流感病毒疫苗抗原制备方法的改进的制作方法
专利名称：流感病毒疫苗抗原制备方法的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感疫苗制备领域。
背景技术：
参考文献1的第17和18章描述了目前常规使用的流感疫苗。它们基于活病毒或 灭活病毒，灭活疫苗可以基于完整病毒、‘裂解'病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素以 及也是通常使用的神经氨酸酶)。已知有许多不同的制备裂解抗原疫苗和表面抗原疫苗的方法。例如，各种裂解过 程如参考文献2-8所述，而制备表面抗原疫苗的不同方法披露于参考文献9-14。本发明的目的是提供制造裂解疫苗和表面抗原疫苗的改良方法。
发明内容
发明人曾经对现有的从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的方法设计了许多改进。去污剂使用时间的改进在现有纯化方法中，流感病毒颗粒先接触第一去污剂(例如聚山梨酸酯，如聚山 梨酸酯80)，然后用第二去污剂(例如CTAB)裂解。第一去污剂在病毒灭活之前使用，而第 二去污剂在灭活之后加入。在上述方法中，第二去污剂随后除去，而第一去污剂仍旧保留， 从而有助于抗原溶解。相反，根据本发明的第一个方面，第一去污剂较晚使用，具体地说是在已经用第二 去污剂裂解病毒颗粒之后。这种时间和顺序的变化使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是 对于H5亚型的甲型流感病毒。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流 感病毒颗粒；(iii)用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂 交换第一去污剂。所述去污剂交换步骤可在裂解步骤之后的任何时刻进行，但在病毒颗粒 捕获步骤之前进行较为理想，所述捕获步骤可通过以下方法进行，例如，亲和捕获、伪亲和 捕获、层析或吸附(见下文)。因此，第二去污剂可在裂解之后但在病毒颗粒捕获之前加入。 可在病毒颗粒捕获之后再加入额外量的第二去污剂，尤其是如果之前加入的第二去污剂的 量小于1.5g/L时。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在不存在去污剂 时灭活流感病毒颗粒；用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；以及在裂解后用第 二去污剂交换第一去污剂。
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在第一方面的其它实施方式中，所述第二去污剂是在灭活之后但在裂解之前加入 的。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不 存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病 毒颗粒；(iii)加入第二去污剂但不裂解灭活的病毒颗粒；(iv)在存在第二去污剂时用包 含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(ν)除去第一去污剂同时保留第二去污剂。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在不存在去污剂 时灭活所述流感病毒颗粒；在存在第二去污剂时用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒 颗粒；以及在裂解之后除去第一去污剂同时保留第二去污剂。在改进去污剂使用时间的还有其它实施方式中，去污剂是在病毒颗粒灭活之前、 但在对病毒颗粒进行超滤/渗滤步骤之后加入的。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒 颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组 合物；( )对含有病毒颗粒的组合物进行超滤/渗滤；(iii)在滤过的含有病毒颗粒的组 合物中加入去污剂但不裂解病毒颗粒；和(iv)灭活流感病毒颗粒。该方法还可包括步骤 (ν)用去污剂裂解灭活的病毒颗粒。步骤(ν)中使用的去污剂可以不同于步骤(iii)中使 用的去污剂。可在步骤(ν)之后加入额外量的与步骤(iii)中所用相同的去污剂，尤其是 如果步骤(iii)中去污剂的加入量小于1. 5g/L时。在之前去污剂的加入量小于1. 5g/L时再加入额外量的去污剂的实施方式中，额 外的加入可在进一步超滤/渗滤步骤之前进行。裂解过程的改进流感疫苗的裂解过程涉及用增溶浓度的去污剂处理病毒颗粒。合适的去污剂包括 聚山梨酸酯类(吐温类)[6]、曲通X-100[6，10，15]、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB) [9，16] 和脱氧胆酸盐[2，17]。在现有纯化过程中，在存在20mM Tris/HCl时接触去污剂而裂解流感病毒颗粒。相 反，根据本发明的第二个方面，在存在具有较高离子强度缓冲液时使用去污剂。因此，本发 明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)获得包含流感病毒 颗粒的组合物；(ii)通过接触用离子强度为IOOmM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解 所述病毒颗粒。