制中的一些可以与结合后的噬菌体感染中的稍后 步骤有关。因此，会修饰感染、复制和裂解功能来拓宽杂性(promiscuity)以成功地造成 宿主菌株的更宽的范围。可选地，这些功能的限制性调节可以通过诱变和选择过程来放 松。特别地，发现跨越革兰氏阴性和革兰氏阳性划分的限制性功能的手段将是理 想的，该划分反映了外细胞壁结构之间的结构差异。特别地，革兰氏阳性细菌的细胞 壁结构似乎相似于革兰氏阴性细菌的内细胞壁结构。同样地，革兰氏阴性细菌内宿主 的共同结构特征会易感于能到达那些结构的噬菌体。因此，联合或修饰噬菌体以并入 消化革兰氏阴性菌株的外细胞壁的局部区域的装置可能是有用的。做到这样的酶活 性会存在于正常噬菌体上，所述噬菌体从外细胞壁的外部攻击革兰氏阴性细菌。参见 Padmanabhan, et al. “ Phage Derived Antimicrobial Activities “(噬菌体来源的抗菌剂活性) W0/2007/130655。无论酶活性是附加到噬菌体还是单独给予，外细胞壁的消化可以为噬 菌体提供接触内细胞膜的可及性。应当注意到，在某些情况下，尽管是顿挫型感染，宿主细胞可能变得无能力。 感染进程可能由于复制或裂解功能的失败而失败，而DNA注射的感染过程自身可以使细 胞无能力并杀死细胞而不产生更多噬菌体。在某些情况下，这实现了使宿主细菌细胞免 于进一步生长或毒力功能或作为赋予细菌细胞噬菌体敏感性和/或抗生素抗性的质粒的 贮存体的有意的结果。非复层噬菌体科宽宿主范围病毒在此相似的方式中也会是有用的。其他噬菌 体的受体可以与编码毒力或抗性因子的质粒关联，则所述噬菌体将是可用的。生成将 相关的选择标记连接到对于合适的噬菌体的受体的组分的质粒会是特别有用的，所述的选择标记无论是抗生素抗性还是毒力。参见，例如Gaidelyte，et al.(2006) JBact. 188 5925-5934。在其他相关实施方案中，可以设计或生成来自不同来源的相关噬菌体可以结合 的杂的(例如更宽的噬菌体谱)或多重密切相关的受体。可以构建可结合很多不同宿主 细菌的“万能的(universal) ”噬菌体。适用于很多不同细菌宿主的感染机制可以与提供 的最初的结合或识别功能联合。
在可选的实施方案中，在可移动元件转移可以用于标记接受体靶细胞的不同标 记的情况下，所述标记可以是，例如对于靶标部分的受体或用于杀死表达细胞的识别元 件。例如，所述受体可以是对于例如毒性偶联物的毒性实体的高亲和力受体，或可以是 对于另一杀死系统的受体，所述系统例如巨噬细胞吞噬作用或免疫组分。VI.人工可移动元件构建体；具有受体基因的质粒在许多情况下，通过生成人工构建体而不是使用天然分离物来实现结果可以更 有效地完成本发明的方法。例如，可以构建在质粒或噬菌体的天然分离物上改进的特殊 的版本。修饰可以并入抗性或毒力标记。来自天然进化以例如对抗治疗上有用的抗生素 的标记的变体改造形式可以用于将提供对可选的相关选择性装置抗性的升高的选择性。 例如相关化合物的不同的抗生素可以用于选择编码变体标记的质粒，所述变体标记可能 更紧密地连接到一个或多个用于表达的所需受体。细菌的群体可以经受可选的选择标 记，从而更有力地选择提供使用宽谱噬菌体的更好效率的宿主破坏的可移动元件的所需 版本。可选地，所述变体标记可以连接到更高表达水平受体或连接到表现出在通过对应 的噬菌体的宿主杀死中的更高亲和力或效率的受体。可以构建在杀死表达限定的受体的 宿主中具有更好的效率或特征的噬菌体。在其他实施方案中，可移动元件可以改造为具有对于所述方法的有利特征。质 粒可以设计为展现例如更高效率转移到新宿主、在宿主中更好的表达、改进的受体性 质、DNA甲基化中改变的效率(其导致编码核酸的改变的表达水平)、无关质粒大小或结 构的移除、其他可追踪的特征等。噬菌体或可移动元件可以设计为在使用条件下、例如 在使用的化学或物理条件下更有效地发挥功能。材料的剂型还可以为用途的具体环境设 计，无论是局部、表面、粘膜、溶液等。存在设计或鉴定不同噬菌体识别的更宽谱受体的装置。因此，从很多不同复层 病毒噬菌体等中可以筛选或选择受体。可以筛选和鉴定出选择变体或天然变体。修饰的 亲和力或选择性在合适的用途下将是重要的。在其他情况下，可以施加手段来改变给定 受体的特征，例如通过盐、pH、极性改变物理环境，并且这样可以造成影响配体-受体 相互作用的功能的构象改变。参见以上的质粒依赖性噬菌体和对应质粒的描述。在某些情况下，鉴定在相对于正常实验室条件的极端环境发挥功能的系统可能 是有用的。选择在低或高温度发挥作用的系统，例如在相对于实验室条件的极端环境条 件下，有效的菌毛表达，其允许更有效的到宽群体的转移。周围空间或环境温度可能是 本方法应用于环境矫正的方面。此外，所需噬菌体功能通常可以通过少于完整的噬菌体来实现。噬菌体片段 或部分，例如脓菌素、尾部、酶等，在有效地损害遗传功能方面可以取代完整的复层病 毒。可移动元件的功能可以用当细胞被破坏时发生的核酸的间接降解来损害。
VII.实践应用本发明的实践应用包括，例如公共健康水和废物处理、医院环境中细菌的处 理、食品加工、抗性或毒力编码质粒的治疗性或环境性清除、有效的致敏作用或感染的 评价/检出，以及为获取质粒的选择压力，然后是杀死含有质粒的细胞的步骤。其他应 用包括减少具有质粒的细菌种，其可以在动物设施上实施，例如在有害细菌的存在是不 希望的建筑物和设备的合适的表面上。此外，本方法可以应用于例如(奶牛和菜牛、 猪、鸡、鱼、虾等)的农业动物应用，以在含有不希望的质粒元件的细菌的总的存在上 减少。
一个重要的应用是可能在正常使用中被污染的物品的处理，所述物品例如导 管、医院监护系统、临床仪器以及设备。场所、设备、环境等靶细菌可能是公共健康危 害的地方可以使用提供的方法和组合物进行处理。目的场所包括公共设施，特别是公共 健康设施，其存在处理含有靶细菌的材料的目的或机会，尤其是具有毒力或抗生素抗性 标记的那些靶那些。这些材料可以包括废物产品、例如液体、固体或气体。被很多人触 摸的表面是重要的，包括门把手、水龙头、电梯按钮等。水性废物处理厂可以合并这些方法，来从排出物中清除靶宿主或可移动元件。 固体废物站可以引入这些方法来最小化感染爆发或可移动元件释放的可能性，所述可移 动元件可以将其基因传递到错误的地方。相反，食品制备区或设备需要定期清洁，并 且本发明提供有效地清除靶细菌，特别是携带可移动元件的最危险靶细菌的组合物和装 置。遭受污染的医疗和其他公共环境可以许可相似的手段，来最小化靶微生物的生长和 扩散以及选择的可移动元件的转移。本方法可以用于以下情况需要靶细菌的灭菌清 除，包括空气过滤系统，其例如用于重症监护病房或如飞机、潜艇等受限的循环环境。