短螺旋体的新序列、免疫原性组合物、制备方法及其用途的制作方法
专利名称：短螺旋体的新序列、免疫原性组合物、制备方法及其用途的制作方法
短螺旋体的新序列、免疫原性组合物、制备方法及其用途发明领域本发明涉及猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)的新基因和其中编 码的蛋白质。本发明还涉及这些新基因和蛋白质用于诊断猪痢疾短螺旋体病、抗猪痢疾短 螺旋体疫苗，和用于筛选杀死猪痢疾短螺旋体或阻断猪痢疾短螺旋体的病理效应的化合 物的用途。这些序列还可以用于诊断性和治疗性和/或预防性地治疗动物内由其他短螺 旋体属物种所致的疾病，其中所述的其他短螺旋体属物种包括密螺旋体(B. intermedia), B. alvinipulli、阿尔堡短螺旋体(B. aalborgi)、无害短螺旋体(B. innocens)、 B. murdochii 和多毛短螺旋体(B. pilosicoli)。背景猪痢疾是在澳大利亚和世界范围内主要的地方流行性猪疾病。猪痢疾是传染性黏 膜出血(mucohaemorrhagic diarrhoeal)疾病，其特征是大肠上皮表面的广泛炎症及坏死。 因猪痢疾所致的经济损失主要由生长迟缓、药疗法成本和死亡率造成。猪痢疾的病原体在 1971年最初鉴定为厌氧螺旋体(猪痢疾密螺旋体(Tr印onema hyodysenteriae))并且最近 重新划分至短螺旋体属(Brachyspira)为猪痢疾短螺旋体(B. hyodysenteriae)。猪痢疾在 猪舍中建立，其疾病谱可以从温和、短暂性或不明显变化至严重或致死。各猪舍内的药疗法 策略可能掩盖临床病征并且在一些猪舍内疾病可能被忽略或可能仅为可疑。无论明显的疾 病是否发生，猪痢疾短螺旋体可以保持于感染猪内或其他储存宿主如啮齿类动物内或在环 境中。所有这些来源为疾病传染至未感染猪群提供潜在可能。猪痢疾短螺旋体也可在商业 家禽中建群，尽管不清楚这在野外条件下发生的有多普遍。猪痢疾短螺旋体的建群激发强烈的抗螺旋体免疫应答，因此暴露于螺旋体的间接 证据可以通过测量感染动物血内的循环抗体滴度而获得。已经报道这些抗体滴度维持于低 水平，即便在已从猪痢疾中恢复的动物内也是如此。因此认为检测抗体的血清学试验具有 检测亚临床感染和在其大肠内具有不可检测数目的螺旋体的恢复猪携带者的巨大潜力。这 些试验作为易用试剂盒形式如酶联免疫吸附测定时将特别有价值。已经开发多种技术以 证实存在抗猪痢疾短螺旋体的循环抗体，这些技术包括间接免疫荧光抗体试验、血凝试验、 微量滴定凝集试验、补体激活试验和使用脂多糖或经超声波破碎的完整螺旋体作为抗原的 ELISA0所有这些试验都遭受特异性问题的困扰，因为相关的非致病性肠道螺旋体可以诱导 交叉反应抗体。这些试验可用于检测其中存在明显疾病和高循环抗体滴度的畜群，但是这 些试验在鉴定亚临床感染畜群和感染猪个体上存在问题。因此，迄今没有用于检测抗猪痢 疾短螺旋体抗体的非常灵敏而特异的测定法。合适诊断试验的缺乏已经妨碍猪痢疾的控 制。使用多种方法以控制猪痢疾，这些方法包括预防性使用抗微生物剂以完全转移感 染畜群并防止感染携带猪的再进入。所有这些选项代价高昂，并且如果它们充分有效，则 需要使用复杂的诊断试验以监测进度。目前，对亚临床感染猪痢疾的畜群和单个健康携带 动物的检测仍是主要难题并且正在妨碍执行有效的控制措施。确定性诊断猪痢疾通常需要 分离并鉴定来自病猪粪便或黏膜的猪痢疾短螺旋体。所涉及的主要困难包括这些厌氧细菌生长缓慢及其营苛刻的营养要求，以及因猪肠道正常菌群内存在形态学相似的螺旋体所致 的混淆。显著改进感染猪个体的诊断通过开发检测来自粪便的螺旋体的聚合酶链式反应 (PCR)测定而实现。不幸的是在实际应用中，PCR检测的限制使它们不能够检测到具有亚临 床感染的携带动物。由于这些诊断难题，显然需要能够在猪群和个体水平检测猪痢疾短螺 旋体感染的简单而高效的诊断工具。强烈的抗螺旋体免疫应答在猪痢疾短螺旋体建群后被诱导，并且从猪痢疾中恢复 的猪受到保护而不发生再感染。尽管如此，开发疫苗以控制猪痢疾的尝试仅获得非常有限 的成功，因为这些疫苗不提供基于畜群的充分保护，或生产它们过于昂贵且困难以至于它 们没有商业实用性。菌苗疫苗提供某些水平的保护，但是菌苗疫苗总是脂多糖血清群特异 性的，因此需要使用多价菌苗。此外，菌苗疫苗因螺旋体苛刻的厌氧生长条件而在大规模生 产时困难且昂贵。已经数度尝试开发用于猪痢疾的减毒活疫苗。这种方法具有如此缺点，即减毒株 表现建群减少并因此导致免疫刺激减少。生产者和兽医人员方面因为存在毒力回复可能而 不愿意使用猪痢疾活疫苗，尤其当对猪痢疾短螺旋体内的遗传调节及组成知之甚少时。使用重组亚单位疫苗是有吸引力的选择，因为此类产物将是充分定义的(主 要因注册目的)并且相对容易大规模生产。迄今，首个已报道的利用来自猪痢疾短螺 旋体重组蛋白的候选疫苗(38Kd鞭毛蛋白)没有防止猪内建群。这种失败可能具体涉 及所用的特定重组蛋白，以及涉及如送递系统和途径、剂量率、佐剂的选择等其他下游事 件(Gabe, JD、Chang, RJ、SIomiany, R、Andrews，WH 禾口 McCaman，MT (1995)， Isolation of extracytoplasmic proteins from Serpulina hyodysenteriae B204 and molecular cloning of the flaBl gene encoding a 38-kilodalton flagellar protein. Infection and Immunity 63:142-148)。最早报道的用于接种的具有部分保护性的重组猪痢疾短 螺旋体蛋白是与多种病原菌的甲硫氨酸结合脂蛋白具有同源性的29. 7kDa外膜脂蛋白 (Bhlp29. 7，又称作BmpB和BlpA)。使用his标记的重组Bhlp29. 7蛋白对猪接种，随后 用猪痢疾短螺旋体实验性攻击，与未接种的对照猪50-70%发生疾病相比，导致已接种的 猪17-40%发生疾病。由于Bhlp29. 7接种的猪的疾病发生率显著低于(P = 0. 047)对照 猪，因此Milp^. 7似乎具有作为猪痢疾疫苗成分的潜质(La, T，Phillips, ND, Reichel, MP 禾口 Hampson, DJ (2004)Protection of pigs from swine dysentery by vaccination with recombinant BmpB, a 29. 7kDa outer-membrane lipoprotein of Brachyspira hyodysenteriae. Veterinary Microbiology 102:97-109)。已经进行其他众多尝试以鉴 定来自猪痢疾短螺旋体的可作为重组疫苗成分使用的外包被蛋白，但是仍然还是没有产生 成功的疫苗。需要更全面的方法以鉴定来自猪痢疾短螺旋体的潜在有用的免疫原性重组蛋 白。迄今，仅报道一项使用DNA用于接种的研究。在该项研究中，将编码推定铁蛋白 (ferritin)的猪痢疾短螺旋体ftnA基因克隆至大肠杆菌质粒并且使用该质粒DNA来包 被用于射弹法接种的金珠。使用猪痢疾的小鼠模型来确定用DNA和/或重组蛋白接种的 保护性基本特征。用重组蛋白接种诱导了抗铁蛋白的良好全身性应答，然而，用DNA接种 仅诱导了可检测的全身性应答。用DNA接种，随后用重组蛋白加强，则仅在用蛋白质加强 后才诱导全身性免疫应答。然而测试的接种方案没有一个能够向小鼠提供抗猪痢疾短螺旋体建群及相关损伤的保护。有趣的是，仅用DNA接种小鼠造成了疾病显著恶化(Davis， A. J.、Smith, S. C.禾口 Moore, R. J. (2005). The Brachyspira hyodysenteriae ftnA gene DNA vaccination and real-time PCR quantification of bacteria in a mouse model of disease. Current Microbiology 50 :285-291)。发明概述发明者鉴定了猪痢疾短螺旋体的新基因和这些基因编码的蛋白质。他们还进一步 鉴定出这些新基因和蛋白质可用于治疗和诊断目的。此外，发明者鉴定了这些基因和/或 蛋白质可用作抗猪痢疾短螺旋体的疫苗和/或诊断猪痢疾短螺旋体的感染。因此，在第一 个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，包含选自SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17和 19的核苷酸序列。本发明还提供和SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19同源的核苷 酸序列，其中同源性可为95%、90%、85%、80%、75%和70%。本发明还包括DNA疫苗或 DNA免疫原性组合物，其包含SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的核苷酸序列以及 与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明还包括诊断性测定法， 其包含具有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19的核苷酸序列的DNA，以及具有与这 些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列的DNA。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条编码选自SEQ ID N0:l、3、5和 7的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条编码选自SEQ ID NO :1、3、5 和7的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由编码选自SEQ ID NO :1、3、5和7的分子 的多核苷酸组成的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少2条编码选自SEQ ID NO :9、11、 13和15的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条编码选自SEQ ID NO :9、11、 13和15的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由编码选自SEQ ID N0:9、ll、13和15的分 子的多核苷酸组成的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少2条编码选自SEQ ID N 0 17和 19的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为下述疫苗组合物，包含(i)至少一条编码选自SEQ ID NO :1、3、5和7的分子的多核苷酸；和/或(ii)至少一条编码选自SEQ ID NO :9、11、13和15的分子的多核苷酸和/或(iii)至少一条编码选自SEQ ID NO 17和19的分子的多核苷酸用于治疗或预防短螺旋体相关的猪痢疾。本发明还提供包含具有SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19序列的DNA的 质粒；包含具有SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19序列的DNA的原核和/或真核表 达载体；和包含质粒的细胞，所述质粒包含具有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19 序列的DNA。在第二个方面，本发明提供了分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列。本发明还提供了具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18和20中所包含的氨基酸序列的新猪痢疾短螺旋体蛋白质。本发明还提供了与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 包含的序列 95%、90%、85%、80%、75%和 70% 同源的 蛋白质。本发明还提供了疫苗或免疫原性组合物，包含具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18和20包含的氨基酸序列或与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20包含的序 列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条选自SEQ ID NO :2、4、6和8的 多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条选自SEQ ID NO :2、4、6和8 的多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由SEQ ID NO :2、4、6和8的多肽组成的疫 苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条选自SEQ ID NO 10、12、14和16 的多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条选自SEQ ID N0:10、12、14和 16的多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由来自SEQ ID NO :10、12、14和16的多肽 组成的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条选自SEQ ID NO 18和20的多 肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为下述疫苗组合物，包含⑴至少一条选自SEQ ID NO :2、4、6和8的多肽和/或(ii)至少一条选自SEQ ID NO: 10、12、14和16的多肽和/或(iii)至少一条选自SEQ ID NO 18和20的多肽用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在第三个方面，本发明提供了诊断短螺旋体感染的方法，包含(a)提供来自疑为 感染了短螺旋体的动物的样品；(b)将样品与一种或多种包含选自SEQ ID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的多肽接触；(c)在允许形成抗体-抗原复合物的条 件下将样品和多肽孵育；和(d)确定一种或多种多肽是否形成抗体-抗原复合物，其中抗 体-抗原复合物的形成指示动物感染短螺旋体。在第四个方面，本发明提供了用于诊断短螺旋体感染的试剂盒，包含一种或多种 包含选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的多肽。本发明的另一个方面为诊断试剂盒，包含一种或多种具有SEQ ID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18和 20包含的序列，或具有与 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和 20包 含的序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列的蛋白质。本发明的另一个方面为核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16,18和20包含的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括质粒、真核和原核表达载体和DNA 疫苗，所述质粒、真核和原核表达载体和DNA疫苗包含具有编码SEQ ID NO :2、4、6、8、10、 12、14、16、18和20包含的氨基酸序列的蛋白质的序列的DNA。本发明包括包含这些质粒和表达载体的细胞。本发明包括单克隆抗体，所述单克隆抗体与具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18和20包含的氨基酸序列的蛋白质结合，或与和SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和20包含的序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的蛋白质结合。本发明包括包含 单克隆抗体的诊断试剂盒，所述单克隆抗体与具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18和 20包含的氨基酸序列的蛋白质结合，或与和SEQ ID而2、4、6、8、10、12、14、16、18和20包 含的序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的蛋白质结合。这些诊断试剂盒可以检 测动物内猪痢疾短螺旋体的存在。所述动物优选是哺乳动物或鸟；更优选是鸡、鹅、鸭、火 鸡、鹦鹉、狗、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、奶牛、绵羊、猪、猴和人。本发明还涉及通过向动物施用DNA疫苗而预防或治疗动物内猪痢疾短螺旋体感 染的方法，其中所述的DNA疫苗含有SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17和19内所列的一 种或多种核苷酸序列，或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发 明还包括通过向动物施用含有一种或多种蛋白质的疫苗而预防或治疗动物内猪痢疾短螺 旋体感染的方法，其中所述的蛋白质含有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20包含 的氨基酸序列或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明还构思通过向动物施用免疫原性组合物而诱导动物内免疫应答的方法，其 中所述的免疫原性组合物含有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19内所列的一种或 多种核苷酸序列或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明还 包括通过向动物施用含有一种或多种蛋白质的免疫原性组合物在动物中产生免疫应答的 方法，其中所述的蛋白质具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20内所包含的氨基 酸序列或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明优选实施方案的详述在详细描述本发明之前，应当理解本发明不局限于具体的示例性方法，并且一定 可以变化。还应当理解此处使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，无意具局 限性，(本发明)仅受限于所附的权利要求书。