这种升高的离子强度使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型 的甲型流感病毒。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的缓冲液的离子强度至少为100mM,例如≥200mM、≥300mM、≥400mM、 ≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM,等等。可通过各种途径获得这种较高的离子强度， 例如使用单价离子(如NaCl)、二价离子(如硫酸盐)、三价离子(如磷酸盐)，等等。使用 三价离子是提高离子强度的便捷方法。一种适用的缓冲液，尤其是当用于基于CTAB的裂解 过程时，是用50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5配制的200福NaCl。在裂解过程中升高离子强度 时需要小心，尤其对于细胞培养物中生长的病毒，以免造成在随后的处理步骤中需要保留 的DNA大量溶解。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于用离子强度为 100mM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解病毒颗粒。
磷酸盐缓冲液在现有纯化过程中，在用Tris缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗粒。 相反，根据本发明的第三个方面，在用磷酸盐缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗 粒。这种缓冲液变化使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在存在磷酸盐缓冲液时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭 活所述流感病毒颗粒；和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的磷酸盐缓冲液 的PH值在6. 5和8. 5之间，例如在7. 0和8. 0之间，或者约7. 5。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于灭活和随后的裂 解病毒颗粒都在存在磷酸盐缓冲液时进行。超滤膜在现有纯化工艺中，半纯化的裂解后流感病毒表面抗原用聚苯醚砜(PES)膜超滤 /渗滤进一步纯化。相反，根据本发明的第四个方面，超滤采用的是纤维素膜。这种膜的变 化降低了疏水性和蛋白质保留，使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型 流感病毒。因此，本发明提供了一种从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述糖蛋白 的方法，包括用纤维素膜超滤所述混合物的步骤。通过这种方法获得的纯化糖蛋白可用于 制备流感疫苗。本发明还提供了一种通过超滤从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述 糖蛋白的方法，改进之处包括采用纤维素超滤膜。可使用各种类型的纤维素膜。这些膜可基于纤维素本身、纤维素酯(例如二乙酸 酯、三乙酸酯、硝酸酯，等等)或其混合物。例如，参考文献18披露了具有非纤维性聚合微孔 基底的膜，膜层由纤维素和/或乙酸纤维素形成。所述膜层的厚度在1-20微米之间，并且 可以延伸入微孔基底5-30微米。参考文献19披露了基于三乙酸纤维素的不对称超滤膜， 该膜任选被至多达30%的二乙酸纤维素取代。参考文献20披露了形式为中空纤维的渗滤 膜，其具有乙酸纤维素或乙酸纤维素衍生物构成的连续内腔。在第一层析步骤之前加入额外处理步骤在现有纯化工艺中，为从细胞培养物发酵培养基组分中分离流感病毒颗粒，流感 病毒颗粒是从树脂上的培养收获物中捕获的。已经观察到某些毒株不能完全结合于树脂。根据本发明的第四个方面，在捕获步骤之前将病毒收获物进行超滤/渗滤到低电 导率缓冲液中。根据流感病毒毒株不同，该初始步骤可使抗原产量提高至多达10倍，且对 于不结合于捕获剂的病毒颗粒尤其有用。因此，本发明提供了一种处理含有流感病毒颗粒的液体培养基的方法，包括超滤 所述液体培养基的步骤以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒渗余物。然后进一步处理 该渗余物，例如通过亲和捕获、吸附、层析等等。本发明还提供了一种从含有流感病毒颗粒的液体培养基中分离流感病毒颗粒的 方法，改进之处在于在分离之前对所述液体培养基进行渗滤以提供包含低电导率缓冲液的 含病毒颗粒渗余物。
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本发明还提供了一种从含有病毒颗粒的液体培养基中分离流感病毒颗粒的方法， 所述方法包括以下步骤(i)渗滤该液体培养基以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒 渗余物；和然后(ii)通过选自亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附的方法从渗余物中捕获 病毒颗粒。通过这些方法获得的渗余物和病毒颗粒可用于制备流感疫苗。渗滤利用透性膜滤器根据溶液和悬浮液组分的分子大小将它们分离。小组分可通 过膜形成滤液，而较大的组分(如病毒颗粒)则无法通过而被保留。可利用渗滤来降低盐、 溶剂或液体培养基中其它低分子量种类的浓度，并任选用来引入新的种类(例如用来交换 缓冲液)。