用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的药物组合物的制作方法
专利名称：用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供用于眼科用途的药物组合物，其包括通过重组酵母细胞产生的重组 人血清白蛋白，所述重组酵母细胞是通过宿主酵母细胞的基因操作得到的。本发明的药 物组合物可用于治疗干眼和角膜结膜损伤。本发明进一步提供使用本发明的组合物用于 治疗角膜结膜损伤以及治疗干眼病症的方法。
背景技术：
角膜结膜损伤是由角膜上皮细胞的表面缺损而造成的。其原因可以包括发病因 素比如干眼、各种角膜结膜炎、变态反应和微生物(例如病毒、细菌、真菌等)感染，化 学因素比如化学品的细胞毒性和由于酸和碱引起的腐蚀，物理因素比如眼球表面干燥、 由于外源物质(例如隐形眼镜等)和热水引起的损伤等。最近报道说包含在眼科组合物 中的防腐剂(例如苯扎氯铵、氯代丁醇等)和眼科试剂(例如氨基糖苷类抗生素、非甾体 抗炎药物、IDU、匹马菌素等)会引起角膜上皮损伤。目前，为了治疗角膜结膜损伤， 给药硫酸软骨素、谷胱甘肽、透明质酸、纤连蛋白、EGF等，或者为了补充泪液还给药 人工泪液，但是这些治疗的效果尚不充分。已知干眼是由于眼泪缺乏或过度蒸发而引起的眼泪膜的病症，其引起对眼睑间 的眼表面的损害，且与眼部不适的症状相关。最近，国际干眼学部的定义和分类小组委 员会(Definition and ClassificationSubcommittee of the International Dry Eye Workshop)提供
了如下干眼的新定义干眼是一种导致不适症状、视力障碍和对眼表面具有潜在损害的 眼泪膜不稳定性的眼泪和眼表面的多因素疾病。其伴随有眼泪膜的渗透压升高和眼表面 的炎症。干眼可以分为两个主要种类泪水缺乏性干眼和蒸发过强性干眼。泪水缺乏性 干眼是由于泪腺分泌眼泪失败引起的。蒸发过强性干眼是由于在正常泪腺分泌功能的情 况下，由暴露的眼表面的水分损失过度引起的。其原因描述为内在性原因，其中其是由 于影响眼睑的结构或动力学的内在性疾病引起，或外在性原因，其中由于一些外在暴露 而出现眼表面疾病(非专利文献1)。存在多种引起干眼的因素。尚未发现使眼泪降低的 量恢复的合适方法。目前，为了治疗干眼，为了补充眼泪的目的而给药人工泪液，和为 了减轻自觉症状而给药硫酸软骨素、谷胱甘肽、透明质酸、纤连蛋白、血清滴眼剂等， 但是效果仍然不足。人血清白蛋白(在下文中，称为HSA)是人血浆蛋白质的主要组分。该蛋白质 是在肝脏中产生，并且在保持血液渗透压在正常范围中起重要作用。另外，所述蛋白质 起多种血清分子的载体的作用。HSA现在被用于治疗与体液的显著损失有关的病症比如 在接受外科手术之后的病症、休克、烧伤和低蛋白质血症。例如，在患有休克或烧伤的 患者中，多次给药HSA以恢复减少的血容量和改善与损伤相关的症状。HSA也用于治疗 低蛋白质血症和胎儿成红细胞增多症。
目前，HSA是通过分馏捐献的人类血液而制备的。如此制备的产品的缺点是成 本高和难于稳定地获得捐献的人类血液。另外，捐献的人类血液有被不利物质比如肝炎病毒污染的可能性。因此，期望开发可以作为HSA替代品的物质。在DNA重组技 术建立之后，已经通过重组微生物制备了多种有用的多肽。已经 通过使用基因操作技术获得重组HSA的大规模生产，并且已经提供了高度纯化的HSA产 物。专利文献1公开了通过毕赤酵母的基因操作而得到的重组酵母产生的重组人血清白 蛋白(在下文中，称为“rHSA” )。如此得到的rHSA现在受到了 Ministry of Health, Labour andWelfare, Japan的授权销售，并且是可以以产品名称“Medway⑧注射剂”从 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation (Osaka, Japan)商购的。与 HSA 类似， Medway 注射剂已经显示可用于治疗与来自血管的体液显著损失相关的病症，包括在外科手术之 后的病症、休克、热烧伤和低蛋白质血症(hypoproteinmia)。另外，FDA批准的重组人 白蛋白 Albagen 也是可从 New Century Pharmaceuticals, Inc. (AL, US)商购的，作为 药物添加剂。Albagen 也是使用重组毕赤酵母制备的。非专利文献2公开了通过酿酒 酵母的基因操作而得到的重组人血清白蛋白。所述rHSA也是FDA批准的可以以名称
Heeombumin 从Novozymes Inc.商购的，其作为医药产品比如疫苗的稳定剂。专利文献2公开了人血清白蛋白可用于治疗一些眼部疾病，包括干眼和角膜结 膜损伤。专利文献3公开了用于治疗干眼的眼科组合物，其包括浓度低至0.001-0.3mg/ ml的HSA。根据专利文献3，包括1.0mg/ml (0.1w/v% )或更多HSA的眼科制剂对眼睛 有刺激性，当向眼睛局部给药时，其引起比如局部刺激的问题。专利文献2和3公开了 HSA通常可以被通过常规遗传工程方法得到的重组人白 蛋白代替。然而，没有关于通过作为宿主生物体的酵母的基因操作而得到的重组人血清 白蛋白对干眼或角膜结膜损伤的作用的信息。专利文献1 JP-A-6-100592专利文献2 W097/039769专利文献3 JP-A-2000-319194非专利文献1: The Ocular Surface 2007 Apr, VOL.5, No.2 12-28非专利文献2 Journal of Clinical Pharmacology 2005 ； 45 57-67 将上述文件引 入本文作为参考。
发明内容
本发明要解决的问题本发明的目的是提供用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的新的药物组合物。解决问题的方式本发明人发现通过酵母细胞的基因操作而得到的重组人血清白蛋白对干眼和角 膜结膜损伤的作用不同于通过在现有技术参考文献中公开的分馏捐献的人类血液而得到 的人血清白蛋白的作用，以及低至0.001-0.3mg/ml的较低浓度的重组人白蛋白不能有效 地治疗干眼或角膜结膜损伤，而高达10mg/ml(1.0W/V%)或更高的较高浓度的重组人血 清白蛋白可有效地治疗干眼以及角膜结膜损伤，而不会引起眼睛刺激，从而完成了本发 明。本申请提供如下发明方案
(1)用于治疗干眼的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而 得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。(2)用于治疗角 膜结膜损伤的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转 化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。(3)根据⑴或⑵的组合物，其中所述重组酵母是通过转化毕赤酵母属 (Pichia)或酵母属(Saccharomyces)的酵母得到的。(4)根据(3)的组合物，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)。(5)根据⑴或⑵的组合物，其中所述重组人血清白蛋白具有下述性质基于重组人血清白蛋白和来源于重组酵母细胞的杂质的总量计，重组人血清白 蛋白的纯度大于99.999%，所述杂质由具有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质 和多糖组成，和来源于重组酵母细胞的杂质的总量少于酶免疫测定(EIA)的检出限，所述杂质 由具有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质和多糖组成。(6)根据⑴或⑵的组合物，其用于局部眼部滴注。(7)根据(1)的组合物，其中干眼为泪水缺乏性干眼或蒸发过强性干眼。(8)根据(1)的组合物，其中干眼选自无泪、干眼症、舍格伦综合征、干性角膜 结膜炎、史-约综合征、眼天疱疮、眼手术后引起的干眼、伴有过敏性结膜炎的干眼、 包括VDT(视觉显示终端)工人的眼泪减少症(teardecrement)和由于空调的干燥房间引起 的没有任何全身症状的眼泪减少症的干眼类病症。