用于诱导移植耐受的干细胞组合物的制作方法
专利名称：用于诱导移植耐受的干细胞组合物的制作方法
技术领域：
本发明基本上涉及一种从脂肪组织中获得间充质干细胞(MSC)的新方法及其与 来源于骨髓和外周血的造血干细胞和间充质干细胞相组合而用于产生“移植耐受”(即不使 用/尽可能少地使用免疫抑制药物进行移植)的用途。
背景技术：
移植已成为因器官衰竭而垂危的患者的可行治疗方式。遗憾的是，所有这些患者 都必须终身接受免疫抑制药物治疗。寻找器官供体、支付其费用和术后护理的这整个过程 不仅让人在情感上疲惫不堪，而且费用对于普通印度家庭来说也无法承受。即使他们能够 渡过所有这些难关，感染和/或恶性肿瘤形式的并发症也经常使患者失去移植器官和生 命。这些问题的唯一合理答案是不使用/尽可能少地使用免疫抑制药物进行移植(耐受)。因此我们在1998年8月认真开始着手我们对耐受的研究。我们研究的主要课题 是在器官移植前对受者进行供体干细胞移植。成功的干细胞移植将保护移植器官免受排斥 而无需任何免疫抑制药物。我们继续调整我们的耐受研究方案，直到产生了一个安全有效 的方案。50年来，包括Peter Medawar爵士(诺贝尔奖获得者)在内的众多医学家在不同 的动物模型中研究“耐受”课题。这些课题中没有一个能够成功转移到人模型上，因为人的 免疫生物学情况要比动物复杂得多，因此很难在人中完成相同的工作。我们高兴地在此声 明，我们(IKDRC-ITS的Ahmedabad课题组)已经有超过1000名患者在最低免疫抑制条件 下跨越MHC屏障进行了移植(即不需要考虑与供体的遗传相容性和免疫匹配)(称为近似 耐受(prope tolerance))。他们中的大部分已没有任何问题地获得了稳定充分的移植物功 能，并且他们中的一些已经过上了正常生活而无需任何免疫抑制药物。这项研究的主要优 点是使因器官衰竭而垂危的患者获得新生，而且只需极少的花费。但是我们无法获得可再 现的结果。问题在于无法得到足够数量的MSC以改善造血干细胞(HSC)移植并因此产生更 好的耐受。我们发现脂肪组织是获得充足数量MSC的便利来源。因此我们调整了我们的研 究，并开发了从器官供体脂肪组织中分离MSC的自有技术。发明目的和
发明内容
本发明的主要目的是为可常规用于产生移植“耐受”的只能得自供体的间充质干 细胞(MSC)找到充分的替代性来源。本发明的另外一个目的是开发一种从选定来源中分离 和分化MSC的实用方便的方法。本发明的另外一个目的是提供一种不同干细胞的组合物以 及实现最期望和一致结果的患者给药方法。本发明首次描述了脂肪组织源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干细胞 (PBSC)的新组合物，其能帮助产生移植耐受(以极低剂量的免疫抑制药物达到稳定充分的 同种异体移植物功能且排斥反应极低/没有排斥反应)。这些细胞使用我们自有的网膜静脉套管插入(omental veincanulation)技术通 过小切口开腹术移植到门脉循环中。这些细胞在非清髓最小条件下移植到受者中，其中使用供体特异性白细胞输注、针对受者的抗T细胞和抗B细胞抗体，并在移植干细胞前对受者 的膈下淋巴结、部分骨盆和臀部骨骼及胸腰椎进行1000CGY的靶标特异性照射。这是首次不使用任何异种材料就在体外从人脂肪组织中产生间充质干细胞MSC。 之前有通过使用异种材料从胚胎干细胞或者脐带血或骨髓(BM)产生MSC的报道。然而从 未有过不使用异种遗传材料而产生MSC。发明详述 在我们连续的研究中，我们观察到MSC改善了 HSC移植，并且脂肪组织是MSC的良 好的、容易获得的可利用来源。除了脂肪组织，MSC不能从其他任何来源中大量获得。我们开发了从器官供体的脂肪组织分离和培养MSC的新技术。我们成功地用一个 独特的干细胞组合(即脂肪组织源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干细胞(PBSC)) 来产生移植耐受。