渗滤可以是连续或不连续的。连续渗滤包括以与滤液生成速度基本相同的速度 在缓冲液或样品中加水来洗出最初的低分子量种类。如果将缓冲液用于渗滤，则样品中的 新缓冲盐的浓度会以与被除去种类的浓度成反比的速度提高。采用连续渗滤，用所选缓冲 液进行6当量样品体积洗涤后通常可除去超过100%可渗透溶质中的99. 5%。不连续渗滤 用大量的水或缓冲液稀释样品，然后浓缩回原始体积。本发明优选不连续渗滤。典型的培 养基渗滤包括至少2(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多)倍渗滤体积(即在渗滤开始时至少 2x样品体积)。渗滤可采用任何合适的膜(例如，PES、纤维素等，如上文所述)以任何合适方式 (例如，中空、盒式、螺旋等等)进行。所述膜保留病毒颗粒的截断值为，例如，500kDa。渗滤步骤可在超滤步骤之前进行，例如，以便浓缩液体培养基。浓度将通常浓缩至 少2倍，例如，> 2倍、> 3倍、> 4倍、> 5倍、> 10倍，等等。超滤/浓缩和随后的渗滤可 采用相同设备进行。渗滤之前进行浓缩能降低完成渗滤所需的液体体积，因此是有利的。渗滤之后的渗余物含有低电导率缓冲液。合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris/ HCl缓冲液、TES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液，等 等。渗余物的电导率通常小于20mS/cm，例如0. 5-10mS/cm，或者是1.0-1.4mS/cm。可采用 IOmM磷酸盐缓冲液。可采用亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附从渗滤渗余物中捕获病毒颗粒。已知适 用于流感病毒的合适技术。例如，已知可采用欧卫矛(Euonymuseuropaeus)凝集素[21]或 用Cellufine Sulfate(CS)或硫酸化S印hadex柱进行亲和捕获或伪亲和捕获。可吸附于， 例如，聚电解质[22]、硫酸钡[23]或磷酸钙[24]，等等。在使用捕获材料之前用渗余物中 存在的低电导率缓冲液进行平衡是有益的。因此，例如，可用IOmM磷酸盐缓冲液平衡捕获 树脂。相同的缓冲液也可用来洗涤捕获材料，然后释放捕获的病毒颗粒。流感病毒本发明可用来从包括甲型、乙型和丙型流感病毒在内的任何合适的流感病毒中制 备抗原。尤其可用于感染人类的甲型病毒株。用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种A 型流感毒株(Hmi和H3N2)和一种B型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明可使用这种流 行间病毒，但也可使用来自大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触的毒株) 的病毒，尤其是甲型流感病毒。因此，本发明可采用选自下组的任何甲型流感病毒血凝素亚 型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16。所述病毒可额 外具有以下任何NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
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本发明尤其适用大流行甲型流感病毒毒株，如H5W毒株。大流行毒株的特征有 (a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即数十年没有在人群中发现 的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如H5、H6或H9，通常只出现在鸟群 体中)，从而疫苗受者和常规人群对该毒株的血凝素没有免疫力；(b)它能够在人群中水平 传播；和(c)它能使人致病。大流行毒株H2、H5、H7或H9亚型毒株有，例如，H5N1、H5N3、 H9N2.H2N2.H7N1和H7N7毒株。H5亚型的病毒可分成许多进化支，如进化支1或进化支2。 已经鉴定出进化支2的6个亚进化支，其中亚进化支1、2和3具有不同的地理分布，并且由 于它们可感染人类而尤其受到重视。乙型流感病毒通常不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒确实可分成两种不同 的谱系。这些谱系在20世纪80年代晚期出现，具有在抗原性上和/或遗传上明显相互不 同的HA[25]。目前的乙型流感病毒毒株类似于B/Victoria/2/87或B/Yamagata/16/88。 这些毒株在抗原上通常不同，但也可用氨基酸序列的差异来区别两种谱系，例如，B/ Yamagata/16/88样毒株通常(但不是总是)具有氨基酸残基164缺失的HA蛋白，上述编号 是根据‘Lee40’ HA序列定的[26]。本发明可用于任一谱系的乙型流感病毒抗原。流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。 然而，当使用活病毒作为疫苗抗原时这三个特征更加典型。流感病毒可以是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[27]和/或扎那米韦有 抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[28]。可用于本发明的流感病毒可以是再分类毒株，并可通过逆向遗传学技术获得。逆 向遗传学技术[如29-33]能够用质粒在体外制备含有所需基因组区段的流感病毒。