提高免疫细胞激活阈值的物质的制作方法
专利名称：提高免疫细胞激活阈值的物质的制作方法
提高免疫细胞激活阈值的物质
本发明涉及活性成分(active principle)在制备预期用于提高皮肤免疫细胞和/或 黏膜免疫细胞的激活阈值的化妆品或药物组合物中的用途。
本发明尤其涉及敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的护理和/ 或治疗。
背景技术：
皮肤刺激和变态反应(迟发型接触性超敏反应或接触性变态反应或接触性湿疹) 已成为工业化国家中的健康问题。其原因与见于例如金属盐、化妆品和卫生产品、香 料、药物、防腐剂、消毒剂、衣物、植物等中的接触性刺激素和变应原的数量一样多。 在此相同背景中，声称其具有敏感或反应过度的皮肤的人数近年中已大幅提高。该数目 已从20世纪80年代的人口的30%上升至今天的约60%。
皮肤敏感性最重要的原因之一涉及尤其是遗传性/获得性角质层胞间脂质缺乏 引起的屏障作用的衰减。提高的神经感觉活性也是引起皮肤敏感性提高的因素，其表征 为表皮神经末梢改变、神经递质累积或中枢神经系统信息传递破坏。皮肤敏感性的第三 个其他原因是提高的免疫敏感性，其尤其包含表皮朗格汉斯细胞(LC)密度的可测量的提 高，且其在最极端情况下导致病状，如接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎、或遗 传过敏性皮炎。
敏感性皮肤类型的多态性表现为主观感觉(如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷 紧)和客观皮肤反应(如发红、可见鳞片和皮肤增厚)。这些不雅和/或不适的现象(尤 其是刺激)是敏感性皮肤的特征。在最极端的情况下，还描述了刺激或甚至变态反应。
在化妆品和药物二者中都已知尤其是通过预防和/或治疗炎症或刺激素反应的 实施来降低所有皮肤类型的敏感性。具体而言，在据称其皮肤是“敏感的”的个体情况 下，甚至轻度暴露于攻击性物质Oigent)或刺激素条件都可以表现为不雅和/或不适的皮 肤和/或黏膜现象，该现象可以导致本应适当避免的炎症或实质的刺激反应。当前对敏 感性皮肤的治疗具有使皮肤更具耐受性的目的，即提高敏感性皮肤类型的反应性阈值的 目的，该敏感性皮肤类型表征为较低的对刺激素反应的刺激性阈值。这些治疗基于使皮 肤“镇静”的产品的用途。
通常将其中成分降至最低，并从其排除基本上不适合用于敏感性或变应性表皮 的物质的专用的“敏感性皮肤”化妆品制剂。叙述可以由既不包含香料，也不包含醇、 染料、色素、防腐剂、活性剂，且具有中性pH的保湿产品的用途构成。
基于富含痕量元素和矿物盐的泉水的润肤或镇静产品具有与生理盐溶液相似的 性质，如等渗性。可以用镇静剂和如锦葵、燕麦和矢车菊的抗炎植物提取物强化这些产 品。
具有用天然分子加强皮肤屏障的能力的防护产品，该天然分子将重建表皮的脂 膜(hydrolipid film)，以使所述表皮恢复其所有防护功能。通常将皮肤脂质的前体神经酰 胺用于这类应用。还针对护理反应过度的皮肤描述了基于具有成膜效应的糖类的产品。
通过作用于皮肤的敏感性神经纤维受体而具有神经化妆品活性(neurocosmetic activity)的减压(destressing)产品，如β -内啡肽样产品。一般通过释放如α-MSH(促 黑激素)的抗炎神经介质或通过抑制如TNF α (肿瘤坏死因子)、IL-I β (白细胞介素1 β) 或PGE2(前列腺素E2)的内源抗炎因子将这些产品偶联至抗炎作用。
基本上涉及所有皮肤细胞的皮肤免疫学成分主要由以下构成
-皮肤树突细胞(DC)朗格汉斯细胞和真皮DC(dermal DC，DDC)，其因作为 抗原呈递细胞(AgPC)的功能而是皮肤免疫应答的起因；
-角质形成细胞其因其所构成的基本的皮肤微环境(汗液、皮脂、抗微生物 肽、生长因子、细胞因子、趋化因子等)而是皮肤CD的主要细胞配偶体。
在抗原(例如变应原、病原体和/或异物)刺激过程中，皮肤DC具有以下功 能
-获得或捕获抗原；
-在皮肤外和在淋巴结的方向迁移；
-将抗原信息呈递至淋巴细胞以起始特异的适应性免疫。
皮肤DC还必须整合由邻近的角质形成细胞递送的所有内源信号。具体而言， 在任意刺激下且取决于其性质，角质形成细胞产生非常广泛的一组将影响LC和DDC的 免疫学功能的可溶性介质(例如细胞因子等)。
捕获抗原后，皮肤DC随后经历表型和功能改变
-抗原的捕获诱导LC和DDC的邀适，然后其获得“激活的”表型。此激活表 型表现为直接涉及DC对T淋巴细胞的激活阈值的共刺激分子CD80和CD86的强表达。 II类MHC (主要组织相容性复合物)分子，尤其是HLA-DR的膜表达也因DC表面抗原 肽的呈递而显著提高。
-LC和DDC的激活还与DC在皮肤外和在淋巴结的方向迁移所必需的CCR7受体表达的获得相关。
-在其迁移过程中，LC和DDC经历成熟过程和获得“成熟的”DC表型。淋 巴细胞的致敏和免疫的建立所必需的此成熟状态表现为CD83和DC-LAMP标记的表达和 分泌细胞因子的能力。
发明目的
本发明的主要目的是提供能够提高个体的免疫细胞，尤其是皮肤和/或黏膜免 疫细胞的激活阈值的活性成分。这导致皮肤和/或黏膜敏感性和/或皮肤和/或黏膜反 应性的降低，和/或皮肤和/或黏膜耐受性的提高。因此，这在化妆品或药物，尤其是 皮肤病学治疗和/或护理的背景中具有不可否认的益处。
本发明的目的还提供用于筛选具有上文所述活性的物质的筛选模型，其考虑皮 肤DC的两个群体(LC和DDC)的应答。
发明详述
本发明涉及选自Phoradendron piperoides 植物提取物、Cestrumlatifolium 植物 提取物、千日菊(Spilanthesoleracea)植物提取物、Maprounea guyanensis植物提取物、 一叶嶮碱(securinine)、单叶芸香定丙酮化合物(foliosidine acetonide)、8-氧代假棕榈碱 (8-oxopseudopalmatine)或其任意组合的至少一种活性成分作为用于提高个体免疫细胞的激活阈值的活性剂在制备化妆品组合物中，或在制备优选预期用于提高个体免疫应答的 激活阈值的药物组合物，尤其是皮肤病学组合物中的用途。这种活性成分有利地使得可 能降低个体的至少部分皮肤和/或黏膜的敏感性和/或反应性。
本发明人通过术语“降低”指至少部分地降低和/或限制个体的至少部分皮肤 和/或黏膜的反应性。
有利地，活性成分降低和/或预防皮肤和/或黏膜免疫反应。
有利地，活性成分降低和/或抑制至少一类免疫细胞尤其是树突细胞的活性。
有利地，活性成分降低至少表皮朗格汉斯细胞(LC)和/或真皮树突细胞(DDC) 的活性。
有利地，活性成分与镇静剂组合。
本发明的活性成分具有通过提高免疫细胞尤其是DC的激活阈值来降低免疫应 答的能力。具体而言，本发明的活性成分有利地免疫抑制基本上不同于皮肤炎症途径的 皮肤免疫能力。当前的抗炎产品基本上降低由皮肤角质形成细胞分泌的可溶性促炎因子 (细胞因子、白细胞介素等)的合成能力。本发明的物质靶向完全不同的调节途径，其是 皮肤免疫应答的途径。这些作用方式可以是互补的。
个体免疫细胞的激活阈值，尤其是DC的激活阈值由激活标记，尤其是CD86激 活标记的表达定义。在正常皮肤中，未成熟和未激活的DC具有我们已定义为这些细胞 的激活阈值的CD86的基础表达水平。因此，未成熟和未激活的DC上激活标记表达的 降低，尤其是CD86表达的降低表现为免疫细胞激活阈值的提高。
与单独作用于皮肤免疫应答的间接途径，尤其是作用于皮肤环境，尤其是角质 形成细胞的可溶性免疫介质(细胞因子)的分泌的标准抗炎产品相反，本发明具有靶向皮 肤DC的优势，即靶向免疫应答的优势。
有利地，本发明的活性成分在皮肤中降低至少一类选自下列的标记的表达(i) 由未成熟的树突细胞按基础水平表达的CD86 ； (ii)由激活的树突细胞表达的CD40、 CD54, CD80、HLA DR、CCR7或CD86 ；和(iii)由激活和成熟的树突细胞表达的 CD40、CD54、CD80、HLA DR> CCR7、CD86、CD83 或 DC LAMP，尤其是以降低敏感性皮肤的反应性。
本发明具有在个体需要时(例如在细菌攻击皮肤的过程中、或一般在病原体 剂、高攻击性化学剂和/或异物存在的情况下)提高触发免疫应答的阈值，而同时对随后 的免疫应答具有最小的影响的优势。另一方面，降低皮肤中可溶性促炎介质合成的抗炎 产品不考虑随后的皮肤DC的应答。因此，在使用抗炎产品的标准治疗中，免疫应答被 阻断或至少受损。这明显具有提供经历免疫应答激活剂攻击的个体皮肤弱保护的缺点。
因此，有利地，本发明的活性成分基本上不抑制免疫应答，尤其是不抑制树突 细胞的免疫功能性。
此外，当局部应用后活性成分不再与皮肤接触时，本发明的活性成分允许基础 免疫活性的部分恢复，尤其是树突细胞基础免疫活性的部分恢复。
本发明的活性成分适合用于任意皮肤类型，且尤其适合用于具有敏感、反应和/ 或反应过度的皮肤，和/或由如维生素A酸和/或攻击性物质和/或攻击性条件治疗的攻 击性皮肤病学治疗致使暂时敏感的皮肤的个体的化妆品护理和/或化妆品治疗。
一般，敏感性皮肤定义为不再耐受或几乎不耐受攻击性物质，尤其是环境因素 如污染物、气候因素(风、冷、热)、暴露于UV、情绪因素尤其是压力和/或化学物质 (重金属、去垢剂、包含于化妆品治疗的化合物如香料、防腐剂、醇、pH或AHA、或如 维生素A酸的皮肤病学治疗)和/或攻击性条件尤其是出汗和机械攻击如拔毛、剃须和 摩擦。敏感性皮肤或致使暂时敏感的皮肤不是具有病理特征的皮肤。然而，它可以通过 不雅和/或不适的皮肤和/或黏膜现象如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷紧、发红、可见 鳞片或皮肤增厚与攻击性物质反应。因此，“敏感性皮肤”的特征可以由个体自身用主 观皮肤感觉或由皮肤病学家用客观皮肤反应来估计。
因此，本发明允许控制皮肤DC的激活和/或成熟水平以预防和/或降低敏感性 皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的提高的和/或过度的应答。
根据一个实施变通方案，本发明涵盖活性成分在预防和/或治疗不雅和/或不适 的皮肤和/或黏膜现象中的化妆品用途。因此，本发明的活性成分尤其适合用于化妆品 护理和/或化妆品治疗。它们尤其是允许具有镇静剂和/或抗刺激素和/或保护效应的化 妆品组合物的制备，尤其是针对攻击性物质和/或攻击性条件的化妆品组合物的制备。
