用于预防性治疗特应性皮炎的软化剂组合物的制作方法
专利名称：用于预防性治疗特应性皮炎的软化剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及特应性领域，以及与之相关的病变治疗领域。
技术背景
特应性被定义为对各种变应原，例如室尘、螨、花粉、兽毛等以症状方式(疾 病)反应的遗传性素因(hereditary predisposition)。被称为特应性的病变包括特应性皮炎 (AD)、变应性支气管哮喘和变应性鼻炎或者“花粉症”。
特应性皮炎(或者特应性湿疹)为常见的皮肤病，影响法国10-15%的婴儿，且 在过去的几十年里有所增加。
特应性皮炎为慢性病，其发展时发疹，间断地出现缓解期，在这期间损害总是 存在但是处于最小程度，基本上表现为干燥病(皮肤干燥)和瘙痒症。
皮肤发炎是发疹的特征，其表现为发炎迹象和症状，包括红色斑块(红斑)、水 疱、痂、渗出物和瘙痒(itch)。
疾病通常在3个月至2年的年龄间开始出现，但是甚至可以更早地从1个月开始 出现。其发展通常是良好的，在大多数情况下，在5至8岁时出现完全缓解。有可能在 青春期或者青少年时再现。在15-20%的情况下，该疾病可持续至成年。
也有可能朝着另一特应性病变发展。在儿童期存在AD增加了患哮喘的风险， 且在AD的出现率与哮喘的出现率间存在明显的相关性。受AD影响的儿童出现哮喘的 风险估计为30-40%。
出现食物过敏的风险(最常出现在3岁前)，或者出现变应性鼻炎(过些时候出 现)的风险根据研究的不同而有所变化。
有关特应性皮炎，存在显著的遗传素因(genetic predisposition)，如果父母之一受到感染，则出现疾病的风险为30-50%，如果父母均受到感染，则风险接近80%。遗 传素因包括很多基因，其编码表皮屏障作用的决定子，或者编码先天或适应性的免疫作 用物(immunity actor)。考虑到很多近期的调查研究，可以假设AD (或者甚至其它特应 性疾病)与表皮的屏障作用的原始异常有关，其导致对环境剂(变应原和微生物)增加的 渗透性，导致免疫激活和过敏症状。
表皮渗透性的异常表现为皮肤干燥病，增加的难以觉察的失水量，以及编码表 皮蛋白如丝聚蛋白(FLG)(参与表皮的屏障作用)的基因表现出多态性(Palmer，2006)。 法国的最新研究证实FLG基因的多态性与AD相关，相对危险性在3以上(Hubiche， 2007)。
特应性可被认为是与环境的变应原接触而引起的延迟的过分敏感反应。其通常 出现两个阶段。临床上不活跃的第一致敏阶段产生对皮肤特异的T淋巴细胞。来自环境 的变应原穿透受干燥病影响的皮肤而导致该致敏的发生。第二阶段特异的T淋巴细胞的 活化导致产生促炎性细胞因子。
总体上，特应性皮炎的外部体征起因于环境因素、药理学异常、皮肤的屏障作用的机能障碍或变更、免疫现象和遗传易感性之间的复杂相互作用。
在众多因素中，皮肤高反应性、对各种微生物不适当的免疫反应以及二次感染 似乎对于慢性病理学起作用。
皮肤菌群在有利于湿疹损伤发展的免疫激活的发生和/或维持中的作用逐渐为 人所知。与受特应性皮炎感染的患者的某些免疫缺陷相关的皮肤的屏障作用的改变，导 致金黄色酿脓葡萄球菌Staphylococcus aureus)的移生，金黄色酿脓葡萄球菌移生在90% 的具有AD的患者的皮肤上，甚至在疾病的进行性出疹之外。(CurrentOpinionteAllergy and Clinical Immunol.2007, 7, 413)。
疾病的严重性一方面与葡萄球菌移生密度之间存在关联，另一方面与针对葡 萄球菌毒素的特应性IgE的阳性检出率(positivity frequency)之间存在关联(J.Allergy Clin.Immunol.2006，117，1141 ； Am.J.Clin.Dermatol., 2006，7，273 ； Clin.Rev.Allergy Immunol.，2007，33，167 ； Current Opinion Allergy and Clinical Immunol.2004, 4，373)。
这些事实引起如下猜想金色葡萄球菌对于引起特应性皮炎和可能的变应性致 敏的外部皮肤体征的局部免疫活化发展起作用。
除搔抓外，很多因素通过改变初级皮肤防御系统并首先改变角质层的类脂组合 物，而促进金黄色酿脓葡萄球菌的移生。该皮肤屏障作用的改变因而导致葡萄球菌的移 生，并导致皮肤失水量的增加，引发干燥病、刺激、搔痒，并因此产生一种病理生理学 上的恶性循环。
特应性皮炎的治疗管理可被认为处于各种水平，主要为症状水平但也有预防水 平。如今对该疾病没有根治疗法。
除了逐出尽可能所需的确定的变应原外，皮肤的保湿作为恢复或维持其屏障作 用的方法可加入通过局部皮质疗法(其为该疾病标准疗法)而对出疹进行的症状治疗中。 其它局部非类固醇类抗炎剂(钙调神经磷酸酶(calcineurin)的显著抑制剂)也可用于治疗 出疹。最后，光线疗法、口服免疫抑制剂或者其它广泛的系统疗法被保留用于重症。
但是，使用肾上腺皮质激素、抗炎剂和/或免疫抑制剂，即使经由局部途径， 特别是对于婴儿或小孩而言并不是件小事，其具有不良副作用，且仅为症状治疗。
另一方面，使用肾上腺皮质激素导致存在恐惧症，这不利于管理该疾病也不符 合患者的要求(他们通常是贫困的)。
最后，金黄色酿脓葡萄球菌可诱导对肾上腺皮质激素的抵抗(Clin.RevAllergy Immunol.2007 33 167)。
因此需要且强烈需求治疗替代方案，更具体地需要且强烈需求预防性治疗。这 些治疗的目的在于降低在感染特应性皮炎的患者中观察到的湿疹出疹的出现率和/或强 度。该方法为根据WHO定义的三级预防方案，因为其倾向于避免已经存在的疾病(特 应性皮炎)的并发症(炎性出疹)。
申请W02008048076公开了使用葡萄糖胺或者其衍生物的一种用于治疗特应性 皮炎。
申请W020070232^公开了使用益生菌并结合益生元用于治疗儿童的特应性皮 炎。
目前，已经注意到令人非常惊奇和意想不到的是，水包油或油包水乳液形式的 丙三醇、凡士林 和液体石蜡的组合能够预防特应性皮炎。
发明人已经显示该组合对于金黄色酿脓葡萄球菌粘附于培养的角质形成细胞的 抑制效果。丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合因此能够预防金黄色酿脓葡萄球菌在特应 性患者中的传染作用，以及其通过生成抑制金黄色酿脓葡萄球菌在皮肤上移生的特应性 IgE而维持炎性反应的作用。
此外，发明人已经显示这种组合恢复了皮肤的保护和功能屏障作用。对此，发 明人使用了诱导性皮肤脱水的活体外皮肤模型。此外，它们遵从表皮标记的表达和丝氨 酸蛋白酶活性。发明内容
因此本发明的目的为一种用于局部用途的组合物，其包含水包油或油包水乳液 形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合作为活性成分，所述组合物用于预防特应性皮 炎。
优选地，预防为初始型。
在本发明中，术语“预防”或“预防性治疗”是指避免疾病、病症、或一个或 多个体征和/或症状的出现。
在本发明中，术语“初级预防”或“初级预防性治疗”是指通过在特应性的第 一临床体征之前(即从发病起)采取行动，预防特应性疾病(特应性皮炎和/或变应性支 气管哮喘和/或变应性鼻炎，通称“花粉症”)和/或变应性致敏的发生。
