增强甲状旁腺激素粘膜递送的组合物和方法

专利名称：：增强甲状旁腺激素粘膜递送的组合物和方法增强甲状旁腺激素粘膜递送的组合物和方法骨质疏松症能被定义为全身性骨骼疾病，其特征在于低骨量、骨组织的微结构受损，以及对骨折增加的骨脆性和敏感性。它最常影响老年群体，基本是绝经后的妇女。骨质疏松症的流行提出严重的健康问题。美国国家骨质疏松症基金会(NationalOsteoporosisFoundation)预计四千四百万人正经历骨质疏才公症或骨量减少的影响。到2010年为止，骨质疏松症将影响五千二百万以上的人，并且到2020年将影响六千一百万以上的人。骨质疏松症的流行在高加索人和亚洲人中比在拉丁美洲人中更严重，可能因为拉丁美洲人有更高的骨峰值。女性比男性受更大的影响因为男性有更高的峰骨密度。此外，由于在绝经后雌激素的缺乏造成的加速骨丟失，当女性年纪增加，骨转化的比例增加。骨质疏松症的药理学治疗的目的是维持或增加骨强度，在患者的生命期间防止骨折，并通过安全地降低骨折的危险最小化骨质疏松症相关的发病率和死亡率。治疗骨质疏松症的最常使用的药疗法包括钙，以及维生素D、雌激素(有或没有黄体酮)、二磷酸酐类药物(bisphonate)、选择性的雌激素受体调节因子(SERMs)，以及降4丐素。曱状旁腺激素(PTH)最近成为流行的骨质疏松症的治疗。不象其它疗法降低骨吸收，PTH增加骨量，其引起更高的骨矿物质密度(BMD)。PTH对骨有多重作用，一些是直接的，而一些是间接的。PTH增加从骨进入血液的钙释放率。PTH的慢性作用是增加成骨细胞和破骨细胞的骨细胞的数量，并增加重塑骨。这些影响在给予PTH后几小时内是明显的，并且在停用PTH后持续几小时。将PTH给予骨质疏松的患者引起骨形成的系统刺激，特别是在脊柱和臀部的小梁骨，导致骨折的显著降低。骨形成被认为是通过PTH刺激成骨细胞发生的，这是因为骨祖细胞具有PTH受体。甲状旁腺激素(PTH)是分泌的、84个氨基酸残基的多肽，其具有氨基酸序歹'JSer-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu誦Met画His-Asn-Leu國Gly國Lys誦His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg國Val-Glu-Tip-Leu-Arg-Lys-Lys画Leu-Gln-Asp陽Val-His画Asn-PheValAlaLeuGlyAlaProLeuAlaProArgAspAlaGlySerGinArgProArgLysLysGluAspAsnValLeuValGluSerHisGluLysSerLeuGlyGluAlaAspLysAlaAsnValAspValLeuThrLysAlaLysSerGin(序列IDNO:1)。对具有某种形式PTH的人类中的研究显示对骨合成代谢的影响，并且提示其在治疗骨质疏;^症和相关的骨疾病中的应用的显著意义。例如应用牛和人类激素N-末端的34个氨基酸Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp陽Leu画Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn誦Phe(序列IDNO:2),其被所有的出版物认为与全长激素是生物学上等值的，在人类中显示甲状旁腺激素增强骨生长，特别当以波动的形式通过皮下途径给药时尤为如此。PTH的轻微差别形式人类PTH(l-38)显示相似的结果。已经从新鲜或冻干的激素重建PTH制品，并且掺入不同形式的载体、赋形剂和运输体。多数制备成基于水的运输体，例如盐水，或典型地用乙酸酸化的水以溶解激素。报道的大多数制剂也掺入铝作为稳定剂[参见例如Reeve等人，MW.乂，2朋:6228;(1980)Reeve等人，7:1035(1976);Reeve等人，Oz/";/:r&wei^s.，":469(1976);Hodsman等人，M/"w9(^:137(1990);Tsai等人，乂C//".五m/ocn'"o/MetoZ"690」:1024(1989);Isaac等人，/fo亂Me感版，"(9):487(1980);Law等人，丄C""/打ve就72P力1106(1983);以及Hulter，J.C"打/fypwte打s'2f力:360(1986)]。其它报道的制剂掺入赋形剂，例如甘露醇，其或者与冻干的激素或者与重建的运输体一起存在。也称作特立帕肽(teriparatide)的PTH1-34目前以商标名FORTEO,EliLilly,Indianapolis,Indiana在市场上销售，用于治疗患骨质疏松症具有高骨折危险的绝经后女性。此药通过溶解于包括醋酸緩沖液、甘露醇及m-甲酚pH4的水溶液，20fig皮下注射，每天一次给药。然而，许多人对注射反感，并且因此变得不愿意用规定处方剂量的PTH。因此，需要开发一种具有合适生物利用度的甲状旁腺激素肽的鼻内制剂，以至在血液中获得治疗水平以有效地治疗骨质疏松症或骨量减少。FORTEO㊣是通过重组DNA技术利用大肠杆菌菌抹生产的。PTHw4有4117.87道尔顿的分子量。关于PTHw4及其临床的综述已经发表，包括例如Brixen等人，2004;Dobnig,2004;Eriksen和Robins,2004;Quattrocchi和Kourlas2004,通过引用并入本文中。Forsteo目前在美国(如FORTECf)和欧洲净皮批准。特立帕肽的安全性已经在2800多个患者中被评估，在短期试验中剂量为5到100pg/天。在达2年的长期试验中给予达40ng/天的剂量。与Forsteo相关的不良事件通常是轻度的，并且一般无需中断治疗。最通常报道的不良事件是头暈、腿抽筋、恶心、呕吐和头痛。已报道与Forsteo相关的轻度短暂的血钙过多，其通常为自限性，在6小时之内。特立帕肽以前在一个研究中以达500pg/天的剂量鼻内给药7天给予人类(SuntoryNewsRelease.SuntoryEstablishesLargeScaleProductionofrecombinanthumanPTHi-34andobtainspromisingresultsfromPhase1ClinicalTrialsusingaNasalFormulation.February1999.http:〃www.suntorv.com/news/l999-02.htmlaccessed15April2004),并且在另一个研究中，主体接受达1000吗/天，持续3个月(Matsumoto等人，DailyNasalSprayofhPTH"34for3MonthsIncreasesBoneMassInOsteoporoticSubjects.)(ASBMR20041171October4，2004,SeattleWA.)。没有注意到用此路径的安全问题。目前Forsteo作为每天皮下注射剂给药。如果非注射的给药路径是可行的，包括鼻、口腔、胃肠和皮肤给药途径，其对于患者的可接受性是优选的。
发明内容优选地曱状旁腺激素和哺乳动物是人类。在最优选的实施方案中，甲状旁腺激素肽是PTHw4,也称作特立帕肽。Tregear美国专利No.4,086,1%描述了人类PTH类似物并且声明在体外细胞分析中开始的27到34个氨基酸在刺激腺苷酸环化酶方面中是最有效的。公布于1993年4月15曰的Pang等人的WO93/06845描述了hPTH的类似物，其包括用一些氨基酸取代Arg25、Lys26、Lys27，所述氨基酸包括丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸，或缬氨酸。其它PTH类似物公布于以下的专利，通过引用并入本文中美国专利No.5,317,010;美国专利No.4，822，609;美国专利No.5,693.616;美国专利No.5,589,452;美国专利No.4,833,125;美国专利No.5，607,915;美国专利No.5,556,940;美国专利No.5，382，658;美国专利No.5,407,911;美国专利No.6,583,114;美国专利No.6,541,450;美国专利No.6,376,502;美国专利No.5,955,425;美国专利No.6,316,410;美国专利No.6,110,892;美国专利No.6,051,686;美国专利No.5,695,955;美国专利No.4，771，124;以及美国专利No.6,376,502。PTH通过活化2个第二信使系统起作用，其为Gs-蛋白质活化的腺苷酸环化酶(AC)以及Gq-蛋白质活化的磷脂酶Cp。后者引起膜结合的蛋白激酶Cs(PKC)活性的刺激。PKC的活性显示需要PTH残基29到32(Jouishomme等人(1994)J.BoneMineralRes.9,(1179-1189))。已经建立骨生长的增加，即在骨质疏松症治疗中的有用的作用与增加AC活性的肽序列的能力是相伴的。天然PTH序列已显示有所有这些活性。hPTH-(l-34)序列典型地显示如SerValSerGlulieGinLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTipLeuArgLysLysLeuGinAspValHisAsnPhe(序列IDNO:2)。下述的线性类似物hPTH^NH2只有AC刺激活性，并且显示在卵巢切除的大鼠模型的恢复骨丟失中是完全活性的[Rixon，R.H.等人，乂M/"w.9:1179-1189(1994);Whitfield等人，C"/ci/^/Hwwe5&81-87(1996);Willick等人的美国专利No.5,556,940,通过引用并入本文中]:SerValSerGlulieGinLeuMetHisAsnLeuGlyLysHisLeuAsnSerMetGluArgValGluTrpLeuArgLysLysLeuGinAspVal(序歹'JIDNO:3)。上述分子(序列IDN0:3)及其具有Leii27取代的类似物(序列IDNO:2),可有一代替氨基末端的自由羧基末端。另一个PTH类似物是[Leu"]环(Ghi22-Lys26)PTH^。在本发明的其它实施方案中，PTH组合物是以小滴的形式给药的，离开传动器的小滴形成具有1-2测量的椭圆体(最长轴与最短轴的比例)的喷雾烟缕，离开传动器的小滴形成具有1-1.3测量的椭圓体(最长对最短轴的比例)的喷雾烟缕，小滴大小的中间体积在10和1000微米之间(10<Dv，50<1000),其中Dv，50在30和300微米之间，具有10微米或更小直径的小滴的百分率是10%或更小，并且具有IO微米或更小直径的小滴的百分率是1%或更小。本发明也涉及PTH-促效剂的鼻内制剂，其基本不含稳定制剂的蛋白质或多肽。具体地，优选的制剂不含例如白蛋白和胶原衍生蛋白质例如明胶的蛋白质。在本发明的其它方面，跨粘膜的PTH肽制剂包括PTH肽、水以及pH3-6.5的增溶剂。在优选的实施方案中，增溶剂是环糊精。在本发明的另一个实施方案中，跨粘膜的PTH肽制剂包括PTH肽、水、增溶剂，增溶剂优选环糊精，并且至少一种多元醇，优选地2种多元醇。在替代的实施方案中，所述制剂可包括一种或所有以下物质螯合剂、表面活性剂以及緩沖剂。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包括PTH肽、水、螯合剂以及增溶剂。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包括PTH肽、水以及pH3-6.5的螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包括PTH肽、水、螯合剂以及至少一种多元醇，优选地两种多元醇。另外的实施方案可包括一种或多种以下物质表面活性剂、增溶剂以及緩冲剂。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包括PTH肽、水，以及至少两种多元醇，例如乳糖和山梨醇。能被加入制剂的另外的试剂包括但不限于增溶剂、螯合剂、一种或多种緩冲剂以及表面活性剂。根据本发明的方法和组合物的PTH肽促效剂的鼻内递送的增强允许这些试剂对治疗哺乳动物主体中不同疾病和疾患的有效药学上的用途。本发明通过提供液体或脱水的PTH肽制剂实现这种需求，其中所述制剂基本不含为多肽或蛋白质的稳定剂。液体曱状旁腺激素制剂包括水、曱状旁腺激素和至少一种以下添加剂，其选自多元醇、表面活性剂、增溶剂和螯合剂。制剂的pH优选地是3到大约7.0,优选地是4.5到大约6.0,最优选地大约5.0±0.3。本发明的另一个实施方案是本发明的水性PTH制剂，其包括水、PTH肽、多元醇和表面活性剂，其中所述制剂有大约3到大约6.5的pH,并且所述制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。本发明的另一个实施方案是水性PTH肽制剂，其包括水、PTH肽、多元醇和增溶剂，其中所述制剂有大约3.0到大约6.5的pH,并且所述制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。本发明的另一个实施方案是水性PTH肽制剂，其包括水、PTH肽、增溶剂和表面活性剂，其中所述制剂有大约3.0到大约6.5的pH,并且所述制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。本发明的另一个实施方案是本发明的水性PTH肽制剂，其包括水、PTH肽、增溶剂、多元醇和表面活性剂，其中所述制剂有大约3.0到大约6.5的pH,并且所述制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。在本发明的另一个方面，稳定的水性制剂是脱水的以产生脱水的PTH肽制剂，其包括PTH肽和至少一种以下添加剂，其选自多元醇、表面活性剂、增溶剂和螯合剂，其中所述脱水的PTH肽制剂基本不含为蛋白质或多肽例如白蛋白、胶原或例如明胶的胶原衍生蛋白质的稳定剂。脱水能通过不同的方法获得例如冻干法、喷雾干燥、盐诱导的沉淀和干燥、真空干燥、旋转蒸发或超临界的C02沉淀。在一个实施方案中，脱水的PTH肽包括PTH肽、多元醇和增溶剂，其中制剂基本不含为蛋白质的稳定剂。在另一个实施方案中，脱水的PTH肽制剂包括PTH肽、多元醇和表面活性剂，其中所述PTH肽制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。在另一个实施方案中，脱水的PTH肽制剂包括PTH肽、表面活性剂和增溶剂，其中所述PTH肽制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。在本发明的另一个实施方案中，脱水的PTH肽制剂包括PTH肽、多元醇、表面活性剂和增溶剂，其中所述PTH肽制剂基本不含为蛋白质或多肽的稳定剂。在本发明的另一个方面，鼻内的PTH肽制剂包括在能够产生所述溶液的气溶胶的传动器之内，其中所述气溶胶的喷路椭圓率当在距离传动器顶端0.5cm和10cm之间的高度测量时在1.00和1.40之间，其优选地具有在l.OO和1.30之间的椭圆率并且每次传动产生在20和200微升之间的气溶胶。在另一个实施方案中，鼻内的PTH肽溶液在传动器中，所述传动器产生所述溶液的气溶胶，其中所述气溶胶的喷路主轴和短轴当在距离传动器顶端0.5cm和10cm之间的高度测量时在10和50mm之间。在另一个实施方案中，PTH肽的水溶液在连接于传动器的容器中以产生所述溶液的气溶胶，其中少于10%所产生的小滴大小小于IO微米并且包含PTH肽的气溶胶每次传动包含20和200微升溶液。在另一个实施方案中，PTH肽的水溶液在附着于传动器的容器中，使得当传动时产生溶液的气溶胶具有在25和700微米之间的小滴。任何增溶剂能被使用但优选的一种选自羟丙基-P-环葡聚糖、磺基丁基醚-(3-环葡聚糖、曱基-p-环糊精和壳聚糖。通常多元醇选自乳糖、山梨醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和麦芽糖及其书f生物和同系物。令人满意的表面活性剂选自L-a-二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨酯20(Tween20)、聚山梨酯80(Tween80)、聚乙二醇(PEG)、十六烷醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、羊毛脂醇和失水山梨醇单油酸酉旨。在优选的制剂中，PTH肽制剂也包括螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。也有防腐剂，例如三氯叔丁醇、对羟基苯曱酸曱酯、对羟基苯曱酸丙酯、对羟基苯曱酸丁酯、氯化苯曱烃铵、氯化卡乙氧铵、苯曱酸钠、山梨酸、苯酚，或邻-、间-或对曱酚。pH—般用緩冲液调节，所述緩冲液例如柠檬酸钠和柠檬酸，以及醋酸钠和醋酸。可选的緩沖液为醋酸及醋酸钠或琥珀酸和氢氧化钠。本发明也包括一种制剂，其中PTH肽的浓度是0.1-15.0mg/mL,优选地1.0-2mg/mL，并且水溶液的pH是3.0-6.5,优选地大约5.0±0.3。本发明进一步包括PTH肽制剂，其中多元醇的浓度在大约0.1%和10%(w/v)之间，并且另外地其中多元醇的浓度在从大约0.1%到大约3%(w/v)的范围中。本发明也包括一种制剂，其中表面活性剂的浓度在大约0.00001%和大约5%(w/v)之间，并且其中表面活性剂的浓度在大约0.0002%和大约0.ly。(w/v)之间。本发明也包括一种制剂，其中增溶剂的浓度是l。/。-10。/。(w/v),并且其中增溶剂的浓度是2%-5%(w/v)。使用本领域普通技术人员已熟知的方法，或遵循低压冻千设备的生产商的说明书，终溶液能被过滤和冷冻干燥、低压冻干。这样生产基本不含为蛋白质的稳定剂的脱水的PTH肽制剂。在本发明的另一个实施方案中，PTH肽制剂包括PTH肽和药学上可接受的载体，其中PTH结合肽制剂在体外组织渗透实验中比由水、氯化钠、緩冲液和PTH肽组成的对照制剂的渗透性高至少1%，优选地3%，并且最优选地至少6%,如通过实施例2和7显示的经上皮的电阻分析(transepithelialelectricalresistanceassay)确定的。在一优选的实施方案中，PTH制剂进一步包括至少一种赋形剂，其选自表面活性剂、增溶剂、多元醇，以及螯合剂。