针对脑膜炎的防卫素的用途的制作方法
专利名称：针对脑膜炎的防卫素的用途的制作方法
针对脑膜炎的防卫素的用途
对序列表的引用
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发明背景发明领域
本发明涉及以防卫素多肽治疗脑膜炎。
背景
脑膜炎是覆盖中枢神经系统的保护性膜(合称脑膜)的炎症。脑膜炎可对一些 原因(最重要的是细菌和病毒)反应而发生。由于发炎邻近脑和脊髓，脑膜炎为一种潜在 严重的病症。严重神经损害或甚至死亡的可能性使得迅速医疗关注和评价成为必需。细 菌性脑膜炎通常以抗生素治疗且需要密切观察。多种微生物可引起细菌性脑膜炎，而肺炎 链球菌(Streptococcus pneumoniae)( “月市炎球菌(pneumococcus)，，)禾口脑膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)(“脑膜炎球菌(meningococcus) ”)是在无免疫缺陷的患者中最 常见的病原体。细菌性脑膜炎对全球健康而言是严重的威胁，其是每年全世界估计171000 例死亡的原因。
肺炎链球菌在幼儿中造成侵入性细菌性感染的原因的流行生物。在患有肺炎球菌 脑膜炎的儿童中死亡率为患脑膜炎球菌性脑膜炎中的至少两倍高且幸存者后遗症的发生 率最高。最近的研究报导了来自大部分欧洲国家在年龄小于5岁的儿童中肺炎球菌脑膜炎 的发生率的数据。整体而言，最低发生率被报导在芬兰(0. 3/100000)而最高发生率被报导 在法国(12.0/100000)。青霉素抗性肺炎球菌常常为多重抗性，因此对治疗造成严重的问 题。对大环内酯类(macrolides)的抗性也为普遍的，且在地中海地区特别高。
本发明的一个目标在于提供能够穿过血脑屏障的多肽，以及使用这些多肽治疗脑 膜炎的方法。发明内容
我们现已发现合成的防卫素显示针对肺炎球菌脑膜炎的优异的活性，且可用于治 疗细菌性脑膜炎。
在第一方面，本发明提供具有抗微生物活性的多肽在制备用于治疗(therapeutic treatment)脑膜炎的药物的用途，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少 90%同一性的氨基酸序列。
在第二方面，本发明提供具有抗微生物活性的多肽，其用于治疗脑膜炎，所述包含 与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供治疗脑膜炎的方法，其包括将有效量的(例如抗脑膜炎 有效量的)具有抗微生物活性的多肽施用于需要所述治疗的受试者，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该多肽为防卫素多肽，优选β-防卫素多肽。在另一个实施方案中，该多肽能够穿过血脑屏障。
根据本发明的脑膜炎可为细菌性脑膜炎，优选肺炎球菌脑膜炎，例如由链球菌属 (Streptococcus)，优选肺炎链球菌引起的脑膜炎。在一个优选的实施方案中，脑膜炎由青 霉素抗性肺炎链球菌引起。
根据本发明使用的多肽或根据本发明用于治疗脑膜炎的多肽以下称为“(根据) 本发明的多肽”。
本发明的详细描述
定义
抗微生物活性术语“抗微生物活性”于本文定义为一种能够杀死微生物细胞或抑 制微生物细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗微生物的”系意欲意指有杀细菌 的和/或抑制细菌的和/或杀真菌的和/或抑制真菌的效果和/或杀病毒的效果，其中术 语“杀细菌的”应被理解为能够杀死细菌细胞。术语“抑制细菌的”应被理解为能够抑制细 菌的生长，即抑制生长的细菌细胞。术语“杀真菌的”应被理解为能够杀死真菌细胞。术语 “抑制真菌的”应被理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。术语“杀病毒的”应 被理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”代表细菌或真菌细胞(包括酵母)。
在本发明的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”意欲指细胞处于非生长状 态，即它们不能繁殖。
在一个优选的实施方案中，术语“抗微生物活性”系定义为杀细菌的和/或抑制细 菌的活性。更优选地，“抗微生物活性”定义为针对链球菌属(优选肺炎链球菌)的杀细菌 的和/或抑制细菌的活性。
就本发明而言，抗微生物活性可根据由Lehrer等，Journal of Immunological methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174(1991)所述的方法测定。或者，抗微生物活性可根据来自 CLSI (临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前 称为国家临床与实验室标准委员会(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指南测定。
将具有抗微生物活性的多肽以浓度为500 μ g/ml ；优选浓度为250 μ g/ml ；更优选 浓度为100 μ g/ml ；甚至更优选浓度为50 μ g/ml ；最优选浓度为25 μ g/ml ；且特别是浓度 为10 μ g/ml的具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37°C温育8小时后 (优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，且特别是30分钟后)可将肺炎链球菌 (ATCC 49619)的活细胞数目减少至1/100。
具有抗微生物活性的多肽当以500 μ g/ml的浓度加入；优选当以250 μ g/ml的浓 度加入；更优选当以100 μ g/ml的浓度加入；甚至更优选当以50 μ g/ml的浓度加入；最优 选当以10 μ g/ml的浓度加入；以及特别是当以5 μ g/ml的浓度加入时，在相关微生物生长 底物中于37°C也可将肺炎链球菌(ATCC 49619)的长出(outgrowth)抑制8小时。
本发明的多肽具有至少20 %，优选至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %， 更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选 至少100%的由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。
防卫素(Defensin)术语“防卫素”用于本文意指本领域的技术人员所识别为属 于抗微生物肽的防卫素类的多肽。为确定一种多肽是否为根据本发明的防卫素，其氨基酸序列优选通过使用可自由得到的HMMER软件包，与PFAM数据库的隐藏马尔科夫模型谱 (hidden markov model profile) (HMM 谱(HMM profile))比较(参见实施例 1)。
PFAM防卫素家族包括防卫素1或“哺乳类防卫素”(登录号PF00323)、防卫素2或 “节肢动物防卫素”(登录号PF01097)、防卫素β或“β防卫素”(登录号PF00711)、防卫 素_propep或“防卫素前肽”(登录号PF00879)与γ-硫堇(gamma-thionin)或“ γ -硫堇 家族”(登录号PF00304)。
防卫素可属于α -防卫素类、β -防卫素类、θ -防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素 类、或植物防卫素类。
在一个实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包含4、5、6、7、或8个半胱 氨酸残基，优选4、5、或6个半胱氨酸残基、更优选4或6个半胱氨酸残基、且最优选6个半 胱氨酸残基。
防卫素也可为享有任何防卫素类的特性特征的合成防卫素。
这样的防卫素的实例包括(但不限于)α-防卫素ΗΝΡ-1(人中性粒细胞 肽)、ΗΝΡ-2 与 ΗΝΡ-3 ； β -防卫素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫堇 (Yl-purothionin)、昆虫防卫素 Α、和 PCT 申请 WO 99/53053,WO 02/06324,WO 02/085934、 WO 03/044049, WO 2006/050737 和 WO 2006/053565 中所公开的防卫素。
分离的多肽术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指自来源分离的变体 或多肽。在一方面，该变体或多肽为至少纯的，优选至少系5%纯的，更优选至少10% 纯的，更优选至少20 %纯的，更优选至少40 %纯的，更优选至少60 %纯的，甚至更优选至少 80 %纯的，且最优选至少90 %纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。
基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以 重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选 至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，且甚至最优选至多0. 5 %的与其天然或重 组结合的其它多肽材料。因此，优选地，基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽材料的 重量计为至少92 %纯的，优选至少94 %纯的，更优选至少95 %纯的，更优选至少96 %纯的， 更优选至少96%纯的，更优选至少97%纯的，更优选至少98%纯的，甚至更优选至少99% 纯的，最优选至少99. 5%纯的，且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯 的形式。这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。
同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性” 描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的 Needle 程序， 优选3. 0. 0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 :443-453)来确定。所使用的任选参数为缺口开放罚分(gap open penalty) 为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记 为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算 如下
