治疗阿尔茨海默病的环孢菌素的制作方法
专利名称：治疗阿尔茨海默病的环孢菌素的制作方法
技术领域：
本发明涉及环孢菌素的新用途，特别是非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素的新的药物用途。
背景技术：
环孢菌素A(CsA)与抑免蛋白例如亲环蛋白(CyP)结合，而同为抑免蛋白结合化合物的FK506和雷帕霉素与FK506结合蛋白质(FKBP)结合。尽管抑免蛋白结合是必需的，但其对这些药物的免疫抑制活性是不足的。观察到药物/抑免蛋白复合物与第三效应物蛋白质相互作用时的生物效应。例如，CyP-CsA和FKBP-FK506复合物抑制钙调磷酸酶的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，由此阻断细胞因子如白介素-2、4的产生。另一方面，FKBP-雷帕霉素复合物抑制称为FRAP(也称为RAFT或mTOR)5的激酶，该激酶参与白介素-2受体介导的T细胞增殖。
已从链霉菌属物种(Streptomyces sp.)A92-308110中分离出被称为sanglifehrin的新一类化合物。在目前分离的20种不同的sanglifehrin中，sanglifehrin A(SFA)是最为丰富的化合物，并显示出有效的免疫抑制活性。SFA代表作用方式与所有其它已知的抑免蛋白结合化合物(即CsA、FK506和雷帕霉素)均不同的新型免疫抑制剂。已显示SFA在线粒体转换孔道(MTP)复合物中以与另一抑免--蛋白亲环蛋白A(CpA)不同的结合位点直接结合抑免蛋白--亲环蛋白D(CyD)并抑制MTP开放。
在欧洲专利no.484281中描述了非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素及其治疗和预防AIDS和AIDS相关紊乱的用途，其中包括对环孢菌素类化合物、它们的命名法和作用方式的一般描述。将EP 0,484,281 B的公开内容，特别是上文涉及的一般描述和下文涉及的其它部分的描述包括在本申请的说明中作为参考。
令人惊奇的是，现已发现与亲环蛋白结合但没有免疫抑制性的环孢菌素可作为神经保护剂用于治疗包括(但不仅限于)阿尔茨海默病(“AD”)的与Aβ产生和/或分泌相关的病理状态。AD表征为脑中淀粉状蛋白斑(主要由Aβ的40或42个氨基酸的肽组成)的胞外堆积。这些肽的细胞外堆积是该疾病的病理学标志(Selkoe 1999)。这些Aβ肽通过内切蛋白酶解切割广泛表达的I型跨膜蛋白质--淀粉样前体蛋白(APP)产生(Selkoe 1999；Sisodia 2000)。在淀粉生成通路中切割APP的两种酶被称为β-分泌酶和γ-分泌酶，其分别从N末端和C末端切割APP。在该通路中，β-分泌酶(BACE1)是切割APP的第一个酶，产生分泌的sAPPβ片段和结合膜的C末端片段(CTF，C99)(Vassar、Bennett等人1999)。C99片段是γ-分泌酶复合物(GACE)的底物，所述复合物切割C99产生Aβ和AICD(APP胞内结构域)。AICD结合含有Tip60和Fe65的复合物，该复合物抑制NFκ-B通路中的基因KAI1(四跨膜蛋白(tetraspanin)细胞表面分子)(Baek、Ohgi等人，2002)。GACE复合物由四个基本组分早老蛋白1(PS1)、呆蛋白(NCSTN)、Aph1和Pen2(Edbauer、Winkler等人，2003；Kimberly、LaVoie等人2003)组成。PS1功能同系物--早老蛋白2(PS2)促成细胞中～20％的Aβ产生(Kimberly、Xia等人，2000)。尽管这四种组分是必需的并且足以重建GACE活性，有非GACE介导的APP切割引起Aβ产生的证据(Tesco、Koh等人2003)，(Nunan、Shearman等人2001)。
发明内容
阐明APP通路涉及的新基因是确定该疾病的完整病因学以及更好理解促使Aβ产生的复杂机制的关键步骤。调节Aβ的新基因和通路的确定有助于开发治疗该疾病进展的新治疗策略。若干遗传连锁和染色体区域与迟发性阿尔茨海默病(LOAD)(＞65岁发病)特异地关联(Ertekin-Taner、Graff-Radford等人，2000)、(Bertram、Blacker等人，2000)、(Scott、Hauser等人，2003)。在共同未决的USSN 中描述了LOAD关联基因的亚型和参与APP加工的新基因，其中包括对用来检测cDNA克隆调节CHOK1细胞中Aβ产生能力的大规模功能性筛选的描述。将该USSN_的公开内容，特别是鉴定修饰Aβ分泌的基因和后文所述的其它部分的描述包括在本申请的说明中作为参考。
作为细胞中Aβ产生关键性调节物的抑免蛋白通路基因的发现提供了合适的阿尔茨海默病药物靶标。功能性筛选中发现的涉及抑免蛋白通路的一些cDNA包括Map激酶4、钙调蛋白、酸性神经酰胺酶和TOB3(一种AAA-腺苷三磷酸酶)。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，又称胞外信号调节激酶(ERK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其磷酸化并正调节或负调节起始信号级联放大事件的靶底物。ERK应答广泛的刺激将信号从细胞膜转导至细胞核并在调节基因表达、有丝分裂、增殖、运动性、代谢和细胞凋亡中起到重要作用(Wada和Penninger 2004)。MEK和ERK活性的抑制剂显示抑制APP分解代谢。此外，MAPK可以激活JNK并引发细胞凋亡--已知提高Aβ产生的过程(Tesco、Koh等人，2003)。尽管不希望受到理论束缚，MAPK4cDNA可通过APP分解代谢或激活细胞凋亡起作用。
APP胞内结构域(AICD)片段还与连接MAP激酶通路与APP加工的cJun N末端激酶(JNK)相互作用(Scheinfeld、Roncarati等人2002)。MAPK4是激活JNK的ERK，因此过表达MAPK4可引起JNK的超活化，其可增加JNK-AICD相互作用引起增加Aβ产生。也可能JNK的激活诱导细胞凋亡。或者，MAPK4可改变APP的磷酸化状态，已显示所述APP的磷酸化状态通过影响APP运输和破坏PS1/β-联蛋白相互作用影响其由β-分泌酶和α-分泌酶优先的加工(Hung和Selkoe 1994)，(Walter、Capell等人，1997)。另外，还显示细胞的磷酸化状态对PS1活性是关键的(Seeger、Nordstedt等人1997)。JNK激活和蛋白质磷酸化也是MAPK4能够起作用以提高Aβ产生的若干其它通路。
筛选中鉴定的另一基因为钙调蛋白。钙调蛋白是环-螺旋-环Ca2+结合蛋白质，其通过与包括CaMKII、CaMKIV、钙调磷酸酶、血影蛋白A2、p21和神经元氧化氮合酶的特定的靶蛋白质相互作用转导Ca2+信号(Means1981)。当Ca2+结合钙调蛋白时，其经历构象变化使其能够与靶蛋白质结合并刺激或抑制靶蛋白质活性。在无细胞制剂和完整细胞中使用钙调蛋白拮抗剂W-7和三氟拉嗪已显示，钙调蛋白调节Aβ产生。这些已知的钙调蛋白活性的抑制剂也可抑制Aβ产生(Desdouits、Buxbaum等人，1996)。因此，胞内Ca2+浓度和/或钙调蛋白的靶蛋白质可影响APP加工。这一综合数据验证了当过表达钙调蛋白时观察到提高Aβ产生的事实。
Ca2+失调，特别是细胞质中Ca2+水平的下降与PS1 FAD突变相关的Aβ产生的提高相伴发生(Yoo、Cheng等人，2000)。PS1 FAD突变可显著消弱容量性钙内流(CCE)并储存消耗激活的电流(depletion-activatedcurrents)，提示降低的CCE可提高Aβ产生(Yoo、Cheng等人，2000)。在筛选中发现钙调蛋白基因的过表达还可引起胞内钙水平的降低，并可预防足够的CCE。可能胞内Ca2+的减少可直接或间接提高PS1活性，引起从细胞分泌更多的Aβ。以下详述的数据表明SFA有效地抑制Aβ40和Aβ42产生并抑制C99和刻缺蛋白切割，说明γ分泌酶活性通过抑免蛋白CyD与Ca2+体内稳态相关。
另一基因--人酸性神经酰胺酶催化神经酰胺水解为鞘氨醇和脂肪酸(Ferlinz、Kopal等人，2001)。神经酰胺作为大部分鞘脂的前体，并且是在大量不同细胞类型中(通常是通过胱天蛋白酶-3激活)诱导细胞凋亡的信号分子。积累的神经酰胺水平与阿尔茨海默病相关，并被认为是老化的AD脑中氧化神经毒性通路的一部分。过表达神经酰胺提高Aβ产生使神经酰胺酶切割与Aβ相关联。由于神经酰胺似乎通过细胞凋亡起作用，可能酸性神经酰胺酶也促进细胞凋亡。
已显示细胞的神经酰胺状况同时调节BACE的稳定性和Aβ的生物发生(Puglielli、Ellis等人2003)。先前的研究证明高水平的神经酰胺可以通过不依赖于细胞凋亡的方式增加Aβ分泌(Puglielli、Ellis等人2003)。过表达神经酰胺酶将降低神经酰胺水平，并且可能改变膜流动性地提高鞘氨醇和游离脂肪酸(FFA)水平，是已知的改变τ蛋白(tau)磷酸化和Aβ聚合作用的方法(Wilson和Binder 1997)。尽管机制尚不清楚，可能神经酰胺酶能够影响FFA水平引起改变的APP加工和更多Aβ产生和/或分泌。
TOB3是执行分子伴侣样功能的AAA-腺苷三磷酸酶，有助于包括蛋白质分泌的蛋白质复合物的装配、操作或解装配(Strausberg、Feingold等人，2002)。该类蛋白质作为被组成型加工的蛋白质帮助维持内质网(ER)的完整性。在缺少AAA-腺苷三磷酸酶活性时，错误折叠蛋白质的过度累积引起ER膨胀和细胞死亡(Kobayashi、Tanaka等人，2002)。过表达TOB3提高Aβ分泌的最可能的解释与其影响蛋白质折叠和在ER中运输的能力相关。如果刺激这一过程，如通过TOB3过表达，可能将提高APP加工。
我们的筛选数据已经显示过表达TOB3改变APP加工引起更多Aβ产生和更少的C99和C83 C末端片段。与HEK 293细胞相比，TOB3表达还在N2A细胞中更大程度降低APP和sAPPα水平(数据未显示)。这提示TOB3影响APP加工机器中一个或多个组分，引起提高的APP和C99切割。由于TOB3参与蛋白质的运输和加工，目前正在确定TOB3在APP加工中的确切机制和特异性。
功能性筛选中鉴定的另一cDNA--羧肽酶Z(CPZ)连同CPE和CPD一起是金属羧肽酶基因家族的成员，认为它们在生物活性肽和蛋白质分泌之前的胞内加工中起作用。CPZ由于含有与Wnt和无翅蛋白质结合的功能性N末端富含半胱氨酸卷曲结构域，是独特的羧肽酶，所述无翅蛋白质是Wnt信号转导的关键组分(Moeller、Swindell等人，2003)。
另一值得注意的cDNA为亲环蛋白D(CyD，也被称为CyF。命名法参考Current Medicinal Chemistry，2003，10，1485-1506 1485 Cyclophilin Das a Drug Target，Waldmeier等人)。发现CyD参与Aβ产生。亲环蛋白如CyD是涉及蛋白质运输和成熟的肽基脯氨酰异构酶。除CyD独自定位于线粒体基质中之外，亲环蛋白主要定位在细胞质中(Waldmeier、Zimmermann等人2003)。过表达CyD时，其能够稳定内源PS1 N末端片段(NTF)。AD脑的普遍损伤是存在由异常磷酸化的τ蛋白--一种微管结合蛋白质组成的胞内神经原纤维缠结(Johnson和Bailey 2002)。过表达APP时，CyD能够提高胱天蛋白酶-3的活性，指示调节Aβ分泌的可能机制。这些结果提示当过表达时，CyD是通过γ-分泌酶通路切割APP和C99所必需的重要因子。
一方面，CyD是线粒体通透性转换孔道的内在组份，其被认为与腺嘌呤核苷酸易位体结合并调节孔道开放(Waldmeier、Zimmermann等人，2003)。线粒体膜的通透性是引起消耗线粒体膜电位、释放致凋亡蛋白质和以凋亡细胞死亡告终的细胞应激的结果(Waldmeier 2002)。
已提示线粒体衰竭在唐氏综合征患者的AD神经病理学发展中通过促进异常的β-APP加工和Aβ的细胞内积累起到显著的作用(Busciglio 2002)。还显示细胞内钙水平的提高引起细胞内Aβ的积累(LaFerla 2002)。令人惊奇地，全长APP不仅沿分泌途径运输，而且在转基因小鼠AD模型的脑中靶向培养的皮质神经细胞的线粒体。β-APP在线粒体膜上的不完全易位和累积能够引起线粒体机能障碍，还能够在AD的发病机理中起重要作用(Anandatheerthavarada、Biswas等人2003)。已知过表达线粒体蛋白质能够引起基质中形成不溶聚集物(例如解偶联蛋白质-3，UCP3)。这些聚集物能够扰乱线粒体的正常功能并提高内膜的被动通透性。CyD可在线粒体处理过量APP或C末端片段的加工中起到重要作用。
CyD是免疫抑制剂药物例如环孢菌素的已知靶标。这些化合物封闭线粒体通透性转换(MPT)并预防细胞凋亡(Samantha J.Clarke 2002；Waldmeier 2002)。还已知FK506化合物与抑免蛋白结合但不与CyD结合(Uchino 2003)。