因此，取决于相关个体的皮肤和/或黏膜的健康状态(化妆品护理或治疗)或病 理状态(皮肤病学或药学护理或治疗)，本发明涉及两类不同的护理和/或治疗。
根据另一个实施变通方案，本发明涵盖用于药物组合物尤其是皮肤病学组合物 的制备的活性成分，该组合物用于预防和/或治疗由免疫应答的激活引起的病状。
在适合用于局部应用的化妆品载体中包含选自浓度在0.001Wt%和10wt%之间 的Phoradendron piperoides植物提取物、Cestram Iatifolium植物提取物、千日菊植物提取 物、浓度为1X10_7%至的一叶Ji彦碱、单叶芸香定丙酮化合物、8-氧代假棕榈碱和其 任意组合的化妆品组合物也是本发明的主题。
本发明还涉及预期用于提高免疫应答尤其是树突细胞的激活阈值，尤其是用于 预防和/或治疗皮肤和/或黏膜的反应性的药物和/或皮肤病学组合物，该组合物在适 合用于局部应用的药物和/或皮肤病学载体中包含选自Phoradendron piperoides植物提取 物、Cestram Iatifolium植物提取物、千日菊植物提取物、一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化 合物、8-氧代假棕榈碱和其任意组合的活性成分。
本发明还涉及至少一种活性成分在制备预期用于预防和/或治疗刺激或皮肤和/ 或黏膜变态反应尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎和/或遗传过敏性皮炎的药物组合物，尤其 是皮肤病学组合物中的用途。
有利地，本发明的至少一种活性成分用于还包含抗炎剂的药物组合物的制备。
根据一个优选模式，病状是刺激或皮肤和/或黏膜变态反应，尤其是接触性反 应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹，荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应 性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎。荨麻疹尤其是引起皮肤和/或黏膜现象的接触性 荨麻疹和/或饮食性荨麻疹。
优选地，药物和/或皮肤病学组合物预期用于预防和/或治疗刺激或皮肤和/或 黏膜变态反应，尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎。
皮肤和/或黏膜免疫应答的激活表征为至少一类免疫细胞尤其是树突细胞(DC) 的激活，例如表皮朗格汉斯细胞(LC)和/或真皮树突细胞(DDC)的激活。
皮肤DC表征为其特异性标记，LC和DDC分别特异地表达Iangerine和 DC-SIGN。
未成熟的树突细胞由用激活和/或成熟物质尤其是TNF α和/或LPS (脂多糖) 型的激活和/或成熟物质激活前的基础表型状态定义。
“激活的”树突细胞由与用激活和/或成熟物质尤其是TNF α和/或LPS型的 激活和/或成熟物质诱导的状态相当的激活表型状态定义。
激活和/或成熟物质(即提高至少一种DC标记的表达的物质)是DC的危险信 号，其触发免疫应答。此物质是非限制性的。这些物质尤其是使用或应用来提高至少一 种DC标记的表达的化学或生物物质，例如LPS或TNF α、刺激皮肤的参数如气流、污染 物、低于15°C或高于40°C的温度。
本发明尤其涉及哺乳动物，且尤其涉及人。
本发明的活性成分是植物提取物或表征的分子。该提取物有利地产生自选自 Phoradendron piperoides、Cestrum Iatifolium、千日菊、Maprouneaguyanensis 及其任意混合物的植物。优选的表征的分子选自一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化合物和8-氧代假棕榈 碱。任意比例的两种或多种上述活性成分的混合物也被本发明涵盖。根据一个尤其有利 的模式，活性成分是Cestram Iatifolium植物提取物和/或一叶Ji彦碱。
按照本领域中的标准方法获得用于本发明的植物提取物。
取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以和10% (w/w)之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0至0/100 (ν/ν) 的水/醇、水/乙二醇或水/多元醇混合物(如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元醇 类如木糖醇等混合)中。然后优选离心和/或过滤和/或蒸馏所获得的提取物以回收活 性可溶性级分(粗提取物)。
优选将植物提取物溶解于溶剂中，如水、醇、多元醇、乙二醇或其混合物。根 据本发明，优选以相对于组合物重量在0.001_%和10wt%之间、有利地在0.01_%和 5wt %之间和更尤其以Iwt %的浓度使用植物提取物。
可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性物质，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
通过溶解于极性溶剂例如水、乙醇、乙二醇或DMSO中来有利地制备表征的分 子(活性成分)。
根据本发明，优选以相对于组合物总重量在lX10_7Wt%和lwt%之间、有利地 在1\10-5对％和IX IO-1Wt^之间和尤其是IX IO-1Wt^的浓度使用表征的分子。
优选地，组合物是优选局部地应用的化妆品或药物组合物，尤其是皮肤病学组 合物。
例如，在最终化妆品制剂中活性成分0.5%至10%的比率和每平方厘米皮肤Img 完成的化妆品产品的应用比率下，每平方厘米皮肤应用的活性成分的量有利地在io_13g和 10-12g表征的分子之间和在10_5g和IO4g植物来源的活性成分(溶剂中0.001Wt%和10wt% 之间的植物提取物)之间。
优选以化妆品或药物组合物且优选皮肤病学组合物的形式使用本发明的化合 物。
组合物可以包含可选地与其他目的化合物组合的任意适合的溶剂和/或任意适 合的载体和/或任意适合的赋形剂。
结果，对于这些化合物，赋形剂包含例如至少一种选自以下的化合物防 腐剂、润滑剂、乳化剂、表面活性剂、湿润剂、增稠剂、调节剂、控油剂(mattifying agent),稳定剂、抗氧化剂、组织形成剂(texturing iigent)、光泽剂、成膜剂、增溶 剂、色素、染料、香料和遮光剂。这些赋形剂优选选自氨基酸及其衍生物、聚甘油、 酯类、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂类、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、 基于蔗糖的稳定剂、维生素E及其衍生物、天然和合成蜡、植物油、甘油三酯、不皂 化材料、植物留醇、植物酯、聚硅氧烷及其衍生物、蛋白质水解物、霍霍巴油(jojoba oil)及其衍生物、脂/水溶性酯、甜菜碱、氧化胺、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、 甘氨酸和对羟基苯甲酸类，更优选选自丁二醇、硬脂醇聚醚-2(Steareth-2)、硬脂醇聚 醚-21(steareth-21)、乙二醇-15硬脂醚、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、苯氧乙醇、对羟 基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、 天然生育酚、甘油、二羟十六烷基磷酸钠(dihydroxycetyl sodium phosphate)、异丙基羟 十六醚(isopropyl hydroxycetyl ether)、硬脂酸乙二醇酯、三异壬精(triisononanoin)、椰 油酸辛酯(octyl cocoate)、聚丙烯酰胺、异链烷烃、聚乙二醇单十二醚_7 (laureth_7)、卡 波姆(carbomer)、丙二醇、丙三醇、红没药醇、二甲基硅氧烷、氢氧化钠、PEG-30 二聚 羟基硬脂酸酯、癸酸/辛酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇辛酸酯(cetearyl octanoate)、己二酸二 丁酯、葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、EDTA、环甲基硅氧烷、黄原胶、柠檬酸、十二 烷基硫酸钠、石蜡和矿物油、异硬脂醇异硬脂酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸 酯、PEG-8、蜂蜡、氢化棕榈仁油甘油酯、氢化棕榈油甘油酯、羊毛脂油、芝麻油、乳 酸十六酯、羊毛脂醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙烯和等渗盐溶液。
有利地，以选自以下的形式配制上述组合物水性或油性溶液、水性凝胶或霜 剂或油性凝胶，尤其是在瓶或管中，尤其是沐浴凝胶或洗发剂；乳；乳状液、微乳或纳 乳(nanoemulsion)，尤其是基于水包油或油包水或多重或聚硅氧烷；洗剂，尤其是在玻 璃瓶、塑料瓶或剂量计量瓶中或作为气溶胶；安瓿剂；液体皂；皮肤病学条；软膏剂； 摩丝；无水产品，其优选是液体、糊剂或固体，例如棒的形式，尤其是唇膏或片剂的形 式；凝胶胶囊；糖浆；颗粒体；粉末。
本文所用的术语“局部应用”指将本发明的组合物应用于皮肤和/或黏膜表 面，尤其是通过直接应用或通过蒸发应用于皮肤和/或黏膜表面。
本发明还涵盖口服施用，尤其是保健品应用。
本文所用的术语“适合的化妆品或皮肤病学载体”指该组合物或其成分适合用 于与人皮肤接触使用而不具有任意过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答或其 等同物。