此处引用的所有出版物、专利和专利申请，无论在以上或以下，在此处以其整体引 入作为参考。然而，引用此处提及的出版物的目的是为了描述和公开在出版物中报导的、可 能在本发明中相关使用的实验方案、试剂和载体。不应将此处的任何内容理解为承认本发 明无权作为在先发明早于这些公开。此外，除非另外指出，本发明的实施应用本领域技术范围内的传统免疫学、分子 生物学技术和药理学。这些技术是本领域技术人员所熟知的，并在文献中充分解释。见 例如 Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher 禾口 Wingfield “Current protocols in Protein &土61 ^”(1999)卷1和11001111 Wiley & Sons Inc.) ；Sambrook 等，‘‘Molecular Cloning A Laboratory Manual，，(1989),第二版(Cold Spring Harbor Laboratory press)；以及 Prescott，Harley 和 Klein "Microbiology" (1999)，第四版(WBC McGraw-Hill)。必须指出如此处使用的和在所附的权利要求书中，除非上下文明确另外指示，单 数形式“一个/种”和“该”包括提及物的复数。因此，例如，提及“一种”包括此类基因的 复数，提及“一种”是指一种或多种动物，等等。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学 术语具有如本发明所属领域普通技术人员普遍理解的相同含义。尽管可使用与此处描述的材料和方法类似或等同的任意材料和方法来实施或检验本发明，现在描述优选的材料和方法。在本发明最广义的方面，提供了新的猪痢疾短螺旋体多核苷酸，其具有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21和23包含的核苷酸序列，或由这些多核苷酸编码的氨 基酸序列(多肽)。术语“氨基酸”旨在包括包含氨基功能性和酸功能性并且能够包含天然存在的氨 基酸聚合物内的全部分子，无论其是天然的还是人工的。示例性的氨基酸包括天然存在的 氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有变异侧链的氨基酸类似物以及任何前述物质的 立体异构物。动物可以是可感染短螺旋体，特别是猪痢疾短螺旋体的哺乳动物或鸟。哺乳动物 的实例包括狗、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、奶牛、绵羊、猪、猴和人。鸟的实例包括鸡、鹅鸭、 火鸡和鹦鹉。本领域技术人员应当理解，某些短螺旋体属物种能够感染一系列宿主范围 (见，例如，Hampson 等，2006，Emerging Infectious diseases, Vol. 12 (5)，p869_870，此处以其整体引入作为参考)。因此如此处使用的术语“动物”包含许多动物，但特别是猪和家食內O术语“保守残基”指作为具有某些共同特性的氨基酸组的成员的氨基酸。术语“保 守性氨基酸置换”指将来自一个此类组的氨基酸(概念性地或其他方式)置换成来自相同 组的不同氨基酸。定义各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的对应蛋白 质的氨基酸变化的归一化频率(Schulz, G.E. ^P R. H. Schinner.，Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。根据该分析，可以定义氨基酸的组，其中组内的氨基酸主 要彼此交换，并且因此它们在其对蛋白质总体结构的影响方面彼此相似(Schul z, G.E.和 R. H. Schinner. ,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以如此方式定义 的氨基酸组的实例包括(i)包含Lys、Arg和His的带正电荷组，(ii)包含Glu和Asp的带 负电荷组，(iii)包含Wie、ΤΥι^Π ρ的芳香族组，(iv)包含His和1Trp的氮环组，(ν)包 含Val.Leu和De的非极性大脂族组，(vi)包含Met和Cys的轻度极性组，(vii)包含Ser, Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 的小残基组，(viii)包含 Val、Leu、Ile、Met 和 Cys 的脂族组和(ix)包含Ser和Thr的小羟基组。“融合蛋白”或“融合多肽”指如同本领域内已知的术语“嵌合蛋白”那样并可以使 用本领域已知技术得以构建。在融合蛋白的众多实例中，存在两种不同的多肽序列并在某 些情况下，可以存在更多种类的多肽序列。编码融合蛋白的多核苷酸序列可以符合读框地 有效连接，以至于融合蛋白可以得到正确翻译。融合蛋白可以包括来自相同物种或来自不 同物种的多肽序列。在多种实施方案中，融合多肽可以含有与第一多肽连接的一个或多个 氨基酸序列。在多于一种的氨基酸序列与第一多肽融合的例子中，融合序列可以是相同序 列的多重拷贝，或备选地可以是不同的氨基酸序列。融合多肽可以与第一多肽的氨基末端、 羧基末端，或者氨基末端及羧基末端融合。示例性的融合蛋白包括含有谷胱甘肽S-转移酶 标签(GST标签)、组氨酸标签(His-标签)、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白结合结构域的 多肽。术语“分离的多肽”指多肽，其在某些实施方案中从重组DNA或RNA中制备或是合 成来源的或自然来源的或其组合，该多肽(1)不与其天然形式的蛋白质结合、( 从该多肽通常存在的细胞内分离、⑶没有来自相同细胞来源的其他蛋白质、⑷由来自不同物种的 细胞表达或(5)不存在于自然界内。有可能分离的多肽存在但不足以称作纯化的多肽。术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”指多核苷酸，无论是基因组DNA、cDNA、 mRNA、tRNA、rRNA、iRNA,或是从细胞器(如线粒体和叶绿体)或合成来源获得的多核苷酸， 该多核苷酸(1)不与分离的核酸天然存在于其内的细胞结合或(2)与不天然连接的多核苷 酸有效连接。有可能分离的多核苷酸存在但不足以称作纯化的多核苷酸。术语“核酸”和“多核苷酸”指聚合形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖 核苷酸或是核苷酸的两种类型的修饰形式。还应当理解该术语包括等效物、从核苷酸类似 物形成的RNA或DNA的类似物并且，如适用于所述实施方案那样包括单链(如有义或反义) 多核苷酸和双链多核苷酸。术语“本发明的核酸”和“本发明的多核苷酸”指编码本发明多肽的核酸。本发明 的多核苷酸可以包含如下的全部或部分目的核苷酸序列；与目的核苷酸序列至少60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列；在严格条件下与目的 核酸序列杂交的核苷酸序列；与本发明多肽功能等效的多肽的编码核苷酸序列；与主题氨 基酸序列至少约60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%同源或相同的多肽的编码 核苷酸序列；具有本发明多肽的活性并与主题氨基酸序列具有至少约eo^jo^^so^、 85^^90%.95^^98^^99%或更多同源性或同一性的多肽的编码核苷酸序列；因1至约2、 3、5、7、10、15、20、30、50、75个或更多个核苷酸置换、添加或缺失而与目的核酸序列不相同 的核苷酸序列，如等位变体；衍生自目的核酸序列并在进化上与其相关的核酸；以及全部 前述及本发明其他核酸的互补物，以及由全部前述及本发明其他核酸的遗传密码简并性而 产生的核苷酸序列。本发明的核酸还包括目的核苷酸序列的同源物，例如直向同源物和侧 向同源物，并且还包括为特定生物(例如宿主细胞)内的表达已进行密码子优化的目的核 苷酸序列的变体。当描述两个核酸区域间的关系时，术语“有效连接的”指并列，其中这两种核酸区 域所处关系允许它们以希望的方式发挥作用。例如与编码序列“有效连接”的控制序列以 如此方式连接以至在与控制序列兼容的条件下，如当合适分子(例如诱导物和聚合酶)结 合至一个或多个控制序列或调节序列时，实现编码序列的表达。本文中可交换使用的术语“多肽”和术语“蛋白质”及“肽”指氨基酸的聚合物。示 例性多肽包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直向同源物、侧向同源物、片段以及前 述物质的其他等效物、变体和类似物。用于指参考多肽时，术语“多肽片段”或“片段”指多肽，在其中当与参考多肽本身 相比较时，氨基酸残基缺失，而剩余的氨基酸序列通常与参考多肽内的相应位置相同。这类 缺失可以出现在参考多肽的氨基末端或羧基末端或备选地在两个末端上。片段一般是至少 5、6、8或10个氨基酸长度、至少14个氨基酸长度、至少20、30、40或50个氨基酸长度、至 少75个氨基酸长度或至少100、150、200、300、500个或更多个氨基酸长度。片段可以保留 参考多肽的一种或多种生物学活性。在某些实施方案中，片段可以包含具有所需生物学活 性的结构域和任选位于结构域的一侧或两侧的额外氨基酸，其中所述的额外氨基酸可以是 从5、10、15、20、30、40、50个或至多100个或更多数目的残基。此外，片段可以包括特定区 域的亚片段，其中亚片段保留衍生自其的区域的功能。在另一实施方案中，片段可以具有免疫原性。术语“本发明多肽”指含有主题氨基酸序列或其等效物或片段的多肽。本发明多肽 包括包含主题氨基酸序列的全部或部分的多肽具有1个至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、 75个或更多个保守性氨基酸置换的主题氨基酸序列；包括与主题氨基酸序列至少60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列，及其功能性片段。本发 明多肽还包括主题氨基酸序列的同源物，例如直向同源物和侧向同源物。还有可能为了如此目的而修饰本发明多肽的结构，如增强治疗性效力或预防效力 或稳定性(例如离体(ex vivo)保存期、在体内蛋白酶解性降解抗性等)。如此修饰的多肽， 当为了保留天然存在形式的蛋白质的至少一种活性而设计时，被视作本文中更详细描述的 多肽的“功能性等效物”。可以产生如此修饰的多肽，例如通过氨基酸置换、缺失或添加，其 中置换可以全部或部分地由保守性氨基酸置换组成。例如，预计单独的保守性氨基酸置换如用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨 酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸将不会明显影响所得的分子的生物学活性，这是合 理的。多肽氨基酸序列中的变化是否产生功能性同源物可以通过评估变异多肽产生与野生 型蛋白质的应答相似的应答的能力而轻易地确定，其中可以用相同方式轻易地测试已经发 生多于一种替换的多肽。术语“纯化的”指作为主导种类存在的目标种类(即基于摩尔，其丰度超过组合 物内的其他各种类)。“纯化的级分”是组合物，在其中目标种类是全部存在种类的至少约 50% (基于摩尔)。在进行溶液或分散体内某种类纯度的测定时，该测定通常不包括所述种 类在其中溶解和分散的溶剂或基质；相反，仅考虑已溶解或已分散的所述种类(包括目的 种类)。通常，纯化的组合物将具有超过组合物内全部存在种类的约80%、超过全部存在种 类的约85%、90%、95(%、99(%或更多的一个种类。目标种类可以纯化至其中组合物基本上 是单一种类的基本均一性(不能在组合物内以常规检测方法检测到杂质种类)。本领域技 术人员可基于本发明的教导，使用蛋白质纯化的标准技术纯化本发明的多肽。多肽的纯度 可以通过本领域技术人员已知的众多方法测定，所述方法包括例如氨基末端氨基酸序列分 析、凝胶电泳、质谱分析和本文中所述的方法。术语“重组蛋白”或“重组多肽”指通过重组DNA技术产生的多肽。此类技术的实 例包括如此例子，即将所表达蛋白质的编码DNA插入至合适表达载体内时，其中所述的合 适表达载体随后用于转化宿主细胞以产生由该DNA所编码的蛋白质和多肽。本说明书通篇所用的术语“调节序列”是指诸如启动信号、增强子、调节子和启动 子的多核苷酸序列的上位术语，其需要或想要影响与该多核苷酸序列有效连接的编码序列 或非编码序列的表达。示例性调节序列在Goeddel ；Gene Expression Technology =Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述并包括例如 SV40 的早期启 动子和晚期启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC 系统、其表达受T7RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、用 于fd衣壳蛋白的控制区域、用于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶 (例如Wio5)的启动子、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子，以及 已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒基因表达的其他序列。此类控制序列的性质和用途 可以根据宿主生物而变化。在原核生物中，此类调节序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“调节序列”旨在至少包括其存在可以影响表达的成分并且还可以 包括其存在是有利的额外成分，例如前导序列和融合配偶物序列。在某些实施方案中，多核 苷酸序列的转录受控于控制该多核苷酸在如此细胞类型内表达的启动子序列(或其他调 节序列)，其中所述细胞类型内旨在所述的表达。还将理解多核苷酸可以受控于调节序列， 其与控制多核苷酸的天然存在形式表达的那些调节序列相同或不同。术语“序列同源性” 指两种核酸序列间碱基匹配的比例或两种氨基酸序列间氨基酸匹配的比例。当序列同源性 表述为百分数例如50%时，该百分数指在来自与其他序列加以比较的所需序列中序列长度 范围内的匹配比例。容许缺口(在两个序列中任意一个内)以使匹配最大化；通常使用15 个碱基或更少的缺口长度，更常见使用6个碱基或更少的缺口长度、甚至常见使用2个碱基 或更少的缺口长度。术语“序列同一性”意指序列在比较窗口范围内是相同的(即对于核 酸是基于核苷酸对核苷酸，或对于多肽是基于氨基酸对氨基酸)。术语“序列同一性的百分 数”通过在比较窗口范围内比较两个已优化比对的序列进行计算。确定在两个序列内均存 在的相同氨基酸位置数或相同核苷酸位置数以产生匹配位置数，匹配位置数除以比较窗口 内的总位置数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分数。计算序列同一性的方法是本 领域技术人员已知的并且进一步详述如下。本文所用的术语“可溶的”涉及本发明多肽或其他蛋白质时，意指在细胞培养物内 表达时，至少一些部分已表达的多肽或蛋白质停留在细胞的胞质部分内并且在裂解及离心 裂解物时，不随细胞碎片发生分级。多肽的可溶性可以通过现有技术已确认的多种方法提 高，所述方法包括与异源氨基酸序列融合、缺失氨基酸残基、氨基酸置换(例如在序列中增 加具有亲水性侧链的氨基酸残基)和化学修饰(例如添加亲水性基团).多肽的可溶性可以通过多种现有技术已确认的方法测量，所述方法包括确定聚集 状态的动态光散射、UV吸收、旨在从非聚集材料中分离已聚集材料的离心，以及SDS凝胶 电泳(例如比较可溶性部分内蛋白质的量与合并的可溶性部分及不溶性部分内蛋白质的 量)。当在宿主细胞内表达时，本发明多肽可以是至少约1%、2%、5%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多可溶性的，例如，位细质部分内发现的细胞内已 表达蛋白质的总量的至少约 1% >2%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%, 90%或更多。在某些实施方案中，1升表达本发明多肽的细胞培养物将产生至少约0. 1、 0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50毫克或更多的可溶性蛋白。在示例性实施方案中，本发明 多肽是至少约10%可溶性的并将从1升细胞培养物中产生至少约1毫克蛋白质。术语“特异性地杂交”指可检测和特异性的核酸结合。在使与非特异核酸可估计 量的可检测的结合最小化的杂交和洗涤条件下，本发明的多核苷酸、寡核苷酸及核酸与核 酸链选择性杂交。可以使用严格条件来实现如本领域已知的并在本文中讨论的选择性杂交 条件。通常，在本发明的多核苷酸、寡核苷酸及核酸与目的核酸序列之间的核酸序列同源性 将是至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高。在某些情 况下，在根据常规杂交方法和如本文中进一步所述的严格条件下进行杂交和洗涤条件。术语“严格条件”或“严格杂交条件”指促进两条互补性多核苷酸链间特异性杂交 以至于形成双链体的条件。严格条件可以选择为比在定义离子强度和PH下的用于给定多 核苷酸双链体的热解链点(Tm)低约5°C。互补性多核苷酸链的长度及它们的GC含量将决 定双链体的Tm并因此决定为获得想要的杂交特异性所必需的杂交条件。Tm是50%的多核苷酸序列杂交成为完全匹配互补链的温度(在定义离子强度和PH下)。在某些情况下，可 能需要增加杂交条件的严格性至大约等同于特定双链体的Tm。可以使用估计Tm的多种技术。一般，估计双链体内的G-C碱基对对Tm贡献约3°C， 而估计A-T碱基对贡献约2 V，直至理论性最大值约80-100°C。然而，可使用更复杂的Tm模型，在其中考虑G-C堆积相互作用、溶剂效应、想要的 测定温度等。例如，具有大约60°C解离温度(Td)的探针可以使用式Td= (((3X#GC) + (2X#AT)) X37)-562)/#bp)-5设计；其中#GC、#AT和#bp分别是参与双链体形成的鸟嘌 呤-胞嘧啶碱基对数、腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对数和总碱基对数。杂交可以以5父55(、4\55(、3\55(、2\55(、1\55(或0.2XSSC 实施至少约 1 小 时、2小时、5小时、12小时或M小时。可以增加杂交温度以调节反应的严格性，例如从约 250C (室温)至约451、501、551、601或651。杂交反应还可以包括影响严格性的另一 种试剂，例如，在50%甲酰胺存在下实施的杂交增加在定义温度下的杂交严格性。杂交反应可以后接单个洗涤步骤，或2个或多个洗涤步骤，这些步骤可为相同或 不同的盐度和温度。例如，为调节严格性可以升高洗涤的温度从约25°C (室温)至约45°C、 50°C、55°C、60°C、65°C或更高。洗涤步骤可以在去污剂例如0. 1或0. 2% SDS存在下实施。 例如、杂交可以后接2个在65°C的洗涤步骤，每个洗涤步骤在2XSSC、0. 1% SDS中持续约 20分钟并且任选地再有2个在65°C的额外洗涤步骤，每个洗涤步骤在0. 22XSSC.0. 1% SDS中持续约20分钟。示例性的严格杂交条件包括65 °C下在含有50 %甲酰胺、10 X Denhardt (0.2% FicolUO. 