如果环孢菌素与人重组亲环蛋白的结合在由Quesniaux于Eur.J.Immuno1.1987，17，1359-1365中所述的竞争性酶联免疫吸附测定中至少占环孢素(又称为环孢菌素A)结合的1/5，则认为其与亲环蛋白结合。该测试中，在亲环蛋白与包被的BSA-环孢菌素的孵育期间添加待测环孢菌素，并计算不含竞争剂的对照反应产生50％抑制所需的浓度(IC50)。结果表达为结合比(BR)，是测试化合物的IC50和在类似测试中使用环孢素代替测试的环孢菌素的IC50比值的以10为底的对数。因此1.0的BR指测试化合物与亲环蛋白质的结合是环孢菌素的十分之一强度，负值表示比环孢菌素结合更强。
作为神经保护剂起作用的环孢菌素具有低于0.7的BR(由于log105＝约0.7)，优选地等于或低于零。
当环孢菌素在混和淋巴细胞反应(MLR)中的活性少于环孢菌素活性的5％，优选少于2％时，认为其是非免疫抑制的。混和淋巴细胞反应由T.Meo描述于《(Immunological Methods)》，L.Lefkovits和B.Peris编辑，AcademicPress，N.Y.227-239页(1979)。将来自Balb/c小鼠(雌性，8-10周)的脾细胞(0.5×106)与来自CBA小鼠(雌性，8-10周)的0.5×106辐射(2000拉德)或丝裂霉素C处理的脾细胞共孵育5天。被辐射的同种异型细胞在Balb/c脾细胞中诱导增殖应答，所述应答可以通过将标记的前体参入DNA得到测量。由于刺激物细胞是被辐射的(或丝裂霉素C处理的)，它们不以增殖应答Balb/c细胞而是保持它们的抗原性。将MLR中测试化合物建立的IC50与平行实验中环孢素建立的IC50相比较。
已发现在上述MLR中判断为非免疫抑制的化合物在IL-2报道基因测定中常常是无活性的，因此可使用IL-2报道基因测定，如作为初级筛选，选择本发明使用的非免疫抑制的亲环蛋白结合化合物。
作为治疗与Aβ分泌相关病理状态的活性物质(例如作为AD中淀粉样蛋白斑细胞外积累的抑制剂)起作用的非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素化合物在下文中被称为“活性化合物”。
因此活性化合物可用于治疗任何与Aβ肽分泌、内源PS1 N末端片段表达(NTF)或提高的γ-分泌酶活性相关的临床病症。活性化合物还可用于治疗与提高Aβ分泌的细胞凋亡相关的病症。Aβ肽形成和随后的聚集不仅是AD的标志，而且是其它神经学疾病如帕金森病、亨廷顿病和其它系统性淀粉样变性的必需部分(Selkoe 1989；Price、Borchelt等人1993；Citron、Vigo-Pelfrey等人1994)。这些结果清楚表明细胞凋亡与Aβ产生是固有相联系的。
活性化合物还能够调节不在脑中表达的“外周Aβ调节物”。外周淀粉样变性能够引起诸如心和皮肤淀粉样变性这样的表型(Yamaguchi、Yamazaki等人1992)、(Selkoe 1989)。如果发现外周Aβ的调节物，还可能得出新的疗法例如阻止穿透血脑屏障需要的靶标。降低外周Aβ水平显示降低转基因小鼠脑中Aβ水平，引起更少的空斑形成(Bohrmann、Tjernberg等人1999；DeMattos、Bales等人2002)。
发现许多活性化合物，特别是在4和/或5位，具有与环孢素不同的结构。可能与环孢素不同的活性化合物的其它位置为6和7位。
一组活性化合物是其中4位的MeLeu基团被不同的N-甲基化氨基酸，例如y-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeTyr或MeTyr(O-PO(OH)2)或Pro取代的环孢菌素。除MeIle和MeThr外，也可使用异型MeaIle和MeaThr。异型中，β-位的立体化学具有与天然氨基酸相反的构象，从而普通形式和异型形成一对非对映异构体。
另一组活性化合物是其中5位的Val被N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸取代。优选的N-烷基化的氨基酸为Val或Leu。优选[Val]5亚氨基的氢被非支链C1-6烷基，优选甲基、乙基或正丙基，特别是甲基取代。后一组优选的活性化合物是全新的。
额外地或可选地，某些活性化合物可以在1、2、3和/或6位上与环孢素不同。
用于本发明的活性化合物的具体类型为式A的环孢素衍生物及其可药用盐 其中B为式B的氨基酸残基
其中a表示连接位置2的αAbu残基的键；b表示连接位置4的C残基的键；Alk代表含有2到6个碳原子的直链或支链亚烷基或含有3到6个碳原子的环亚烷基，且R代表羧基或烷氧基羰基；-NR1R2基，其中R1和R2是相同或不同的并且代表氢、烷基、C2-4链烯基、C3-6环烷基、苯基(任选地由卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代)或苯甲基或含有5或6个环原子及1到3个杂原子的饱和或不饱和杂环基，或其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和的杂环，所述杂环含有4到6个环原子和任选地含有选自氮、氧或硫的其它杂原子并任选地由烷基、苯基或苯甲基取代；下式的原子团 其中R1和R2如上定义，R3代表氢或烷基且n为从2到4的整数，且其中烷基表示含有1到4个碳原子的直链或支链烷基；C为MeLeu或4-羟基-MeLeu。
在公开的国际专利申请WO 98/28328、WO 98/28329和WO 9828330中进一步描述该类环孢素衍生物。特别优选的此类化合物为式A的化合物，
其中B为氨基酸残基B’ 且C为氨基酸残基4-羟基-MeLeu。
特别优选的活性化合物组是由式I的化合物及其可药用盐组成 其中W为MeBmt、二氢-MeBmt或8’-羟基-MeBmt；X为αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)；R为Sar或(D)-MeAla；Y为MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeTyr、MeTyr(O-PO(OH)2)、MeaIle或MeaThr或Pro；Z为Val、Leu、N-Alk-Val或N-Alk-Leu，其中Alk代表Me或如下取代的Me由乙烯基取代的Me，所述乙烯基任选地由苯基或含有6个环原子数的N、S或O杂芳香基取代，或由苯基取代的Me，所述苯基任选地由卤素取代；并且Q为MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
基团W、X、Y、Z和Q独立地具有如下优选的含义优选地，W为W’，其中W’为MeBmt或二氢-MeBmt；优选地，X为X’，其中X’为αAbu或Nva，更优选X”，其中X”为αAbu；优选地，Y为Y’，其中Y’为γ-羟基-MeLeu、MeVal、MeThr、MeAla或MeTyr(O-PO(OH)2)；
优选地，Z为Z’，其中Z’为Val或MeVal；和优选地，Q为Q’，其中Q’为MeLeu。
一组特别优选的活性化合物为式I的化合物，其中W为W’，X为X’，Y为Y’，Z为Z’且Q为Q’。
特别优选的式I的活性化合物为a)[二氢-MeBmt]1-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；b)[MeVal]4-环孢素；c)[MeIle]4-环孢素；d)[MeThr]4-环孢素；e)[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；f)[Nva]2-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；g)[γ-羟基-MeLeu]4-[γ-羟基-MeLeu]6-环孢素；h)[MeVal]5-环孢素；i)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-环孢素，orj)[8’-羟基-MeBmt]1-环孢素.
m)[N-苯甲基-Val]5-环孢素，n)[N-5-氟-苯甲基-Val]5-环孢素，o)[N-烯丙基-Val]5-环孢素，p)[N-3-苯基-烯丙基-Val]5-环孢素，q)[Pro]4-环孢素特别优选的活性化合物为[MeIle]4-环孢素和[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素，最优选[MeIle]4-环孢素。
除式I的化合物外，优选的活性化合物还包括，例如r)[γ-羟基-MeLeu]9-环孢素。
可获得活性化合物的方法包括1)发酵2)生物转化3)衍生
4)半合成5)全合成。
这些方法被普遍地描述，并且在EP 0484281 B的实施例1到10中和美国专利No.5767069中更具体地描述了这些方法。在本申请中引入这些概述和这些实施例的教导作为参考。EP 0484281 B的实施例11描述了与环孢素有关的代表性活性化合物的免疫抑制和亲环结合活性的测量，且该实施例的教导也被包括在本申请的公开内容中。
因此本发明提供了非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素在制备用于治疗或预防与Aβ分泌相关病理状态的药物中的用途，所述病理状态包括例如阿尔茨海默病、帕金森病、τ蛋白病(tauopathies)、朊病毒病、额颞型痴呆、纹状体黑质变性、卢伊体痴呆、亨廷顿病、皮克病、淀粉样变和其它与过量Aβ产生相关的神经变性病症。
本发明还提供用于治疗或预防与Aβ分泌相关病理状态的方法，所述病理状态包括例如阿尔茨海默病、帕金森病、τ蛋白病、朊病毒病、额颞型痴呆、纹状体黑质变性、卢伊体痴呆、亨廷顿病、皮克病、淀粉样变和其它神经变性病症，所述方法包括对所述患者施用有效量的本发明的活性化合物。
可以通过任何常规途径，特别是经肠地，例如以饮用溶液、片剂或胶囊形式口服地；或非经肠地，例如以注射液或悬液形式施用活性化合物。静脉内注射途径的每日指示剂量可以是从1到20mg/kg，优选从3到10mg/kg，而口服途径的每日指示剂量为从1到50mg/kg，优选从10到30mg/kg。
活性化合物的毒性被认为低于环孢素。由于活性化合物是非免疫抑制的，避免了环孢素与免疫抑制相关的某些副作用。其它与环孢菌素相关的副作用，特别是长期使用时的肾毒性和中枢神经系统毒性均有利地低于环孢素。
用于活性化合物的优选的盖伦制剂包括那些基于如英国专利申请2222 770A中所述的微乳，其包括局部及口服的形式；还包括如英国专利申请2 209 671A所述从含有脂肪酸糖单酯(例如蔗糖单月桂酸酯)的固溶体获得的口服和可注射的形式。适用于口服施用的单位剂型包括例如每剂从25到200mg活性化合物。
在这里引入EP 0484281 B的制剂实施例A、B、C和D作为参考在英国专利申请2 222 770中有这些制剂各自的成分以及它们的制备方法的详尽描述，在这里引入其内容作为参考。
可以在体内或体外测试中证明活性化合物作为神经保护剂的用途，例如可单独提供本发明的活性化合物，或将其与其它物质组合或序贯联合。例如，可以将本发明的活性化合物与抗炎剂，例如(但不仅限于)糖皮质激素在中风或脊髓损伤后联合施用(作为阻断进一步神经损伤并抑制轴突再生的手段)；还可以将本发明的活性化合物与神经营养因子，如NGF、BDNF或其它用于神经变性疾病的药物，如ExelonTM或左旋多巴联合施用。如这里所用，当同时施用两种物质或以使所述物质在相同时间起作用的方式独立施用两种物质时，称两种物质为联合施用。
由代码、通用名或商品名定义的活性成分的结构可以取自标准纲要“默克索引”的现行版本或来自数据库，例如国际专利(例如IMS世界出版物)。在这里引入其相应的内容作为参考。任何本领域技术人员完全能够鉴定所述活性成分并且基于这些参考同样能够制备和在标准测试模型中体外和体内地测试其药物适应症和特性。
对于上述适应症，适当的剂量将当然地依赖于，例如本发明所使用的具体分子、施用方式和治疗病症的性质和严重性而变化。
实施例实施下列方法以进行以下公开的实施例转染。在含有10％胎牛血清、5％青霉素/链霉素和22mg的左旋脯氨酸的DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的平板中涂布CHO K1细胞(ATCC，Manassas，VA)。将平板置于37℃水压CO2细胞培养箱中孵育过夜。根据制造商说明使用QiagenSuperFect试剂以1∶15的比例(cDNAAPPwt(695))用目的cDNA和全长APP进行共转染。将5×105细胞铺在含有10％胎牛血清、5％青霉素/链霉素的DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的六孔板中并培养24小时。SuperFect混合物由100μl无血清培养基(DMEM)、3μg的总DNA和20μl的SuperFect组成。从细胞移去培养基并添加1mL新鲜培养基。将全部SuperFect混合物添加至培养基中并在37℃孵育2小时。然后移去混合物并用3mL PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入新鲜培养基并孵育24或48小时。