(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包 (EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice 等，2000，如上；http://emboss, org)的 Needle 程序，优选 3. 0. 0 或更晚版本 中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，如上)测定。所使用的任 选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本) 取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为 百分比同一性并计算如下
(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)。
等位变体术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两 种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因 突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。 多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽 或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是 一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(数个)氨基酸侧链 的置换；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特别地，修饰可为酰胺化， 例如C-端的酰胺化。
具有抗微生物活性的多肽
在第一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO :1( S卩，成熟多肽)有至少80%，优选 至少85%，更优选至少90%，最优选至少95%，且特别地至少97%同一性程度的氨基酸序 列的分离的多肽，其具有抗微生物活性(以下称“同源多肽”)。在一个优选的方面，同源多 肽具有与SEQ ID NO :1的氨基酸序列相差至多六个氨基酸，优选至多五个氨基酸，更优选至 多四个氨基酸，甚至更优选至多三个氨基酸，最优选至多两个氨基酸，且特别地是一个氨基 酸的氨基酸序列。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列或其等位变体。在一个优选的 方面，多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID N0:1的 氨基酸序列或其等位变体组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO :1的氨基酸序列 组成。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸 取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；单缺失；小的氨基-或羧基-末端 延伸；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小 延伸，如多组氨酸标签(poly histidine tag)、抗原表位(antigenic印itope)或结合域 (binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、 酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨 基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小 氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍发生的交换是 Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。
除了 20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基 异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非 保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨 基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结 构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲 基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham 和Wells，1989，Science M4 :1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术 中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即， 抗微生物活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等， 1996，J.Biol. Chem. 271 =4699-47080生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定， 如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点 氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBS Lett. 309 :59_64。必需氨基酸的身份 (identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方 法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公开的那 些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌 体展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的 克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使 用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的 重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽为防卫素多肽，优选防卫素多肽。
N-端延伸
本发明的多肽的N-端延伸可适当地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤 其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施 方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_样切割位点，如在下文进一步定义的。在一个优选的 实施方案中，N-端延伸为肽，其包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基，如包含以 下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。
Kex2 位点
Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel编，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 样位点为在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间存在的二元的(dibasic)识别位点(即，切割位点)ο
插入kex2位点或kex2_样位点已在某些情况中显示改进于前肽切割位置的正确 内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。
在本发明的上下文中，插入kex2或kex2_样位点导致在N-端延伸中某个位置处 获得切割的可能性，造成抗微生物的多肽与SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延长。
融合的多肽
本发明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽被融合于 本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部 分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是 本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合的多肽 的表达在相同启动子和终止子的控制下。
方法和用途
本发明涉及本发明的多肽用于治疗脑膜炎之用途。因此，本发明的多肽可用作为 抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。因此，本发明的防卫素变体可用于制备供治疗脑 膜炎之用的兽用或人用治疗剂或预防剂。
本发明的多肽可以足以杀死链球菌属菌种(如肺炎链球菌)或抑制链球菌属菌种 (如肺炎链球菌)生长的量使用。
本发明的多肽的配制物被施用于患有(suffering from)或易感染(predisposed to)脑膜炎(如细菌性脑膜炎，例如肺炎球菌脑膜炎)的宿主。在一个实施方案中，脑膜炎 由青霉素抗性肺炎链球菌感染引起。
施用可为局部的或全身的(systematic)。一般而言，本发明的抗微生物多肽的剂 量会足以通过至少1 log，且可为2个以上log的致死而将微生物群体减少。本发明的多肽 系以减少微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。期望的是获得组合物并在医师的 指导下使用以用于体内用途。
可采用多种施用方法。多肽配制物可口服给予，或可血管内、肌肉内、皮下、腹膜注 射、通过气溶胶、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部等方式施用。治疗配制物的剂量变化 会很大，取决于待施用的特定抗微生物多肽、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除 等。初始剂量可较大，然后为较小的维持剂量。在许多情况中，口服施用会需要比静脉内 施用更高的剂量。酰胺键，以及氨基与羧基端，可进行修饰以在口服施用时具有较大的稳定 性。例如，羧端可经酰胺化。
配制物