在范例的实施方案中，本发明增强的递送方法和组合物提供在哺乳动物主体中预防或治疗骨质疏松症或骨量减少的PTH肽促效剂的治疗有效的粘膜递送。在本发明的一个方面，提供了适合鼻内给药的药学制剂，如在此所述的其包括治疗有效量的PTH肽以及一种或多种鼻内递送增强剂，所述制剂在本发明的鼻粘膜递送方法中是有效的，以预防哺乳动物主体中骨质疏松症或骨量减少的发生或进行。治疗有效量的PTH肽促效剂以及一种或多种鼻内递送增强剂的鼻粘膜递送在主体中产生提高的PTH肽促效剂的治疗水平并且在个体中促进骨量的增加。本发明增强的递送方法和组合物提供了PTH肽的治疗有效粘膜递送，以在哺乳动物主体中预防或治疗骨质疏松症或骨量减少。PTH肽能被通过不同的粘膜^各径给药，例如通过PTH肽与鼻粘膜上皮细胞、支气管或肺粘膜上皮细胞、口腔颊面或口腔和小肠粘膜表面的接触。在范例实施方案中，方法和组合物是直接针对或配制成用于鼻内递送的(例如鼻的粘膜递送或鼻内的粘膜递送)。在本发明的一个方面，适合鼻内给药的药学制剂被提供，其包括如在此所述的治疗有效量的PTH肽促效剂以及一种或多种鼻内递送增强剂，其中制剂在本发明的鼻粘膜递送方法中是有效的，以预防或治疗骨质疏松症。在本发明的另一个方面，药学的制剂和方法是直接针对PTH肽促效剂与钙、维生素D、二膦酸盐、降钓素或成骨蛋白(bonemorphogenicprotein)联合给药的。参见美国专利No.5,616,560和美国专利No.5,700,774，通过引用并入本文中。本发明上述的粘膜PTH肽制剂和制备及和递送方法提供对哺乳动物主体改进的PTH肽的粘膜递送。这些组合物和方法能包括一种或多种PTH肽与一种或多种粘膜递送增强剂的联合的制剂或协同给药。为获得这些制剂和方法，粘膜递送增强剂选自下列之中(A)增溶剂；(B)电荷调节剂；(C)pH控制剂；(D)降解酶抑制剂；(E)粘液溶解或剂粘液清除剂；(F)纤毛稳定剂；(G)膜穿透增强剂(例如(i)表面活性剂，(ii)胆盐，(iii)磷脂或脂肪酸添加剂、混合的胶束、脂质体，或载体，(iv)醇，(v)烯胺，(iv)NO供体化合物，(vii)长链两性分子，(viii)小的疏水渗透增强剂，(ix)水杨酸钠或水杨酸的衍生物，(x)乙酰乙酸的甘油酯，(xi)环糊精或卩-环糊精的衍生物，(xii)中链脂肪酸，(xiii)螯合剂，(xiv)氨基酸或其盐，(xv)N-乙酰氨基酸或其盐，(xvi)降解为选择的膜组分的酶，(xvii)脂肪酸合成的抑制剂，(xviii)胆固醇合成的抑制剂，或(xiv)任何(i)-(xviii)的膜穿透增强剂的组合；(H)上皮连接生理调节剂，例如一氧化氮(NO)刺激因子、壳聚糖及壳聚糖的衍生物；(I)血管扩张剂；(J)选择性的运输增强剂；(K)稳定递送运输体、载体、支持或形成复合体的物质，其能有效地组合、联合、包含、嚢化或结合PTH肽以稳定增强粘膜递送的活性剂；以及(L)醇例如乙醇。在本发明的各种实施方案，PTH肽与一种、两种、三种、四种或更多种的以上在(A)-(K)叙述的粘膜递送增强剂组合。这些粘膜递送增强剂可单独或一起和PTH肽混合，或与药学上可接受的制剂或递送运输体结合。PTH肽与一种或多种依据此处的教导的粘膜递送增强剂(可选择地包括两种或多种选自上述(A)-(K)的粘膜递送增强剂的任何组合)的制剂提供了PTH肽在哺乳动物主体的粘膜表面递送后的增加的生物利用度。因此，本发明是治疗哺乳动物中骨质疏松症或骨量减少的方法，其包括跨粘膜运输地给予包括PTH肽的制剂，使得当50吗PTH被跨粘膜运输地给予哺乳动物，哺乳动物血浆中的PTH肽的浓度增加至少5pmol，优选地每升血浆增加至少lOpmol。使用鼻内递送增强剂，其增强PTH进入或穿过鼻粘膜的表面的递送。对于被动吸收药物，细胞旁和跨细胞通道至药物运输的相对影响依赖于pKa、分配系数、分子半径和药物的电荷、药物递送的腔环境的pH以及吸收表面面积。本发明的鼻内递送增强剂可以是pH控制剂。本发明的药物制剂pH是影响PTH通过细胞旁和跨细胞通道到药物运输的吸收的因素。在一个实施方案中，本发明的药物制剂的pH被调至大约pH3.0到6.5之间。在另一实施方案中，本发明的药物制剂的pH被调至大约pH3.0到5.0之间。在另一实施方案中，本发明的药物制剂的pH被调至大约pH4.0到5.0之间。一般地，pH是5.0士0.3。如上所述，本发明提供了对哺乳动物主体PTH肽粘膜递送改进的方法和组合物，以治疗或预防骨质疏松症或骨量减少。依据本发明的方法，用于治疗和预防的合适的哺乳动物主体例子包括，但不限于，人类和非人类灵长类的动物，家禽类，例如马、牛、绵羊以及山羊，以及研究与驯养的物种，包括狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠和家兔。为了提供对本发明的更好的理解，提供以下定义根据本发明，曱状旁腺激素肽还包括自由基、酸加成盐或金属盐，例如肽的钾盐或钠盐，并且曱状旁腺激素肽通过例如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化、环化以及其它很已知的共价修饰方法的过程修饰。骨量减少是减少的骨的钙化或密度，是对所有疾患被注意的骨骼系统适用的描述性术语。"粘膜递送增强剂"是指化学品及其它赋形剂，当加入包括水、盐和/或通用緩沖液和PTH肽(对照制剂)产生一种制剂，其产生PTH肽跨粘膜运输的显著增长，如通过最大血浓度、最大血清浓度，或最大脑脊髓液浓度(C目x)或在一个浓度对时间的图中曲线下的面积(AUC)而测量。粘膜包括鼻的、口腔的、肠的、颊的、支气管肺的、阴道的及直肠的粘膜表面，而且实际包括衬于所有体腔和连接外部的通道的所有粘液分泌膜。粘膜递送增强剂有时称作载体。"非输入给药"指不包括直接进入动脉或静脉的注射的任何递送方法，其是通过针头、注射器或其它侵入方法用力或驱使(典型地为一种液体)进入某物，并且特别指引入一个肢体部位的方法。非输入给药包括皮下注射、肌肉注射、腔内注射(intraparitonealinjection)和非注射方法的粘膜递送。如以上提及的，本发明为PTH肽的鼻粘膜递送提供了改进的和有用如在此使用的，预防和治疗骨质疏松症或骨量减少意思是通过在患者中增加骨量、减少骨吸收，或降低骨折的发病率预防骨质疏松症的发病或降低临床骨质疏松症的发病率或严重度。PTH肽也能与其它治疗剂联合给药，例如二磷酸酐类药物、4丐、维生素D、雌激素或雌激素受体结合的化合物、选择性雌激素受体调节因子(SERMs),成骨蛋白或降4丐素。PTH肽对哺乳动物主体粘膜给药的改进的方法和组合物优化了PTH肽给药方案。本发明提供配制有一种或多种粘膜递送增强剂的PTH肽的粘膜递送，其中PTH肽的剂量释放基本标准化和/或持续在PTH肽有效递送阶段释放，在粘膜给药后其范围为大约0.1到2.0小时；0.4到1.5小时；0.7到1.5小时；或0.8到1.0小时。重复运用本发明的方法和组合物^^予外源PTH肽可有利于所取得的PTH肽的持续释放。PTH肽对哺乳动物主体粘膜给药的改进的组合物和方法优化了PTH肽给药方案。本发明提供一种制剂的改进的粘膜(例如，鼻粘膜)递送，此制剂包括PTH肽，结合一种或多种粘膜递送增强剂以及一种或多种可选择的持续释放增强剂。本发明的粘膜递送增强剂产生递送中的有效增加，例如，最大血浆浓度(Q^)的增加以增加粘膜给药的PTH肽的治疗活性。影响血浆和CNS中PTH肽的治疗活性的第二个因素为滞留时间(RT)。与鼻内递送增强剂联合，持续释放增强剂增加PTH肽的Q^以及增加滞留时间(RT)。本发明例如聚乙二醇(PEG)的产生持续释放增强制剂的聚合物递送运输体及其它试剂和方法公布于此。本发明为在哺乳动物主体中治疗骨质疏松症或骨量减少提供改进的PTH肽的递送方法和剂型。在本发明的粘膜递送制剂和方法中，PTH肽经常与用于粘膜递送的合适的载体或运输体结合或协同给药。如在此所用，术语"载体"指药学上可接受的固体或液体填充剂、稀释剂或胶嚢物质。一种含水液体载体可以包括药学上可接受的添加剂，例如酸化剂、碱化剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、緩冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、保湿剂、溶剂、悬浮和/或粘度增加剂、张度剂、湿润剂，或其它生物相容物质。以上种类成分的列表见于t/.51.尸/"mmcope/a7Va"o加/FwTm//"^,1857-1859,(1990)。一些能作为药物上可接受载体材料的例子为糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧曱基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂如可可脂和栓剂蜡；油如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄揽油、玉米油和大豆油；二醇类如丙二醇；多元醇如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；緩沖剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐；Ringer's溶液、乙醇和磷酸盐緩沖液，以及其它用于药物制剂的无毒可相容的物质。湿润剂、乳化剂和润滑剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁以及染料、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也能依据制剂者所需加入所述组合物。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括水溶性抗氧化剂例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；脂溶性抗氧化剂例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟基茴香醚(BHA)、二叔丁基对曱酚(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；及金属螯合剂例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。能结合载体物质产生单个剂型的活性组分的量将依据特定给药模式变化。本发明粘膜递送组合物和方法中，多种递送增强剂一皮运用，所述递送增强剂促进PTH肽递送进入或穿过粘膜表面。在这点上，PTH肽递送穿过粘膜上皮可"跨细胞地"或"细胞旁地"发生。这些路径对PTH肽的整个流量和生物利用度的贡献程度依赖于粘膜的环境、活性剂的物理化学性能，以及粘膜上皮的性质。细胞旁的运输只包括被动扩散，然而跨细胞运输可通过被动、被协助或主动的过程发生。一般地，亲水的、被动运输的极性溶质通过细胞旁路径扩散，而较为亲脂的溶质利用跨细胞的路径。不同的、被动地和主动地吸收的溶质的吸收和生物利用度(例如，渗透系数或生理学分析所反映)，可容易地用细胞旁的和跨细胞递送组分的方式对本发明中选择的任何PTH肽进行评估。对,皮动吸收的药物，细胞旁的和3争细胞的路径对药物运输的相对贡献依赖于pKa、分配系数、分子半径和药物的电荷、药物所递送的腔环境的pH,及吸收表面的面积。细胞旁的路径代表鼻粘膜上皮可及表面积相对小的部分。一般而言，有报道细胞膜占据的粘膜表面面积几千倍于细胞旁的空间所占据的面积。因此较小的可及表面积、基于尺寸和电荷上不利于大分子渗透提示与药物运输的跨细胞递送相比，细胞旁路径会是一般不利的路径。令人惊讶地，本发明的方法和组合物提供了通过细胞旁路径进入和跨粘膜上皮的生物治疗物显著增加的运输。因此，本发明的方法和组合物可选地或在单一方法或组合物中成功耙向细胞旁的和if夸细胞的^各径。如在此所用，"粘膜递送增强剂"包括下述试剂，其提高PTH肽或其它生物活性化合物的释》文性或可溶性(例如，从一种制剂递送运输体)、扩散速率、渗透能力和时间、摄取、滞留时间、稳定性、有效半衰期、峰值或持续的浓度水平、清除率及其它期望的粘膜递送特征(例如，在递送点或在活性的选择靶向点如血流或中枢神经系统测量的)。粘膜递送的增强可因此通过多种机制发生，例如通过增加PTH肽的扩散、运输、持续性或稳定性，增加膜流动性，调整那些调节细胞内或细胞旁的渗透的钙和其它离子的利用度或活动，增溶粘膜组分(例如，脂质)，改变粘膜组织中非蛋白和蛋白巯基水平，增加跨粘膜表面的水流量，调整上皮的连接生理，降低覆盖粘膜上皮的粘液的粘度，降低粘膜纤毛清除率，及其它机制。如在此所用，"PTH肽的粘膜有效量"预期是在主体中PTH肽到药物活性靶向点的有效粘膜递送，可能包括多种递送或运输路径。例如，给定的活性剂可能通过粘膜细胞间的清除而到达临近的血管壁，而通过其它路径所述试剂可能或者被动地或主动地吸收进粘膜细胞以在细胞内起作用，或被释放出或运输出细胞而到达二级耙点，例如全身循环。本发明的方法和组合物可能促进活性剂沿一个或多个所述选择性的路径的易位，或直接作用于粘膜组织或临近的血管组织以促进活性剂的吸收或渗透。上下文中所述促进吸收或渗透不限于这些机制。如在此所用，"血浆中PTH肽的峰浓度(C^x)"、"血浆中PTH肽的浓度对时间曲线下的面积(AUC)"、"血浆中PTH肽的最大血浆浓度对应的时间(t丽)"是本领域技术人员已知的药物动力学参数。Laursen等人，乂￡m/ocn'"o/ogy，"5:309-315(1996)。"浓度对时间曲线"测量在通过鼻内、肌肉内、皮下或其它肠胃外给药路径给予主体一个剂量的PTH肽之后，主体血清中PTH肽对时间的浓度。"Cmax，，是在给予主体单个剂量的PTH肽后，主体血清中PTH肽的最大浓度。"t皿，，是在给予主体单个剂量的PTH肽后，主体血清中PTH肽到达最大浓度的时间。尽管吸收促进机制可能随本发明不同的粘膜递送增强剂而不同，在本文中有用的试剂基本不会不利于粘膜组织，而且根据特定的PTH肽或其它活性或递送增强剂生物化学特征而被选择。在本文，增加粘膜组织的渗透或通透性的递送增强剂会经常引起粘膜保护通透性屏障的一些改变。对于这样的在本发明中有价值的递送增强剂，一般期望那些任何显著的粘膜通透性的变化，在适于药物递送的理想持续过程的一个时间^:中是可逆的。而且，在长期使用中，应该对粘膜屏障性能引起的变化是无实质的、蓄积的毒性，并且无任何永久的有害变化。在本发明的某些方面，与本发明的PTH肽协同给药或组合制剂的吸收促进剂选自小的亲水分子，其包括但不限于二曱基亚砜(DMSO)、二曱基酰胺、乙醇、丙二醇和2-吡咯烷酮。可选地，长链两性分子可用于增加PTH肽的粘膜渗透，例如去曱酰基亚砜、月桂氮卓酮、月桂硫酸钠、油酸和胆盐。在另外的方面，表面活性剂(例如，聚山梨酯)被用作增加PTH肽鼻内递送的辅助化合物、加工剂，或制剂添加剂。例如DMSO、聚乙二醇和乙醇的试剂，如果以足够高浓度存在于递送环境(例如，通过预给药或合并到治疗制剂中)，能进入粘膜的水相并改变其增溶性能，从而增加PTH肽从运输体进入粘膜的分配。另外的在本发明协同给药和加工处理方法及组合制剂中有用的粘膜递送增强剂包括但不限于，混合胶束；烯胺；氧化亚氮的供体(例如，S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺、N0R1、NOR4-最好与NO清除剂例如羧基-PITO或双氯芬钠(doclofenacsodium)共同给药)；水杨酸钠；乙酰乙酸的甘油酯(例如，甘油-l,3-二乙酰乙酸酯或1，2-异亚丙基甘油-3-乙酰乙酸酯)；及其它释放扩散或上皮内或穿过上皮的渗透促进剂，其与粘膜递送生理相容。其它吸收促进剂选自多种增强PTH肽粘膜递送、稳定性、活性或穿过上皮渗透的载体、基质和赋形剂。这些包括，尤其是，环糊精和|3-环糊精衍生物(例如，2-羟丙基-(3-环糊精)和七(2,6-二-0-曱基-(3-环糊精)。这些化合物，可选择地连接于一种或多种活性成份和进一步可选择地制备于油性基质之中，在本发明的粘膜制剂中增加生物利用度。另外适合粘膜递送的吸收增强剂包括中链脂肪酸，其包括单-和双甘油酯(例如椰子油提取物癸酸钠、Capmul)和甘油三酯(例如淀粉糊精、Estaram299、Miglyo1810)。本发明粘膜治疗和预防组合物可以添加任何合适的渗透促进剂以促进PTH肽跨粘膜屏障的吸收、扩散或渗透。渗透促进剂可以是任何药学上可接受的促进剂。因此，在本发明更详细的方面，提供了掺入一种或多种渗透促进剂的组合物，所述渗透促进剂选自水杨酸钠和水杨酸衍生物(乙酰水杨酸、胆碱水杨酸、水杨酰胺等)；氨基酸及其盐(例如单胺羧酸如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等；羟基氨基酸如丝氨酸；酸性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸等；和碱性氨基酸如赖氨酸等-包括它们的碱金属盐或碱土金属盐)；和N-乙酰氨基酸(N-乙酰丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甘氨酸、N-乙酰赖氨酸、N-乙酰谷氨酸、N-乙酰脯氨酸、N-乙酰羟脯氨酸等)及它们的盐(碱金属盐和碱土金属盐)。还提供作为本发明的方法和组合物中渗透促进剂的是通常用作乳化剂的物质(如油基磷酸钠、月桂磷酸钠、月桂硫酸钠、肉豆蔻硫酸钠、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯等)、己酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸和它们的碱金属盐、吡咯烷酮羧酸、烷基吡咯烷酮羧酸酯、N-烷基吡咯烷酮、脯氨酸酰基酯，等等。本发明的多方面中，提供了改进的鼻粘膜递送的制剂和方法，其允许本发明中PTH肽和其它治疗剂穿越给药位点和选定的靶向点之间的粘膜屏障而递送。某些制剂特别适合选定的靶向细胞、组织，或器官，或甚至特定的疾病状态。在其它方面，制剂和方法提供PTH肽有效、选择性的细胞内摄或跨细胞作用，其特别是沿指定的细胞间或细胞内路径。典型地，PTH肽被有效地在载体或其它递送运输体中以有效浓度水平装载，并且被以一种稳定的形式递送和维持，例如，在鼻粘膜和/或在穿越细胞内间隔和膜到达远距离的药物活性的耙向点的过程中(例如，血流或指定的组织、器官，或细胞外间隔)。