该技术 一般包括表达(a)例如，由poll启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子编码所需病毒RNA分子 的DNA分子，和(b)例如，由polll启动子编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两 种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质， 但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的基于质粒的方法[34-36]，这些方法也包括 使用质粒来表达所有或一些病毒蛋白(例如，仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中最 多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，近期方法[37]将多个RNA聚合酶I转录盒 (用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A vRNA区 段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码 1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感々!111 ^转录物的序列)上。参考文献37方法的优选方面包 括(a)PBl、PB2和PA mRNA编码区在同一质粒上；和(b)所有8个vRNA编码区段在同一质 粒上。一个质粒上包含NA和HA区段而另外六个区段位于另一质粒上也可能是有利的。Poll启动子是种特异性的，因此可选择与发生反向遗传学的细胞类型相匹配的启 动子，例如在犬细胞中优选使用犬poll启动子[38，39]。然而，作为使用poll启动子来编 码病毒RNA区段的替换方式，可使用噬菌体聚合酶启动子[40]。例如，可方便地使用SP6、 T3或T7聚合酶的启动子。由于poll启动子的物种特异性，噬菌体聚合酶启动子可能较适 合许多细胞类型，但也必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。在其它技术中，可能使用po 11和po 1II双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和 可表达的mRNA [41，42]。
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因此，流感A病毒可包含来自A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(一般是 来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2再造毒株)。也可包含 来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的再造病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA 区段。甲型流感病毒包括不到6个(即0，1，2，3，4或5)个来自AA/6/60流感病毒(A/ AnnArbor/6/60)的病毒区段。乙型流感病毒包括不到6个(即0，1，2，3，4或5)个来自 AA/1/66流感病毒(B/ArmArbor/1/66)的病毒区段。本发明一般保护免受能够在人之间传 播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含源自哺乳动物(如人)流感病毒的至少一 个RNA区段。它可包含源自禽流感病毒的NS区段。流感病毒生长和病毒颗粒纯化可对含有流感病毒颗粒的原料进行本发明的方法。这些病毒颗粒可以是病毒在卵 (例如，无特定病原体的卵)或在细胞培养物中生长的产物。目前培养流感病毒的标准方法 采用含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。然而，更近一段时间以来，已经在动 物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。用来生长流感病毒的细胞系通常是哺乳动物来源的。合适的哺乳动物细胞来源包 括但不限于仓鼠、牛、灵长动物(包括人和猴)和犬细胞，但不优选使用灵长动物细胞。可 采用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例 子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞， 如Vero细胞系[43-45]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于=MDCK ；CHO ；CLDK ；HKCC ；293T ；BHK ；Vero ； MRC-5 ；PER. C6[46] ；FRhL2 ;WI_38 ；等等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型 培养物保藏中心(ATCC) [47]、Coriell细胞库[48]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。 例如，ATCC供应各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81. 