免疫细胞化学--如制造商(Life Technologies)所述，在OPTIMEM(不含血清培养基)中使用Lipofectamine用适当的构建体转染CHO细胞。如Dev等人1999，Neuropharmacol.，(1999)38，635-644所述，对CHO细胞免疫染色并观察免疫反应性。使用抗-Flag M2单克隆小鼠抗体(Sigma)检测Flag-蛋白质表达，二抗为德克萨斯红-X山羊抗兔IgG(Molecular Probes)。
胱天蛋白酶-3的流式细胞术分析。用CyD或CPZ与APPwt一起瞬时转染HEK细胞24小时。将细胞固定、透化处理并用来自BD Biosciences的胱天蛋白酶-3编程性细胞凋亡试剂盒(#550914)染色。从≥101门控FITC染色的细胞并将其作为胱天蛋白酶-3的阳性细胞测量。同时检查前散射和侧散射以检验细胞群的健康。
化合物处理。用环孢菌素A、Sangliferhin A、FK506(如Sedrani等人，J.Am.Chem.Soc.125，3849-3859页(2003)所述，将其整体引入作为参考)和N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素浓缩物处理稳定表达APPswe突变体的HEK293细胞24小时。使用来自Promega的CellTiter-Glo试剂盒(#G7573)测量细胞生存力。使用自制双夹层酶联免疫吸附测定(除使用Novartis发展的抗体代替Biosource抗体外，自制酶联免疫吸附测定与所述形式相同)测量细胞上清中Aβ40和Aβ42水平。使用稳定表达5×Gal4应答元件荧光素酶报道基因和C99-Gal4-VP16或刻缺蛋白-Gal4-VP16构建体的细胞系测量C99或刻缺蛋白切割(如Maltese、Wilson等人2001所公开的)。Gal4-VP16在由γ-分泌酶切割后被释放并结合到报道基因增加荧光素酶活性。用化合物处理稳定细胞并测定IC50值。
Aβ酶联免疫吸附测定。将可商购的靶向Aβ肽NH2末端的小鼠单克隆抗体作为预包被96孔板的捕获抗体(对于Aβ40为BiosourceCat#KBH3481/PPO81，对于Aβ42为Cat#KBH3441/PPO81)。从Biosource获得多克隆检测抗体(抗hAβ40抗体Cat#44-348和抗hAβ42抗体Cat#44-344)并周15mM叠氮化钠以1/220稀释。二抗(Aβ4为BiosourceCat#KBH3481，Aβ42为Cat#KBH3441)为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG。用3.3mM百里香酚按1/100稀释二抗。使用前将抗体包被板用PBS-TE(1mM EDTA和0.05％吐温20，洗涤缓冲液)在微量培养板洗涤器(Bioteck Instruments，Inc，Winooski，VT)上洗涤四次。取出100μl转染细胞的条件培养基并在含有1mM AEBSF(Biosource，Camarillo，CA)的样品稀释剂中以1∶2稀释。将100μl该混合物加至洗过的抗体包被的96孔板中，用胶带覆盖并在4℃孵育过夜。移去样品并用洗涤缓冲液洗涤平板四次。按100μl/孔添加抗体检测溶液，并将平板在室温摇动培养2小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板四次并按100μl/孔添加二抗和摇动孵育2小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板5次并在纸巾上拍干。每孔添加100μl稳定色原(四甲联苯胺)并将平板在黑暗中孵育30分钟。向平板中添加100μl终止液(1NH2S)以终止反应。1小时内在微量培养板读取器(microplate reader)(Molecular Devices)于450nM读取平板。
抗体和Western印迹分析。如先前所述将APP野生型和APP瑞典突变体的cDNA插入pCI质粒表达载体巨细胞病毒启动子下游(Promega，Madison，WI)(Bodendorf，U.、Fischer，F.、Bodian，D.、Multhaup，G.、Paganetti，P.2001 J.Biol.Chem.27612019 12023)。PS1 NTF抗体识别PS1的N末端(Thinakaran、Borchelt等人1996)。细胞转染24小时后在含有蛋白酶抑制剂(CompleteRoche Molecular Biochemicals)的RIPA缓冲液(10mM Tris pH 7.5、150mM氯化钠、1mM EDTA、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、1％SDS)中提取培养的HEK293细胞并在4℃以10000×g离心10分钟。收集上清液并丢弃沉淀。随后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物，转移至PVDF Immobilon-P膜(Millipore)并用指示的一抗探测。如先前所述(Manni，M.，等人，1998.FEBS.427367-370)用ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)进行免疫检测。
免疫细胞化学--如制造商(Life Technologies)所述，在OPTIMEM(无血清培养基)中使用Lipofectamine用适当构建体转染CHO细胞。如Dev等人1999，Neuropharmacol.，(1999)38，635-644所述，对CHO细胞免疫染色并观察免疫反应性。使用抗-Flag M2单克隆小鼠抗体(Sigma)检测Flag-蛋白质表达。二抗为德克萨斯红-X山羊抗兔IgG(Molecular Probes)。
CPZ构建体--从购自Life Technologies，Inc的纯人DRG的标准化cDNA文库(L0001)(LTI，商品号11315-017，批号81027-242)获得野生型人羧肽酶(hCPZ)。将cDNA插入片段以5’到3’的方向克隆至Gateway-相容载体pCMV·SPORT6的EcoR V和Not I位点。使用引物通过位点定向的诱变完成对对应于氨基酸42-161的卷曲(FZ)结构域和氨基酸179-568的催化(Cat)结构域的缺失、点突变(氨基酸E251A)以及在氨基酸29之后引入N-末端FLAG标签(DYKDDDDK Seq ID.No 1)，所述引物为5’CCTCCAGGCCTCCCCGAAGCTTCTCGGCGCTGTCTGCAGCTGGTGGCCTGTGG-3’(Seq Id No.2)和5’CCACAGGCCACCAGCTGCAGACAGCGCCGAGAAGCTTCGGGGAGGCCTGGAGG-3’(Seq Id No.3)用于卷曲结构域的缺失，5’CCACACGGCCAGCCCTCTTCATCCGGGCCAGCCCTGAGGGCAGTGCCTCGTCAGC-3’(Seq Id No.4)和5’GCTGACGAGGCACTGCCCTCAGGGCTGGCCCGGATGAAGAGGGCTGGCCGTGTGG 3’(Seq Id No.5)用于催化结构域的缺失，5’CATCTCCCGGCCCGCCACCGCGTTGCCATGAATGTTGC-3’(Seq Id No.6)和5’GCAACATTCATGGCAACGCGGTGGCGGGCCGGGAGAIGC-3’(SeqId No.7)用于点突变E251A，以及5’GGTGGCCTGTGGCATTCACCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGGCGGGGTTCCGCTCAAACTCG-3’(Seq Id No.8)和5’CGAGTTTGAGCGGAACCCCGCCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGTGAATGCCACAGGCCACC-3’(Seq Id No.9)用于引入FLAG标签。使用Qiagen质粒试剂盒从转化的大肠杆菌中分离所有DNA。使用ABI Prism 3700 DNA分析仪系统通过DNA测序验证所有可读框的序列。
原位杂交--使用聚合酶链式反应(PCR)用5’侧接SP6启动子和T7启动子识别序列的自身引导的寡核苷酸引物，可以不需要任何克隆步骤地从任何已知基因序列产生RNA探针模板。PCR反应进行如下95℃变性45秒，58℃退火阶段30秒，70℃延伸阶段1分钟，共40个循环。在4％琼脂糖凝胶上分离后，用QiAQuick纯化试剂盒根据制造商说明(Qiagen，Switzerland)纯化PCR产物。使用含有地高辛-UTP的dNTP用T7-RNA聚合酶(反义)和SP6-RNA聚合酶(正义)于37℃2小时转录纯化的PCR产物。除去未整合的核苷酸，用乙醇沉淀探针并将其溶于50μl水中然后储存在-20℃。将DIG-探针和标记的对照RNA(已知浓度)的梯度稀释点在尼龙膜上。用与抗DIG抗体缀合的碱性磷酸酶孵育后，接着使用NBT/BCIP(溶在70％二甲基甲酰胺和30％水中的75mg/ml氮蓝四唑和溶在100％二甲基甲酰胺中的50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐)作为碱性磷酸酶底物进行显色步骤。通过与标记的对照RNA点的强度比较估计CPZ探针浓度。使用原位杂交和免疫化学的全自动仪器DiscoveryTM(Ventana MedicalSystems，Strasbourg)进行ISH。在RNA分析实验室内建立使用石蜡包埋的组织切片定位该基因的方法，且该方法如下所述，在无溶剂条件下使用EZprep溶液(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)于75℃8分钟，继之于42℃8分钟对组织切片进行去石蜡化和再水化。使用RiboMapTM试剂盒(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)根据制造商说明并且使用酶消化作为一个附加的透化步骤完成所有的预处理步骤用12μg/ml的蛋白酶K于37℃消化16分钟获得最佳结果。用稀释于RiboHybe溶液(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)的适量DIG-核糖核酸探针(CPZ探针＝5ng/载玻片)在45℃进行CPZ探针杂交6小时。杂交后在高严格条件(0.1×SSC)下于50℃8分钟洗涤3次。为了检测DIG-标记，用抗体稀释剂以1/2000稀释生物素缀合的小鼠抗地高辛抗体(JacksonImmunoresearch Inc.)之后，于37℃施加所述抗体30分钟，继之使用BlueMapTM试剂盒(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)根据制造商说明进行BCIP/NBT显色检测。具有最佳信/噪平衡的底物孵育时间为4小时。使用ISH核快红(nuclear fast red)复染10分钟。在石英盖片(Crystalmount)中固定切片并使用Permount封片。
实施例1早老蛋白加工观察到过表达cDNA提高C99底物的Aβ水平，提示GACE介导的APP切割提高。由于CPZ和CyD显著提高C99的加工并提高Aβ42分泌，选择它们进一步研究。检测了用CPZ或CyD转染的HEK293细胞中PS1 N末端片段(NTF)水平。在用PS1稳定转染的细胞中，可容易地检测到全长PS1和NTF。相反，在未转染的HEK细胞中，内源全长PS1和NTF水平较低。在过表达CPZ或CyD的细胞中，PS1 NTF水平的显著提高指示这些片段在以更高速率产生或者内源NTF在48小时的转染期间被稳定化。
CPZ分析CPZ是羧肽酶(CP)基因家族的成员，属于CPE亚家族，已知其加工生物活性神经肽(Song和Fricker 1997)。CPE相关酶通常参与选择性加工反应，其从加工中间体的C末端选择性去除碱性残基。为了确定CPZ的催化活性、表达或亚细胞定位是否是诱导Aβ所必需的，产生三种CPZ突变构建体。在第一种构建体中，完全去除催化结构域(Δcat)只剩下信号肽、卷曲结构域和C末端。在第二种构建体中缺失卷曲结构域(Δfz)，而在第三种构建体中，向催化结构域中引入损伤CPZ催化活性的单个点突变(Glu251Ala)。将每种CPZ变体与APPwt或C99底物共转染进入HEK293细胞。与野生型CPZ或flag标记的CPZ相比，三个突变构建体各自均不具有活性。使用APPwt和C99底物的结果是相似的。
对CPZ突变体活性缺失的可能的解释为在细胞中缺少表达或该蛋白质的错误定位。为了弄清该问题，用flag标记CPZ突变体并在CHO细胞中过表达。在透化处理的细胞中，CPZ野生型具有澄清的细胞质膜或迟的分泌小泡定位。该结果与之前检测CPZ胞内分布的研究一致(Novikova、Reznik等人2000)。CPZ突变构建体Δcat、Δfz和Glu251Ala的亚细胞定位保持不变。这些发现提示CPZ的催化活性而非其细胞内定位或表达水平是在CHO细胞中诱导Aβ水平所必需的。