PTH肽可以在递送运输体中或另外被^修饰的形式(例如，以药物前体的形式)被提供，其中PTH肽的释放或活化由生理上的刺激启动(例如，pH的改变、溶酶体的酶等)。经常，PTH肽在到达其活性靶向点之前是药理学无活性的。多数情况，PTH肽和其它制剂成分是无毒的和无免疫原性的。在本文，载体和其它制剂成分是一般依据它们在生理条件下能被快速降解和分泌的能力而选择的。同时，制剂在用于有效储存的剂型下是化学和物理稳定的。在用于本发明的生物活性肽和蛋白质的定义中包括天然的或合成的、治疗或预防活性的肽(包括两个或更多共价连接的氨基酸)、蛋白质、肽或蛋白质片段、肽或蛋白质的类似物，及活性肽或蛋白质的化学修饰的衍生物或盐。许多种有用的PTH肽的类似物和模仿物被预期用于本发明并且依据已知方法能^L生产和测试生物活性。经常地，本发明所用PTH肽的肽或蛋白质或其它生物活性肽或蛋白质是突变蛋白质，其通过部分取代、添加或删除天然发生的或天然的(例如，野生型、天然发生的突变，或等位变异)肽或蛋白质序列中的氨基酸而易于获得。另外，包括天然肽或蛋白质的生物活性片段。所述突变衍生物和片段基本保持天然肽或蛋白质的期望的生物活性。在肽或蛋白质有碳水化合物链的情况，标记在这些如在此所用，术语"保守氨基酸取代"指有相似支链的的氨基酸残基一般可互换性。例如，通常可互换的有脂肪支链的氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；有脂肪羟基支链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；有包含酰胺基支链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；有芳香支链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；有碱性支链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；有含硫支链的氨基酸基团是半胱氨酸和曱硫氨酸。保守取代的例子包括非极性(疏水的)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或曱疏氨酸等取代其他氨基酸。同样，本发明预期极性(亲水的)残基，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间及苏氨酸和丝氨酸之间的取代。另外，也预期碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸等的取代，或酸性残基如天门冬氨酸或谷氨酸等的取代。典型的保守氨基酸取代基团是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。通过最佳地对比肽或蛋白质类似物和相应的天然肽或蛋白质，和通过用适当分析，例如粘附蛋白或受体结合分析，以确定选择的生物活性，我们可以容易地鉴定可操作的肽和蛋白质类似物，以用于本发明的方法和组合物。可操作的肽和蛋白质类似物和针对相应天然肽或蛋白质的抗体是典型地特异性免疫反应性的。本发明稳定固体蛋白制剂的方法是增加纯化的蛋白质如低压冻干的蛋白质的物理稳定性。这会抑制通过疏水相互作用及共价路径的聚集，其在蛋白质展开时会增加。在本文，稳定制剂经常包括基于聚合物的制剂，例如一种生物可降解水凝胶制剂/递送系统。如上所述，水对蛋白质结构、功能和稳定性的关4定作用是已熟知的。典型地，蛋白质在大量去水的固体状态是相对稳定的。但是，固态治疗性蛋白质制剂可能在高湿度的储存中或在从持续释放组合物或装置的递送过程中变得含水。蛋白质的稳定性一般随水合作用的增加而降低。在固体蛋白质聚集中，水也起显著的作用，例如，通过增加蛋白质的柔性以提高反应基团的可及性，通过提供反应物移动相，和通过在例如(3-清除和水解的几个有害的过程中作为反应物。含大约6%-28%水的蛋白质制剂是最不稳定的。低于此水平，结合水的移动性和蛋白质内部运动是低的。高于此水平，水的移动性和蛋白质运动接近全部水合。高到一定水平，在几个系统中观察到，随水合作用的增加对固相聚集敏感性增加。但是，在更高的含水量，观察到较少的聚集，这是因为稀释的作用。依据这些原理，稳定肽和蛋白质防止粘膜递送的固态聚集的有效方法是控制固体制剂的含水量和维持制剂中的水活性于最优水平。这个水平依赖于蛋白质的自然属性，但一般维持在低于其"单层"水覆盖的蛋白质会表现超固态稳定性。多种添加剂、稀释剂、基质和递送运输体提供于本发明内，其可有效控制含水量来增加蛋白质稳定性。这些有效作为抗聚集剂的试剂和载体物质从这个意思上包括，例如，各种官能性的聚合物如聚乙二醇、葡聚糖、二乙基氨乙基葡聚糖和羧曱基纤维素，它们显著提高与它们混合或与它们连接的肽和蛋白质的稳定性和降低与它们混合或与它们连接的肽和蛋白质的固相聚集性。在一些情况，蛋白质的活性或物理稳定性也可以通过在肽或蛋白质药物的水溶液中加入多种添加剂提高。例如可以使用，添加剂如多元醇(包括糖)、氨基酸、蛋白质如胶原和明胶，及多种盐。某些添加剂，特别是糖和其它多元醇，也赋予给干燥蛋白质如低压冻干蛋白质显著的物理稳定性。这些添加剂也能用于本发明以保护蛋白质防止在冻干且干态储存中的聚集。例如蔗糖和聚蔗糖70(—种以蔗糖为单元的聚合体)显示显著的保护作用防止肽或蛋白质在多种条件的固相孵育过程中的聚集。这些添加剂也可以提高包埋于聚合物基质的固体蛋白质的稳定性。其它的添加剂，例如蔗糖，稳定蛋白质防止在高温的潮湿的环境中固态聚集，其可发生在本发明的某些持续释放制剂中。例如明胶和胶原的蛋白质也作为稳定剂和填充剂以减少本文不稳定蛋白质的变性和聚集。这些添加剂可被掺入本发明中多聚融化过程和组合物。例如多肽微粒能通过简单低压冻干或喷雾干燥一种包含多种上述稳定添加剂的溶液而制备。非聚集肽和蛋白质的持续释放能因此在长期的时间获得。各种其他制备组分和方法及特定的制剂添加剂提供在此，其产生倾向聚集的肽和蛋白质的粘膜递送的制剂，其中肽或蛋白质用增溶剂稳定于基本纯的、非聚集的形式。一个范围的组分和添加剂预期用于这些方法和制剂。这些增溶剂的典范是环糊精(CD)，其选择性地结合多肽的疏水支链。这些CD已被发现以显著地抑制聚集的形式结合蛋白的疏水片段。这种抑制对CD和有关的蛋白质都是选择性的。此蛋白质聚集的选择性地抑制，提供本发明鼻内递送方法和组合物更多的优点。在本文所用添加剂包括有不同的几何形状的CD二聚体、三聚体和四聚体，其通过特异性阻断肽和蛋白质聚集的连接子控制。而并入本发明的增溶剂和方法包括肽和肽模仿物的使用以选择性地阻断蛋白质-蛋白质相互作用。在一个方面，通过使用类似地阻断蛋白质聚集的肽和肽模仿物，报道的CD多聚体对疏水支链的特异性结合被扩展到蛋白质。宽范围的合适方法和抗聚集剂可用于并入本发明的组合物和操作中。为改进生物活性剂(包括PTH肽、其它活性肽和蛋白质，及大分子和小分子药物)运输特征以增加跨疏水粘膜屏障的递送，本发明也提供在此所述的选择的生物活性剂或递送增强剂的电荷修饰的技术和试剂。由此考虑，大分子的相对渗透性一般和它们的分配系数有关。分子的电离度，其依赖于分子的pIQ和粘膜表面的pH，也影响分子的渗透性。用于粘膜递送的包括本发明的PTH肽和类似物的生物活性剂的渗透和分配，可由活性剂或渗透剂的电荷改变或电荷扩散而促进，此过程可以通过例如改变带电荷的官能团，或通过改变递送活性剂的递送运输体或溶液的pH,或通过与活性剂协同给予电荷改变的或pH改变的试剂而获得。与这些通用知识一致，带电大分子物质，包括本发明方法和组合物中的PTH肽和其它生物活性肽和蛋白质，当作为活性剂以基本非电离，或中性的电荷状态递送到粘膜表面时，其粘膜递送得到显著改进。本发明中所用粘膜制剂的某些PTH肽和其它生物活性肽和蛋白质成分会是电荷修饰的，以产生肽或蛋白质正电荷密度增加。这些修饰也扩展到肽和蛋白质共轭物、载体和其它公布于此的递送形式的阳离子化。阳离子化提供一种改变本发明中蛋白质和大分子的生物分配和运输性能的方便的方法。阳离子化执行方式基本保存活性剂的生物活性并且限制潜在的不利副作用，包括组织损伤和毒性。除了由于结合到粘液层糖蛋白的药物损失，生物治疗剂通过鼻内给药的有效递送必须考虑跨鼻粘膜保护性粘液层的药物运输速率减小。正常粘液是一种粘弹性的、类似凝胶的物质，由水、电解质、粘蛋白、大分子和脱落的上皮细胞所组成。它主要作为下层粘膜组织的细胞保护和润滑覆盖。粘液是由鼻上皮内和其它粘膜上皮中随机分布的分泌细胞分泌的。粘液的结构单位是粘蛋白。此糖蛋白主要负责粘液的粘弹性性质，但是其它大分子也可促成这个性能。在气道粘液，这些大分子包括局部产生的分泌型IgA、IgM、IgE、溶菌酶和支气管铁传递蛋白，其在宿主免疫机制中也有重要作用。本发明的协同给药方法可选择地掺入有效的粘液溶解剂或粘液清除剂，其用作降解、稀化或清除鼻内粘膜表面的粘液以有利鼻内给药生物治疗剂的吸收。这些方法中，粘液溶解剂或粘液清除剂是作为辅助化合物协同地给药的，以提高生物活性剂的鼻内递送。可选地，有效量的粘液溶解剂或粘液清除剂作为本发明的多加工方法的加工剂，或作为本发明的联合制剂的添加剂掺入，以提供改进的制剂，其通过降低鼻内粘液的障碍效应，增加生物治疗化合物的鼻内递送。多种粘液溶解剂或粘液清除剂可用于并入本发明的方法和组合物中。基于它们的作用机制，粘液溶解和粘液清除剂可以通常分为以下组裂解粘蛋白糖蛋白的蛋白核心的蛋白酶(例如，链霉蛋白酶、番木瓜蛋白酶)；分开粘蛋白二硫键的巯基化合物；和打破粘液中非共价键的去污剂(例如TritonX-IOO、吐温20)。在本文另外的化合物包括，但不限于，胆盐和表面活性剂如去氧胆酸钠、牛磺去氧胆酸钠、甘氨胆酸钠和溶血磷脂胆碱。胆盐在造成粘液的结构断裂中的有效性依次是脱氧胆酸盐>牛磺胆酸盐>甘氨胆酸盐。依据本发明的方法其它减少粘液粘度或粘附以提高鼻内递送的有效剂包括，例如，短链脂肪酸，和通过螯合作用起作用的粘液溶解剂如N-酰基胶原肽、胆汁酸和皂甙(后者的部分功能是螯合在维持粘液层结构中有重要作用的Ca"和/或Mg2+)。本发明方法和组合物中使用的另外的粘液溶解剂包括一种潜在的粘液溶解剂，N-乙酰-L-半胱氨酸(ACS),其减少支气管肺粘液的粘度和粘附，并报道在麻醉的大鼠中适当地增加人生长激素的鼻生物利用度(从7.5°/0到12.2%)。这些和其它粘液溶解剂或粘液清除剂是与鼻粘膜接触的，典型地在大约0.2到20mM的浓度范围，与生物活性剂协同给药，以减少鼻内粘液的极化粘性和/或弹性。其它粘液溶解剂或粘液清除剂可选自一个范围的糖苷酶，其能裂解粘液糖蛋白中的糖苷键。a-淀粉酶和fi-淀粉酶是这类酶的代表，但是它们的粘液溶解效应是有限的。相反，细菌糖香酶允许这些微生物穿过它们宿主的粘液层。为与本发明包括肽和蛋白质治疗物的多数生物活性剂联合运用，非电离的去污剂一般也有用地作为粘液溶解剂或粘液清除剂。这些试剂典型地不会修饰或基本不会破坏治疗多肽的活性。由于某些粘膜组织(例如，鼻粘膜组织)通过粘膜纤毛清除的自洁能力作为保护性功能(例如，去灰尘、变态反应原和细菌)是必需的，通常认为这种功能基本不应被粘膜药疗损害。呼吸通道的粘膜纤毛运输是一个特别重要的防卫感染的机制。为实现这项功能，鼻内和呼吸通3各的纤毛搏动沿粘膜移动一层粘液以清除吸入的颗粒和微生物。纤毛稳定剂可用于本发明的方法和组合物，以提高粘膜(如鼻内)给药的PTH肽、类似物和模仿物，和其它公布于此的生物活性剂的滞留时间。具体地，本发明方法和组合物中的这些试剂的递送通过一种或多种纤毛稳定剂的协同给药或联合制剂在某些方面显著地增加，所述纤毛稳定剂可逆地抑制粘膜细胞的纤毛活性，以提供暂时、可逆的粘膜给药活性剂的滞留时间增加。为应用本发明的这些方面，上述的纤毛稳定因子，它们的活性或特异性或间接的，都是在合适的量(依赖递送的浓度、持续时间和模式)成功用作纤毛稳定剂的候选物，如此它们产生临时的(即，可逆的)粘膜纤毛在粘膜给药位点清除作用的减少或停止，以增加PTH肽、类似物和模仿物，以及其它公布于此的生物活性剂的递送，而无不能接受的不良副作用。在更详细的方面，特异的纤毛稳定因子用于有一种或多种PTH肽蛋白、类似物和模仿物，和/或其它公布于此的生物活性剂的联合制剂或协同给药方案。文献中分离和鉴定的多种细菌纤毛稳定因子可用于本发明的这些实施方案中。来自细菌绿脓假单胞菌(尸化Mcfomow^aen^'woya)的纤毛稳定因子包括吩溱衍生物，绿脓杆菌素化合物(2-烷基-4-羟基喹啉)和鼠李糖脂(也称溶血素)。绿脓杆菌素化合物在浓度为50吗/ml产生纤毛稳定，并且无明显的超微结构的损伤。吩。秦衍生物在大得多的浓度400昭/ml也抑制纤毛运动，但是造成一些膜的破坏。有限暴露气管的移出物于鼠李糖脂导致纤毛稳定，这与变化的纤毛膜有关。更大暴露于鼠李糖与动力蛋白臂从轴丝去除有关。本发明更详细的方面，一种或多种膜渗透增强剂可用于本发明的粘膜递送方法或制剂中，以增加PTH肽蛋白、类似物和模仿物，和其它公布于此的生物活性剂的粘膜递送。在本文膜渗透增强剂能选自(i)表面活性剂，(ii)胆盐，(iii)磷脂添加剂、混合胶束、脂质体或载体，(iv)醇,(v)烯胺，(vi)NO供体化合物，(vii)长链两性分子，(viii)小的疏水渗透增强剂；(ix)水杨酸钠或水杨酸衍生物；(x)乙酰乙酸的甘油酯，(xi)环糊精或(3-环糊精衍生物，(xii)中链脂肪酸，(xiii)螯合剂，(xiv)氨基酸或其盐，(xv)N-乙酰氨基酸或其盐，(xvi)降解为所选膜组分的酶，(xvii)脂肪酸合成的抑制剂，或(xviii)胆固醇合成的抑制剂；或(xix)(i)-(xix)所述膜渗透增强剂的任何组合。某些表面活性剂易于掺入本发明的粘膜递送制剂和方法，作为粘膜吸收增强剂。这些试剂，它们可与PTH肽蛋白、类似物和模仿物，及其它公布于此的生物活性剂协同给药或联合制剂，可选自一大范围的已知表面活性剂。表面活性剂，其一般分为三类(l)非离子的聚氧乙烯醚；(2)胆盐例如甘氨胆酸钠(SGC)和脱氧胆酸盐(DOC);和(3)夫西地酸的衍生物例如牛磺二氢甾酸霉素钠(sodiumtaurodihydroflisidate)(STDHF)。这些各种类型表面活性剂的作用机制典型地包括生物活性剂的增溶作用。对经常聚集的蛋白质和肽，这些吸收促进剂的表面活性特征能允许与蛋白质的相互作用，这样较小的单位例如表面活性剂包被的单体可以更容易在溶液中维持。其它表面活性剂的例子是L-a-二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)、聚山梨酯80和聚山梨酯20。这些单体预计比聚集体更易运输。第二个有效机制是在粘膜环境中防止蛋白酶对肽或蛋白质的蛋白水解降解作用。胆盐和一些夫西地酸衍生物被报道以小于或等于增加蛋白吸收所需的浓度抑制蛋白质被鼻匀浆物的蛋白水解降解作用。这些蛋白酶抑制对生物半衰期短的肽尤为重要。本发明提供药学组合物，其包括配制在用于粘膜递送药物制剂中的一种或多种PTH肽蛋白、类似物或模仿物，和/或其它生物活性剂连同公布于此的粘膜递送增强剂。渗透渗透剂典型地通过在主体的粘膜上皮表面调整上皮连接的结构和/或生理学，可逆地增强粘膜上皮细胞旁的运输。这个效应典型地包括由渗透渗透剂抑制相邻上皮细胞的上皮膜粘附蛋白之间的同型或异型结合。用于所述同型或异型结合阻断的靶蛋白可选自多种相关的连接粘附分子(JAMs)、咬合蛋白(occludin)或闭合蛋白(claudin)。这样的例子是抗体、抗体片段或单链抗体，其结合这些蛋白质的胞外域。在另外的详细的实施方案中，本发明提供用于增强粘膜上皮细胞旁的运输的渗透肽和肽类似物和模仿物。受试肽和肽类似物和模仿物典型地通过调整哺乳动物主体上皮连接的结构和/或生理学，在本发明的组合物和方法中起作用。在特定的实施方案中，肽和肽类似物和模仿物有效地抑制上皮膜粘附蛋白的同型和/或异型结合，所述上皮膜粘附蛋白选自连接粘附分子(JAMs)、咬合蛋白或闭合蛋白。一种如此被广泛研究的试剂是细菌毒素，它是来自霍乱弧肠菌(F/ZwV)c/zo/erae)的细菌毒素，名为"紧密连接毒素(zonulaoccludenstoxin)，，(ZOT)。这种毒素介导增加的肠内的粘膜渗透性并造成被感染体包括腹泻的疾病症状。Fasano爭乂，iVa/.爿c"d，"S.A，&5242-5246(1991)。当在家兔回肠的粘膜试验时，ZOT通过调整细胞间的紧密连接结构而增强肠内渗透性。最近，发现ZOT能可逆地打开肠内粘膜的紧密连接。也有报道ZOT能可逆地打开鼻粘膜的紧密连接。美国专利No.5,908,825。在本发明中的方法和组合物中，ZOT以及多种作为ZOT活性的激动剂或拮抗剂的ZOT的类似物和模仿物，用于增加生物活性剂的鼻内递送-通过增加细胞旁吸收进入和穿越鼻粘膜。在本文，ZOT典型地通过引起以连接蛋白ZOl的位置变化为标记的紧密连接的结构重组而起作用。在本发明这些方面中，ZOT以有效量与生物活性剂协同给药或联合制剂，通过可逆地增加鼻粘膜通透性，产生显著增强的活性剂的吸收，并基本无不良副反应。本发明的组合物和递送方法可选地掺入选择性的运输增强剂，其促进一种或多种生物活性剂的运输。这些运输增强剂可用于与一种或多种公布于此的PTH肽蛋白、类似物和模仿物的联合制剂或协同给药方案，以协同地增强一种或多种另外的生物活性剂跨粘膜运输屏障的递送，增强所述活性剂的粘膜递送以到达主体的靶向组织或间隔(例如，粘膜上皮、肝脏、中枢神经系统组织或流体，或血浆)。可选地，运输增强剂可用于联合制剂或协同给药方案以直接增强一种或多种PTH肽蛋白、类似物和模仿物的粘膜递送，伴有或不伴有另外的生物活性剂的增强递送。用于本发明这个方面的选择性的运输增强剂的范例包括，但不限于，糖苷、含糖分子和结合剂如凝集素结合剂，已知其与上皮运输屏障组分特异性反应。例如，特异的"生物粘附"配体，包括多种植物和细菌的凝集素，它们通过受体介导的相互作用结合细胞表面糖部分，能用作载体或共轭的运输介导因子以增强本发明中生物活性剂的粘膜递送，例如，鼻递送。某些用于本发明的生物粘附配体能介导生物信号向上皮靶细胞的传递，其触地摄取。这些运输介导因子因此能用作"载体系统"以刺激或指导选择性摄取一种或多种PTH肽蛋白、类似物和模仿物和其它生物活性剂进入和/或跨粘膜上皮。这些和其它选择性的运输增强剂显著地增强本发明中大分子生物药物(特别是肽、蛋白质、寡核苦酸和多核苷酸载体)的粘膜递送。凝集素是植物蛋白，其结合可见于真核细胞糖蛋白和糖脂表面的特定的糖。凝集素的浓缩溶液有"粘液牵引(mucotractive)"作用，多种研究已显示凝集素和凝集素共轭物(例如，辄合胶体金的颗粒的刀豆球蛋白A)跨粘膜表面的快速的受体介导的内吞作用(RME)。