本领域技术人员已知许多用于改善皮肤的健康和/或物理状态的化妆品活性成 分。本领域技术人员知道如何配制化妆品和/或皮肤病学组合物以获得最佳效应。此 外，当将它们彼此组合时，本发明中所描述的化合物可以具有协同效应。这些组合也包含于本发明。The CTFA CosmeticIngredient Handbook，第二版(1992)描述了尤其适合用 于局部使用的通常用于化妆品和药物工业的多种化妆品和药物成分。这些类型的活性成 分的实例包含但不限于以下化合物研磨剂、吸收剂、用于美容目的的化合物如香料、 色素、染料、精油、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸 薄荷酯、hamelis馏出物)、防痤疮剂、防絮凝剂、防沫剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲 酸碘丙酯)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、溶胀剂、螯合剂、添加剂、杀 虫剂、变性剂、增稠剂、和维生素及其衍生物或等同物、成膜材料、聚合物、遮光剂、 pH调节剂、还原剂、消色剂或浅色剂(lighting iigent)(例如氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏 血酸磷酸酯镁或抗坏血酸葡糖胺)和调节剂(例如湿润剂)。
具体而言，为了尽可能充分地改善皮肤的敏感性状态，根据本发明将本发明的 活性成分与选自已知其特性的表征的分子和植物提取物的一种或多种其他活性剂组合尤 其有利
-神经化妆品，
-外用止痛药，
-皮肤镇静剂，尤其是PLA2抑制剂、细菌来源的外泌多糖，尤其是化妆品镇 静剂如描述于专利EP 0987010中的欧洲七叶树(Aesculushippocastanum)提取物(CAS 8053392)、交替单孢菌属(Alteromonas)发酵提取物、描述于专利FR2847267中并被申请 人以Inhipase 的名称推向市场的活性成分尤其是野葛(Pueraria lobata)根提取物。
-创伤愈合剂，如泛醇及其衍生物例如乙基泛醇、芦荟(Aloevera)、泛酸及其衍 生物、尿囊素、红没药醇和甘草酸二钾。
-抗炎剂，如类固醇和非类固醇抗炎药，尤其是细胞因子和趋化因子、环加氧 酶、氧化氮(NO)和NOS氧化氮合酶的产生的抑制剂。可以提及的抗炎产品的实例包含 银杏(Gingkobiloba)提取物、三内酯萜类(trilactoneterpenes)如银杏苦内酯(gingkolide)， 尤其是已知其对血小板活化因子(PAF)的拮抗特性的银杏苦内酯B和白果内酯。
-弹性蛋白酶抑制剂，如Haslea ostrearia提取物，例如由申请人推向市场的Blue algae extract 。
-保湿和/或抗炎剂，如Palmariapalmate提取物，例如由申请人推向市场的Sea Parsley 产品。
本发明还涉及包含与其他活性成分组合的本发明的活性成分的化妆品组合物， 已知该其他活性成分用于敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应和/或反应过度的皮肤的化 妆品护理和/或治疗。
本发明涵盖药物治疗方法，其包括尤其是通过局部应用对有需要的个体施用用 于上文所列的多种治疗的活性剂。
本发明还涉及用于筛选这些活性成分的方法。
根据一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和/或黏膜树突细胞免 疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括
⑴制备包含未成熟或未激活的树突细胞(DC)的培养基；
( )将包含DC的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质接触；
(iii)回收DC以定量DC激活标记的表达；
(iv)相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的DC激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质接触的DC的激活标记表达值，以选择提高皮肤和/或黏膜 树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。
根据另一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和/或黏膜树突细胞 免疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括
⑴制备包含未成熟或未激活的树突细胞(DC)的培养基；
( )将包含DC的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质和已知用于通过提高至少一种DC标记的表达来激活免疫应答 的至少一种物质接触；
(iii)回收DC以定量用待筛选物质或活性成分处理和用所述物质刺激后DC激活 标记的表达；
(iv)相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的DC激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质和所述物质接触的DC的激活标记表达值，以选择在所述物 质存在的情况下提高皮肤和/或黏膜树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。
用于提高至少一种DC标记的表达的物质可以是已知用于刺激免疫细胞的应答的 物质，如LPS禾口 TNF α的混合物。
有利地，该方法还包括
(iiib)将步骤(iii)中回收的一些DC再培养足以使这些细胞恢复其基础激活水平 的时间，所述培养基不包含待筛选的任意活性成分或物质；
(ivb)步骤(iiib)之后定量DC激活标记的表达，以选择提高皮肤树突细胞免疫应 答的激活阈值和允许步骤(iiib)之后激活免疫应答的活性成分。待针对其提高皮肤树突 细胞免疫应答的激活阈值的能力筛选的物质是例如希望定量其抑制DC激活标记表达的能 力的植物来源的物质或表征的分子的物质。
表征的分子是已知其化学结构的分子。
DC 激活标记优选选自 CD40、CD54, CD80、CD86、HLA-DR、CCR7，其是 ΜΙΡ-3 β (巨噬细胞炎性蛋白-3 β)趋化因子受体。
DC成熟标记优选选自CD83和DC LAMP。
可以使用任意方法来定量DC激活标记的表达。可以有利地使用RT-PCR尤其 是定量RT-PCR或流式细胞术或ELISA的方法。
因此DC激活标记的表达涉及DC激活标记的蛋白质表达和DC激活标记的基因 表达(mRNA) 二者。
用阳性对照和阴性对照来进行相对于对照的用于选择活性成分的DC激活标记表 达值的比较，优选该阳性对照和阴性对照是激活和/或成熟剂例如LPS/TNFa混合物和 免疫抑制剂例如地塞米松。
有利地，当其使得可能按照该筛选方法获得LC或DDC所表达的CD86的蛋白 质表达低于或等于有或无由LPS 50μ g/mL和TNFci lOng/mL组成的激活剂存在的情况下 LC或DDC所表达的CD86蛋白质表达的95%且优选低于70%，和/或LC或DDC所表 达的CD86的基因表达低于或等于有或无由LPS 50 μ g/mL和TNF α 10ng/mL组成的激活剂存在的情况下LC或DDC所表达的CD86基因表达的95%且优选低于75%时，认为所 筛选的物质是活性成分或活性物质。
根据其他实施方案，本发明涉及本发明的活性成分与刺激剂或潜在的刺激剂组 合的局部用途，优选非治疗性用途。
本发明还涉及预期与皮肤和/或黏膜接触的包含本发明的活性成分和刺激剂的 组合物。刺激剂可以是例如去垢剂，接触攻击剂，防腐剂尤其是乙二醇衍生物尤其是 戊二醇衍生物，化妆品刺激剂如AHA尤其是乙醇酸、乳酸及其衍生物，如视黄醇及类 视黄醇衍生物，尤其是视黄醛、视黄酸，如水杨酸，和/或与在限制条件下允许的EEC Directive 76/768中所列的一种或几种成分组合于化妆品组合物中，尤其是AraiKc 3中所列 的成分。
根据其他实施方案，本发明的活性成分可以用于日常化妆品护理组合物。因此 本发明涉及化妆品护理和/或治疗方法，其中至少一种本发明的活性成分优选Cestrum Iatifolium提取物可能与化妆品刺激剂组合每天以有效剂量在皮肤和/或黏膜上应用。
通过阅读参考了实施例的解释性描述，本发明的其他目的、特征和优势将清楚 地呈现给本领域技术人员，所述实施例是为了纯说明性目的而给出，不应以任意方式认 为其限制本发明的范围。
实施例形成本发明的整体部分，来自其(包含实施例)的整体中取出的描述的任 意相对于现有技术表现为新颖的特征以其功能和其一般性形成本发明的整体部分。
因此，每一实施例具有一般范围。
此外，在实施例中，除非另作指定，所有百分数以重量计，除非另作指定，温 度表示为摄氏度数，除非另作指定，压力是大气压。实施例
实施例1 皮肤树突细胞LC和DDC的制备
在两个连续步骤中进行从血单核细胞制备LC和DDC的方法。
步骤1 从循环外周血分离单核细胞的方法
在有抗凝剂优选肝素锂存在的情况下收集一个或多个人供体的循环静脉外周血。
可以有利地按照以下流程进行单核细胞从循环血的分离
1/在淋巴细胞分离培养基上离心血液后，回收单核细胞，然后
-或者用抗体混合物例如偶联至磁珠的抗-CD3、抗-CD7、抗-CD16、抗 CD19、抗CD56、抗CD123、抗-血型糖蛋白A抗体标记。穿过磁化柱后，仅洗脱和回 收未标记的单核细胞。
-或者用对单核细胞特异的抗体，如偶联至磁珠的抗-CD14抗体标记。穿过磁 化柱后，仅标记的单核细胞滞留在柱中。洗脱柱后，回收标记的单核细胞。
-或者用对单核细胞特异的抗体如偶联至荧光染料如澡红蛋白的抗-CD16抗体 标记。通过流式细胞术分选细胞后，仅回收标记的单核细胞。
2/通过进行本领域技术人员公知的任意物理分离方法，尤其是通过沉淀或离心 回收单核细胞，并在不为随后的培养进一步加工的情况下洗脱。
3/每IOOmL所收集的血液的提取收率是约150兆(million) (士 20兆)单核细胞，从其中获得至多40兆单核细胞。
步骤2:冻存来自循环外周血的单核细胞的方法
可以有利地在-80°C至_196°C，优选在液氮中于_196°C、以约10兆/mL的比 率、在适合的冻存培养基例如由90%胎牛血清和10% DMSO(二甲基亚砜)组成的培养 基中冻存步骤1中获得的单核细胞。
该冻存步骤有利地允许供体库例如3个单核细胞供体的细胞混合物的制备。
步骤3 培养分离的单核细胞以获得未成熟的LC和DDC的方法
按约1兆/mL的比率在确定或不确定的培养基中培养(37°C、5% C02)步骤1 和/或2中获得的单核细胞，优选在补充10%胎牛血清并包含以下三种细胞因子的RPMI 1640培养基中GM-CSF (粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，比率为200ng/mL)、比率为 10ng/mL的TGF β 1 (转化生长因子β 1)和比率为10ng/mL的IL-13 (白细胞介素13)。