破坏CPZ催化活性阻止Aβ产生而不影响其表达或亚细胞定位。过表达CPZ能够与Wnt竞争与内源卷曲受体的结合引起更少的β-联蛋白激活(Tesco、Kim等人1998)。β-联蛋白活性降低与提高的Aβ产生相关，认为所述提高的Aβ产生是由PS1提高β-联蛋白与GSK3β缔合的能力介导的(Kang、Soriano等人1999)。可能CPZ能够通过经由胱天蛋白酶-3激活PS1切割诱导Aβ产生，导致更少的PS1/β-联蛋白复合物(Tesco、Kim等人1998)。如果PS1未与β-联蛋白结合，则其能够更容易地与GACE复合物缔合。由于卷曲结构域表征为蛋白质相互作用结构域，可能CPZ的卷曲结构域能够与γ-分泌酶复合物的组分(即PS1或APP自身)相互作用。目前正在研究这些相互作用。
值得注意的是，认为CPZ结构域的C末端含有将CPZ从质膜释放至胞外环境的假定的弗林蛋白酶切割位点(Novikova、Reznik等人2000)。弗林蛋白酶还参与刻缺蛋白配体δ从细胞表面刻缺蛋白的释放(Ikeuchi和Sisodia 200)。尽管尚未确认CPZ上的弗林蛋白酶位点为弗林蛋白酶底物，已证明能够从细胞分泌CPZ(Novikova、Reznik等人2000)。这提示CPZ可能位于与刻缺蛋白相同的加工通路上，但目前尚不清楚CPZ的刻缺蛋白切割如何涉及Aβ产生(Kim、Wang等人1999)。然而，观察到，与CyD过表达相似，CPZ能够使细胞进入细胞凋亡，指示两种蛋白质存在影响Aβ产生的共同机制。
先前的发现(Novikova和Fricker 1999)提示，CPZ在大鼠脑柔脑脊膜细胞中表达，但尚未显示CPZ在已知受阿尔茨海默病侵袭的脑区域中表达(Novikova和Fricker 1999)。为了确定CPZ在何处表达，通过原位杂交分析小鼠脑切片。在野生型C7BL-6小鼠(Jackson Laboratories)中，CPZ反义探针显示在脑中有广泛分布的结合，在小脑和额皮质具有最高水平信号。在更进一步的检查中，还发现CPZ在靠近CA1和CA3区域的海马中，最可能在锥体细胞中表达。在小脑中，CPZ在靠近Perkinje和颗粒细胞层的分子区域表达。CPZ在额皮质中的分布未显示位于特定细胞类型中，而是在该区域中平均地表达。CPZ在小鼠海马、小脑和额皮质中的定位说明其在脑中已知受到人阿尔茨海默病侵袭的区域表达。
CyD的表征为了测定这些抑免蛋白结合化合物是否能够调节APP加工，用一定浓度范围的环孢菌素A、Sangliferhin A、FK506或N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素浓缩物处理HEK/APPswe稳定细胞。按照制造商说明(Promega Cat#G5421)对每个浓度通过MTS测定法测量生存力并用本文所述酶联免疫吸附测定法测量分泌的Aβ40和Aβ42。所有浓度的生存力IC50均＞40μM。环孢菌素A、Sangliferhin A对于Aβ40和Aβ42的抑制性IC50为＜3μM，说明对Aβ分泌的强抑制。N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素对于Aβ40和Aβ42分泌的IC50为＜10μM，而FK506对于Aβ分泌没有影响。相反，FK506处理引起Aβ42从3-20μM的剂量依赖性提高。
已证明免疫抑制剂如环孢菌素A能够抑制若干动物模型中神经变性和细胞凋亡并抑制分离的小鼠线粒体中Aβ诱导的线粒体损伤(Kim 2002)。由于CyD是环孢菌素A的靶标并定位于线粒体内，其可能在该位点Aβ加工中起作用，提示CyD可能对人AD的发展是重要的。尽管尚未测试到其它同工型，CyD可能由于它是唯一已知定位于线粒体的亲环蛋白同工型对Aβ加工具有独特效应。发现在HEK细胞中过表达CyD能够提高胱天蛋白酶-3活性并稳定PS1 NTF，提示其能够直接修饰PS1活性。另外，能够与CyD结合并抑制其活性的化合物强烈抑制Aβ分泌和C99切割。
具体的，3μM Sanglifehrin A强烈抑制Aβ并且在低于20μM之前对细胞没有毒性。已知Sanglifehrin A结合CyD并抑制其PPIase活性，而不影响CyD与腺嘌呤核苷酸易位体(ANT)的结合能力，并且不抑制如CsA(Samantha J.Clarke 2002)的钙调磷酸酶的活性。可以以若干方式解释Sanglifehrin A急剧升降的剂量应答(steep dose response)。只有当Sanglifehrin A与相当多部分的CyD结合，足以破坏其在MPT的活性时，Sanglifehrin A才可抑制孔道开放(Clarke 2002)。由于ANT以二聚体存在，很可能CyD必需以多于一个分子与ANT结合以诱导构象变化。由于Sanglifehrin A必需结合多个CyD分子以抑制MPT复合物活性，这将解释在3μM阈值时对Aβ分泌的快速抑制。一旦达到该阈值，MPT复合物可被完全抑制并阻止孔道开放。该MPT抑制的阈值还似乎是Aβ加工和/或分泌的重要调节物。或者，Sanglifehrin A可以具有与CyD不同或除CyD之外还有多个靶标。尚不清楚CyD是直接通过其PPIase活性还是通过MPT构象变化调节MPT化合物。无论如何，这里所给出的数据与由其它研究给出的数据一致说明CyD和MPT孔道在Aβ加工中起关键作用。
尽管这些化合物能够显著降低Aβ分泌并抑制C99切割，它们还抑制刻缺蛋白切割。考虑到数据显示CyD和CPZ过表达影响GACE活性，这一结果并不令人惊讶。这一数据首次说明抑免化合物能够抑制GACE活性并定义了细胞中能够影响Aβ和刻缺蛋白加工的新通路。
值得注意的是，FK506处理以剂量依赖的形式显著地提高Aβ42分泌。已知FK506结合抑免蛋白而非CyD。Aβ42的特异性提高提示FK506靶蛋白质可能调节Aβ42的代谢或产生。FK506和CsA都能抑制钙调磷酸酶但它们对Aβ分泌具有不同影响，因此钙调磷酸酶可能不影响Aβ水平。FK506的这一独特影响进一步支持抑免蛋白通路调节Aβ加工。
实施例2C99和刻缺蛋白切割如Maltrese、Wilson等人2001所述，使用带有信号肽、TGN保留序列和插入在Q56/Y57处的GAL4-NLS-VP16序列的修饰的C99或刻缺蛋白跨膜序列产生HEK 293稳定细胞系。所述细胞还稳定表达5×GAL4RE-荧光素酶报道基因构建体(RD-2002-01437和RD-2001-02419)。当切割C99转基因从而激活Gal4荧光素酶报道基因时，测量到这些细胞的GACE活性。用环孢菌素A、Sangliferhin A、FK506或N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素处理这些HEK稳定细胞并确定C99切割的IC50。GALVP可单独作为阴性对照。环孢菌素A、N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素、Sangliferhin A和FK506的GALVP IC50分别为6.9、9.9、＞20和＞20μM，由于这些化合物在＞40μM之前并无毒性，表明C99切割的抑制与细胞生存力间存在明显联系。然而，环孢菌素A、N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素、Sangliferhin A分别在0.71、0.87和0.85μM都抑制C99切割，并分别在1.7、2.7和3.2μM抑制刻缺蛋白切割。FK506对C99或刻缺蛋白切割没有影响。因此能够与CyD结合的配体强烈抑制C99和刻缺蛋白切割表明GACE活性被抑制。
实施例3胱天蛋白酶-3激活近期研究提示激活胱天蛋白酶-3能够引起Aβ分泌提高并稳定GACE复合物中的蛋白质(Tesco、Koh等人2003)。由于CyD和CPZ都提高Aβ分泌并稳定PS1 NTF，在CyD和CPZ过表达细胞中分析胱天蛋白酶-3激活的水平。用CyD和CPZ与APPwt一起瞬时转染HEK 293细胞24小时，皂苷透化处理、固定并用针对活性胱天蛋白酶-3的FITC缀合的单克隆抗体探测。阴性对照细胞用空载体和APPwt转染，而阳性对照细胞在分析前用1μM星形孢菌素处理6小时。在表达CyD的细胞中，52％检测的细胞是活性胱天蛋白酶-3阳性的，而在表达CPZ的细胞中，48％的细胞是胱天蛋白酶-3阳性的。这些结果表明这些蛋白质的过表达诱导胱天蛋白酶-3的激活，提示这是稳定化PS1 NTF和提高Aβ分泌的可能机制。
权利要求
1.非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素在制备用于治疗或预防与Aβ产生和/或分泌相关病理状态的药物中的用途，所述病理状态例如阿尔茨海默病、帕金森病、τ蛋白病、朊病毒病、额颞型痴呆、纹状体黑质变性、卢伊体痴呆、亨廷顿病、皮克病、淀粉样变和其它与过量Aβ产生相关的神经变性病症。
2.用于治疗或预防与Aβ产生和/或分泌相关的病理状态的方法，其包括对所述患者施用有效量的非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素。
3.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素为式A的化合物及其可药用盐 其中B为式B的氨基酸残基 其中a表示连接位置2的αAbu残基的键；b表示连接位置4的C残基的键；Alk代表含有2到6个碳原子的直链或支链亚烷基或含有3到6个碳原子的环亚烷基，且R代表羧基或烷氧基羰基；-NR1R2基，其中R1和R2是相同或不同的并且代表氢、烷基、C2-4链烯基、C3-6环烷基、苯基(任选地由卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代)或苯甲基或含有5或6个环原子及1到3个杂原子的饱和或不饱和杂环基；或其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和的杂环，所述杂环含有4到6个环原子，任选地含有选自氮、氧或硫的其它杂原子，并任选地由烷基、苯基或苯甲基取代；下式的原子团 其中R1和R2如上定义，R3代表氢或烷基且n为从2到4的整数，且其中烷基表示含有从1到4个碳原子的直链或支链烷基；C为MeLeu或4-羟基-MeLeu。
4.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素为式I的化合物 其中W为MeBmt、二氢-MeBmt或8′-羟基-MeBmt；X为αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)；R为Sar或(D)-MeAla；Y为MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、Me Tyr、MeTyr(O-PO(OH)2)、MeaIle或MeaThr或Pro；Z为Val、Leu、N-Alk-Val或N-Alk-Leu，其中Alk代表Me或如下取代的Me由乙烯基取代的Me，所述乙烯基任选地由苯基或含有6元环的N、S或O杂芳香基取代，或由苯基取代的Me，所述苯基任选地由卤素取代；Q为MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
5.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素为选自以下的化合物a)[二氢-MeBmt]1-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；b)[MeVal]4-环孢素；c)[MeIle]4-环孢素；d)[MeThr]4-环孢素；e)[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；f)[Nva]2-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；g)[γ-羟基-MeLeu]4-[γ-羟基-MeLeu]6-环孢素；h)[MeVal]5-环孢素；i)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-环孢素，orj)[8’-羟基-MeBmt]1-环孢素.m)[N-苯甲基-Val]5-环孢素，n)[N-5-氟-苯甲基-Val]5-环孢素，o)[N-烯丙基-Val]5-环孢素，p)[N-3-苯基-烯丙基-Val]5-环孢素，q)[Pro]4-环孢素，或r)[γ-羟基-MeLeu]9-环孢素。
6.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢素为[MeVal]4-环孢素。
全文摘要
非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素可以，例如在与Aβ分泌和/或产生有关的病理状态的预防或治疗中用作神经保护剂。
文档编号A61P25/00GK1984670SQ200580023721