更多的研究报道凝集素的摄取机制能用于体内肠内药物靶向。在某些这些研究中，聚苯乙烯纳米微粒(500nm)共价配对到番茄凝集素，并被报道给大鼠口服给药后，产生改进的全身摄取。除了植物凝集素，微生物的粘附和侵入因子提供丰富的候选资源以用作本发明中粘膜递送方法和组合物的粘附/选择性的运输载体。两种组分，细菌'粘附素，(粘附或定居因子)和宿主细胞表面上的受体，对于细菌粘附过程是必需的。引起粘膜感染的细菌需要在粘附它们自己于上皮表面之前穿透粘液层。这种粘附通常由细菌的菌毛或纤毛结构介导，但是其它细胞表面组分也可参与此过程。通过繁殖和起始一系列通过信号转导机制(有或无毒素的帮助)的耙细胞内的生物化学反应，粘附细菌寄居于粘膜上皮。联合这些侵入机制，知道了来源于多种细菌和病毒的多种生物粘附蛋白(如透明质酸酶、内化素(internalin)。这些允许这些微生物带有给人深刻印象的对宿主种类甚至特定靶组织的选择性的细胞外粘附。通过如此受体-配体相互作用传递的信号激发完整的活微生物通过内吞和跨越细胞过程运送入，以及最后穿越上皮细胞。依据在此的教导，如此天然发生的现象可被利用(例如，通过络合如PTH肽的生物活性剂与外源凝集素)，以增强生物活性化合物递送进入和跨粘膜上皮和/或其它指定的药物功能的靶向点。以特异的、凝集素样的方式结合上皮表面的多种细菌和植物毒素也可用于本发明的方法和组合物。例如，白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)通过RME迅速进入宿主细胞。同样，大肠杆菌不耐热毒素的B亚基以高特异的、凝集素样方式结合到肠内上皮细胞的刷状缘。已报道在体内和体外该毒素的摄取和跨细胞到肠上皮细胞基底外侧。其它研究已在大肠杆菌以麦芽糖结合融合蛋白表达了白喉毒素的跨膜域并且将其与高分子量的多聚-L-赖氨酸化学配对。所得的复合物成功地用于介导体外报告基因的内在化。除了这些实例，金黄色酿脓葡萄球菌(ito//^/ococcws"w"t^)产生一组既是超抗原又是毒素的蛋白质(例如葡萄球菌肠毒素A(SEA)、SEB、中毒性休克综合症毒素l(TSST-l))。与这些蛋白质有关的研究已报道在Caco-2细胞中SEB和TSST-I剂量依赖性促进的跨细胞作用。病毒血细胞凝集素包含另一类运输剂，其促进本发明中的方法和组合物的生物活性剂的粘膜递送。许多病毒感染的初始步骤是表面蛋白(血细胞凝集素)与粘膜细胞的结合。对多数病毒已经鉴定了这些结合蛋白，包括轮状病毒、水痘带状疱瘆病毒、塞姆利基(semliki)森林病毒、腺病毒、马铃薯巻叶病毒和呼吸道肠道病毒。这些和其它典范的病毒血球凝集素可用于与一种或多种公布于此的PTH肽、类似物和模仿物联合制剂(例如，混合物或共轭物制剂)或协同给药方案中，以协同地增强一种或多种另外的生物活性剂的粘膜递送。可选地，病毒血球凝集素可用于联合制剂或协同给药方案以直接增强一种或多种PTH肽蛋白、类似物和模仿物的粘膜递送，无论伴有或不伴有另外的生物活性剂的递送增强。多种内源的、选择性的运输介导因子也可用于本发明。哺乳动物细胞已发展一种分配机制以促进特异的物质内在化和耙向这些到确定的间隔。总而言之，这些膜变形的过程名为'内吞作用，并包含吞噬作用、胞饮作用、受体介导的内吞作用(笼形蛋白介导的RME)，以及细胞摄液作用(非笼形蛋白介导的RME)。RME是高特异的细胞生物过程，如其名字所示，通过其多种配体结合到细胞表面受体以及之后在细胞内内在化和运输(traffick)。在许多细胞，此内吞作用过程非常活跃以致整个膜表面在不到半个小时被内在化和取代。两类受体被基于其在细胞膜的定向而提出；I类受体的氨基末端位于膜的细胞外侧，而II类受体在细胞内环境有同样的蛋白末端。本发明的其它实施方案利用铁传递蛋白作为粘膜递送的生物活性剂的RME的载体或刺激剂。铁传递蛋白，一种80kDa离子运输糖蛋白，通过RME被有效地吸收进入细胞。铁传递蛋白受体可见于多数增殖细胞表面，在有核红细胞和许多胂瘤细胞上数量增加。据报道，铁传递蛋白(Tf)和铁传递蛋白共轭物的跨细胞作用在真菌代谢产物布雷菲德菌素A(BFA)存在时增强。在其它研究中，报道BFA治疗能快速增加蓖麻毒素和HRP在MDCK细胞中的顶端内吞作用。因此，BFA和那些刺激受体介导运输的其它试剂可用于本发明的方法作为联合制剂(例如，共轭的)和/或协同给药的试剂以增强包括PTH肽蛋白、类似物和模仿物的生物活性剂的受体介导的运输。在本发明的某些方面，在此处的联合制剂和/或协同给药方法掺入有效量的肽和蛋白质，其可粘附于带电荷的玻璃从而减少容器内有效浓度。硅烷化的容器，如硅烷化玻璃容器，可用于储存终产物以减少多肽或蛋白质对玻璃容器的吸附。在本发明另外的方面，治疗哺乳动物主体的试剂盒包括粘膜递送到哺乳动物主体的一种或多种PTH肽化合物制剂的稳定的药学组合物，其中所述组合物对于治疗或预防骨质疏松症或骨量减少是有效的。试剂盒进一步包括药物试剂瓶以包含一种或多种PTH肽化合物。药物试剂瓶由药物级聚合物、玻璃或其它合适的材料组成。药物试剂瓶是例如硅烷化的玻璃瓶。试剂盒进一步包括递送组合物到主体的鼻粘膜表面的孔。递送孔是由药物级聚合物、玻璃或其它合适的材料组成的。递送孔是例如硅烷化的玻璃。硅烷化技术结合表面在低压下经过硅烷化的过程而硅烷化的特殊的净化技术。硅烷在气相中并且在将要被硅烷化的表面的高温度。此方法提供稳定、一致的和有单层特征的功能性硅烷层的可再生的表面。硅烷化的表面防止本发明的多肽或粘膜递送增强剂与玻璃的结合。本过程可用于制备盛装本发明PTH肽组合物的硅烷化药物试剂瓶。玻璃盘在用前用双蒸水(ddH20)冲洗清洁。然后硅烷盘用95。/。EtOH冲洗，丙酮盘用丙酮沖洗。药物试剂瓶在丙酮中声处理10分钟。丙酮中声处理后，试剂瓶在ddH20盘中洗涤至少两次。试剂瓶在0.1MNaOH中声处理IO分钟。当试剂瓶在NaOH中声处理时，在通风橱中制备硅烷溶液。(硅烷溶液800mL95。/o乙醇；96L冰醋酸；25mL缩水甘油基氧丙基三曱氧硅烷)。NaOH声处理后，试剂瓶在双蒸水盘中洗涤至少两次。试剂瓶在硅烷溶液中声处理3-5分钟。试剂并瓦在100。/。EtOH盘中洗涤至少两次。试剂瓶用预纯化N2气干燥并在用前储藏在100°C烤箱中至少2小时。在本发明的某些方面，在此处的联合制剂和/或协同给药方法掺入有效量的非毒性生物粘附剂作为辅助化合物或载体以增强一种或多种生物活性剂的粘膜递送。在本文生物粘附剂表现与一种或多种组分或靶向粘膜的表面通常的或特异的粘附。生物粘附剂维持期望浓度梯度的生物活性剂进入或跨粘膜以确保甚至大分子(例如肽和蛋白质)进入或跨粘膜上皮的渗透。典型地，本发明中的方法和组合物所用的生物粘附剂导致肽和蛋白质进入或跨粘膜上皮的渗透性增加2到5倍，经常地5到10倍。这种上皮渗透增强通常允许大分子有效跨粘膜递送至，例如鼻上皮的基底的部分或进入邻近的细胞外间隔或血浆或中枢神经系统组织或液体。这样的增强的递送提供了生物活性肽、蛋白质和其它大分子治疗物质递送的大大改进的有效性。这些结果部分依赖于化合物的亲水性，借此与水不可溶的化合物相比，更大的渗透是通过亲水物质实现的。除了这些效应，为增强药物在粘膜表面的持续性而使用生物粘附剂能引起延长药物递送的贮器机制，借此化合物不仅跨粘膜组织而且当表面的物质用尽时也向粘膜表面反向扩散。多种合适的生物粘附剂公布于口服给药领域，美国专利No.3,972,995;4,259,314;4,680,323;4,740,365;4,573,996;4,292,299;4,715,369;4,876,092;4,855,142;4,250,163;4,226,848;4,948,580;美国专利再版33,093，通过引用并入本文中，其用于本发明新的方法和组合物。多种生物粘附聚合物作为本发明方法和组合物中粘膜例如鼻粘膜的递送平台的潜力，可简单地通过测定它们保留和释放PTH肽的能力，以及通过掺入活性剂之后它们与粘膜表面相互作用的能力来评价。另外，能使用已知方法测定所选聚合物与粘膜给药位点组织的生物相容性。当靶向粘膜被粘液覆盖(即，在无粘液溶解或粘液清洁的治疗下)，它能作为与下层粘膜上皮相连的连接。因此，在此处所用术语"生物粘附剂"也包括对增强本发明生物活性剂粘膜递送有用的粘膜粘附化合物。但是，通过粘附于粘液凝胶层介导的对粘膜组织的粘附接触可受限于粘液层和下层组织之间不完全或瞬时的粘附，特别在发生快速的粘液清除的鼻表面。这方面，粘蛋白糖蛋白被不断分泌，在它们从细胞或腺体释放后立即形成一种粘弹性的凝胶。然而粘附的凝胶层的腔表面不断被机械的、酶的和/或纤毛的活动侵蚀。当这种活动较突出或期望有更长粘附时间，本发明协同给药方法和联合制剂的方法可进一步掺入公布于以上的粘液溶解的和/或纤毛稳定的方法或试剂。典型地，本发明所用粘膜粘附聚合物是天然的或合成的大分子，其通过复杂但是非特异的机制粘附湿的粘膜组织表面。除了这些粘膜粘附聚合物，本发明也提供掺入那些通过特异的包括受体介导的相互作用直接粘附到细胞表面而非粘液的生物粘附剂的方法和组合物。以这样特异的方式起作用的生物粘附剂的一个例子是被称为凝集素的化合物组。这些是具有特异识别和结合糖分子的糖蛋白，所述糖分子例如糖蛋白或糖脂，其形成部分鼻内上皮的细胞膜并且能认为是"凝集素受体"。在本发明的某些方面，增强生物活性剂鼻内递送的生物粘附物质包含例如水溶或水可膨胀的亲水聚合物的基质或聚合物的混合物，其可粘附于湿的粘膜表面。这些粘附剂可以制备为例如药膏、水凝胶(见上述)、薄膜和其它应用形式。通常，这些粘附剂与生物活性剂混合以实现活性剂的緩慢释放和局部递送。一些是与另外的成分一起配制以促进活性剂通过鼻粘膜的渗透，例如，进入个体的循环系统。多种天然的和合成的聚合物，在生理条件下与粘液和/或粘膜上皮的表面表现显著的结合性。这种相互作用的强度可易于通过机械削皮(peel)或剪切试验测量。当应用于湿的粘膜表面，许多干的物质会自发粘附，至少是轻微地。这个初始接触后，一些亲水的物质开始通过吸收、膨胀或毛细管的力而吸引水，如果水是从下层基质或从聚合物-组织的界面吸收来的，粘附能有效达到增加生物活性剂粘膜吸收的目的。这样的"通过水合粘附"可能是非常强的，但适于用这种机制的制剂必须考虑膨胀，当剂量转换为水合粘质其持续存在。这个特点突出表现在本发明中许多有用的水胶体，特别是纤维素衍生物，当其以预水合态应用时通常是非粘附。虽然如此，当这些物质用于干的聚合物粉末、微球或膜类递送的形式时，粘膜给药的生物粘附药物递送系统是在本发明中有效的。其它聚合物当不仅以干态，而且在完全水合态和有过量的水存在下使用时粘附于粘膜表面。因此，粘膜粘附剂的选择需要适当考虑生理学和物理化学条件，在所述条件下会形成和维持与组织的接触。特别，粘附预期点通常存在的水量或湿度，和占优势的pH，已知大大影响不同聚合物粘膜粘附的结合强度。多种聚合物的生物粘附药物递送系统已在过去的20年被制造和研究，但不总是成功。然而目前多种这样载体用于临床应用，包括，牙科的、矫形的、眼科的和外科的使用。例如，基于丙烯酸的水凝胶已被广泛用于生物粘附装置。基于丙烯酸的水凝胶，由于其在部分膨胀态的柔性和非磨蚀特征，非常适于生物粘附，其减少对接触组织造成损坏的磨损。此外，它们在膨胀态的高通透性允许未反应的单体、未交联的聚合物链和起始物在聚合后洗出混合物，这是本发明所选生物粘附物质的重要的特征。基于丙烯酸的聚合物装置展示非常高的粘附结合力。对于肽和蛋白质药物的控制粘膜递送，本发明的方法和组合物可选地包括载体的使用，例如，聚合物的递送运输体，其部分防止蛋白水解破坏生物活性剂，而同时提供肽或蛋白质进入或穿越鼻粘膜的增强的渗透。在本文，生物粘附聚合物已显示增强口服药物递送的相当大的潜力。作为一个例子，9-去甘氨酰胺，8-精氨酸抗利尿激素(DGAVP)十二指肠内给药于大鼠，同时给药P/。(w/v)粘膜粘附聚丙烯酸衍生物聚卡波非的盐分散相，与无这些聚合物的肽药物的水溶液相比生物利用度增加3-5倍。聚丙烯酸类的粘膜粘附聚合物是一些肠内蛋白酶的有效的抑制剂。酶抑制的机制可通过这类聚合物对二价阳离子例如钩或锌强的亲和力来解释，所述二价阳离子是例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的金属蛋白酶的必需辅助因子。通过聚丙烯酸去除蛋白酶的辅助因子，被报道诱导酶蛋白的不可逆的结构变化，其伴有酶活性的丧失。同时，其它粘膜粘附聚合物(例如一些纤维素衍生物和壳聚糖)可在某些条件下不抑制蛋白水解酶。与其它预期在本发明使用的相对小分子的酶抑制剂相反(例如抑肽酶、苯丁抑制素)，抑制的聚合物经鼻吸收可能由于这些分子的大小而最小化，从而消除可能的不良副反应。因此，粘膜粘附聚合物，特别是聚丙烯酸类，可既作为吸收促进粘附剂又作为酶保护剂以增强肽和蛋白质药物的控制递送，特别是安全性被考虑时。除了防止酶的降解作用，本发明中所用生物粘附剂和其它聚合物的或非聚合物的吸收促进剂可直接增强对生物活性剂的粘膜通透性。为促进例如肽和蛋白质的大的和亲水分子穿越鼻上皮屏障的运输，除了通过延长递送系统的前粘膜滞留时间所说明的以外，粘膜粘附聚合物和其它试剂已被假定产生增强的渗透影响。药物血浆浓度的时程报道提示生物粘附微球造成胰岛素穿越鼻粘膜通透性的急性、但瞬时的增加。其它用于本发明的粘膜粘附聚合物，例如壳聚糖，报道增强某些粘膜上皮的通透性，甚至当它们作为水溶液或凝胶使用时也是如此。另一个据报道直接影响上皮通透性的粘膜粘附聚合物是透明质酸及其酯衍生物。在本发明协同给药和/或联合制剂的方法和组合物中特别有用的生物粘附剂是壳聚糖，及其类似物和衍生物。壳聚糖是非毒性的、生物相容的和生物可降解聚合物，因其低毒和良好生物相容性的有利特性广泛地用于药物和医学应用。它是天然的通过利用基质的N-脱乙酰作用从甲壳质制备的多聚氨基糖。如在本发明的方法和组合物中使用，壳聚糖增加公布于此的PTH肽蛋白、类似物和模仿物和其它生物活性剂在粘膜应用位点的滞留。这种模式的给药也能改进患者的顺应性和接受性。如在此处进一步提供的，本发明的方法和组合物会可选择地包括新型壳聚糖衍生物或壳聚糖的化学修饰的形式。本发明中使用的一种这样的新型衍生物被表示为P-[1—4]-2-胍基-2-脱氧-D-葡萄糖聚合物(多聚-GuD)。壳聚糖是曱壳质的N-去乙酰化产物，一种天然存在聚合物，其广泛地用于制备口服和鼻内制剂的微球。壳聚糖聚合物还被建议作为肠胃外药物递送的可溶载体。在本发明的一个方面，o-曱基异脲用于转化壳聚糖胺到其胍基部分。胍基化合物是通过例如在pH8.0以上壳聚糖和o-曱基异脲的等当量溶液的反应而制备的。胍基产物为-[14]-胍基-2-脱氧-D-葡萄糖聚合物。在本文简写为多聚-GuD(壳聚糖中胺的单体的F.W.=161;多聚-GuD中胍盐单体的F.W.=203)。在本发明中使用的另外的归于生物粘附剂的化合物通过介导特异的相互作用起作用，所述特异的相互作用典型地归于生物粘附复合物和粘膜上皮表面组分互补结构之间的"受体-配体相互作用"。许多天然的实例显示这样形式的特异性结合生物粘附，如通过凝集素-糖相互作用例证的。凝集素是非免疫来源的(糖)蛋白，其结合多糖或糖轭合物。几种植物凝集素被研究作为可能的药物吸收促进剂。一种植物凝集素肾豆血凝素(PHA),给大鼠服用后显示超过10%的高的口服生物利用度。番茄(Z^copera'cowescw/ewfww)凝集素(TL)显示对多种模式给药的安全性。总之，上述生物粘附剂可用于本发明的联合制剂和协同给药方法，其可选择地掺入有效量和形式的生物粘附剂，以延长一种或多种PTH肽蛋白、类似物和模仿物以及其它生物活性剂的持续性或以其它方式增加粘膜给药。在某些实施方案中，生物粘附剂作为'药物胶，，然而在其它实施方案中，生物粘附剂的辅助递送或联合制剂用作增强生物活性剂与鼻粘膜的接触，在一些情况中通过促进与上皮细胞的"受体"特异的受体-配体相互作用，以及在其它情况中通过增强上皮通透性以显著地增加在递送耙向位点(例如，肝脏、血浆，或中枢神经系统组织或液体)测量的药物浓度梯度。然而另外的用于本发明的生物粘附剂作为酶(例如，蛋白酶)抑制剂以增强与生物粘附剂协同递送的或联合制剂的粘膜给药的生物治疗剂的稳定性。本发明的协同给药方法和联合制剂可选择地掺入有效的基于脂质或脂肪酸的载体、加工剂或递送运输体，以为PTH肽、类似物和才莫仿物，以及其它生物活性剂的粘膜递送提供改进的制剂。例如，提供了粘膜递送的多种制剂和方法，其包含例如肽或蛋白质的一种或多种这些活性剂被脂质体、混合的胶束载体或乳剂混合或嚢化，或与其协同给药，以在粘膜递送中增强生物活性剂的化学的和物理的稳定性和增加其半衰期(例如，通过降低对蛋白质水解作用、化学修饰和/或变性的敏感性)。在本发明的某些方面，生物活性剂的特异的递送系统包含名为脂质体的小脂嚢泡。这些是典型地从天然的、生物可降解、非毒性的和非免疫原性的脂质分子制备的，并且能有效地包容或结合包括肽和蛋白质的药物分子进入它们的膜内或到达膜上。本发明中脂质体作为肽和蛋白质递送系统的吸引力是通过下述事实而增加的即被嚢的蛋白质能保持在小嚢泡中其优选的水环境中，而脂质体的膜保护其抵抗蛋白水解作用和其它失稳因子。因为肽和蛋白质的单一物理和化学性能，即使不是全部已知的脂质体制备方法适于其嚢化，但多种方法允许这些大分子的嚢化并基本无失活。多种用于制备本发明使用的脂质体的方法是可得到的，美国专利No.4，235,871、4,501,728和4,837,028,通过引用并入本文中。为利用脂质体递送，生物活性剂是典型地包容于脂质体内，或脂质小嚢泡内，或结合于小嚢泡的外侧。像脂质体，非饱和的长链脂肪酸，其也有对粘膜吸收增强的活性，能形成有双层样结构的封闭小嚢泡(也称"聚集体(ufasomes)")。在本发明中这些小嚢泡可通过例如用油酸包容用于粘膜例如鼻内粘膜的递送的生物活性肽和蛋白质而形成。其它用于本发明的递送系统结合聚合物和脂质体的使用，以联合两种运输体的优势特性例如在天然的聚合物纤维蛋白内嚢化。此外，生物治疗化合物从所述递送系统的释放是通过使用共价交联和向纤维蛋白聚合物添加抗纤维蛋白溶解剂而可控制的。用于本发明的更简化的递送系统包括阳离子脂质作为递送运输体或载体的使用，其能有效地使用以提供脂质载体和这些带电荷的生物活性剂例如蛋白和多聚阴离子核酸之间的静电相互作用。这允许药物进入适合粘膜给药和/或之后递送到全身间隔的形式的有效包装。用于本发明的另外的递送运输体包括长链和中链的脂肪酸，以及带有脂肪酸的混合表面活性剂的微粒。多数天然存在的酯形式的脂质对它们自身跨粘膜表面的运输具有重要意义。游离脂肪酸和它们的带有极性基团的甘油单酯，已显示以混合微粒形式在肠内屏障上作为渗透增强剂。