本发明的多肽可并入多种配制物中用于治疗施用。更具体地，本发明的多肽可通 过与适合的、医药上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半 固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、粉末、颗粒(granules)、软膏(ointment)、 乳霜(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气溶胶。 按原样，多肽的施用可以多种方式实现，其包括口服施用、颊施用、直肠施用、非消化道 (parenteral)施用、腹膜内施用、皮内施用、透皮施用、气管内施用等。本发明的抗微生物多 肽在施用后可为全身性或可为局部化的。
本发明的多肽可单独施用、彼此组合施用、或它们可与其它已知化合物(例如，穿 孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素等)组合使用。在医药剂型中，多肽可以其医药上可接受 的盐的形式施用。以下方法与赋形剂仅为例示性的而非以任何方式限制。
对于口服制备物，多肽可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉末、颗 粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂 (binder)，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶组合；与 崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组 合；以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂结合。
多肽可通过将它们溶解、悬浮、或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其它 类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇)中，以及如果需要，与常规的 添加剂(例如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)结合，而配制成用于注射 的制备物。
多肽可用于气溶胶配制物中以经由吸入施用。本发明的多肽可配制成加压的可接 受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，多肽可通过与多种基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制 成栓剂。本发明的多肽可经由栓剂而直肠施用。栓剂可包括媒介物，例如可可脂、碳蜡 (carbowax)和聚乙二醇，其在体温融化，但在室温固化。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单 位，例如茶匙量、汤匙量、片剂或栓剂)包含预定量的组合物，所述组合物包含一种或多种 本发明的多肽。类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂型可包含组合物中的本发明的多 肽，而该组合物作为无菌水、一般盐水或另一个医药上可接受的载体中的溶液。
用于持续释放配制物的移植物是本领域中公知的。移植物以生物可降解的或非生 物可降解的聚合物配制成微球、平板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可 侵蚀性聚合物，其可良好地被宿主所容忍。包含本发明的抗微生物多肽的移植物置于接近 感染的位点，使得活性剂的局部浓度相对于身体的其余部分增加。
用于本文，术语“单位剂型”意指物理上地分开的单位，其适合作为用于人和动 物受试者的单元剂量，每个单元包含预定量的本发明的多肽，该量经计算为足够产生期望 效果的量，所述多肽与医药上可接受的稀释剂、载体或媒介物组合。本发明的单位剂型的 规格取决于所采用的特定多肽和待实现的效果、以及在宿主中与多肽相关的药效动力学 (pharmacodynamics)0
医药上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众容易获得的。此 外，医药上可接受的辅助物质，如PH调整与缓冲剂、张度调节剂(tonicity adjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，是公众容易获得的。
用于全身性施用的通常剂量的范围为0. Ipg至100毫克每公斤受试者重量每次 施用。通常剂量可为每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一颗延时-释放的 (time-release)胶囊或片剂，且包含成比例更高含量的活性成分。延时-释放效果可通过 在不同PH值溶解的胶囊材料、通过由于渗透压缓慢释放的胶囊、或通过任何其它已知的控 制释放方法而获得。
本领域的技术人员容易理解的是剂量水平可作为特定多肽、症状的严重性、受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定多肽比其它更有潜力。用于给定多肽的优选 剂量可由本领域的技术人员通过多种手段容易地确定。一个优选的手段为测量给定多肽的 生理潜力(physiological potency)。
使用脂质体作为递送媒介物是一种所关注的方法。脂质体与目标位置的细胞融合 并将内腔的内容物在细胞内递送。维持脂质体与细胞接触一段足够融合的时间，其使用多 种方法以维持接触，如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，脂质体经设计以气溶胶化用 于肺部施用。脂质体可以介导膜融合的纯化蛋白质或肽(如，仙台病毒或流感病毒等)制 备。脂质可为已知的脂质体形成性脂质的任何有用组合，包括阳离子脂质或两性离子脂质， 如磷脂酰胆碱。剩下的脂质通常为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油寸。
为了制备脂质体，可使用Kato等(1991) J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。 简言之，脂质与包含肽的内腔组合物在适合的水性介质(方便地为盐水介质)中组合，其中 总固体在大约1-10重量百分比的范围内。在短时间(大约5-60秒)激烈地搅动后，将管 子置于温水浴(大约25-40°C )并重复此循环大约5-10次。然后对组合物进行声处理一段 方便的时间(一般大约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。然后通过加入水性介 质扩增体积，一般将体积增加大约1-2倍，然后摇动并冷却。此方法允许将高分子量分子并 入内腔中。
具有其它活性剂的配制物
为了用于本方法，本发明的抗微生物多肽可与其它医药活性剂(特别是其它抗 微生物剂)一起配制。所关注的其它药剂包括广大范围的抗生素，如于技术领域中已 知的。抗生素的类型包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、 苯唑西林(oxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄青霉 素等；青霉素类与β -内酰胺酶抑制剂、头胞菌素的组合，例如头孢克洛(cefaclor)、头 孢唑林(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯类 (carbapenems)；单酰胺菌素类(moncAactams)；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可 霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑 (metronidazole)；大观霉素；甲氧节唆(trimethoprim)；万古霉素等。
抗霉菌剂(包括多烯类，例如两性霉素B (amphotericin B)、制霉菌素； 5-flucosyn ；以及唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康 唑(itraconazol)与氟康唑(f luconazol))也是有用的。抗结核药物包括异烟胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素和利福平(rifampin)。细胞因子(例如干扰 素Y、肿瘤坏死因子α、白介素12等)也可包括于本发明的抗微生物多肽的配制物中。
体外合成
本发明的多肽可通过体外合成使用如本技术领域中已知的方便方法制备。多种商 业合成设备(例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自动化合成仪等)是可获得的。 通过使用合成仪，可以非天然氨基酸(特别是D-同型异构物(或D-型)，例如D-丙氨酸 与D-异亮氨酸、非对映异构物、具有不同长度或官能团的侧链等)取代天然存在的氨基酸。 制备的特定顺序与方式可通过方便性、经济性、所需纯度等确定。
可将化学结合提供给多种肽或蛋白质，其包括方便的用于键合的官能团，如用于酰胺或取代的胺(例如还原性胺化)形成的氨基、用于硫醚或双硫键形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。
如果需要，可在合成过程中或在表达过程中将多个基团(其允许结合至其它分子 或结合至表面)导入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用组氨酸以连结于金属 离子复合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。
多肽也可根据常规的重组合成方法而分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物，而 该裂解物使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析、或其它纯化技术纯化。一般来说，所使 用的组合物会包含按重量计至少20%的期望产物，更通常按重量计至少大约75%，优选按 重量计至少大约95 %，以及为了治疗目的，通常按重量计至少大约99. 5 %，其系相对于与 产物的制备及其纯化方法有关的污染物而言。通常，百分比会基于总蛋白质。
通过以下实施例进一步描述本发明，且所述实施例不应被理解为限制本发明的范 围。实施例
实施例1
#用来自PFAM数据库的HMMf件以鉴定防下.素
可在因特网上在线或在本地于计算机上，使用公知的HMMER可自由得到的软件 包，使用隐藏马尔科夫模型谱进行序列分析。目前的版本是HMMER 2.3.2，2003十月。