(9)根据(1)的组合物，其中干眼为蒸发过强性干眼。(10)根据(2)的组合物，其中所述角膜结膜损伤为由下列因素引起的角膜结膜 上皮缺损、角膜结膜糜烂或角膜结膜溃疡干眼、角膜结膜炎、变态反应和包括病毒、 细菌和真菌的微生物的感染、化学品的细胞毒性、化学因素、干眼症、由于包含在眼科 组合物中的防腐剂、包含在眼科组合物中的活性成分、眼科手术和眼部注射引起的损 伤。(11)通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清 白蛋白在制备用于治疗干眼的药物组合物中的用途。(12)通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清 白蛋白在制备用于治疗角膜结膜损伤的药物组合物中的用途。(13)用于治疗干眼的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过用人血清 白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。(14)用于治疗角膜结膜损伤的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过 用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。发明效果根据本申请，已经显示出通过遗传修饰的酵母产生的重组人血清白蛋白对干眼 以及角膜结膜损伤的作用不同于如在专利文献3公开的，即通过分馏人血液获得的人血 清白蛋白的作用。本发明的眼科组合物可用于有效地治疗干眼和/或角膜结膜损伤。实施本发明的最佳方式
在本发明中，通过基因操作得到的产生rHSA的重组酵母没有特别地限制， 只要其是通过使用酵母作为宿主微生物进行基因操作制备的。即，可以合适地使用 在文献中已经报道的和将来开发的那些。酵母的实例可以包括属于克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)的那些，特别地，克 鲁维酵母(Kluyveromyceslaactis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵 (Pichiapastoris)是优选使用的。更优选地使用乳酸克鲁维酵母属(Kluyveromyceslaactis) CBS2360 菌株、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22 菌株(a、his 4、leu 2、can 1) 和毕赤酵母属(Pichia)GTS115菌株(his4)作为宿主酵母。在本发明中，尤其地，毕赤 (Pichia)酵母和酵母属(Saccharomyces)酵母，特别是巴斯德毕赤酵(Pichiapastoris)和酿 酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是优选使用的。产生rHSA的重组细胞的制备、通过培养该重组细胞产生 rHSA和从培养物中分离和回收产生的rHSA都可以根据可以稍微改变 的已知方法进行。例如，产生rHSA细胞株的制备可以使用如下方法进 行其中使用天然HSA基因的方法(JP-A-58-56684 (EP-A-73646)、 JP-A-58-90515(EP-A_79739)和 JP-A-58-150517(EP-A_91527))、其中使用新 的人血清白蛋白基因的方法(JP-A-62-29985 和 JP-A_1_98486 (EP_A_206733))、 其中使用合成信号序列的方法(JP-A-1-240191 (EP-A-329127))、其中使用血 清白蛋白信号序列的方法(JP-A-2-167095 (EP-A-319641))、其中将重组质粒 引入染色体中的方法(JP-A-3-72889(EP-A_399455))、其中融合宿主的方法 (JP-A-3-53877(EP-A_409156))、其中在含有甲醇的培养基中产生突变 的方法、其 中使用突变体AOX2启动子的方法(JP-A-3-63598、JP-A-3-63599)、其中在枯草杆 菌(B.Subtilis)中表达 HSA 的方法(JP-A-62-25133 (EP-A-229712))、其中在酵母中 表达 HSA 的方法 Ρ-Α-60-41487(ΕΡ-Α_123544)、JP-A-63-39576 (EP-A-248657) 和JP-A-63-74493(EP-A_251744)和其中在毕赤酵母中表达HSA的方法 (JP-A-2-104290 (EP-A-3444S9))。在这些方法中，其中在含有甲醇的培养基中引起酵母突变的方法以如下方式进 行。通过将包含在AOX1启动子的控制下表达HSA的转录单位的质粒引入宿主的AOX1 基因区域，以常见的方式获得合适的宿主的转化体，所述宿主优选地为毕赤酵母，示例 为菌株GTS115(NRRL保藏号No.Y_15851)(参见JP-A 2-104290)。这一转化体在包含 甲醇的培养基中几乎不生长。因此，将这一转化体培养在包含甲醇的培养基中，以产生 突变，并且分离能够在该培养基中生长的菌株。甲醇在培养基中的浓度范围可以为例如 约0.0001至约5%。所述培养基可以是合成的或天然的。所述培养可以在例如约15至 40°C的温度下进行约1至1,000小时。产生rHSA的重组细胞的培养，即产生rHSA，可通过上述专利中公开的每种方 法进行，或者通过其中产生rHSA的重组酵母细胞和产物以高浓度通过分批进料培养(半 分批培养)获得的方法进行。所述分批进料培养是通过逐渐地提供高浓度葡萄糖以避免 抗重组细胞的基质抑制来进行的(JP-A-1-219561)。重组细胞的培养也可通过其中向培 养基中加入脂肪酸而提高rHSA产率的方法进行(JP-A-4-293495 (EP-A-504823)和美国 专利No.5,334,512)。用于分离和获取rHSA的方法可以包括例如通过加热处理灭活蛋白酶(JP-A-3-103188)，和通过使用阴离子交换剂、疏水性载体和活性碳中的至少一员分 离rHSA与着色组分抑制rHSA着色(JP-A-4-54198)。可以使用本领域通常使用的补充有具有10至26个碳原子的脂肪酸或其盐的培养 基作为用于培养重组酵母的培养基，并且可以在已知条件下进行培养重组酵母。所述培 养基可以是合成的或天然的，但优选地为液体培养基。例如，合适的合成培养基可以由 下述成分组成碳源，比如各种糖类；氮源，比如脲、铵盐、硝酸盐；微量营养素，比 如多种维生素、核苷酸；和无机盐，比如Mg、Ca、Fe、Na、K、Mn、Co禾Π Cu的。这 样的培养基的示例性实例是YNB液体培养基，其包括0.7%的酵母氮碱(Difco)和2%的 葡萄糖。有用的天然培养基的 示例性实例是YPD液体培养基，其包括的酵母提取物 (Difco)、2%的Bacto Peptone (Difco)和2%的葡萄糖。培养基的pH可以是中性、弱碱 性或弱酸性的。在甲基营养酵母(methylotrophicyeast)的情况下，所述培养基可以进一 步补充有约0.01至5%的量的甲醇。培养温度优选地为15至43°C，特别地为20至30°C。培养期为约1至1,000小 时。所述培养可以利用静置或震荡培养或在分批、半分批或连续培养搅动下培养而进 行。在主要培养之前的预培养优选地使用培养基例如YNB液体培养基或YPD液体培养 基进行。所述预培养可以在约30°C下进行10至100小时。在完成培养之后，通过已知的分离方法从培养滤液或酵母细胞中获取rHSA。rHSA的纯化可以利用通常已知的方法，比如各种分馏方法、吸收色谱、亲和色 谱、凝胶过滤、密度梯度离心和透析进行。优选的纯化方法的一个实例可以包括下述步 骤(1)至(7)(1)使用具有100,000至500,000和1,000至50,000的分级分子量的超滤膜超滤产 生人血清白蛋白的重组酵母细胞的培养上清液；(2)在50_70°C下，加热包含rHSA的级分30分钟至5小时；(3)用酸调节包含rHSA的级分的pH在pH 3-5 ；(4)用具有100,000至500,000的分级分子量的超滤膜超滤如此处理的产物；(5)在pH 3-5和盐浓度0.01-0.2M的条件下，用阳离子交换剂接触包含rHSA的 级分；并在pH 8-10和盐浓度0.2-0.5M的条件下洗脱产物；(6)在pH6_8和盐浓度0.01-0.5M的条件下，用用于疏水性层析的载体接触所述 洗脱液，并收集未吸附的级分；和(7)在pH6_8和盐浓度0.01-0.1M的条件下，用阴离子交换剂接触所述未吸附的 级分，并收集该未吸附的级分。