在培养的第6天，未成熟的LC和DDC同时产生，且在表型上和功能上非常类 似于其体内相应物
-体外产生的树突细胞的至多40%在胞内表达langerine，至多60%表达 DC-SIGN。
-体外产生的LC和DDC是未成熟的，因为它们按基础水平表达共刺激分子 CD80和D86，且不表达成熟分子CD83和DC-LAMP。
-用TNFα (有利地为10ng/mL)和LPS (有利地为50 μ g/mL)刺激48小时后， 如由分子CD80和CD86表达的提高和由成熟标记CD83和DOLAMP表达的获得所表 明，LC和DDC获得激活和成熟的DC的表型。
步骤4 培养分离的单核细胞以获得激活的LC和DDC的方法
按实施例1和步骤3中所述，但在存在以下三种细胞因子的情况下培养细胞比 率为 200ng/mL 的 GB-CSF、比率为 10ng/mL 的 TGF β 1 和比率为 10ng/mL 的 TNF α。
孵育M小时后，激活的LC和DDC同时产生，且在表型上和功能上非常类似于 其体内相应物。
-LC和DDC显示以下分子的强表达HLA-DR，其是II类MHC分子；CD80和 CD86,其是共刺激分子；和CCR7，其是迁移受体。
-LC和DDC还显示应答趋化因子ΜΙΡ-3 β的高迁移能力。
实施例2 =化妆品活件成分的制备
活性成分具有不同的来源(例如植物来源或表征的分子)。
取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以和10% (w/w)之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，且有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0至0/100 (ν/ ν)的水/醇、水/乙二醇或水/多元醇混合物(如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元 醇类如木糖醇等混合)中。然后优选离心和/或过滤和/或蒸馏所获得的提取物以回收 活性可溶性级分(粗提取物)。活性物质有利地是在溶剂如水、醇、多元醇、乙二醇或其 混合物中且优选在水中的植物提取物。优选在0.001%和10% (ν/ν)之间，有利地是粗提 取物的重量相对于活性成分的总重量在0.01%和5%之间和更尤其是lwt%的浓度将溶解在溶剂中的粗提取物(活性成分)用来进行测试。可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性成 分，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
通过溶解在溶剂例如水、乙醇、乙二醇中或优选溶解在DMSO中制备表征的分 子，并优选在间，有利地在IXlO-1Wt^,且尤其是 在1 X IO-1WtVo的活性成分浓度测试。
实施例3 =用于筛诜化妆品活件成分的樽型
在按照实施例1获得的LC/DDC上测试活性成分。当在实施例1的步骤3中获 得的“未成熟的” LC/DDC上测试活性成分时，这称为预防性护理。当在实施例1的步 骤4中获得的“激活的” LC/DDC上测试活性成分时，这称为治疗性护理。
例如按400000细胞/cm2的比率，在确定或不确定的培养基中，优选在补充10% 胎牛血清和包含以下两种细胞因子的RPMI 1640培养基中将细胞接种至M孔板内比率 为200ng/mL的GM-CSF和比率为lOng/mL的TGF β 1。然后将活性成分加至所述培养 基并用以下终浓度测试
-对于植物提取物，活性成分相对于培养基的总重量在0.001%和10%(ν/ν)之 间，有利地在间和尤其是在lwt% ；
-对于表征的分子，表征的分子(或化学分子)相对于培养基的总重量在 1X10—7%和(ν/ν)之间，有利地在1\10-5_%和IXlO-1Wt^i之间，且尤其是在 IX KT1Wt^。
于37°C在5% C02下在所述培养基中孵育活性成分至多48小时且有利地孵育M 小时。
阴性对照是仅培养基，或包含浓度与所测试的活性剂的浓度相等的提取所测试 的提取物的过程中使用的溶剂的培养基，或包含主要的抗炎糖皮质激素地塞米松(10_8M) 的培养基。用来诱导LC/DDC激活的参考阳性对照是LPS (有利地在50 μ g/mL)和 TNFa (有利地在10ng/mL)的混合物。
^MM 4 所诛雇的H有免疫抑泡丨布丨能力 射舌+牛成分
我们选择了 3种表征的分子(一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化合物、8-氧代假 棕榈碱)以及 4 种植物提取物(Cestram Iatifolium> Phoradendron piperoides、Maprounea guyanensis和千日菊)，其分别表示在表1和2中。
权利要求
1.至少一种活性成分作为用于提高个体免疫细胞激活阈值的活性剂在化妆品组合物 中的用途；或在制备优选预期用于提高个体免疫细胞激活阈值的药物组合物，尤其是 皮肤病学组合物中的用途，所述至少一种活性成分选自Cestram Iatifolium植物提取物、 Phoradendron piperoides植物提取物、千日菊植物提取物、Maprounea guyanensis植物提取 物、一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化合物、8-氧代假棕榈碱或其任意组合。
2.权利要求1的至少一种活性成分的用途，其用于降低和/或预防皮肤和/或黏膜免 疫反应。
3.权利要求1的至少一种活性成分的用途，其用于降低和/或抑制至少一种类型的免 疫细胞，尤其是树突细胞的活性。
4.权利要求1的至少一种活性成分的用途，其用于降低至少表皮朗格汉斯细胞(LC) 和/或真皮树突细胞(DDC)的活性。
5.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其与镇静剂组合。
6.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其特征在于所述植物提取物 的量为所述组合物的0.001_%和10wt%之间，优选0.01_%和5wt%之间。
7.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其特征在于一叶嶮碱、单叶 芸香定丙酮化合物和/或8-氧代假棕榈碱的量相对于所述组合物的总重量在1 X 10-7wt% 和lwt%之间，有利地在lX10_5wt%iP lX10_\vt%之间。
8.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其特征在于所述活性成分是 Cestrum Iatifolium植物提取物和/或一叶嶮碱。
9.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其用于降低选自以下的至少 一种类型的标记在皮肤中的表达G)由未成熟的树突细胞按基础水平表达的CD86; (ii) 由激活的树突细胞表达的CD40、CD54、CD80、HLA-DR、CCR7或CD86 ；和(iii)由 激活和成熟的树突细胞表达的CD40、CD54, CD80、HLA-DR、CCR7、CD86、CD83 或 DC-LAMP。
10.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其用于护理和/或治疗敏 感、反应和/或反应过度的皮肤的化妆方法。
11.至少一种活性成分在用于降低和/或预防不雅和/或不适现象，尤其是蛰刺、 灼烧感觉、瘙痒感觉、绷紧、可见鳞片和皮肤增厚的化妆品护理和/或治疗方法中的用 途，所述至少一种活性成分选自Cestram Iatifolium植物提取物、Phoradendronpiperoides 植物提取物、千日菊植物提取物、Maprounea guyanensis植物提取物、一叶嶮碱、单叶芸 香定丙酮化合物、8-氧代假棕榈碱或其任意组合。
12.权利要求1至10中任一项的至少一种活性成分的用途，其用于预防和/或治疗刺 激，或皮肤和/或黏膜变态反应尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿 疹、荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎的 药物组合物，尤其是皮肤病学组合物的制备。
13.权利要求12的至少一种活性成分的用途，其用于还包含抗炎剂的药物组合物的制备。
14.化妆品组合物，其在适合局部应用的化妆品载体中包含活性成分，所述活性成 分选自浓度在0.00 Iwt %和1 Owt %之间的Cestrum Iatifolium植物提取物、Phoradendronpiperoides植物提取物、千日菊植物提取物；浓度从1X 10_7(%至1 %的一叶Ji彦碱；单叶芸 香定丙酮化合物；8-氧代假棕榈碱及其任意组合。
15.药物和/或皮肤病学组合物，其用于提高树突细胞的免疫应答的激活阈值，尤其 用于预防和/或治疗由皮肤和/或黏膜的免疫应答引起的病状，其在适合局部应用的药物 和/或皮肤病学载体中包含活性成分，所述活性成分选自Phoradendron piperoides植物提 取物、Cestrum Iatifolium植物提取物、千日菊植物提取物、一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化 合物、8-氧代假棕榈碱及其任意组合。
16.权利要求15的药物和/或皮肤病学组合物，其特征在于其预期用于治疗刺激， 或皮肤，和/或黏膜变态反应，尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿 疹、荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎。
全文摘要
本发明涉及作为活性成分提高免疫细胞的激活阈值的活性物质在制备化妆品或药物组合物，尤其是皮肤病学组合物中的用途。本发明还涉及用于筛选此类活性物质的方法。
文档编号A61P17/00GK102026616SQ200980117229
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月16日 优先权日2008年3月14日