HMM谱可获得自公知的PFAM数据库。目前的版本是PFAM 16. 0,2004 i^一月。对 于所有平台，HMMER与PFAM两者皆可得自(例如)美国华盛顿大学圣路易斯分校医学院 (Washington University in St. Louis(USA), School of Medicine)(http://pfam. wustl. edu 禾口 http://hmmer. wustl. edu)。
若查询氨基酸序列(或其片段)属于以下五个PFAM家族之一，则该氨基酸序列是 根据本发明的防卫素
-防卫素或“β防卫素”登录号PF00711；
-防卫素_prop印或“防卫素前肽”登录号PF00879；
-防卫素_1或“哺乳动物防卫素”登录号PF00323；
-防卫素_2或“节肢动物防卫素”登录号PF01097；
-γ-硫堇或“γ -硫堇家族”登录号PF00304。
当在线使用PFAM数据库时，或当hmmpfam程序(来自HMMER软件包)在本地使用 时，若氨基酸序列产生大于0. 1的E-值和大于或等于零的分数，根据本发明，其属于PFAM家族。
当序列分析使用hmmpfam程序在本地进行时，需要自PFAM数据库获得(下载) HMM谱。每个家族存在两个谱；用于全局搜索的XXX_ls.hmm，以及用于局部搜索的xxx_ fs.hmm( “XXX”系家族的名称)。这使以上提及的五个家族共有十个谱。
此十个谱可独立地使用，或可结合(附加)成单谱(使用文本编辑器-该谱为 ASCII文件)，其可被命名为(例如Wefensin.hmm。然后可使用以下命令行评估查询氨基 酸序列
hmmpfam-E 0. ldefensin. hmm sequence_file
-其中“Sequence_file”是文件，其具有可由HMMER软件包识别的任何格式的查询氨基酸序列。
若分数大于或等于零(0.0)，且E-值大于0. 1，查询序列是根据本发明之防卫素。
PFAM 数据库进一步描述于 Bateman 等 Q004) "The Pfam Protein Families Database，，，Nucleic Acids Research, Vol. 32 (Database Issue) pp. D138-D141。
实施例2
研究在脑腊炎i寸蔣中合成的防下.素的CSF穿诱禾Π杀细菌效果
将青霉素抗性血清型9V肺炎链球菌的分离物(1395)，其原始分离自患有 脑膜炎的78岁年长女性的CSF，用于脑膜炎模型中。此菌株先前被用于评估使用 Moxifloxacin(莫西沙星)治疗脑膜炎的有效性(参见Ostergaard等“Evaluation of moxifloxacin, a new 8-methoxyquinolone, for treatment of meningitis caused by a penicillin-resistant pneumococcus in rabbits，，， Antimicrob Agents Chemother, vol. 42(7)，pp.1706-1712(1998))。
该菌株的毒性通过将细菌通过小鼠腹膜炎模型继代而增强。使来自取样的腹膜流 体的细菌在血液琼脂板上生长，回收并以加入10%甘油的牛肉汤(beef-broth)稀释与冷 冻在_80°C。
解冻细菌等分试样并生长在血液琼脂板上，悬浮在无菌牛肉汤中以达到在MOnm 的3. 5光学密度，并随后稀释以获得最终浓度为1-2 X 106CFU/ml。
用于实验的合成防卫素为具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的多肽。在实施例 中，此合成的防卫素称为“Meningicin”。Meningicin针对肺炎链球菌(1395)的最小抑制 浓度(minimium inhibitory concentration, MIC)测定为 0· 25 μ g/ml。
在功效研究中，将Meningicin在清除脑膜感染中的有效性与头孢曲松 (Ceftriaxone，其为频繁用于治疗患有青霉素抗性菌株的肺炎球菌脑膜炎的患者的抗生 素)的有效性和不给予治疗(“媒介物”)的效果比较。头孢曲松针对肺炎链球菌(1395) 的MIC测定为0. 5μ g/ml。
脑膜炎模型
将重量约2500g的雄性新西兰白兔用于实验中。兔子于实验1-2周前到达实验室 (facilities)以允许适应。将它们放在以干草覆盖的单独笼子中并无限制提供食物和水。 实验室有兽医专家，且实验设计由当地的动物法规委员会批准。
为了固定在立体定位头架(stereotactic frame)中的准备
将兔子称重并以多美康(dormicum)O. 5ml/kg(咪达唑仑(midazolam) 5mg/ml)皮 下注射(s. c.)和在10分钟后以hypnorm 0. 35ml/kg (柠檬酸芬太尼(fentanylcitrat) + 氟阿尼酮(fluanison))肌肉注射(i. m.)麻醉。
将兔子的耳朵、头皮和颈部刮毛并将皮肤消毒。在兔子的前额上制造大小大约km 的切口并将头皮通过钝剥离(blunt dissection)暴露。制造界定一个正方形的4个钻孔 并以直角将4个螺钉拧到表面上O. 5至3转)。从牙科铸造材料直接将丙烯酸酯类盔(嵌 有螺丝扣)铸造在兔子之头皮上并以流动的水冷却盔。将兔子放回其笼子中并无限制提供 食物和水以休息8-10小时，直到细菌接种的时间或对未经感染兔子的药物动力学治疗研 究开始。给予丁丙诺啡(buprenorfin)，。. lmg/kg止痛。
细菌接种
在晚上，于10p.m.，在使用Meningicin进行治疗实验的前一天，将兔子以 hypnorm-多美康再麻醉。将兔子之头部固定在立体定位头架中并将脊髓套管(spinal canula)导入小脑延髓池(cistema magna)中用于接种1 X IOtFU肺炎球菌。在细菌接种 后，将兔子放回其笼子并使其可取用食物和水另8小时。给予丁丙诺啡(0. lmg/kg)止痛 (注意未感染的兔子不经历细菌接种程序)。
(setup)
于7. 30a. m 将兔子以乌拉坦(urethan) 3. 5ml/kg(丙烯酸二甲酯 50%,1. 75g/kg) 皮下注射再麻醉。将静脉导管施加于左耳静脉并缓慢地灌注Mebumal (戊巴比妥)大约 0. 5-lml (戊巴比妥(pentobarbital) 50mg/ml)静脉注射(i. v.)直到兔子入睡并被深度麻 醉。将三通弯头(three-way tap)连接至静脉导管并将包含用于追加麻醉的戊巴比妥和用 于冲洗的等张NaCl与肝素lUI/ml的注射器连接至弯头。每半小时观察兔子一次。当需要 追加麻醉时，给予另外0. 2ml的Mebumal (戊巴比妥50mg/ml)。在实验期间将观察和麻醉记 录在实验室动物部门的方案中和实验室动物审视书(the book of the Laboratory Animal Inspection)中。
将动脉套管施加于右耳动脉并在整个实验过程中用于血液取样。将螺栓紧固至嵌 在丙烯酸酯类盔中的螺扣，并将兔子之头部固定在立体定位头架中。在整个实验过程中使 兔子维持固定。
以脊髓套管穿刺小脑延髓池，紧固至立体定位头架。在整个实验过程中使套管维 持正确的位置并用于CSF取样。
在与所实施实验有关的时间点，将Iml的血液和0.3ml的CSF从动脉套管/脊 髓针吸出并转移至EDTA管/Eppendorf管。在最后一次取样后，终止实验并以过量的 Mebumal (戊巴比妥200mg/ml)杀死兔子。
iMr
Meningicin的CSF和血浆浓度通过使用HPLC测量。当评估在接种体和样本中的 细菌浓度时，使用在血液琼脂板上铺板成为50 μ 1的点的系列10倍稀释(需要20 μ 1的测 试材料)以计算CFU/ml。
具体到对药物动力学研究
在实验开始10分钟以静脉内大量灌注将Meningicin (剂量分别为20、40和80mg/ kg)通过三通弯头施用。
用于研究Meningicin通过发炎脑膜的穿过的兔子如以上所述感染并等待直到细 菌接种后10小时的静脉注射Meningicin施用。使用两只兔子的组研究Meningicin于3 个不同剂量通过发炎和未发炎脑膜的穿透(对应的CSF和血浆水平)。血液和CSF在施用 Meningicin 后 0、1/4、1/2、1、11/2、2、3、4、5 和 6 小时取样以测定 Meningicin 浓度(HPLC)。 基于MIC和对于Meningicin所观察的药物动力学，建立用于治疗试验的剂量方案。
具体到功效研究
在施用脊髓套管后，将0. 5ml的CSF吸入注射器中。在接种前将0. Iml用于溶解 细菌接种物并将0. 2ml用于之后冲洗注射器和导管。制备接种物的系列10倍稀释物以确 认感染性剂量。
使用Meningicin或头孢曲松治疗在细菌接种后10_11小时起始。在静脉内剂量 的抗生素之后0、1、3、5、6和10小时取样血液和脑脊液。测定抗生素浓度和细菌计数。
药物动力学的结果
如上所述，将Meningicin以剂量20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg施用。测量来自经 感染兔子的血清中Meningicin的浓度并计算“曲线下面积”(AUC血清)。同样地，测量脑 脊液(CSF)中的Meningicin的浓度并计算“曲线下面积”(AUC CSF)。
Meningicin 剂量(mg/kg)在血清中的峰 农度(ng/l)AUC血 清细/1)在CSF中的峰 浓度AUC CSF (μ8/ )血脑屏障的 Meningicin 穿透
权利要求
1.一种具有抗微生物活性的多肽在制备用于治疗脑膜炎的药物中的用途，所述多肽包 含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
2.一种具有抗微生物活性的多肽，其用于治疗脑膜炎，所述多肽包含与SEQ ID NO 1 的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.一种治疗脑膜炎的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的，例如抗脑膜炎 有效量的具有抗微生物活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少 90%同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的用途、多肽或方法，其中所述多肽包含与SEQID N0:1的 氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，优选其中所述多肽包含SEQ ID N0:1的多 肽或由SEQ ID NO 1的多肽组成。
5.权利要求1-3中任一项的用途、变体或方法，其中所述多肽为防卫素多肽，优选 β-防卫素多肽。
6.权利要求1-3中任一项的用途、变体或方法，其中所述脑膜炎为细菌性脑膜炎。
7.根据权利要求6的用途、变体或方法，其中所述细菌性脑膜炎由链球菌属菌种 (Streptococcus sp)的感染弓I起。
8.根据权利要求6的用途、变体或方法，其中所述细菌性脑膜炎为肺炎球菌脑膜炎。
9.根据权利要求6的用途、变体或方法，其中所述肺炎球菌脑膜炎由青霉素抗性肺炎 链球菌(Streptococcus pneumoniae)的感染弓I起。