耐受与移植骨髓中约10%的HSC相关。PBSC是T淋巴细胞的丰富来源， 后者也是干细胞移植所必需的。MSC的角色是HSC的老大哥。它们发挥脚手架的作用，协助 HSC在器官之间的趋化运输。根据国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会的规定，MSC在标准培养条件 下维持时必须具备塑料粘附性，它们必须显示出朝向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的分 化潜能，它们必须阳性表达⑶90、⑶73和⑶105标志物，同时它们必须不表达造血细胞谱系 的标志物，包括⑶45、⑶；34、⑶14、⑶lib、⑶四、HLA-DR、c_kit。我们的细胞系符合上述标准。脂肪组织源性MSC (hAD-MSC)的作用是剂量依赖性的，细胞植入时需要 hAD-MSC HSC的比例为1 20，该比例越高，植入效果越好。我们的结果证实了这些实验
室结论。之前通过不同策略使用药物和造血干细胞诱导移植耐受的尝试都是不成功的。这 是用独特干细胞组合实现移植耐受的首次成功尝试。这些细胞使用我们自有的网膜静脉套管插入术技术通过小切口开腹术移植到门 脉循环中。这些细胞在非清髓最小条件下移植到受者中，其中使用供体特异性白细胞输注、 针对受者的抗T细胞和抗B细胞抗体，并在移植干细胞前对受者的膈下淋巴结、部分骨盆和 臀部骨骼及胸腰椎进行1000CGY的靶标特异性照射。因此，该脂肪组织源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干细胞PBSC的独特组 合物是在上述条件(抗T/B细胞抗体和靶标特异性照射)产生移植相关的移植耐受所必需 的。开发T IUTfe术并用于从H旨Ife組iR中IBr集禾时吝养MSC细朐,。技术从脂肪组织收集后分离MSC 在获得知情同意后，在局部麻醉下，在供体脐下左侧做小切口，然后从腹前壁切除 1.5克脂肪组织。确保止血后缝合。将该脂肪组织收集在下述培养基中1. 20ml α -MEM2. 5ml，20%人白蛋白
3. 20 μ 1，青霉素(200000 单位 /ml)4. 20 μ 1，链霉素(200000 单位 /ml)5. 10 μ 1，头孢噻月亏(lgm/5ml)6· 10μ 1，氟康唑，100mg/dl。用刀将脂肪组织切成碎末。然后将其转移到每IOml中加入IOmg I型胶原酶的上 述培养基中。然后放置在35RPM的摇床上37°C孵育1小时进行消化。将在培养皿中处理的 全部培养基内含物转移到15ml离心管中，780RPM离心8分钟。将上清液和沉淀用上述培 养基分别培养在IOOcm2和25cm2细胞+培养皿(Sarsted，USA)中，在37°C、5% CO2下培养 8天。将细胞传代3次(每隔一天更换培养基)，在第3次传代结束时，用IN磷酸盐缓冲液 (PBS)清洗，再通过胰酶消化(0. 25%胰蛋白酶EDTA溶液，用0. 25%胰蛋白酶和0. 2% EDTA 钠盐粉末制成，HiMedia, India)收集细胞。检查所收集细胞的活性、无菌性和细胞计数并进行流式细胞术分析。进行 ⑶45 (Per CP)阴性和⑶90 (PE)阳性测试。将这些细胞与培养的骨髓和外周血干细胞PBSC 混合，将全部内含物输注到门脉循环中。发明结果以下为患者详细信息用MSC+BMSC+PBSC讲行肾移棺的患者总数60年龄33.5 (范围8-59)岁性别男性女性49 11供体年龄46. 4 (范围:20-67)岁HLA 匹配0/6 2，1/6 11，2/6 10，3/6 28，4/6 5，5/6 2，6/6 2所输注干细胞的信息BM CD34+平均倌0. 23 (范围0· 01-4. 01)(标准差-0. 37)CD45-/90+ 平均倌BM 0. 42 (范围0. 02-0. 84)(标准差-0. 23)BM+MSC 21. 