游离脂肪酸(链长从12到20个碳原子不等的羧酸)和它们的极性衍生物的屏障修饰功能的发现，已刺激这些试剂作为粘膜吸收增强剂的应用的广泛研究。为在本发明的方法中使用，长链脂肪酸，特别是融合(isogenic)脂质(非饱和脂肪酸和甘油单酯，例如油酸、亚麻仁油酸、亚麻仁油酸、一油清等)提供有用的载体以增强公布于此处的PTH肽、类似物和模仿物，以及其它生物活性剂的粘膜递送。中链脂肪酸(C6到C12)和甘油单酯也显示在肠内药物吸收中有增强活性，以及能适于本发明粘膜递送制剂和方法的使用。另外，中链和长链脂肪酸的钠盐对本发明的生物活性剂的粘膜递送是有效递送运输体和吸收增强剂。因此，脂肪酸可以钠盐的溶解形式或通过添加非毒性表面活性剂，例如聚氧乙基化的氢化蓖麻油、牛磺胆酸钠等使用。在本发明有用的其他脂肪酸以及混合胶粒的制品包括但不限于，辛酸钠(C8)、癸酸钠(CIO)、月桂酸钠(C12)或油酸钠(C18)，其可选择地结合胆盐，例如甘氨胆盐和牛磺胆盐。提供于本发明内的另外的方法和组合物包括生物活性肽和蛋白质的化学修饰，其通过聚合物物质的共价粘附，例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸。所得共轭的肽和蛋白质保留它们对粘膜给药的生物活性和可溶性。在另一个实施方案中，PTH肽蛋白、类似物和模仿物，以及其它生物活性肽和蛋白质，被共轭到多聚烯基氧化聚合物，特别是聚乙二醇(PEG)。美国专利No.4,179,337,通过引用并入本文中。如本领域技术描述的，肽能直接连接到PEG。PEG可为具有300和60,000分子量范围之间的分子。也包括多种PEG分子，包括线性的、分枝的，在单个部分或多重附着位点与肽连接。用于本发明的胺反应性的PEG聚合物包括具有分子量2000、5000、10000、12000和20000的SC-PEG;U-PEG-10000;NHS-PEG-3400-生物素；T-PEG-5000;T-PEG-12000;和TPC-PEG-5000。生物活性肽和蛋白质的聚乙二醇化可通过修饰羧基位点(例如，除羧基末端外，还有天冬氨酸或谷氨酸基团)而获得。在酸性条件下选择性的修饰碳二亚胺-活化的蛋白羧基基团的PEG-酰肼的使用已被描述。可选地，生物活性肽和蛋白质的双官能性PEG修饰可被使用。在一些过程，带电荷的氨基酸残基，包括赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，有蛋白表面上溶剂易接近性的显著倾向。除了聚乙二醇化，用于本发明的生物活性剂例如肽和蛋白质能4皮修饰以增强循环的半衰期，其通过与其它已知的保护的或稳定的化合物的连接而屏蔽活性剂，例如通过产生活性肽、蛋白质、类似物或模仿物与一种或多种载体蛋白，例如一个或多个免疫球蛋白链连接的融合蛋白。本发明的粘膜递送制剂包括PTH肽、类似物和模仿物，典型地联合一种或多种药学上可接受的载体一起以及，可选择地，联合其它治疗成分。载体必须是"药学上可接受的"，意思是与制剂其它成分相容的，以及不引起对主体不可接受的有害影响。这样的载体前文已有描述或对药学领域的技术人员是已知的。期望地，制剂不应包括例如酶或氧化剂的物质，与其一起给药的生物活性剂是已知不相容的。制剂可用药学领域熟知的任意方法制备。在本发明的组合物和方法中，公布于此的PTH肽蛋白、类似物和模仿物以及其它生物活性剂可以通过多种粘膜给药模式给药给予主体，包括通过口腔的、直肠的、阴道的、鼻内的、肺内的，或经皮肤的递送，或通过局部递送到眼、耳、皮肤或其它粘膜表面。可选择地，公布于此的PTH肽蛋白、类似物和模仿物以及其它生物活性剂能通过非粘膜路径协同地或辅助地给药，包括通过肌内的、皮下的、静脉内、心房内的、关节内的、腹膜内的，或肠胃外的路径。在其它可选的实施方案中，生物活性剂能是体外给药的，通过直接暴露于源于哺乳动物个体的细胞、组织或器官，例如作为体外组织或器官治疗制剂的组分，其包括在合适液体或固体载体的生物活性剂。本发明的组合物经常是作为鼻的或肺的喷雾剂在水溶液中给药，并且可以通过本领域技术人员已知的多种方法以喷雾剂型配药。作为鼻的喷雾剂的配药液体的优选的系统公布于美国专利No.4,511,069，通过引用并入本文中。制剂可存在于多剂量容器，例如公布于美国专利No.4,511,069的封闭的配药系统中。另外的气溶胶递送形式可以包括，例如压缩的空气-、喷嘴-、超声的-，以及压电的喷雾器，其递送溶解的或悬浮在例如水、乙醇或它们的混合物的药物溶剂中的生物活性剂。本发明的鼻的和肺的喷雾剂溶液典型地包括药物或要递送的药物，其可选择地与例如非离子的表面活性剂(例如，聚山梨酸酯-80)的表面活性剂以及一种或多种緩沖液配制。在本发明的一些实施方案中，鼻的喷雾剂溶液进一步包含喷射剂。鼻喷雾剂溶液的pH可选择地在大约pH3.0和6.0之间，优选5.0±0.3。用于这些组合物的合适的緩冲液在前文有描述或是本领域已知。其它组分可以被添加以增强或维持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂，或气体。合适的防腐剂包括，但不限于，苯酚、对羟基苯曱酸曱酯(methylparaben)、对羟基苯曱酸酯(paraben)、间-曱酚、硫柳汞、三氯叔丁醇、苯曱基氯铵(benzylalkonimumchloride),等等。合适的表面活性剂包括，但不限于，油酸、失水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱和多种长链甘油二酯和磷脂。合适的分散剂包括，但不限于，乙二胺四乙酸等。合适的气体包括，但不限于，氮气、氦气、氯氟碳(CFCs)、氢氟碳(HFCs)、二氧化碳、空气等。在其它的实施方案中，粘膜制剂是以用于鼻内递送的包括生物活性剂干粉制剂给药，所述干粉制剂为干态的，通常是合适颗粒尺寸或在合适颗粒尺寸范围内的低压冻干形式。适合在鼻的或肺的通道沉积的最小的颗粒尺寸通常是约0.5i!质量中值当量空气动力学直径(MMEAD),—般大约l(iMMEAD，和更典型地大约2pMMEAD。适合在鼻通道沉积的最大颗粒尺寸通常是大约10(1MMEAD，一般大约8(iMMEAD,和更典型地大约4|iMMEAD。能通过多种常规技术产生这些大小范围的鼻内呼吸粉末，例如气流动力磨G'etmilling)、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界液体浓集等。这些合适的MMEAD干粉能经由传统的干粉吸入装置(DPI)给予患者，所述传统的干粉吸入装置依赖于患者的呼吸，当肺或鼻吸入时，分散粉末至气溶胶化的量。可选地，干粉可以经由空气协助的装置给药，该装置使用外部能源分散粉末至气溶胶化的量，例如活塞泵。干粉装置典型地需要粉末质量在从大约lmg到20mg的范围内以产生单一的气溶胶的剂量("泡夫(puff)")。如果生物活性剂的所需或希望的剂量低于这个量，粉末化的活性剂会典型地与干的药物填充粉剂联合，以提供所需的总粉末质量。优选的干的填充粉剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、人血清白蛋白(HSA)和淀粉。其它合适的干的填充粉剂包括纤维二糖、葡聚糖、麦芽三糖、果胶、柠檬酸钠、抗坏血酸钠等。为制备本发明用于粘膜递送的组合物，生物活性剂可与为分散活性剂的多种药学上可接受的添加剂，以及基质或载体联合。理想的添加剂包括但不限于，pH控制剂，例如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸等。此外，可包括局部麻醉药(例如苯曱基醇)、等渗剂(例如氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸附抑制剂(例如吐温80)、增溶剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。当粘膜递送的组合物是液体，制剂的张度，其用参考0.9。/。(w/v)生理盐水溶液的张度作单位来测量，典型地调节到一个数值，在这个数值无显著不可逆的组织损伤会在鼻粘膜的给药位点引起。一般，溶液的张度调节到大约1/3到3的数值，更典型地1/2到2，最经常地3/4到1.7。生物活性剂可以分散在基质或运输体中，其可以包含具有分散活性剂和任何理想的添加剂能力的亲水化合物。基质可选自一广泛范围的合适载体，包括但不限于，多聚羧酸或其盐的共聚物、羧基脱水物(例如马来酸酐)和其它单体(例如(曱基)丙烯酸曱酯、丙烯酸等)，亲水的乙烯聚合物例如聚乙酸乙烯酯、多聚乙烯醇、多聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物例如羟基曱基纤维素、羟基丙基纤维素等，和天然的聚合物例如壳聚糖、胶原、海藻酸钠、明胶、透明质酸及其非毒性的金属盐。通常，生物可降解聚合物是选择作为基质或载体，例如聚乳酸、多聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、多聚羟基丁酸、多聚(羟基丁酸-羟基乙酸)共聚物及其混合物。可选地或另外地，合成的脂肪酸酯例如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等可用作载体。亲水的聚合物和其它载体能被单独使用或联合使用，而且能通过部分结晶、离子键、交联等给予载体增强的结构完整性。载体能为直接用于鼻粘膜以多种形式提供，包括，液体或粘稠的溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球和薄膜。在本文所选载体的使用可引起生物活性剂吸收的促进。生物活性剂依据多种方法能联合基质或载体，活性剂的释放可通过渗透、载体的分解，或水通道的联合制剂。在某些情况，活性剂分散在从合适的聚合物例如异丁基2-氰丙烯酸酯制备的微粒体(微球)或毫微型胶嚢(毫微球)中，并分散在用于鼻粘膜的生物相容的分散介质中，在一个延长的时间产生持续的递送和生物活性。为进一步增强本发明药剂的粘膜递送，包括活性剂的制剂也可以包含亲水的低分子量的化合物作为基质或赋形剂。这些亲水的低分子量化合物提供一种通道介质，通过该通道介质，水溶性的活性剂，例如生理活性肽或蛋白质，可通过基质扩散到机体的表面，在那里活性剂被吸收。亲水的低分子量化合物可选择地从粘膜或给药环境吸收湿气并且溶解水溶性活性肽。亲水的低分子量化合物的分子量通常不大于10000和优选不大于3000。亲水的低分子量化合物例子包括多元醇化合物，例如寡聚糖、双糖和单糖，如蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、L-阿4i伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油和聚乙二醇。其它在本发明用作载体的亲水的低分子量复合物的例子包括N-曱基吡咯烷酮以及醇(例如寡聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)。这些亲水的低分子量化合物能被单独使用或相互联合或与鼻内制剂的其它活性或非活性组分联合。本发明的组合物可选地可包括如所需临近生理条件的药学上可接受载体的物质，例如pH调节剂和緩沖剂、张度调节剂、湿润剂等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钩、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。对固体组合物，可使用传统的非毒性药学上可接受的载体，其包括，例如，药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。用于施用生物活性剂的治疗组合物也能制备成溶液、微乳化液，或其它适于高浓度活性成分的有序的结构。载体可为溶剂或分散介质，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。溶液合适的流动性能被维持，例如通过使用例如卵磷脂的包被，通过在可分散的制剂情况下维持理想的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂。在许多情况，希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。生物活性剂延长的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶而实现。在本发明的某些实施方案中，生物活性剂是在时间-释放制剂中给药的，例如在包括緩释聚合物的组合物中。活性剂能与防止快速释放的载体一起制备，例如控释运输体如聚合物、被微嚢化的递送系统或生物粘附凝胶。在本发明多种组合物中，活性剂的延长递送能通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶而实现。当生物活性剂的控释制剂是期望的，根据本发明适合使用的控释结合剂包括任何生物相容的控释物质，其对活性剂是惰性的并且能掺入生物活性剂。许多这样的物质是本领域中已知的。有用的控释结合剂是那些在它们的鼻内递送后的生理条件下(例如在鼻的粘膜表面，或跨粘膜递送后在体液存在情况下)代谢緩慢的物质。合适的结合剂包括但不限于先前在本领域持续释放制剂中使用的生物相容的聚合物和共聚物。这样的生物相容的化合物是对周围組织非毒性和惰性的，并且不引起显著的不良副反应例如鼻的刺激、免疫反应、炎症等。它们被代谢成为代谢产物，后者也是生物相容的并容易从机体清除。和同聚的多聚酯衍生的聚合物基质。许多这些是本领域中已知生物可降解并产生无毒性或低毒性的降解产物。聚合物实例包括多聚羟基乙酸(PGA)和多聚乳酸(PLA)、多聚(DL-乳酸-co-羟基乙酸)(DLPLGA)、多聚(D-乳酸-co羟基乙酸)(DPLGA)和多聚(L-乳酸-co-羟基乙酸)(LPLGA)。其它有用的生物可降解或生物可蚀解的聚合物包括但不限于下述聚合物，例如多聚O己内酉旨)、多聚(s-阿内酯源(aprolactone)-CO-乳酸)、多聚(e-阿内酯源-CO-羟基乙酸)、多聚((3-羟基丁酸)、多聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、水凝胶如多聚(羟基乙基曱基丙烯酸酯)、聚酰胺、多聚(氨基酸)(即L-亮氨酸、谷氨酸、L-天冬氨酸等)、多聚(酯脲)、多聚(2-羟基乙基DL-阿司帕坦(aspartamide))、多聚缩醛聚合物、多聚原酸酯类、多聚碳酸酯、多聚马来酰胺、多糖和它们的共聚物。制备这样的制剂的许多方法通常为本领域的技术人员已知的。其它有用的制剂包括控释组合物例如微粒体，美国专利No.4，652,441和4,917,893，用于制备微粒体和其它制剂的乳酸-羟基乙酸共聚物，美国专利No.4,677,191和4，728，721,以及用于水溶性肽的持续释放组合物，美国专利No.4，675，189，所有专利通过引用并入本文中。无菌的溶液能通过在合适的溶剂中掺入所需量的活性化合物而制备，包括以上列举的一种成分或多种成分的组合，根据需要，随后过滤除菌。通常，分散是通过将活性化合物掺入无菌的运输体，其包括基本的分散介质和所需的来自以上列举的其它成分。在无菌粉末的情况下，制备的方法包括真空干燥和冻干法，它们产生来自事先无菌过滤溶液的活性成分加上任何其他所需成分的粉剂。微生物活动的预防能通过多种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如，对羟基苯曱酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。依据本发明的粘膜给药允许通过患者治疗的有效自我给药，前提是有足够的安全保护控制和监视剂量和副反应。粘膜给药也克服其它给药形式的某些缺点，例如注射，它是令人疼痛的且暴露患者于可能的感染，以及可有药物生物利用度问题。对鼻的和肺的递送，治疗性液体的受控制气溶胶配药系统作为喷雾剂为人熟知。在一个实施方案中，活性剂的测定剂量是通过特殊结构的机械泵阀递送的，美国专利No.4,511,069。对于预防和治疗的目的，/^布于此的生物活性剂可以每天一次鼻内给予主体。在本文，PTH肽的治疗有效剂量可包括在延长的预防或治疗的方案中的重复剂量，它会产生临床显著的效果以减轻或防止骨质疏松症或骨量减少。在本文有效剂量的确定典型地基于动物模型研究，之后为人临床试验，以及通过确定显著减少机体耙向疾病症状或病情的发生或严重度的有效剂量和给药方案而被指导。在这方面合适的模型包括，例如，小鼠、大鼠、猪、猫、非人类灵长类动物，和本领域已知其它可接受的动物模型。可选地，有效剂量能用体外模型(例如，免疫学的和组织病理学的分析)确定。用这些模型，通常仅需要普通计算和调节确定合适的浓度和剂量，来给予治疗有效量的生物活性剂(例如，鼻内有效的、经皮肤有效的、静脉内有效的，或肌内有效的剂量以引起期望的反应)。生物活性剂的实际剂量当然根据下述因素而不同，例如主体的疾病适应症和特定情况(例如主体的年龄、大小、健康情况、症状的程度、敏感性因子等)，给药的时间和路径，同时给予的其它药物或治疗，以及在主体中引起期望的活性或生物应答的生物活性剂的特定药理学。可以调节给药方案以提供最佳的预防或治疗应答。治疗有效量还是这样一种量即在此量在临床方面对治疗有益的作用重于生物活性剂的任何毒性或有害的副作用。在本发明的方法和制剂中，PTH肽的治疗有效量的非限定范围是0.7吗/kg到大约25吗/kg。为治疗骨质疏松症或骨量减少，给予PTH肽的鼻内剂量，剂量高到足以促进骨质的增长，但低到足以不引起任何不想要的副作用例如恶心。曱状旁腺激素W4优选的鼻内剂量是大约1吗-10吗/kg患者体重，最优选地从大约1.5jxg/kg到大约3吗/kg患者体重。在一种标准的剂量，患者会接受50吗到1600吗，更优选地大约在75吗到800吗之间，最优选地100吗、150昭、200吗到大约400吗。可选地，在本发明的方法和制剂中，生物活性剂的治疗有效剂量的非限定范围在每kg体重大约0.001pmol到大约100pmol之间，在每kg体重大约0.01pmol到大约10pmol之间，在每kg体重大约0.1pmol到大约5pmol之间，或在每kg体重大约0.5pmol到大约1.0pmol之间。每次给药，期望给予一般人类主体至少1毫克的生物活性剂(例如一种或多种PTH肽蛋白质、类似物和模仿物以及其它生物活性剂)，更典型地在大约10吗和5.0mg之间，并且在某些实施方案中，在大约100吗和l.Omg或2.0mg之间。