全文摘要
本发明涉及以防卫素多肽治疗脑膜炎，如细菌性脑膜炎的方法。
文档编号A61K38/17GK102036678SQ200980117980
公开日2011年4月27日 申请日期2009年3月30日 优先权日2008年4月4日
发明者多思·桑德范, 汉斯-亨里克·K·霍根豪格 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
针对脑膜炎的防卫素的用途
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景发明领域
本发明涉及以防卫素多肽治疗脑膜炎。
背景
脑膜炎是覆盖中枢神经系统的保护性膜(合称脑膜)的炎症。脑膜炎可对一些 原因(最重要的是细菌和病毒)反应而发生。由于发炎邻近脑和脊髓，脑膜炎为一种潜在 严重的病症。严重神经损害或甚至死亡的可能性使得迅速医疗关注和评价成为必需。细 菌性脑膜炎通常以抗生素治疗且需要密切观察。多种微生物可引起细菌性脑膜炎，而肺炎 链球菌(Streptococcus pneumoniae)( “月市炎球菌(pneumococcus)，，)禾口脑膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)(“脑膜炎球菌(meningococcus) ”)是在无免疫缺陷的患者中最 常见的病原体。细菌性脑膜炎对全球健康而言是严重的威胁，其是每年全世界估计171000 例死亡的原因。
肺炎链球菌在幼儿中造成侵入性细菌性感染的原因的流行生物。在患有肺炎球菌 脑膜炎的儿童中死亡率为患脑膜炎球菌性脑膜炎中的至少两倍高且幸存者后遗症的发生 率最高。最近的研究报导了来自大部分欧洲国家在年龄小于5岁的儿童中肺炎球菌脑膜炎 的发生率的数据。整体而言，最低发生率被报导在芬兰(0. 3/100000)而最高发生率被报导 在法国(12.0/100000)。青霉素抗性肺炎球菌常常为多重抗性，因此对治疗造成严重的问 题。对大环内酯类(macrolides)的抗性也为普遍的，且在地中海地区特别高。
本发明的一个目标在于提供能够穿过血脑屏障的多肽，以及使用这些多肽治疗脑 膜炎的方法。发明内容
我们现已发现合成的防卫素显示针对肺炎球菌脑膜炎的优异的活性，且可用于治 疗细菌性脑膜炎。
在第一方面，本发明提供具有抗微生物活性的多肽在制备用于治疗(therapeutic treatment)脑膜炎的药物的用途，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少 90%同一性的氨基酸序列。
在第二方面，本发明提供具有抗微生物活性的多肽，其用于治疗脑膜炎，所述包含 与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供治疗脑膜炎的方法，其包括将有效量的(例如抗脑膜炎 有效量的)具有抗微生物活性的多肽施用于需要所述治疗的受试者，所述多肽包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该多肽为防卫素多肽，优选β-防卫素多肽。在另一个实施方案中，该多肽能够穿过血脑屏障。
根据本发明的脑膜炎可为细菌性脑膜炎，优选肺炎球菌脑膜炎，例如由链球菌属 (Streptococcus)，优选肺炎链球菌引起的脑膜炎。在一个优选的实施方案中，脑膜炎由青 霉素抗性肺炎链球菌引起。
根据本发明使用的多肽或根据本发明用于治疗脑膜炎的多肽以下称为“(根据) 本发明的多肽”。
本发明的详细描述
定义
抗微生物活性术语“抗微生物活性”于本文定义为一种能够杀死微生物细胞或抑 制微生物细胞生长的活性。在本发明的上下文中，术语“抗微生物的”系意欲意指有杀细菌 的和/或抑制细菌的和/或杀真菌的和/或抑制真菌的效果和/或杀病毒的效果，其中术 语“杀细菌的”应被理解为能够杀死细菌细胞。术语“抑制细菌的”应被理解为能够抑制细 菌的生长，即抑制生长的细菌细胞。术语“杀真菌的”应被理解为能够杀死真菌细胞。术语 “抑制真菌的”应被理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。术语“杀病毒的”应 被理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”代表细菌或真菌细胞(包括酵母)。
在本发明的上下文中，术语“抑制微生物细胞的生长”意欲指细胞处于非生长状 态，即它们不能繁殖。
在一个优选的实施方案中，术语“抗微生物活性”系定义为杀细菌的和/或抑制细 菌的活性。更优选地，“抗微生物活性”定义为针对链球菌属(优选肺炎链球菌)的杀细菌 的和/或抑制细菌的活性。
就本发明而言，抗微生物活性可根据由Lehrer等，Journal of Immunological methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174(1991)所述的方法测定。或者，抗微生物活性可根据来自 CLSI (临床和实验室标准学会(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前 称为国家临床与实验室标准委员会(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指南测定。
将具有抗微生物活性的多肽以浓度为500 μ g/ml ；优选浓度为250 μ g/ml ；更优选 浓度为100 μ g/ml ；甚至更优选浓度为50 μ g/ml ；最优选浓度为25 μ g/ml ；且特别是浓度 为10 μ g/ml的具有抗微生物活性的多肽在相关微生物生长底物中于37°C温育8小时后 (优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，且特别是30分钟后)可将肺炎链球菌 (ATCC 49619)的活细胞数目减少至1/100。
具有抗微生物活性的多肽当以500 μ g/ml的浓度加入；优选当以250 μ g/ml的浓 度加入；更优选当以100 μ g/ml的浓度加入；甚至更优选当以50 μ g/ml的浓度加入；最优 选当以10 μ g/ml的浓度加入；以及特别是当以5 μ g/ml的浓度加入时，在相关微生物生长 底物中于37°C也可将肺炎链球菌(ATCC 49619)的长出(outgrowth)抑制8小时。
本发明的多肽具有至少20 %，优选至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %， 更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，且甚至最优选 至少100%的由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性。
防卫素(Defensin)术语“防卫素”用于本文意指本领域的技术人员所识别为属 于抗微生物肽的防卫素类的多肽。为确定一种多肽是否为根据本发明的防卫素，其氨基酸序列优选通过使用可自由得到的HMMER软件包，与PFAM数据库的隐藏马尔科夫模型谱 (hidden markov model profile) (HMM 谱(HMM profile))比较(参见实施例 1)。
PFAM防卫素家族包括防卫素1或“哺乳类防卫素”(登录号PF00323)、防卫素2或 “节肢动物防卫素”(登录号PF01097)、防卫素β或“β防卫素”(登录号PF00711)、防卫 素_propep或“防卫素前肽”(登录号PF00879)与γ-硫堇(gamma-thionin)或“ γ -硫堇 家族”(登录号PF00304)。
防卫素可属于α -防卫素类、β -防卫素类、θ -防卫素类、昆虫或节肢动物防卫素 类、或植物防卫素类。
在一个实施方案中，根据本发明的防卫素的氨基酸序列包含4、5、6、7、或8个半胱 氨酸残基，优选4、5、或6个半胱氨酸残基、更优选4或6个半胱氨酸残基、且最优选6个半 胱氨酸残基。
防卫素也可为享有任何防卫素类的特性特征的合成防卫素。
这样的防卫素的实例包括(但不限于)α-防卫素ΗΝΡ-1(人中性粒细胞 肽)、ΗΝΡ-2 与 ΗΝΡ-3 ； β -防卫素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫堇 (Yl-purothionin)、昆虫防卫素 Α、和 PCT 申请 WO 99/53053,WO 02/06324,WO 02/085934、 WO 03/044049, WO 2006/050737 和 WO 2006/053565 中所公开的防卫素。
分离的多肽术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指自来源分离的变体 或多肽。在一方面，该变体或多肽为至少纯的，优选至少系5%纯的，更优选至少10% 纯的，更优选至少20 %纯的，更优选至少40 %纯的，更优选至少60 %纯的，甚至更优选至少 80 %纯的，且最优选至少90 %纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。
基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”于本文代表一种多肽制备物，其含有以 重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选 至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，且甚至最优选至多0. 5 %的与其天然或重 组结合的其它多肽材料。因此，优选地，基本上纯的多肽按该制备物中存在的总多肽材料的 重量计为至少92 %纯的，优选至少94 %纯的，更优选至少95 %纯的，更优选至少96 %纯的， 更优选至少96%纯的，更优选至少97%纯的，更优选至少98%纯的，甚至更优选至少99% 纯的，最优选至少99. 5%纯的，且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯 的形式。这可以通过以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该多肽来完成。
同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性” 描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的 Needle 程序， 优选3. 0. 0或更晚版本中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 :443-453)来确定。所使用的任选参数为缺口开放罚分(gap open penalty) 为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记 为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并计算 如下