发明者N·贝舍图瓦耶, V·安德烈 申请人:巴斯夫美容护理法国公司
提高免疫细胞激活阈值的物质
本发明涉及活性成分(active principle)在制备预期用于提高皮肤免疫细胞和/或 黏膜免疫细胞的激活阈值的化妆品或药物组合物中的用途。
本发明尤其涉及敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的护理和/ 或治疗。
背景技术：
皮肤刺激和变态反应(迟发型接触性超敏反应或接触性变态反应或接触性湿疹) 已成为工业化国家中的健康问题。其原因与见于例如金属盐、化妆品和卫生产品、香 料、药物、防腐剂、消毒剂、衣物、植物等中的接触性刺激素和变应原的数量一样多。 在此相同背景中，声称其具有敏感或反应过度的皮肤的人数近年中已大幅提高。该数目 已从20世纪80年代的人口的30%上升至今天的约60%。
皮肤敏感性最重要的原因之一涉及尤其是遗传性/获得性角质层胞间脂质缺乏 引起的屏障作用的衰减。提高的神经感觉活性也是引起皮肤敏感性提高的因素，其表征 为表皮神经末梢改变、神经递质累积或中枢神经系统信息传递破坏。皮肤敏感性的第三 个其他原因是提高的免疫敏感性，其尤其包含表皮朗格汉斯细胞(LC)密度的可测量的提 高，且其在最极端情况下导致病状，如接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎、或遗 传过敏性皮炎。
敏感性皮肤类型的多态性表现为主观感觉(如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷 紧)和客观皮肤反应(如发红、可见鳞片和皮肤增厚)。这些不雅和/或不适的现象(尤 其是刺激)是敏感性皮肤的特征。在最极端的情况下，还描述了刺激或甚至变态反应。
在化妆品和药物二者中都已知尤其是通过预防和/或治疗炎症或刺激素反应的 实施来降低所有皮肤类型的敏感性。具体而言，在据称其皮肤是“敏感的”的个体情况 下，甚至轻度暴露于攻击性物质Oigent)或刺激素条件都可以表现为不雅和/或不适的皮 肤和/或黏膜现象，该现象可以导致本应适当避免的炎症或实质的刺激反应。当前对敏 感性皮肤的治疗具有使皮肤更具耐受性的目的，即提高敏感性皮肤类型的反应性阈值的 目的，该敏感性皮肤类型表征为较低的对刺激素反应的刺激性阈值。这些治疗基于使皮 肤“镇静”的产品的用途。
通常将其中成分降至最低，并从其排除基本上不适合用于敏感性或变应性表皮 的物质的专用的“敏感性皮肤”化妆品制剂。叙述可以由既不包含香料，也不包含醇、 染料、色素、防腐剂、活性剂，且具有中性pH的保湿产品的用途构成。
基于富含痕量元素和矿物盐的泉水的润肤或镇静产品具有与生理盐溶液相似的 性质，如等渗性。可以用镇静剂和如锦葵、燕麦和矢车菊的抗炎植物提取物强化这些产 品。
具有用天然分子加强皮肤屏障的能力的防护产品，该天然分子将重建表皮的脂 膜(hydrolipid film)，以使所述表皮恢复其所有防护功能。通常将皮肤脂质的前体神经酰 胺用于这类应用。还针对护理反应过度的皮肤描述了基于具有成膜效应的糖类的产品。
通过作用于皮肤的敏感性神经纤维受体而具有神经化妆品活性(neurocosmetic activity)的减压(destressing)产品，如β -内啡肽样产品。一般通过释放如α-MSH(促 黑激素)的抗炎神经介质或通过抑制如TNF α (肿瘤坏死因子)、IL-I β (白细胞介素1 β) 或PGE2(前列腺素E2)的内源抗炎因子将这些产品偶联至抗炎作用。
基本上涉及所有皮肤细胞的皮肤免疫学成分主要由以下构成
-皮肤树突细胞(DC)朗格汉斯细胞和真皮DC(dermal DC，DDC)，其因作为 抗原呈递细胞(AgPC)的功能而是皮肤免疫应答的起因；
-角质形成细胞其因其所构成的基本的皮肤微环境(汗液、皮脂、抗微生物 肽、生长因子、细胞因子、趋化因子等)而是皮肤CD的主要细胞配偶体。
在抗原(例如变应原、病原体和/或异物)刺激过程中，皮肤DC具有以下功 能
-获得或捕获抗原；
-在皮肤外和在淋巴结的方向迁移；
-将抗原信息呈递至淋巴细胞以起始特异的适应性免疫。
皮肤DC还必须整合由邻近的角质形成细胞递送的所有内源信号。具体而言， 在任意刺激下且取决于其性质，角质形成细胞产生非常广泛的一组将影响LC和DDC的 免疫学功能的可溶性介质(例如细胞因子等)。
捕获抗原后，皮肤DC随后经历表型和功能改变
-抗原的捕获诱导LC和DDC的邀适，然后其获得“激活的”表型。此激活表 型表现为直接涉及DC对T淋巴细胞的激活阈值的共刺激分子CD80和CD86的强表达。 II类MHC (主要组织相容性复合物)分子，尤其是HLA-DR的膜表达也因DC表面抗原 肽的呈递而显著提高。
-LC和DDC的激活还与DC在皮肤外和在淋巴结的方向迁移所必需的CCR7受体表达的获得相关。
-在其迁移过程中，LC和DDC经历成熟过程和获得“成熟的”DC表型。淋 巴细胞的致敏和免疫的建立所必需的此成熟状态表现为CD83和DC-LAMP标记的表达和 分泌细胞因子的能力。
发明目的
本发明的主要目的是提供能够提高个体的免疫细胞，尤其是皮肤和/或黏膜免 疫细胞的激活阈值的活性成分。这导致皮肤和/或黏膜敏感性和/或皮肤和/或黏膜反 应性的降低，和/或皮肤和/或黏膜耐受性的提高。因此，这在化妆品或药物，尤其是 皮肤病学治疗和/或护理的背景中具有不可否认的益处。
本发明的目的还提供用于筛选具有上文所述活性的物质的筛选模型，其考虑皮 肤DC的两个群体(LC和DDC)的应答。
发明详述
本发明涉及选自Phoradendron piperoides 植物提取物、Cestrumlatifolium 植物 提取物、千日菊(Spilanthesoleracea)植物提取物、Maprounea guyanensis植物提取物、 一叶嶮碱(securinine)、单叶芸香定丙酮化合物(foliosidine acetonide)、8-氧代假棕榈碱 (8-oxopseudopalmatine)或其任意组合的至少一种活性成分作为用于提高个体免疫细胞的激活阈值的活性剂在制备化妆品组合物中，或在制备优选预期用于提高个体免疫应答的 激活阈值的药物组合物，尤其是皮肤病学组合物中的用途。这种活性成分有利地使得可 能降低个体的至少部分皮肤和/或黏膜的敏感性和/或反应性。
本发明人通过术语“降低”指至少部分地降低和/或限制个体的至少部分皮肤 和/或黏膜的反应性。
有利地，活性成分降低和/或预防皮肤和/或黏膜免疫反应。
有利地，活性成分降低和/或抑制至少一类免疫细胞尤其是树突细胞的活性。
有利地，活性成分降低至少表皮朗格汉斯细胞(LC)和/或真皮树突细胞(DDC) 的活性。
有利地，活性成分与镇静剂组合。
本发明的活性成分具有通过提高免疫细胞尤其是DC的激活阈值来降低免疫应 答的能力。具体而言，本发明的活性成分有利地免疫抑制基本上不同于皮肤炎症途径的 皮肤免疫能力。当前的抗炎产品基本上降低由皮肤角质形成细胞分泌的可溶性促炎因子 (细胞因子、白细胞介素等)的合成能力。本发明的物质靶向完全不同的调节途径，其是 皮肤免疫应答的途径。这些作用方式可以是互补的。
个体免疫细胞的激活阈值，尤其是DC的激活阈值由激活标记，尤其是CD86激 活标记的表达定义。在正常皮肤中，未成熟和未激活的DC具有我们已定义为这些细胞 的激活阈值的CD86的基础表达水平。因此，未成熟和未激活的DC上激活标记表达的 降低，尤其是CD86表达的降低表现为免疫细胞激活阈值的提高。
与单独作用于皮肤免疫应答的间接途径，尤其是作用于皮肤环境，尤其是角质 形成细胞的可溶性免疫介质(细胞因子)的分泌的标准抗炎产品相反，本发明具有靶向皮 肤DC的优势，即靶向免疫应答的优势。
有利地，本发明的活性成分在皮肤中降低至少一类选自下列的标记的表达(i) 由未成熟的树突细胞按基础水平表达的CD86 ； (ii)由激活的树突细胞表达的CD40、 CD54, CD80、HLA DR、CCR7或CD86 ；和(iii)由激活和成熟的树突细胞表达的 CD40、CD54、CD80、HLA DR> CCR7、CD86、CD83 或 DC LAMP，尤其是以降低敏感性皮肤的反应性。
本发明具有在个体需要时(例如在细菌攻击皮肤的过程中、或一般在病原体 剂、高攻击性化学剂和/或异物存在的情况下)提高触发免疫应答的阈值，而同时对随后 的免疫应答具有最小的影响的优势。另一方面，降低皮肤中可溶性促炎介质合成的抗炎 产品不考虑随后的皮肤DC的应答。因此，在使用抗炎产品的标准治疗中，免疫应答被 阻断或至少受损。这明显具有提供经历免疫应答激活剂攻击的个体皮肤弱保护的缺点。
因此，有利地，本发明的活性成分基本上不抑制免疫应答，尤其是不抑制树突 细胞的免疫功能性。
此外，当局部应用后活性成分不再与皮肤接触时，本发明的活性成分允许基础 免疫活性的部分恢复，尤其是树突细胞基础免疫活性的部分恢复。
本发明的活性成分适合用于任意皮肤类型，且尤其适合用于具有敏感、反应和/ 或反应过度的皮肤，和/或由如维生素A酸和/或攻击性物质和/或攻击性条件治疗的攻 击性皮肤病学治疗致使暂时敏感的皮肤的个体的化妆品护理和/或化妆品治疗。
一般，敏感性皮肤定义为不再耐受或几乎不耐受攻击性物质，尤其是环境因素 如污染物、气候因素(风、冷、热)、暴露于UV、情绪因素尤其是压力和/或化学物质 (重金属、去垢剂、包含于化妆品治疗的化合物如香料、防腐剂、醇、pH或AHA、或如 维生素A酸的皮肤病学治疗)和/或攻击性条件尤其是出汗和机械攻击如拔毛、剃须和 摩擦。敏感性皮肤或致使暂时敏感的皮肤不是具有病理特征的皮肤。然而，它可以通过 不雅和/或不适的皮肤和/或黏膜现象如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷紧、发红、可见 鳞片或皮肤增厚与攻击性物质反应。因此，“敏感性皮肤”的特征可以由个体自身用主 观皮肤感觉或由皮肤病学家用客观皮肤反应来估计。
因此，本发明允许控制皮肤DC的激活和/或成熟水平以预防和/或降低敏感性 皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的提高的和/或过度的应答。
根据一个实施变通方案，本发明涵盖活性成分在预防和/或治疗不雅和/或不适 的皮肤和/或黏膜现象中的化妆品用途。因此，本发明的活性成分尤其适合用于化妆品 护理和/或化妆品治疗。它们尤其是允许具有镇静剂和/或抗刺激素和/或保护效应的化 妆品组合物的制备，尤其是针对攻击性物质和/或攻击性条件的化妆品组合物的制备。
因此，取决于相关个体的皮肤和/或黏膜的健康状态(化妆品护理或治疗)或病 理状态(皮肤病学或药学护理或治疗)，本发明涉及两类不同的护理和/或治疗。