在本发明中，水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合被 称为“活性组合”。
有利地，丙三醇、凡士林和液体石蜡具有根据“欧洲药典”(第6版)所记载和 管理的标准。
有利地，活性组合的凡士林具有35至70°C，优选51至57°C，更优选大约M°C 的滴点。根据在“欧洲药典”(第6版)中所述的2.2.17方法测量滴点。
有利地，活性组合的凡士林具有175至1951/10毫米，优选大约1851/10毫米的 稠度(在25 °C下锥体针入度(cone penetration))。
有利地，活性组合的凡士林具有在100°C下4至^^1优选在100°C下大约4. 的粘度。
在根据本发明的组合物中，活性组合的存在比例以组合物的总重量计为10-50 重量％，优选20-30重量丙三醇浓度以组合物的总重量计为5-30重量％，优选10-20 重量％，更优选大约15重量％，凡士林浓度以组合物的总重量计为3-20重量％，优选 5-10重量％，更优选大约8重量％，以及液体石蜡浓度以组合物的总重量计为0.5-5重 量％，优选1-3重量％，更优选大约2重量％。
在水相中，基于组合物的总重量包含30-80重量％的水。
有利地，根据本发明的组合物包含以组合物的总重量计，大约15重量％的丙三 醇、大约8重量％的凡士林和大约2重量％的液体石蜡。
根据本发明的皮肤病学组合物进一步包含常规皮肤病学可相容赋形剂。
根据本发明的皮肤病学组合物可以制备成油包水(W/0)或水包油(0/W)乳 液，制备成多重乳液如水包油包水乳液(W/0/W)或油包水包油乳液(0/W/0)，或者进 一步制备成水分散体或脂分散体、凝胶或气溶胶。
皮肤病学上相容的赋形剂可以为本领域技术人员公知的任何赋形剂，从而获得 以乳膏、洗剂、凝胶、软膏、乳液、微乳剂、喷雾剂等形式局部施用的组合物。
根据本发明的组合物可特别地包含添加剂和制剂助剂，如乳化剂、增稠剂、胶 凝剂、固水剂(water fixing iigent)、铺展剂、稳定剂、染料、香料和防腐剂。
合适的乳化剂包括硬脂酸、三乙醇胺(trolamine)、PEG_40_硬脂酸酯。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约5重量％的乳化 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计1-5重量％，优选大约3 重量％的硬脂酸。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0-2重量％，优选大约0.5重量％的三乙醇胺。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0-2重量％，优选大约 0.5重量％的PEG-40-硬脂酸酯。
合适的增稠剂包括甘油单硬脂酸酯、PEG。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约5重量％的增稠 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计2-10重量％，优选大约 5重量％的甘油单硬脂酸酯。
合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约0.1重量％的防腐 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0.05-1重量％，优选大约0.1重量％的对羟基苯甲酸丙酯。
合适的铺展剂包括聚二甲基硅氧烷(dimethicone)、聚二甲基环硅氧烷。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约2重量％的铺展 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0.2-2重量％，优选大约0.5重量％的聚二甲基硅氧烷。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计1-3重量％，优选大约 2.5重量％的聚二甲基环硅氧烷。
合适的固水剂包括聚乙二醇，优选聚乙二醇600。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约8重量％的固水 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计2-10重量％，优选大约5重量％的聚乙二醇。
用于乳液的水相的水可以为蒸馏水或者具有美肤性能的温泉水。
有利地，根据本发明的组合物包含
-大约15%的丙三醇，
-大约8%的凡士林，
-大约2%的液体石蜡，以及作为赋形剂的如下组分
-大约1-5%的硬脂酸，
-大约2-10%的甘油单硬脂酸酯，
-大约1-3%的聚二甲基环硅氧烷，
-大约0.2-2%的聚二甲基硅氧烷，
-大约2-10%的聚乙二醇600，
-大约0-2%的三乙醇胺，
-大约0.05-1%的对羟基苯甲酸丙酯，
-直至100%的水。
本发明的目的还在于根据本发明的组合物用于制备旨在预防特应性皮炎的药物 的用途。
具体实施方式
通过以下实施例阐明本发明。
实施例
实施例1 制剂
组合物A
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-0.5克的三乙醇胺，
-以及作为赋形剂的硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、聚二甲基环硅氧烷、聚二甲基硅 氧烷、聚乙二醇(PEG)600、对羟基苯甲酸丙酯，
-直至IOOg的水。
组合物A'
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-1.5克的硬脂酸，
-5克的甘油单硬脂酸酯，
-1.5克的聚二甲基环硅氧烷，
-0.5克的聚二甲基硅氧烷，
-5克的聚乙二醇600，
-0.15克的三乙醇胺，
-0.1克的对羟基苯甲酸丙酯，
-直至IOOg的水。
组合物B
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-0.5克的PEG-40-硬脂酸酯，
-以及作为赋形剂的硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、聚二甲基环硅氧烷、聚二甲基硅 氧烷、聚乙二醇(PEG) 600、氯甲酚，
-直至IOOg的水。
组合物B'
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-3克的硬脂酸，
-5克的甘油单硬脂酸酯，
-2克的聚二甲基环硅氧烷，
-0.5克的聚二甲基硅氧烷，
-0.1克的三乙醇胺，
-3克的聚乙二醇600，
-0.5克的PEG-40-硬脂酸酯，
-0.075克的氯甲酚，
-直至IOOg的水。
实施例2 细胞毒性试验
M
试验的原理基于四唑鐺盐“3，3_[1[(苯基氨基)羰基]-3_4四唑鐺钠双甲 氧基-6-硝基)]苯磺酸水合物”(即XTT)酶转化为有色产品，甲臜(formazan)。