(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如于EMBOSS包 (EMBOSS 欧洲分子生物开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice 等，2000，如上；http://emboss, org)的 Needle 程序，优选 3. 0. 0 或更晚版本 中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，如上)测定。所使用的任 选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本) 取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)作为 百分比同一性并计算如下
(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)。
等位变体术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两 种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因 突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。 多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO 1的氨基酸序列组成的多肽 或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是 一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(数个)氨基酸侧链 的置换；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特别地，修饰可为酰胺化， 例如C-端的酰胺化。
具有抗微生物活性的多肽
在第一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO :1( S卩，成熟多肽)有至少80%，优选 至少85%，更优选至少90%，最优选至少95%，且特别地至少97%同一性程度的氨基酸序 列的分离的多肽，其具有抗微生物活性(以下称“同源多肽”)。在一个优选的方面，同源多 肽具有与SEQ ID NO :1的氨基酸序列相差至多六个氨基酸，优选至多五个氨基酸，更优选至 多四个氨基酸，甚至更优选至多三个氨基酸，最优选至多两个氨基酸，且特别地是一个氨基 酸的氨基酸序列。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列或其等位变体。在一个优选的 方面，多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID N0:1的 氨基酸序列或其等位变体组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO :1的氨基酸序列 组成。
优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸 取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；单缺失；小的氨基-或羧基-末端 延伸；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小 延伸，如多组氨酸标签(poly histidine tag)、抗原表位(antigenic印itope)或结合域 (binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、 酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨 基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小 氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍发生的交换是 Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。
除了 20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基 异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非 保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨 基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结 构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲 基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham 和Wells，1989，Science M4 :1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术 中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即， 抗微生物活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等， 1996，J.Biol. Chem. 271 =4699-47080生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定， 如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点 氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBS Lett. 309 :59_64。必需氨基酸的身份 (identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方 法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公开的那 些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌 体展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的 克隆的、诱变的多肽的活性。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使 用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的 重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽为防卫素多肽，优选防卫素多肽。
N-端延伸
本发明的多肽的N-端延伸可适当地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤 其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施 方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_样切割位点，如在下文进一步定义的。在一个优选的 实施方案中，N-端延伸为肽，其包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基，如包含以 下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。
Kex2 位点
Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel编，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 样位点为在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间存在的二元的(dibasic)识别位点(即，切割位点)ο
插入kex2位点或kex2_样位点已在某些情况中显示改进于前肽切割位置的正确 内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。
在本发明的上下文中，插入kex2或kex2_样位点导致在N-端延伸中某个位置处 获得切割的可能性，造成抗微生物的多肽与SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延长。
融合的多肽
本发明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽被融合于 本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部 分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是 本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合的多肽 的表达在相同启动子和终止子的控制下。
方法和用途
本发明涉及本发明的多肽用于治疗脑膜炎之用途。因此，本发明的多肽可用作为 抗微生物的兽用或人用治疗剂或预防剂。因此，本发明的防卫素变体可用于制备供治疗脑 膜炎之用的兽用或人用治疗剂或预防剂。
本发明的多肽可以足以杀死链球菌属菌种(如肺炎链球菌)或抑制链球菌属菌种 (如肺炎链球菌)生长的量使用。
本发明的多肽的配制物被施用于患有(suffering from)或易感染(predisposed to)脑膜炎(如细菌性脑膜炎，例如肺炎球菌脑膜炎)的宿主。在一个实施方案中，脑膜炎 由青霉素抗性肺炎链球菌感染引起。
施用可为局部的或全身的(systematic)。一般而言，本发明的抗微生物多肽的剂 量会足以通过至少1 log，且可为2个以上log的致死而将微生物群体减少。本发明的多肽 系以减少微生物群体同时最小化任何副作用的剂量施用。期望的是获得组合物并在医师的 指导下使用以用于体内用途。
可采用多种施用方法。多肽配制物可口服给予，或可血管内、肌肉内、皮下、腹膜注 射、通过气溶胶、眼部(opthalmically)、膀胱内、局部等方式施用。治疗配制物的剂量变化 会很大，取决于待施用的特定抗微生物多肽、施用的频率、施用的方式、药剂自宿主的清除 等。初始剂量可较大，然后为较小的维持剂量。在许多情况中，口服施用会需要比静脉内 施用更高的剂量。酰胺键，以及氨基与羧基端，可进行修饰以在口服施用时具有较大的稳定 性。例如，羧端可经酰胺化。
配制物