在某些口部应用中，可需要高到每kg体重o.5mg的剂量以获得足够的血浆水平。应进一步注意，对每个特定的主体，应该评估特定的给药方案并且根据个体的需要和给予或监督给予渗透肽或其它生物活性剂的人员的专业判断在时间过程中调整。甲状旁腺激素的鼻内剂量将是从50吗到1600|ig的曱状旁腺激素范围，优选地75昭到800吗，更优选地100吗到400吗，最优选的剂量为100(ig到200吗之间，认为150吗为高度有效的剂量。使用本发明制剂的重复鼻内给药，在时间表上剂量间隔从大约O.l到24小时，优选地剂量间隔从0.5到24.0小时，会维持PTH肽标准化的、持续的治疗水平，以最大化临床效果同时最小化过度暴露和副作用的危险。目的是粘膜递送足以在个体的血浆中提高PTH肽浓度的PTH肽的量以促进骨质的增长。例如曱状旁腺激素的PTH促效剂的剂量可能由于主治医生或患者而不同，如果通过气流计数器剂型自我给药以维持在靶点期望的浓度。在一个可选的实施方案中，本发明提供PTH肽的鼻内递送的组合物和方法，其中PTH肽化合物通过鼻内有效剂量方案被重复给药，所述鼻内有效剂量方案包括在每天或每周的时间表过程中PTH肽的多重给药于个体，以在长期的给药阶段中维持PTH肽治疗有效的提升和降低的波动水平。组合物和方法提供那些通过个体以鼻制剂每天一次到六次自我给药的PTH肽化合物在8小时到24小时长给药时间维持PTH肽治疗有效的提升和降低的波动水平。本发明也包括含有用于预防和治疗哺乳动物主体的疾病和其它疾患的上述药学组合物、活性成分，和/或给药装置的试剂盒、包装和多容器单位。简而言之，这些试剂盒包括一种容器或制剂，它们含有公布于此的配制进用于粘膜递送的药学制品的一种或多种PTH肽蛋白、类似物或模仿物，和/或其它生物活性剂，并联合粘膜递送增强剂。本发明的鼻内制剂能通过使用任何喷雾瓶或注射器给药。鼻喷雾瓶的一个例子是"有安全夹的鼻喷雾泵"，PfeifferSAP#60548，其每次喷出递送O.lmL的剂量以及有长为36.05mm的浸管。它能从美国新泽西州普林斯顿的Pfeiffer购买到。例如曱状旁腺激素的PTH肽的鼻内剂量能从0.1ng/kg到大约1500吗/kg。但以鼻内喷雾给药时，优选喷雾的颗粒尺寸在10-100pim(微米)大小之间，优选地20-100|im大小。我们发现曱状旁腺激素肽能用鼻的喷雾剂或气溶胶鼻内地给药。这是另人吃惊的，因为在产生喷雾剂或气溶胶过程中，许多蛋白质和肽由于传动器产生的机械力而被切断或变性。在此领域，以下的定义是有用的。1.气溶胶-一种产品，它在压力下被包装而且包括治疗活性成分，后者在合适的阀系统激活时被释放。2.计量的气溶胶-一种加压剂型，它包括计量的剂量阀，后者允许在每次激活时递送均一量的喷雾剂。3.粉末气溶胶-一种产品，它在压力下被包装而且包括粉末形式的治疗活性成分，后者在合适的阀系统激活时被释放。4.喷雾气溶胶-一种气溶胶产品，它利用压缩的气体作为推进剂以提供产品以湿喷雾被释放所必需的力；它通常适用于在水溶剂中的医学试剂的溶-液。5.喷雾剂-一种溶液，它被空气或蒸汽喷射口细密地分散。鼻的喷雾药品包含治疗活性成分，后者溶解或悬浮于非压缩的分配器中的溶液或赋形剂的混合物。6.计量喷雾剂-一种非压缩的包含阀的剂型，在每次激活时，它允许一特定量喷雾剂的配药。7.悬浮喷雾剂-一种液体制品，包括分散在液体运输体以及当然以小滴或精细分散的固体的形式的固体颗粒。通过计量鼻喷雾泵作为药物递送装置("DDD")发射的气溶胶喷雾剂的流体动力学特征。喷雾剂特征是食品和药物管理局("FDA")批准对新的和现有的鼻喷雾泵的研究和开发、质量保证和稳定性测试过程所必需的法规要求的一个组成部分。已发现喷雾剂的几何学的所有特征是鼻喷雾泵总体性能最好的指示。特别地，已发现当喷雾剂离开装置，喷雾剂分散角度(烟缕几何学)的测量；喷雾剂横断层面的椭圓率、均匀度和颗粒/小滴分布(喷路)；和展开的喷雾剂的时间演变是鼻喷雾泵特征的最具代表性的性能分量。质量保证和稳定性测试中，烟缕的几何学和喷雾路测量是验证与鼻喷雾泵的批准数据标准的一致性和相符性的关键鉴定标识。定义烟缕高度-从传动器顶到由于直线流的断裂烟缕角度变得非直线的点的尺寸。基于数字图像的视觉测定，以及为了建立一个与喷路最远测量点一致的宽度测量点，对本研究确定了30mm的高度。主轴-最长的带，它能在拟合的喷路中被画出，喷路以基本单位(mm)越过COMw。短轴-最短的带，它能在拟合的喷路中被画出，喷路以基本单位(mm)越过COMw。椭圓率-主轴对短轴的比例。D!o-某种小滴直径，对于该小滴直径，样品总液体体积的10%由丰支小直径(pm)的小滴组成。D50-某种小滴直径，对于该小滴直径，样品总液体体积的50%由4交小直径(inm)的小滴组成，也称作质量中位直径。D9o-某种小滴的直径，对于该小滴直径，样品总液体体积的90%由较小直径Oim)的小滴组成。(D90-Dio)跨距-分布宽度的尺寸，值越小，分布越窄。跨距的计算是D5。。。/oRSD-百分比相对标准差，标准差除以系列平均值以及乘于100,也称作。/。CV。鼻喷雾装置能根据工业上习惯的或管理卫生当局可接受的选择。合适装置的一个例子描述于美国申请10/869,649(S.Quay和G.Brandt:CompositionsandmethodsforenhancedmucosaldeliveryofY2receptor-bindingpeptidesandmethodsfortreatingandpreventingobesity,filedJune16，2004)中。为治疗骨质疏松症或骨量减少，PTH肽曱状旁腺激素的鼻内给药的剂量高至足以促进骨质的增长但低至足以不？1起任何不想要的副作用例如恶心。例如曱状旁腺激素(1-34)的PTH肽的优选的鼻内剂量是大约3吗-10吗/kg患者体重，最优选地大约6吗/kg患者体重。在标准的剂量中患者将接受50吗到800吗，更优选地大约在100吗到400吗之间，最优选地"0吗到大约200吗。例如曱状旁腺激素(l-34)的PTH肽优选地每天给药一次。通过说明而非限制的方式提供以下实施例。实施例1在本发明详述的教导后，用于增强PTH鼻粘膜递送的范例制剂能如表1中显示的被制备或评估。实施例2鼻粘膜递送-渗透动力学和细胞毒性以下的方法通常用于在本发明的制剂和方法中评估PTH鼻粘膜递送参数、动力学和副作用，以及确定在此公布的用于与PTH联合制剂或协同给药的不同鼻内递送增强剂的功效和特征。渗透动力学和细胞毒性还用于确定在此公布的用于与粘膜递送增强剂联合制剂或协同给药的不同粘膜递送增强剂的功效和特征。在一个范例实验设计中，显示上述与生物活性治疗剂例如PTH联合的鼻内递送增强剂的渗透动力学和无不可接受的细胞毒性。EpiAirway系统作为排列在呼吸道的假复层的上皮细胞的才莫型，由MatTekCorp(Ashland,MA)开发。上皮细胞在气体-液体界面的多孔的以膜为底部的细胞培养嵌入物上生长，其引起细胞分化成高度极性的形态。尖已经通过免疫印迹法证实)。嵌入物直径为0.875cm,提供0.6cn^的表面积。在装运之前大约3周在工厂细胞被铺至在嵌入物上。当运送到达时，单元被放置在6孔微量培养板中的无菌的支柱上。每个孔接受5mL专用培养基。此基于DMEM的培养基是无血清的，但添加有表皮生长因子和其它因子。培养基总是测试任何细胞因子或生长因子的内生水平，其被认为用于鼻内递送，但是没有除了胰岛素以外的至今研究的所有细胞因子和生长因子。5mL的体积只是足够提供与它们所在的单元的底部的接触，但上皮细胞的顶部表面被允许维持与空气的直接接触。无菌的镊子用于这个步骤以及所有后继的步骤，其包括转移单元到包单元在它们的培养亚中维持在37。C、孵育箱中、5%(302的环境的空气中孵育24小时。在这段时间末，培养基被新鲜的培养基取代并且单元被放回孵育箱另外孵育24小时。24EpiAirway单元的试剂盒能常规地用于评估5种不同的制剂，其中每个应用于4组孔。每个孔是用于确定渗透动力学(4个时间点)、经上皮的电阻、如MTT还原测量的线粒体还原酶活性，以及通过LDH释放测量的细胞溶解。另外的l组孔用作对照，其在渗透动力学的测量过程中被假处理，但是与用于经上皮电阻和生存力的测定的包括试验样品单元的处理相同。对照上的测定也常规地在4组单元上进行，但是偶尔我们对对照采阻和生存力的测量，或者我们已经冻结和融解单元用于测定总LDH水平以作为用于100%细胞溶解的参考值。在所有实验中，要研究的鼻粘膜递送制剂是以100^L的体积应用于每个单元的顶部表面，所述体积有效地覆盖整个顶部表面。试验制剂的用于顶部表面浓度的合适的体积(一般需要不超过100jiL)被留出以用于后继通过ELISA或其它指定的分析方法对活性材料浓度的测定。单元被放置在用于实验的没有支架的6孔培养皿中每个孔包含0.9mL的培养基，其足够接触单元的多孔的膜底部但不产生单元上任何显著的向上的流体静力的压力。为了最小化潜在的误差源并且避免任何浓度梯度的形成，在研究的每个时间点单元从一个包含0.9mL的孔转移到另一个。这些转移基于100体积的试验材料:故应用到顶部表面的零时间，在以下的时间点进行15分钟、30分钟、60分钟，以及120分钟。在时间点之间，单元在它们的培养板中保持在37。C孵育箱中。每个孔包含0.9mL培养基的培养板也维持在孵育箱中，以致当移动培养板并且单元用无菌镊子从一个孔转移到另一个孔时，在短暂的期间内发生最小的温度变化。在每个时间点完成时，从转移每个单元的孔移去培养基，并整分进两个管子中(一个管子接受700nL,另一个接受200nL)用以测定渗透的试验材料的浓度，且在试验材料具细胞毒性的情况用于细胞溶质的酶乳酸脱氢酶乂人上皮细胞释放。如果分析要在24小时内进行，这些样品保存于水箱中，或者样品被亚整分并且冻存于-80。C直到分析的时候融解一次。应该避免反复的冷冻-融解循环。为了最小化误差，所有的管子、培养板以及孔在实验开始前预标记。在120分钟时间点末，单元被从最后包含0.9mL的孔转移到24孔微量培养板，其每个孔包含0.3mL培养基。此体积也足够与单元底部的接触，但在单元上不产生向上的流体静力压力。在测量经上皮的电阻前单元被放回孵育箱。体内以及体外呼吸气道上皮细胞形成紧密连接限制穿过组织的溶质的流动。这些连接在离体的气道组织给予几百ohmsxcrr^的经上皮的电阻；在MatTekEpiAirway单元中，制造商声明经上皮的电阻(TER)常规地大约1000ohmsxcm2。我们发现在渗透研究中在顺序的步骤中假暴露的对照EpiAirway单元的TER有些更低的(700-800ohmsxcm2),但是因为小分子的渗透是与TER的反涵数成比例的，此值仍然足够高以提供渗透的主要屏障。相反，没有细胞的多孔的以膜为底部的单元只提供最小的^争膜电阻(5-20ohmsxcm2)。准确的TER的测定需要欧姆计的电极放置超过高于或低于膜的显著表面积，并且从膜到电极的距离被重现性地控制。由MatTek推荐以及用于此处所有实验的TER测定的方法4吏用来自WorldPrecisionInstruments,Inc.，Sarasota,FL的"EVOM"TM上皮细胞的伏欧表和"ENDOHM"TM组织电阻测量腔。在TER测定之前，腔首先用Dulbecco磷酸盐緩冲液(PBS)装满至少20分钟以平衡电极。TER的测定在腔中用1.5mL的PBS进行并且测量以膜为底部的单元中的350pL的PBS。调节顶部电极到高于没有包含细胞(但包含350pL的PBS)的单元的膜以上的位置，并且然后固定以保证重现性的定位。无细胞的单元的电阻典型地为5-20ohmsxcm2("背景电阻")。一旦准备了腔并且记录了背景电阻，刚刚用于渗透测定的24孔培养板中地单元被从孵育箱移去并且各自放置在腔中用于TER测定。每个单元首先被转移到包含PBS的培养亚(petridish)以保证膜底部是湿润的。整分的350PBS被加入单元，并且然后被小心吸进标记的管子以冲洗顶部表面。然后向单元加入第二次冲洗的350PBS并且吸进相同的收集管子。只是当放进腔(包含新鲜的1.5mL整分的PBS)中之前，吸干单元外部表面多余的PBS。在顶部电极放到腔上以及在EVOM计上读取TER之前向单元加入350pL整分的PBS。在ENDOHM腔中读取单元的TER后，移去单元，吸取并保存PBS，并且带有顶部表面上的空气界面的单元被返回至每个孔包含0.3mL培养基的24孔培养板。按以下的顺序读取单元所有假处理的对照，之后所有制剂处理的样品，之后每个假处理的对照的第二次TER读取。在完成所有TER测定后，MTT是可渗透细胞的四唑盐，其通过具有完整线粒体功能的活细胞的线粒体脱氢酶活性或者通过来自能产生呼吸爆发细胞的非线粒体的NAD(P)H脱氬酶活性还原成不溶性有色的曱月替。曱月替的形成是上皮细胞生存力的良好指示剂，因为这些细胞不产生显著的呼吸爆发。我们使用了由MatTekCorp制备的MTT试剂盒，用于它们的单元以评价生存力。MTT试剂是以浓缩剂提供的并且在要分析生存力的当天(典型地在渗透动力学和TER在上午被测定的该天下午)稀释成基于专用DMEM的稀释剂。在使用前短暂离心以除去不溶性的试剂。MTT的终浓度为1mg/mL。MTT的终溶液以每个孔300)iL的体积加入24孔孩i量培养板的孔。如上面提到的，这个体积足够接触EpiAirway单元的膜但在细胞上不施加显著的正流体静力的压力。在TER测量后从24孔培养板放置单元的地方移去单元，并且在从单元的外表面移去多余的液体后，它们被转移到包含MTT试剂的培养板。在培养板中的单元然后被放置在孵育箱，在37。C,5%(302的环境中孵育3小时。在3小时的孵育末，包含活细胞的单元会变成可见的紫色。不溶性的曱月替必须从单元中的细胞提取以定量MTT还原的程度。曱月替的提取通过如以前的在移去单元外表面多余的液体后，将单元转移到每个孔包含2mL提取溶液的24孔微量培养板实现。此体积足够完全覆盖膜和单元的顶部表面。在避光的腔中提取被允许在室温下进行过夜。传统上，MTT提取剂包含高浓度的去污剂并且破坏细胞。在提取末，组合在每个单元中的流体和它周围孔的流体并转移到管子用于后继整分至96孔微量培养板(200pL整分部分为最佳)并在VMax多孔微量培养板分光光度计上测定在570nm的吸光度。为保证源于来自提取单元的残骇的浊度不构成吸光度，在VMax中每个孔也测定在650nm的吸光度并且被自动地从在570nm的吸光度减去。用于曱月替吸光度测定的"空白"是没有单元暴露的200pL整分的提取剂。认为此吸光度值构成零生存力。来自24EpiAirway单元的每个试剂盒的2个单元在测定渗透动力学和TER的过程中被留着未处理。这些单元用作100%细胞生存力的阳性对照。在我们进行的所有研究中，这些未处理单元的细胞的生存力与对照单元中的细胞没有统计学上显著的差异，其中对照单元中的细胞已经被假处理用于渗透动力学并且在其上已经进行TER测定。所有用试验制剂处理的单元的吸光度^皮认为在与MTT孵育时与单元中的细胞生存力的百分数成线性比例。应该注意这样的分析典型地在向顶部表面加入试验材料至少4小时后进行，并且后继在TER测定中冲洗单元的顶部表面。虽然通过MTT还原的线粒体还原酶活性的测量是细胞生存力的敏感探针，但是分析需要破坏细胞因此只能在每一研究末期进行。当细胞经历坏死溶解,它们的细胞溶质的内容物流进周围的培养基，此培养基中能够检测到例如乳酸脱氢酶(LDH)的细胞溶质的酶。用于培养基中LDH的分析能在渗透动力学的2小时测定的每个时间点移去的培养基的样品上进行。因此，直到显著的时间已经过去才发展的制剂的细胞毒素作用以及在暴露气道上皮细胞最早几分钟诱导的细胞溶解的制剂的作用能被检测到。用于评价EpiAirway单元的细胞溶解的推荐的LDH分析是基于乳酸根到丙酮酸根的转变并有NADH从NAD产生。NADH然后被再氧化并伴有四唑盐INT的同时还原，这由天然的"硫辛酸脱氢酶"制剂催化。从INT的还原形成的曱月替是溶解性的，所以对LDH活性的整个分析能在包含乳酸根、NAD、硫辛酸脱氬酶和INT的均一的水性培养基中进行。用于LDH活性的分析在来自EpiAirway单元周围的"上清液"培养基的样品并且在每个时间点收集的50pL整分部分进行。这些样品或者在冰箱中储存不超过24小时，或者在收集后的几个小时内冷冻后融解。每个EpiAirway单元产生上清液培养基的样品，其在应用试-睑材料后的15分钟、30分钟、l小时和2小时被收集。整分部分被全部转移到96孔微量培养板。没有暴露于单元的培养基的50pL整分部分作为0%细胞毒性的"空白"或阴性对照。我们发现在分析试剂混合物和未暴露的培养基反应后存在"内源的"LDH的明显水平，与在进行渗透动力学研究所需的整个2小时的过程中所有布￡处理的对照单元释^:的LDH明显水平在相同的实-睑误差内。因此在实验误差内，在渗透动力学测量的时程中这些假处理的单元没有显示上皮细胞的细胞溶解。为了制备反映单元中100%的细胞被裂解后释放的LDH水平的上清液培养基的样品，如在用于测定渗透动力学的实验设计中，没有受任何事先处理的单元被加入包含0.9mL培养基的6孔微量培养板的孔，包含单元的培养板被冷冻在-80。C，并且然后允许孔的内含物融解。这样的冷冻融解循环有效地裂解细胞，并且将它们的细胞溶质内含物包括LDH释放至上清液培养基。来自冷冻融解的细胞的培养基的50整分部分被加入96孔培养板作为反应100%细胞毒性的阳性对照。对每个包含上清液培养基的整分部分的孔，加入LDH分析试剂的50整分部分。然后在暗处孵育培养板30分钟。通过加入1M醋酸的"停止"溶液终止反应，在加入停止溶液的1小时内测定培养板在490nm的吸光度。细胞溶解百分数的计算是基于在吸光度和细胞溶解之间线性关系的假设，用单独从培养基得到的吸光度作为0%细胞溶解的参考值，以及从冷冻和融解单元周围的培养基得到的吸光度作为100%细胞溶解的参考值。用于测定作为试验材料的生物活性剂的浓度，以用于评估与本发明的粘膜递送的增强剂一起协同给药或联合制剂的活性剂增强的渗透的程序通常如上所述，并且根据已知方法和用于每个特定分析的ELISA试剂盒的特定的产品说明书。在生物活性剂与顶部上皮细胞表面接触后(其可能与顶部细胞表面暴露于粘膜递送增强剂同时或在其后)，生物活性剂的渗透动力学一般通过在多重时间点(例如15分钟、30分钟、60分钟和120分钟)进行测量而确定。确定在血清、中枢神经系统(CNS)组织或液体、脑脊液(CSF),或哺学分析确定。