上述步骤可以包括代替前述步骤(6)，而在pH 6-8和盐浓度1_3M的条件下， 用用于疏水性层析的载体接触所述洗脱液，然后在pH 6-8和盐浓度0.01-0.5M的条件下 洗脱产物的步骤；代替前述步骤(7)，而在pH6-8和盐浓度0.001-0.05M的条件下，用阴 离子交换剂接触所述未吸附的级分，然后在pH 6-8和盐浓度0.05-1M的条件下洗脱产物 的步骤。另外，所述步骤也可包括在前述步骤(5)和(6)之间、(6)和(7)之间或在(7) 之后，在pH 3-5和盐浓度0.5-3M的条件下盐析并收集沉淀的级分的步骤。rHSA的纯化步骤可以包含优选地在纯化步骤结束时的脱色步骤。所述脱色步 骤可以通过用具有特定配体的螯合树脂接触获得的粗rHSA来进行。优选地，所述螯合树脂的载体部分是具有疏水性质者，比如苯乙烯/二乙烯基苯共聚物和丙烯酸/甲基丙 烯酸共聚物。所述螯合树脂的配体部分的实例包括多元醇基团比如N-甲基葡糖胺，在 分子中具有多个亚氨基、氨基、亚乙基亚氨基等的多胺基团(包括多亚烷基多胺，比如 多亚乙基多胺)和硫脲基。方便地使用市售可获得的具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物 载体的那些，比如DIAION CRB02(配体N-甲基葡糖胺基团，由Mitsubishi Chemical Corporation 制造)、DIAION CR20 (配体-NH (CH2CH2NH) nH,由 Mitsubishi Chemical Corporation 制造)、LEWATIT TP (配体-NHCSNH2,由 Bayer Corporation 制造)禾口 AmberliteCG4000。 该螯合树脂处理的合适条件如下。pH 酸性或中性，优选pH3至9，更优选pH 4至7。处理时间一小时或更长，优选6小时或更长。离子强度50mmho或更低，优选1到IOmmho。混合比例0.1至IOOg,优选1至IOg (按湿量计)的树脂每250mg的rHSA。如此得到的rHSA，即通过进行步骤(1)_(7)、盐析步骤和进行螯合树脂处理从 重组酵母培养物获取并纯化的rHSA的着色度非常低。当将rHSA配制成250mg/ml的 rHSA溶液(25%溶液)时，A500nm/A280nm的比例为约0.001-0.005。螯合树脂处理 可以降低着色度至1/2-1/10。尤其，rHSA在约500nm吸收波长的着色度，即红色着色 度，通过螯合处理降低至1/3-1/10。在本发明中使用的rHSA是具有约67,000的分子量和4.6-5.0的等电点的均勻物 质。其由单独的单体组成，并且基本上不含二聚物、聚合物或分解产物。特别地，包括 二聚物、聚合物和分解产物的杂质的总量小于约0.01%。另外，在本发明中使用的rHSA 基本上不含来源于重组酵母的杂质，包括不同于rHSA的蛋白质和多糖。基于rHSA和 杂质总量的rHSA的纯度高于99.999999%，优选地高于99.9999999%。特别地，示例了 可以提供包含等于或少于lng/ml，优选等于或少于O.lng/ml的不同于rHSA的蛋白质的 25% rHSA溶液的纯化rHSA。类似地，还示例了可以提供包含等于或少于10ng/ml，优 选等于或少于lng/ml多糖的25% rHSA溶液的纯化rHSA。如本文使用的，“rHSA的 纯度”指在可以包括杂质的rHSA产物中rHSA的比例，所述杂质比如来源于产生rHSA 的重组酵母细胞的不同于rHSA的蛋白质和多糖。本发明的rHSA可以提供使用25% rHSA溶液测定的如下着色度A350/A280的比例为约0.01-0.05，A450/A280的比例为 约0.001-0.02，和A500/A280的比例为约0.001-0.005。结合到一个rHSA分子上的脂肪 酸分子的数量等于或小于1，优选地等于或小于0.1。根据本发明，rHSA可以是任何从通过基因操作而得到的重组酵母获得的那些， 包括市售可获得的产品。例如，可以优选地使用Medway 注射剂(Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Tokyo, Japan)。如本文使用的，术语“角膜结膜损伤”包括由下述因素引起的角膜和/或结膜 损伤致病因素比如干眼、各种角膜结膜炎、变态反应和微生物(例如病毒、细菌、真 菌等)的感染，化学因素比如化学品的细胞毒性和由于酸和碱引起的腐蚀，物理因素比 如眼球表面干燥、由于外源物质(例如隐形眼镜等)和热水等、眼科组合物中包含的防 腐剂(例如苯扎氯铵、氯代丁醇等)和眼科试剂(例如氨基糖苷类抗生素、非留体抗炎药物、IDU、匹马菌素等)引起的损伤；角膜外层缺损；角膜糜烂；角膜溃疡等。另外，所述角膜结膜损伤可以包括外科手术后的病症，所述外科手术比如角膜 移植术、屈光性外科手术包括屈光性角膜切削术(RK)、准分子激光屈光性角膜切削术 (PRK)、准分子激光原位角膜磨镶术(Iaserassociatedinsitukeratomileusis) (LASIK)、角膜 环植入外科手术(ICRS)、前房眼内透镜植入包括人工晶体植入术(phakicIOL)、翼状胬 肉外科手术、囊内白内障摘除术(ICCE)、囊外白内障摘除术(ECCE)、晶状体后囊切开 术(posterior capsultomy)、眼内透镜植入术、玻璃体切割术、小梁切开术、滤帘切除术、 玻璃体内植入术、切除异物和麦粒肿切除术，及由于玻璃体内注射和泪小点闭塞(punctal occlusion)引起的损伤。如本文使用的，术语“干眼”可以包括泪水缺乏性干眼和蒸发过强性干眼。特 别地，举例为干眼病症比如无泪、干眼症、舍格伦综合征、干性角膜结膜炎、史-约综 合征、眼天疱疮和睑缘炎。另外，术语“干眼”包括在前眼部手术后的干眼，比如白内 障手术和屈光性外科手术，和伴有过敏性结膜炎的干眼，以及比如VDT (视觉显示终端) 工人的眼泪减少症和由于例如空调的干燥房间引起的没有任何全身症状的眼泪减少症的 干眼类病症。如本文使用的，术语“治疗”指控制所述病症的任何方式，包括预防、治愈和 缓解所述病症，以及阻止或缓解所述病症的发展。本发明的药物组合物可以是剂型比如片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、胶囊、栓 齐U、注射制剂、软膏剂、眼用溶液(滴眼剂)等。特别优选的是可局部给药的眼科溶液 或滴眼剂。在本发明的组合物配制成眼科溶液的情况下，所述组合物可以包含如下量的 rHSA 约 1 至 1000mg/ml(0.1-100w/v% )，更优选约 10 至 1000mg/ml (l-100w/v% )， 特别地为约10至100mg/ml(l-10W/v% )。所述组合物可以进一步包含可药用稀释剂。如本文使用的，“可药用稀释剂”可以是用于本领域技术人员已知的眼科组合 物的任何稀释剂，例如水、生理盐水、人工泪液等。本发明的药物组合物可以进一步包 括通常用于眼科组合物的各种组分，比如稳定剂、灭菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、 pH调节剂、表面活性剂等。当所述组合物配制成眼科溶液或滴眼剂时，该组合物的pH优选地调节为5至 8。所述眼科溶液可以以每次给药约1至100 μ 1/眼睛，优选地约10至50 μ 1/眼睛，更 优选地约30-50 μ 1/眼睛的量给药。在另一个方面，本发明还提供rHSA在制备如上描述的本发明的药物组合物中的 用途。在另一方面，本发明提供 用于治疗角膜结膜损伤的方法，其包括向需要治疗角 膜结膜损伤的受试者给药有效量的rHSA。如本文使用的，术语“需要治疗角结膜损伤的 受试者”包括事实上患有角膜结膜损伤的患者和疑似患有这种损伤的患者。其不仅包括 已经事实上确定角膜结膜损伤的患者，而且包括疑似患有角膜结膜损伤的患者，以及处 于其中预期出现该病症的可能性高的患者，比如在接受角膜移植术之后的患者。在另一方面，本发明还提供用于治疗干眼的方法，其包括向需要治疗角干眼的 受试者给药有效量的rHSA。如本文使用的，术语“需要治疗干眼的受试者”包括患有干眼病症的患者和疑似患有干眼的患者。给药途经没有特别地限制，局部眼部给药是优 选的。在本发明的这些方法中，rHSA的“有效量”为预期治疗所需要的量，其可以根 据患者的症状、年龄、性别、体重、饮食、组合使用的其它药物和医学领域的技术人员 认可的各种因素选择最佳量。除了上述因素之外，该有效量也可以根据rHSA的种类或 活性变化。在本发明的这些方法中，所述药物组合物可以以约1至100 μ 1/眼睛、优选约 10至50 μ 1/眼睛、更优选约30至50 μ 1/眼睛的量给药，每天给药1至20次，更优选地 每天约1至10次，其并不意味着限制本发明的范围。本发明使用的药物组合物可以与不同于rHSA的药学活性化合物共同给药。术语 “共同给药”可以包括在给药本发明的药物组合物之前、同时和之后给药不同于rHSA的