根据另一个实施变通方案，本发明涵盖用于药物组合物尤其是皮肤病学组合物 的制备的活性成分，该组合物用于预防和/或治疗由免疫应答的激活引起的病状。
在适合用于局部应用的化妆品载体中包含选自浓度在0.001Wt%和10wt%之间 的Phoradendron piperoides植物提取物、Cestram Iatifolium植物提取物、千日菊植物提取 物、浓度为1X10_7%至的一叶Ji彦碱、单叶芸香定丙酮化合物、8-氧代假棕榈碱和其 任意组合的化妆品组合物也是本发明的主题。
本发明还涉及预期用于提高免疫应答尤其是树突细胞的激活阈值，尤其是用于 预防和/或治疗皮肤和/或黏膜的反应性的药物和/或皮肤病学组合物，该组合物在适 合用于局部应用的药物和/或皮肤病学载体中包含选自Phoradendron piperoides植物提取 物、Cestram Iatifolium植物提取物、千日菊植物提取物、一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化 合物、8-氧代假棕榈碱和其任意组合的活性成分。
本发明还涉及至少一种活性成分在制备预期用于预防和/或治疗刺激或皮肤和/ 或黏膜变态反应尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎和/或遗传过敏性皮炎的药物组合物，尤其 是皮肤病学组合物中的用途。
有利地，本发明的至少一种活性成分用于还包含抗炎剂的药物组合物的制备。
根据一个优选模式，病状是刺激或皮肤和/或黏膜变态反应，尤其是接触性反 应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹，荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应 性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎。荨麻疹尤其是引起皮肤和/或黏膜现象的接触性 荨麻疹和/或饮食性荨麻疹。
优选地，药物和/或皮肤病学组合物预期用于预防和/或治疗刺激或皮肤和/或 黏膜变态反应，尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎。
皮肤和/或黏膜免疫应答的激活表征为至少一类免疫细胞尤其是树突细胞(DC) 的激活，例如表皮朗格汉斯细胞(LC)和/或真皮树突细胞(DDC)的激活。
皮肤DC表征为其特异性标记，LC和DDC分别特异地表达Iangerine和 DC-SIGN。
未成熟的树突细胞由用激活和/或成熟物质尤其是TNF α和/或LPS (脂多糖) 型的激活和/或成熟物质激活前的基础表型状态定义。
“激活的”树突细胞由与用激活和/或成熟物质尤其是TNF α和/或LPS型的 激活和/或成熟物质诱导的状态相当的激活表型状态定义。
激活和/或成熟物质(即提高至少一种DC标记的表达的物质)是DC的危险信 号，其触发免疫应答。此物质是非限制性的。这些物质尤其是使用或应用来提高至少一 种DC标记的表达的化学或生物物质，例如LPS或TNF α、刺激皮肤的参数如气流、污染 物、低于15°C或高于40°C的温度。
本发明尤其涉及哺乳动物，且尤其涉及人。
本发明的活性成分是植物提取物或表征的分子。该提取物有利地产生自选自 Phoradendron piperoides、Cestrum Iatifolium、千日菊、Maprouneaguyanensis 及其任意混合物的植物。优选的表征的分子选自一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化合物和8-氧代假棕榈 碱。任意比例的两种或多种上述活性成分的混合物也被本发明涵盖。根据一个尤其有利 的模式，活性成分是Cestram Iatifolium植物提取物和/或一叶Ji彦碱。
按照本领域中的标准方法获得用于本发明的植物提取物。
取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以和10% (w/w)之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0至0/100 (ν/ν) 的水/醇、水/乙二醇或水/多元醇混合物(如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元醇 类如木糖醇等混合)中。然后优选离心和/或过滤和/或蒸馏所获得的提取物以回收活 性可溶性级分(粗提取物)。
优选将植物提取物溶解于溶剂中，如水、醇、多元醇、乙二醇或其混合物。根 据本发明，优选以相对于组合物重量在0.001_%和10wt%之间、有利地在0.01_%和 5wt %之间和更尤其以Iwt %的浓度使用植物提取物。
可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性物质，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
通过溶解于极性溶剂例如水、乙醇、乙二醇或DMSO中来有利地制备表征的分 子(活性成分)。
根据本发明，优选以相对于组合物总重量在lX10_7Wt%和lwt%之间、有利地 在1\10-5对％和IX IO-1Wt^之间和尤其是IX IO-1Wt^的浓度使用表征的分子。
优选地，组合物是优选局部地应用的化妆品或药物组合物，尤其是皮肤病学组 合物。
例如，在最终化妆品制剂中活性成分0.5%至10%的比率和每平方厘米皮肤Img 完成的化妆品产品的应用比率下，每平方厘米皮肤应用的活性成分的量有利地在io_13g和 10-12g表征的分子之间和在10_5g和IO4g植物来源的活性成分(溶剂中0.001Wt%和10wt% 之间的植物提取物)之间。
优选以化妆品或药物组合物且优选皮肤病学组合物的形式使用本发明的化合 物。
组合物可以包含可选地与其他目的化合物组合的任意适合的溶剂和/或任意适 合的载体和/或任意适合的赋形剂。
结果，对于这些化合物，赋形剂包含例如至少一种选自以下的化合物防 腐剂、润滑剂、乳化剂、表面活性剂、湿润剂、增稠剂、调节剂、控油剂(mattifying agent),稳定剂、抗氧化剂、组织形成剂(texturing iigent)、光泽剂、成膜剂、增溶 剂、色素、染料、香料和遮光剂。这些赋形剂优选选自氨基酸及其衍生物、聚甘油、 酯类、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂类、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、 基于蔗糖的稳定剂、维生素E及其衍生物、天然和合成蜡、植物油、甘油三酯、不皂 化材料、植物留醇、植物酯、聚硅氧烷及其衍生物、蛋白质水解物、霍霍巴油(jojoba oil)及其衍生物、脂/水溶性酯、甜菜碱、氧化胺、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、 甘氨酸和对羟基苯甲酸类，更优选选自丁二醇、硬脂醇聚醚-2(Steareth-2)、硬脂醇聚 醚-21(steareth-21)、乙二醇-15硬脂醚、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、苯氧乙醇、对羟 基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、 天然生育酚、甘油、二羟十六烷基磷酸钠(dihydroxycetyl sodium phosphate)、异丙基羟 十六醚(isopropyl hydroxycetyl ether)、硬脂酸乙二醇酯、三异壬精(triisononanoin)、椰 油酸辛酯(octyl cocoate)、聚丙烯酰胺、异链烷烃、聚乙二醇单十二醚_7 (laureth_7)、卡 波姆(carbomer)、丙二醇、丙三醇、红没药醇、二甲基硅氧烷、氢氧化钠、PEG-30 二聚 羟基硬脂酸酯、癸酸/辛酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇辛酸酯(cetearyl octanoate)、己二酸二 丁酯、葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、EDTA、环甲基硅氧烷、黄原胶、柠檬酸、十二 烷基硫酸钠、石蜡和矿物油、异硬脂醇异硬脂酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸 酯、PEG-8、蜂蜡、氢化棕榈仁油甘油酯、氢化棕榈油甘油酯、羊毛脂油、芝麻油、乳 酸十六酯、羊毛脂醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙烯和等渗盐溶液。
有利地，以选自以下的形式配制上述组合物水性或油性溶液、水性凝胶或霜 剂或油性凝胶，尤其是在瓶或管中，尤其是沐浴凝胶或洗发剂；乳；乳状液、微乳或纳 乳(nanoemulsion)，尤其是基于水包油或油包水或多重或聚硅氧烷；洗剂，尤其是在玻 璃瓶、塑料瓶或剂量计量瓶中或作为气溶胶；安瓿剂；液体皂；皮肤病学条；软膏剂； 摩丝；无水产品，其优选是液体、糊剂或固体，例如棒的形式，尤其是唇膏或片剂的形 式；凝胶胶囊；糖浆；颗粒体；粉末。
本文所用的术语“局部应用”指将本发明的组合物应用于皮肤和/或黏膜表 面，尤其是通过直接应用或通过蒸发应用于皮肤和/或黏膜表面。
本发明还涵盖口服施用，尤其是保健品应用。
本文所用的术语“适合的化妆品或皮肤病学载体”指该组合物或其成分适合用 于与人皮肤接触使用而不具有任意过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答或其 等同物。