67 (范围3· 06-63. 73)(标准差 MSC-18. 3)(这些在 PBSC 中不存在)MSC+BM CD45-/73+平均倌(在单独的BM中没有发现)6. 39 (范围0. 1-23. 82)(标准差 6. 37)随访情况天数99.86(19-184)血清肌酸酐(mg%) :1.27 (0. 63-2. 3)(标准差0. 32)嵌合性用荧光原位杂交(FISH)检测:7.2% (范围5_14· 7% )CD3dim(天然抑制细胞):2.92% (范围1. 47-5. 14% )(标准差1. 33)CD 19+:0. 33(范围0· 01-1. 53% )(标准差0· 47)CD 25+ 0. 49(范围0· 21-1. 06% )(标准差0· 26)
权利要求
1.用于在接受移植的患者中产生移植耐受的组合物，其包含从合适供体获得的人脂肪 组织源性间充质干细胞(MSC)、骨髓源性间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)以及外周 血干细胞(PBSC-HSC)。
2.权利要求1的组合物，其中细胞植入所需的人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC)与 造血干细胞(HSC)的优选比例为1 20或更高。
3.权利要求1或2的组合物，其用于施用给接受肾移植的患者。
4.权利要求1、2和3的组合物，其用于施用给患者，优选通过输注经门脉循环施用。
5.用于在接受移植的患者中产生“移植耐受”的方法，其通过施用、优选输注有效浓度 的组合物来实现，该组合物包含从合适供体获得的人脂肪组织源性间充质干细胞(MSC)、骨 髓源性间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)以及外周血干细胞(PBSC)。
6.权利要求5的治疗方法，其中细胞植入所需的人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC) 与造血干细胞(HSC)的优选比例为1 20或更高。
7.权利要求5和6的方法，其中患者接受的移植类型为肾移植。
8.权利要求1的组合物，其中所述人脂肪组织源性间充质干细胞(MSC)是通过基本无 需异种材料的方法分离的，所述方法包括以下步骤a)从供体的腹前壁切除约1.5克脂肪组织，b)将脂肪组织收集在含有MEM、人白蛋白、抗生素和至少一种抗真菌剂的培养基中，c)将脂肪组织切成碎末，并且将其转移到含有I型胶原酶的步骤b所述培养基中，d)在摇床上孵育和消化约1小时，e)将以上从培养皿中转移到离心管中进行离心，f)将上清液和沉淀分别在37°C、5%CO2的条件下培养在培养皿中的上述培养基中，优 选培养8天，g)将细胞传代3次，每隔一天更换培养基，h)用合适缓冲液清洗后通过胰酶消化收集上述细胞，i)收集细胞并检查活性、无菌性和数目，并进行流式细胞术分析，CD45、CD90测试。
全文摘要
本发明提供一种简单、经济但高效的方法，其能在器官移植患者体内产生移植物耐受，而无需持续使用昂贵的有严重副作用的免疫抑制药物。本发明基本上涉及对患者施用新组合物，所述组合物由脂肪组织源性间充质干细胞(MSC)与骨髓源性造血干细胞(HSC)和MSC以及外周血干细胞(PBSC)组合而成。这有助于产生移植物耐受，即通过极低量的免疫抑制药物产生稳定充分的同种异体移植物功能而使排斥反应尽可能低/不发生。本发明还涉及一种无需任何任何异种材料而从人脂肪组织中分离间充质干细胞的简单方法。
文档编号A61K35/14GK102065871SQ200980117407
公开日2011年5月18日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月15日
发明者H·L·特里维迪, 阿鲁娜·瓦尼卡 申请人:H·L·特里维迪博士移植科学研究所, Smt.G.R.多斯及Smt.K M玛塔肾病研究所及研究中心