药学活性成分。当所述不同于rHSA的药学活性化合物与本发明的组合物同时给药时， rHSA和其它活性成分可以一起配制在单一剂型中，或分别配制在不同的剂型中。例如， 人工泪液、多糖硫酸酯比如透明质酸和硫酸软骨素、环胞菌素、谷胱甘肽、黄素腺嘌呤 核苷酸钠、皮质类固醇、四环素、维生素A(视黄醇)及其衍生物比如维生素A酯(包括 视黄醇棕榈酸酯和视黄醇乙酸酯)和细胞生长因子比如肝细胞生长因子(HGF)、表皮生 长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子 (NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子仃0 1和10 -0)和角质形成细 胞生长因子(KGF)可以与本发明的药物组合物共同给药。通过如下所示的试验实施例进一步阐述本发明。所述试验实施例不应以任何方 式用于限制本申请的范围。试验实施例1兔子强制打开眼睑干眼模型试验方法使用Std: JW/CSK兔子。通过皮下注射乌拉坦(2g/kg，8ml/kg)将动物麻醉。 通过使用开睑器强制打开兔子的眼睑，并使用兔子固定器将动物以面朝下位置固定3小 时。在完成强制打开眼睑之后，通过静脉内给药过量的5%戊巴比妥处死动物，摘除眼 球。将50μ1的亚甲蓝溶液滴到摘除眼球的角膜表面，并静置1分钟。然后，将眼 球放入包含15ml生理盐水的容器中以冲洗亚甲蓝。用剃刀切除角膜，浸泡在丙酮/硫酸 钠溶液(100%丙酮9% Na2SO4水溶液=7 3)中一晚上，以从角膜中提取亚甲蓝进入 溶液中。通过使用Multskan Spectrum Thermo在660nm下测量光密度确定提取溶液中 亚甲蓝的含量。平均吸光度士标准误差显示在下表中。用平均吸光度(即亚甲蓝吸光 度)评价角膜损伤。根据如下标准评价各组的角膜损伤抑制率未处理组(组I)的平均亚甲蓝吸光度=100%角膜损伤抑制接受强制打开眼睑和给药生理盐水的组(组II)的平均亚甲蓝吸光度=0%角膜 损伤抑制根据下式计算试验组的角膜损伤抑制率
^(组II)-(试验组)
角膜损伤抑制率(％)=(组H)—(组丨)xIQO在上式中，(组I)、(组II)、和(试验组)表示各组的平均亚甲蓝吸光度。(试 验组)表示组III-VI的任一组。试验化合物的给药在开始强制打开眼睑之后，立即向动物的两只眼睛局部给药50 μ 1的生理盐水， 1、3或5w/V%&rHSA溶液或0.3%透明质酸钠(Hyalein 眼科溶液0.3%，Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Osaka, Japan)。对于1、3和5%rHSA溶液，用生理盐水稀释25%Medway 注射剂(包含25w/ v%&rHSA，Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Tokyo, Japan),得到期望的浓度。试验组表 1
H处理ρ
10小时强制打开眼睑+没有处理5 (10只眼睛)
1 3小时强制打开眼睑+生理盐水10 (20只眼睛)
1 3小时强制打开眼睑+1% rHSA10 (20只眼睛)
1 3小时强制打开眼睑+3% rHSA10 (20只眼睛)
V3小时强制打开眼睑+5% rHSA10 (20只眼睛)
VI3小时强制打开眼睑+0.3%透明质酸钠10 (20只眼睛)结果在3小时强制打开眼睑之后，测量指示角膜损伤的亚甲蓝吸光度。将结果显示 在下表2中
基于表2的结果计算角膜损伤抑制率。表 权利要求
1.用于治疗干眼的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到 的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
2.用于治疗角膜结膜损伤的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵 母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述重组酵母是通过转化毕赤酵母属(Pichia) 或酵母属Maccharomyces)的酵母得到的。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
5.根据权利要求1或2的组合物，其中所述重组人血清白蛋白具有下述性质基于重组人血清白蛋白和来源于重组酵母细胞的杂质的总量计，重组人血清白蛋白 的纯度大于99.999%，所述杂质由具有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质和多 糖组成，和来源于重组酵母细胞的杂质的总量少于酶免疫测定(EIA)的检出限，所述杂质由具 有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质和多糖组成。
6.根据权利要求1或2的组合物，其用于局部眼部滴注。
7.根据权利要求1的组合物，其中干眼为泪水缺乏性干眼或蒸发过强性干眼。
8.根据权利要求1的组合物，其中干眼选自无泪、干眼症、舍格伦综合征、干性角膜 结膜炎、史-约综合征、眼天疱疮、眼手术后引起的干眼、伴有过敏性结膜炎的干眼、 包括VDT(视觉显示终端)工人的眼泪减少症和由于空调的干燥房间引起的没有任何全身 症状的眼泪减少症的干眼类病症。
9.根据权利要求7的组合物，其中干眼为蒸发过强性干眼。
10.根据权利要求2的组合物，其中所述角膜结膜损伤为由下列因素引起的角膜结膜 上皮缺损、角膜结膜糜烂或角膜结膜溃疡干眼、角膜结膜炎、变态反应和包括病毒、 细菌和真菌的微生物的感染、化学品的细胞毒性、化学因素、干眼症、由于包含在眼科 组合物中的防腐剂、包含在眼科组合物中的活性成分、眼科手术和眼部注射引起的损 伤。
11.通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白 在制备用于治疗干眼的药物组合物中的用途。
12.通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白 在制备用于治疗角膜结膜损伤的药物组合物中的用途。
13.用于治疗干眼的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过用人血清白蛋白 的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
14.用于治疗角膜结膜损伤的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过用人血 清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
全文摘要
本发明提供用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。另外，本发明提供用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的方法，其包括向需要治疗眼睛和/或角膜结膜损伤的受试者给药有效量的通过用人血清白蛋白的基因转化酵母菌而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
文档编号A61K38/00GK102026648SQ20098011742