本领域技术人员已知许多用于改善皮肤的健康和/或物理状态的化妆品活性成 分。本领域技术人员知道如何配制化妆品和/或皮肤病学组合物以获得最佳效应。此 外，当将它们彼此组合时，本发明中所描述的化合物可以具有协同效应。这些组合也包含于本发明。The CTFA CosmeticIngredient Handbook，第二版(1992)描述了尤其适合用 于局部使用的通常用于化妆品和药物工业的多种化妆品和药物成分。这些类型的活性成 分的实例包含但不限于以下化合物研磨剂、吸收剂、用于美容目的的化合物如香料、 色素、染料、精油、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸 薄荷酯、hamelis馏出物)、防痤疮剂、防絮凝剂、防沫剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲 酸碘丙酯)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、溶胀剂、螯合剂、添加剂、杀 虫剂、变性剂、增稠剂、和维生素及其衍生物或等同物、成膜材料、聚合物、遮光剂、 pH调节剂、还原剂、消色剂或浅色剂(lighting iigent)(例如氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏 血酸磷酸酯镁或抗坏血酸葡糖胺)和调节剂(例如湿润剂)。
具体而言，为了尽可能充分地改善皮肤的敏感性状态，根据本发明将本发明的 活性成分与选自已知其特性的表征的分子和植物提取物的一种或多种其他活性剂组合尤 其有利
-神经化妆品，
-外用止痛药，
-皮肤镇静剂，尤其是PLA2抑制剂、细菌来源的外泌多糖，尤其是化妆品镇 静剂如描述于专利EP 0987010中的欧洲七叶树(Aesculushippocastanum)提取物(CAS 8053392)、交替单孢菌属(Alteromonas)发酵提取物、描述于专利FR2847267中并被申请 人以Inhipase 的名称推向市场的活性成分尤其是野葛(Pueraria lobata)根提取物。
-创伤愈合剂，如泛醇及其衍生物例如乙基泛醇、芦荟(Aloevera)、泛酸及其衍 生物、尿囊素、红没药醇和甘草酸二钾。
-抗炎剂，如类固醇和非类固醇抗炎药，尤其是细胞因子和趋化因子、环加氧 酶、氧化氮(NO)和NOS氧化氮合酶的产生的抑制剂。可以提及的抗炎产品的实例包含 银杏(Gingkobiloba)提取物、三内酯萜类(trilactoneterpenes)如银杏苦内酯(gingkolide)， 尤其是已知其对血小板活化因子(PAF)的拮抗特性的银杏苦内酯B和白果内酯。
-弹性蛋白酶抑制剂，如Haslea ostrearia提取物，例如由申请人推向市场的Blue algae extract 。
-保湿和/或抗炎剂，如Palmariapalmate提取物，例如由申请人推向市场的Sea Parsley 产品。
本发明还涉及包含与其他活性成分组合的本发明的活性成分的化妆品组合物， 已知该其他活性成分用于敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应和/或反应过度的皮肤的化 妆品护理和/或治疗。
本发明涵盖药物治疗方法，其包括尤其是通过局部应用对有需要的个体施用用 于上文所列的多种治疗的活性剂。
本发明还涉及用于筛选这些活性成分的方法。
根据一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和/或黏膜树突细胞免 疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括
⑴制备包含未成熟或未激活的树突细胞(DC)的培养基；
( )将包含DC的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质接触；
(iii)回收DC以定量DC激活标记的表达；
(iv)相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的DC激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质接触的DC的激活标记表达值，以选择提高皮肤和/或黏膜 树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。
根据另一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和/或黏膜树突细胞 免疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括
⑴制备包含未成熟或未激活的树突细胞(DC)的培养基；
( )将包含DC的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质和已知用于通过提高至少一种DC标记的表达来激活免疫应答 的至少一种物质接触；
(iii)回收DC以定量用待筛选物质或活性成分处理和用所述物质刺激后DC激活 标记的表达；
(iv)相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的DC激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质和所述物质接触的DC的激活标记表达值，以选择在所述物 质存在的情况下提高皮肤和/或黏膜树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。
用于提高至少一种DC标记的表达的物质可以是已知用于刺激免疫细胞的应答的 物质，如LPS禾口 TNF α的混合物。
有利地，该方法还包括
(iiib)将步骤(iii)中回收的一些DC再培养足以使这些细胞恢复其基础激活水平 的时间，所述培养基不包含待筛选的任意活性成分或物质；
(ivb)步骤(iiib)之后定量DC激活标记的表达，以选择提高皮肤树突细胞免疫应 答的激活阈值和允许步骤(iiib)之后激活免疫应答的活性成分。待针对其提高皮肤树突 细胞免疫应答的激活阈值的能力筛选的物质是例如希望定量其抑制DC激活标记表达的能 力的植物来源的物质或表征的分子的物质。
表征的分子是已知其化学结构的分子。
DC 激活标记优选选自 CD40、CD54, CD80、CD86、HLA-DR、CCR7，其是 ΜΙΡ-3 β (巨噬细胞炎性蛋白-3 β)趋化因子受体。
DC成熟标记优选选自CD83和DC LAMP。
可以使用任意方法来定量DC激活标记的表达。可以有利地使用RT-PCR尤其 是定量RT-PCR或流式细胞术或ELISA的方法。
因此DC激活标记的表达涉及DC激活标记的蛋白质表达和DC激活标记的基因 表达(mRNA) 二者。
用阳性对照和阴性对照来进行相对于对照的用于选择活性成分的DC激活标记表 达值的比较，优选该阳性对照和阴性对照是激活和/或成熟剂例如LPS/TNFa混合物和 免疫抑制剂例如地塞米松。
有利地，当其使得可能按照该筛选方法获得LC或DDC所表达的CD86的蛋白 质表达低于或等于有或无由LPS 50μ g/mL和TNFci lOng/mL组成的激活剂存在的情况下 LC或DDC所表达的CD86蛋白质表达的95%且优选低于70%，和/或LC或DDC所表 达的CD86的基因表达低于或等于有或无由LPS 50 μ g/mL和TNF α 10ng/mL组成的激活剂存在的情况下LC或DDC所表达的CD86基因表达的95%且优选低于75%时，认为所 筛选的物质是活性成分或活性物质。
根据其他实施方案，本发明涉及本发明的活性成分与刺激剂或潜在的刺激剂组 合的局部用途，优选非治疗性用途。
本发明还涉及预期与皮肤和/或黏膜接触的包含本发明的活性成分和刺激剂的 组合物。刺激剂可以是例如去垢剂，接触攻击剂，防腐剂尤其是乙二醇衍生物尤其是 戊二醇衍生物，化妆品刺激剂如AHA尤其是乙醇酸、乳酸及其衍生物，如视黄醇及类 视黄醇衍生物，尤其是视黄醛、视黄酸，如水杨酸，和/或与在限制条件下允许的EEC Directive 76/768中所列的一种或几种成分组合于化妆品组合物中，尤其是AraiKc 3中所列 的成分。
根据其他实施方案，本发明的活性成分可以用于日常化妆品护理组合物。因此 本发明涉及化妆品护理和/或治疗方法，其中至少一种本发明的活性成分优选Cestrum Iatifolium提取物可能与化妆品刺激剂组合每天以有效剂量在皮肤和/或黏膜上应用。
通过阅读参考了实施例的解释性描述，本发明的其他目的、特征和优势将清楚 地呈现给本领域技术人员，所述实施例是为了纯说明性目的而给出，不应以任意方式认 为其限制本发明的范围。
实施例形成本发明的整体部分，来自其(包含实施例)的整体中取出的描述的任 意相对于现有技术表现为新颖的特征以其功能和其一般性形成本发明的整体部分。
因此，每一实施例具有一般范围。
此外，在实施例中，除非另作指定，所有百分数以重量计，除非另作指定，温 度表示为摄氏度数，除非另作指定，压力是大气压。实施例
实施例1 皮肤树突细胞LC和DDC的制备
在两个连续步骤中进行从血单核细胞制备LC和DDC的方法。
步骤1 从循环外周血分离单核细胞的方法
在有抗凝剂优选肝素锂存在的情况下收集一个或多个人供体的循环静脉外周血。
可以有利地按照以下流程进行单核细胞从循环血的分离
1/在淋巴细胞分离培养基上离心血液后，回收单核细胞，然后
-或者用抗体混合物例如偶联至磁珠的抗-CD3、抗-CD7、抗-CD16、抗 CD19、抗CD56、抗CD123、抗-血型糖蛋白A抗体标记。穿过磁化柱后，仅洗脱和回 收未标记的单核细胞。
-或者用对单核细胞特异的抗体，如偶联至磁珠的抗-CD14抗体标记。穿过磁 化柱后，仅标记的单核细胞滞留在柱中。洗脱柱后，回收标记的单核细胞。
-或者用对单核细胞特异的抗体如偶联至荧光染料如澡红蛋白的抗-CD16抗体 标记。通过流式细胞术分选细胞后，仅回收标记的单核细胞。
2/通过进行本领域技术人员公知的任意物理分离方法，尤其是通过沉淀或离心 回收单核细胞，并在不为随后的培养进一步加工的情况下洗脱。
3/每IOOmL所收集的血液的提取收率是约150兆(million) (士 20兆)单核细胞，从其中获得至多40兆单核细胞。
步骤2:冻存来自循环外周血的单核细胞的方法
可以有利地在-80°C至_196°C，优选在液氮中于_196°C、以约10兆/mL的比 率、在适合的冻存培养基例如由90%胎牛血清和10% DMSO(二甲基亚砜)组成的培养 基中冻存步骤1中获得的单核细胞。
该冻存步骤有利地允许供体库例如3个单核细胞供体的细胞混合物的制备。
步骤3 培养分离的单核细胞以获得未成熟的LC和DDC的方法
按约1兆/mL的比率在确定或不确定的培养基中培养(37°C、5% C02)步骤1 和/或2中获得的单核细胞，优选在补充10%胎牛血清并包含以下三种细胞因子的RPMI 1640培养基中GM-CSF (粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，比率为200ng/mL)、比率为 10ng/mL的TGF β 1 (转化生长因子β 1)和比率为10ng/mL的IL-13 (白细胞介素13)。