用于测定作为试验材料的PTH的浓度，以用于评估与本发明的粘膜递送的增强剂一起协同给药或联合制剂的活性剂增强的渗透的程序通常如上所述，并且根据已知方法和用于放射免疫分析(RIA)、免疫酶分析(EIA)及用于PTH肽免疫组织化学或免疫焚光的抗体试剂的特定的产品说明书。BachemAG(KingofPrussia,PA)。EpiAirway组织膜在没有酚红和氲化可的+^的培养基(MatTekCorp.,Ashland，MA)中培养。组织膜在37。C培养48小时以使得组织平衡。每个组织膜放置于包含0.9mL不含血清的培养基的6孔培养板的单个孔中。lOO^L的制剂(试验样品或对照)被加到膜的顶部表面。在每个分析中评估每个试验样品(粘膜递送增强剂与生物活性剂PTH联合)和对照(单独的生物活性剂PTH)的3组或4组样品。在每个时间点(15、30、60和120分钟)，组织膜被移到包含新鲜培养基的新孔。在每个时间点收集在下面的0.9mL的培养基样品并储存在4。C用于ELISA和乳酸脱氢酶(LDH)分析。ELISA试剂盒典型地是2步骤夹层ELISA:被研究的免疫反应形式的试剂首先被固定化在96孔微量培养板上的抗体"捕获"，并且在将未结合的材料洗出孔后，允许"检测"抗体与结合的免疫反应的试剂反应。这样的;险测抗体典型地与酶(最经常地是辣根过氧化物酶)辄合，并且然后通过分析它与生色试剂的活性测量以免疫复合体与培养板结合的酶量。除了在渗透动力学研究中在每个时间点收集的上清液培养基的样品，在动力学研究开始时用在单元的顶部表面的制剂的适当稀释的样品(例如包括主体生物活性试验试剂)连同一系列制造商提供的标准物也在ELISA培养板中分析。每个上清液培养基样品一般以复孔通过ELISA分析(应想到在渗透动力学测定的每个制剂使用4组单元，产生在所有4个时间点收集的上清液培养基的总共16个样品)。在上清液培养基的样品中或在用于单元顶部表面的材料的稀释样品中，在ELISA完成后，活性试验试剂的明显浓度在标准物的浓度范围之外并非罕见。在试验样品中存在的材料的浓度没有用超过标准物浓度的外推法确定；而是在重复的ELISA中，样品被适当再稀释以产生试验材料的浓度能通过插入标准物之间而^皮更准确地测量。用于例如PTH的生物活性试一险试剂的ELISA独特之处在于它的i殳计和推荐的实验设计。与多数试剂盒不同，ELISA使用2种单克隆抗体,一个用于捕获以及另一个作为检测抗体(此抗体与辣根过氧化物酶辄合)直接针对例如PTH的生物活性试验试剂的不重叠的决定物。只要分析的上限以下的PTH的浓度存在于实验样品中，分析实验设计能按照制造商的说明书使用,其允许用两个同时存在的抗体在ELISA培养板上孵育样品。当样品中的PTH水平显著高于此上限时，免疫反应的PTH的水平可能超过孵育混合物中抗体的量，并且一些没有结合检测抗体的PTH会在培养板上被捕获，而一些结合检测抗体的PTH可能没有被捕获。这引起严重的对样品中PTH水平的低估(会显示在这样的样品中PTH水平显著低于分析的上限)。为消除这种可能性，已经修改了分析实验设计'.稀释的样品首先在包含固定化的捕获抗体而没有任何检测抗体的ELISA培养板上孵育1小时。在孵育1小时后，冲洗孔洗去没有结合的材料。检测抗体与培养板一起孵育1小时以使与所有捕获的抗原形成免疫复合体。检测抗体的浓度足够与被捕获抗体结合的最高PTH水平反应。此培养板然后被再次冲洗以除去未结合的检测抗体。向培养板加入过氧化物酶底物并且孵育15分钟以允许颜色的发展发生。向培养板加入"停止"溶液，在VMax微量培养板分光光度计中读取450nm和490nm的吸光度。有颜色的产物在490nm的吸光度较450nm的吸光度低得多，但在每个波长的吸光度仍然与产物的浓度成比例。2种读数保证在VMax仪器的工作范围上吸光度与结合的PTH的量线性相关(虽然报道仪器在从0到3.0OD的范围是准确的，我们常规地限制范围从0到2.5OD)。样品中PTH的量通过在ELISA中获得的包括不同标准物的OD值之间读取OD而确定。OD读数在获得的标准物的范围之外的样品#:再次稀释并且进行重复的ELISA。通过TER分析测量经上皮的电阻在末次分析时间点后，膜被放进24孔培养板的单个孔0.3mL干净的培养基中，并且用EVOMEp他elialVoltohmmeter和Endohm腔(WorldPrecisionInstruments,Sarasota,FL)观'J量跨上皮细胞的电阻(TER)。顶部电极被调节到接近但不接触膜的顶部表面。组织从它们各自的孔一次被移去一个，并且底部表面通过浸泡在干净的PBS中清洗。用PBS小心冲洗顶部表面2次。组织单元被放置在Endohm腔中，250^L的PBS加到嵌入物，耳又代顶部电才及并且测量和记录电阻。测量后，倒出PBS并且组织嵌入物被放回培养板。所有TER值作为组织表面积的函数报道。最终数值计算如细胞膜的TER=(具有膜的嵌入物的电阻(R)-空白嵌入物的R)X膜的面积(0.6cm2)。实施例3无蛋白质作为稳定剂的曱状旁腺激素制剂的制备制备具有以下所列制剂的适合甲状旁腺激素鼻内给药的曱状旁腺激素制剂，其基本无蛋白质作为稳定剂。将大约3/4的水加入烧杯并在搅拌皿上用搅拌棒搅拌并且加入柠檬酸钠直到溶解完全。EDTA随后被加入并且搅拌直到全部溶解。柠檬酸随后被加入并且搅拌直到全部溶解。曱基-p-环糊精被加入并且搅拌直到全部溶解。DDPC随后被加入并且搅拌直到全部溶解。乳糖随后被加入并且搅拌直到全部溶解。山梨醇随后被加入并且搅拌直到全部溶解。三氯^k丁醇随后被加入并且搅拌直到全部溶解。曱状旁腺激素1-34随后被加入并且轻轻搅拌直到全部溶解。通过加入HC1或NaOH调节pH到5.0±0.25。加水到终体积。实施例4PTH和增强剂对人类软骨细胞的作用体外测量鼻内PTHu4制剂对人类软骨细胞的作用，特别测量与降钙素和IGF-I相比渗透促进剂对软骨细胞增殖和胶原产生的作用。所用的细胞系源于人类关节软骨。关节软骨细胞与鼻软骨细胞表型上非常相似(Shikani等，2004),因此为本研究提供良好模型。以两种不同形式提供细胞，第一种作为单层(增殖模型)，以及第二种作为在藻酸盐珠中嚢化的细胞(再分化模型)。细胞的单层模型用于检查细胞的增殖。目的是检查在PTHw4存在的简单制剂(柠檬酸緩冲液)或包含制剂增强剂的制剂中细胞的增殖，并且然后将这些数据与阳性对照(包含抗生素、胰岛素、TGF-p和IGF-I的培养基)和阴性对照(没有任何细胞生长成分的培养基)的细胞增殖相比。用于制备含肽制剂的安慰剂溶液描述于表3。肽被加入此溶液以获得期望的浓度。使用的PTHw4和鲑鱼降4丐素来自Nastech。IGF-1购自Sigma。源于正常的人类软骨的软骨细胞单层(CellApplications,Inc.,SanDiego，CA)粘附在24孔培养板上并且在第一次倍增后装运。当收到细胞时期望每个孔大约16000个细胞。2个培养板用PTH^4以及合适的对照样品相同地处理。对照包括用软骨细胞生长培养基处理的阳性对照细胞(CellApplications)和用基础培养基处理的阴性对照细胞(CellApplications)。一旦被处理，两个培养板之一被分析细胞生存力(〖=0样品)。另一个培养板被放置在37。C、5%C02孵育箱4天，其后培养板用MTT分析。对于MTT分析(CellApplications),100jxL体积的MTT浓缩液被加入包含1000pL样品的每个孔。培养板被密封并放在37。C4小时。37°C4小时孵育后移去每个培养板并放在桌上。小心移去和丢弃来自每个孔的上清液。看见可见的紫色晶体粘附在每个孔的培养板底。然后向每个孔加入500pL的提取溶液。在加入提取溶液后培养板立即用石蜡膜密封，并且然后轻轻地摇动和/或旋转以溶解紫色晶体。在570nm读取吸光度。在藻酸盐珠中嚢化的大约3百万人类软骨细胞(CellApplications)被接受在总体积25mL的再分化培养基中。在藻酸盐珠中的人类软骨细胞产生它们表型的标记例如聚集蛋白聚糖和II型胶原(Benya等，1982;Guo等，1982;Kato等，1984),不像在单层培养中，软骨细胞失去它们的表型特征并且去分化到成纤维细胞样的细胞(Kuettmer等，1982;Jennings等，1983;Kato等，1984)。开展基于藻酸盐的细胞系统是为了评估作为PTHw4给药的结果的II型胶原的表达并且因此评估任何软骨生长的指征。包含细胞的藻酸盐珠的悬浮液被从细胞培养瓶转移到50mL圆锥形管子。500(xL体积的(~每个孔62,500细胞)悬浮液被分散到24孔培养板的每个孔。向每个孔加样品并且使用适当的生长培养基使终体积到1毫升。对照包括用再分化培养基处理的细胞(CellApplications)作为阳性对照、用软骨细胞生长培养基处理的细胞(CellApplications)以及基础培养基(CellApplications)作为阴性对照。轻轻旋转培养板以使每个样品均一混合。培养板被放在37。C、5%C02的孵育箱中。人类软骨细胞生长达12天或更长。每两天或三天更换合适的生长培养基。在实验的最后一天，制备藻酸盐珠用于II型胶原的提取，并且提取的胶原用NativeTypeIICollagenDetectionKit(ChondrexInc.,RedmondWA)定量。用捕获型ELISA试剂盒(Chondrex)测量天然的II型胶原。通过试剂盒(AccumteChemical&ScientificCorp)测量氨基葡聚糖。MTT分析用于检测细胞增殖。MTT分析测量细胞生存力，并且MTT分析值的增加或减少反映活细胞群的增加或减少。对于用于软骨细胞生长的刺激试验，包含PTHw4的不同测试溶液被加到软骨细胞单层的顶面，并且在开始和在37。C/5%C02孵育4天后进行MTT分析。无论以简单的溶液配制或有渗透促进剂存在，结果显示PTHw4不刺激软骨细胞的生长。检查软骨生长模型，在其中细胞以在藻酸盐珠中嚢化的形式提供。在这样的形式，人类软骨细胞展示它们的表型标记例如聚集蛋白聚糖和II型胶原(Benya等，1982;Guo等，1982;Kato等，1984),不像在单层培养中，软骨细胞失去它们的表型特征并去分化为成纤维细胞样细胞(Kuettmer等1982;Jennings等1983;Kato等l984)。这样的基于藻酸盐的细胞系统被用于评估PTHw4给药对作为软骨生长的指征的II型胶原表达的作用。测试PTHU3的刺激软骨细胞产生软骨的能力。包含细胞的藻酸盐珠在多种试验溶液存在下37°C、5%C02孵育12天。孵育后，藻酸盐珠用提取方法处理以定量II型胶原(鼻软骨细胞外基质的主要成分(Shikani等，2004))的产生。以阳性(再分化培养基)和阴性(生长培养基)对照测量II型胶原的产生以及将细胞暴露于20或200吗PTHw4的影响。在再分化培养基存在下而不是在生长培养基存在下产生低水平的II型胶原。无论在柠檬酸緩冲液中或使用有渗透促进剂的情况，20mg的PTHw4的使用不引起从软骨细胞的II型胶原的产生。当在简单制剂中的200mgPTHw4用于细胞培养，II型胶原的产生增加。令人惊讶地，当在包含渗透促进剂的制剂中加入相同量的肽，细胞不产生II型胶原。作为对照，细胞系统在试验中被验证，其中显示通过使用5mglGF-I的培养II型胶原的产生增加。这些结果与例如曱基-b-环糊精和/或DDPC的渗透促进剂在阻断PTHw4的局部活性中的作用相符。实施例5在家兔中PTHl34的PK研究本研究的目的是确定对家兔鼻内或皮下剂量给药后PTHU34的血浆药物动力学和相对的鼻内的和皮下的生物利用度。另外，评估皮下重组和合成的PTHl34的吸收。这是在4组每组4只动物的随机、单个处理的平行研究。在剂量给药后，通过耳缘静脉的直接静脉穿刺从每只动物获得系列血样品。所述系列血样品(每个大约2mL)通过耳缘静脉的直接静脉穿刺收集至含EDTA作为抗凝剂的血液收集管子。收集血液后，立即轻轻振荡管子几次以抗凝结。将100pL抑肽酶加入收集管子。给药后0、5、10、20、30、45、60、120和240分钟收集血液样品。至少每天一次以及在所有采集血液样品的时间进行临床观察。剂量是基于最近记录的体重。对鼻内和皮下给药，动物给药量分别是50pl/kg和5nl/kg。剂量倍数基于家兔与人类鼻表面的测量。在此研究中，基于家兔和人类的单侧鼻表面分别是30cm2和80cm2,家兔对人类的鼻表面剂量的倍数为大约2倍。给药组显示在表4。用于组l、2、3和4的鼻和皮下制剂是根据以上描述的方法。酶免疫分析被开发以测量家兔血清中人类PTHw4的浓度。样品用蛋白酶抑制剂(抑肽酶)收集并且冻存。用改良的HumanBioactivePTH^4ELISA试剂盒分析样品(Sample)、标准品(Standards)和质量控制样品(QualityControlsamples)。样品、标准品和质量控制样品以两伤"故加入抗生物素蛋白链菌素包被的长条孔。这些样品然后与生物素化的人类PTH^4抗体和轭合HRP的人类PTHw4抗体的混合物一起孵育。用试剂盒的洗液(Washsolution)沖洗培养板并且每个孔加入TMB底物。在每个孔加入溶液前允许发展颜色10分钟。在吸光度读板机上测量OD。通过标准曲线的内插法计算浓度并且分析性能是用质量控制样品控制的。用使用非区划模型的WinNonLin專欠寸牛(PharsightCorporation,Version4.0,MountainView,CA)进行药物动力学计算。组1和2通过鼻内途径使用来自Bachem的合成的PTH作为活性成分以50jig/kg给药。组1为市售的为Forteo制剂，组2为Nastech's制剂。组3和4通过皮下途径分别使用重组的和合成的PTH以5pg/kg给药。对于2个组用于皮下途径的赋形剂与市售的Forteo⑧产品相同。对于组1、2、3和4，平均C腿分別是1,921.13、2,559.28、1，538.10和2,526.43pg/mL。对于组1、2、3和4,平均Tm狀分别是35、20、20和10分钟。组2的C腿与1、3和4组相比分别高1.3倍、1.7倍和大致相同。然而，组2的剂量比组3和组4高10倍。用于剂量^f交正的组2的相对生物利用度用与组3和组4的Cmax相比分别是16.6和10.0%。组2的Cmax比组l高1.3倍。组3对组4的与皮下途径比较的相对生物利用度是61%。对于组l、2、3和4，平均AUdast分别是111,850.81、123,498.63、173,992.88和194,895.25min*pg/mL。对于组1、2、3和4，平均AUCinf分别是118,022.48、130,377.44、177,755.35和206,317.05。用于剂量校正的组2的相对生物利用度用与用于AUClast的组3和4相比分别是7.1%和6.3%。用于剂量校正的组2的相对生物利用度用与用于AUCinf的组3和4相比分别是7.3%和6.3%。组2的AUC^t和无限性比组1高1.1倍。比较皮下途径AUQa3t的相对生物利用度，组3对组4是89.3%。比较皮下途径AUCM的相对生物利用度，组3对组4是86.2%。基于测试批准的以20吗剂量皮下给药的Forteo⑧的人类药物动力学数据，组2人类剂量全身暴露倍数分别是对于Cmax、AUCto和AUCirf的大约20、8.4和7.4倍。基于家兔的平均重量2.5kg以及家兔和人类的鼻表面积分别为30cr^和80cm2,本研究中鼻暴露是大约2倍。对于所有组，PTHl34的t^范围为大约43-55分钟。对于组1、2、3和4,平均t腿分别是35、20、20和10分钟。对于组l、2、3和4,Kel分别是0.018、0.017、0.016和0.014。在任何制剂的给药后没有观察到不良临床体征。基于C皿和AUC,本发明制剂的相对生物利用度为大约10%。因PYY3-36具有相似制剂基质活性而使用的在家兔中进行的其它鼻内研究也有大约19%生物利用度，并且当在人类中测试时结果为相似的生物利用度。因此，人类鼻内剂量为200吗，对比Forteo⑧皮下剂量为20jig。即使本发明的制剂有更高的Cmax、AUC和更快的Tmax,组1与组2、3和4相比有未预期的高吸收率，这与体外研究一致。通过皮下的途径给药，合成的PTHw4与重组的PTH卜34相比有更高的吸收率。在此研究中，用本发明的制剂达到的水平对于基于人类剂量20吗的C腿和AUQast大约是20和8.4倍。基于鼻表面积基础，本研究测试的剂量大约是2倍。因此，在14天毒性研究中选择的剂量50和250吗给出与用于鼻和全身暴露的人类剂量的合适的比较。实施例6PTHl34的PK研究进行本研究以确定特立帕肽(人类曱状旁腺激素1-34(hPTHw4))在选择的制剂中在家兔鼻内给药后的药物动力学类型。表5提供整个研究设计。基于先前对特立帕肽经鼻内滴入法给药的研究选择剂量水平。每个动物通过鼻内滴入法进入左鼻孔给药。在给药前，给药后5、10、20、30、45分钟和1小时(60分钟)，2小时(120分钟)和4小时(240分钟)，从耳缘静脉取血液样品。按照实验设计进行血液采样和处理，没有被认为对样品质量有影响的偏差。用蛋白酶抑制剂(抑肽酶)收集血液样品，处理以收集血清和血浆，并且冷冻和保存在-70°C直到分析。在研究中评估了特立帕肽的5种鼻制剂。表6提供了每种制剂的运输体组合物。本发明的鼻制剂是在NastechPharmaceuticalCompanyInc.(Bothell,WA)生产的。开发(血清和血浆)并验证(血清)酶免疫分析以检测家兔血样品中人类PTHw4的浓度。研究样品、标准品和质量控制样品用改良的HumanBioactivePTH-34ELISA试剂盒分析。标准品、样品和质量控制样品净皮加到抗生物素蛋白链菌素包被的长条孔，每个样品以双份分析。样品与生物素化的抗人类PTHw4抗体和轭合HRP的抗人类PTHl34抗体的混合物一起孵育。用试剂盒的洗液冲洗培养板并且每个孔加入TMB底物。在通过向每个孔加入1M硫酸终止反应前，允许颜色发展10分钟。每个孔的OD45()在吸光度读板机上测量，并且通过标准曲线的内插法计算浓度。分析性能是用质量控制样品监控的。用作为标准分析物的人类PTHw4和正常家兔血清和血浆，分析定量下限(LowerLimitofQuantification(LLOQ))被确定为7.8pg/mL。由于家兔和人类曱状旁腺激素的物种相似性，期望分析会检测内源的(即家兔的)曱状旁腺激素和家兔的PTHw4。药物动力学计算如上面描述的。PTH(假定代表家兔曱状旁腺激素和它的片断)在血清或血浆中的给药前浓度一般低于100pg/mL，其中几个样品被确定为<62.4pg/mL。样品体积的限制排除了重复分析以获得确定的结果和分析LLOQ。提供的值是获得的最低值(或估计值)，在此值没有进一步分析的可能。