2%聚乙烯吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白)和200 μ g/ml变性载体DNA(例如剪 切鲑精DNA)的溶液中杂交过夜，随后是2个在65°C的洗涤步骤，每个洗涤步骤在2XSSC、 0. 1 % SDS中持续约20分钟，以及2个在65 °C的洗涤步骤，每个洗涤步骤在0. 22 X SSC, 0. 1% SDS中持续约20分钟。杂交可以由在溶液中杂交两种核酸，或将溶液中的一种核酸杂交至另一种结合于 固态支持物例如滤膜上的核酸组成。当一种核酸处于固态支持物上时，预杂交步骤可以在 杂交前进行。预杂交可以在如杂交溶液那样的相同溶液及在相同温度下实施至少约1小 时、3小时或10小时(无互补性多核苷酸链)。合适的严格条件是本领域技术人员已知的或可以由技术人员实验确定。参见， 例如 Current Protocols i η Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y. (1989)， 6. 3. 1-12. 3. 6 ；Sambrook 等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N. Y. ；S.Agrawal(编 辑)Methods in Molecular Biology, 第 20 卷；Ti jssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes，例如第 2 章第 I 部分 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", ElsevieriNew York 和 Tibanyenda，N.等，Eur. J. Biochem. 139 :19 (1984)以及 Ebel，S.等， Biochem. 31 :12083(1992)。术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一种核酸的核酸。根据本发明可以使 用的一种类型的载体是附加体，即能够进行染色体外复制的核酸。其他载体包括能够自主 复制并表达与之连接的核酸的那些载体。能够指导与之有效连接的基因表达的载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组技术中所用的表达载体常常是“质粒”形式，所述质粒指在 其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA分子。在本说明书中。“质粒”和“载体”可 交换地使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明旨在包括此类其他形式的表达 载体，它们发挥等效功能并在本领域内是迄今已知的。本发明的核酸可以用作诊断试剂以检测与其特异性结合的靶DNA或靶RNA序列的 存在与否，例如用于测定本发明核酸的表达水平。在一个方面，本发明构思检测在样品内本 发明核酸或其部分存在的方法，该方法的步骤是(a)提供长度为至少8个核苷酸的寡核苷 酸，该寡核苷酸与本发明核酸的部分互补；(b)使寡核苷酸与含有至少一种核酸的样品在 允许此寡核苷酸与本发明核酸或其部分杂交的条件下接触；和(c)检测寡核苷酸与样品内 核酸的杂交，因而检测在样品内本发明的核酸或其部分的存在。在另一方面，本发明构思通 过如此方式检测样品内本发明核酸或其部分存在的方法，即(a)提供一对单链寡核苷酸， 其中每一单链寡核苷酸长度为至少8个核苷酸，与本发明核酸的序列互补并且其中与寡核 苷酸互补的序列间隔至少10个核苷酸；和(b)使寡核苷酸与含有至少一种核酸的样品在 杂交条件下接触；(c)扩增两条寡核苷酸引物间的核苷酸序列；和(d)检测被扩增序列的存 在，因而检测样品内本发明的核酸或其部分的存在。在本发明的另一方面，本发明的多核苷酸在表达载体内提供，所述表达载体含有 编码本发明多肽的核苷酸序列并与至少一种调节序列有效连接。应当理解的是表达载体的 设计可能取决于如此因素，如待转化宿主细胞的选择和/或想要表达的蛋白质的类型。应 当考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标记的 表达。含有本发明多核苷酸的表达载体随后可以用作药剂以治疗感染猪痢疾短螺旋体 的动物，或作为疫苗(也是药剂)以防止动物感染猪痢疾短螺旋体，或旨在减少疾病症状 和疾病过程，若该动物确实受到感染。使用表达载体作为药剂的一种方式是施用核酸疫 苗至有感染风险的动物或感染后的动物。在本领域内充分描述了核酸疫苗技术。一些描 述可以在美国专利6，562，376 (Hooper等)、美国专利5，589，466 (Feigner等)、美国专利 6，673，776 (Feigner等)和美国专利6，710，035 (Feigner等)内找到。核酸疫苗可以注射 至肌肉或皮下，可以经电穿孔(见WO 01/23537，King等和WO 01/68889，Malone等)、经月旨 质组合物(见美国专利5，703，055，Feigner等)或本技术领域已知的其他机制进入动物。表达载体还可以转染至细菌内，所述细菌可以施用至目标动物以诱导针对表达 载体内含有的本发明核苷酸所编码的蛋白质的免疫应答。表达载体可以含有真核表达序 列以至于在宿主动物内转录并翻译本发明的核苷酸。备选地，表达载体可以在细菌内转录 并随后在宿主动物内翻译。用作表达载体的携带者的细菌应当是减毒的但仍有侵染性。 可以使用已减毒的但仍有侵染性的志贺氏菌属某种(Shigella spp.)、沙门氏菌属某种 (Salmonella spp.)、埃希氏菌属某禾中(Escherichia spp.)禾口气单胞菌属某禾中(Aeromonas spp.)，这里仅仅例举若干。这些方法的实例可以在美国专利5，824，538 (Branstrom 等)、美国专利5，877，159 (Powell等)、美国专利6，150，170 (Powell等)、美国专利 6，500，419 (Hone 等)和美国专利 6，682，7 (Powell 等)中找到。备选地，可以将本发明的多核苷酸置于作为载体的某些病毒内。病毒载体可以 将本发明的蛋白质表达在病毒表面上或携带本发明的多核苷酸进入动物细胞内，在其中多核苷酸转录并翻译成蛋白质。用病毒载体感染的动物可以发生针对本发明多核苷酸所 编码蛋白质的免疫应答。因此。可以减轻或预防在接受病毒载体的动物内由猪痢疾短 螺旋体所致的感染。病毒载体的实例可以在美国专利5，283, 191 (Morgan等)、美国专利 5，554，525 (Sondermeijer 等)和美国专利 5，712，118 (Murphy)中找到。本发明的多核苷酸可以用来引起本发明多肽在培养中繁殖的细胞内表达和过量 表达，例如以产生蛋白质或多肽，包括融合蛋白或融合多肽。本发明涉及用重组基因转染宿主细胞以表达本发明的多肽。宿主细胞可以是任意 的原核细胞或真核细胞。例如，本发明多肽可以表达于细菌细胞内，如大肠杆菌、昆虫细胞 (杆状病毒)、酵母、植物细胞或哺乳动物细胞内。在这些例子中，当宿主细胞是人细胞时， 它可以位于活受体内或不在其中。本领域技术人员已知其他合适的宿主细胞。另外，宿主 细胞可以补充宿主内通常找不到的tRNA分子以至于优化了多肽的表达。备选地，可以改变 核苷酸序列以优化宿主细胞内的表达，所产生的蛋白质仍将具有与最初编码蛋白质的高度 同源性。适用于最大化表达多肽的的其他方法将是本领域技术人员已知的。本发明还涉及产生本发明多肽的方法。例如可以在允许多肽表达发生的合适条件 下培养宿主细胞，其编码本发明多肽的表达载体转染。多肽可以被分泌并从细胞与含有该 多肽的培养基的混合物中分离。备选地，多肽可以停留在细胞质内，并收获、裂解细胞以及 分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基在 本领域众所周知。多肽可以使用本领域已知用于纯化蛋白质的技术从细胞培养基、宿主细 胞或该两者中分离，所述的技术包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳及用针对本 发明多肽中特定表位呈特异性的抗体的免疫亲和纯化。因此，编码本发明多肽的全部或所选择部分的核苷酸序列可以用来通过微生物细 胞过程或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。标准方法是将序列连接到多核苷酸构建 体如表达载体，并转化或转染至宿主即真核宿主(酵母、鸟、昆虫或哺乳动物)或原核宿主 (细菌细胞)内。类似的方法或其改良可以用来通过微生物手段或组织培养技术制备本发 明的重组多肽。用于表达本发明多肽的合适载体包括如下类型的质粒用于原核细胞如大肠杆菌 内表达的pTrcHis衍生性质粒、pET衍生性质粒、pBR322衍生性质粒、pEMBL衍生性质粒、 PEX衍生性质粒、pBTac衍生性质粒和pUC衍生性质粒。在制备质粒和转化宿主生物中使用 的多种方法在本领域众所周知。关于同时适用于原核细胞和真核细胞的其他合适表达系统 以及通用重组方法，见Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，编者Sambrook， Fritsch 禾口 Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),第 16 禾口 17 章。目的多肽的编码序列可以作为包括编码不同多肽的核苷酸序列的融合基因的部 分并入。本发明构思含有本发明核酸和编码异源肽的至少一种异源序列的分离的多核苷 酸，其中所述的异源序列符合读框地与本发明核酸的核苷酸序列连接，以至于编码含有异 源多肽的融合蛋白。异源多肽可以与(a)本发明多肽的羧基末端、(b)本发明多肽的氨基 末端或(c)本发明多肽的羧基末端及氨基末端融合。在某些情况下，异源序列编码这样的 多肽，该多肽允许检测、分离、增溶与该多肽融合的多肽，和/或使与该多肽融合的多肽稳 定化。在其他实施方案中，异源序列编码多肽，如多His标签、myc、HA、GST、蛋白Α、蛋白G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、多精氨酸、多His-Asp、FLAG、免疫球蛋白的 部分和胞运肽。在需要产生本发明多肽的免疫原性片段时，可以使用融合表达系统。例如，可以使 用轮状病毒的VP6衣壳蛋白作为多肽部分的免疫载体蛋白，其为单体形式或是病毒颗粒形 式。与待产生针对性抗体的本发明多肽的部分相对应的核酸序列可以引入到融合基因构建 体内，所述融合基因构建体包含用于痘苗病毒晚期结构蛋白的编码序列，以产生使包含本 发明蛋白质的部分的融合蛋白作为病毒粒子的部分进行表达的一组重组病毒。乙型肝炎表 面抗原也可以以此目的使用。类似地，可以产生嵌合构建体以增强免疫原性，其中该嵌合 构建体编码含有本发明多肽的部分及脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白的融合蛋白(见，例如欧洲 专利公开号:0259149 和 Evans 等，(1989)Nature 339 :385 ；Huang 等，(1988) J. Virol. 62 3855 和 Schlienger 等，(1992) J. Virol. 66 2)。融合蛋白可以辅助表达和/或纯化蛋白质。例如，本发明多肽可以作为谷胱甘 肽-S-转移酶(GST)融合蛋白生成。这类GST融合蛋白可以用来简化本发明多肽的纯化，如 通过利用谷胱甘肽-衍生化基质(见，例如Current Protocols in Molecular Biology，编 者Ausubel等(N. Y. John Wiley & Sons，1991))。在另一实施方案中，编码纯化用前导序列 (如重组蛋白中所需部分氨基末端上的多-(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因可以 允许使用Ni2+金属树脂通过亲和层析纯化已表达的融合蛋白。纯化用前导序列随后可以通 过用肠激酶处理除去，以提供纯化的蛋白质(例如见Hochuli等，(1987) J. Chromatography 411 177 ；和 Janknecht 等，PNAS 美国 88 :8972)。用于产生融合基因的技术是众所周知的。基本上，根据常规技术进行编码不同多 肽序列的多种DNA片段的连接，即采用用于连接的平末端或交错末端，限制酶消化以提供 合适末端，根据需要补平粘端，碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接以及酶连接。在另一实 施方案中，融合基因可以通过包括自动DNA合成仪在内的常规技术合成。备选地，基因片 段的PCR扩增可以使用在连续的两个基因片段间产生互补突出端的锚式引物实施，其中所 述的两个基因片段随后可以复性以生成嵌合的基因序列(见，例如Current Protocols in Molecular Biology，编者 Ausubel 等，John Wiley & Sons :1992)。在其他实施方案中，本发明提供固定在固态表面上的本发明核酸，所述的固态表 面包括平板、微量滴定平板、载玻片、小珠、颗粒、球、膜、链、沉淀、凝胶、薄片、管、容器、毛细 管、贴片、条等。本发明的核酸可以固定于芯片上作为阵列的部分。该阵列可以含有如本文 所述的一种或多种本发明多核苷酸。在一个实施方案中，芯片含有一种或多种本发明多核 苷酸作为来自如本发明多核苷酸的相同致病物种内的多核苷酸序列阵列的部分。在本发明的优选形式中，提供如本文所述的分离的猪痢疾短螺旋体多肽并还提供 编码这些多肽的多核苷酸序列。更希望的是以基本上纯化的形式提供猪痢疾短螺旋体多 肽。本发明的优选多肽将具有全长天然多肽的一种或多种生物学特性(例如体内特 性、体外特性或免疫特性)。本发明的范围还包括非功能性多肽，因为它们可以用作例如功 能性多肽的拮抗剂。可以测定与野生型相关的类似物、片段或衍生物的生物学特性，例如通 过生物学测定手段。多肽，包括类似物、片段和衍生物，可以合成性地制备(例如使用众所周知的固相或液相肽合成技术)。优选使用固相合成技术。备选地，本发明多肽可以是使用众所周知的 基因工程技术制备，如下文所述。在另一实施方案，多肽可以(例如通过免疫亲和纯化)从 中纯化，该生物学流体例如但不限于来自动物的血浆、粪便、血清或尿，其中所述的动物包 括但不限于猪、鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉、人、猴、狗、猫、马、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛和绵羊。猪痢疾短螺旋体多肽类似物包括具有如此氨基酸序列的那些多肽，其中一个或多 个氨基酸用其他氨基酸置换，所述置换基本不改变分子的生物学活性。根据本发明，重组或通过化学合成产生的本发明多肽和其片段或其他衍生物或类 似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以生成识别该多肽的抗体。当分子能够特异相互作用于免疫系统的抗原识别分子如免疫球蛋白(抗体)或T 细胞抗原受体时，该分子有“抗原性”。抗原性氨基酸序列含有至少约5个并优选至少约10 个氨基酸。分子的抗原性部分可以是对抗体识别或T细胞受体识别呈免疫优势的部分，或 其可以是这样的部分，其中通过使抗原性部分缀合至用于免疫的载体分子而使用该部分以 生成针对该分子的抗体。具有抗原性的分子本身不需要是免疫原性的，即能够在载体不存 在下激发免疫应答。“抗体”是结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多 克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体以及抗体的抗原结合部分，其中提及的嵌合抗体在美国 专利号4，816，397和4，816，567中进一步详述，所述抗原结合部分包括Fab、F(ab' )2和 F (v)(包括单链抗体)。因此如本文中所用处于多种语法形式的短语“抗体分子”构思完整 的免疫球蛋白分子及含有抗体结合位点的免疫球蛋白分子的免疫活性部分。“抗体结合位 点”是抗体分子的结构性部分，其由重链区和轻链区及特异性结合抗原的高变区构成。示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免 疫球蛋白分子中含有互补位的那些部分，包括本领域称作Fab、Fab\F(ab'的那 些部分，这些部分优选用于本文中所述的治疗性方法内。抗体分子的Fab和F(ab‘ )2部分经众所周知的方法，各自通过由木瓜蛋白酶和胃 蛋白酶在基本完整的抗体分子上的蛋白水解反应制备。见，例如Theofilopolous等的美国 专利号4，342，566。Fab'抗体分子部分也是众所周知的，从F(ab‘ )2部分中随后用巯基 乙醇使连接两个重链部分的二硫键还原，然后用还原剂(如碘乙酰胺)烷基化所得蛋白质 硫醇而产生。本文中优选含有完整抗体分子的抗体。处于多种语法形式的短语“单克隆抗体”指仅具有一种能够与特定抗原发生免疫 反应的抗体结合位点的抗体。单克隆抗体因此通常显示对该单克隆抗体与之发生免疫反应 的任何抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体可以因此含有具备多种抗体结合位点的抗体分 子，其中每一抗体结合位点对不同抗原呈免疫特异性；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。术语“佐剂”指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以作为缓 慢释放抗原的组织储存佐剂并且还作为非特异性增强免疫应答的淋巴系统活化剂发 挥作用[Hood 等在 Immunology,第 384 页，第 二 版，Benjamin/Cummings, Menlo Park, California(1984)]0在无佐剂下单用抗原的初次免疫往往不能激发体液或细胞免疫应答。 佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性 物质如溶血磷脂酰胆碱、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油或烃乳状液、匙孔血 蓝蛋白、二硝基苯酚和人可能使用的佐剂如BCG(Bacille de Calmette-Guerin)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。优选地，佐剂是可药用的。本领域已知的多种方法可以用于产生抗本发明多肽的多克隆抗体。为产生抗体， 多种宿主动物可以通过注射本发明多肽加以免疫，所述宿主动物包括但不限于兔、小鼠，大 鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案，本发明多肽可以缀合至免疫原性载体，例如牛血清白蛋 白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。多种佐剂可以用来提高免疫应答，所述佐剂根据宿主种类 包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血磷脂 酰胆碱、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和人可能使用的佐剂 如BCG和小棒杆菌。为产生抗本发明多肽的单克隆抗体，可以使用通过连续传代细胞系培养产生 抗体分子的任何技术。