可选的应用包括兽医或医疗环境中的用途。确定特定细菌的存在或鉴定具体靶 标的手段可以鉴定出这些技术的用途的其他来源。将杀菌或抑菌活性包含到清洁剂(其 包括动物和宠物的清洗)可以与这些技术联合应用。噬菌体可以用于清除具有赋予易感性的质粒的宿主。在抗生素选择条件下(其 要求宿主具有含有抗性基因的质粒)，所述宿主也会表达使那些细胞对噬菌体感染敏感、 并从而杀死含有所述质粒的细胞的噬菌体受体。本发明的方法可以用于在通常不相互作用的细菌种之间转移噬菌体易感性。作 为实例，在通常具有例如脊椎动物或哺乳动物的动物宿主的细菌之间转移的接合型质粒 可以被转移到通常感染例如如昆虫的无脊椎动物或植物的不同宿主的细菌。可选地， 通常感染植物或无脊椎动物宿主的细菌可以要求作为用于转移到通常具有脊椎动物或 哺乳动物宿主的细菌的接合型质粒的来源。可服从这种转移的示例性的种是，例如沙 门氏菌属细菌和黄单胞杆菌属(Xanthomonas)细菌。在一实施方案中，编码复层病毒 PRDl噬菌体的受体的接合型质粒被从鼠伤寒沙门氏菌细菌细胞转移到野油菜黄单胞菌 (X.campestris)细菌细胞。接合型质粒的转移使野油菜黄单胞菌宿主细胞易感于复层病毒 的感染，并因此停止或降低细胞复制率。本文的实施例8提供了接合型质粒从沙门氏菌 属细菌到黄单胞杆菌属细菌的转移的示范。本方法学还可以用于清除携带抗生素抗性标记的群体中的质粒。因此，在某 些情况下，本方法可以用于减少限定的细菌群体或培养物中抗性基因的流行。这些方法可以与其他处理联合，例如用其他抗菌方法或组合物处理，或可以与诱导F菌毛形 成的化合物联合。参见，例如 Hergenrother，etal." Methods of Treating Drug-Resistant Bacterial Infections"(治疗药物抗性细菌感染的方法)美国专利公开第20030130169号， USSNlO/261,851和相关组合物。所述组合可以共同或连续给予。质粒还可以用于通过将编码受体基因转移到相反缺乏所述受体的细胞上，来赋 予对噬菌体感染的敏感性。如此，提供了将噬菌体非易感宿主转换为易感宿主的手段。VIII.治疗性给药应用的方法或给药途径和剂量会根据感染细菌菌株、感染部位和程度(例如局 部的或系统性的)、使用的标记或受体和治疗对象而有所不同。给药方法，无论对于质 粒或噬菌体，包括但不限于口服、气雾剂或用于递送到肺的其他装置、鼻喷雾、静脉 内(IV)、肌内、腹膜内、鞘内、眼内、阴道、直肠、局部(topical)、腰部穿刺、鞘内和 直接应用到脑和/或脑膜。可以用作用于递送治疗剂的媒介的赋形剂对于本领域技术人 员是显而易见的。例如，质粒或噬菌体可以是冻干的形式并且临在通过IV注射给药前 溶解。给药的剂量涉及宿主感染中的每个细菌约0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、 300、1000、3000、10000或更多质粒分子的范围。根据质粒的大小(其自身可以是串联 相关的)或以多拷贝形式(二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等)或与一个或多个其他实 体联合(例如片段或不同佐剂)，剂量可以是约100万至约10万亿/每公斤/每天，并且 优选地约1万亿/每公斤/每天。在噬菌体给药的稍后步骤中，剂量可以是宿主感染中 每个细菌约 0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000、10000 或更多噬菌 体颗粒的范围，或从约10E6细菌杀死单位/公斤/天至约10E13杀死单位/公斤/天。评价杀死能力的方法可以相似于技术人员使用的评价完整的复制噬菌体的方 法，例如空斑形成单位(plaque forming units)或pfu，然而杀死单位可以通过在杀死单位 滴定后测定存活细菌数更好地评价。但是，杀死定量是更清晰的，因为非复制噬菌体颗 粒在细菌宿主菌苔上可能不会形成空斑。因此，评价“杀死(killing) ”单位的量的连续 稀释方法被方便地用于代替标准pfu。暴露于杀死组合物的细菌培养物的连续稀释可以对 杀死单位定量。可选地，将总细菌计数与有活力的菌落单位比较可以建立细菌的哪部分 是实际上有活力的，并暗示出，哪部分已经易感于杀死构建体。在人工或特别制备底物 的活性的其他测量通常可以用作杀死单位的替代测量。一种或多种治疗剂通常被给药或滴定直到实现成功清除致病质粒，尽管当确定 感染菌株的具体诊断时，可以使用宽谱制剂。因此，本发明涉及本发明的组合物的单一 剂型以及多重剂型，以及用于实现递送这些单一和多重剂型的持续释放手段的方法。杀 死噬菌体的延迟释放制剂可以与较早的或立即的质粒转移联合，所述转移例如可移动元 件系统的给药。 关于对肺或其他粘膜表面的气雾剂给药，本治疗剂组合物被并入为给药特别设 计的气雾剂制剂。很多这些气雾剂是本领域已知的，并且本发明不限于特定制剂。该气 雾剂的实例是Schering-Plough生产的沙丁胺醇吸入器(Proventil inhaler)，其推进物含有
三氯氟化甲烷、二氯二氟甲烷和油酸。其他实施方案包括设计用于对个体或患者的鼻和 鼻窦通道给药的吸入器。如果必要的话，根据治疗中使用的具体的组合物，调整推进物 成分和乳化剂的浓度。每次气雾剂治疗待给药的噬菌体杀死单位的数量通常会在约10E6至10E13杀死单位的范围并且优选地约10E12杀死单位。通常，杀死会降低宿主复制能力至少约3倍，并且可能影响其约10、30、100、 300等至很多数量级。但是，即使减缓宿主复制的速率而不杀死也可以具有显著的治疗或 商业价值。优选的遗传失活效率可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8或更多对数单位。 相似地，增长或绝对质粒流行的速率的减少或每宿主细菌细胞数量增加的减少可以是有 用的测量，并且会优选地导致相对于非治疗至少约3、10、30、100或300倍的减少。IX.制剂 本发明还涉及包含提供在药学可接受的赋形剂中的本发明的质粒和/或噬菌体 的药物组合物。本发明制剂和药物组合物从而涉及包含能被转移到特定细菌宿主的分离 的质粒节段的制剂；2、3、5、10或20或更多影响相同的或典型的细菌宿主的实体的混 合物；或编码2、3、5、10或20或更多影响不同细菌宿主或相同细菌宿主的不同菌株的 受体的质粒。可以有这样的实例，其中使用共同地抑制细菌多菌株生长的质粒的鸡尾酒 混合物是有用的，所述细菌例如金黄色葡萄球菌。如此，本发明的组合物可以适应计划 的用途的需要。化合物或组合物通常会是无菌的或接近无菌的。