在电子耦合剂、辅酶Q的存在下，XTT通过活细胞的线粒体脱氢酶而被还原为 黄色/橙色水溶性化合物甲臜(其可通过分光光度法在450纳米下进行测定)。
用产品进行治疗
用IO5细胞/毫升播种96-孔微板，在孵育M小时后，除去培养基，并用PBS 冲洗微板。向微板的每个孔中加入100微升测试产品的不同稀释物。在相同条件下制备 无任何产品的对照样。
将微板置于5% CO2下，在37°C孵育2小时。
揭露细胞毒性
在孵育后，用PBS洗涤微板两次。接着，在96-孔板的每个孔中加入100微升 XTT (1毫克/毫升)/辅酶Q (0.2毫克/毫升)混合物。
在孵育3小时后，向每个孔中加入100微升10%的SDS溶液。
采用分光光度计POLARstar (BMG，法国)，在450纳米处进行光密度的瞬间读数。
结果表示
测量的光密度与存活细胞总数(viablecellpopulation)成正比。
当光密度小于对照批次的光密度时，因此我们有可能通过该试验，从对应于对 照批次的光密度分析细胞毒性
存活率％ (% viability)=(治疗的 OD-对比 OD) / 对比 OD X 10
如果存活率百分数<30%，则产品被认为是细胞毒性的。
进行8次内操作试验。
MM
取决于产品的非细胞毒性的程度，所选用于粘附试验的浓度如下
-组合物A: 6%, 3%, 1.5%, 0.8%禾口 0.4%
-Atopiclair0.8%、0.4%, 0.2%, 0.1%禾口 0.05%
-Physiogel 6%、3%, 1.5%, 0.8%禾口 0.4%
-组合物B: 3%, 1.5%, 0.8%, 0.4% 禾口 0.2%
实施例3 粘附试骑
M
用含氚腺嘌呤(σ)标记细菌，并通过评价放射性水平确定粘附于角质形成细胞 表面的细菌比例。
用含氚腺嘌呤标记细菌
在充足培养基中，在30 μ Ci含氚腺嘌呤的存在下进行细菌的标记。在37°C下孵 育18小时后，在PBS中洗涤微生物3遍以除去非掺入的放射性。
在维持介质中调节悬浮液至2X IO8微生物/毫升。
粘附抑制效果
在产品的每个试验稀释液的存在下，在细胞层的表面沉积500微升标记的细 菌。
在孵育(37°C，5%C02)2小时后，用PBS洗涤3遍。
细胞的溶解
在37°C下用500微升0.5N的氢氧化钠溶液(含0.1 %的十二烷基硫酸钠)对粘附 于角质形成细胞的细菌溶解18小时。
对每个孔的溶解产物取样并置于计数管中。在每个管中加入2毫升液体闪烁 体。
结果表示
用β计数(其表示放射性水平，以cpm(计数/分钟)计)进行读数。
-根据下式计算粘附抑制百分数
抑制％ =((试验 cpm-对比 cpm) / 对比 cpm) X 100
如果粘附抑制百分数的值<-30%，则其是显著的。
一式四份地进行测试。
Mit
-在6%和3 %下孵育2小时后，组合物A显著地抑制了金黄色酿脓葡萄球菌粘 附于角质形成细胞。
-在6%但并非3%下孵育2小时后，Physiogel产品显著地抑制了金黄色酿脓葡萄球菌粘附于角质形成细胞。
-Atopiclair产品对金黄色酿脓葡萄球菌粘附于角质形成细胞没有任何影响。
-在组合物B的存在下，金黄色酿脓葡萄球菌对角质形成细胞的粘附异常地增 加。
实施例4 对诱导件皮肤脱水的调整件的分析
我们在此通过使用诱导性皮肤脱水的活体外皮肤模型，评价了组合物A的增湿 活性以及后续对皮肤屏障作用的改进。
我们通过定量PCR和免疫组织化学，观察了微分分子表皮标记的表达。
我们还通过原位酶谱法追踪了丝氨酸蛋白酶的活性，并通过Western免疫印迹法 (Western blotting)追踪了角层桥粒蛋白(corneodesmosomal protein)的降解。
利用荧光探针分析皮肤屏障的作用。
装置和方法
1、组织模型
1、皮肤移植物的制备
实验室从整形外科(乳房缩小)的操作废料中回收皮肤样品。使用这些样品进 入法国高等教育和研究部规定的“Pierre Fabre组的研究方案所需的人体元件的保存和制 备活动的声明 ” ("the declaration of an activity for preserving and preparing elements of the human body for the needs of a research program of the Pierre Fabre group ”)的范围。
在10PBS浴中洗涤这些样品，然后冲切成直径为2厘米的盘状。将皮肤移植物 展开在Petri盘中的网格上，并将1厘米直径的环密封在皮肤上以限定治疗区域。
2、模型动力学
对于诱导性脱水模型，在无任何盖子的盘中，在细胞培养超净台下干燥皮肤2 小时，然后将皮肤置于保温箱(oven)中，在存在或不存在任何活性组合的情况下局部治 疗2小时。脱水应激的阴性对比样在封闭的Petri盘中经历相同的动力学。
3、用于分析的样品
在治疗后，取样2个直径为6毫米的活组织用以分析RNA表达，以及取样一个 包括在Tissue Tek(Sakura Finetek)树脂团中的直径为4毫米的活组织用于组织学。为 分析蛋白，将皮肤在60°C水浴的热冲击中暴露5分钟，然后在4°C中暴露2分钟以分离表 皮和真皮。
在液氮中冷却活组织和表皮，并存储在-80°C下以待分析。
II.通过定量PCR分析转录组(transcriptome)
在之前用液氮冷却的研钵中研磨皮肤活组织，根据提供者的推荐利用RNeasy 试剂盒(QIAGEN)提取 RNA。然后用 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)在 RNA 6000 Nano LabChip 切片上测定 RNA。采用 Access RT-PCR Core Reagents 试剂盒 (Promega)，使用寡dT引物，通过进行酶逆转录反应，自1微克RNA获得cDNA。根 据40个循环步骤(包括在95°C下变性(15秒)和在60°C下伸长(1毫米))，通过在配 备 PCRiQ SYBR Green Super Mix 试剂盒(Biorad)的荧光温度循环器 IClycler iQ (Biorad)上定量的PCR分析基因表达水平。利用iCycler软件观察在一个接一个循环中 PCR产品的积聚(正比于荧光发射6YBR Green intercalant))。
iClycler版本3.1分析软件传送Ct (循环阈值)的原始值开始cDNA放大的循环。利用程序Genorm版本3.4 (其能够从各样品中选择最稳定的参考基因)平行分析数 个参考基因的表达。然后使用该基因作为对比，通过计算Δ Ct=感兴趣的基因Ct-对比 基因Ct来归一化结果。
然后计算每个治疗相对于对应的对比条件的诱导因子(IF)。IF = 2_mct，其中 Δ Δ CT =处理的Δ CT-对比Δ CTo对于获自5个不同个体的五个试验评价mRNA的表 达2次。当相对于对比样的诱导因子在2以上时，认为基因表达受到诱导，但其在0.5以 下时，认为表达被抑制。通过用下式计算抑制百分数来评价在模型中引起的活性成分对 应激反应的影响
应激反应抑制％ = 100*[(应激的IF-无应激的对比IF)-(治疗的IF-无应激的对 比IF) ]/[(应激的IF-无应激的IF)]
与研究模型相比，“无应激的对比”条件对应于无干燥的对比；“应激的”条 件对应于已经干燥2小时且在对比条件下(即无任何局部治疗)处理另外2小时的皮肤活 组织；最后“治疗的”条件为已经干燥2小时且接着用软化剂局部治疗2小时的皮肤。