在培养的第6天，未成熟的LC和DDC同时产生，且在表型上和功能上非常类 似于其体内相应物
-体外产生的树突细胞的至多40%在胞内表达langerine，至多60%表达 DC-SIGN。
-体外产生的LC和DDC是未成熟的，因为它们按基础水平表达共刺激分子 CD80和D86，且不表达成熟分子CD83和DC-LAMP。
-用TNFα (有利地为10ng/mL)和LPS (有利地为50 μ g/mL)刺激48小时后， 如由分子CD80和CD86表达的提高和由成熟标记CD83和DOLAMP表达的获得所表 明，LC和DDC获得激活和成熟的DC的表型。
步骤4 培养分离的单核细胞以获得激活的LC和DDC的方法
按实施例1和步骤3中所述，但在存在以下三种细胞因子的情况下培养细胞比 率为 200ng/mL 的 GB-CSF、比率为 10ng/mL 的 TGF β 1 和比率为 10ng/mL 的 TNF α。
孵育M小时后，激活的LC和DDC同时产生，且在表型上和功能上非常类似于 其体内相应物。
-LC和DDC显示以下分子的强表达HLA-DR，其是II类MHC分子；CD80和 CD86,其是共刺激分子；和CCR7，其是迁移受体。
-LC和DDC还显示应答趋化因子ΜΙΡ-3 β的高迁移能力。
实施例2 =化妆品活件成分的制备
活性成分具有不同的来源(例如植物来源或表征的分子)。
取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以和10% (w/w)之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，且有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0至0/100 (ν/ ν)的水/醇、水/乙二醇或水/多元醇混合物(如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元 醇类如木糖醇等混合)中。然后优选离心和/或过滤和/或蒸馏所获得的提取物以回收 活性可溶性级分(粗提取物)。活性物质有利地是在溶剂如水、醇、多元醇、乙二醇或其 混合物中且优选在水中的植物提取物。优选在0.001%和10% (ν/ν)之间，有利地是粗提 取物的重量相对于活性成分的总重量在0.01%和5%之间和更尤其是lwt%的浓度将溶解在溶剂中的粗提取物(活性成分)用来进行测试。可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性成 分，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
通过溶解在溶剂例如水、乙醇、乙二醇中或优选溶解在DMSO中制备表征的分 子，并优选在间，有利地在IXlO-1Wt^,且尤其是 在1 X IO-1WtVo的活性成分浓度测试。
实施例3 =用于筛诜化妆品活件成分的樽型
在按照实施例1获得的LC/DDC上测试活性成分。当在实施例1的步骤3中获 得的“未成熟的” LC/DDC上测试活性成分时，这称为预防性护理。当在实施例1的步 骤4中获得的“激活的” LC/DDC上测试活性成分时，这称为治疗性护理。
例如按400000细胞/cm2的比率，在确定或不确定的培养基中，优选在补充10% 胎牛血清和包含以下两种细胞因子的RPMI 1640培养基中将细胞接种至M孔板内比率 为200ng/mL的GM-CSF和比率为lOng/mL的TGF β 1。然后将活性成分加至所述培养 基并用以下终浓度测试
-对于植物提取物，活性成分相对于培养基的总重量在0.001%和10%(ν/ν)之 间，有利地在间和尤其是在lwt% ；
-对于表征的分子，表征的分子(或化学分子)相对于培养基的总重量在 1X10—7%和(ν/ν)之间，有利地在1\10-5_%和IXlO-1Wt^i之间，且尤其是在 IX KT1Wt^。
于37°C在5% C02下在所述培养基中孵育活性成分至多48小时且有利地孵育M 小时。
阴性对照是仅培养基，或包含浓度与所测试的活性剂的浓度相等的提取所测试 的提取物的过程中使用的溶剂的培养基，或包含主要的抗炎糖皮质激素地塞米松(10_8M) 的培养基。用来诱导LC/DDC激活的参考阳性对照是LPS (有利地在50 μ g/mL)和 TNFa (有利地在10ng/mL)的混合物。
^MM 4 所诛雇的H有免疫抑泡丨布丨能力 射舌+牛成分
我们选择了 3种表征的分子(一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化合物、8-氧代假 棕榈碱)以及 4 种植物提取物(Cestram Iatifolium> Phoradendron piperoides、Maprounea guyanensis和千日菊)，其分别表示在表1和2中。
权利要求
1.至少一种活性成分作为用于提高个体免疫细胞激活阈值的活性剂在化妆品组合物 中的用途；或在制备优选预期用于提高个体免疫细胞激活阈值的药物组合物，尤其是 皮肤病学组合物中的用途，所述至少一种活性成分选自Cestram Iatifolium植物提取物、 Phoradendron piperoides植物提取物、千日菊植物提取物、Maprounea guyanensis植物提取 物、一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化合物、8-氧代假棕榈碱或其任意组合。
2.权利要求1的至少一种活性成分的用途，其用于降低和/或预防皮肤和/或黏膜免 疫反应。
3.权利要求1的至少一种活性成分的用途，其用于降低和/或抑制至少一种类型的免 疫细胞，尤其是树突细胞的活性。
4.权利要求1的至少一种活性成分的用途，其用于降低至少表皮朗格汉斯细胞(LC) 和/或真皮树突细胞(DDC)的活性。
5.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其与镇静剂组合。
6.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其特征在于所述植物提取物 的量为所述组合物的0.001_%和10wt%之间，优选0.01_%和5wt%之间。
7.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其特征在于一叶嶮碱、单叶 芸香定丙酮化合物和/或8-氧代假棕榈碱的量相对于所述组合物的总重量在1 X 10-7wt% 和lwt%之间，有利地在lX10_5wt%iP lX10_\vt%之间。
8.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其特征在于所述活性成分是 Cestrum Iatifolium植物提取物和/或一叶嶮碱。
9.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其用于降低选自以下的至少 一种类型的标记在皮肤中的表达G)由未成熟的树突细胞按基础水平表达的CD86; (ii) 由激活的树突细胞表达的CD40、CD54、CD80、HLA-DR、CCR7或CD86 ；和(iii)由 激活和成熟的树突细胞表达的CD40、CD54, CD80、HLA-DR、CCR7、CD86、CD83 或 DC-LAMP。
10.前述权利要求中任一项的至少一种活性成分的用途，其用于护理和/或治疗敏 感、反应和/或反应过度的皮肤的化妆方法。
11.至少一种活性成分在用于降低和/或预防不雅和/或不适现象，尤其是蛰刺、 灼烧感觉、瘙痒感觉、绷紧、可见鳞片和皮肤增厚的化妆品护理和/或治疗方法中的用 途，所述至少一种活性成分选自Cestram Iatifolium植物提取物、Phoradendronpiperoides 植物提取物、千日菊植物提取物、Maprounea guyanensis植物提取物、一叶嶮碱、单叶芸 香定丙酮化合物、8-氧代假棕榈碱或其任意组合。
12.权利要求1至10中任一项的至少一种活性成分的用途，其用于预防和/或治疗刺 激，或皮肤和/或黏膜变态反应尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿 疹、荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎的 药物组合物，尤其是皮肤病学组合物的制备。
13.权利要求12的至少一种活性成分的用途，其用于还包含抗炎剂的药物组合物的制备。
14.化妆品组合物，其在适合局部应用的化妆品载体中包含活性成分，所述活性成 分选自浓度在0.00 Iwt %和1 Owt %之间的Cestrum Iatifolium植物提取物、Phoradendronpiperoides植物提取物、千日菊植物提取物；浓度从1X 10_7(%至1 %的一叶Ji彦碱；单叶芸 香定丙酮化合物；8-氧代假棕榈碱及其任意组合。
15.药物和/或皮肤病学组合物，其用于提高树突细胞的免疫应答的激活阈值，尤其 用于预防和/或治疗由皮肤和/或黏膜的免疫应答引起的病状，其在适合局部应用的药物 和/或皮肤病学载体中包含活性成分，所述活性成分选自Phoradendron piperoides植物提 取物、Cestrum Iatifolium植物提取物、千日菊植物提取物、一叶嶮碱、单叶芸香定丙酮化 合物、8-氧代假棕榈碱及其任意组合。
16.权利要求15的药物和/或皮肤病学组合物，其特征在于其预期用于治疗刺激， 或皮肤，和/或黏膜变态反应，尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿 疹、荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和/或遗传过敏性皮炎。
全文摘要
本发明涉及作为活性成分提高免疫细胞的激活阈值的活性物质在制备化妆品或药物组合物，尤其是皮肤病学组合物中的用途。本发明还涉及用于筛选此类活性物质的方法。
文档编号A61P17/00GK102026616SQ200980117229
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月16日 优先权日2008年3月14日
发明者N·贝舍图瓦耶, V·安德烈 申请人:巴斯夫美容护理法国公司
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