本文的“治疗有效量”是表示产生效果的剂量，所述效果例如抑菌或优选地 杀菌，所述剂量的给药是为了所述效果。在质粒清除的情况下，治疗有效量可以按照 细菌群体成员中数量或生长的降低的速率来测量。确切的量将取决于治疗的目的，并 且可以由本领域技术人员使用已知技术确定。参见，例如Ansel，et al.Pharmaceutical Dosage Forms and DragDelivery (药物剂型和药物递送)；Lieberman (1992) Pharmaceutical DosageForms (药物剂型)(vols.l-3)，Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692，0824716981 ； Lloyd (1999) The Art, Science and Technology ofPharmaceutical Compounding (药物化合的技艺、科学和技术)；和 Pickar (1999) Dosage Calculations (剂量 计算)。正如本领域所知，针对质粒或噬菌体降解、系统对局部递送和质粒转移速率、以 及年龄、体重、基本健康、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、菌落中细菌组分的 谱和状况的严重程度的调整可能是必需的，并且是本领域技术人员可以利用一些实验能 确定的。各种药学可接受的赋形剂是本领域熟知的。如本文使用，“药学可接受的赋形 齐U”包括如下的材料，当其与组合物的活性成分组合时，允许所述成分保留生物活性并 不引起与个体免疫系统的破坏性反应。这类可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖复合物或 晶体等。示例性的药学载体包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳剂。实例包括但不 限于，标准药学赋形剂例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、例如油/水乳剂的乳剂以及各种 类型的润湿剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油以及例如 油酸乙酯的可注射的有机酯类。水性载体包括水、醇的/水性溶液、乳剂或悬液，包括 盐水和缓冲介质。肠胃外媒介包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer' s dextrose)、葡 萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液(IactatedRinger' s)或不挥发性油。静脉内媒介包括流体 和营养补充物，电解质补充物(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。在其他实施方案中， 本组合物会被并入固体基质，包括缓释颗粒、玻璃珠、绷带、眼用插入物和局部形式。包含本发明的组合物的组合物还可以使用本领域熟知的手段冻干，例如用于按照本发明的后续复原和用途。 另外的感兴趣的是用于脂质体递送的剂型和包含微胶囊酶的剂型，包括糖 晶体。包含这些赋形剂的组合物通过公知常规方法配置(参见，例如Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学)，第 43 章，14thEd.，Mack Publishing Col， Easton PA 18042, USA)。用于噬菌体的延迟释放制剂可以在质粒移动步骤之后应用，这
可以允许单一联合的给药步骤。总体上，药物组合物可以以不同形式制备，所述形式例如颗粒剂、片剂、丸 齐IJ、栓剂、胶囊(例如适于口服递送)、微珠、微球、脂质体、悬液、药膏、洗剂等。适 于口服和局部使用的药学级有机或无机载体和/或稀释剂可以用于组成包含治疗活性化 合物的组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物和动物油和脂肪。制剂可以合 并稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变渗透压的盐类或用于获得合适ρΗ值的缓冲液。本药物组合物在活性组合物之外可以包含其他组分。此外，本药物组合物可以 包含多于一种活性成分，例如2种或更多、3种或更多、5种或更多、或10种或更多不同 实体，其中不同质粒或噬菌体可以特异性针对相同的、不同的或伴随的细菌。例如，本 药物组合物可以含有多重(例如至少2个或更多)质粒，其中组合物中质粒的至少2个具 有不同的对于转移的细菌宿主特异性。如此，本治疗剂组合物可以适用于治疗不同细菌 的混合感染，或可以是为对常见于特定公共(institutional)环境的各种类型的感染有效而 选择的组合物。选择组合可以这样产生，例如通过选择不同群的质粒实体，以便含有至 少一种对怀疑存在于感染中(例如在感染部位中)的不同的或关键的细菌(例如菌株、种 等)有效的组分。如上文所述，本组合物可以与其他药剂联合给药，所述药剂例如常规 抗菌剂。在一些实施方案中，将质粒和噬菌体在同一制剂内给药可能是理想的，其可以 具有不同的质粒和噬菌体组分的释放速率。X.方法学实践本发明的一些方面涉及公知方法，普通临床微生物学、操作噬菌体的一般 方法和生物技术、原理和方法的一般基础。对于这些方法的参考在下文列出并且为了所 有目的通过引用将其并入本文。A.普通临床微生物学普通微生物学是微生物的研究。参见，例如Sonenshein，et al. (eds.2002) Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives From Genes to Cells (才古草芽孢杆菌及其近亲 从基因到细胞)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN 1555812058 ； Alexander 和 Strete (2001) Microbiology A Photographic Atlasfor the Laboratory(微生物学实验图集)Benjamin/ Cummings, ISBN 0805327320 ； Cann (2001) Principles of Molecular Virology (分子病毒学 原理)(带 CD-ROM 书；3ded.)