本发明的多肽可并入多种配制物中用于治疗施用。更具体地，本发明的多肽可通 过与适合的、医药上可接受的载体或稀释剂组合而配制成药物组合物，且可配制成固体、半 固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、粉末、颗粒(granules)、软膏(ointment)、 乳霜(cream)、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂(lotion)和气溶胶。 按原样，多肽的施用可以多种方式实现，其包括口服施用、颊施用、直肠施用、非消化道 (parenteral)施用、腹膜内施用、皮内施用、透皮施用、气管内施用等。本发明的抗微生物多 肽在施用后可为全身性或可为局部化的。
本发明的多肽可单独施用、彼此组合施用、或它们可与其它已知化合物(例如，穿 孔素(perforin)、抗炎剂、抗生素等)组合使用。在医药剂型中，多肽可以其医药上可接受 的盐的形式施用。以下方法与赋形剂仅为例示性的而非以任何方式限制。
对于口服制备物，多肽可单独使用或与适合的添加剂组合以制造片剂、粉末、颗 粒或胶囊，例如，与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂 (binder)，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶组合；与 崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组 合；以及如果需要，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和调味剂结合。
多肽可通过将它们溶解、悬浮、或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其它 类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇)中，以及如果需要，与常规的 添加剂(例如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂)结合，而配制成用于注射 的制备物。
多肽可用于气溶胶配制物中以经由吸入施用。本发明的多肽可配制成加压的可接 受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，多肽可通过与多种基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制 成栓剂。本发明的多肽可经由栓剂而直肠施用。栓剂可包括媒介物，例如可可脂、碳蜡 (carbowax)和聚乙二醇，其在体温融化，但在室温固化。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂型，如糖浆、酏剂和悬浮剂，其中每个剂量单 位，例如茶匙量、汤匙量、片剂或栓剂)包含预定量的组合物，所述组合物包含一种或多种 本发明的多肽。类似的，用于注射或静脉内施用的单位剂型可包含组合物中的本发明的多 肽，而该组合物作为无菌水、一般盐水或另一个医药上可接受的载体中的溶液。
用于持续释放配制物的移植物是本领域中公知的。移植物以生物可降解的或非生 物可降解的聚合物配制成微球、平板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可 侵蚀性聚合物，其可良好地被宿主所容忍。包含本发明的抗微生物多肽的移植物置于接近 感染的位点，使得活性剂的局部浓度相对于身体的其余部分增加。
用于本文，术语“单位剂型”意指物理上地分开的单位，其适合作为用于人和动 物受试者的单元剂量，每个单元包含预定量的本发明的多肽，该量经计算为足够产生期望 效果的量，所述多肽与医药上可接受的稀释剂、载体或媒介物组合。本发明的单位剂型的 规格取决于所采用的特定多肽和待实现的效果、以及在宿主中与多肽相关的药效动力学 (pharmacodynamics)0
医药上可接受的赋形剂，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众容易获得的。此 外，医药上可接受的辅助物质，如PH调整与缓冲剂、张度调节剂(tonicity adjusting agent)、稳定剂、润湿剂等，是公众容易获得的。
用于全身性施用的通常剂量的范围为0. Ipg至100毫克每公斤受试者重量每次 施用。通常剂量可为每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一颗延时-释放的 (time-release)胶囊或片剂，且包含成比例更高含量的活性成分。延时-释放效果可通过 在不同PH值溶解的胶囊材料、通过由于渗透压缓慢释放的胶囊、或通过任何其它已知的控 制释放方法而获得。
本领域的技术人员容易理解的是剂量水平可作为特定多肽、症状的严重性、受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定多肽比其它更有潜力。用于给定多肽的优选 剂量可由本领域的技术人员通过多种手段容易地确定。一个优选的手段为测量给定多肽的 生理潜力(physiological potency)。
使用脂质体作为递送媒介物是一种所关注的方法。脂质体与目标位置的细胞融合 并将内腔的内容物在细胞内递送。维持脂质体与细胞接触一段足够融合的时间，其使用多 种方法以维持接触，如分离、结合剂等。在本发明的一个方面，脂质体经设计以气溶胶化用 于肺部施用。脂质体可以介导膜融合的纯化蛋白质或肽(如，仙台病毒或流感病毒等)制 备。脂质可为已知的脂质体形成性脂质的任何有用组合，包括阳离子脂质或两性离子脂质， 如磷脂酰胆碱。剩下的脂质通常为中性或酸性脂质，如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油寸。
为了制备脂质体，可使用Kato等(1991) J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。 简言之，脂质与包含肽的内腔组合物在适合的水性介质(方便地为盐水介质)中组合，其中 总固体在大约1-10重量百分比的范围内。在短时间(大约5-60秒)激烈地搅动后，将管 子置于温水浴(大约25-40°C )并重复此循环大约5-10次。然后对组合物进行声处理一段 方便的时间(一般大约1-10秒)并可进一步通过漩涡震荡而搅动。然后通过加入水性介 质扩增体积，一般将体积增加大约1-2倍，然后摇动并冷却。此方法允许将高分子量分子并 入内腔中。
具有其它活性剂的配制物
为了用于本方法，本发明的抗微生物多肽可与其它医药活性剂(特别是其它抗 微生物剂)一起配制。所关注的其它药剂包括广大范围的抗生素，如于技术领域中已 知的。抗生素的类型包括青霉素类，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、 苯唑西林(oxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄青霉 素等；青霉素类与β -内酰胺酶抑制剂、头胞菌素的组合，例如头孢克洛(cefaclor)、头 孢唑林(cefazolin)、头孢呋辛(cefuroxime)、拉氧头孢(moxalactam)等；碳青霉烯类 (carbapenems)；单酰胺菌素类(moncAactams)；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可 霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑 (metronidazole)；大观霉素；甲氧节唆(trimethoprim)；万古霉素等。
抗霉菌剂(包括多烯类，例如两性霉素B (amphotericin B)、制霉菌素； 5-flucosyn ；以及唑类，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康 唑(itraconazol)与氟康唑(f luconazol))也是有用的。抗结核药物包括异烟胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、链霉素和利福平(rifampin)。细胞因子(例如干扰 素Y、肿瘤坏死因子α、白介素12等)也可包括于本发明的抗微生物多肽的配制物中。
体外合成
本发明的多肽可通过体外合成使用如本技术领域中已知的方便方法制备。多种商 业合成设备(例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自动化合成仪等)是可获得的。 通过使用合成仪，可以非天然氨基酸(特别是D-同型异构物(或D-型)，例如D-丙氨酸 与D-异亮氨酸、非对映异构物、具有不同长度或官能团的侧链等)取代天然存在的氨基酸。 制备的特定顺序与方式可通过方便性、经济性、所需纯度等确定。
可将化学结合提供给多种肽或蛋白质，其包括方便的用于键合的官能团，如用于酰胺或取代的胺(例如还原性胺化)形成的氨基、用于硫醚或双硫键形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。
如果需要，可在合成过程中或在表达过程中将多个基团(其允许结合至其它分子 或结合至表面)导入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用组氨酸以连结于金属 离子复合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。
多肽也可根据常规的重组合成方法而分离和纯化。可制备表达宿主的裂解物，而 该裂解物使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析、或其它纯化技术纯化。一般来说，所使 用的组合物会包含按重量计至少20%的期望产物，更通常按重量计至少大约75%，优选按 重量计至少大约95 %，以及为了治疗目的，通常按重量计至少大约99. 5 %，其系相对于与 产物的制备及其纯化方法有关的污染物而言。通常，百分比会基于总蛋白质。
通过以下实施例进一步描述本发明，且所述实施例不应被理解为限制本发明的范 围。实施例
实施例1
#用来自PFAM数据库的HMMf件以鉴定防下.素
可在因特网上在线或在本地于计算机上，使用公知的HMMER可自由得到的软件 包，使用隐藏马尔科夫模型谱进行序列分析。目前的版本是HMMER 2.3.2，2003十月。
HMM谱可获得自公知的PFAM数据库。目前的版本是PFAM 16. 0,2004 i^一月。对 于所有平台，HMMER与PFAM两者皆可得自(例如)美国华盛顿大学圣路易斯分校医学院 (Washington University in St. Louis(USA), School of Medicine)(http://pfam. wustl. edu 禾口 http://hmmer. wustl. edu)。
若查询氨基酸序列(或其片段)属于以下五个PFAM家族之一，则该氨基酸序列是 根据本发明的防卫素
-防卫素或“β防卫素”登录号PF00711；
-防卫素_prop印或“防卫素前肽”登录号PF00879；
-防卫素_1或“哺乳动物防卫素”登录号PF00323；