技术领域：
本发明基本上涉及一种从脂肪组织中获得间充质干细胞(MSC)的新方法及其与 来源于骨髓和外周血的造血干细胞和间充质干细胞相组合而用于产生“移植耐受”(即不使 用/尽可能少地使用免疫抑制药物进行移植)的用途。
背景技术：
移植已成为因器官衰竭而垂危的患者的可行治疗方式。遗憾的是，所有这些患者 都必须终身接受免疫抑制药物治疗。寻找器官供体、支付其费用和术后护理的这整个过程 不仅让人在情感上疲惫不堪，而且费用对于普通印度家庭来说也无法承受。即使他们能够 渡过所有这些难关，感染和/或恶性肿瘤形式的并发症也经常使患者失去移植器官和生 命。这些问题的唯一合理答案是不使用/尽可能少地使用免疫抑制药物进行移植(耐受)。因此我们在1998年8月认真开始着手我们对耐受的研究。我们研究的主要课题 是在器官移植前对受者进行供体干细胞移植。成功的干细胞移植将保护移植器官免受排斥 而无需任何免疫抑制药物。我们继续调整我们的耐受研究方案，直到产生了一个安全有效 的方案。50年来，包括Peter Medawar爵士(诺贝尔奖获得者)在内的众多医学家在不同 的动物模型中研究“耐受”课题。这些课题中没有一个能够成功转移到人模型上，因为人的 免疫生物学情况要比动物复杂得多，因此很难在人中完成相同的工作。我们高兴地在此声 明，我们(IKDRC-ITS的Ahmedabad课题组)已经有超过1000名患者在最低免疫抑制条件 下跨越MHC屏障进行了移植(即不需要考虑与供体的遗传相容性和免疫匹配)(称为近似 耐受(prope tolerance))。他们中的大部分已没有任何问题地获得了稳定充分的移植物功 能，并且他们中的一些已经过上了正常生活而无需任何免疫抑制药物。这项研究的主要优 点是使因器官衰竭而垂危的患者获得新生，而且只需极少的花费。但是我们无法获得可再 现的结果。问题在于无法得到足够数量的MSC以改善造血干细胞(HSC)移植并因此产生更 好的耐受。我们发现脂肪组织是获得充足数量MSC的便利来源。因此我们调整了我们的研 究，并开发了从器官供体脂肪组织中分离MSC的自有技术。发明目的和
发明内容
本发明的主要目的是为可常规用于产生移植“耐受”的只能得自供体的间充质干 细胞(MSC)找到充分的替代性来源。本发明的另外一个目的是开发一种从选定来源中分离 和分化MSC的实用方便的方法。本发明的另外一个目的是提供一种不同干细胞的组合物以 及实现最期望和一致结果的患者给药方法。本发明首次描述了脂肪组织源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干细胞 (PBSC)的新组合物，其能帮助产生移植耐受(以极低剂量的免疫抑制药物达到稳定充分的 同种异体移植物功能且排斥反应极低/没有排斥反应)。这些细胞使用我们自有的网膜静脉套管插入(omental veincanulation)技术通 过小切口开腹术移植到门脉循环中。这些细胞在非清髓最小条件下移植到受者中，其中使用供体特异性白细胞输注、针对受者的抗T细胞和抗B细胞抗体，并在移植干细胞前对受者 的膈下淋巴结、部分骨盆和臀部骨骼及胸腰椎进行1000CGY的靶标特异性照射。这是首次不使用任何异种材料就在体外从人脂肪组织中产生间充质干细胞MSC。 之前有通过使用异种材料从胚胎干细胞或者脐带血或骨髓(BM)产生MSC的报道。然而从 未有过不使用异种遗传材料而产生MSC。发明详述 在我们连续的研究中，我们观察到MSC改善了 HSC移植，并且脂肪组织是MSC的良 好的、容易获得的可利用来源。除了脂肪组织，MSC不能从其他任何来源中大量获得。我们开发了从器官供体的脂肪组织分离和培养MSC的新技术。我们成功地用一个 独特的干细胞组合(即脂肪组织源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干细胞(PBSC)) 来产生移植耐受。耐受与移植骨髓中约10%的HSC相关。