，ISBN 0121585336 ； Garrity (ed.2005) Bergey' sManual of Systematic Bacteriology (伯杰氏系统细菌学手册)(2 vol.2d ed.) Plenum, ISBN 0387950400 ； Salyers 和 Whitt (2001) Bacterial Pathogenesis A Molecular Approach (细菌 致病机制分子途径)(2ded.)Amer. Soc.Microbiol.，ISBN 155581171X ； Tierno (2001) The Secret Life of Germs Observations and Lessons from a Microbe Hunter (微生物的神秘、 生活来自微生物猎人的观察和经验)Pocket Star，ISBN 0743421876 ； Block (ed.2000) Disinfection, Sterilization, and Preservation(消毒、灭菌禾口保存)(5th ed.)LippincottWilliams&Wilkins Publ., ISBN 0683307401 ； Cullimore (2000) Practical Atlas for Bacterial Identification(细菌鉴定实践图集)Lewis Pub.，ISBN 1566703921 ； Madigan, et al. (2000) Brock BiOlogy of Microorganisms (Brock 微生物生物学)(9th ed.) Prentice Hall, ASIN 0130819220 ； Maier, etal. (eds.2000) Environmental Microbiology (微生物 生物学)Academic Pr.，ISBN 0124975704 ； Tortora, et al. (2000)Microbiology An Introduction(微生物学引言)包括微生物学位置(TM)网站、学生辅导CD-ROM和 细菌 ID CD-ROM (7th ed.)，Benjamin/Cummings, ISBN 0805375546 ； Demain，etal. (eds. 1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (工业微生物学和生物技术 手册)(2ded.)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN 1555811280； Flint, et al. (eds. 1999) Principles of Virology : MolecularBiology，Pathogenesis, and Control (病毒学原理分子生物学、 致病机制和控制)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN 15558112 72 ； Murray, et al. (ed.1999) Manual of Clinical Microbiology (临床微生物学手册)(7th ed.) Amer.Soc.Microbiol., ISBN 1555811264 ； Burlage, et al. (eds. 1998) Techniques inMicrobial Ecology (微生物生 态学技术)Oxford Univ.Pr., ISBN 0195092236 ； Forbes, et al. (1998) Bailey&Scott' s Diagnostic Microbiology (Bailey 和 Scott ' s 诊断微生物学)(10th ed.) Mosby，ASIN 0815125356 ； Schaechter, et al. (ed.1998) Mechanisms of Microbial Disease (微生物疾病 机制)(3d ed.)Lippincott，Williams&Wilkins，ISBN 0683076051； Tomes(1998)The Gospel of Germs Men, Women, and the Microbe in American Life(微生物的福音男 人，女人，以及在美国生活的微生物)Harvard Univ.Pr.，ISBN 0674357078 ； Snyder和 Champness (1997) Molecular Genetics ofBacteria(细菌的分子遗传学)Amer.Soc.Microbiol, ISBN 1555811027 ； Karlen (1996) MAN AND MICROBES Disease and Plagues in History andModern Times (人类和微生物历史和现代的疾病和瘟疫)TouchstoneBooks，ISBN 0684822709 ；和 Bergey (ed. 1994) Bergey' s Manual ofDeterminative Bacteriology (伯杰氏鉴 定细菌学手册)(9th ed.) Lippincott，Williams&Wilkins，ISBN 0683006037。B.操作噬菌体的一般方法操作噬菌体的一般方法是公知的，参见，例如Snustad和Dean (2002) Genetics Experiments with Bacterial Viruses (利用细菌病毒的遗传学实验)Freeman ； O ‘ Brien 禾口 Aitken (eds.2002) Antiody Phage Display Methodsand Protocols (抗体噬菌体展示方法和 操作步骤)Humana ； Ring 和 Blair (eds.2000) Genetically Engineered Viruses (遗传改造病毒) BIOS Sci.Pub. ； Adolf(ed. 1995) Methods in Molecular Genetics Viral Gene Techniques (分 子遗传学方法病毒基因技术)vol.6, Elsevier ； Adolf (ed. 1995) Methods inMolecular Genetics Viral Gene Techniques(分子遗传学方法病毒基因技术)vol.7，Elsevier ；以 及 Hoban 和 Rott (eds. 1988) Molec.Biol，of BacterialVirus Systems (细菌病毒系统的分子生 物学)(Current Topics inMicrobiology and Immunology (微生物和免疫学当前主题)Νο.136) Springer-Verlag。