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者岛直子, 岸本中行, 田渕玲子, 真岛行彦 申请人:株式会社·R-技术上野
技术领域：
本发明提供用于眼科用途的药物组合物，其包括通过重组酵母细胞产生的重组 人血清白蛋白，所述重组酵母细胞是通过宿主酵母细胞的基因操作得到的。本发明的药 物组合物可用于治疗干眼和角膜结膜损伤。本发明进一步提供使用本发明的组合物用于 治疗角膜结膜损伤以及治疗干眼病症的方法。
背景技术：
角膜结膜损伤是由角膜上皮细胞的表面缺损而造成的。其原因可以包括发病因 素比如干眼、各种角膜结膜炎、变态反应和微生物(例如病毒、细菌、真菌等)感染，化 学因素比如化学品的细胞毒性和由于酸和碱引起的腐蚀，物理因素比如眼球表面干燥、 由于外源物质(例如隐形眼镜等)和热水引起的损伤等。最近报道说包含在眼科组合物 中的防腐剂(例如苯扎氯铵、氯代丁醇等)和眼科试剂(例如氨基糖苷类抗生素、非甾体 抗炎药物、IDU、匹马菌素等)会引起角膜上皮损伤。目前，为了治疗角膜结膜损伤， 给药硫酸软骨素、谷胱甘肽、透明质酸、纤连蛋白、EGF等，或者为了补充泪液还给药 人工泪液，但是这些治疗的效果尚不充分。已知干眼是由于眼泪缺乏或过度蒸发而引起的眼泪膜的病症，其引起对眼睑间 的眼表面的损害，且与眼部不适的症状相关。最近，国际干眼学部的定义和分类小组委 员会(Definition and ClassificationSubcommittee of the International Dry Eye Workshop)提供
了如下干眼的新定义干眼是一种导致不适症状、视力障碍和对眼表面具有潜在损害的 眼泪膜不稳定性的眼泪和眼表面的多因素疾病。其伴随有眼泪膜的渗透压升高和眼表面 的炎症。干眼可以分为两个主要种类泪水缺乏性干眼和蒸发过强性干眼。泪水缺乏性 干眼是由于泪腺分泌眼泪失败引起的。蒸发过强性干眼是由于在正常泪腺分泌功能的情 况下，由暴露的眼表面的水分损失过度引起的。其原因描述为内在性原因，其中其是由 于影响眼睑的结构或动力学的内在性疾病引起，或外在性原因，其中由于一些外在暴露 而出现眼表面疾病(非专利文献1)。存在多种引起干眼的因素。尚未发现使眼泪降低的 量恢复的合适方法。目前，为了治疗干眼，为了补充眼泪的目的而给药人工泪液，和为 了减轻自觉症状而给药硫酸软骨素、谷胱甘肽、透明质酸、纤连蛋白、血清滴眼剂等， 但是效果仍然不足。人血清白蛋白(在下文中，称为HSA)是人血浆蛋白质的主要组分。该蛋白质 是在肝脏中产生，并且在保持血液渗透压在正常范围中起重要作用。另外，所述蛋白质 起多种血清分子的载体的作用。HSA现在被用于治疗与体液的显著损失有关的病症比如 在接受外科手术之后的病症、休克、烧伤和低蛋白质血症。例如，在患有休克或烧伤的 患者中，多次给药HSA以恢复减少的血容量和改善与损伤相关的症状。HSA也用于治疗 低蛋白质血症和胎儿成红细胞增多症。
目前，HSA是通过分馏捐献的人类血液而制备的。如此制备的产品的缺点是成 本高和难于稳定地获得捐献的人类血液。另外，捐献的人类血液有被不利物质比如肝炎病毒污染的可能性。因此，期望开发可以作为HSA替代品的物质。在DNA重组技 术建立之后，已经通过重组微生物制备了多种有用的多肽。已经 通过使用基因操作技术获得重组HSA的大规模生产，并且已经提供了高度纯化的HSA产 物。专利文献1公开了通过毕赤酵母的基因操作而得到的重组酵母产生的重组人血清白 蛋白(在下文中，称为“rHSA” )。如此得到的rHSA现在受到了 Ministry of Health, Labour andWelfare, Japan的授权销售，并且是可以以产品名称“Medway⑧注射剂”从 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation (Osaka, Japan)商购的。与 HSA 类似， Medway 注射剂已经显示可用于治疗与来自血管的体液显著损失相关的病症，包括在外科手术之 后的病症、休克、热烧伤和低蛋白质血症(hypoproteinmia)。另外，FDA批准的重组人 白蛋白 Albagen 也是可从 New Century Pharmaceuticals, Inc. (AL, US)商购的，作为 药物添加剂。Albagen 也是使用重组毕赤酵母制备的。非专利文献2公开了通过酿酒 酵母的基因操作而得到的重组人血清白蛋白。所述rHSA也是FDA批准的可以以名称
Heeombumin 从Novozymes Inc.商购的，其作为医药产品比如疫苗的稳定剂。专利文献2公开了人血清白蛋白可用于治疗一些眼部疾病，包括干眼和角膜结 膜损伤。专利文献3公开了用于治疗干眼的眼科组合物，其包括浓度低至0.001-0.3mg/ ml的HSA。根据专利文献3，包括1.0mg/ml (0.1w/v% )或更多HSA的眼科制剂对眼睛 有刺激性，当向眼睛局部给药时，其引起比如局部刺激的问题。专利文献2和3公开了 HSA通常可以被通过常规遗传工程方法得到的重组人白 蛋白代替。然而，没有关于通过作为宿主生物体的酵母的基因操作而得到的重组人血清 白蛋白对干眼或角膜结膜损伤的作用的信息。专利文献1 JP-A-6-100592专利文献2 W097/039769专利文献3 JP-A-2000-319194非专利文献1: The Ocular Surface 2007 Apr, VOL.5, No.2 12-28非专利文献2 Journal of Clinical Pharmacology 2005 ； 45 57-67 将上述文件引 入本文作为参考。
发明内容
本发明要解决的问题本发明的目的是提供用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的新的药物组合物。解决问题的方式本发明人发现通过酵母细胞的基因操作而得到的重组人血清白蛋白对干眼和角 膜结膜损伤的作用不同于通过在现有技术参考文献中公开的分馏捐献的人类血液而得到 的人血清白蛋白的作用，以及低至0.001-0.3mg/ml的较低浓度的重组人白蛋白不能有效 地治疗干眼或角膜结膜损伤，而高达10mg/ml(1.0W/V%)或更高的较高浓度的重组人血 清白蛋白可有效地治疗干眼以及角膜结膜损伤，而不会引起眼睛刺激，从而完成了本发 明。本申请提供如下发明方案
(1)用于治疗干眼的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而 得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。(2)用于治疗角 膜结膜损伤的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转 化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。(3)根据⑴或⑵的组合物，其中所述重组酵母是通过转化毕赤酵母属 (Pichia)或酵母属(Saccharomyces)的酵母得到的。(4)根据(3)的组合物，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)。(5)根据⑴或⑵的组合物，其中所述重组人血清白蛋白具有下述性质基于重组人血清白蛋白和来源于重组酵母细胞的杂质的总量计，重组人血清白 蛋白的纯度大于99.999%，所述杂质由具有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质 和多糖组成，和来源于重组酵母细胞的杂质的总量少于酶免疫测定(EIA)的检出限，所述杂质 由具有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质和多糖组成。(6)根据⑴或⑵的组合物，其用于局部眼部滴注。(7)根据(1)的组合物，其中干眼为泪水缺乏性干眼或蒸发过强性干眼。(8)根据(1)的组合物，其中干眼选自无泪、干眼症、舍格伦综合征、干性角膜 结膜炎、史-约综合征、眼天疱疮、眼手术后引起的干眼、伴有过敏性结膜炎的干眼、 包括VDT(视觉显示终端)工人的眼泪减少症(teardecrement)和由于空调的干燥房间引起 的没有任何全身症状的眼泪减少症的干眼类病症。(9)根据(1)的组合物，其中干眼为蒸发过强性干眼。