III.通过Western免疫印迹法分析蛋白表达
在用液氮冷却的研钵中研磨治疗的表皮，在溶解缓冲液ROPA(Tris HCl pH8 50mM ； NaCl 150mM ； Triton X 100 IX ；脱氧胆酸钠(Na+desoxycholate) 1 % ； SDS 0.1% ； EDTA 5mM ； DTT IOOmM ；蛋白酶抑制剂的混合物(参考P8340，SIGMA)中提取蛋白。
然后利用DC-DC蛋白测定法(Biorad)测定蛋白，并利用Western免疫印迹 法分析蛋白。对于每个条件，将25至40微克的总蛋白沉积在含7.5%聚丙烯酰胺的 Tris-Glycine凝胶上。利用Mini Protean II系统(Biorad)，通过电泳法分离蛋白混合物， 在PVDF膜(Hybond-Ρ，Amersham)上转移蛋白。通过特定的抗体和ECL+试剂盒 (Amersham)揭露感兴趣的蛋白。在相对于β-肌动蛋白(参比蛋白)归一化后，通过软 件Image Master TotalLab版本1.11 (Amersham)计算蛋白的量和降解形式的比例。
IV.组织学技术
采用Cryotome (Leica CM 3050s)将皮肤活组织切成厚度为5微米的切块，并沉积 在观察载玻片Mtarfrost )上。
1、免疫组织化学
在20°C下采用丙酮固定冷冻切块(CTyocut)IO分钟，然后在用免疫化学标记分析 之前用PBS进行再水合。在固定和再水合之后，采用3% BSA溶液使皮肤切块饱和， 并用针对感兴趣的蛋白的初级抗体将其孵育1小时。在第二阶段，用与Alexa-488或 Alexa-555荧光染料结合的第二抗体将它们孵育1小时，最后将其固定在包含DAPI的 Mowiol中用于标记细胞核。
2、原位酶谱法
在_20°C下在丙酮中固定10分钟后，在洗涤液(在水中的Tween20)中冲洗 切块，并用包含感兴趣的酶的特定作用物结合荧光团(辅助的)的溶液在37°C下孵育2小 时。当活化酶时，荧光团被分开，释放荧光信号，这可在显微镜下观察到。然后在落射 荧光显微镜(NikonEclipse 50i)下或者在反相的同焦显微镜Zeiss Axiovert 100下观察标记的载玻片。
3、荧光探针
在脱水治疗后，采用在HBSS缓冲液中ImM的荧光探针萤光黄羧基-酰胼二 锂盐(Invitrogen)，在37°C下在保温箱中进一步孵育皮肤移植物1小时。然后在HBSS 浴中冲洗皮肤1分钟，接着取样直径为4毫米的活组织，使其包括在Tissue TekR 树脂 MakuraFinetek) (Matsuki等人，1998)中。其后切开皮肤，用DAPI标记细胞核，在如上 所述的荧光显微镜下采用450纳米波长观察载玻片。
结果
1、由于诱导干燥的屏障作用失效模型
1、采用荧光探针测量皮肤渗透性
第一分析的组成为研究皮肤屏障作用中的基本功能参数表皮上层的渗透性。 在干燥实验后利用荧光探针(萤光黄)的皮肤孵育能够表征皮肤渗透性的调节。在对比条 件下，标记非常低和浅，探针通过角质层穿透得并不很多，且在冲洗过程中被除去。在 干燥2小时后，在角质层的较深层可观察到标记。干燥使得皮肤更具有渗透性，其屏障 作用被破坏。在干燥两小时后用组合物A进行局部治疗恢复了 SC相对于探针的不渗透 性，标记再次变得低和浅，与在对比条件下的类似。由此可以得出结论增湿治疗对于 干燥皮肤以及对于皮肤屏障作用具有修复效果，这可在组织模型上观察到。
2、对转录组和蛋白质组的调整性的影响
在干燥模型的不同应激或治疗条件下，通过定量PCR测量潜在地涉及表皮屏障 作用的内环境平衡(homeostasia)的不同基因的表达。通过免疫组织化学分析给出显示就 定位而言重新组织某些蛋白表达(例如关闭连接)的可能性。通过Western免疫印迹法分 析角层桥粒蛋白的降解。
将通过这些不同方法研究的目标根据其生理学作用组合在一起(参见表1)。研 究的目的是观察可观察的应激反应和由于组合物A的局部施用带来的对应激效果的修 正。
根据已完成的工作，还有可能显示出某些目标的不同调整水平。因此，我们能 够注意到脱屑的酶没有在转录水平，而是更特别地在其活性水平被调整(参照结果3)。
表1 :在干燥模型中研究的目标和药理反应的汇总
Y =在模型中目标反应；Y =是
X=在模型中目标不反应N =否
权利要求
1.一种用于局部用途的组合物，其包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林 和液体石蜡的组合作为活性成分，所述组合物用于预防特应性皮炎。
2.根据权利要求1所述的组合物，其用于初级预防特应性皮炎。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述凡士林具有35至70°C的滴点。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述凡士林具有51至57°C，特别是54°C的滴点ο
5.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其中所述凡士林具有175至1951/10毫米 的稠度(在25 °C下的锥体针入度)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述凡士林具有大约1851/10毫米的稠度(在 25°C下的锥体针入度)。
7.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其中所述凡士林在100°C下具有4至5cSt 的粘度。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述凡士林在100°C下具有大约4.8cSt的粘度。
9.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其包含大约15%的丙三醇、大约8%的凡 士林和大约2%的液体石蜡。
10.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其包含选自硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、 聚二甲基环硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇600、三乙醇胺、对羟基苯甲酸丙酯、蒸 馏水的一种或多种赋形剂。
11.一种包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合作为活性 成分的组合物用于制备旨在预防特应性皮炎的药物的用途。
12.如权利要求3至10中所述的组合物在制备旨在预防特应性皮炎的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于局部用途的组合物，其包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合作为活性成分，所述组合物用于预防特应性皮炎。
文档编号A61K31/01GK102026631SQ200980117468