在5到60分钟的时间点，用于特立帕肽的单个动物血清和血浆水平超过100pg/mL。在最后的时间点，特别是240分钟，多数动物特立帕肽浓度<31.2pg/mL(为最后点，此处样品的体积不足以进一步评价)。因此特立帕肽的吸收和清除期通过用于本研究的取样时间框架捕获。制剂1/组1:组1动物的血清和血浆的Cmax、t^和AUCto结果大大超过基于剂量水平的期望值。组1中4只动物每只的给药前水平在期望值内，提示在此观察中动物的内源水平不是因素。动物#931在5和IO分钟有在期望范围内的血清和血浆中的特立帕肽水平。动物#932的5分钟时间点在期望范围内，然而给药后10分钟血浆的分析值>250,000pg/mL。对于两种动物在后继的时间点发现血清或血浆的浓度>30,000pg/mL。对于动物#933和#934,发现在所有给药后时间点的血清和血浆有〉30,000pg/mL的特立帕肽浓度。结果，对于多数动物，C觀〉45，000pg/mL以及W^300分钟。平均AUClast>7,000,000min*pg/mL。对于血清和血浆的29和20分钟的平均Tmax分别与鼻内给药的期望范围一致。然而30,000到几乎50,000pg/mL的所测Cmax比期望的最大浓度3000到5000pg/mL高出一个数量级。制剂2/组2:在血清中，组平均Qnax和T皿分别是4396pg/mL和36分钟。组平均t^是70.7分钟，然而，这被动物#935影响，其中计算的ti,2是198分钟；其它3只动物的t!/2是37.7、22.7和24.6分钟。平均AUClast是307213min*pg/mL。在血浆中平均C腿和AUC^分别是3819pg/mL和105144min*pg/mL。T腦x估计是9分钟以及11/2是66.9分钟。制剂3/组3:在血清中，C腿、T鍵、W2和AUQast分别是1224pg/mL、9分钟、53分钟和35111min*pg/mL。血浆中，C腿、T腿和AUClast分另'J是1102pg/mL、8分钟和53283min*pg/mL。平均t^估计是99.7分钟，然而，这是由于动物#939的长11/2(216.6分钟)。制剂4/组4:在血清中,C證、T證、11/2和AUQast分别是653pg/mL、35分钟、22.3分钟和30807min*pg/mL。在血浆中，这些相同参数分别是915pg/mL、35分钟、73.9分钟和56383min*pg/mL。制剂5/组5:在血清中,Cmax、Tmax、11/2和AUC,ast分别是549pg/mL、45分钟、57.6分钟和41489min*pg/mL。在血浆中，这些相同参数分别是734pg/mL、41分钟、48.8分钟和23710.9min*pg/mL。组1给药后数据显示未期望的高浓度和缺少清楚的清除期。这会与收集操作中一般溶液的污染和不依赖剂量给药的浓度一致。对于组3和组5，在给药后的每个时间点特立帕肽的平均浓度在血清和血浆间是相似的。血清和血浆间的浓度对时间的曲线形状也是相似的。在组2中，血清和血浆的特立帕肽的峰浓度是相似的，但是注意到在后面的时间点血清有更高的浓度。对組4,与血清相比，在后面的时间点特立帕肽的血浆浓度更高；在给药后的早期时间点，发现血清和血浆中相似的浓度。总之，这些结果提示或者血浆或者血清可以是用于确定在剂量给药后特立帕肽浓度的合适基质。算，然而考虑到此组获得的数据，任何比较被认为是不适当的。作为替代，以上早先研究的数据被搜集以获得Q^和AUdw值。虽然这些研究的制剂成分是稍有不同，主要成分-甲基-卩环糊精、二癸酰磷脂酰胆碱、乙二胺四乙酸二钠和苯曱酸钠-有与制剂1相似的浓度。使用对于C籠和AUdast收集的数值，对于每个鼻内的制剂/组计算特立帕肽的比较生物利用度。对于制剂2/组2，C腿和AUCto与收集的数据大致相等(血清)或稍高于(血浆)收集的数值，提示相当的生物利用度。对于制剂2，主要的不同是二癸酰磷脂酰胆碱的浓度被降低到0.1mg/mL(从1.0mg/mL)。剂量制剂3在半剂量体积给药，但包含6.6mg/mL特立帕肽以获得同样的总剂量。增加曱基-P环糊精、二癸酰磷脂酰胆碱和乙二胺四乙酸二钠的浓度；苯曱酸钠保持在同样的浓度。制剂3的比较生物利用度对于血清和血浆大约都为40%。制剂4包含FORTEO⑧(一种特立帕肽皮下给药的形式)的所列的浓度的成分。制剂5是移去m-曱酚的这种制剂。组4(制剂4)和组5(制剂5)的相对生物利用度对于血清和血浆大约为30%-35%。数据显示m-曱酚不明显影响特立帕肽的生物利用度。这些结果显示二癸酰磷脂酰胆碱的浓度能从1.0mg/mL降低到0.1mg/mL,且没有显著地降低生物利用度。增加特立帕肽和吸收促进剂的浓度对生物利用度有明显的负面影响。这样的降低的原因可与由于减少的体积而减少的与鼻粘膜接触的面积有关。在没有吸收促进剂的情况下，相对生物利用度进一步降低。这种降低的生物利用度被期望是由于某些特定渗透促进剂的缺乏，并且也与体外渗透数据一致。皮下注射是最常用于特立帕肽的非临床研究的给药途径，而且是批准用于临床的唯一途径。对于组2，5%到17%中的相对生物利用度与早先估计的6-10%—致。增加特立帕肽和吸收促进剂的浓度(组3)降低相对生物利用度到2-5%。在没有吸收促进剂的情况下(组4和5),特立帕肽的相对生物利用度约为2-3%。实施例7人类中PTHu4的PK研究此研究的主要目的是在两个剂量水平评估本发明在鼻喷雾中3种制剂的吸收；在两个剂量水平评估这些制剂的安全性并且在两个剂量水平比较皮下给药的Forsteo与这些制剂的生物利用度。这是I期，与包括6名健康男性和6名健康女性志愿者的剂量范围研究交叉。有如下的5个研究阶段阶段l:所有的12名受试者接受皮下给药的Forsteo20吗。阶段2:6名受试者(3名男性和3名女性)接受500吗的制剂#2以及6名受试者(3名男性和3名女性)接受500吗的制剂#3。在给药后4小时下降的总4丐水平结果被用于确定在以下阶段4和5中这些制剂的纟会药剂量如果在给药后4小时接受给予的制剂的6名受试者没有一名有>3mmol/L(12.0mg/dL)的总4丐水平，则在阶l爻4或5中制剂的所有剂量在1000(xg。如果在给药后4小时接受给予制剂的6名受试者中的单个受试者有〉3mmoI/L(12.0mg/dL)的总钓水平，那个受试者在阶段4和5中只接受500吗剂量的制剂2和3。如果在给药后4小时接受给予的制剂的6名受试者中两名或更多有>3mmol/L(12.0mg/dL)的总钩水平，则在阶段4或5中所有受试者接受那种制剂的500pg剂量。阶段3:所有受试者接受制剂#11000吗。阶段4:如上所述，所有受试者接受制剂#2的剂量或者在500吗或者在1000jag。阶段5:如上所述，所有受试者接受制剂#3的剂量或者在500吗或者在1000ng。乂t人第一天到所有研究活动完成的给药第5天(DosingDay弁5),受试者被限定在研究中心。安全鉴定包括生命体征、临床实验评价、鼻耐受性以及不良事件。用于特立帕肽水平的PK分析的血液样品通过留置导管和/或通过直接静脉穿刺收集。这些样品会在给药后O(即第一次给药前(pre-first-dose))、5、10、15、30、45、60、90分钟和2、3和4小时后收集。在每个时间点，会收集7ml血液样品。通过验证的分析方法确定特立帕肽的血浆浓度。虽然为了清楚理解已经通过举例的方式详细描述上述发明，但是对于技术人员显而易见的是，某些改变和修改包括在本
发明内容，并且在附加的权利要求的范围之内没有过度的实验就可以实施，所述权利要求通过说明的而不是限定的方式存在。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表4:毒物代谢动力学动物的给药组<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表5:用于药物动力学评价的给药组<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表6:用于制剂l-5的运输体组合物成分mg/mL(%w/v)制剂1_曱基-P-环糊精二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)乙二胺四乙酸二钠，USP苯曱酸钠，NF氢氧化钠，USP盐酸，NF用于冲洗的无菌水，USPpH=4.5_制剂2曱基-P-环糊精45(4.5)二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)0.1(0.01)乙二胺四乙酸二4内，USP1.0(0.1)笨曱酸钠，NF4.0(0.4)氩氧化钠，USPTAP盐酸，NFTAP用于冲洗的无菌水，USPq.spH=4.5_制剂3曱基-p-环糊精二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)乙二胺四乙酸二钠，USP苯曱酸钠，NF氩氧化钠，USP盐酸，NF用于冲洗的无菌水，USPpH=4.5_制剂4甘露醇，USP30.8(3.08)m陽甲酚3.0(0.3)冰醋酸，USP0.42(0.042)无水醋酸钠，USP0.1(0.01)氢氧化钠，USPTAP盐酸，NFTAP用于冲洗的无菌水，USPq.spH=4.0_制剂5_甘露醇,USP30.8(3.08)冰醋酸，USP0.42(0.042)无水醋酸钠，USP0.1(0.01)氢氧化钠，USPTAP盐酸，NFTAP用于冲洗的无菌水，USPq.spH=4.0_TAP二加入以调节终pH5<q力.qAA4114TT3-274o刀力AA91r44-TT权利要求1.一种用于跨粘膜细胞层递送PTH的制剂，其包括PTH和增强剂的混合物，其中所述增强剂能够调节细胞紧密连接的屏障作用。2.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述混合物进一步包括一种分子，其能在软骨细胞阻断PTH的活性。3.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述增强剂包括一种增溶剂，其选自环葡聚糖、羟基丙基-(3-环葡聚糖、磺基丁基醚-(3-环葡聚糖和曱基-p-环糊精。4.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述增强剂包括一种螯合剂，其选自乙二胺四乙酸和乙二醇四乙酸。5.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述增强剂包括一种或多种多元醇。6.根据权利要求5所述的PTH制剂，其中所述多元醇选自蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤鲜糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、海藻糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油和聚乙二醇。7.根据权利要求6所述的PTH制剂，其中所述多元醇是乳糖和山梨醇。8.根据权利要求1所述的PTH制剂，其进一步包括一种或多种表面活性剂。9.根据权利要求8所述的PTH制剂，其中所述表面活性剂选自非离子聚氧乙烯醚、胆盐、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸盐、夫西地酸及其衍生物、牛磺二氢甾酸霉素钠、L-a-二癸酰磷脂酰胆碱、聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚乙二醇、十六烷醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羊毛脂醇和失水山梨醇单油酸酯。10.根据权利要求9所述的PTH制剂，其中所述表面活性剂是L-a-二癸酰磷脂酰胆碱。11.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述增强剂是PN159或PN159的类似物。12.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述混合物进一步包括水和防腐剂，所述防腐剂选自三氯叔丁醇、对羟基苯曱酸曱酯、对羟基苯曱酸丙酯、对羟基苯曱酸丁酯、氯化苯曱烃铵、氯化千乙氧铵、苯甲酸钠、山梨酸、苯酚，或邻、间或对曱酚。13.根据权利要求12所述的PTH制剂，其中所述制剂具有大约3到大约6的pH。14.根据权利要求1所述的PTH制剂，其中所述PTH分子选自序列NO:1、序列NO:2、序列NO:3,以及类似物或模仿物。15.根据权利要求14所述的PTH制剂，其中所述PTH分子与一种或多种聚烯化氧聚合物轭合。16.根据权利要求15所述的PTH制剂，其中所述聚烯化氧聚合物是聚乙二醇。17.根据权利要求16所述的PTH制剂，其中所述聚乙二醇具有在0.3和60千道尔顿之间的分子量。18.—种对人类递送PTH的方法，其包括将粘膜细胞层暴露于PTH和增强剂的混合物，其中所述增强剂能够调节细胞紧密连接的屏障作用。19.根据权利要求18所述的递送PTH的方法，其中所述方法使用非注射用的给药。20.根据权利要求19所述的递送PTH的方法，其中所述给药方法选自鼻内的、口腔的、胃肠的、阴道的和经皮肤的给药方法。21.根据权利要求20所述的递送PTH的方法，其中所述方法是鼻内的给药。22.根据权利要求21所述的递送PTH的方法，其中所述鼻内的给药包括递送气溶胶，所述气溶胶包括大小在1和700微米之间的小滴。23.根据权利要求21所述的递送PTH的方法，其中所述鼻内的给药包括递送气溶胶，所述气溶胶包括每kg患者体重大约0.7到大约25吗的PTH。24.根据权利要求23所述的递送PTH的方法，其中所述鼻内的给药包括递送气溶胶，所述气溶胶包括50到800吗PTH。25.根据权利要求19所述的递送PTH的方法，其中所述方法是口部的递送。26.根据权利要求25所述的递送PTH的方法，其中所述口部的递送是控制释放递送，其中Tmax从释放的时间开始少于40分钟。27.—种治疗人类骨质疏松症或骨量减少的方法，其包括给予PTH和增强剂的混合物，其中所述增强剂能够调节细胞紧密连接的屏障作用。28.根据权利要求27所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述给药方法选自鼻内的、口腔的、胃肠的、阴道的和经皮肤的给药方法。29.根据权利要求27所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述给药引起PTH的血清水平，其具有少于40分钟的Tmax。30.根据权利要求27所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述给药引起高于背景的PTH的血清水平持续少于4个小时。31.根据权利要求27所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述给药是鼻内给药。32.根据权利要求31所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述鼻内的给药包括递送气溶胶，所述气溶胶包括每kg患者体重大约0.3到大约30吗的PTH。33.根据权利要求31所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述鼻内的给药包括递送气溶胶，所述气溶胶包括0.5到1.0mgPTH/0.1ml的溶液。34.根据权利要求33所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述鼻内的给药以0.1到24小时之间的剂量频率给予。35.根据权利要求33所述的治疗骨质疏松症或骨量减少的方法，其中所述鼻内的给药包括以下步骤(a)用PTH溶液注满鼻腔喷雾泵装置；(b)起动所述喷雾装置；(c)移去存在于所述喷雾装置外部的喷雾小滴；(d)倾斜直到所述喷雾装置与鼻道在一条直线上；以及(e)喷射所述溶液进入鼻道。36.—种药学组合物产物，其包括(a)PTH肽的水溶液，其具有足以产生治疗有效血浆浓度的浓度；(b)容器，所述组合物放置其中，及；(c)传动器，其与所述容器液体连通，能够产生气溶胶，所述气溶胶在传动时从所述溶液的顶端喷射出，其中所述气溶胶当在距离传动器顶端0.5cm和10cm之间的高度测量时具有在l.OO和1.40之间的椭圓率的喷路。37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述传动器产生气溶胶，所述气溶胶具有在l.OO和1.30之间的椭圓率。38.根据权利要求36所述的组合物，其中每次传动所述气溶胶包括在20和200樣i升之间的溶液。39.—种药学组合物产品，其包括(a)PTH肽的水溶液，其放置于容器中；液的气溶胶，其中所述气溶胶具有喷路，当在距离传动器顶端0.5cm和10cm之间的高度测量时，其具有在IO和50mm之间的主轴和短轴。40.根据权利要求39所述的组合物，其中每次传动所述气溶胶包括在20和200微升之间的溶液。41.一种药学组合物产物，其包括(a)PTH肽的水溶液，其具有足以产生治疗有效血浆浓度的浓度，并包括在容器中；以及(b)传动器，其与所述容器液体连通，当传动时能够产生所述溶液的气溶胶，其中所述气溶胶包括所述PTH溶液的小滴，并且少于10%的小滴的大小小于IO微米。42.根据权利要求41所述的组合物，其中通过传动器的传动产生的所述气溶胶包括在20和200微升之间的溶液。43.—种药学组合物产物，其包括(a)PTH肽的水溶液制剂，其在容器中，及；(b)传动器，其与所述容器液体连通，其中当传动时，所述溶液的气溶胶通过所述传动器的顶端产生，其中所述气溶胶包括所述溶液的小滴，其中所述小滴的大小在25和700微米之间。全文摘要本发明描述药学组合物和方法，其至少包括甲状旁腺激素肽(parathyroidhormonepeptide)(PTH)，优选地PTH_1-34，以及一种或多种增强PTH的鼻粘膜递送的粘膜递送增强剂，用于治疗或预防优选为人类的哺乳动物主体中的骨质疏松症或骨量减少。文档编号A61K9/127GK101151048SQ200580023137公开日2008年3月26日申请日期2005年5月10日优先权日2004年5月10日发明者M·S·克勒佩,亨利·R·康斯坦丁诺,史蒂文·C·夸伊,李静媛申请人:纳斯泰克制药公司