这些技术包括但不限于最初由Kohler等，(197 Nature，256 495-497开发的杂交瘤技术、三瘤体技术、人B-细胞杂交瘤技术[Kozbor等，(1983) Immunology Today, A :12]和旨在产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等，(1985) 在 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第 77-96 页，Alan R. Liss, Inc.]。永生 性抗体产生细胞系可以通过除融合法之外的技术创造，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞 或用Epstein-Barr病毒的转染。见，例如美国专利号4，341，761,4, 399，121,4, 427，783、 4，444，887,4, 451，570,4, 466，917,4, 472，500,4, 491，632 和 4，493，890。在本发明另一实施方案中，单克隆抗体可以利用最新技术在无菌动物内产生。根 据本发明，可以使用鸡抗体或猪抗体，并该抗体可以通过使用鸡杂交瘤或猪杂交瘤或通过 在体外用EBV病毒转化B细胞得到。实际上根据本发明，可以使用为如此产生“嵌合抗体” 而开发的技术[Morrison 等，(1984) J. Bacterol.，159-870 ;Neuberger 等，(1984)Nature, 312 =604-608 ；Takeda等，(1985) Nature, 314 :452-454]，其中所述的嵌合抗体通过将来自 对本发明多肽特异的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物学活性的抗体分子地基因 剪接在一起而产生，本发明的范围包括此类抗体。此类嵌合抗体优选用于治疗肠道疾病或 功能紊乱(描述见下)，因为在特定变态反应中这类抗体本身诱导免疫应答的可能性比异 种抗体更小。根据本发明，所述用于产生单链抗体的技术(美国专利4，946，778)可适用于产生 对本发明多肽特异性的单链抗体。本发明另一实施方案利用所述用于构建Fab表达文库的 技术[Huse等，(1989) Science, 246 :1275-1281]以允许快速而简单地鉴定对本发明多肽具 有所需特异性的单克隆Fab片段。含有抗体分子独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括但 不限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab' )2片段；可以通过还原F(ab' )2 片段的二硫键产生的Fab'片段以及可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的 Fab片段。在抗体产生中，筛选所需要的抗体可以通过本领域已知技术完成，例如放射免疫 测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫 测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、Western印迹、沉淀反应、凝集测定(例 如凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定、免疫电泳 测定等。在一个实施方案中，通过检测在第一抗体上的标记而检测抗体的结合。在另一实 施方案，通过检测第二抗体或试剂对第一抗体的结合而检测第一抗体。在另一实施方案中，第二抗体经过标记。用于检测在免疫测定中结合作用的多种手段是本领域已知的并且处于 本发明的范围内。例如为选择可识别本发明多肽的特异性表位的抗体，可以对已生成的杂 交瘤测定与含有如此表位的本发明多肽片段相结合的产物。本发明还包括旨在使用本发明多肽和/或结合至本发明多肽的抗体检测猪痢疾 短螺旋体存在的诊断方法及预测方法，以及用于诊断和预测猪痢疾短螺旋体感染的试剂品.ο诊断及预测方法通常将使用从动物如鸡或猪中获得的生物样品进行。“样品”指怀 疑含有短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋体或其多核苷酸或其多肽的动物组织或动物流体。 此类组织或流体的实例包括但不限于血浆、血清、粪便材料、尿、肺、心脏、骨骼肌、胃、肠道 和体外细胞培养成分。本发明提供用于检测样品内本发明多肽存在的方法，步骤如下(a)使怀疑含有本 发明多肽的样品与抗体在允许形成包含该抗体和本发明多肽的反应复合物的条件下接触， 其中所述抗体与本发明多肽(优选结合于固态支持物)特异性结合；和(b)检测样品内包 含抗体和本发明多肽的反应复合物的形成，其中检测到反应复合物的形成表示样品内存在 本发明的多肽。优选地，该方法内所用的抗体衍生自亲和纯化的多克隆抗体并且更优选是单克隆 抗体。此外，优选本文中所用的抗体分子处于Fab、Fab'、F(ab' )2或F(ν)部分或完整抗 体分子的形式。基于以上方法检测猪痢疾短螺旋体的特别优选方法包括酶联免疫吸附测定法、放 射免疫测定、免疫放射测定和免疫酶测定，包括使用单克隆抗体和/或多克隆抗体的夹心 测定法。尤其有用的这样三种方法利用了用可检测标记物标记的本发明多肽(或其片 段)、用可检测标记物标记的抗体Ab1或用可检测标记物标记的抗体Ab2。该方法可以由如 下等式概述，其中星号表示颗粒经过标记并且“AA”代表本发明的多肽A. AA^Ab1 = AA=KAb1B. AA+Ah* = AA Ab1*C. AA+AVAb2* = Ab1AA Ab2*这些方法和它们的应用均是本领域技术人员熟悉的并且因此可以在本发明的范 围内利用。“竞争性”方法即方法A在美国专利号3，654，090和3，850，752内描述。方法B 是众所周知的竞争性测定技术的代表。方法C即“夹心”方法在美国专利号RE 31，006和 4,016,043内描述。其他方法也是已知的并可以利用，如“双抗体”或“DASP”方法。在任何情况下，本发明的多肽与一种或多种抗体或结合配偶物形成复合物并且复 合物中的一个成员用可检测标记物标记。即复合物已经形成，并且根据需要，复合物的量可 以通过可用于检测标记物的已知方法确定。从上述将看出，Ab2的特征性特点在于它将Ab1反应。该反应是因为在一种哺乳动 物物种内所产生的Ab1已经用作另一物种内的抗原以产生抗体Ab2。例如AId2可以使用兔抗 体作为抗原在山羊内产生。因此，AId2是在山羊内产生的抗兔抗体。为本说明书和权利要求 书的目的，Ab1将称作第一抗体，并且Ab2将称作第二抗体或抗Ab1抗体。这些研究最通常使用的标记物是放射性元素、酶、当暴露于紫外线时发荧光的化学品和其他物质。能够作为标记物利用的荧光物质的实例包括荧光素、罗丹明和金胺。特定 检测物质是在山羊内制备并与荧光素经异硫氰酸盐缀合的抗兔抗体。优选同位素的实例包 括 3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59!^、9°Y、125l、131I 和 186Re0 放射性标记可以通过目前可 用的任何计数方法检测。在可以使用多种酶的同时，优选的酶实例是过氧化物酶、葡糖 醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶加上过氧化物酶，以及碱性 磷酸酶。酶通过桥接分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等缀合至所选择的颗粒。酶标记 物可以是通过目前采用的任何比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流分析技术 或气体分析技术(gasometric)检测。参考美国专利号3，654，090,3,850, 752和4，016，043 例如对替代性标记材料和方法的公开。本发明还提供检测生物样品内抗本发明多肽的抗体的方法，其使用如下步骤(a) 提供本发明的多肽或其片段；(b)将生物样品与所述的本发明多肽在允许形成抗体-抗原 复合物的条件下温育；和(c)确定是否形成具有本发明多肽的抗体-抗原复合物。在本发明的另一实施方案中，提供用于评测生物样品内抗本发明多肽抗体的水平 的体外方法，其使用如下步骤(a)根据上述方法检测在生物样品内反应复合物的形成；和 (b)评测已形成的反应复合物的量，其中反应复合物的量与生物样品内抗本发明多肽抗体 的水平对应。本发明还提供用于监测治疗性治疗动物宿主内与猪痢疾短螺旋体相关的疾病的 体外方法，即通过如上所述评测在系列生物样品内的抗本发明多肽抗体的水平，其中所述 的系列生物样品在不同时间点上从接受所述治疗性治疗的动物宿主获得。本发明还提供检测生物样品内猪痢疾短螺旋体存在或不存在的方法，即通过(a) 使生物样品与本发明多核苷酸的多核苷酸探针或引物在合适杂交条件下接触；和(b)检测 在探针或引物与样品内的核酸间所形成的任何双链体。本发明的一个实施方案中，猪痢疾短螺旋体的检测可以如此完成，即使用已知技 术，通过直接扩增来自生物样品的多核苷酸序列，并随后检测本发明多核苷酸序列的存在。在本发明的一个形式中，靶核酸序列通过PCR法扩增和随后使用以上提及的任何 特异性方法检测。用于检测多核苷酸序列存在的其他诊断性技术包括但不限于1)等位基 因特异性PCR ；2)单链形态分析；幻变性梯度凝胶电泳；4) RNA酶保护测定力)使用识别核苷酸错配的蛋白质如大肠杆菌mutS蛋白质；6)等位基因特异性寡核苷酸和7)荧光原位杂 、-父。除以上方法之外，多核苷酸序列还可以使用常规探针技术检测。当使用探针来检 测所需的多核苷酸序列的存在时，根据需要可以处理待分析的生物样品如血液或血清以提 取核酸。样品多核苷酸序列可以按照多种促进靶序列检测的方式制备；例如变性、限制性消 化、电泳或点印迹。样品多核苷酸序列中的目标区域通常必须至少部分是单链，以便与探针 的目标序列形成杂交体。若序列天然是单链的，则无需变性。然而，若序列是双链的，可能 需要使序列变性。变性可以通过本领域已知的多种技术实施。样品多核苷酸序列和探针在促进探针内的靶序列与样品内的推定所需多核苷酸 序列形成稳定杂交体的条件下温育。优选地，使用高严格条件以预防假阳性。检测产生的杂交体(若存在)通常利用标记探针完成。备选地，探针可以是非标 记的，但是可以因与标记的配体直接或间接特异性结合而是可检测的。用于标记探针和配体的合适标记物和方法是本领域已知的，并包括例如可以通过已知方法(例如切口平移、 随机引发或激酶法)引入放射性标记物、生物素、荧光基团、化学发光基团(例如二氧杂环 丁烷、特需触发的二氧杂环丁烷)、酶、抗体等。这种基本方案的变通方案在本领域是已知 的，并包括促进从外来物中分离待监测的杂交体的变通方案或促进扩增标记部分的信号的 变通方案。在本发明的范围内还构思本发明的核酸探针测定法可以采用能够检测所需要的 本发明多核苷酸序列的核酸探针的混合物。因此，在检测在细胞样品内的本发明多核苷酸 序列存在的实例中，使用与多核苷酸序列互补的多于一种的探针并且不同探针的数目尤其 备选是2、3或5个不同核酸探针序列。本文中所述的多核苷酸序列(优选处于探针形式)还可以固定在固态支持物上， 以便检测短螺旋体属物种，其包括但不限于猪痢疾短螺旋体、密螺旋体、B. alvinipulli、阿 尔堡短螺旋体、无害短螺旋体、B.murdochii和多毛短螺旋体。备选地，本文中所述的多核 苷酸序列将构成可以用来同时检测来自短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋的大量不同基因 的DNA分子文库的部分。在本发明的另一变化形式中，本文中所述的多核苷酸序列连同其 他多核苷酸序列(如来自细菌或病毒的多核苷酸序列)可以按照如此方式固定于固态支持 物上，其中所述的方式允许鉴定短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋体的存在，和/或鉴定结 合在固态支持物上的任何其他多核苷酸序列。用于产生DNA分子的固定化文库的技术已经在现有技术中描述。通常，绝大部分 现有技术方法描述单链核酸分子文库的合成，使用例如掩蔽技术以便在固体基质多个隔开 的位置上建立序列的多种排列。美国专利号5，837，832描述了基于超大规模整合技术的用 于产生固定至硅基质上的DNA阵列的改良方法。美国专利号5，837，832特别描述了称作“覆 盖”的策略以在可以用来产生本发明固定化DNA文库的基质上已空间定义的位置内合成特 异性探针组。美国专利号5，837，832还提供对仍可以使用的较早技术的参考。因此多核苷 酸序列探针可以在基质的表面上原位合成。备选地，单链分子可以脱离固体基质合成并且预先形成的每种序列可以施加至固 体基质上分隔的位置内。例如，使用配备针式装置或压电(pizoelectric)装置的机器人设 备，可以将多核苷酸序列直接印刷在基质上。文库序列通常固定在固体基质的分隔区域表面或其内部。基质可以是多孔的，以 允许在基质内部的固定，或基本上是无孔的，此时文库序列通常固定在基质的表面。固体基 质可以直接或间接地由可结合于多肽的任何材料制成。合适的固体基质的实例包括平板玻 璃、硅片、云母、陶瓷和有机聚合物如塑料，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯。还可能使用可 广泛获得的半透膜，如硝酸纤维素膜或尼龙膜。半透膜可以固定在更坚固的固态表面上，如 玻璃。该表面可以任选地以金属层包被，如金、钼或其他过渡金属。优选地，固体基质通常是具有硬表面或半硬表面的材料。在优选的实施方案中， 基质的至少一个表面是基本平整的，尽管在一些实施方案中，可能需要例如用升高的区域 或蚀刻沟将用于不同聚合物的合成区域物理分隔。还优选固体基质适用于在通常50至 100 μ m的分隔区域内高密度施加DNA序列，产生10000至40000个点/cm2的密度。将固体基质方便地划分成部分。这可以通过如光蚀刻技术或通过使用疏水性墨水 例如基于聚四氟乙烯墨水(Cel-line，美国)来实现。
在其中存在每一不同文库成员的分隔位置可以具有任何方便的形状，例如圆形、 矩形、椭园形、楔形等。多核苷酸序列可以通过共价方法或非共价方法附着至基质。多核苷酸序列可以通 过结合文库序列的分子层附着至基质。例如，多核苷酸序列可以用生物素加以标记并且基 质用抗生物素蛋白和/或链亲和素包被。使用生物素化多核苷酸序列的便利特征是可以轻 易地测定偶联至固体基质的效率。由于多核苷酸序列可能与一些固体基质结合很差，经常 需要在固体基质(如在玻璃的例子中)和核酸序列之间提供化学界面。合适化学界面的实 例包括六甘醇。另一实例是利用聚赖氨酸包被的玻璃，随后使用导入亲和配体的标准方法 化学修饰聚赖氨酸。利用偶联剂将分子附着至固体基质表面的其他方法是本领域已知的， 见，例如 W098/49557。可以通过多种方法测定互补性多核苷酸序列与固定化核酸文库的结合，如结合的 多核苷酸序列光学特征的变化(即通过使用溴化乙锭)或通过使用标记的核酸，如用荧光 团标记的多肽。不需要使用标记物的其他检测技术包括光学技术，如光声法、反射测量术、 椭圆测量术和表面等离子体共振法(见W097/49989).因此，本发明提供已将至少一种本发明的多核苷酸、优选两种或多种本发明不同 的多核苷酸序列在其上面固定的固体基质。本发明还可以用作预防或治疗，其可以用于刺激动物如鸡和猪内的体液应答和细 胞介导性应答的目的，因而提供防止短螺旋体属物种建群的保护，所述的短螺旋体属物种 包括但不限于猪痢疾短螺旋体、密螺旋体、B. alvinipulli、阿尔堡短螺旋体、无害短螺旋 体、B. murdochii和多毛短螺旋体。短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋体的自然感染诱导了 针对本文中所述蛋白质的循环抗体滴度。因此，本文中所述的氨基酸序列或其部分具有形 成可提供抗肠道螺旋体病保护的全身施用或口服施用预防剂治疗剂的基础的潜力。本领域技术人员会理解，在短螺旋体属物种中具有高度的序列保守性。例如，如下 显示的猪痢疾短螺旋体外膜蛋白(OMP)H122和H114在许多短螺旋体属物种中具有高度相 似性。猪痢疾短螺旋体OPM H114的跨物种核苷酸相似性
权利要求
1.分离的多核苷酸，包含选自SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19的核苷酸序列。
2.分离的DNA分子，包含与根据权利要求1的多核苷酸至少70%、优选的至少80%和 更优选的至少90%同源的序列。
3.分离的多肽，包含选自SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列。
4.分离的多核苷酸，包含编码根据权利要求3的多肽序列的核苷酸序列。
5.质粒，其包含根据权利要求1或4的多核苷酸，或根据权利要求2的DNA分子。
6.根据权利要求5的质粒，其中所述质粒为表达载体。
7.包含根据权利要求5或权利要求6的质粒的细胞。
8.分离的蛋白质，包含与根据权利要求3的多肽至少70%、优选的至少80%和更优选 的至少90%同源的序列。
9.免疫原性组合物，包含根据权利要求5或权利要求6的质粒、根据权利要求3的多 肽、根据权利要求7的细胞或根据权利要求8的蛋白质。
10.用于预防短螺旋体感染的疫苗组合物，包含根据权利要求5或权利要求6的质粒、 根据权利要求3的多肽、根据权利要求7的细胞或根据权利要求8的蛋白质。
11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中短螺旋体感染为猪痢疾短螺旋体的感染。
12.根据权利要求10或权利要求11的疫苗组合物，其中组合物包含至少2种选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 的多肽。
13.根据权利要求10至12中任一项的疫苗组合物，其中组合物包含至少3种选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的多肽，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪 痢疾。
14.诊断短螺旋体感染的方法，包含(a)提供来自疑为感染短螺旋体动物的样品；(b)将样品与包含选自SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的一 种或多种多肽接触；(c)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下孵育样品和多肽；和(d)确定是否形成具有一种或多种多肽的抗体-抗原复合物， 其中抗体-抗原复合物的形成指示动物感染短螺旋体。
15.根据权利要求14的方法，其中短螺旋体感染为猪痢疾短螺旋体的感染。
16.诊断短螺旋体感染的试剂盒，包含一种或多种多肽，所述多肽包含选自SEQID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 的氨基酸序列。
全文摘要
本发明描述了猪痢疾短螺旋体的新的多核苷酸和氨基酸。这些序列用于诊断动物内的猪痢疾短螺旋体病，以及用作治疗性治疗或预防性治疗动物内的猪痢疾短螺旋体病。这些序列还可以用于诊断、治疗性和/或预防性治疗动物内由其他短螺旋体属物种所致的疾病。
文档编号A61K39/02GK102046651SQ200980119455
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月26日 优先权日2008年3月27日
发明者D·J·汉普森, M·I·贝尔伽德, N·D·菲利普斯, T·拉 申请人:斯拜尔基因私人有限公司