公开日2007年6月20日 申请日期2005年7月12日 优先权日2004年7月13日
发明者D·科恩, L·A·该赛 申请人:诺瓦提斯公司
技术领域：
本发明涉及环孢菌素的新用途，特别是非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素的新的药物用途。
背景技术：
环孢菌素A(CsA)与抑免蛋白例如亲环蛋白(CyP)结合，而同为抑免蛋白结合化合物的FK506和雷帕霉素与FK506结合蛋白质(FKBP)结合。尽管抑免蛋白结合是必需的，但其对这些药物的免疫抑制活性是不足的。观察到药物/抑免蛋白复合物与第三效应物蛋白质相互作用时的生物效应。例如，CyP-CsA和FKBP-FK506复合物抑制钙调磷酸酶的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，由此阻断细胞因子如白介素-2、4的产生。另一方面，FKBP-雷帕霉素复合物抑制称为FRAP(也称为RAFT或mTOR)5的激酶，该激酶参与白介素-2受体介导的T细胞增殖。
已从链霉菌属物种(Streptomyces sp.)A92-308110中分离出被称为sanglifehrin的新一类化合物。在目前分离的20种不同的sanglifehrin中，sanglifehrin A(SFA)是最为丰富的化合物，并显示出有效的免疫抑制活性。SFA代表作用方式与所有其它已知的抑免蛋白结合化合物(即CsA、FK506和雷帕霉素)均不同的新型免疫抑制剂。已显示SFA在线粒体转换孔道(MTP)复合物中以与另一抑免--蛋白亲环蛋白A(CpA)不同的结合位点直接结合抑免蛋白--亲环蛋白D(CyD)并抑制MTP开放。
在欧洲专利no.484281中描述了非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素及其治疗和预防AIDS和AIDS相关紊乱的用途，其中包括对环孢菌素类化合物、它们的命名法和作用方式的一般描述。将EP 0,484,281 B的公开内容，特别是上文涉及的一般描述和下文涉及的其它部分的描述包括在本申请的说明中作为参考。
令人惊奇的是，现已发现与亲环蛋白结合但没有免疫抑制性的环孢菌素可作为神经保护剂用于治疗包括(但不仅限于)阿尔茨海默病(“AD”)的与Aβ产生和/或分泌相关的病理状态。AD表征为脑中淀粉状蛋白斑(主要由Aβ的40或42个氨基酸的肽组成)的胞外堆积。这些肽的细胞外堆积是该疾病的病理学标志(Selkoe 1999)。这些Aβ肽通过内切蛋白酶解切割广泛表达的I型跨膜蛋白质--淀粉样前体蛋白(APP)产生(Selkoe 1999；Sisodia 2000)。在淀粉生成通路中切割APP的两种酶被称为β-分泌酶和γ-分泌酶，其分别从N末端和C末端切割APP。在该通路中，β-分泌酶(BACE1)是切割APP的第一个酶，产生分泌的sAPPβ片段和结合膜的C末端片段(CTF，C99)(Vassar、Bennett等人1999)。C99片段是γ-分泌酶复合物(GACE)的底物，所述复合物切割C99产生Aβ和AICD(APP胞内结构域)。AICD结合含有Tip60和Fe65的复合物，该复合物抑制NFκ-B通路中的基因KAI1(四跨膜蛋白(tetraspanin)细胞表面分子)(Baek、Ohgi等人，2002)。GACE复合物由四个基本组分早老蛋白1(PS1)、呆蛋白(NCSTN)、Aph1和Pen2(Edbauer、Winkler等人，2003；Kimberly、LaVoie等人2003)组成。PS1功能同系物--早老蛋白2(PS2)促成细胞中～20％的Aβ产生(Kimberly、Xia等人，2000)。尽管这四种组分是必需的并且足以重建GACE活性，有非GACE介导的APP切割引起Aβ产生的证据(Tesco、Koh等人2003)，(Nunan、Shearman等人2001)。
发明内容
阐明APP通路涉及的新基因是确定该疾病的完整病因学以及更好理解促使Aβ产生的复杂机制的关键步骤。调节Aβ的新基因和通路的确定有助于开发治疗该疾病进展的新治疗策略。若干遗传连锁和染色体区域与迟发性阿尔茨海默病(LOAD)(＞65岁发病)特异地关联(Ertekin-Taner、Graff-Radford等人，2000)、(Bertram、Blacker等人，2000)、(Scott、Hauser等人，2003)。在共同未决的USSN 中描述了LOAD关联基因的亚型和参与APP加工的新基因，其中包括对用来检测cDNA克隆调节CHOK1细胞中Aβ产生能力的大规模功能性筛选的描述。将该USSN_的公开内容，特别是鉴定修饰Aβ分泌的基因和后文所述的其它部分的描述包括在本申请的说明中作为参考。
作为细胞中Aβ产生关键性调节物的抑免蛋白通路基因的发现提供了合适的阿尔茨海默病药物靶标。功能性筛选中发现的涉及抑免蛋白通路的一些cDNA包括Map激酶4、钙调蛋白、酸性神经酰胺酶和TOB3(一种AAA-腺苷三磷酸酶)。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，又称胞外信号调节激酶(ERK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其磷酸化并正调节或负调节起始信号级联放大事件的靶底物。ERK应答广泛的刺激将信号从细胞膜转导至细胞核并在调节基因表达、有丝分裂、增殖、运动性、代谢和细胞凋亡中起到重要作用(Wada和Penninger 2004)。MEK和ERK活性的抑制剂显示抑制APP分解代谢。此外，MAPK可以激活JNK并引发细胞凋亡--已知提高Aβ产生的过程(Tesco、Koh等人，2003)。尽管不希望受到理论束缚，MAPK4cDNA可通过APP分解代谢或激活细胞凋亡起作用。
APP胞内结构域(AICD)片段还与连接MAP激酶通路与APP加工的cJun N末端激酶(JNK)相互作用(Scheinfeld、Roncarati等人2002)。MAPK4是激活JNK的ERK，因此过表达MAPK4可引起JNK的超活化，其可增加JNK-AICD相互作用引起增加Aβ产生。也可能JNK的激活诱导细胞凋亡。或者，MAPK4可改变APP的磷酸化状态，已显示所述APP的磷酸化状态通过影响APP运输和破坏PS1/β-联蛋白相互作用影响其由β-分泌酶和α-分泌酶优先的加工(Hung和Selkoe 1994)，(Walter、Capell等人，1997)。另外，还显示细胞的磷酸化状态对PS1活性是关键的(Seeger、Nordstedt等人1997)。JNK激活和蛋白质磷酸化也是MAPK4能够起作用以提高Aβ产生的若干其它通路。
筛选中鉴定的另一基因为钙调蛋白。钙调蛋白是环-螺旋-环Ca2+结合蛋白质，其通过与包括CaMKII、CaMKIV、钙调磷酸酶、血影蛋白A2、p21和神经元氧化氮合酶的特定的靶蛋白质相互作用转导Ca2+信号(Means1981)。当Ca2+结合钙调蛋白时，其经历构象变化使其能够与靶蛋白质结合并刺激或抑制靶蛋白质活性。在无细胞制剂和完整细胞中使用钙调蛋白拮抗剂W-7和三氟拉嗪已显示，钙调蛋白调节Aβ产生。这些已知的钙调蛋白活性的抑制剂也可抑制Aβ产生(Desdouits、Buxbaum等人，1996)。因此，胞内Ca2+浓度和/或钙调蛋白的靶蛋白质可影响APP加工。这一综合数据验证了当过表达钙调蛋白时观察到提高Aβ产生的事实。
Ca2+失调，特别是细胞质中Ca2+水平的下降与PS1 FAD突变相关的Aβ产生的提高相伴发生(Yoo、Cheng等人，2000)。PS1 FAD突变可显著消弱容量性钙内流(CCE)并储存消耗激活的电流(depletion-activatedcurrents)，提示降低的CCE可提高Aβ产生(Yoo、Cheng等人，2000)。在筛选中发现钙调蛋白基因的过表达还可引起胞内钙水平的降低，并可预防足够的CCE。可能胞内Ca2+的减少可直接或间接提高PS1活性，引起从细胞分泌更多的Aβ。以下详述的数据表明SFA有效地抑制Aβ40和Aβ42产生并抑制C99和刻缺蛋白切割，说明γ分泌酶活性通过抑免蛋白CyD与Ca2+体内稳态相关。
另一基因--人酸性神经酰胺酶催化神经酰胺水解为鞘氨醇和脂肪酸(Ferlinz、Kopal等人，2001)。神经酰胺作为大部分鞘脂的前体，并且是在大量不同细胞类型中(通常是通过胱天蛋白酶-3激活)诱导细胞凋亡的信号分子。积累的神经酰胺水平与阿尔茨海默病相关，并被认为是老化的AD脑中氧化神经毒性通路的一部分。过表达神经酰胺提高Aβ产生使神经酰胺酶切割与Aβ相关联。由于神经酰胺似乎通过细胞凋亡起作用，可能酸性神经酰胺酶也促进细胞凋亡。
已显示细胞的神经酰胺状况同时调节BACE的稳定性和Aβ的生物发生(Puglielli、Ellis等人2003)。先前的研究证明高水平的神经酰胺可以通过不依赖于细胞凋亡的方式增加Aβ分泌(Puglielli、Ellis等人2003)。过表达神经酰胺酶将降低神经酰胺水平，并且可能改变膜流动性地提高鞘氨醇和游离脂肪酸(FFA)水平，是已知的改变τ蛋白(tau)磷酸化和Aβ聚合作用的方法(Wilson和Binder 1997)。尽管机制尚不清楚，可能神经酰胺酶能够影响FFA水平引起改变的APP加工和更多Aβ产生和/或分泌。
TOB3是执行分子伴侣样功能的AAA-腺苷三磷酸酶，有助于包括蛋白质分泌的蛋白质复合物的装配、操作或解装配(Strausberg、Feingold等人，2002)。该类蛋白质作为被组成型加工的蛋白质帮助维持内质网(ER)的完整性。在缺少AAA-腺苷三磷酸酶活性时，错误折叠蛋白质的过度累积引起ER膨胀和细胞死亡(Kobayashi、Tanaka等人，2002)。过表达TOB3提高Aβ分泌的最可能的解释与其影响蛋白质折叠和在ER中运输的能力相关。如果刺激这一过程，如通过TOB3过表达，可能将提高APP加工。
我们的筛选数据已经显示过表达TOB3改变APP加工引起更多Aβ产生和更少的C99和C83 C末端片段。与HEK 293细胞相比，TOB3表达还在N2A细胞中更大程度降低APP和sAPPα水平(数据未显示)。这提示TOB3影响APP加工机器中一个或多个组分，引起提高的APP和C99切割。由于TOB3参与蛋白质的运输和加工，目前正在确定TOB3在APP加工中的确切机制和特异性。
功能性筛选中鉴定的另一cDNA--羧肽酶Z(CPZ)连同CPE和CPD一起是金属羧肽酶基因家族的成员，认为它们在生物活性肽和蛋白质分泌之前的胞内加工中起作用。CPZ由于含有与Wnt和无翅蛋白质结合的功能性N末端富含半胱氨酸卷曲结构域，是独特的羧肽酶，所述无翅蛋白质是Wnt信号转导的关键组分(Moeller、Swindell等人，2003)。
另一值得注意的cDNA为亲环蛋白D(CyD，也被称为CyF。命名法参考Current Medicinal Chemistry，2003，10，1485-1506 1485 Cyclophilin Das a Drug Target，Waldmeier等人)。发现CyD参与Aβ产生。亲环蛋白如CyD是涉及蛋白质运输和成熟的肽基脯氨酰异构酶。除CyD独自定位于线粒体基质中之外，亲环蛋白主要定位在细胞质中(Waldmeier、Zimmermann等人2003)。过表达CyD时，其能够稳定内源PS1 N末端片段(NTF)。AD脑的普遍损伤是存在由异常磷酸化的τ蛋白--一种微管结合蛋白质组成的胞内神经原纤维缠结(Johnson和Bailey 2002)。过表达APP时，CyD能够提高胱天蛋白酶-3的活性，指示调节Aβ分泌的可能机制。这些结果提示当过表达时，CyD是通过γ-分泌酶通路切割APP和C99所必需的重要因子。
一方面，CyD是线粒体通透性转换孔道的内在组份，其被认为与腺嘌呤核苷酸易位体结合并调节孔道开放(Waldmeier、Zimmermann等人，2003)。线粒体膜的通透性是引起消耗线粒体膜电位、释放致凋亡蛋白质和以凋亡细胞死亡告终的细胞应激的结果(Waldmeier 2002)。
已提示线粒体衰竭在唐氏综合征患者的AD神经病理学发展中通过促进异常的β-APP加工和Aβ的细胞内积累起到显著的作用(Busciglio 2002)。还显示细胞内钙水平的提高引起细胞内Aβ的积累(LaFerla 2002)。令人惊奇地，全长APP不仅沿分泌途径运输，而且在转基因小鼠AD模型的脑中靶向培养的皮质神经细胞的线粒体。β-APP在线粒体膜上的不完全易位和累积能够引起线粒体机能障碍，还能够在AD的发病机理中起重要作用(Anandatheerthavarada、Biswas等人2003)。已知过表达线粒体蛋白质能够引起基质中形成不溶聚集物(例如解偶联蛋白质-3，UCP3)。这些聚集物能够扰乱线粒体的正常功能并提高内膜的被动通透性。CyD可在线粒体处理过量APP或C末端片段的加工中起到重要作用。
CyD是免疫抑制剂药物例如环孢菌素的已知靶标。这些化合物封闭线粒体通透性转换(MPT)并预防细胞凋亡(Samantha J.Clarke 2002；Waldmeier 2002)。还已知FK506化合物与抑免蛋白结合但不与CyD结合(Uchino 2003)。