C.生物技术、原理和方法的一般基础生物技术、原理和方法的一般基础描述于例如Alberts，et al. (2002)Molecular Biology of the Cell (细胞的分子生物学)(4th ed.) Garland ISBN 0815332181 ； Lodish, et al. (1999) Molecular Cell Biology (分子细胞生物学)(4th ed.) Freeman,ISBN 071673706X ； Janeway, et al. (eds.2001) Immunobiology (免疫生物学)(5th ed.) Garland, ISBN 081533642X ； Flint, et al. (eds. 1999) Principles of Virology Molecular Biology, Pathogenesis, and Control (病毒学原理分子生物学、致病机制 禾口 控制)，Am.Soc.Microbiol.，ISBN 1555811272 ； Nelson, et al. (2000) Lehninger Principles offiiochemistry (Lehninger 生物化学原理)(3d ed.) Worth, ISBN 1572599316 ； Freshney (2000) Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (动物细胞培养基 础技术手册)(4th ed.) Wiley-Liss ； ISBN 0471348899 ； Arias 和 Stewart (2002) Molecular Principles of Animal Development (动物发育的分子原理)，Oxford University Press, ISBN 0198792840 ； Griffiths, et al. (2000) An Introduction to Genetic Analysis (遗传 学分析介绍)(7th ed.) Freeman，ISBN 071673771X ； Kierszenbaum (2001) Histology andCellBiology(组织学和细胞生物学)，Mosby, ISBN 0323016391 ； Weaver(2001) Molecular Biology (分子生物学)(2d ed.)McGraw_Hill，ISBN 0072345179 ； Barker (1998) At the Bench A Laboratory Navigator (分子生物学实验室工作手册) CSH Laboratory, ISBN 0879695234 ； Branden 禾Π Tooze (1999) Introduction to Protein Structure (蛋白质结构介绍)(2ded.)，GarlandPublishing ； ISBN 0815323050 ； Sambrook 禾口 Russell(2001)MolecularCloning A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)(3vol.， 3d ed.), CSHLab.Press, ISBN 0879695773 ；禾Π Scopes (1994) Protein Purification Principles and Practice (蛋白纯化原理和实践)(3d ed.) Springer Verlag, ISBN 0387940723。D.蛋白表达的转录调节 转录是过程，通过该过程，例如来自载体的DNA序列被RNA聚合酶拷贝而产生 产物RNA，例如信使RNA或mRNA。对于蛋白或肽表达，mRNA的转录是潜在调节步 骤并因此，最终影响重组蛋白或肽的表达水平。转录由RNA聚合酶与DNA序列中的启动子区的结合起始。启动子是对于DNA 表达的正向调节区，其位于待转录基因的上游(在5'区)。转录也可以通过例如抑制蛋 白与通常位于接近启动子序列的抑制DNA序列的结合以负向方式来调节。为了调节重组蛋白的转录，表达盒可以包含多启动子以及负向调节序列，例如 抑制蛋白结合位点。被认为是强启动子的tac启动子由de Boer和同事描述(deBoeretal， PNAS 80 21-25(1983)。一般来说，当启动子在数量和相对强度上都增加时，核酸表达 水平被认为会增加。可以使用的其他启动子包括Tac启动子。其他示例性启动子包括例 如T7启动子、T5启动子、Pr启动子、P^启动子、trp启动子、Iac启动子、araB启动子 和gal启动子。在本发明的一些实施方案中，Iac和tac启动子的任何数量和组合被设计入载体。E.诱变；位点特异性、随机、改组(shhffling)基于本文提供的结构的和功能的描述，可以分离或生成可以优化优选特征的同 源物和变体。因此，质粒转移、受体表达、噬菌体结合或靶宿主杀死功能的其他催化节 段可以通过结构同源性或通过评价在特征基因组织基序中发现的实体而发现。质粒、噬 菌体受体或宿主细胞识别基因通常见于特定基因排列，并且在对应排列中发现的其他实 体可以通过评价可用的序列信息例如通过生物信息学手段来发现。这些还可以作为筛选结构的变体的起点，例如诱变这些结构并筛选具有所需特征的那些，所述所需性质例如 更宽的质粒可传递性、更宽的噬菌体受体功能或更广泛的宿主靶特异性。可以使用诱变 的标准方法。可以应用基因或结构域改组技术来寻找合适的变体。可以相似地鉴定质粒宿主细胞相容性、噬菌体受体节段或噬菌体杀死功能，并 且为了对已述方法优化，可以鉴定流行的或特异性的靶基序。那些靶标中很多可能是在 各种潜在的靶菌株上发现的高表达的蛋白、碳水化合物或含有脂质的结构。在细菌细胞 外部发现的菌毛结构可能是另一蛋白靶向结合的结构。诱变可以拓宽结合选择性或增加 节段或整个构建体的稳定性，缺失策略可以清除无关节段。革兰氏阳性细菌细胞壁的组分可以与革兰氏阴性细胞壁的组分共享，或可能与 其他分支杆菌或孢子共享。但是，在革兰氏阴性中可能有也能作为对于噬菌体进入的另 外屏障的其他层的壁。来源于噬菌体或其他地方的其他活性可能被联合，以穿透更复杂 的革兰氏阴性细胞壁结构。特别地，多催化节段可以在单一构建体中提供多重活性，所 述多重活性可以协同地发挥功能，或当与另一例如抗生素或抗菌剂的治疗剂联合时，可 以提供协同效果。