(10)根据(2)的组合物，其中所述角膜结膜损伤为由下列因素引起的角膜结膜 上皮缺损、角膜结膜糜烂或角膜结膜溃疡干眼、角膜结膜炎、变态反应和包括病毒、 细菌和真菌的微生物的感染、化学品的细胞毒性、化学因素、干眼症、由于包含在眼科 组合物中的防腐剂、包含在眼科组合物中的活性成分、眼科手术和眼部注射引起的损 伤。(11)通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清 白蛋白在制备用于治疗干眼的药物组合物中的用途。(12)通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清 白蛋白在制备用于治疗角膜结膜损伤的药物组合物中的用途。(13)用于治疗干眼的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过用人血清 白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。(14)用于治疗角膜结膜损伤的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过 用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。发明效果根据本申请，已经显示出通过遗传修饰的酵母产生的重组人血清白蛋白对干眼 以及角膜结膜损伤的作用不同于如在专利文献3公开的，即通过分馏人血液获得的人血 清白蛋白的作用。本发明的眼科组合物可用于有效地治疗干眼和/或角膜结膜损伤。实施本发明的最佳方式
在本发明中，通过基因操作得到的产生rHSA的重组酵母没有特别地限制， 只要其是通过使用酵母作为宿主微生物进行基因操作制备的。即，可以合适地使用 在文献中已经报道的和将来开发的那些。酵母的实例可以包括属于克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)的那些，特别地，克 鲁维酵母(Kluyveromyceslaactis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵 (Pichiapastoris)是优选使用的。更优选地使用乳酸克鲁维酵母属(Kluyveromyceslaactis) CBS2360 菌株、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22 菌株(a、his 4、leu 2、can 1) 和毕赤酵母属(Pichia)GTS115菌株(his4)作为宿主酵母。在本发明中，尤其地，毕赤 (Pichia)酵母和酵母属(Saccharomyces)酵母，特别是巴斯德毕赤酵(Pichiapastoris)和酿 酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是优选使用的。产生rHSA的重组细胞的制备、通过培养该重组细胞产生 rHSA和从培养物中分离和回收产生的rHSA都可以根据可以稍微改变 的已知方法进行。例如，产生rHSA细胞株的制备可以使用如下方法进 行其中使用天然HSA基因的方法(JP-A-58-56684 (EP-A-73646)、 JP-A-58-90515(EP-A_79739)和 JP-A-58-150517(EP-A_91527))、其中使用新 的人血清白蛋白基因的方法(JP-A-62-29985 和 JP-A_1_98486 (EP_A_206733))、 其中使用合成信号序列的方法(JP-A-1-240191 (EP-A-329127))、其中使用血 清白蛋白信号序列的方法(JP-A-2-167095 (EP-A-319641))、其中将重组质粒 引入染色体中的方法(JP-A-3-72889(EP-A_399455))、其中融合宿主的方法 (JP-A-3-53877(EP-A_409156))、其中在含有甲醇的培养基中产生突变 的方法、其 中使用突变体AOX2启动子的方法(JP-A-3-63598、JP-A-3-63599)、其中在枯草杆 菌(B.Subtilis)中表达 HSA 的方法(JP-A-62-25133 (EP-A-229712))、其中在酵母中 表达 HSA 的方法 Ρ-Α-60-41487(ΕΡ-Α_123544)、JP-A-63-39576 (EP-A-248657) 和JP-A-63-74493(EP-A_251744)和其中在毕赤酵母中表达HSA的方法 (JP-A-2-104290 (EP-A-3444S9))。在这些方法中，其中在含有甲醇的培养基中引起酵母突变的方法以如下方式进 行。通过将包含在AOX1启动子的控制下表达HSA的转录单位的质粒引入宿主的AOX1 基因区域，以常见的方式获得合适的宿主的转化体，所述宿主优选地为毕赤酵母，示例 为菌株GTS115(NRRL保藏号No.Y_15851)(参见JP-A 2-104290)。这一转化体在包含 甲醇的培养基中几乎不生长。因此，将这一转化体培养在包含甲醇的培养基中，以产生 突变，并且分离能够在该培养基中生长的菌株。甲醇在培养基中的浓度范围可以为例如 约0.0001至约5%。所述培养基可以是合成的或天然的。所述培养可以在例如约15至 40°C的温度下进行约1至1,000小时。产生rHSA的重组细胞的培养，即产生rHSA，可通过上述专利中公开的每种方 法进行，或者通过其中产生rHSA的重组酵母细胞和产物以高浓度通过分批进料培养(半 分批培养)获得的方法进行。所述分批进料培养是通过逐渐地提供高浓度葡萄糖以避免 抗重组细胞的基质抑制来进行的(JP-A-1-219561)。重组细胞的培养也可通过其中向培 养基中加入脂肪酸而提高rHSA产率的方法进行(JP-A-4-293495 (EP-A-504823)和美国 专利No.5,334,512)。用于分离和获取rHSA的方法可以包括例如通过加热处理灭活蛋白酶(JP-A-3-103188)，和通过使用阴离子交换剂、疏水性载体和活性碳中的至少一员分 离rHSA与着色组分抑制rHSA着色(JP-A-4-54198)。可以使用本领域通常使用的补充有具有10至26个碳原子的脂肪酸或其盐的培养 基作为用于培养重组酵母的培养基，并且可以在已知条件下进行培养重组酵母。所述培 养基可以是合成的或天然的，但优选地为液体培养基。例如，合适的合成培养基可以由 下述成分组成碳源，比如各种糖类；氮源，比如脲、铵盐、硝酸盐；微量营养素，比 如多种维生素、核苷酸；和无机盐，比如Mg、Ca、Fe、Na、K、Mn、Co禾Π Cu的。这 样的培养基的示例性实例是YNB液体培养基，其包括0.7%的酵母氮碱(Difco)和2%的 葡萄糖。有用的天然培养基的 示例性实例是YPD液体培养基，其包括的酵母提取物 (Difco)、2%的Bacto Peptone (Difco)和2%的葡萄糖。培养基的pH可以是中性、弱碱 性或弱酸性的。在甲基营养酵母(methylotrophicyeast)的情况下，所述培养基可以进一 步补充有约0.01至5%的量的甲醇。培养温度优选地为15至43°C，特别地为20至30°C。培养期为约1至1,000小 时。所述培养可以利用静置或震荡培养或在分批、半分批或连续培养搅动下培养而进 行。在主要培养之前的预培养优选地使用培养基例如YNB液体培养基或YPD液体培养 基进行。所述预培养可以在约30°C下进行10至100小时。在完成培养之后，通过已知的分离方法从培养滤液或酵母细胞中获取rHSA。rHSA的纯化可以利用通常已知的方法，比如各种分馏方法、吸收色谱、亲和色 谱、凝胶过滤、密度梯度离心和透析进行。优选的纯化方法的一个实例可以包括下述步 骤(1)至(7)(1)使用具有100,000至500,000和1,000至50,000的分级分子量的超滤膜超滤产 生人血清白蛋白的重组酵母细胞的培养上清液；(2)在50_70°C下，加热包含rHSA的级分30分钟至5小时；(3)用酸调节包含rHSA的级分的pH在pH 3-5 ；(4)用具有100,000至500,000的分级分子量的超滤膜超滤如此处理的产物；(5)在pH 3-5和盐浓度0.01-0.2M的条件下，用阳离子交换剂接触包含rHSA的 级分；并在pH 8-10和盐浓度0.2-0.5M的条件下洗脱产物；(6)在pH6_8和盐浓度0.01-0.5M的条件下，用用于疏水性层析的载体接触所述 洗脱液，并收集未吸附的级分；和(7)在pH6_8和盐浓度0.01-0.1M的条件下，用阴离子交换剂接触所述未吸附的 级分，并收集该未吸附的级分。