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月18日 优先权日2008年5月16日
发明者D·库斯图, H·杜普兰 申请人:皮埃尔·法布尔皮肤化妆品公司
技术领域：
本发明涉及特应性领域，以及与之相关的病变治疗领域。
技术背景
特应性被定义为对各种变应原，例如室尘、螨、花粉、兽毛等以症状方式(疾 病)反应的遗传性素因(hereditary predisposition)。被称为特应性的病变包括特应性皮炎 (AD)、变应性支气管哮喘和变应性鼻炎或者“花粉症”。
特应性皮炎(或者特应性湿疹)为常见的皮肤病，影响法国10-15%的婴儿，且 在过去的几十年里有所增加。
特应性皮炎为慢性病，其发展时发疹，间断地出现缓解期，在这期间损害总是 存在但是处于最小程度，基本上表现为干燥病(皮肤干燥)和瘙痒症。
皮肤发炎是发疹的特征，其表现为发炎迹象和症状，包括红色斑块(红斑)、水 疱、痂、渗出物和瘙痒(itch)。
疾病通常在3个月至2年的年龄间开始出现，但是甚至可以更早地从1个月开始 出现。其发展通常是良好的，在大多数情况下，在5至8岁时出现完全缓解。有可能在 青春期或者青少年时再现。在15-20%的情况下，该疾病可持续至成年。
也有可能朝着另一特应性病变发展。在儿童期存在AD增加了患哮喘的风险， 且在AD的出现率与哮喘的出现率间存在明显的相关性。受AD影响的儿童出现哮喘的 风险估计为30-40%。
出现食物过敏的风险(最常出现在3岁前)，或者出现变应性鼻炎(过些时候出 现)的风险根据研究的不同而有所变化。
有关特应性皮炎，存在显著的遗传素因(genetic predisposition)，如果父母之一受到感染，则出现疾病的风险为30-50%，如果父母均受到感染，则风险接近80%。遗 传素因包括很多基因，其编码表皮屏障作用的决定子，或者编码先天或适应性的免疫作 用物(immunity actor)。考虑到很多近期的调查研究，可以假设AD (或者甚至其它特应 性疾病)与表皮的屏障作用的原始异常有关，其导致对环境剂(变应原和微生物)增加的 渗透性，导致免疫激活和过敏症状。
表皮渗透性的异常表现为皮肤干燥病，增加的难以觉察的失水量，以及编码表 皮蛋白如丝聚蛋白(FLG)(参与表皮的屏障作用)的基因表现出多态性(Palmer，2006)。 法国的最新研究证实FLG基因的多态性与AD相关，相对危险性在3以上(Hubiche， 2007)。
特应性可被认为是与环境的变应原接触而引起的延迟的过分敏感反应。其通常 出现两个阶段。临床上不活跃的第一致敏阶段产生对皮肤特异的T淋巴细胞。来自环境 的变应原穿透受干燥病影响的皮肤而导致该致敏的发生。第二阶段特异的T淋巴细胞的 活化导致产生促炎性细胞因子。
总体上，特应性皮炎的外部体征起因于环境因素、药理学异常、皮肤的屏障作用的机能障碍或变更、免疫现象和遗传易感性之间的复杂相互作用。
在众多因素中，皮肤高反应性、对各种微生物不适当的免疫反应以及二次感染 似乎对于慢性病理学起作用。
皮肤菌群在有利于湿疹损伤发展的免疫激活的发生和/或维持中的作用逐渐为 人所知。与受特应性皮炎感染的患者的某些免疫缺陷相关的皮肤的屏障作用的改变，导 致金黄色酿脓葡萄球菌Staphylococcus aureus)的移生，金黄色酿脓葡萄球菌移生在90% 的具有AD的患者的皮肤上，甚至在疾病的进行性出疹之外。(CurrentOpinionteAllergy and Clinical Immunol.2007, 7, 413)。
疾病的严重性一方面与葡萄球菌移生密度之间存在关联，另一方面与针对葡 萄球菌毒素的特应性IgE的阳性检出率(positivity frequency)之间存在关联(J.Allergy Clin.Immunol.2006，117，1141 ； Am.J.Clin.Dermatol., 2006，7，273 ； Clin.Rev.Allergy Immunol.，2007，33，167 ； Current Opinion Allergy and Clinical Immunol.2004, 4，373)。
这些事实引起如下猜想金色葡萄球菌对于引起特应性皮炎和可能的变应性致 敏的外部皮肤体征的局部免疫活化发展起作用。
除搔抓外，很多因素通过改变初级皮肤防御系统并首先改变角质层的类脂组合 物，而促进金黄色酿脓葡萄球菌的移生。该皮肤屏障作用的改变因而导致葡萄球菌的移 生，并导致皮肤失水量的增加，引发干燥病、刺激、搔痒，并因此产生一种病理生理学 上的恶性循环。
特应性皮炎的治疗管理可被认为处于各种水平，主要为症状水平但也有预防水 平。如今对该疾病没有根治疗法。
除了逐出尽可能所需的确定的变应原外，皮肤的保湿作为恢复或维持其屏障作 用的方法可加入通过局部皮质疗法(其为该疾病标准疗法)而对出疹进行的症状治疗中。 其它局部非类固醇类抗炎剂(钙调神经磷酸酶(calcineurin)的显著抑制剂)也可用于治疗 出疹。最后，光线疗法、口服免疫抑制剂或者其它广泛的系统疗法被保留用于重症。
但是，使用肾上腺皮质激素、抗炎剂和/或免疫抑制剂，即使经由局部途径， 特别是对于婴儿或小孩而言并不是件小事，其具有不良副作用，且仅为症状治疗。
另一方面，使用肾上腺皮质激素导致存在恐惧症，这不利于管理该疾病也不符 合患者的要求(他们通常是贫困的)。
最后，金黄色酿脓葡萄球菌可诱导对肾上腺皮质激素的抵抗(Clin.RevAllergy Immunol.2007 33 167)。
因此需要且强烈需求治疗替代方案，更具体地需要且强烈需求预防性治疗。这 些治疗的目的在于降低在感染特应性皮炎的患者中观察到的湿疹出疹的出现率和/或强 度。该方法为根据WHO定义的三级预防方案，因为其倾向于避免已经存在的疾病(特 应性皮炎)的并发症(炎性出疹)。
申请W02008048076公开了使用葡萄糖胺或者其衍生物的一种用于治疗特应性 皮炎。
申请W020070232^公开了使用益生菌并结合益生元用于治疗儿童的特应性皮 炎。
目前，已经注意到令人非常惊奇和意想不到的是，水包油或油包水乳液形式的 丙三醇、凡士林 和液体石蜡的组合能够预防特应性皮炎。
发明人已经显示该组合对于金黄色酿脓葡萄球菌粘附于培养的角质形成细胞的 抑制效果。丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合因此能够预防金黄色酿脓葡萄球菌在特应 性患者中的传染作用，以及其通过生成抑制金黄色酿脓葡萄球菌在皮肤上移生的特应性 IgE而维持炎性反应的作用。
此外，发明人已经显示这种组合恢复了皮肤的保护和功能屏障作用。对此，发 明人使用了诱导性皮肤脱水的活体外皮肤模型。此外，它们遵从表皮标记的表达和丝氨 酸蛋白酶活性。发明内容
因此本发明的目的为一种用于局部用途的组合物，其包含水包油或油包水乳液 形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合作为活性成分，所述组合物用于预防特应性皮 炎。
优选地，预防为初始型。
在本发明中，术语“预防”或“预防性治疗”是指避免疾病、病症、或一个或 多个体征和/或症状的出现。
在本发明中，术语“初级预防”或“初级预防性治疗”是指通过在特应性的第 一临床体征之前(即从发病起)采取行动，预防特应性疾病(特应性皮炎和/或变应性支 气管哮喘和/或变应性鼻炎，通称“花粉症”)和/或变应性致敏的发生。