靶向部分可以增加催化片段的局 浓度，但是合适长度的连接子也可以局部增 加壁降解事件的数量。因此，与靶标和催化基序相容的具有合适长度的连接子可能是有 用的，并且增加导致靶细菌的停滞或杀死的催化穿透活性。技术人员会意识到，可以对多肽的催化或功能结构域进行某些修饰而不减少其 生物活性。可以进行一些修饰以便于克隆、表达或将催化结构域并入融合多肽。这些修 饰对本领域技术人员是熟知的并且包括，例如在编码催化结构域的多核苷酸的任一末端 添加密码子，例如添加在氨基末端以提供起始位点的甲硫氨酸，或置于任一末端以创造 方便定位的限制性酶位点或终止密码子或纯化序列的其他氨基酸(例如多聚His)。必须注意到，如本文所用，和在所附权利要求书中，除非上下文明确指示，否 则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“这/那(the)”包括复数指示物。 因此，例如涉及“噬菌体(a bacteriophage)”包括多个该噬菌体并且涉及〃宿主细菌(a host bacterium)"包括涉及一个或多个宿主细菌及其等同物，所述等同物是本领域技术人 员已知的，并诸如此类。提供本文所讨论的公开只出于其在本申请的申请日之前的公开。本文中没有地 方应解释为承认，借助在先发明，本发明无权先于这些公开。此外，提供的
公开日期可 能不同于实际的
公开日期，这可能需要单独地确认。引文通过引用其整体将其并入本 文。本说明书中引用的所有公开和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的公 开和专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。尽管为了清晰理解的目的，上述发明通过说明和举例的方式已经在一些细节上 进行了描述，但是根据本发明的教导，对于本领域常规技术人员显而易见的是，可以对 本发明进行某些改变和修饰而不偏离所附权利要求书的精神或范围。
实施例实施例1 F因子接合
对于特定质粒和宿主，应当优化的接合条件的重要参数包括，例如供体和接受 体细胞的对数期、接合的孵育时间以及其他条件。因此，可以影响接合频率或效率的各 种组分可以包括温度，并且可以滴定在合适的范围。对于温血动物的治疗性用途，很可 能在约25-45°C，而对于环境情况，温度范围可以是可能高于或低于周围温度20度的范 围。混合、搅拌、离子强度、离子浓度等方面也可以优化。会对于F+与F-宿主的摩尔 关系等测试优化。在某些情况下，接合可以不需要菌毛或此类结构的实际表达。接合可以依赖于 其他“接合相关”生物学，并且在可能不是菌毛依赖性的过程中可能有可选的特征。这 可以使用当前技术和方法进行研究。实施例2 转移质粒/将细胞从F-转换为F+F-宿主到F+宿主转换的证明可以使用标准接合实验来展示。参见，例如 Paranchych 和 Frost (1988) “ The Physiology and Biochemistry of Pili “(菌毛的生理学和 生物化学)Advances in Microbial Physiology 29 53-114 ； Low 和 Porter(1978) “ Modes of Gene Transfer and Recombination inBacteria “(细菌中基因转移和重组模式)Ann.Rev. Genetics 12 249-287 ； Rowbury (1977) “ Bacterial Plasmids with Particular Reference to theirReplication and Transfer Properties “(细菌质粒，特别关于其复制和转移性质) Progress in Biophysics&Molecular Biology 31 271-317; Simon, et al. (1983) " A Broad Host Ran ge Mobilization System for In Vivo GeneticEngineering Transposon Mutagenesis in Gram Negative Bacteria ".(用于体内遗传改造的宽宿主范围移动系统革兰氏 阴性细菌中转座子诱变)Nature Biotechnology 1 784-791 ； Clewell, et al(1993). BacterialConjugation (细菌接合).Plenum Press，New York.ISBN 0-306-44376-7 ； Grohmann, et al. (2003). " Conjugative Plasmid Transfer in Gram-PositiveBacteria "(革 兰氏阳性细菌中接合型质粒转移).Microbiology andMolecular Biology Reviews 67(2) 277-301。可以评价效率、转移速率、对于特定质粒和宿主的条件优化等。例如，方法学可以按照生长例如5ml的体积的供体和接受体细胞到达OD 0.5-0.7。从这些培养物中，混合例如100微升的小体积的供体和接受体培养物。(对照 100微升单独的供体和接受体细胞)。通常，有通过离心和洗涤的清洗，所述洗涤例如用 0.85%盐水两次。重悬沉淀例如于20微升的盐水，并且点在充分干燥的陪替氏平板例如 LB上。平板允许干燥并例如在30度孵育过夜。生长期后，将培养物刮到培养基例如500微升盐水中，涡旋以破坏交配对。悬 液以不同的适当稀释涂板在分别的选择平例如双抗生素平板上。可选地，可检测的标记 (GFP或类似物)可以用于避免抗生素的使用。通常确认合适菌落的接合，所述确认例如 使用PCR确认接合型质粒的存在。实施例3 并入质粒的标记选择合适的标记，其优选地是易于检测的。尽管在治疗性或公共健康实施方案 中毒力或抗性标记通常会是最感兴趣的，较容易的检出标记在建立方法学的确有效中是 有用的。因此，例如GFP的荧光标记可以用于显示标记确实被可检测的转移了，并可以 为所需系统而优化。标记被PCR扩增和克隆到质粒中合适的限制性位点。可以测定在目的质粒和宿主之间有效转移的速率和最适条件。这些可以包括质粒、转染条件、接合条件、动力 学、温度等方面。摄取和表达的速率的评价可以利用例如荧光激活细胞分选或相似方法学。实施例4 诜择缺乏标记的细胞的清除为了选择已获得质粒的细胞，使用质粒上的抗生素或其他选择标记会是理想 的，因为将细胞在抗生素平板上接种只会选择已获得所述质粒的那些细胞。选择标记可 以连接到所需标记，这样选择条件会优选地几乎直接选择标记。