如果环孢菌素与人重组亲环蛋白的结合在由Quesniaux于Eur.J.Immuno1.1987，17，1359-1365中所述的竞争性酶联免疫吸附测定中至少占环孢素(又称为环孢菌素A)结合的1/5，则认为其与亲环蛋白结合。该测试中，在亲环蛋白与包被的BSA-环孢菌素的孵育期间添加待测环孢菌素，并计算不含竞争剂的对照反应产生50％抑制所需的浓度(IC50)。结果表达为结合比(BR)，是测试化合物的IC50和在类似测试中使用环孢素代替测试的环孢菌素的IC50比值的以10为底的对数。因此1.0的BR指测试化合物与亲环蛋白质的结合是环孢菌素的十分之一强度，负值表示比环孢菌素结合更强。
作为神经保护剂起作用的环孢菌素具有低于0.7的BR(由于log105＝约0.7)，优选地等于或低于零。
当环孢菌素在混和淋巴细胞反应(MLR)中的活性少于环孢菌素活性的5％，优选少于2％时，认为其是非免疫抑制的。混和淋巴细胞反应由T.Meo描述于《(Immunological Methods)》，L.Lefkovits和B.Peris编辑，AcademicPress，N.Y.227-239页(1979)。将来自Balb/c小鼠(雌性，8-10周)的脾细胞(0.5×106)与来自CBA小鼠(雌性，8-10周)的0.5×106辐射(2000拉德)或丝裂霉素C处理的脾细胞共孵育5天。被辐射的同种异型细胞在Balb/c脾细胞中诱导增殖应答，所述应答可以通过将标记的前体参入DNA得到测量。由于刺激物细胞是被辐射的(或丝裂霉素C处理的)，它们不以增殖应答Balb/c细胞而是保持它们的抗原性。将MLR中测试化合物建立的IC50与平行实验中环孢素建立的IC50相比较。
已发现在上述MLR中判断为非免疫抑制的化合物在IL-2报道基因测定中常常是无活性的，因此可使用IL-2报道基因测定，如作为初级筛选，选择本发明使用的非免疫抑制的亲环蛋白结合化合物。
作为治疗与Aβ分泌相关病理状态的活性物质(例如作为AD中淀粉样蛋白斑细胞外积累的抑制剂)起作用的非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素化合物在下文中被称为“活性化合物”。
因此活性化合物可用于治疗任何与Aβ肽分泌、内源PS1 N末端片段表达(NTF)或提高的γ-分泌酶活性相关的临床病症。活性化合物还可用于治疗与提高Aβ分泌的细胞凋亡相关的病症。Aβ肽形成和随后的聚集不仅是AD的标志，而且是其它神经学疾病如帕金森病、亨廷顿病和其它系统性淀粉样变性的必需部分(Selkoe 1989；Price、Borchelt等人1993；Citron、Vigo-Pelfrey等人1994)。这些结果清楚表明细胞凋亡与Aβ产生是固有相联系的。
活性化合物还能够调节不在脑中表达的“外周Aβ调节物”。外周淀粉样变性能够引起诸如心和皮肤淀粉样变性这样的表型(Yamaguchi、Yamazaki等人1992)、(Selkoe 1989)。如果发现外周Aβ的调节物，还可能得出新的疗法例如阻止穿透血脑屏障需要的靶标。降低外周Aβ水平显示降低转基因小鼠脑中Aβ水平，引起更少的空斑形成(Bohrmann、Tjernberg等人1999；DeMattos、Bales等人2002)。
发现许多活性化合物，特别是在4和/或5位，具有与环孢素不同的结构。可能与环孢素不同的活性化合物的其它位置为6和7位。
一组活性化合物是其中4位的MeLeu基团被不同的N-甲基化氨基酸，例如y-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeTyr或MeTyr(O-PO(OH)2)或Pro取代的环孢菌素。除MeIle和MeThr外，也可使用异型MeaIle和MeaThr。异型中，β-位的立体化学具有与天然氨基酸相反的构象，从而普通形式和异型形成一对非对映异构体。
另一组活性化合物是其中5位的Val被N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸取代。优选的N-烷基化的氨基酸为Val或Leu。优选[Val]5亚氨基的氢被非支链C1-6烷基，优选甲基、乙基或正丙基，特别是甲基取代。后一组优选的活性化合物是全新的。
额外地或可选地，某些活性化合物可以在1、2、3和/或6位上与环孢素不同。
用于本发明的活性化合物的具体类型为式A的环孢素衍生物及其可药用盐 其中B为式B的氨基酸残基
其中a表示连接位置2的αAbu残基的键；b表示连接位置4的C残基的键；Alk代表含有2到6个碳原子的直链或支链亚烷基或含有3到6个碳原子的环亚烷基，且R代表羧基或烷氧基羰基；-NR1R2基，其中R1和R2是相同或不同的并且代表氢、烷基、C2-4链烯基、C3-6环烷基、苯基(任选地由卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代)或苯甲基或含有5或6个环原子及1到3个杂原子的饱和或不饱和杂环基，或其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和的杂环，所述杂环含有4到6个环原子和任选地含有选自氮、氧或硫的其它杂原子并任选地由烷基、苯基或苯甲基取代；下式的原子团 其中R1和R2如上定义，R3代表氢或烷基且n为从2到4的整数，且其中烷基表示含有1到4个碳原子的直链或支链烷基；C为MeLeu或4-羟基-MeLeu。
在公开的国际专利申请WO 98/28328、WO 98/28329和WO 9828330中进一步描述该类环孢素衍生物。特别优选的此类化合物为式A的化合物，
其中B为氨基酸残基B’ 且C为氨基酸残基4-羟基-MeLeu。
特别优选的活性化合物组是由式I的化合物及其可药用盐组成 其中W为MeBmt、二氢-MeBmt或8’-羟基-MeBmt；X为αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)；R为Sar或(D)-MeAla；Y为MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeTyr、MeTyr(O-PO(OH)2)、MeaIle或MeaThr或Pro；Z为Val、Leu、N-Alk-Val或N-Alk-Leu，其中Alk代表Me或如下取代的Me由乙烯基取代的Me，所述乙烯基任选地由苯基或含有6个环原子数的N、S或O杂芳香基取代，或由苯基取代的Me，所述苯基任选地由卤素取代；并且Q为MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
基团W、X、Y、Z和Q独立地具有如下优选的含义优选地，W为W’，其中W’为MeBmt或二氢-MeBmt；优选地，X为X’，其中X’为αAbu或Nva，更优选X”，其中X”为αAbu；优选地，Y为Y’，其中Y’为γ-羟基-MeLeu、MeVal、MeThr、MeAla或MeTyr(O-PO(OH)2)；
优选地，Z为Z’，其中Z’为Val或MeVal；和优选地，Q为Q’，其中Q’为MeLeu。
一组特别优选的活性化合物为式I的化合物，其中W为W’，X为X’，Y为Y’，Z为Z’且Q为Q’。
特别优选的式I的活性化合物为a)[二氢-MeBmt]1-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；b)[MeVal]4-环孢素；c)[MeIle]4-环孢素；d)[MeThr]4-环孢素；e)[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；f)[Nva]2-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；g)[γ-羟基-MeLeu]4-[γ-羟基-MeLeu]6-环孢素；h)[MeVal]5-环孢素；i)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-环孢素，orj)[8’-羟基-MeBmt]1-环孢素.
m)[N-苯甲基-Val]5-环孢素，n)[N-5-氟-苯甲基-Val]5-环孢素，o)[N-烯丙基-Val]5-环孢素，p)[N-3-苯基-烯丙基-Val]5-环孢素，q)[Pro]4-环孢素特别优选的活性化合物为[MeIle]4-环孢素和[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素，最优选[MeIle]4-环孢素。
除式I的化合物外，优选的活性化合物还包括，例如r)[γ-羟基-MeLeu]9-环孢素。
可获得活性化合物的方法包括1)发酵2)生物转化3)衍生
4)半合成5)全合成。
这些方法被普遍地描述，并且在EP 0484281 B的实施例1到10中和美国专利No.5767069中更具体地描述了这些方法。在本申请中引入这些概述和这些实施例的教导作为参考。EP 0484281 B的实施例11描述了与环孢素有关的代表性活性化合物的免疫抑制和亲环结合活性的测量，且该实施例的教导也被包括在本申请的公开内容中。
因此本发明提供了非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素在制备用于治疗或预防与Aβ分泌相关病理状态的药物中的用途，所述病理状态包括例如阿尔茨海默病、帕金森病、τ蛋白病(tauopathies)、朊病毒病、额颞型痴呆、纹状体黑质变性、卢伊体痴呆、亨廷顿病、皮克病、淀粉样变和其它与过量Aβ产生相关的神经变性病症。
本发明还提供用于治疗或预防与Aβ分泌相关病理状态的方法，所述病理状态包括例如阿尔茨海默病、帕金森病、τ蛋白病、朊病毒病、额颞型痴呆、纹状体黑质变性、卢伊体痴呆、亨廷顿病、皮克病、淀粉样变和其它神经变性病症，所述方法包括对所述患者施用有效量的本发明的活性化合物。
可以通过任何常规途径，特别是经肠地，例如以饮用溶液、片剂或胶囊形式口服地；或非经肠地，例如以注射液或悬液形式施用活性化合物。静脉内注射途径的每日指示剂量可以是从1到20mg/kg，优选从3到10mg/kg，而口服途径的每日指示剂量为从1到50mg/kg，优选从10到30mg/kg。
活性化合物的毒性被认为低于环孢素。由于活性化合物是非免疫抑制的，避免了环孢素与免疫抑制相关的某些副作用。其它与环孢菌素相关的副作用，特别是长期使用时的肾毒性和中枢神经系统毒性均有利地低于环孢素。
用于活性化合物的优选的盖伦制剂包括那些基于如英国专利申请2222 770A中所述的微乳，其包括局部及口服的形式；还包括如英国专利申请2 209 671A所述从含有脂肪酸糖单酯(例如蔗糖单月桂酸酯)的固溶体获得的口服和可注射的形式。适用于口服施用的单位剂型包括例如每剂从25到200mg活性化合物。
在这里引入EP 0484281 B的制剂实施例A、B、C和D作为参考在英国专利申请2 222 770中有这些制剂各自的成分以及它们的制备方法的详尽描述，在这里引入其内容作为参考。
可以在体内或体外测试中证明活性化合物作为神经保护剂的用途，例如可单独提供本发明的活性化合物，或将其与其它物质组合或序贯联合。例如，可以将本发明的活性化合物与抗炎剂，例如(但不仅限于)糖皮质激素在中风或脊髓损伤后联合施用(作为阻断进一步神经损伤并抑制轴突再生的手段)；还可以将本发明的活性化合物与神经营养因子，如NGF、BDNF或其它用于神经变性疾病的药物，如ExelonTM或左旋多巴联合施用。如这里所用，当同时施用两种物质或以使所述物质在相同时间起作用的方式独立施用两种物质时，称两种物质为联合施用。
由代码、通用名或商品名定义的活性成分的结构可以取自标准纲要“默克索引”的现行版本或来自数据库，例如国际专利(例如IMS世界出版物)。在这里引入其相应的内容作为参考。任何本领域技术人员完全能够鉴定所述活性成分并且基于这些参考同样能够制备和在标准测试模型中体外和体内地测试其药物适应症和特性。
对于上述适应症，适当的剂量将当然地依赖于，例如本发明所使用的具体分子、施用方式和治疗病症的性质和严重性而变化。
实施例实施下列方法以进行以下公开的实施例转染。在含有10％胎牛血清、5％青霉素/链霉素和22mg的左旋脯氨酸的DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的平板中涂布CHO K1细胞(ATCC，Manassas，VA)。将平板置于37℃水压CO2细胞培养箱中孵育过夜。根据制造商说明使用QiagenSuperFect试剂以1∶15的比例(cDNAAPPwt(695))用目的cDNA和全长APP进行共转染。将5×105细胞铺在含有10％胎牛血清、5％青霉素/链霉素的DMEM(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的六孔板中并培养24小时。SuperFect混合物由100μl无血清培养基(DMEM)、3μg的总DNA和20μl的SuperFect组成。从细胞移去培养基并添加1mL新鲜培养基。将全部SuperFect混合物添加至培养基中并在37℃孵育2小时。然后移去混合物并用3mL PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入新鲜培养基并孵育24或48小时。