在本发明中，水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合被 称为“活性组合”。
有利地，丙三醇、凡士林和液体石蜡具有根据“欧洲药典”(第6版)所记载和 管理的标准。
有利地，活性组合的凡士林具有35至70°C，优选51至57°C，更优选大约M°C 的滴点。根据在“欧洲药典”(第6版)中所述的2.2.17方法测量滴点。
有利地，活性组合的凡士林具有175至1951/10毫米，优选大约1851/10毫米的 稠度(在25 °C下锥体针入度(cone penetration))。
有利地，活性组合的凡士林具有在100°C下4至^^1优选在100°C下大约4. 的粘度。
在根据本发明的组合物中，活性组合的存在比例以组合物的总重量计为10-50 重量％，优选20-30重量丙三醇浓度以组合物的总重量计为5-30重量％，优选10-20 重量％，更优选大约15重量％，凡士林浓度以组合物的总重量计为3-20重量％，优选 5-10重量％，更优选大约8重量％，以及液体石蜡浓度以组合物的总重量计为0.5-5重 量％，优选1-3重量％，更优选大约2重量％。
在水相中，基于组合物的总重量包含30-80重量％的水。
有利地，根据本发明的组合物包含以组合物的总重量计，大约15重量％的丙三 醇、大约8重量％的凡士林和大约2重量％的液体石蜡。
根据本发明的皮肤病学组合物进一步包含常规皮肤病学可相容赋形剂。
根据本发明的皮肤病学组合物可以制备成油包水(W/0)或水包油(0/W)乳 液，制备成多重乳液如水包油包水乳液(W/0/W)或油包水包油乳液(0/W/0)，或者进 一步制备成水分散体或脂分散体、凝胶或气溶胶。
皮肤病学上相容的赋形剂可以为本领域技术人员公知的任何赋形剂，从而获得 以乳膏、洗剂、凝胶、软膏、乳液、微乳剂、喷雾剂等形式局部施用的组合物。
根据本发明的组合物可特别地包含添加剂和制剂助剂，如乳化剂、增稠剂、胶 凝剂、固水剂(water fixing iigent)、铺展剂、稳定剂、染料、香料和防腐剂。
合适的乳化剂包括硬脂酸、三乙醇胺(trolamine)、PEG_40_硬脂酸酯。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约5重量％的乳化 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计1-5重量％，优选大约3 重量％的硬脂酸。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0-2重量％，优选大约0.5重量％的三乙醇胺。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0-2重量％，优选大约 0.5重量％的PEG-40-硬脂酸酯。
合适的增稠剂包括甘油单硬脂酸酯、PEG。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约5重量％的增稠 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计2-10重量％，优选大约 5重量％的甘油单硬脂酸酯。
合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约0.1重量％的防腐 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0.05-1重量％，优选大约0.1重量％的对羟基苯甲酸丙酯。
合适的铺展剂包括聚二甲基硅氧烷(dimethicone)、聚二甲基环硅氧烷。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约2重量％的铺展 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计0.2-2重量％，优选大约0.5重量％的聚二甲基硅氧烷。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计1-3重量％，优选大约 2.5重量％的聚二甲基环硅氧烷。
合适的固水剂包括聚乙二醇，优选聚乙二醇600。
优选地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计大约8重量％的固水 剂。
有利地，根据本发明的组合物具有以组合物的总重量计2-10重量％，优选大约5重量％的聚乙二醇。
用于乳液的水相的水可以为蒸馏水或者具有美肤性能的温泉水。
有利地，根据本发明的组合物包含
-大约15%的丙三醇，
-大约8%的凡士林，
-大约2%的液体石蜡，以及作为赋形剂的如下组分
-大约1-5%的硬脂酸，
-大约2-10%的甘油单硬脂酸酯，
-大约1-3%的聚二甲基环硅氧烷，
-大约0.2-2%的聚二甲基硅氧烷，
-大约2-10%的聚乙二醇600，
-大约0-2%的三乙醇胺，
-大约0.05-1%的对羟基苯甲酸丙酯，
-直至100%的水。
本发明的目的还在于根据本发明的组合物用于制备旨在预防特应性皮炎的药物 的用途。
具体实施方式
通过以下实施例阐明本发明。
实施例
实施例1 制剂
组合物A
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-0.5克的三乙醇胺，
-以及作为赋形剂的硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、聚二甲基环硅氧烷、聚二甲基硅 氧烷、聚乙二醇(PEG)600、对羟基苯甲酸丙酯，
-直至IOOg的水。
组合物A'
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-1.5克的硬脂酸，
-5克的甘油单硬脂酸酯，
-1.5克的聚二甲基环硅氧烷，
-0.5克的聚二甲基硅氧烷，
-5克的聚乙二醇600，
-0.15克的三乙醇胺，
-0.1克的对羟基苯甲酸丙酯，
-直至IOOg的水。
组合物B
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-0.5克的PEG-40-硬脂酸酯，
-以及作为赋形剂的硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、聚二甲基环硅氧烷、聚二甲基硅 氧烷、聚乙二醇(PEG) 600、氯甲酚，
-直至IOOg的水。
组合物B'
-15克的丙三醇，
-8克的凡士林，
-2克的液体石蜡，
-3克的硬脂酸，
-5克的甘油单硬脂酸酯，
-2克的聚二甲基环硅氧烷，
-0.5克的聚二甲基硅氧烷，
-0.1克的三乙醇胺，
-3克的聚乙二醇600，
-0.5克的PEG-40-硬脂酸酯，
-0.075克的氯甲酚，
-直至IOOg的水。
实施例2 细胞毒性试验
M
试验的原理基于四唑鐺盐“3，3_[1[(苯基氨基)羰基]-3_4四唑鐺钠双甲 氧基-6-硝基)]苯磺酸水合物”(即XTT)酶转化为有色产品，甲臜(formazan)。
在电子耦合剂、辅酶Q的存在下，XTT通过活细胞的线粒体脱氢酶而被还原为 黄色/橙色水溶性化合物甲臜(其可通过分光光度法在450纳米下进行测定)。