如果所述标记是可靶向 的，例如可被噬菌体靶向，那么在选择中存活的细胞应该是易感于由受体介导的噬菌体 感染过程。实施例5 将噬菌体警体标记连接到诜择标记噬菌体受体编码基因和选择标记会在同一质粒上并且优选地紧密地连接。可以 并入装置以最小化受体编码基因和标记不能被轻易分开的可能性。这些标记可以紧密地 连接到合适质粒的复制原点。实施例6 来自F因子的无关序列的检出通过生成单独基因缺失突变体和测试复层病毒易感性，方法可应用于在含有噬 菌体易感性的质粒上鉴定受体编码区。利用分子生物学方法、测序和生物信息学分析以 及操作方法，可以鉴定质粒的区，从而知道哪些是噬菌体易感性的功能转移所必需的。鉴定出的区可以通过弥补反式突变基因产物和测试复层病毒易感性进一步评 价。此后，可以使用方法移除质粒的无关部分以只获得连接到关键质粒接合节段的受体 编码区。实施例7 各种选择标记β-半乳糖苷酶、荧光素酶、GFP、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、 链霉素等是用于这些策略的好的选择标记。选择或检出装置是公知并且容易获得的。^mm8 m^mmmmi^mmmmmm^m^mMmmmmmmmmu使5毫升供体细菌(鼠伤寒沙门氏菌LT2 (pLM2)，其获得自Felixd ‘ Herelle Reference Center for Bacterial Viruses，Laval, Canada)和接受体细菌的培养物(野油菜黄 单胞菌 HER1103，其获得自 Felix De Herelle Center，Laval, Canada)生长在 LB 肉汤中、
37°C和30°C下、200rpm振摇。培养物的最终OD6tltl为0.5-0.7。100微升的供体和接受体培养物混合在一起。还制备了对照样品仅100微升 的供体细胞和仅100微升的接受体细胞。细胞通过离心而沉淀，并且用0.85%盐溶液洗 涤两次。沉淀在20微升的盐溶液中重悬，并且点在充分干燥的LB平板上。平板允许风 干，然后在30°C孵育过夜。 将下一天培养物刮到500微升盐溶液中。通过涡旋分开交配对。加入另外500微 升盐溶液。未稀释的和连续稀释的样品接种在双抗生素平板上，所述平板即具有25 μ g/ ml卡那霉素和100 μ g/ml链霉素的LB。因为鼠伤寒沙门氏菌LT2 (pLM20)是抗卡那霉 素的，并且野油菜黄单胞菌HER1103是抗链霉素的，所以只有已接受pLM2质粒和卡那 霉素抗性基因的野油菜黄单胞菌HER1103细胞生长在双抗生素平板上。使用PCR筛选 生长在双抗生素平板上的细菌的接合型质粒的存在。使用质粒特异性寡核苷酸引物用于 筛选。用接合型质粒转染的野油菜黄单胞菌细胞的单一菌落被接种到含有卡那霉素和链霉素的LB肉汤中，并且在30°C、200rpm振摇下，使其生长到0.5-0.7的最终0D_。细菌的菌苔接种在LB平板上，并且2微升的PRDl噬菌体被点到所述细菌菌苔上。平板在 30°C孵育过夜，并且第二天确认病毒空斑的存在，所述空斑表明PRDl噬菌体感染后，含 有质粒的细菌的死亡或减少的生长。实施例9 多种质粒与合适的噬菌体的配对以上描述提供了示例性的质粒依赖性噬菌体类型的教导，以及那些类别中的噬 菌体的具体实例。描述了不同靶种，并且质粒中的一些是种特异性的或稍差的特异性的 (可能是相关种的簇)。合适的质粒可以被引入靶种，无论是通过接合或其他方法学，包 括转化或电穿孔。一旦所述质粒被内化并且发现表达发生的合适条件，噬菌体易感性通 过标准方法容易地检测。检测可以通常在液体或平板培养物中，其适于所需评价。因 此，随着报告或测试新的配对，可以确认或筛选多种质粒类型(例如IncD质粒与噬菌体 D)的测试及其它。可以筛选提高所需受体的表达或噬菌体作用效率的培养条件。
权利要求
1.减少编码连接到噬菌体受体的抗生素或毒力标记的质粒流行的方法，所述质粒携 带于异质细菌培养物中的细胞内，所述方法包括a)使所述细菌培养物与足够的能够与所述受体结合的噬菌体受体特异性杀死剂接触，其中所述接触允许所述受体特异性杀死剂与所述噬菌体受体结合并杀死含有所述接 合型质粒的宿主细菌，从而减少异质细菌培养物内编码所述抗生素或毒力因子的接合型 质粒的流行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述流行的减少是a)所述细菌培养物中所述接合型质粒的绝对数量的减少；或b)每个所述细菌培养物的成员的所述接合型质粒数量的减少。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述流行的减少为至少2倍。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌培养物是a)处于对数生长阶段；b)处于稳定状态生长阶段；c)乳酸杆菌或乳制品加工培养物；d)在水处理设施中；e)在真核细胞或器官培养物中；f)在真核宿主中；g)在脊椎生物体中或脊椎生物体上；或h)在哺乳动物中或哺乳动物上。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述噬菌体受体特异性杀死剂是a)复层病毒(tectiviras)；b)宽宿主范围的含有脂质的噬菌体；c)PRDl噬菌体群的成员；d)质粒依赖性宽宿主范围噬菌体；e)复层噬菌体科(tectiviridae)；f)以二十面体形态、脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个 或多个为特征的噬菌体；g)选自命名为PRD1、PRRU PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GIL01、pGILOl、 BAM35或GIL16的噬菌体。