免疫细胞化学--如制造商(Life Technologies)所述，在OPTIMEM(不含血清培养基)中使用Lipofectamine用适当的构建体转染CHO细胞。如Dev等人1999，Neuropharmacol.，(1999)38，635-644所述，对CHO细胞免疫染色并观察免疫反应性。使用抗-Flag M2单克隆小鼠抗体(Sigma)检测Flag-蛋白质表达，二抗为德克萨斯红-X山羊抗兔IgG(Molecular Probes)。
胱天蛋白酶-3的流式细胞术分析。用CyD或CPZ与APPwt一起瞬时转染HEK细胞24小时。将细胞固定、透化处理并用来自BD Biosciences的胱天蛋白酶-3编程性细胞凋亡试剂盒(#550914)染色。从≥101门控FITC染色的细胞并将其作为胱天蛋白酶-3的阳性细胞测量。同时检查前散射和侧散射以检验细胞群的健康。
化合物处理。用环孢菌素A、Sangliferhin A、FK506(如Sedrani等人，J.Am.Chem.Soc.125，3849-3859页(2003)所述，将其整体引入作为参考)和N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素浓缩物处理稳定表达APPswe突变体的HEK293细胞24小时。使用来自Promega的CellTiter-Glo试剂盒(#G7573)测量细胞生存力。使用自制双夹层酶联免疫吸附测定(除使用Novartis发展的抗体代替Biosource抗体外，自制酶联免疫吸附测定与所述形式相同)测量细胞上清中Aβ40和Aβ42水平。使用稳定表达5×Gal4应答元件荧光素酶报道基因和C99-Gal4-VP16或刻缺蛋白-Gal4-VP16构建体的细胞系测量C99或刻缺蛋白切割(如Maltese、Wilson等人2001所公开的)。Gal4-VP16在由γ-分泌酶切割后被释放并结合到报道基因增加荧光素酶活性。用化合物处理稳定细胞并测定IC50值。
Aβ酶联免疫吸附测定。将可商购的靶向Aβ肽NH2末端的小鼠单克隆抗体作为预包被96孔板的捕获抗体(对于Aβ40为BiosourceCat#KBH3481/PPO81，对于Aβ42为Cat#KBH3441/PPO81)。从Biosource获得多克隆检测抗体(抗hAβ40抗体Cat#44-348和抗hAβ42抗体Cat#44-344)并周15mM叠氮化钠以1/220稀释。二抗(Aβ4为BiosourceCat#KBH3481，Aβ42为Cat#KBH3441)为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG。用3.3mM百里香酚按1/100稀释二抗。使用前将抗体包被板用PBS-TE(1mM EDTA和0.05％吐温20，洗涤缓冲液)在微量培养板洗涤器(Bioteck Instruments，Inc，Winooski，VT)上洗涤四次。取出100μl转染细胞的条件培养基并在含有1mM AEBSF(Biosource，Camarillo，CA)的样品稀释剂中以1∶2稀释。将100μl该混合物加至洗过的抗体包被的96孔板中，用胶带覆盖并在4℃孵育过夜。移去样品并用洗涤缓冲液洗涤平板四次。按100μl/孔添加抗体检测溶液，并将平板在室温摇动培养2小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板四次并按100μl/孔添加二抗和摇动孵育2小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板5次并在纸巾上拍干。每孔添加100μl稳定色原(四甲联苯胺)并将平板在黑暗中孵育30分钟。向平板中添加100μl终止液(1NH2S)以终止反应。1小时内在微量培养板读取器(microplate reader)(Molecular Devices)于450nM读取平板。
抗体和Western印迹分析。如先前所述将APP野生型和APP瑞典突变体的cDNA插入pCI质粒表达载体巨细胞病毒启动子下游(Promega，Madison，WI)(Bodendorf，U.、Fischer，F.、Bodian，D.、Multhaup，G.、Paganetti，P.2001 J.Biol.Chem.27612019 12023)。PS1 NTF抗体识别PS1的N末端(Thinakaran、Borchelt等人1996)。细胞转染24小时后在含有蛋白酶抑制剂(CompleteRoche Molecular Biochemicals)的RIPA缓冲液(10mM Tris pH 7.5、150mM氯化钠、1mM EDTA、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、1％SDS)中提取培养的HEK293细胞并在4℃以10000×g离心10分钟。收集上清液并丢弃沉淀。随后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物，转移至PVDF Immobilon-P膜(Millipore)并用指示的一抗探测。如先前所述(Manni，M.，等人，1998.FEBS.427367-370)用ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)进行免疫检测。
免疫细胞化学--如制造商(Life Technologies)所述，在OPTIMEM(无血清培养基)中使用Lipofectamine用适当构建体转染CHO细胞。如Dev等人1999，Neuropharmacol.，(1999)38，635-644所述，对CHO细胞免疫染色并观察免疫反应性。使用抗-Flag M2单克隆小鼠抗体(Sigma)检测Flag-蛋白质表达。二抗为德克萨斯红-X山羊抗兔IgG(Molecular Probes)。
CPZ构建体--从购自Life Technologies，Inc的纯人DRG的标准化cDNA文库(L0001)(LTI，商品号11315-017，批号81027-242)获得野生型人羧肽酶(hCPZ)。将cDNA插入片段以5’到3’的方向克隆至Gateway-相容载体pCMV·SPORT6的EcoR V和Not I位点。使用引物通过位点定向的诱变完成对对应于氨基酸42-161的卷曲(FZ)结构域和氨基酸179-568的催化(Cat)结构域的缺失、点突变(氨基酸E251A)以及在氨基酸29之后引入N-末端FLAG标签(DYKDDDDK Seq ID.No 1)，所述引物为5’CCTCCAGGCCTCCCCGAAGCTTCTCGGCGCTGTCTGCAGCTGGTGGCCTGTGG-3’(Seq Id No.2)和5’CCACAGGCCACCAGCTGCAGACAGCGCCGAGAAGCTTCGGGGAGGCCTGGAGG-3’(Seq Id No.3)用于卷曲结构域的缺失，5’CCACACGGCCAGCCCTCTTCATCCGGGCCAGCCCTGAGGGCAGTGCCTCGTCAGC-3’(Seq Id No.4)和5’GCTGACGAGGCACTGCCCTCAGGGCTGGCCCGGATGAAGAGGGCTGGCCGTGTGG 3’(Seq Id No.5)用于催化结构域的缺失，5’CATCTCCCGGCCCGCCACCGCGTTGCCATGAATGTTGC-3’(Seq Id No.6)和5’GCAACATTCATGGCAACGCGGTGGCGGGCCGGGAGAIGC-3’(SeqId No.7)用于点突变E251A，以及5’GGTGGCCTGTGGCATTCACCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGGCGGGGTTCCGCTCAAACTCG-3’(Seq Id No.8)和5’CGAGTTTGAGCGGAACCCCGCCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGTGAATGCCACAGGCCACC-3’(Seq Id No.9)用于引入FLAG标签。使用Qiagen质粒试剂盒从转化的大肠杆菌中分离所有DNA。使用ABI Prism 3700 DNA分析仪系统通过DNA测序验证所有可读框的序列。
原位杂交--使用聚合酶链式反应(PCR)用5’侧接SP6启动子和T7启动子识别序列的自身引导的寡核苷酸引物，可以不需要任何克隆步骤地从任何已知基因序列产生RNA探针模板。PCR反应进行如下95℃变性45秒，58℃退火阶段30秒，70℃延伸阶段1分钟，共40个循环。在4％琼脂糖凝胶上分离后，用QiAQuick纯化试剂盒根据制造商说明(Qiagen，Switzerland)纯化PCR产物。使用含有地高辛-UTP的dNTP用T7-RNA聚合酶(反义)和SP6-RNA聚合酶(正义)于37℃2小时转录纯化的PCR产物。除去未整合的核苷酸，用乙醇沉淀探针并将其溶于50μl水中然后储存在-20℃。将DIG-探针和标记的对照RNA(已知浓度)的梯度稀释点在尼龙膜上。用与抗DIG抗体缀合的碱性磷酸酶孵育后，接着使用NBT/BCIP(溶在70％二甲基甲酰胺和30％水中的75mg/ml氮蓝四唑和溶在100％二甲基甲酰胺中的50mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐)作为碱性磷酸酶底物进行显色步骤。通过与标记的对照RNA点的强度比较估计CPZ探针浓度。使用原位杂交和免疫化学的全自动仪器DiscoveryTM(Ventana MedicalSystems，Strasbourg)进行ISH。在RNA分析实验室内建立使用石蜡包埋的组织切片定位该基因的方法，且该方法如下所述，在无溶剂条件下使用EZprep溶液(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)于75℃8分钟，继之于42℃8分钟对组织切片进行去石蜡化和再水化。使用RiboMapTM试剂盒(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)根据制造商说明并且使用酶消化作为一个附加的透化步骤完成所有的预处理步骤用12μg/ml的蛋白酶K于37℃消化16分钟获得最佳结果。用稀释于RiboHybe溶液(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)的适量DIG-核糖核酸探针(CPZ探针＝5ng/载玻片)在45℃进行CPZ探针杂交6小时。杂交后在高严格条件(0.1×SSC)下于50℃8分钟洗涤3次。为了检测DIG-标记，用抗体稀释剂以1/2000稀释生物素缀合的小鼠抗地高辛抗体(JacksonImmunoresearch Inc.)之后，于37℃施加所述抗体30分钟，继之使用BlueMapTM试剂盒(Ventana Medical Systems SA，Strasbourg)根据制造商说明进行BCIP/NBT显色检测。具有最佳信/噪平衡的底物孵育时间为4小时。使用ISH核快红(nuclear fast red)复染10分钟。在石英盖片(Crystalmount)中固定切片并使用Permount封片。
实施例1早老蛋白加工观察到过表达cDNA提高C99底物的Aβ水平，提示GACE介导的APP切割提高。由于CPZ和CyD显著提高C99的加工并提高Aβ42分泌，选择它们进一步研究。检测了用CPZ或CyD转染的HEK293细胞中PS1 N末端片段(NTF)水平。在用PS1稳定转染的细胞中，可容易地检测到全长PS1和NTF。相反，在未转染的HEK细胞中，内源全长PS1和NTF水平较低。在过表达CPZ或CyD的细胞中，PS1 NTF水平的显著提高指示这些片段在以更高速率产生或者内源NTF在48小时的转染期间被稳定化。
CPZ分析CPZ是羧肽酶(CP)基因家族的成员，属于CPE亚家族，已知其加工生物活性神经肽(Song和Fricker 1997)。CPE相关酶通常参与选择性加工反应，其从加工中间体的C末端选择性去除碱性残基。为了确定CPZ的催化活性、表达或亚细胞定位是否是诱导Aβ所必需的，产生三种CPZ突变构建体。在第一种构建体中，完全去除催化结构域(Δcat)只剩下信号肽、卷曲结构域和C末端。在第二种构建体中缺失卷曲结构域(Δfz)，而在第三种构建体中，向催化结构域中引入损伤CPZ催化活性的单个点突变(Glu251Ala)。将每种CPZ变体与APPwt或C99底物共转染进入HEK293细胞。与野生型CPZ或flag标记的CPZ相比，三个突变构建体各自均不具有活性。使用APPwt和C99底物的结果是相似的。
对CPZ突变体活性缺失的可能的解释为在细胞中缺少表达或该蛋白质的错误定位。为了弄清该问题，用flag标记CPZ突变体并在CHO细胞中过表达。在透化处理的细胞中，CPZ野生型具有澄清的细胞质膜或迟的分泌小泡定位。该结果与之前检测CPZ胞内分布的研究一致(Novikova、Reznik等人2000)。CPZ突变构建体Δcat、Δfz和Glu251Ala的亚细胞定位保持不变。这些发现提示CPZ的催化活性而非其细胞内定位或表达水平是在CHO细胞中诱导Aβ水平所必需的。