用产品进行治疗
用IO5细胞/毫升播种96-孔微板，在孵育M小时后，除去培养基，并用PBS 冲洗微板。向微板的每个孔中加入100微升测试产品的不同稀释物。在相同条件下制备 无任何产品的对照样。
将微板置于5% CO2下，在37°C孵育2小时。
揭露细胞毒性
在孵育后，用PBS洗涤微板两次。接着，在96-孔板的每个孔中加入100微升 XTT (1毫克/毫升)/辅酶Q (0.2毫克/毫升)混合物。
在孵育3小时后，向每个孔中加入100微升10%的SDS溶液。
采用分光光度计POLARstar (BMG，法国)，在450纳米处进行光密度的瞬间读数。
结果表示
测量的光密度与存活细胞总数(viablecellpopulation)成正比。
当光密度小于对照批次的光密度时，因此我们有可能通过该试验，从对应于对 照批次的光密度分析细胞毒性
存活率％ (% viability)=(治疗的 OD-对比 OD) / 对比 OD X 10
如果存活率百分数<30%，则产品被认为是细胞毒性的。
进行8次内操作试验。
MM
取决于产品的非细胞毒性的程度，所选用于粘附试验的浓度如下
-组合物A: 6%, 3%, 1.5%, 0.8%禾口 0.4%
-Atopiclair0.8%、0.4%, 0.2%, 0.1%禾口 0.05%
-Physiogel 6%、3%, 1.5%, 0.8%禾口 0.4%
-组合物B: 3%, 1.5%, 0.8%, 0.4% 禾口 0.2%
实施例3 粘附试骑
M
用含氚腺嘌呤(σ)标记细菌，并通过评价放射性水平确定粘附于角质形成细胞 表面的细菌比例。
用含氚腺嘌呤标记细菌
在充足培养基中，在30 μ Ci含氚腺嘌呤的存在下进行细菌的标记。在37°C下孵 育18小时后，在PBS中洗涤微生物3遍以除去非掺入的放射性。
在维持介质中调节悬浮液至2X IO8微生物/毫升。
粘附抑制效果
在产品的每个试验稀释液的存在下，在细胞层的表面沉积500微升标记的细 菌。
在孵育(37°C，5%C02)2小时后，用PBS洗涤3遍。
细胞的溶解
在37°C下用500微升0.5N的氢氧化钠溶液(含0.1 %的十二烷基硫酸钠)对粘附 于角质形成细胞的细菌溶解18小时。
对每个孔的溶解产物取样并置于计数管中。在每个管中加入2毫升液体闪烁 体。
结果表示
用β计数(其表示放射性水平，以cpm(计数/分钟)计)进行读数。
-根据下式计算粘附抑制百分数
抑制％ =((试验 cpm-对比 cpm) / 对比 cpm) X 100
如果粘附抑制百分数的值<-30%，则其是显著的。
一式四份地进行测试。
Mit
-在6%和3 %下孵育2小时后，组合物A显著地抑制了金黄色酿脓葡萄球菌粘 附于角质形成细胞。
-在6%但并非3%下孵育2小时后，Physiogel产品显著地抑制了金黄色酿脓葡萄球菌粘附于角质形成细胞。
-Atopiclair产品对金黄色酿脓葡萄球菌粘附于角质形成细胞没有任何影响。
-在组合物B的存在下，金黄色酿脓葡萄球菌对角质形成细胞的粘附异常地增 加。
实施例4 对诱导件皮肤脱水的调整件的分析
我们在此通过使用诱导性皮肤脱水的活体外皮肤模型，评价了组合物A的增湿 活性以及后续对皮肤屏障作用的改进。
我们通过定量PCR和免疫组织化学，观察了微分分子表皮标记的表达。
我们还通过原位酶谱法追踪了丝氨酸蛋白酶的活性，并通过Western免疫印迹法 (Western blotting)追踪了角层桥粒蛋白(corneodesmosomal protein)的降解。
利用荧光探针分析皮肤屏障的作用。
装置和方法
1、组织模型
1、皮肤移植物的制备
实验室从整形外科(乳房缩小)的操作废料中回收皮肤样品。使用这些样品进 入法国高等教育和研究部规定的“Pierre Fabre组的研究方案所需的人体元件的保存和制 备活动的声明 ” ("the declaration of an activity for preserving and preparing elements of the human body for the needs of a research program of the Pierre Fabre group ”)的范围。
在10PBS浴中洗涤这些样品，然后冲切成直径为2厘米的盘状。将皮肤移植物 展开在Petri盘中的网格上，并将1厘米直径的环密封在皮肤上以限定治疗区域。
2、模型动力学
对于诱导性脱水模型，在无任何盖子的盘中，在细胞培养超净台下干燥皮肤2 小时，然后将皮肤置于保温箱(oven)中，在存在或不存在任何活性组合的情况下局部治 疗2小时。脱水应激的阴性对比样在封闭的Petri盘中经历相同的动力学。
3、用于分析的样品
在治疗后，取样2个直径为6毫米的活组织用以分析RNA表达，以及取样一个 包括在Tissue Tek(Sakura Finetek)树脂团中的直径为4毫米的活组织用于组织学。为 分析蛋白，将皮肤在60°C水浴的热冲击中暴露5分钟，然后在4°C中暴露2分钟以分离表 皮和真皮。
在液氮中冷却活组织和表皮，并存储在-80°C下以待分析。
II.通过定量PCR分析转录组(transcriptome)
在之前用液氮冷却的研钵中研磨皮肤活组织，根据提供者的推荐利用RNeasy 试剂盒(QIAGEN)提取 RNA。然后用 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)在 RNA 6000 Nano LabChip 切片上测定 RNA。采用 Access RT-PCR Core Reagents 试剂盒 (Promega)，使用寡dT引物，通过进行酶逆转录反应，自1微克RNA获得cDNA。根 据40个循环步骤(包括在95°C下变性(15秒)和在60°C下伸长(1毫米))，通过在配 备 PCRiQ SYBR Green Super Mix 试剂盒(Biorad)的荧光温度循环器 IClycler iQ (Biorad)上定量的PCR分析基因表达水平。利用iCycler软件观察在一个接一个循环中 PCR产品的积聚(正比于荧光发射6YBR Green intercalant))。
iClycler版本3.1分析软件传送Ct (循环阈值)的原始值开始cDNA放大的循环。利用程序Genorm版本3.4 (其能够从各样品中选择最稳定的参考基因)平行分析数 个参考基因的表达。然后使用该基因作为对比，通过计算Δ Ct=感兴趣的基因Ct-对比 基因Ct来归一化结果。
然后计算每个治疗相对于对应的对比条件的诱导因子(IF)。IF = 2_mct，其中 Δ Δ CT =处理的Δ CT-对比Δ CTo对于获自5个不同个体的五个试验评价mRNA的表 达2次。当相对于对比样的诱导因子在2以上时，认为基因表达受到诱导，但其在0.5以 下时，认为表达被抑制。通过用下式计算抑制百分数来评价在模型中引起的活性成分对 应激反应的影响
应激反应抑制％ = 100*[(应激的IF-无应激的对比IF)-(治疗的IF-无应激的对 比IF) ]/[(应激的IF-无应激的IF)]
与研究模型相比，“无应激的对比”条件对应于无干燥的对比；“应激的”条 件对应于已经干燥2小时且在对比条件下(即无任何局部治疗)处理另外2小时的皮肤活 组织；最后“治疗的”条件为已经干燥2小时且接着用软化剂局部治疗2小时的皮肤。