短螺旋体的新序列、免疫原性组合物、制备方法及其用途发明领域本发明涉及猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)的新基因和其中编 码的蛋白质。本发明还涉及这些新基因和蛋白质用于诊断猪痢疾短螺旋体病、抗猪痢疾短 螺旋体疫苗，和用于筛选杀死猪痢疾短螺旋体或阻断猪痢疾短螺旋体的病理效应的化合 物的用途。这些序列还可以用于诊断性和治疗性和/或预防性地治疗动物内由其他短螺 旋体属物种所致的疾病，其中所述的其他短螺旋体属物种包括密螺旋体(B. intermedia), B. alvinipulli、阿尔堡短螺旋体(B. aalborgi)、无害短螺旋体(B. innocens)、 B. murdochii 和多毛短螺旋体(B. pilosicoli)。背景猪痢疾是在澳大利亚和世界范围内主要的地方流行性猪疾病。猪痢疾是传染性黏 膜出血(mucohaemorrhagic diarrhoeal)疾病，其特征是大肠上皮表面的广泛炎症及坏死。 因猪痢疾所致的经济损失主要由生长迟缓、药疗法成本和死亡率造成。猪痢疾的病原体在 1971年最初鉴定为厌氧螺旋体(猪痢疾密螺旋体(Tr印onema hyodysenteriae))并且最近 重新划分至短螺旋体属(Brachyspira)为猪痢疾短螺旋体(B. hyodysenteriae)。猪痢疾在 猪舍中建立，其疾病谱可以从温和、短暂性或不明显变化至严重或致死。各猪舍内的药疗法 策略可能掩盖临床病征并且在一些猪舍内疾病可能被忽略或可能仅为可疑。无论明显的疾 病是否发生，猪痢疾短螺旋体可以保持于感染猪内或其他储存宿主如啮齿类动物内或在环 境中。所有这些来源为疾病传染至未感染猪群提供潜在可能。猪痢疾短螺旋体也可在商业 家禽中建群，尽管不清楚这在野外条件下发生的有多普遍。猪痢疾短螺旋体的建群激发强烈的抗螺旋体免疫应答，因此暴露于螺旋体的间接 证据可以通过测量感染动物血内的循环抗体滴度而获得。已经报道这些抗体滴度维持于低 水平，即便在已从猪痢疾中恢复的动物内也是如此。因此认为检测抗体的血清学试验具有 检测亚临床感染和在其大肠内具有不可检测数目的螺旋体的恢复猪携带者的巨大潜力。这 些试验作为易用试剂盒形式如酶联免疫吸附测定时将特别有价值。已经开发多种技术以 证实存在抗猪痢疾短螺旋体的循环抗体，这些技术包括间接免疫荧光抗体试验、血凝试验、 微量滴定凝集试验、补体激活试验和使用脂多糖或经超声波破碎的完整螺旋体作为抗原的 ELISA0所有这些试验都遭受特异性问题的困扰，因为相关的非致病性肠道螺旋体可以诱导 交叉反应抗体。这些试验可用于检测其中存在明显疾病和高循环抗体滴度的畜群，但是这 些试验在鉴定亚临床感染畜群和感染猪个体上存在问题。因此，迄今没有用于检测抗猪痢 疾短螺旋体抗体的非常灵敏而特异的测定法。合适诊断试验的缺乏已经妨碍猪痢疾的控 制。使用多种方法以控制猪痢疾，这些方法包括预防性使用抗微生物剂以完全转移感 染畜群并防止感染携带猪的再进入。所有这些选项代价高昂，并且如果它们充分有效，则 需要使用复杂的诊断试验以监测进度。目前，对亚临床感染猪痢疾的畜群和单个健康携带 动物的检测仍是主要难题并且正在妨碍执行有效的控制措施。确定性诊断猪痢疾通常需要 分离并鉴定来自病猪粪便或黏膜的猪痢疾短螺旋体。所涉及的主要困难包括这些厌氧细菌生长缓慢及其营苛刻的营养要求，以及因猪肠道正常菌群内存在形态学相似的螺旋体所致 的混淆。显著改进感染猪个体的诊断通过开发检测来自粪便的螺旋体的聚合酶链式反应 (PCR)测定而实现。不幸的是在实际应用中，PCR检测的限制使它们不能够检测到具有亚临 床感染的携带动物。由于这些诊断难题，显然需要能够在猪群和个体水平检测猪痢疾短螺 旋体感染的简单而高效的诊断工具。强烈的抗螺旋体免疫应答在猪痢疾短螺旋体建群后被诱导，并且从猪痢疾中恢复 的猪受到保护而不发生再感染。尽管如此，开发疫苗以控制猪痢疾的尝试仅获得非常有限 的成功，因为这些疫苗不提供基于畜群的充分保护，或生产它们过于昂贵且困难以至于它 们没有商业实用性。菌苗疫苗提供某些水平的保护，但是菌苗疫苗总是脂多糖血清群特异 性的，因此需要使用多价菌苗。此外，菌苗疫苗因螺旋体苛刻的厌氧生长条件而在大规模生 产时困难且昂贵。已经数度尝试开发用于猪痢疾的减毒活疫苗。这种方法具有如此缺点，即减毒株 表现建群减少并因此导致免疫刺激减少。生产者和兽医人员方面因为存在毒力回复可能而 不愿意使用猪痢疾活疫苗，尤其当对猪痢疾短螺旋体内的遗传调节及组成知之甚少时。使用重组亚单位疫苗是有吸引力的选择，因为此类产物将是充分定义的(主 要因注册目的)并且相对容易大规模生产。迄今，首个已报道的利用来自猪痢疾短螺 旋体重组蛋白的候选疫苗(38Kd鞭毛蛋白)没有防止猪内建群。这种失败可能具体涉 及所用的特定重组蛋白，以及涉及如送递系统和途径、剂量率、佐剂的选择等其他下游事 件(Gabe, JD、Chang, RJ、SIomiany, R、Andrews，WH 禾口 McCaman，MT (1995)， Isolation of extracytoplasmic proteins from Serpulina hyodysenteriae B204 and molecular cloning of the flaBl gene encoding a 38-kilodalton flagellar protein. Infection and Immunity 63:142-148)。最早报道的用于接种的具有部分保护性的重组猪痢疾短 螺旋体蛋白是与多种病原菌的甲硫氨酸结合脂蛋白具有同源性的29. 7kDa外膜脂蛋白 (Bhlp29. 7，又称作BmpB和BlpA)。使用his标记的重组Bhlp29. 7蛋白对猪接种，随后 用猪痢疾短螺旋体实验性攻击，与未接种的对照猪50-70%发生疾病相比，导致已接种的 猪17-40%发生疾病。由于Bhlp29. 7接种的猪的疾病发生率显著低于(P = 0. 047)对照 猪，因此Milp^. 7似乎具有作为猪痢疾疫苗成分的潜质(La, T，Phillips, ND, Reichel, MP 禾口 Hampson, DJ (2004)Protection of pigs from swine dysentery by vaccination with recombinant BmpB, a 29. 7kDa outer-membrane lipoprotein of Brachyspira hyodysenteriae. Veterinary Microbiology 102:97-109)。已经进行其他众多尝试以鉴 定来自猪痢疾短螺旋体的可作为重组疫苗成分使用的外包被蛋白，但是仍然还是没有产生 成功的疫苗。需要更全面的方法以鉴定来自猪痢疾短螺旋体的潜在有用的免疫原性重组蛋 白。迄今，仅报道一项使用DNA用于接种的研究。在该项研究中，将编码推定铁蛋白 (ferritin)的猪痢疾短螺旋体ftnA基因克隆至大肠杆菌质粒并且使用该质粒DNA来包 被用于射弹法接种的金珠。使用猪痢疾的小鼠模型来确定用DNA和/或重组蛋白接种的 保护性基本特征。用重组蛋白接种诱导了抗铁蛋白的良好全身性应答，然而，用DNA接种 仅诱导了可检测的全身性应答。用DNA接种，随后用重组蛋白加强，则仅在用蛋白质加强 后才诱导全身性免疫应答。然而测试的接种方案没有一个能够向小鼠提供抗猪痢疾短螺旋体建群及相关损伤的保护。有趣的是，仅用DNA接种小鼠造成了疾病显著恶化(Davis， A. J.、Smith, S. C.禾口 Moore, R. J. (2005). The Brachyspira hyodysenteriae ftnA gene DNA vaccination and real-time PCR quantification of bacteria in a mouse model of disease. Current Microbiology 50 :285-291)。发明概述发明者鉴定了猪痢疾短螺旋体的新基因和这些基因编码的蛋白质。他们还进一步 鉴定出这些新基因和蛋白质可用于治疗和诊断目的。此外，发明者鉴定了这些基因和/或 蛋白质可用作抗猪痢疾短螺旋体的疫苗和/或诊断猪痢疾短螺旋体的感染。因此，在第一 个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，包含选自SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17和 19的核苷酸序列。本发明还提供和SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19同源的核苷 酸序列，其中同源性可为95%、90%、85%、80%、75%和70%。本发明还包括DNA疫苗或 DNA免疫原性组合物，其包含SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的核苷酸序列以及 与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明还包括诊断性测定法， 其包含具有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19的核苷酸序列的DNA，以及具有与这 些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列的DNA。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条编码选自SEQ ID N0:l、3、5和 7的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条编码选自SEQ ID NO :1、3、5 和7的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由编码选自SEQ ID NO :1、3、5和7的分子 的多核苷酸组成的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少2条编码选自SEQ ID NO :9、11、 13和15的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条编码选自SEQ ID NO :9、11、 13和15的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由编码选自SEQ ID N0:9、ll、13和15的分 子的多核苷酸组成的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少2条编码选自SEQ ID N 0 17和 19的分子的多核苷酸的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为下述疫苗组合物，包含(i)至少一条编码选自SEQ ID NO :1、3、5和7的分子的多核苷酸；和/或(ii)至少一条编码选自SEQ ID NO :9、11、13和15的分子的多核苷酸和/或(iii)至少一条编码选自SEQ ID NO 17和19的分子的多核苷酸用于治疗或预防短螺旋体相关的猪痢疾。本发明还提供包含具有SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19序列的DNA的 质粒；包含具有SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19序列的DNA的原核和/或真核表 达载体；和包含质粒的细胞，所述质粒包含具有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19 序列的DNA。在第二个方面，本发明提供了分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列。本发明还提供了具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18和20中所包含的氨基酸序列的新猪痢疾短螺旋体蛋白质。本发明还提供了与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 包含的序列 95%、90%、85%、80%、75%和 70% 同源的 蛋白质。本发明还提供了疫苗或免疫原性组合物，包含具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18和20包含的氨基酸序列或与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20包含的序 列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条选自SEQ ID NO :2、4、6和8的 多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条选自SEQ ID NO :2、4、6和8 的多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由SEQ ID NO :2、4、6和8的多肽组成的疫 苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条选自SEQ ID NO 10、12、14和16 的多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为包含至少3条选自SEQ ID N0:10、12、14和 16的多肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为由来自SEQ ID NO :10、12、14和16的多肽 组成的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的一个方面，疫苗组合物为包含至少2条选自SEQ ID NO 18和20的多 肽的疫苗组合物，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在本发明的另一个方面，疫苗组合物为下述疫苗组合物，包含⑴至少一条选自SEQ ID NO :2、4、6和8的多肽和/或(ii)至少一条选自SEQ ID NO: 10、12、14和16的多肽和/或(iii)至少一条选自SEQ ID NO 18和20的多肽用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪痢疾。在第三个方面，本发明提供了诊断短螺旋体感染的方法，包含(a)提供来自疑为 感染了短螺旋体的动物的样品；(b)将样品与一种或多种包含选自SEQ ID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的多肽接触；(c)在允许形成抗体-抗原复合物的条 件下将样品和多肽孵育；和(d)确定一种或多种多肽是否形成抗体-抗原复合物，其中抗 体-抗原复合物的形成指示动物感染短螺旋体。在第四个方面，本发明提供了用于诊断短螺旋体感染的试剂盒，包含一种或多种 包含选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的多肽。本发明的另一个方面为诊断试剂盒，包含一种或多种具有SEQ ID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18和 20包含的序列，或具有与 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和 20包 含的序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列的蛋白质。本发明的另一个方面为核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16,18和20包含的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括质粒、真核和原核表达载体和DNA 疫苗，所述质粒、真核和原核表达载体和DNA疫苗包含具有编码SEQ ID NO :2、4、6、8、10、 12、14、16、18和20包含的氨基酸序列的蛋白质的序列的DNA。本发明包括包含这些质粒和表达载体的细胞。本发明包括单克隆抗体，所述单克隆抗体与具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18和20包含的氨基酸序列的蛋白质结合，或与和SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和20包含的序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的蛋白质结合。本发明包括包含 单克隆抗体的诊断试剂盒，所述单克隆抗体与具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18和 20包含的氨基酸序列的蛋白质结合，或与和SEQ ID而2、4、6、8、10、12、14、16、18和20包 含的序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的蛋白质结合。这些诊断试剂盒可以检 测动物内猪痢疾短螺旋体的存在。所述动物优选是哺乳动物或鸟；更优选是鸡、鹅、鸭、火 鸡、鹦鹉、狗、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、奶牛、绵羊、猪、猴和人。本发明还涉及通过向动物施用DNA疫苗而预防或治疗动物内猪痢疾短螺旋体感 染的方法，其中所述的DNA疫苗含有SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17和19内所列的一 种或多种核苷酸序列，或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发 明还包括通过向动物施用含有一种或多种蛋白质的疫苗而预防或治疗动物内猪痢疾短螺 旋体感染的方法，其中所述的蛋白质含有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20包含 的氨基酸序列或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明还构思通过向动物施用免疫原性组合物而诱导动物内免疫应答的方法，其 中所述的免疫原性组合物含有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19内所列的一种或 多种核苷酸序列或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明还 包括通过向动物施用含有一种或多种蛋白质的免疫原性组合物在动物中产生免疫应答的 方法，其中所述的蛋白质具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20内所包含的氨基 酸序列或与这些序列95%、90%、85%、80%、75%和70%同源的序列。本发明优选实施方案的详述在详细描述本发明之前，应当理解本发明不局限于具体的示例性方法，并且一定 可以变化。还应当理解此处使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，无意具局 限性，(本发明)仅受限于所附的权利要求书。此处引用的所有出版物、专利和专利申请，无论在以上或以下，在此处以其整体引 入作为参考。