6.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤将所述细菌培养物暴露于提供至少 一个编码所述受体的所述接合型质粒从所述细菌培养物的供体成员到接受体成员的转移 的交配对形成系统(mating pairformation system)，并且允许所述系统实现所述接合型质粒 从所述细菌培养物的所述供体成员到所述接受体成员的转移，从而产生包含所述接合型 质粒并表达所述噬菌体受体的宿主细菌。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述接合型质粒a)选自不相容性群N、P或W质粒；b)编码在所述噬菌体复制中重要的一个或多个其他基因；c)编码一个或多个抗生素抗性或毒力标记；d)是以与所述成员的染色体分离的DNA的形式；或e)编码一个或多个菌毛基因。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述交配对形成系统包含a)至少一个菌毛接合基因；b)另一可移动元件转移系统。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述a)允许是在至少30°C的温度下；b)允许是在其中多个菌毛基因被表达的温度下；c)实现是至少2小时的时间段；d)供体是F+细菌细胞；e)接受体是F-细菌细胞；f)允许导致包含所述接合型质粒的所述细菌培养物的成员的增加；g)供体是非致病性细菌菌株；或h)供体和接受体的比例在1 1的两个对数单位内。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述接触是与a)对于每个包含所述编码所述受体的接合型质粒的细菌细胞至少10个噬菌体；b)能够减少所述接合型质粒数量的噬菌体；c)不能在包含所述质粒的所述成员中复制的噬菌体；或d)不能在包含所述接合型质粒的所述培养物的成员中复制其核酸的噬菌体。
11.在异质细菌培养物中转移赋予结合噬菌体的易感性的可移动遗传元件的方法，其 中所述异质细菌培养物包含易感于所述噬菌体结合的供体细菌细胞和非易感于所述噬菌 体结合的接受体细菌细胞，所述供体细菌细胞处于如下条件，其中所述可移动遗传元件 可以从所述供体细胞转移到所述接受体细胞，从而将所述可移动元件转移到所述接受体 细胞并赋予对于结合所述供体细胞上的复层病毒(tectiviras)噬菌体的易感性。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述a)可移动元件是质粒，所述质粒编码至少一个i)复层病毒噬菌体受体基因；或 ii)菌毛基因；b)质粒为i)选自F、R386、RU ColB_K99、ColB_K166、R124、R62、R64、R483、R391、 R46、R724、RP4、RK2、R751、RSF1010、R401、R388 或 S_a ；或ii)在Inc群N、P或W中；或iii)在Inc 群 D、M、X、PU U、W、C 或 J 中；c)易感于所述噬菌体的供体细胞是i)F+细胞；或ii)来自革兰氏阴性细菌种；或iii)来自选自埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属 (Salmonella)、变形杆菌属(Proteus) > 弧菌属(Vibrio)、不动细菌属(Acinetobacter)、芽 胞杆菌属(Bacillus)或微球菌属(Micrococcus)的属；d)接受体细菌细胞是i)F-细胞；ii)来自革兰氏阴性细菌种；iii)来自选自埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细 菌属、芽胞杆菌属或微球菌属的属；或iv)抗生素抗性基因或毒力基因的载体；e)方法增加所述菌落或感染中所述结合噬菌体的细胞的比例；f)噬菌体是复层病毒，包括选自PRD1、AP50、Bam35、NS11、PR3、PR4、PR5、 PR722、L17或P37-14的复层病毒；或g)条件允许菌毛蛋白表达表型从供体到接受体细胞的转移。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述供体细胞和所述接受体细胞来自不同细菌种。
14.如权利要求11所述的方法，还包括给予噬菌体以感染表达受体的细胞的步骤，其 中所述a)感染导致所述易感细胞的死亡；b)方法导致编码抗生素抗性或细菌毒力基因的可移动元件数量的减少；或c)方法还包括将所述细菌细胞暴露于抗生素或诱导F菌毛形成的化合物的步骤。
15.包含编码复层病毒(tectiviras)受体组分的节段的遗传构建体，所述节段由在靶 细菌中有功能的强异源启动子驱动，所述靶细菌可以作为使用所述受体的复层病毒的宿主。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述a)强启动子诱导所述组分的高表达，其将复层病毒与所述宿主的结合增加至少5倍；b)启动子是诱导型启动子；c)构建体还包含紧密连接于所述受体组分的选择标记；d)靶细菌是革兰氏阴性细菌；或e)构建体可以转染感染中的细菌。
17.包含可传递DNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述可传递DNA编码 与裂解性噬菌体结合的噬菌体受体，其中所述裂解性噬菌体会杀死表达所述噬菌体受体 的细菌细胞。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述a)可传递DNA是选自N、P、W、D、M、X、PI、U、W、C或J的Inc质粒；或b)所述裂解性噬菌体是命名为PRD1、PRRUPR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GIL01、pGILOl、BAM35 或 GIL16 的噬菌体。
19.试剂盒，其包括具有权利要求16的所述裂解性噬菌体和所述药物组合物的一个或多个室。
20.将接合型质粒从供体细菌细胞转移到接受体细菌细胞的方法，其中所述接合型质 粒编码噬菌体受体组分，其中所述供体细菌细胞感染脊椎动物并且其中所述接受体细菌 细胞感染昆虫或植物，所述方法包括使所述接受体细菌细胞与所述供体细菌细胞接触，从而允许所述接合型质粒转移到所述接受体细菌细胞的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述噬菌体受体是复层病毒(tectivirus)受体。
22.如权利要求20所述的方法，还包括使包含所述接合型质粒的接受体细菌细胞与结 合所述受体组分的噬菌体接触的步骤，其中所述接触允许所述噬菌体与所述噬菌体受体 组分结合并杀死包含所述接合型质粒的接受体细菌细胞。
全文摘要
本发明提供减少包括感染在内的微生物菌落中质粒的流行的方法和组合物，并且包括治疗剂组合物、用于治疗感染的方法和用于鉴定其他此类组合物的方法。提供了减少抗生素抗性基因的拷贝数以及赋予噬菌体与缺乏那些噬菌体的受体的细胞结合的装置。
文档编号A61K35/76GK102027107SQ200980116840
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者C·B·阿巴艾亚, 巴拉希·西瑞兰姆, 贾亚希拉·马努尔 申请人:冈戈根股份有限公司
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