上述步骤可以包括代替前述步骤(6)，而在pH 6-8和盐浓度1_3M的条件下， 用用于疏水性层析的载体接触所述洗脱液，然后在pH 6-8和盐浓度0.01-0.5M的条件下 洗脱产物的步骤；代替前述步骤(7)，而在pH6-8和盐浓度0.001-0.05M的条件下，用阴 离子交换剂接触所述未吸附的级分，然后在pH 6-8和盐浓度0.05-1M的条件下洗脱产物 的步骤。另外，所述步骤也可包括在前述步骤(5)和(6)之间、(6)和(7)之间或在(7) 之后，在pH 3-5和盐浓度0.5-3M的条件下盐析并收集沉淀的级分的步骤。rHSA的纯化步骤可以包含优选地在纯化步骤结束时的脱色步骤。所述脱色步 骤可以通过用具有特定配体的螯合树脂接触获得的粗rHSA来进行。优选地，所述螯合树脂的载体部分是具有疏水性质者，比如苯乙烯/二乙烯基苯共聚物和丙烯酸/甲基丙 烯酸共聚物。所述螯合树脂的配体部分的实例包括多元醇基团比如N-甲基葡糖胺，在 分子中具有多个亚氨基、氨基、亚乙基亚氨基等的多胺基团(包括多亚烷基多胺，比如 多亚乙基多胺)和硫脲基。方便地使用市售可获得的具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物 载体的那些，比如DIAION CRB02(配体N-甲基葡糖胺基团，由Mitsubishi Chemical Corporation 制造)、DIAION CR20 (配体-NH (CH2CH2NH) nH,由 Mitsubishi Chemical Corporation 制造)、LEWATIT TP (配体-NHCSNH2,由 Bayer Corporation 制造)禾口 AmberliteCG4000。 该螯合树脂处理的合适条件如下。pH 酸性或中性，优选pH3至9，更优选pH 4至7。处理时间一小时或更长，优选6小时或更长。离子强度50mmho或更低，优选1到IOmmho。混合比例0.1至IOOg,优选1至IOg (按湿量计)的树脂每250mg的rHSA。如此得到的rHSA，即通过进行步骤(1)_(7)、盐析步骤和进行螯合树脂处理从 重组酵母培养物获取并纯化的rHSA的着色度非常低。当将rHSA配制成250mg/ml的 rHSA溶液(25%溶液)时，A500nm/A280nm的比例为约0.001-0.005。螯合树脂处理 可以降低着色度至1/2-1/10。尤其，rHSA在约500nm吸收波长的着色度，即红色着色 度，通过螯合处理降低至1/3-1/10。在本发明中使用的rHSA是具有约67,000的分子量和4.6-5.0的等电点的均勻物 质。其由单独的单体组成，并且基本上不含二聚物、聚合物或分解产物。特别地，包括 二聚物、聚合物和分解产物的杂质的总量小于约0.01%。另外，在本发明中使用的rHSA 基本上不含来源于重组酵母的杂质，包括不同于rHSA的蛋白质和多糖。基于rHSA和 杂质总量的rHSA的纯度高于99.999999%，优选地高于99.9999999%。特别地，示例了 可以提供包含等于或少于lng/ml，优选等于或少于O.lng/ml的不同于rHSA的蛋白质的 25% rHSA溶液的纯化rHSA。类似地，还示例了可以提供包含等于或少于10ng/ml，优 选等于或少于lng/ml多糖的25% rHSA溶液的纯化rHSA。如本文使用的，“rHSA的 纯度”指在可以包括杂质的rHSA产物中rHSA的比例，所述杂质比如来源于产生rHSA 的重组酵母细胞的不同于rHSA的蛋白质和多糖。本发明的rHSA可以提供使用25% rHSA溶液测定的如下着色度A350/A280的比例为约0.01-0.05，A450/A280的比例为 约0.001-0.02，和A500/A280的比例为约0.001-0.005。结合到一个rHSA分子上的脂肪 酸分子的数量等于或小于1，优选地等于或小于0.1。根据本发明，rHSA可以是任何从通过基因操作而得到的重组酵母获得的那些， 包括市售可获得的产品。例如，可以优选地使用Medway 注射剂(Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Tokyo, Japan)。如本文使用的，术语“角膜结膜损伤”包括由下述因素引起的角膜和/或结膜 损伤致病因素比如干眼、各种角膜结膜炎、变态反应和微生物(例如病毒、细菌、真 菌等)的感染，化学因素比如化学品的细胞毒性和由于酸和碱引起的腐蚀，物理因素比 如眼球表面干燥、由于外源物质(例如隐形眼镜等)和热水等、眼科组合物中包含的防 腐剂(例如苯扎氯铵、氯代丁醇等)和眼科试剂(例如氨基糖苷类抗生素、非留体抗炎药物、IDU、匹马菌素等)引起的损伤；角膜外层缺损；角膜糜烂；角膜溃疡等。另外，所述角膜结膜损伤可以包括外科手术后的病症，所述外科手术比如角膜 移植术、屈光性外科手术包括屈光性角膜切削术(RK)、准分子激光屈光性角膜切削术 (PRK)、准分子激光原位角膜磨镶术(Iaserassociatedinsitukeratomileusis) (LASIK)、角膜 环植入外科手术(ICRS)、前房眼内透镜植入包括人工晶体植入术(phakicIOL)、翼状胬 肉外科手术、囊内白内障摘除术(ICCE)、囊外白内障摘除术(ECCE)、晶状体后囊切开 术(posterior capsultomy)、眼内透镜植入术、玻璃体切割术、小梁切开术、滤帘切除术、 玻璃体内植入术、切除异物和麦粒肿切除术，及由于玻璃体内注射和泪小点闭塞(punctal occlusion)引起的损伤。如本文使用的，术语“干眼”可以包括泪水缺乏性干眼和蒸发过强性干眼。特 别地，举例为干眼病症比如无泪、干眼症、舍格伦综合征、干性角膜结膜炎、史-约综 合征、眼天疱疮和睑缘炎。另外，术语“干眼”包括在前眼部手术后的干眼，比如白内 障手术和屈光性外科手术，和伴有过敏性结膜炎的干眼，以及比如VDT (视觉显示终端) 工人的眼泪减少症和由于例如空调的干燥房间引起的没有任何全身症状的眼泪减少症的 干眼类病症。如本文使用的，术语“治疗”指控制所述病症的任何方式，包括预防、治愈和 缓解所述病症，以及阻止或缓解所述病症的发展。本发明的药物组合物可以是剂型比如片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、胶囊、栓 齐U、注射制剂、软膏剂、眼用溶液(滴眼剂)等。特别优选的是可局部给药的眼科溶液 或滴眼剂。在本发明的组合物配制成眼科溶液的情况下，所述组合物可以包含如下量的 rHSA 约 1 至 1000mg/ml(0.1-100w/v% )，更优选约 10 至 1000mg/ml (l-100w/v% )， 特别地为约10至100mg/ml(l-10W/v% )。所述组合物可以进一步包含可药用稀释剂。如本文使用的，“可药用稀释剂”可以是用于本领域技术人员已知的眼科组合 物的任何稀释剂，例如水、生理盐水、人工泪液等。本发明的药物组合物可以进一步包 括通常用于眼科组合物的各种组分，比如稳定剂、灭菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、 pH调节剂、表面活性剂等。当所述组合物配制成眼科溶液或滴眼剂时，该组合物的pH优选地调节为5至 8。所述眼科溶液可以以每次给药约1至100 μ 1/眼睛，优选地约10至50 μ 1/眼睛，更 优选地约30-50 μ 1/眼睛的量给药。在另一个方面，本发明还提供rHSA在制备如上描述的本发明的药物组合物中的 用途。在另一方面，本发明提供 用于治疗角膜结膜损伤的方法，其包括向需要治疗角 膜结膜损伤的受试者给药有效量的rHSA。如本文使用的，术语“需要治疗角结膜损伤的 受试者”包括事实上患有角膜结膜损伤的患者和疑似患有这种损伤的患者。其不仅包括 已经事实上确定角膜结膜损伤的患者，而且包括疑似患有角膜结膜损伤的患者，以及处 于其中预期出现该病症的可能性高的患者，比如在接受角膜移植术之后的患者。在另一方面，本发明还提供用于治疗干眼的方法，其包括向需要治疗角干眼的 受试者给药有效量的rHSA。如本文使用的，术语“需要治疗干眼的受试者”包括患有干眼病症的患者和疑似患有干眼的患者。给药途经没有特别地限制，局部眼部给药是优 选的。在本发明的这些方法中，rHSA的“有效量”为预期治疗所需要的量，其可以根 据患者的症状、年龄、性别、体重、饮食、组合使用的其它药物和医学领域的技术人员 认可的各种因素选择最佳量。除了上述因素之外，该有效量也可以根据rHSA的种类或 活性变化。在本发明的这些方法中，所述药物组合物可以以约1至100 μ 1/眼睛、优选约 10至50 μ 1/眼睛、更优选约30至50 μ 1/眼睛的量给药，每天给药1至20次，更优选地 每天约1至10次，其并不意味着限制本发明的范围。本发明使用的药物组合物可以与不同于rHSA的药学活性化合物共同给药。术语 “共同给药”可以包括在给药本发明的药物组合物之前、同时和之后给药不同于rHSA的