PBSC是T淋巴细胞的丰富来源， 后者也是干细胞移植所必需的。MSC的角色是HSC的老大哥。它们发挥脚手架的作用，协助 HSC在器官之间的趋化运输。根据国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会的规定，MSC在标准培养条件 下维持时必须具备塑料粘附性，它们必须显示出朝向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的分 化潜能，它们必须阳性表达⑶90、⑶73和⑶105标志物，同时它们必须不表达造血细胞谱系 的标志物，包括⑶45、⑶；34、⑶14、⑶lib、⑶四、HLA-DR、c_kit。我们的细胞系符合上述标准。脂肪组织源性MSC (hAD-MSC)的作用是剂量依赖性的，细胞植入时需要 hAD-MSC HSC的比例为1 20，该比例越高，植入效果越好。我们的结果证实了这些实验
室结论。之前通过不同策略使用药物和造血干细胞诱导移植耐受的尝试都是不成功的。这 是用独特干细胞组合实现移植耐受的首次成功尝试。这些细胞使用我们自有的网膜静脉套管插入术技术通过小切口开腹术移植到门 脉循环中。这些细胞在非清髓最小条件下移植到受者中，其中使用供体特异性白细胞输注、 针对受者的抗T细胞和抗B细胞抗体，并在移植干细胞前对受者的膈下淋巴结、部分骨盆和 臀部骨骼及胸腰椎进行1000CGY的靶标特异性照射。因此，该脂肪组织源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干细胞PBSC的独特组 合物是在上述条件(抗T/B细胞抗体和靶标特异性照射)产生移植相关的移植耐受所必需 的。开发T IUTfe术并用于从H旨Ife組iR中IBr集禾时吝养MSC细朐,。技术从脂肪组织收集后分离MSC 在获得知情同意后，在局部麻醉下，在供体脐下左侧做小切口，然后从腹前壁切除 1.5克脂肪组织。确保止血后缝合。将该脂肪组织收集在下述培养基中1. 20ml α -MEM2. 5ml，20%人白蛋白
3. 20 μ 1，青霉素(200000 单位 /ml)4. 20 μ 1，链霉素(200000 单位 /ml)5. 10 μ 1，头孢噻月亏(lgm/5ml)6· 10μ 1，氟康唑，100mg/dl。用刀将脂肪组织切成碎末。然后将其转移到每IOml中加入IOmg I型胶原酶的上 述培养基中。然后放置在35RPM的摇床上37°C孵育1小时进行消化。将在培养皿中处理的 全部培养基内含物转移到15ml离心管中，780RPM离心8分钟。将上清液和沉淀用上述培 养基分别培养在IOOcm2和25cm2细胞+培养皿(Sarsted，USA)中，在37°C、5% CO2下培养 8天。将细胞传代3次(每隔一天更换培养基)，在第3次传代结束时，用IN磷酸盐缓冲液 (PBS)清洗，再通过胰酶消化(0. 25%胰蛋白酶EDTA溶液，用0. 25%胰蛋白酶和0. 2% EDTA 钠盐粉末制成，HiMedia, India)收集细胞。检查所收集细胞的活性、无菌性和细胞计数并进行流式细胞术分析。进行 ⑶45 (Per CP)阴性和⑶90 (PE)阳性测试。将这些细胞与培养的骨髓和外周血干细胞PBSC 混合，将全部内含物输注到门脉循环中。发明结果以下为患者详细信息用MSC+BMSC+PBSC讲行肾移棺的患者总数60年龄33.5 (范围8-59)岁性别男性女性49 11供体年龄46. 4 (范围:20-67)岁HLA 匹配0/6 2，1/6 11，2/6 10，3/6 28，4/6 5，5/6 2，6/6 2所输注干细胞的信息BM CD34+平均倌0. 23 (范围0· 01-4. 01)(标准差-0. 37)CD45-/90+ 平均倌BM 0. 42 (范围0. 02-0. 84)(标准差-0. 23)BM+MSC 21. 67 (范围3· 06-63. 73)(标准差 MSC-18. 