然而，引用此处提及的出版物的目的是为了描述和公开在出版物中报导的、可 能在本发明中相关使用的实验方案、试剂和载体。不应将此处的任何内容理解为承认本发 明无权作为在先发明早于这些公开。此外，除非另外指出，本发明的实施应用本领域技术范围内的传统免疫学、分子 生物学技术和药理学。这些技术是本领域技术人员所熟知的，并在文献中充分解释。见 例如 Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher 禾口 Wingfield “Current protocols in Protein &土61 ^”(1999)卷1和11001111 Wiley & Sons Inc.) ；Sambrook 等，‘‘Molecular Cloning A Laboratory Manual，，(1989),第二版(Cold Spring Harbor Laboratory press)；以及 Prescott，Harley 和 Klein "Microbiology" (1999)，第四版(WBC McGraw-Hill)。必须指出如此处使用的和在所附的权利要求书中，除非上下文明确另外指示，单 数形式“一个/种”和“该”包括提及物的复数。因此，例如，提及“一种”包括此类基因的 复数，提及“一种”是指一种或多种动物，等等。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学 术语具有如本发明所属领域普通技术人员普遍理解的相同含义。尽管可使用与此处描述的材料和方法类似或等同的任意材料和方法来实施或检验本发明，现在描述优选的材料和方法。在本发明最广义的方面，提供了新的猪痢疾短螺旋体多核苷酸，其具有SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21和23包含的核苷酸序列，或由这些多核苷酸编码的氨 基酸序列(多肽)。术语“氨基酸”旨在包括包含氨基功能性和酸功能性并且能够包含天然存在的氨 基酸聚合物内的全部分子，无论其是天然的还是人工的。示例性的氨基酸包括天然存在的 氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有变异侧链的氨基酸类似物以及任何前述物质的 立体异构物。动物可以是可感染短螺旋体，特别是猪痢疾短螺旋体的哺乳动物或鸟。哺乳动物 的实例包括狗、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、奶牛、绵羊、猪、猴和人。鸟的实例包括鸡、鹅鸭、 火鸡和鹦鹉。本领域技术人员应当理解，某些短螺旋体属物种能够感染一系列宿主范围 (见，例如，Hampson 等，2006，Emerging Infectious diseases, Vol. 12 (5)，p869_870，此处以其整体引入作为参考)。因此如此处使用的术语“动物”包含许多动物，但特别是猪和家食內O术语“保守残基”指作为具有某些共同特性的氨基酸组的成员的氨基酸。术语“保 守性氨基酸置换”指将来自一个此类组的氨基酸(概念性地或其他方式)置换成来自相同 组的不同氨基酸。定义各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的对应蛋白 质的氨基酸变化的归一化频率(Schulz, G.E. ^P R. H. Schinner.，Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。根据该分析，可以定义氨基酸的组，其中组内的氨基酸主 要彼此交换，并且因此它们在其对蛋白质总体结构的影响方面彼此相似(Schul z, G.E.和 R. H. Schinner. ,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以如此方式定义 的氨基酸组的实例包括(i)包含Lys、Arg和His的带正电荷组，(ii)包含Glu和Asp的带 负电荷组，(iii)包含Wie、ΤΥι^Π ρ的芳香族组，(iv)包含His和1Trp的氮环组，(ν)包 含Val.Leu和De的非极性大脂族组，(vi)包含Met和Cys的轻度极性组，(vii)包含Ser, Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 的小残基组，(viii)包含 Val、Leu、Ile、Met 和 Cys 的脂族组和(ix)包含Ser和Thr的小羟基组。“融合蛋白”或“融合多肽”指如同本领域内已知的术语“嵌合蛋白”那样并可以使 用本领域已知技术得以构建。在融合蛋白的众多实例中，存在两种不同的多肽序列并在某 些情况下，可以存在更多种类的多肽序列。编码融合蛋白的多核苷酸序列可以符合读框地 有效连接，以至于融合蛋白可以得到正确翻译。融合蛋白可以包括来自相同物种或来自不 同物种的多肽序列。在多种实施方案中，融合多肽可以含有与第一多肽连接的一个或多个 氨基酸序列。在多于一种的氨基酸序列与第一多肽融合的例子中，融合序列可以是相同序 列的多重拷贝，或备选地可以是不同的氨基酸序列。融合多肽可以与第一多肽的氨基末端、 羧基末端，或者氨基末端及羧基末端融合。示例性的融合蛋白包括含有谷胱甘肽S-转移酶 标签(GST标签)、组氨酸标签(His-标签)、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白结合结构域的 多肽。术语“分离的多肽”指多肽，其在某些实施方案中从重组DNA或RNA中制备或是合 成来源的或自然来源的或其组合，该多肽(1)不与其天然形式的蛋白质结合、( 从该多肽通常存在的细胞内分离、⑶没有来自相同细胞来源的其他蛋白质、⑷由来自不同物种的 细胞表达或(5)不存在于自然界内。有可能分离的多肽存在但不足以称作纯化的多肽。术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”指多核苷酸，无论是基因组DNA、cDNA、 mRNA、tRNA、rRNA、iRNA,或是从细胞器(如线粒体和叶绿体)或合成来源获得的多核苷酸， 该多核苷酸(1)不与分离的核酸天然存在于其内的细胞结合或(2)与不天然连接的多核苷 酸有效连接。有可能分离的多核苷酸存在但不足以称作纯化的多核苷酸。术语“核酸”和“多核苷酸”指聚合形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖 核苷酸或是核苷酸的两种类型的修饰形式。还应当理解该术语包括等效物、从核苷酸类似 物形成的RNA或DNA的类似物并且，如适用于所述实施方案那样包括单链(如有义或反义) 多核苷酸和双链多核苷酸。术语“本发明的核酸”和“本发明的多核苷酸”指编码本发明多肽的核酸。本发明 的多核苷酸可以包含如下的全部或部分目的核苷酸序列；与目的核苷酸序列至少60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列；在严格条件下与目的 核酸序列杂交的核苷酸序列；与本发明多肽功能等效的多肽的编码核苷酸序列；与主题氨 基酸序列至少约60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%同源或相同的多肽的编码 核苷酸序列；具有本发明多肽的活性并与主题氨基酸序列具有至少约eo^jo^^so^、 85^^90%.95^^98^^99%或更多同源性或同一性的多肽的编码核苷酸序列；因1至约2、 3、5、7、10、15、20、30、50、75个或更多个核苷酸置换、添加或缺失而与目的核酸序列不相同 的核苷酸序列，如等位变体；衍生自目的核酸序列并在进化上与其相关的核酸；以及全部 前述及本发明其他核酸的互补物，以及由全部前述及本发明其他核酸的遗传密码简并性而 产生的核苷酸序列。本发明的核酸还包括目的核苷酸序列的同源物，例如直向同源物和侧 向同源物，并且还包括为特定生物(例如宿主细胞)内的表达已进行密码子优化的目的核 苷酸序列的变体。当描述两个核酸区域间的关系时，术语“有效连接的”指并列，其中这两种核酸区 域所处关系允许它们以希望的方式发挥作用。例如与编码序列“有效连接”的控制序列以 如此方式连接以至在与控制序列兼容的条件下，如当合适分子(例如诱导物和聚合酶)结 合至一个或多个控制序列或调节序列时，实现编码序列的表达。本文中可交换使用的术语“多肽”和术语“蛋白质”及“肽”指氨基酸的聚合物。示 例性多肽包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直向同源物、侧向同源物、片段以及前 述物质的其他等效物、变体和类似物。用于指参考多肽时，术语“多肽片段”或“片段”指多肽，在其中当与参考多肽本身 相比较时，氨基酸残基缺失，而剩余的氨基酸序列通常与参考多肽内的相应位置相同。这类 缺失可以出现在参考多肽的氨基末端或羧基末端或备选地在两个末端上。片段一般是至少 5、6、8或10个氨基酸长度、至少14个氨基酸长度、至少20、30、40或50个氨基酸长度、至 少75个氨基酸长度或至少100、150、200、300、500个或更多个氨基酸长度。片段可以保留 参考多肽的一种或多种生物学活性。在某些实施方案中，片段可以包含具有所需生物学活 性的结构域和任选位于结构域的一侧或两侧的额外氨基酸，其中所述的额外氨基酸可以是 从5、10、15、20、30、40、50个或至多100个或更多数目的残基。此外，片段可以包括特定区 域的亚片段，其中亚片段保留衍生自其的区域的功能。在另一实施方案中，片段可以具有免疫原性。术语“本发明多肽”指含有主题氨基酸序列或其等效物或片段的多肽。本发明多肽 包括包含主题氨基酸序列的全部或部分的多肽具有1个至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、 75个或更多个保守性氨基酸置换的主题氨基酸序列；包括与主题氨基酸序列至少60%、 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列，及其功能性片段。本发 明多肽还包括主题氨基酸序列的同源物，例如直向同源物和侧向同源物。还有可能为了如此目的而修饰本发明多肽的结构，如增强治疗性效力或预防效力 或稳定性(例如离体(ex vivo)保存期、在体内蛋白酶解性降解抗性等)。如此修饰的多肽， 当为了保留天然存在形式的蛋白质的至少一种活性而设计时，被视作本文中更详细描述的 多肽的“功能性等效物”。可以产生如此修饰的多肽，例如通过氨基酸置换、缺失或添加，其 中置换可以全部或部分地由保守性氨基酸置换组成。例如，预计单独的保守性氨基酸置换如用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨 酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸将不会明显影响所得的分子的生物学活性，这是合 理的。多肽氨基酸序列中的变化是否产生功能性同源物可以通过评估变异多肽产生与野生 型蛋白质的应答相似的应答的能力而轻易地确定，其中可以用相同方式轻易地测试已经发 生多于一种替换的多肽。术语“纯化的”指作为主导种类存在的目标种类(即基于摩尔，其丰度超过组合 物内的其他各种类)。“纯化的级分”是组合物，在其中目标种类是全部存在种类的至少约 50% (基于摩尔)。在进行溶液或分散体内某种类纯度的测定时，该测定通常不包括所述种 类在其中溶解和分散的溶剂或基质；相反，仅考虑已溶解或已分散的所述种类(包括目的 种类)。通常，纯化的组合物将具有超过组合物内全部存在种类的约80%、超过全部存在种 类的约85%、90%、95(%、99(%或更多的一个种类。目标种类可以纯化至其中组合物基本上 是单一种类的基本均一性(不能在组合物内以常规检测方法检测到杂质种类)。本领域技 术人员可基于本发明的教导，使用蛋白质纯化的标准技术纯化本发明的多肽。多肽的纯度 可以通过本领域技术人员已知的众多方法测定，所述方法包括例如氨基末端氨基酸序列分 析、凝胶电泳、质谱分析和本文中所述的方法。术语“重组蛋白”或“重组多肽”指通过重组DNA技术产生的多肽。此类技术的实 例包括如此例子，即将所表达蛋白质的编码DNA插入至合适表达载体内时，其中所述的合 适表达载体随后用于转化宿主细胞以产生由该DNA所编码的蛋白质和多肽。本说明书通篇所用的术语“调节序列”是指诸如启动信号、增强子、调节子和启动 子的多核苷酸序列的上位术语，其需要或想要影响与该多核苷酸序列有效连接的编码序列 或非编码序列的表达。示例性调节序列在Goeddel ；Gene Expression Technology =Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述并包括例如 SV40 的早期启 动子和晚期启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC 系统、其表达受T7RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、用 于fd衣壳蛋白的控制区域、用于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶 (例如Wio5)的启动子、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子，以及 已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒基因表达的其他序列。此类控制序列的性质和用途 可以根据宿主生物而变化。在原核生物中，此类调节序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“调节序列”旨在至少包括其存在可以影响表达的成分并且还可以 包括其存在是有利的额外成分，例如前导序列和融合配偶物序列。在某些实施方案中，多核 苷酸序列的转录受控于控制该多核苷酸在如此细胞类型内表达的启动子序列(或其他调 节序列)，其中所述细胞类型内旨在所述的表达。还将理解多核苷酸可以受控于调节序列， 其与控制多核苷酸的天然存在形式表达的那些调节序列相同或不同。术语“序列同源性” 指两种核酸序列间碱基匹配的比例或两种氨基酸序列间氨基酸匹配的比例。当序列同源性 表述为百分数例如50%时，该百分数指在来自与其他序列加以比较的所需序列中序列长度 范围内的匹配比例。容许缺口(在两个序列中任意一个内)以使匹配最大化；通常使用15 个碱基或更少的缺口长度，更常见使用6个碱基或更少的缺口长度、甚至常见使用2个碱基 或更少的缺口长度。术语“序列同一性”意指序列在比较窗口范围内是相同的(即对于核 酸是基于核苷酸对核苷酸，或对于多肽是基于氨基酸对氨基酸)。术语“序列同一性的百分 数”通过在比较窗口范围内比较两个已优化比对的序列进行计算。确定在两个序列内均存 在的相同氨基酸位置数或相同核苷酸位置数以产生匹配位置数，匹配位置数除以比较窗口 内的总位置数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分数。计算序列同一性的方法是本 领域技术人员已知的并且进一步详述如下。本文所用的术语“可溶的”涉及本发明多肽或其他蛋白质时，意指在细胞培养物内 表达时，至少一些部分已表达的多肽或蛋白质停留在细胞的胞质部分内并且在裂解及离心 裂解物时，不随细胞碎片发生分级。多肽的可溶性可以通过现有技术已确认的多种方法提 高，所述方法包括与异源氨基酸序列融合、缺失氨基酸残基、氨基酸置换(例如在序列中增 加具有亲水性侧链的氨基酸残基)和化学修饰(例如添加亲水性基团).多肽的可溶性可以通过多种现有技术已确认的方法测量，所述方法包括确定聚集 状态的动态光散射、UV吸收、旨在从非聚集材料中分离已聚集材料的离心，以及SDS凝胶 电泳(例如比较可溶性部分内蛋白质的量与合并的可溶性部分及不溶性部分内蛋白质的 量)。当在宿主细胞内表达时，本发明多肽可以是至少约1%、2%、5%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多可溶性的，例如，位细质部分内发现的细胞内已 表达蛋白质的总量的至少约 1% >2%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%, 90%或更多。在某些实施方案中，1升表达本发明多肽的细胞培养物将产生至少约0. 1、 0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50毫克或更多的可溶性蛋白。在示例性实施方案中，本发明 多肽是至少约10%可溶性的并将从1升细胞培养物中产生至少约1毫克蛋白质。术语“特异性地杂交”指可检测和特异性的核酸结合。在使与非特异核酸可估计 量的可检测的结合最小化的杂交和洗涤条件下，本发明的多核苷酸、寡核苷酸及核酸与核 酸链选择性杂交。可以使用严格条件来实现如本领域已知的并在本文中讨论的选择性杂交 条件。通常，在本发明的多核苷酸、寡核苷酸及核酸与目的核酸序列之间的核酸序列同源性 将是至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高。在某些情 况下，在根据常规杂交方法和如本文中进一步所述的严格条件下进行杂交和洗涤条件。术语“严格条件”或“严格杂交条件”指促进两条互补性多核苷酸链间特异性杂交 以至于形成双链体的条件。严格条件可以选择为比在定义离子强度和PH下的用于给定多 核苷酸双链体的热解链点(Tm)低约5°C。互补性多核苷酸链的长度及它们的GC含量将决 定双链体的Tm并因此决定为获得想要的杂交特异性所必需的杂交条件。Tm是50%的多核苷酸序列杂交成为完全匹配互补链的温度(在定义离子强度和PH下)。在某些情况下，可 能需要增加杂交条件的严格性至大约等同于特定双链体的Tm。可以使用估计Tm的多种技术。一般，估计双链体内的G-C碱基对对Tm贡献约3°C， 而估计A-T碱基对贡献约2 V，直至理论性最大值约80-100°C。然而，可使用更复杂的Tm模型，在其中考虑G-C堆积相互作用、溶剂效应、想要的 测定温度等。例如，具有大约60°C解离温度(Td)的探针可以使用式Td= (((3X#GC) + (2X#AT)) X37)-562)/#bp)-5设计；其中#GC、#AT和#bp分别是参与双链体形成的鸟嘌 呤-胞嘧啶碱基对数、腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对数和总碱基对数。杂交可以以5父55(、4\55(、3\55(、2\55(、1\55(或0.2XSSC 实施至少约 1 小 时、2小时、5小时、12小时或M小时。可以增加杂交温度以调节反应的严格性，例如从约 250C (室温)至约451、501、551、601或651。杂交反应还可以包括影响严格性的另一 种试剂，例如，在50%甲酰胺存在下实施的杂交增加在定义温度下的杂交严格性。杂交反应可以后接单个洗涤步骤，或2个或多个洗涤步骤，这些步骤可为相同或 不同的盐度和温度。例如，为调节严格性可以升高洗涤的温度从约25°C (室温)至约45°C、 50°C、55°C、60°C、65°C或更高。洗涤步骤可以在去污剂例如0. 1或0. 2% SDS存在下实施。 例如、杂交可以后接2个在65°C的洗涤步骤，每个洗涤步骤在2XSSC、0. 1% SDS中持续约 20分钟并且任选地再有2个在65°C的额外洗涤步骤，每个洗涤步骤在0. 22XSSC.0. 1% SDS中持续约20分钟。示例性的严格杂交条件包括65 °C下在含有50 %甲酰胺、10 X Denhardt (0.2% FicolUO. 