破坏CPZ催化活性阻止Aβ产生而不影响其表达或亚细胞定位。过表达CPZ能够与Wnt竞争与内源卷曲受体的结合引起更少的β-联蛋白激活(Tesco、Kim等人1998)。β-联蛋白活性降低与提高的Aβ产生相关，认为所述提高的Aβ产生是由PS1提高β-联蛋白与GSK3β缔合的能力介导的(Kang、Soriano等人1999)。可能CPZ能够通过经由胱天蛋白酶-3激活PS1切割诱导Aβ产生，导致更少的PS1/β-联蛋白复合物(Tesco、Kim等人1998)。如果PS1未与β-联蛋白结合，则其能够更容易地与GACE复合物缔合。由于卷曲结构域表征为蛋白质相互作用结构域，可能CPZ的卷曲结构域能够与γ-分泌酶复合物的组分(即PS1或APP自身)相互作用。目前正在研究这些相互作用。
值得注意的是，认为CPZ结构域的C末端含有将CPZ从质膜释放至胞外环境的假定的弗林蛋白酶切割位点(Novikova、Reznik等人2000)。弗林蛋白酶还参与刻缺蛋白配体δ从细胞表面刻缺蛋白的释放(Ikeuchi和Sisodia 200)。尽管尚未确认CPZ上的弗林蛋白酶位点为弗林蛋白酶底物，已证明能够从细胞分泌CPZ(Novikova、Reznik等人2000)。这提示CPZ可能位于与刻缺蛋白相同的加工通路上，但目前尚不清楚CPZ的刻缺蛋白切割如何涉及Aβ产生(Kim、Wang等人1999)。然而，观察到，与CyD过表达相似，CPZ能够使细胞进入细胞凋亡，指示两种蛋白质存在影响Aβ产生的共同机制。
先前的发现(Novikova和Fricker 1999)提示，CPZ在大鼠脑柔脑脊膜细胞中表达，但尚未显示CPZ在已知受阿尔茨海默病侵袭的脑区域中表达(Novikova和Fricker 1999)。为了确定CPZ在何处表达，通过原位杂交分析小鼠脑切片。在野生型C7BL-6小鼠(Jackson Laboratories)中，CPZ反义探针显示在脑中有广泛分布的结合，在小脑和额皮质具有最高水平信号。在更进一步的检查中，还发现CPZ在靠近CA1和CA3区域的海马中，最可能在锥体细胞中表达。在小脑中，CPZ在靠近Perkinje和颗粒细胞层的分子区域表达。CPZ在额皮质中的分布未显示位于特定细胞类型中，而是在该区域中平均地表达。CPZ在小鼠海马、小脑和额皮质中的定位说明其在脑中已知受到人阿尔茨海默病侵袭的区域表达。
CyD的表征为了测定这些抑免蛋白结合化合物是否能够调节APP加工，用一定浓度范围的环孢菌素A、Sangliferhin A、FK506或N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素浓缩物处理HEK/APPswe稳定细胞。按照制造商说明(Promega Cat#G5421)对每个浓度通过MTS测定法测量生存力并用本文所述酶联免疫吸附测定法测量分泌的Aβ40和Aβ42。所有浓度的生存力IC50均＞40μM。环孢菌素A、Sangliferhin A对于Aβ40和Aβ42的抑制性IC50为＜3μM，说明对Aβ分泌的强抑制。N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素对于Aβ40和Aβ42分泌的IC50为＜10μM，而FK506对于Aβ分泌没有影响。相反，FK506处理引起Aβ42从3-20μM的剂量依赖性提高。
已证明免疫抑制剂如环孢菌素A能够抑制若干动物模型中神经变性和细胞凋亡并抑制分离的小鼠线粒体中Aβ诱导的线粒体损伤(Kim 2002)。由于CyD是环孢菌素A的靶标并定位于线粒体内，其可能在该位点Aβ加工中起作用，提示CyD可能对人AD的发展是重要的。尽管尚未测试到其它同工型，CyD可能由于它是唯一已知定位于线粒体的亲环蛋白同工型对Aβ加工具有独特效应。发现在HEK细胞中过表达CyD能够提高胱天蛋白酶-3活性并稳定PS1 NTF，提示其能够直接修饰PS1活性。另外，能够与CyD结合并抑制其活性的化合物强烈抑制Aβ分泌和C99切割。
具体的，3μM Sanglifehrin A强烈抑制Aβ并且在低于20μM之前对细胞没有毒性。已知Sanglifehrin A结合CyD并抑制其PPIase活性，而不影响CyD与腺嘌呤核苷酸易位体(ANT)的结合能力，并且不抑制如CsA(Samantha J.Clarke 2002)的钙调磷酸酶的活性。可以以若干方式解释Sanglifehrin A急剧升降的剂量应答(steep dose response)。只有当Sanglifehrin A与相当多部分的CyD结合，足以破坏其在MPT的活性时，Sanglifehrin A才可抑制孔道开放(Clarke 2002)。由于ANT以二聚体存在，很可能CyD必需以多于一个分子与ANT结合以诱导构象变化。由于Sanglifehrin A必需结合多个CyD分子以抑制MPT复合物活性，这将解释在3μM阈值时对Aβ分泌的快速抑制。一旦达到该阈值，MPT复合物可被完全抑制并阻止孔道开放。该MPT抑制的阈值还似乎是Aβ加工和/或分泌的重要调节物。或者，Sanglifehrin A可以具有与CyD不同或除CyD之外还有多个靶标。尚不清楚CyD是直接通过其PPIase活性还是通过MPT构象变化调节MPT化合物。无论如何，这里所给出的数据与由其它研究给出的数据一致说明CyD和MPT孔道在Aβ加工中起关键作用。
尽管这些化合物能够显著降低Aβ分泌并抑制C99切割，它们还抑制刻缺蛋白切割。考虑到数据显示CyD和CPZ过表达影响GACE活性，这一结果并不令人惊讶。这一数据首次说明抑免化合物能够抑制GACE活性并定义了细胞中能够影响Aβ和刻缺蛋白加工的新通路。
值得注意的是，FK506处理以剂量依赖的形式显著地提高Aβ42分泌。已知FK506结合抑免蛋白而非CyD。Aβ42的特异性提高提示FK506靶蛋白质可能调节Aβ42的代谢或产生。FK506和CsA都能抑制钙调磷酸酶但它们对Aβ分泌具有不同影响，因此钙调磷酸酶可能不影响Aβ水平。FK506的这一独特影响进一步支持抑免蛋白通路调节Aβ加工。
实施例2C99和刻缺蛋白切割如Maltrese、Wilson等人2001所述，使用带有信号肽、TGN保留序列和插入在Q56/Y57处的GAL4-NLS-VP16序列的修饰的C99或刻缺蛋白跨膜序列产生HEK 293稳定细胞系。所述细胞还稳定表达5×GAL4RE-荧光素酶报道基因构建体(RD-2002-01437和RD-2001-02419)。当切割C99转基因从而激活Gal4荧光素酶报道基因时，测量到这些细胞的GACE活性。用环孢菌素A、Sangliferhin A、FK506或N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素处理这些HEK稳定细胞并确定C99切割的IC50。GALVP可单独作为阴性对照。环孢菌素A、N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素、Sangliferhin A和FK506的GALVP IC50分别为6.9、9.9、＞20和＞20μM，由于这些化合物在＞40μM之前并无毒性，表明C99切割的抑制与细胞生存力间存在明显联系。然而，环孢菌素A、N-甲基-4-缬氨酸-环孢菌素、Sangliferhin A分别在0.71、0.87和0.85μM都抑制C99切割，并分别在1.7、2.7和3.2μM抑制刻缺蛋白切割。FK506对C99或刻缺蛋白切割没有影响。因此能够与CyD结合的配体强烈抑制C99和刻缺蛋白切割表明GACE活性被抑制。
实施例3胱天蛋白酶-3激活近期研究提示激活胱天蛋白酶-3能够引起Aβ分泌提高并稳定GACE复合物中的蛋白质(Tesco、Koh等人2003)。由于CyD和CPZ都提高Aβ分泌并稳定PS1 NTF，在CyD和CPZ过表达细胞中分析胱天蛋白酶-3激活的水平。用CyD和CPZ与APPwt一起瞬时转染HEK 293细胞24小时，皂苷透化处理、固定并用针对活性胱天蛋白酶-3的FITC缀合的单克隆抗体探测。阴性对照细胞用空载体和APPwt转染，而阳性对照细胞在分析前用1μM星形孢菌素处理6小时。在表达CyD的细胞中，52％检测的细胞是活性胱天蛋白酶-3阳性的，而在表达CPZ的细胞中，48％的细胞是胱天蛋白酶-3阳性的。这些结果表明这些蛋白质的过表达诱导胱天蛋白酶-3的激活，提示这是稳定化PS1 NTF和提高Aβ分泌的可能机制。
权利要求
1.非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素在制备用于治疗或预防与Aβ产生和/或分泌相关病理状态的药物中的用途，所述病理状态例如阿尔茨海默病、帕金森病、τ蛋白病、朊病毒病、额颞型痴呆、纹状体黑质变性、卢伊体痴呆、亨廷顿病、皮克病、淀粉样变和其它与过量Aβ产生相关的神经变性病症。
2.用于治疗或预防与Aβ产生和/或分泌相关的病理状态的方法，其包括对所述患者施用有效量的非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素。
3.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素为式A的化合物及其可药用盐 其中B为式B的氨基酸残基 其中a表示连接位置2的αAbu残基的键；b表示连接位置4的C残基的键；Alk代表含有2到6个碳原子的直链或支链亚烷基或含有3到6个碳原子的环亚烷基，且R代表羧基或烷氧基羰基；-NR1R2基，其中R1和R2是相同或不同的并且代表氢、烷基、C2-4链烯基、C3-6环烷基、苯基(任选地由卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基取代)或苯甲基或含有5或6个环原子及1到3个杂原子的饱和或不饱和杂环基；或其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和的杂环，所述杂环含有4到6个环原子，任选地含有选自氮、氧或硫的其它杂原子，并任选地由烷基、苯基或苯甲基取代；下式的原子团 其中R1和R2如上定义，R3代表氢或烷基且n为从2到4的整数，且其中烷基表示含有从1到4个碳原子的直链或支链烷基；C为MeLeu或4-羟基-MeLeu。
4.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素为式I的化合物 其中W为MeBmt、二氢-MeBmt或8′-羟基-MeBmt；X为αAbu、Val、Thr、Nva或O-甲基苏氨酸(MeOThr)；R为Sar或(D)-MeAla；Y为MeLeu、γ-羟基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、Me Tyr、MeTyr(O-PO(OH)2)、MeaIle或MeaThr或Pro；Z为Val、Leu、N-Alk-Val或N-Alk-Leu，其中Alk代表Me或如下取代的Me由乙烯基取代的Me，所述乙烯基任选地由苯基或含有6元环的N、S或O杂芳香基取代，或由苯基取代的Me，所述苯基任选地由卤素取代；Q为MeLeu、γ-羟基-MeLeu或MeAla。
5.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素为选自以下的化合物a)[二氢-MeBmt]1-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；b)[MeVal]4-环孢素；c)[MeIle]4-环孢素；d)[MeThr]4-环孢素；e)[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；f)[Nva]2-[γ-羟基-MeLeu]4-环孢素；g)[γ-羟基-MeLeu]4-[γ-羟基-MeLeu]6-环孢素；h)[MeVal]5-环孢素；i)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-环孢素，orj)[8’-羟基-MeBmt]1-环孢素.m)[N-苯甲基-Val]5-环孢素，n)[N-5-氟-苯甲基-Val]5-环孢素，o)[N-烯丙基-Val]5-环孢素，p)[N-3-苯基-烯丙基-Val]5-环孢素，q)[Pro]4-环孢素，或r)[γ-羟基-MeLeu]9-环孢素。
6.根据权利要求1的用途或根据权利要求2的方法，其中非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢素为[MeVal]4-环孢素。
全文摘要
非免疫抑制的亲环蛋白结合环孢菌素可以，例如在与Aβ分泌和/或产生有关的病理状态的预防或治疗中用作神经保护剂。
文档编号A61P25/00GK1984670SQ200580023721
公开日2007年6月20日 申请日期2005年7月12日 优先权日2004年7月13日
发明者D·科恩, L·A·该赛 申请人:诺瓦提斯公司
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