3)(这些在 PBSC 中不存在)MSC+BM CD45-/73+平均倌(在单独的BM中没有发现)6. 39 (范围0. 1-23. 82)(标准差 6. 37)随访情况天数99.86(19-184)血清肌酸酐(mg%) :1.27 (0. 63-2. 3)(标准差0. 32)嵌合性用荧光原位杂交(FISH)检测:7.2% (范围5_14· 7% )CD3dim(天然抑制细胞):2.92% (范围1. 47-5. 14% )(标准差1. 33)CD 19+:0. 33(范围0· 01-1. 53% )(标准差0· 47)CD 25+ 0. 49(范围0· 21-1. 06% )(标准差0· 26)
权利要求
1.用于在接受移植的患者中产生移植耐受的组合物，其包含从合适供体获得的人脂肪 组织源性间充质干细胞(MSC)、骨髓源性间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)以及外周 血干细胞(PBSC-HSC)。
2.权利要求1的组合物，其中细胞植入所需的人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC)与 造血干细胞(HSC)的优选比例为1 20或更高。
3.权利要求1或2的组合物，其用于施用给接受肾移植的患者。
4.权利要求1、2和3的组合物，其用于施用给患者，优选通过输注经门脉循环施用。
5.用于在接受移植的患者中产生“移植耐受”的方法，其通过施用、优选输注有效浓度 的组合物来实现，该组合物包含从合适供体获得的人脂肪组织源性间充质干细胞(MSC)、骨 髓源性间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)以及外周血干细胞(PBSC)。
6.权利要求5的治疗方法，其中细胞植入所需的人脂肪源性间充质干细胞(hAD-MSC) 与造血干细胞(HSC)的优选比例为1 20或更高。
7.权利要求5和6的方法，其中患者接受的移植类型为肾移植。
8.权利要求1的组合物，其中所述人脂肪组织源性间充质干细胞(MSC)是通过基本无 需异种材料的方法分离的，所述方法包括以下步骤a)从供体的腹前壁切除约1.5克脂肪组织，b)将脂肪组织收集在含有MEM、人白蛋白、抗生素和至少一种抗真菌剂的培养基中，c)将脂肪组织切成碎末，并且将其转移到含有I型胶原酶的步骤b所述培养基中，d)在摇床上孵育和消化约1小时，e)将以上从培养皿中转移到离心管中进行离心，f)将上清液和沉淀分别在37°C、5%CO2的条件下培养在培养皿中的上述培养基中，优 选培养8天，g)将细胞传代3次，每隔一天更换培养基，h)用合适缓冲液清洗后通过胰酶消化收集上述细胞，i)收集细胞并检查活性、无菌性和数目，并进行流式细胞术分析，CD45、CD90测试。
全文摘要
本发明提供一种简单、经济但高效的方法，其能在器官移植患者体内产生移植物耐受，而无需持续使用昂贵的有严重副作用的免疫抑制药物。本发明基本上涉及对患者施用新组合物，所述组合物由脂肪组织源性间充质干细胞(MSC)与骨髓源性造血干细胞(HSC)和MSC以及外周血干细胞(PBSC)组合而成。这有助于产生移植物耐受，即通过极低量的免疫抑制药物产生稳定充分的同种异体移植物功能而使排斥反应尽可能低/不发生。本发明还涉及一种无需任何任何异种材料而从人脂肪组织中分离间充质干细胞的简单方法。
文档编号A61K35/14GK102065871SQ200980117407
公开日2011年5月18日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月15日
发明者H·L·特里维迪, 阿鲁娜·瓦尼卡 申请人:H·L·特里维迪博士移植科学研究所, Smt.G.R.多斯及Smt.K M玛塔肾病研究所及研究中心
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