2%聚乙烯吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白)和200 μ g/ml变性载体DNA(例如剪 切鲑精DNA)的溶液中杂交过夜，随后是2个在65°C的洗涤步骤，每个洗涤步骤在2XSSC、 0. 1 % SDS中持续约20分钟，以及2个在65 °C的洗涤步骤，每个洗涤步骤在0. 22 X SSC, 0. 1% SDS中持续约20分钟。杂交可以由在溶液中杂交两种核酸，或将溶液中的一种核酸杂交至另一种结合于 固态支持物例如滤膜上的核酸组成。当一种核酸处于固态支持物上时，预杂交步骤可以在 杂交前进行。预杂交可以在如杂交溶液那样的相同溶液及在相同温度下实施至少约1小 时、3小时或10小时(无互补性多核苷酸链)。合适的严格条件是本领域技术人员已知的或可以由技术人员实验确定。参见， 例如 Current Protocols i η Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y. (1989)， 6. 3. 1-12. 3. 6 ；Sambrook 等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N. Y. ；S.Agrawal(编 辑)Methods in Molecular Biology, 第 20 卷；Ti jssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes，例如第 2 章第 I 部分 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", ElsevieriNew York 和 Tibanyenda，N.等，Eur. J. Biochem. 139 :19 (1984)以及 Ebel，S.等， Biochem. 31 :12083(1992)。术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一种核酸的核酸。根据本发明可以使 用的一种类型的载体是附加体，即能够进行染色体外复制的核酸。其他载体包括能够自主 复制并表达与之连接的核酸的那些载体。能够指导与之有效连接的基因表达的载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组技术中所用的表达载体常常是“质粒”形式，所述质粒指在 其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA分子。在本说明书中。“质粒”和“载体”可 交换地使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明旨在包括此类其他形式的表达 载体，它们发挥等效功能并在本领域内是迄今已知的。本发明的核酸可以用作诊断试剂以检测与其特异性结合的靶DNA或靶RNA序列的 存在与否，例如用于测定本发明核酸的表达水平。在一个方面，本发明构思检测在样品内本 发明核酸或其部分存在的方法，该方法的步骤是(a)提供长度为至少8个核苷酸的寡核苷 酸，该寡核苷酸与本发明核酸的部分互补；(b)使寡核苷酸与含有至少一种核酸的样品在 允许此寡核苷酸与本发明核酸或其部分杂交的条件下接触；和(c)检测寡核苷酸与样品内 核酸的杂交，因而检测在样品内本发明的核酸或其部分的存在。在另一方面，本发明构思通 过如此方式检测样品内本发明核酸或其部分存在的方法，即(a)提供一对单链寡核苷酸， 其中每一单链寡核苷酸长度为至少8个核苷酸，与本发明核酸的序列互补并且其中与寡核 苷酸互补的序列间隔至少10个核苷酸；和(b)使寡核苷酸与含有至少一种核酸的样品在 杂交条件下接触；(c)扩增两条寡核苷酸引物间的核苷酸序列；和(d)检测被扩增序列的存 在，因而检测样品内本发明的核酸或其部分的存在。在本发明的另一方面，本发明的多核苷酸在表达载体内提供，所述表达载体含有 编码本发明多肽的核苷酸序列并与至少一种调节序列有效连接。应当理解的是表达载体的 设计可能取决于如此因素，如待转化宿主细胞的选择和/或想要表达的蛋白质的类型。应 当考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标记的 表达。含有本发明多核苷酸的表达载体随后可以用作药剂以治疗感染猪痢疾短螺旋体 的动物，或作为疫苗(也是药剂)以防止动物感染猪痢疾短螺旋体，或旨在减少疾病症状 和疾病过程，若该动物确实受到感染。使用表达载体作为药剂的一种方式是施用核酸疫 苗至有感染风险的动物或感染后的动物。在本领域内充分描述了核酸疫苗技术。一些描 述可以在美国专利6，562，376 (Hooper等)、美国专利5，589，466 (Feigner等)、美国专利 6，673，776 (Feigner等)和美国专利6，710，035 (Feigner等)内找到。核酸疫苗可以注射 至肌肉或皮下，可以经电穿孔(见WO 01/23537，King等和WO 01/68889，Malone等)、经月旨 质组合物(见美国专利5，703，055，Feigner等)或本技术领域已知的其他机制进入动物。表达载体还可以转染至细菌内，所述细菌可以施用至目标动物以诱导针对表达 载体内含有的本发明核苷酸所编码的蛋白质的免疫应答。表达载体可以含有真核表达序 列以至于在宿主动物内转录并翻译本发明的核苷酸。备选地，表达载体可以在细菌内转录 并随后在宿主动物内翻译。用作表达载体的携带者的细菌应当是减毒的但仍有侵染性。 可以使用已减毒的但仍有侵染性的志贺氏菌属某种(Shigella spp.)、沙门氏菌属某种 (Salmonella spp.)、埃希氏菌属某禾中(Escherichia spp.)禾口气单胞菌属某禾中(Aeromonas spp.)，这里仅仅例举若干。这些方法的实例可以在美国专利5，824，538 (Branstrom 等)、美国专利5，877，159 (Powell等)、美国专利6，150，170 (Powell等)、美国专利 6，500，419 (Hone 等)和美国专利 6，682，7 (Powell 等)中找到。备选地，可以将本发明的多核苷酸置于作为载体的某些病毒内。病毒载体可以 将本发明的蛋白质表达在病毒表面上或携带本发明的多核苷酸进入动物细胞内，在其中多核苷酸转录并翻译成蛋白质。用病毒载体感染的动物可以发生针对本发明多核苷酸所 编码蛋白质的免疫应答。因此。可以减轻或预防在接受病毒载体的动物内由猪痢疾短 螺旋体所致的感染。病毒载体的实例可以在美国专利5，283, 191 (Morgan等)、美国专利 5，554，525 (Sondermeijer 等)和美国专利 5，712，118 (Murphy)中找到。本发明的多核苷酸可以用来引起本发明多肽在培养中繁殖的细胞内表达和过量 表达，例如以产生蛋白质或多肽，包括融合蛋白或融合多肽。本发明涉及用重组基因转染宿主细胞以表达本发明的多肽。宿主细胞可以是任意 的原核细胞或真核细胞。例如，本发明多肽可以表达于细菌细胞内，如大肠杆菌、昆虫细胞 (杆状病毒)、酵母、植物细胞或哺乳动物细胞内。在这些例子中，当宿主细胞是人细胞时， 它可以位于活受体内或不在其中。本领域技术人员已知其他合适的宿主细胞。另外，宿主 细胞可以补充宿主内通常找不到的tRNA分子以至于优化了多肽的表达。备选地，可以改变 核苷酸序列以优化宿主细胞内的表达，所产生的蛋白质仍将具有与最初编码蛋白质的高度 同源性。适用于最大化表达多肽的的其他方法将是本领域技术人员已知的。本发明还涉及产生本发明多肽的方法。例如可以在允许多肽表达发生的合适条件 下培养宿主细胞，其编码本发明多肽的表达载体转染。多肽可以被分泌并从细胞与含有该 多肽的培养基的混合物中分离。备选地，多肽可以停留在细胞质内，并收获、裂解细胞以及 分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基在 本领域众所周知。多肽可以使用本领域已知用于纯化蛋白质的技术从细胞培养基、宿主细 胞或该两者中分离，所述的技术包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳及用针对本 发明多肽中特定表位呈特异性的抗体的免疫亲和纯化。因此，编码本发明多肽的全部或所选择部分的核苷酸序列可以用来通过微生物细 胞过程或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。标准方法是将序列连接到多核苷酸构建 体如表达载体，并转化或转染至宿主即真核宿主(酵母、鸟、昆虫或哺乳动物)或原核宿主 (细菌细胞)内。类似的方法或其改良可以用来通过微生物手段或组织培养技术制备本发 明的重组多肽。用于表达本发明多肽的合适载体包括如下类型的质粒用于原核细胞如大肠杆菌 内表达的pTrcHis衍生性质粒、pET衍生性质粒、pBR322衍生性质粒、pEMBL衍生性质粒、 PEX衍生性质粒、pBTac衍生性质粒和pUC衍生性质粒。在制备质粒和转化宿主生物中使用 的多种方法在本领域众所周知。关于同时适用于原核细胞和真核细胞的其他合适表达系统 以及通用重组方法，见Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，编者Sambrook， Fritsch 禾口 Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),第 16 禾口 17 章。目的多肽的编码序列可以作为包括编码不同多肽的核苷酸序列的融合基因的部 分并入。本发明构思含有本发明核酸和编码异源肽的至少一种异源序列的分离的多核苷 酸，其中所述的异源序列符合读框地与本发明核酸的核苷酸序列连接，以至于编码含有异 源多肽的融合蛋白。异源多肽可以与(a)本发明多肽的羧基末端、(b)本发明多肽的氨基 末端或(c)本发明多肽的羧基末端及氨基末端融合。在某些情况下，异源序列编码这样的 多肽，该多肽允许检测、分离、增溶与该多肽融合的多肽，和/或使与该多肽融合的多肽稳 定化。在其他实施方案中，异源序列编码多肽，如多His标签、myc、HA、GST、蛋白Α、蛋白G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、多精氨酸、多His-Asp、FLAG、免疫球蛋白的 部分和胞运肽。在需要产生本发明多肽的免疫原性片段时，可以使用融合表达系统。例如，可以使 用轮状病毒的VP6衣壳蛋白作为多肽部分的免疫载体蛋白，其为单体形式或是病毒颗粒形 式。与待产生针对性抗体的本发明多肽的部分相对应的核酸序列可以引入到融合基因构建 体内，所述融合基因构建体包含用于痘苗病毒晚期结构蛋白的编码序列，以产生使包含本 发明蛋白质的部分的融合蛋白作为病毒粒子的部分进行表达的一组重组病毒。乙型肝炎表 面抗原也可以以此目的使用。类似地，可以产生嵌合构建体以增强免疫原性，其中该嵌合 构建体编码含有本发明多肽的部分及脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白的融合蛋白(见，例如欧洲 专利公开号:0259149 和 Evans 等，(1989)Nature 339 :385 ；Huang 等，(1988) J. Virol. 62 3855 和 Schlienger 等，(1992) J. Virol. 66 2)。融合蛋白可以辅助表达和/或纯化蛋白质。例如，本发明多肽可以作为谷胱甘 肽-S-转移酶(GST)融合蛋白生成。这类GST融合蛋白可以用来简化本发明多肽的纯化，如 通过利用谷胱甘肽-衍生化基质(见，例如Current Protocols in Molecular Biology，编 者Ausubel等(N. Y. John Wiley & Sons，1991))。在另一实施方案中，编码纯化用前导序列 (如重组蛋白中所需部分氨基末端上的多-(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因可以 允许使用Ni2+金属树脂通过亲和层析纯化已表达的融合蛋白。纯化用前导序列随后可以通 过用肠激酶处理除去，以提供纯化的蛋白质(例如见Hochuli等，(1987) J. Chromatography 411 177 ；和 Janknecht 等，PNAS 美国 88 :8972)。用于产生融合基因的技术是众所周知的。基本上，根据常规技术进行编码不同多 肽序列的多种DNA片段的连接，即采用用于连接的平末端或交错末端，限制酶消化以提供 合适末端，根据需要补平粘端，碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接以及酶连接。在另一实 施方案中，融合基因可以通过包括自动DNA合成仪在内的常规技术合成。备选地，基因片 段的PCR扩增可以使用在连续的两个基因片段间产生互补突出端的锚式引物实施，其中所 述的两个基因片段随后可以复性以生成嵌合的基因序列(见，例如Current Protocols in Molecular Biology，编者 Ausubel 等，John Wiley & Sons :1992)。在其他实施方案中，本发明提供固定在固态表面上的本发明核酸，所述的固态表 面包括平板、微量滴定平板、载玻片、小珠、颗粒、球、膜、链、沉淀、凝胶、薄片、管、容器、毛细 管、贴片、条等。本发明的核酸可以固定于芯片上作为阵列的部分。该阵列可以含有如本文 所述的一种或多种本发明多核苷酸。在一个实施方案中，芯片含有一种或多种本发明多核 苷酸作为来自如本发明多核苷酸的相同致病物种内的多核苷酸序列阵列的部分。在本发明的优选形式中，提供如本文所述的分离的猪痢疾短螺旋体多肽并还提供 编码这些多肽的多核苷酸序列。更希望的是以基本上纯化的形式提供猪痢疾短螺旋体多 肽。本发明的优选多肽将具有全长天然多肽的一种或多种生物学特性(例如体内特 性、体外特性或免疫特性)。本发明的范围还包括非功能性多肽，因为它们可以用作例如功 能性多肽的拮抗剂。可以测定与野生型相关的类似物、片段或衍生物的生物学特性，例如通 过生物学测定手段。多肽，包括类似物、片段和衍生物，可以合成性地制备(例如使用众所周知的固相或液相肽合成技术)。优选使用固相合成技术。备选地，本发明多肽可以是使用众所周知的 基因工程技术制备，如下文所述。在另一实施方案，多肽可以(例如通过免疫亲和纯化)从 中纯化，该生物学流体例如但不限于来自动物的血浆、粪便、血清或尿，其中所述的动物包 括但不限于猪、鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉、人、猴、狗、猫、马、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛和绵羊。猪痢疾短螺旋体多肽类似物包括具有如此氨基酸序列的那些多肽，其中一个或多 个氨基酸用其他氨基酸置换，所述置换基本不改变分子的生物学活性。根据本发明，重组或通过化学合成产生的本发明多肽和其片段或其他衍生物或类 似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以生成识别该多肽的抗体。当分子能够特异相互作用于免疫系统的抗原识别分子如免疫球蛋白(抗体)或T 细胞抗原受体时，该分子有“抗原性”。抗原性氨基酸序列含有至少约5个并优选至少约10 个氨基酸。分子的抗原性部分可以是对抗体识别或T细胞受体识别呈免疫优势的部分，或 其可以是这样的部分，其中通过使抗原性部分缀合至用于免疫的载体分子而使用该部分以 生成针对该分子的抗体。具有抗原性的分子本身不需要是免疫原性的，即能够在载体不存 在下激发免疫应答。“抗体”是结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多 克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体以及抗体的抗原结合部分，其中提及的嵌合抗体在美国 专利号4，816，397和4，816，567中进一步详述，所述抗原结合部分包括Fab、F(ab' )2和 F (v)(包括单链抗体)。因此如本文中所用处于多种语法形式的短语“抗体分子”构思完整 的免疫球蛋白分子及含有抗体结合位点的免疫球蛋白分子的免疫活性部分。“抗体结合位 点”是抗体分子的结构性部分，其由重链区和轻链区及特异性结合抗原的高变区构成。示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免 疫球蛋白分子中含有互补位的那些部分，包括本领域称作Fab、Fab\F(ab'的那 些部分，这些部分优选用于本文中所述的治疗性方法内。抗体分子的Fab和F(ab‘ )2部分经众所周知的方法，各自通过由木瓜蛋白酶和胃 蛋白酶在基本完整的抗体分子上的蛋白水解反应制备。见，例如Theofilopolous等的美国 专利号4，342，566。Fab'抗体分子部分也是众所周知的，从F(ab‘ )2部分中随后用巯基 乙醇使连接两个重链部分的二硫键还原，然后用还原剂(如碘乙酰胺)烷基化所得蛋白质 硫醇而产生。本文中优选含有完整抗体分子的抗体。处于多种语法形式的短语“单克隆抗体”指仅具有一种能够与特定抗原发生免疫 反应的抗体结合位点的抗体。单克隆抗体因此通常显示对该单克隆抗体与之发生免疫反应 的任何抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体可以因此含有具备多种抗体结合位点的抗体分 子，其中每一抗体结合位点对不同抗原呈免疫特异性；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。术语“佐剂”指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以作为缓 慢释放抗原的组织储存佐剂并且还作为非特异性增强免疫应答的淋巴系统活化剂发 挥作用[Hood 等在 Immunology,第 384 页，第 二 版，Benjamin/Cummings, Menlo Park, California(1984)]0在无佐剂下单用抗原的初次免疫往往不能激发体液或细胞免疫应答。 佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性 物质如溶血磷脂酰胆碱、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油或烃乳状液、匙孔血 蓝蛋白、二硝基苯酚和人可能使用的佐剂如BCG(Bacille de Calmette-Guerin)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。优选地，佐剂是可药用的。本领域已知的多种方法可以用于产生抗本发明多肽的多克隆抗体。为产生抗体， 多种宿主动物可以通过注射本发明多肽加以免疫，所述宿主动物包括但不限于兔、小鼠，大 鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案，本发明多肽可以缀合至免疫原性载体，例如牛血清白蛋 白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。多种佐剂可以用来提高免疫应答，所述佐剂根据宿主种类 包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血磷脂 酰胆碱、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和人可能使用的佐剂 如BCG和小棒杆菌。为产生抗本发明多肽的单克隆抗体，可以使用通过连续传代细胞系培养产生 抗体分子的任何技术。