药学活性成分。当所述不同于rHSA的药学活性化合物与本发明的组合物同时给药时， rHSA和其它活性成分可以一起配制在单一剂型中，或分别配制在不同的剂型中。例如， 人工泪液、多糖硫酸酯比如透明质酸和硫酸软骨素、环胞菌素、谷胱甘肽、黄素腺嘌呤 核苷酸钠、皮质类固醇、四环素、维生素A(视黄醇)及其衍生物比如维生素A酯(包括 视黄醇棕榈酸酯和视黄醇乙酸酯)和细胞生长因子比如肝细胞生长因子(HGF)、表皮生 长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子 (NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子仃0 1和10 -0)和角质形成细 胞生长因子(KGF)可以与本发明的药物组合物共同给药。通过如下所示的试验实施例进一步阐述本发明。所述试验实施例不应以任何方 式用于限制本申请的范围。试验实施例1兔子强制打开眼睑干眼模型试验方法使用Std: JW/CSK兔子。通过皮下注射乌拉坦(2g/kg，8ml/kg)将动物麻醉。 通过使用开睑器强制打开兔子的眼睑，并使用兔子固定器将动物以面朝下位置固定3小 时。在完成强制打开眼睑之后，通过静脉内给药过量的5%戊巴比妥处死动物，摘除眼 球。将50μ1的亚甲蓝溶液滴到摘除眼球的角膜表面，并静置1分钟。然后，将眼 球放入包含15ml生理盐水的容器中以冲洗亚甲蓝。用剃刀切除角膜，浸泡在丙酮/硫酸 钠溶液(100%丙酮9% Na2SO4水溶液=7 3)中一晚上，以从角膜中提取亚甲蓝进入 溶液中。通过使用Multskan Spectrum Thermo在660nm下测量光密度确定提取溶液中 亚甲蓝的含量。平均吸光度士标准误差显示在下表中。用平均吸光度(即亚甲蓝吸光 度)评价角膜损伤。根据如下标准评价各组的角膜损伤抑制率未处理组(组I)的平均亚甲蓝吸光度=100%角膜损伤抑制接受强制打开眼睑和给药生理盐水的组(组II)的平均亚甲蓝吸光度=0%角膜 损伤抑制根据下式计算试验组的角膜损伤抑制率
^(组II)-(试验组)
角膜损伤抑制率(％)=(组H)—(组丨)xIQO在上式中，(组I)、(组II)、和(试验组)表示各组的平均亚甲蓝吸光度。(试 验组)表示组III-VI的任一组。试验化合物的给药在开始强制打开眼睑之后，立即向动物的两只眼睛局部给药50 μ 1的生理盐水， 1、3或5w/V%&rHSA溶液或0.3%透明质酸钠(Hyalein 眼科溶液0.3%，Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Osaka, Japan)。对于1、3和5%rHSA溶液，用生理盐水稀释25%Medway 注射剂(包含25w/ v%&rHSA，Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, Tokyo, Japan),得到期望的浓度。试验组表 1
H处理ρ
10小时强制打开眼睑+没有处理5 (10只眼睛)
1 3小时强制打开眼睑+生理盐水10 (20只眼睛)
1 3小时强制打开眼睑+1% rHSA10 (20只眼睛)
1 3小时强制打开眼睑+3% rHSA10 (20只眼睛)
V3小时强制打开眼睑+5% rHSA10 (20只眼睛)
VI3小时强制打开眼睑+0.3%透明质酸钠10 (20只眼睛)结果在3小时强制打开眼睑之后，测量指示角膜损伤的亚甲蓝吸光度。将结果显示 在下表2中
基于表2的结果计算角膜损伤抑制率。表 权利要求
1.用于治疗干眼的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到 的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
2.用于治疗角膜结膜损伤的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵 母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述重组酵母是通过转化毕赤酵母属(Pichia) 或酵母属Maccharomyces)的酵母得到的。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
5.根据权利要求1或2的组合物，其中所述重组人血清白蛋白具有下述性质基于重组人血清白蛋白和来源于重组酵母细胞的杂质的总量计，重组人血清白蛋白 的纯度大于99.999%，所述杂质由具有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质和多 糖组成，和来源于重组酵母细胞的杂质的总量少于酶免疫测定(EIA)的检出限，所述杂质由具 有不同于重组人血清白蛋白的抗原性的蛋白质和多糖组成。
6.根据权利要求1或2的组合物，其用于局部眼部滴注。
7.根据权利要求1的组合物，其中干眼为泪水缺乏性干眼或蒸发过强性干眼。
8.根据权利要求1的组合物，其中干眼选自无泪、干眼症、舍格伦综合征、干性角膜 结膜炎、史-约综合征、眼天疱疮、眼手术后引起的干眼、伴有过敏性结膜炎的干眼、 包括VDT(视觉显示终端)工人的眼泪减少症和由于空调的干燥房间引起的没有任何全身 症状的眼泪减少症的干眼类病症。
9.根据权利要求7的组合物，其中干眼为蒸发过强性干眼。
10.根据权利要求2的组合物，其中所述角膜结膜损伤为由下列因素引起的角膜结膜 上皮缺损、角膜结膜糜烂或角膜结膜溃疡干眼、角膜结膜炎、变态反应和包括病毒、 细菌和真菌的微生物的感染、化学品的细胞毒性、化学因素、干眼症、由于包含在眼科 组合物中的防腐剂、包含在眼科组合物中的活性成分、眼科手术和眼部注射引起的损 伤。
11.通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白 在制备用于治疗干眼的药物组合物中的用途。
12.通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白 在制备用于治疗角膜结膜损伤的药物组合物中的用途。
13.用于治疗干眼的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过用人血清白蛋白 的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
14.用于治疗角膜结膜损伤的方法，其包括向需要其的患者给药有效量的通过用人血 清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
全文摘要
本发明提供用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的药物组合物，其包括通过用人血清白蛋白的基因转化酵母而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。另外，本发明提供用于治疗干眼和/或角膜结膜损伤的方法，其包括向需要治疗眼睛和/或角膜结膜损伤的受试者给药有效量的通过用人血清白蛋白的基因转化酵母菌而得到的重组酵母产生的重组人血清白蛋白。
文档编号A61K38/00GK102026648SQ20098011742
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者岛直子, 岸本中行, 田渕玲子, 真岛行彦 申请人:株式会社·R-技术上野
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