-防卫素_2或“节肢动物防卫素”登录号PF01097；
-γ-硫堇或“γ -硫堇家族”登录号PF00304。
当在线使用PFAM数据库时，或当hmmpfam程序(来自HMMER软件包)在本地使用 时，若氨基酸序列产生大于0. 1的E-值和大于或等于零的分数，根据本发明，其属于PFAM家族。
当序列分析使用hmmpfam程序在本地进行时，需要自PFAM数据库获得(下载) HMM谱。每个家族存在两个谱；用于全局搜索的XXX_ls.hmm，以及用于局部搜索的xxx_ fs.hmm( “XXX”系家族的名称)。这使以上提及的五个家族共有十个谱。
此十个谱可独立地使用，或可结合(附加)成单谱(使用文本编辑器-该谱为 ASCII文件)，其可被命名为(例如Wefensin.hmm。然后可使用以下命令行评估查询氨基 酸序列
hmmpfam-E 0. ldefensin. hmm sequence_file
-其中“Sequence_file”是文件，其具有可由HMMER软件包识别的任何格式的查询氨基酸序列。
若分数大于或等于零(0.0)，且E-值大于0. 1，查询序列是根据本发明之防卫素。
PFAM 数据库进一步描述于 Bateman 等 Q004) "The Pfam Protein Families Database，，，Nucleic Acids Research, Vol. 32 (Database Issue) pp. D138-D141。
实施例2
研究在脑腊炎i寸蔣中合成的防下.素的CSF穿诱禾Π杀细菌效果
将青霉素抗性血清型9V肺炎链球菌的分离物(1395)，其原始分离自患有 脑膜炎的78岁年长女性的CSF，用于脑膜炎模型中。此菌株先前被用于评估使用 Moxifloxacin(莫西沙星)治疗脑膜炎的有效性(参见Ostergaard等“Evaluation of moxifloxacin, a new 8-methoxyquinolone, for treatment of meningitis caused by a penicillin-resistant pneumococcus in rabbits，，， Antimicrob Agents Chemother, vol. 42(7)，pp.1706-1712(1998))。
该菌株的毒性通过将细菌通过小鼠腹膜炎模型继代而增强。使来自取样的腹膜流 体的细菌在血液琼脂板上生长，回收并以加入10%甘油的牛肉汤(beef-broth)稀释与冷 冻在_80°C。
解冻细菌等分试样并生长在血液琼脂板上，悬浮在无菌牛肉汤中以达到在MOnm 的3. 5光学密度，并随后稀释以获得最终浓度为1-2 X 106CFU/ml。
用于实验的合成防卫素为具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的多肽。在实施例 中，此合成的防卫素称为“Meningicin”。Meningicin针对肺炎链球菌(1395)的最小抑制 浓度(minimium inhibitory concentration, MIC)测定为 0· 25 μ g/ml。
在功效研究中，将Meningicin在清除脑膜感染中的有效性与头孢曲松 (Ceftriaxone，其为频繁用于治疗患有青霉素抗性菌株的肺炎球菌脑膜炎的患者的抗生 素)的有效性和不给予治疗(“媒介物”)的效果比较。头孢曲松针对肺炎链球菌(1395) 的MIC测定为0. 5μ g/ml。
脑膜炎模型
将重量约2500g的雄性新西兰白兔用于实验中。兔子于实验1-2周前到达实验室 (facilities)以允许适应。将它们放在以干草覆盖的单独笼子中并无限制提供食物和水。 实验室有兽医专家，且实验设计由当地的动物法规委员会批准。
为了固定在立体定位头架(stereotactic frame)中的准备
将兔子称重并以多美康(dormicum)O. 5ml/kg(咪达唑仑(midazolam) 5mg/ml)皮 下注射(s. c.)和在10分钟后以hypnorm 0. 35ml/kg (柠檬酸芬太尼(fentanylcitrat) + 氟阿尼酮(fluanison))肌肉注射(i. m.)麻醉。
将兔子的耳朵、头皮和颈部刮毛并将皮肤消毒。在兔子的前额上制造大小大约km 的切口并将头皮通过钝剥离(blunt dissection)暴露。制造界定一个正方形的4个钻孔 并以直角将4个螺钉拧到表面上O. 5至3转)。从牙科铸造材料直接将丙烯酸酯类盔(嵌 有螺丝扣)铸造在兔子之头皮上并以流动的水冷却盔。将兔子放回其笼子中并无限制提供 食物和水以休息8-10小时，直到细菌接种的时间或对未经感染兔子的药物动力学治疗研 究开始。给予丁丙诺啡(buprenorfin)，。. lmg/kg止痛。
细菌接种
在晚上，于10p.m.，在使用Meningicin进行治疗实验的前一天，将兔子以 hypnorm-多美康再麻醉。将兔子之头部固定在立体定位头架中并将脊髓套管(spinal canula)导入小脑延髓池(cistema magna)中用于接种1 X IOtFU肺炎球菌。在细菌接种 后，将兔子放回其笼子并使其可取用食物和水另8小时。给予丁丙诺啡(0. lmg/kg)止痛 (注意未感染的兔子不经历细菌接种程序)。
(setup)
于7. 30a. m 将兔子以乌拉坦(urethan) 3. 5ml/kg(丙烯酸二甲酯 50%,1. 75g/kg) 皮下注射再麻醉。将静脉导管施加于左耳静脉并缓慢地灌注Mebumal (戊巴比妥)大约 0. 5-lml (戊巴比妥(pentobarbital) 50mg/ml)静脉注射(i. v.)直到兔子入睡并被深度麻 醉。将三通弯头(three-way tap)连接至静脉导管并将包含用于追加麻醉的戊巴比妥和用 于冲洗的等张NaCl与肝素lUI/ml的注射器连接至弯头。每半小时观察兔子一次。当需要 追加麻醉时，给予另外0. 2ml的Mebumal (戊巴比妥50mg/ml)。在实验期间将观察和麻醉记 录在实验室动物部门的方案中和实验室动物审视书(the book of the Laboratory Animal Inspection)中。
将动脉套管施加于右耳动脉并在整个实验过程中用于血液取样。将螺栓紧固至嵌 在丙烯酸酯类盔中的螺扣，并将兔子之头部固定在立体定位头架中。在整个实验过程中使 兔子维持固定。
以脊髓套管穿刺小脑延髓池，紧固至立体定位头架。在整个实验过程中使套管维 持正确的位置并用于CSF取样。
在与所实施实验有关的时间点，将Iml的血液和0.3ml的CSF从动脉套管/脊 髓针吸出并转移至EDTA管/Eppendorf管。在最后一次取样后，终止实验并以过量的 Mebumal (戊巴比妥200mg/ml)杀死兔子。
iMr
Meningicin的CSF和血浆浓度通过使用HPLC测量。当评估在接种体和样本中的 细菌浓度时，使用在血液琼脂板上铺板成为50 μ 1的点的系列10倍稀释(需要20 μ 1的测 试材料)以计算CFU/ml。
具体到对药物动力学研究
在实验开始10分钟以静脉内大量灌注将Meningicin (剂量分别为20、40和80mg/ kg)通过三通弯头施用。
用于研究Meningicin通过发炎脑膜的穿过的兔子如以上所述感染并等待直到细 菌接种后10小时的静脉注射Meningicin施用。使用两只兔子的组研究Meningicin于3 个不同剂量通过发炎和未发炎脑膜的穿透(对应的CSF和血浆水平)。血液和CSF在施用 Meningicin 后 0、1/4、1/2、1、11/2、2、3、4、5 和 6 小时取样以测定 Meningicin 浓度(HPLC)。 基于MIC和对于Meningicin所观察的药物动力学，建立用于治疗试验的剂量方案。
具体到功效研究
在施用脊髓套管后，将0. 5ml的CSF吸入注射器中。在接种前将0. Iml用于溶解 细菌接种物并将0. 2ml用于之后冲洗注射器和导管。制备接种物的系列10倍稀释物以确 认感染性剂量。
使用Meningicin或头孢曲松治疗在细菌接种后10_11小时起始。在静脉内剂量 的抗生素之后0、1、3、5、6和10小时取样血液和脑脊液。测定抗生素浓度和细菌计数。
药物动力学的结果
如上所述，将Meningicin以剂量20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg施用。测量来自经 感染兔子的血清中Meningicin的浓度并计算“曲线下面积”(AUC血清)。同样地，测量脑 脊液(CSF)中的Meningicin的浓度并计算“曲线下面积”(AUC CSF)。
Meningicin 剂量(mg/kg)在血清中的峰 农度(ng/l)AUC血 清细/1)在CSF中的峰 浓度AUC CSF (μ8/ )血脑屏障的 Meningicin 穿透
权利要求
1.一种具有抗微生物活性的多肽在制备用于治疗脑膜炎的药物中的用途，所述多肽包 含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
2.一种具有抗微生物活性的多肽，其用于治疗脑膜炎，所述多肽包含与SEQ ID NO 1 的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.一种治疗脑膜炎的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的，例如抗脑膜炎 有效量的具有抗微生物活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少 90%同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的用途、多肽或方法，其中所述多肽包含与SEQID N0:1的 氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，优选其中所述多肽包含SEQ ID N0:1的多 肽或由SEQ ID NO 1的多肽组成。
5.权利要求1-3中任一项的用途、变体或方法，其中所述多肽为防卫素多肽，优选 β-防卫素多肽。
6.权利要求1-3中任一项的用途、变体或方法，其中所述脑膜炎为细菌性脑膜炎。
7.根据权利要求6的用途、变体或方法，其中所述细菌性脑膜炎由链球菌属菌种 (Streptococcus sp)的感染弓I起。
8.根据权利要求6的用途、变体或方法，其中所述细菌性脑膜炎为肺炎球菌脑膜炎。
9.根据权利要求6的用途、变体或方法，其中所述肺炎球菌脑膜炎由青霉素抗性肺炎 链球菌(Streptococcus pneumoniae)的感染弓I起。
全文摘要
本发明涉及以防卫素多肽治疗脑膜炎，如细菌性脑膜炎的方法。
文档编号A61K38/17GK102036678SQ200980117980
公开日2011年4月27日 申请日期2009年3月30日 优先权日2008年4月4日
发明者多思·桑德范, 汉斯-亨里克·K·霍根豪格 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
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