这些技术包括但不限于最初由Kohler等，(197 Nature，256 495-497开发的杂交瘤技术、三瘤体技术、人B-细胞杂交瘤技术[Kozbor等，(1983) Immunology Today, A :12]和旨在产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等，(1985) 在 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第 77-96 页，Alan R. Liss, Inc.]。永生 性抗体产生细胞系可以通过除融合法之外的技术创造，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞 或用Epstein-Barr病毒的转染。见，例如美国专利号4，341，761,4, 399，121,4, 427，783、 4，444，887,4, 451，570,4, 466，917,4, 472，500,4, 491，632 和 4，493，890。在本发明另一实施方案中，单克隆抗体可以利用最新技术在无菌动物内产生。根 据本发明，可以使用鸡抗体或猪抗体，并该抗体可以通过使用鸡杂交瘤或猪杂交瘤或通过 在体外用EBV病毒转化B细胞得到。实际上根据本发明，可以使用为如此产生“嵌合抗体” 而开发的技术[Morrison 等，(1984) J. Bacterol.，159-870 ;Neuberger 等，(1984)Nature, 312 =604-608 ；Takeda等，(1985) Nature, 314 :452-454]，其中所述的嵌合抗体通过将来自 对本发明多肽特异的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物学活性的抗体分子地基因 剪接在一起而产生，本发明的范围包括此类抗体。此类嵌合抗体优选用于治疗肠道疾病或 功能紊乱(描述见下)，因为在特定变态反应中这类抗体本身诱导免疫应答的可能性比异 种抗体更小。根据本发明，所述用于产生单链抗体的技术(美国专利4，946，778)可适用于产生 对本发明多肽特异性的单链抗体。本发明另一实施方案利用所述用于构建Fab表达文库的 技术[Huse等，(1989) Science, 246 :1275-1281]以允许快速而简单地鉴定对本发明多肽具 有所需特异性的单克隆Fab片段。含有抗体分子独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括但 不限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab' )2片段；可以通过还原F(ab' )2 片段的二硫键产生的Fab'片段以及可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的 Fab片段。在抗体产生中，筛选所需要的抗体可以通过本领域已知技术完成，例如放射免疫 测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫 测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、Western印迹、沉淀反应、凝集测定(例 如凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定、免疫电泳 测定等。在一个实施方案中，通过检测在第一抗体上的标记而检测抗体的结合。在另一实 施方案，通过检测第二抗体或试剂对第一抗体的结合而检测第一抗体。在另一实施方案中，第二抗体经过标记。用于检测在免疫测定中结合作用的多种手段是本领域已知的并且处于 本发明的范围内。例如为选择可识别本发明多肽的特异性表位的抗体，可以对已生成的杂 交瘤测定与含有如此表位的本发明多肽片段相结合的产物。本发明还包括旨在使用本发明多肽和/或结合至本发明多肽的抗体检测猪痢疾 短螺旋体存在的诊断方法及预测方法，以及用于诊断和预测猪痢疾短螺旋体感染的试剂品.ο诊断及预测方法通常将使用从动物如鸡或猪中获得的生物样品进行。“样品”指怀 疑含有短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋体或其多核苷酸或其多肽的动物组织或动物流体。 此类组织或流体的实例包括但不限于血浆、血清、粪便材料、尿、肺、心脏、骨骼肌、胃、肠道 和体外细胞培养成分。本发明提供用于检测样品内本发明多肽存在的方法，步骤如下(a)使怀疑含有本 发明多肽的样品与抗体在允许形成包含该抗体和本发明多肽的反应复合物的条件下接触， 其中所述抗体与本发明多肽(优选结合于固态支持物)特异性结合；和(b)检测样品内包 含抗体和本发明多肽的反应复合物的形成，其中检测到反应复合物的形成表示样品内存在 本发明的多肽。优选地，该方法内所用的抗体衍生自亲和纯化的多克隆抗体并且更优选是单克隆 抗体。此外，优选本文中所用的抗体分子处于Fab、Fab'、F(ab' )2或F(ν)部分或完整抗 体分子的形式。基于以上方法检测猪痢疾短螺旋体的特别优选方法包括酶联免疫吸附测定法、放 射免疫测定、免疫放射测定和免疫酶测定，包括使用单克隆抗体和/或多克隆抗体的夹心 测定法。尤其有用的这样三种方法利用了用可检测标记物标记的本发明多肽(或其片 段)、用可检测标记物标记的抗体Ab1或用可检测标记物标记的抗体Ab2。该方法可以由如 下等式概述，其中星号表示颗粒经过标记并且“AA”代表本发明的多肽A. AA^Ab1 = AA=KAb1B. AA+Ah* = AA Ab1*C. AA+AVAb2* = Ab1AA Ab2*这些方法和它们的应用均是本领域技术人员熟悉的并且因此可以在本发明的范 围内利用。“竞争性”方法即方法A在美国专利号3，654，090和3，850，752内描述。方法B 是众所周知的竞争性测定技术的代表。方法C即“夹心”方法在美国专利号RE 31，006和 4,016,043内描述。其他方法也是已知的并可以利用，如“双抗体”或“DASP”方法。在任何情况下，本发明的多肽与一种或多种抗体或结合配偶物形成复合物并且复 合物中的一个成员用可检测标记物标记。即复合物已经形成，并且根据需要，复合物的量可 以通过可用于检测标记物的已知方法确定。从上述将看出，Ab2的特征性特点在于它将Ab1反应。该反应是因为在一种哺乳动 物物种内所产生的Ab1已经用作另一物种内的抗原以产生抗体Ab2。例如AId2可以使用兔抗 体作为抗原在山羊内产生。因此，AId2是在山羊内产生的抗兔抗体。为本说明书和权利要求 书的目的，Ab1将称作第一抗体，并且Ab2将称作第二抗体或抗Ab1抗体。这些研究最通常使用的标记物是放射性元素、酶、当暴露于紫外线时发荧光的化学品和其他物质。能够作为标记物利用的荧光物质的实例包括荧光素、罗丹明和金胺。特定 检测物质是在山羊内制备并与荧光素经异硫氰酸盐缀合的抗兔抗体。优选同位素的实例包 括 3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59!^、9°Y、125l、131I 和 186Re0 放射性标记可以通过目前可 用的任何计数方法检测。在可以使用多种酶的同时，优选的酶实例是过氧化物酶、葡糖 醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶加上过氧化物酶，以及碱性 磷酸酶。酶通过桥接分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等缀合至所选择的颗粒。酶标记 物可以是通过目前采用的任何比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流分析技术 或气体分析技术(gasometric)检测。参考美国专利号3，654，090,3,850, 752和4，016，043 例如对替代性标记材料和方法的公开。本发明还提供检测生物样品内抗本发明多肽的抗体的方法，其使用如下步骤(a) 提供本发明的多肽或其片段；(b)将生物样品与所述的本发明多肽在允许形成抗体-抗原 复合物的条件下温育；和(c)确定是否形成具有本发明多肽的抗体-抗原复合物。在本发明的另一实施方案中，提供用于评测生物样品内抗本发明多肽抗体的水平 的体外方法，其使用如下步骤(a)根据上述方法检测在生物样品内反应复合物的形成；和 (b)评测已形成的反应复合物的量，其中反应复合物的量与生物样品内抗本发明多肽抗体 的水平对应。本发明还提供用于监测治疗性治疗动物宿主内与猪痢疾短螺旋体相关的疾病的 体外方法，即通过如上所述评测在系列生物样品内的抗本发明多肽抗体的水平，其中所述 的系列生物样品在不同时间点上从接受所述治疗性治疗的动物宿主获得。本发明还提供检测生物样品内猪痢疾短螺旋体存在或不存在的方法，即通过(a) 使生物样品与本发明多核苷酸的多核苷酸探针或引物在合适杂交条件下接触；和(b)检测 在探针或引物与样品内的核酸间所形成的任何双链体。本发明的一个实施方案中，猪痢疾短螺旋体的检测可以如此完成，即使用已知技 术，通过直接扩增来自生物样品的多核苷酸序列，并随后检测本发明多核苷酸序列的存在。在本发明的一个形式中，靶核酸序列通过PCR法扩增和随后使用以上提及的任何 特异性方法检测。用于检测多核苷酸序列存在的其他诊断性技术包括但不限于1)等位基 因特异性PCR ；2)单链形态分析；幻变性梯度凝胶电泳；4) RNA酶保护测定力)使用识别核苷酸错配的蛋白质如大肠杆菌mutS蛋白质；6)等位基因特异性寡核苷酸和7)荧光原位杂 、-父。除以上方法之外，多核苷酸序列还可以使用常规探针技术检测。当使用探针来检 测所需的多核苷酸序列的存在时，根据需要可以处理待分析的生物样品如血液或血清以提 取核酸。样品多核苷酸序列可以按照多种促进靶序列检测的方式制备；例如变性、限制性消 化、电泳或点印迹。样品多核苷酸序列中的目标区域通常必须至少部分是单链，以便与探针 的目标序列形成杂交体。若序列天然是单链的，则无需变性。然而，若序列是双链的，可能 需要使序列变性。变性可以通过本领域已知的多种技术实施。样品多核苷酸序列和探针在促进探针内的靶序列与样品内的推定所需多核苷酸 序列形成稳定杂交体的条件下温育。优选地，使用高严格条件以预防假阳性。检测产生的杂交体(若存在)通常利用标记探针完成。备选地，探针可以是非标 记的，但是可以因与标记的配体直接或间接特异性结合而是可检测的。用于标记探针和配体的合适标记物和方法是本领域已知的，并包括例如可以通过已知方法(例如切口平移、 随机引发或激酶法)引入放射性标记物、生物素、荧光基团、化学发光基团(例如二氧杂环 丁烷、特需触发的二氧杂环丁烷)、酶、抗体等。这种基本方案的变通方案在本领域是已知 的，并包括促进从外来物中分离待监测的杂交体的变通方案或促进扩增标记部分的信号的 变通方案。在本发明的范围内还构思本发明的核酸探针测定法可以采用能够检测所需要的 本发明多核苷酸序列的核酸探针的混合物。因此，在检测在细胞样品内的本发明多核苷酸 序列存在的实例中，使用与多核苷酸序列互补的多于一种的探针并且不同探针的数目尤其 备选是2、3或5个不同核酸探针序列。本文中所述的多核苷酸序列(优选处于探针形式)还可以固定在固态支持物上， 以便检测短螺旋体属物种，其包括但不限于猪痢疾短螺旋体、密螺旋体、B. alvinipulli、阿 尔堡短螺旋体、无害短螺旋体、B.murdochii和多毛短螺旋体。备选地，本文中所述的多核 苷酸序列将构成可以用来同时检测来自短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋的大量不同基因 的DNA分子文库的部分。在本发明的另一变化形式中，本文中所述的多核苷酸序列连同其 他多核苷酸序列(如来自细菌或病毒的多核苷酸序列)可以按照如此方式固定于固态支持 物上，其中所述的方式允许鉴定短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋体的存在，和/或鉴定结 合在固态支持物上的任何其他多核苷酸序列。用于产生DNA分子的固定化文库的技术已经在现有技术中描述。通常，绝大部分 现有技术方法描述单链核酸分子文库的合成，使用例如掩蔽技术以便在固体基质多个隔开 的位置上建立序列的多种排列。美国专利号5，837，832描述了基于超大规模整合技术的用 于产生固定至硅基质上的DNA阵列的改良方法。美国专利号5，837，832特别描述了称作“覆 盖”的策略以在可以用来产生本发明固定化DNA文库的基质上已空间定义的位置内合成特 异性探针组。美国专利号5，837，832还提供对仍可以使用的较早技术的参考。因此多核苷 酸序列探针可以在基质的表面上原位合成。备选地，单链分子可以脱离固体基质合成并且预先形成的每种序列可以施加至固 体基质上分隔的位置内。例如，使用配备针式装置或压电(pizoelectric)装置的机器人设 备，可以将多核苷酸序列直接印刷在基质上。文库序列通常固定在固体基质的分隔区域表面或其内部。基质可以是多孔的，以 允许在基质内部的固定，或基本上是无孔的，此时文库序列通常固定在基质的表面。固体基 质可以直接或间接地由可结合于多肽的任何材料制成。合适的固体基质的实例包括平板玻 璃、硅片、云母、陶瓷和有机聚合物如塑料，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯。还可能使用可 广泛获得的半透膜，如硝酸纤维素膜或尼龙膜。半透膜可以固定在更坚固的固态表面上，如 玻璃。该表面可以任选地以金属层包被，如金、钼或其他过渡金属。优选地，固体基质通常是具有硬表面或半硬表面的材料。在优选的实施方案中， 基质的至少一个表面是基本平整的，尽管在一些实施方案中，可能需要例如用升高的区域 或蚀刻沟将用于不同聚合物的合成区域物理分隔。还优选固体基质适用于在通常50至 100 μ m的分隔区域内高密度施加DNA序列，产生10000至40000个点/cm2的密度。将固体基质方便地划分成部分。这可以通过如光蚀刻技术或通过使用疏水性墨水 例如基于聚四氟乙烯墨水(Cel-line，美国)来实现。
在其中存在每一不同文库成员的分隔位置可以具有任何方便的形状，例如圆形、 矩形、椭园形、楔形等。多核苷酸序列可以通过共价方法或非共价方法附着至基质。多核苷酸序列可以通 过结合文库序列的分子层附着至基质。例如，多核苷酸序列可以用生物素加以标记并且基 质用抗生物素蛋白和/或链亲和素包被。使用生物素化多核苷酸序列的便利特征是可以轻 易地测定偶联至固体基质的效率。由于多核苷酸序列可能与一些固体基质结合很差，经常 需要在固体基质(如在玻璃的例子中)和核酸序列之间提供化学界面。合适化学界面的实 例包括六甘醇。另一实例是利用聚赖氨酸包被的玻璃，随后使用导入亲和配体的标准方法 化学修饰聚赖氨酸。利用偶联剂将分子附着至固体基质表面的其他方法是本领域已知的， 见，例如 W098/49557。可以通过多种方法测定互补性多核苷酸序列与固定化核酸文库的结合，如结合的 多核苷酸序列光学特征的变化(即通过使用溴化乙锭)或通过使用标记的核酸，如用荧光 团标记的多肽。不需要使用标记物的其他检测技术包括光学技术，如光声法、反射测量术、 椭圆测量术和表面等离子体共振法(见W097/49989).因此，本发明提供已将至少一种本发明的多核苷酸、优选两种或多种本发明不同 的多核苷酸序列在其上面固定的固体基质。本发明还可以用作预防或治疗，其可以用于刺激动物如鸡和猪内的体液应答和细 胞介导性应答的目的，因而提供防止短螺旋体属物种建群的保护，所述的短螺旋体属物种 包括但不限于猪痢疾短螺旋体、密螺旋体、B. alvinipulli、阿尔堡短螺旋体、无害短螺旋 体、B. murdochii和多毛短螺旋体。短螺旋体属物种如猪痢疾短螺旋体的自然感染诱导了 针对本文中所述蛋白质的循环抗体滴度。因此，本文中所述的氨基酸序列或其部分具有形 成可提供抗肠道螺旋体病保护的全身施用或口服施用预防剂治疗剂的基础的潜力。本领域技术人员会理解，在短螺旋体属物种中具有高度的序列保守性。例如，如下 显示的猪痢疾短螺旋体外膜蛋白(OMP)H122和H114在许多短螺旋体属物种中具有高度相 似性。猪痢疾短螺旋体OPM H114的跨物种核苷酸相似性
权利要求
1.分离的多核苷酸，包含选自SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19的核苷酸序列。
2.分离的DNA分子，包含与根据权利要求1的多核苷酸至少70%、优选的至少80%和 更优选的至少90%同源的序列。
3.分离的多肽，包含选自SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列。
4.分离的多核苷酸，包含编码根据权利要求3的多肽序列的核苷酸序列。
5.质粒，其包含根据权利要求1或4的多核苷酸，或根据权利要求2的DNA分子。
6.根据权利要求5的质粒，其中所述质粒为表达载体。
7.包含根据权利要求5或权利要求6的质粒的细胞。
8.分离的蛋白质，包含与根据权利要求3的多肽至少70%、优选的至少80%和更优选 的至少90%同源的序列。
9.免疫原性组合物，包含根据权利要求5或权利要求6的质粒、根据权利要求3的多 肽、根据权利要求7的细胞或根据权利要求8的蛋白质。
10.用于预防短螺旋体感染的疫苗组合物，包含根据权利要求5或权利要求6的质粒、 根据权利要求3的多肽、根据权利要求7的细胞或根据权利要求8的蛋白质。
11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中短螺旋体感染为猪痢疾短螺旋体的感染。
12.根据权利要求10或权利要求11的疫苗组合物，其中组合物包含至少2种选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 的多肽。
13.根据权利要求10至12中任一项的疫苗组合物，其中组合物包含至少3种选自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的多肽，用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体相关的猪 痢疾。
14.诊断短螺旋体感染的方法，包含(a)提供来自疑为感染短螺旋体动物的样品；(b)将样品与包含选自SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的一 种或多种多肽接触；(c)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下孵育样品和多肽；和(d)确定是否形成具有一种或多种多肽的抗体-抗原复合物， 其中抗体-抗原复合物的形成指示动物感染短螺旋体。
15.根据权利要求14的方法，其中短螺旋体感染为猪痢疾短螺旋体的感染。
16.诊断短螺旋体感染的试剂盒，包含一种或多种多肽，所述多肽包含选自SEQID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 的氨基酸序列。
全文摘要
本发明描述了猪痢疾短螺旋体的新的多核苷酸和氨基酸。这些序列用于诊断动物内的猪痢疾短螺旋体病，以及用作治疗性治疗或预防性治疗动物内的猪痢疾短螺旋体病。这些序列还可以用于诊断、治疗性和/或预防性治疗动物内由其他短螺旋体属物种所致的疾病。
文档编号A61K39/02GK102046651SQ200980119455
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月26日 优先权日2008年3月27日
发明者D·J·汉普森, M·I·贝尔伽德, N·D·菲利普斯, T·拉 申请人:斯拜尔基因私人有限公司
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