III.通过Western免疫印迹法分析蛋白表达
在用液氮冷却的研钵中研磨治疗的表皮，在溶解缓冲液ROPA(Tris HCl pH8 50mM ； NaCl 150mM ； Triton X 100 IX ；脱氧胆酸钠(Na+desoxycholate) 1 % ； SDS 0.1% ； EDTA 5mM ； DTT IOOmM ；蛋白酶抑制剂的混合物(参考P8340，SIGMA)中提取蛋白。
然后利用DC-DC蛋白测定法(Biorad)测定蛋白，并利用Western免疫印迹 法分析蛋白。对于每个条件，将25至40微克的总蛋白沉积在含7.5%聚丙烯酰胺的 Tris-Glycine凝胶上。利用Mini Protean II系统(Biorad)，通过电泳法分离蛋白混合物， 在PVDF膜(Hybond-Ρ，Amersham)上转移蛋白。通过特定的抗体和ECL+试剂盒 (Amersham)揭露感兴趣的蛋白。在相对于β-肌动蛋白(参比蛋白)归一化后，通过软 件Image Master TotalLab版本1.11 (Amersham)计算蛋白的量和降解形式的比例。
IV.组织学技术
采用Cryotome (Leica CM 3050s)将皮肤活组织切成厚度为5微米的切块，并沉积 在观察载玻片Mtarfrost )上。
1、免疫组织化学
在20°C下采用丙酮固定冷冻切块(CTyocut)IO分钟，然后在用免疫化学标记分析 之前用PBS进行再水合。在固定和再水合之后，采用3% BSA溶液使皮肤切块饱和， 并用针对感兴趣的蛋白的初级抗体将其孵育1小时。在第二阶段，用与Alexa-488或 Alexa-555荧光染料结合的第二抗体将它们孵育1小时，最后将其固定在包含DAPI的 Mowiol中用于标记细胞核。
2、原位酶谱法
在_20°C下在丙酮中固定10分钟后，在洗涤液(在水中的Tween20)中冲洗 切块，并用包含感兴趣的酶的特定作用物结合荧光团(辅助的)的溶液在37°C下孵育2小 时。当活化酶时，荧光团被分开，释放荧光信号，这可在显微镜下观察到。然后在落射 荧光显微镜(NikonEclipse 50i)下或者在反相的同焦显微镜Zeiss Axiovert 100下观察标记的载玻片。
3、荧光探针
在脱水治疗后，采用在HBSS缓冲液中ImM的荧光探针萤光黄羧基-酰胼二 锂盐(Invitrogen)，在37°C下在保温箱中进一步孵育皮肤移植物1小时。然后在HBSS 浴中冲洗皮肤1分钟，接着取样直径为4毫米的活组织，使其包括在Tissue TekR 树脂 MakuraFinetek) (Matsuki等人，1998)中。其后切开皮肤，用DAPI标记细胞核，在如上 所述的荧光显微镜下采用450纳米波长观察载玻片。
结果
1、由于诱导干燥的屏障作用失效模型
1、采用荧光探针测量皮肤渗透性
第一分析的组成为研究皮肤屏障作用中的基本功能参数表皮上层的渗透性。 在干燥实验后利用荧光探针(萤光黄)的皮肤孵育能够表征皮肤渗透性的调节。在对比条 件下，标记非常低和浅，探针通过角质层穿透得并不很多，且在冲洗过程中被除去。在 干燥2小时后，在角质层的较深层可观察到标记。干燥使得皮肤更具有渗透性，其屏障 作用被破坏。在干燥两小时后用组合物A进行局部治疗恢复了 SC相对于探针的不渗透 性，标记再次变得低和浅，与在对比条件下的类似。由此可以得出结论增湿治疗对于 干燥皮肤以及对于皮肤屏障作用具有修复效果，这可在组织模型上观察到。
2、对转录组和蛋白质组的调整性的影响
在干燥模型的不同应激或治疗条件下，通过定量PCR测量潜在地涉及表皮屏障 作用的内环境平衡(homeostasia)的不同基因的表达。通过免疫组织化学分析给出显示就 定位而言重新组织某些蛋白表达(例如关闭连接)的可能性。通过Western免疫印迹法分 析角层桥粒蛋白的降解。
将通过这些不同方法研究的目标根据其生理学作用组合在一起(参见表1)。研 究的目的是观察可观察的应激反应和由于组合物A的局部施用带来的对应激效果的修 正。
根据已完成的工作，还有可能显示出某些目标的不同调整水平。因此，我们能 够注意到脱屑的酶没有在转录水平，而是更特别地在其活性水平被调整(参照结果3)。
表1 :在干燥模型中研究的目标和药理反应的汇总
Y =在模型中目标反应；Y =是
X=在模型中目标不反应N =否
权利要求
1.一种用于局部用途的组合物，其包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林 和液体石蜡的组合作为活性成分，所述组合物用于预防特应性皮炎。
2.根据权利要求1所述的组合物，其用于初级预防特应性皮炎。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述凡士林具有35至70°C的滴点。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述凡士林具有51至57°C，特别是54°C的滴点ο
5.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其中所述凡士林具有175至1951/10毫米 的稠度(在25 °C下的锥体针入度)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述凡士林具有大约1851/10毫米的稠度(在 25°C下的锥体针入度)。
7.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其中所述凡士林在100°C下具有4至5cSt 的粘度。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述凡士林在100°C下具有大约4.8cSt的粘度。
9.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其包含大约15%的丙三醇、大约8%的凡 士林和大约2%的液体石蜡。
10.根据前述权利要求任意项所述的组合物，其包含选自硬脂酸、甘油单硬脂酸酯、 聚二甲基环硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇600、三乙醇胺、对羟基苯甲酸丙酯、蒸 馏水的一种或多种赋形剂。
11.一种包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合作为活性 成分的组合物用于制备旨在预防特应性皮炎的药物的用途。
12.如权利要求3至10中所述的组合物在制备旨在预防特应性皮炎的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于局部用途的组合物，其包含水包油或油包水乳液形式的丙三醇、凡士林和液体石蜡的组合作为活性成分，所述组合物用于预防特应性皮炎。
文档编号A61K31/01GK102026631SQ200980117468
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月18日 优先权日2008年5月16日
发明者D·库斯图, H·杜普兰 申请人:皮埃尔·法布尔皮肤化妆品公司
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