2、CRL1586和CRL-1587，还 供应MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER. C6可获自ECACC，保藏号为96022940。最优选的细胞系是具有哺乳动物类糖基化的细胞系。哺乳动物细胞系的一个较不 优选的替代方式是，可以在禽细胞系上培养[例如参考文献49-51]，包括衍生自鸭(如鸭视 网膜)或鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[49.52]和鸭视网膜细胞[50]。 合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074 [53]。 也可利用鸡胚成纤维细胞(CEF)。然而，除了使用禽细胞，使用哺乳动物细胞意味着疫苗可 不含禽DNA以及卵蛋白(如卵清蛋白和卵类黏蛋白)，从而降低变应原性。用于培养流感病毒的最优选细胞系是衍生自Madin Darby狗肾的MDCK细胞 系[54-57]。原始MDCK细胞系可购自ATCC (CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞 系。例如，参考文献54公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(‘MDCK 33016，，保藏号 DSM ACC 2219)。类似地，参考文献58公开了在无血清培养基(‘B-702，，保藏号FERM BP-7449)中悬浮培养的MDCK衍生细胞系。参考文献59公开了非致瘤性MDCK细胞，包 括 ‘MDCK-S，(ATCC PTA-6500)、‘MDCK-SF 101，(ATCC PTA-6501)、‘MDCK-SF 102，(ATCC PTA-6502)和‘MDCK-SF103，(PTA-6503)。参考文献60公开了非常易于感染的MDCK细胞 系，包括‘MDCK. 5F1，细胞(ATCC CRL12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。也可采用微载体培养。因此，在一些 实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。
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优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养细胞系。在本发明中，如果培养 基中没有人或动物来源的血清的添加剂，则称为无血清培养基。生长在该培养物中的细胞 通常本身就含有蛋白质，但无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非 血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等 可能是病毒生长所必需的蛋白质。在病毒复制期间，支持流感病毒复制的细胞系优选低于37°C生长[61](例如， 30-36°C，或约 30°C，31°C，32°C，33°C，34°C，35°C，36°C )。在培养细胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步骤用待培养的菌株接种培 养的细胞，将感染细胞培养所需时间以使病毒增殖，例如通过病毒效价或抗原表达来确 定所需时间(如接种后24-168小时)，然后收获增殖的病毒。用1 500-1 1，优选 1 100-1 5，更优选1 50-1 10的病毒(由PFU或TCID50测定)细胞比接种培养 的细胞。将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，在25-40°C，优选28-37°C下，使病毒 吸附于细胞至少60分钟，但通常小于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用去 除感染的细胞培养物(如单层)，以提高收获的细胞上清液的病毒含量。然后，可灭活或冷 冻储存收获的液体。可以约0. 0001-10、优选0. 002-5、更优选0. 001-2的感染复数(“m. ο. i.“)感染培养的细胞。更优选地，以约0. 01的m. ο. i.感染细胞。可以在感染后30-60 小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收 获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒释放，可以在培养 的任何合适阶段加入蛋白酶，例如在接种前、接种时或接种后[61]。在优选的实施方式中，尤其是采用MDCK细胞时，超过40群体倍增水平时细胞系不 从主工作细胞库传代。病毒接种物以及病毒培养物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹 病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病 毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[62]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。流感病毒在卵或细胞培养物中生长之后可获得含有病毒颗粒的液体。本发明可用 来从这种液体制备抗原，且通常的第一个步骤是从所述液体中纯化(或浓缩)病毒颗粒。 纯化可通过各种方法实现[63，64]。例如，可使用区带离心法[65]，例如采用线性蔗糖梯度 溶液。密度梯度离心可使用差速区带离心或连续流转头[66]。也可采用沉淀法，例如使用 聚乙二醇[67]。可采用亲和捕获或伪亲和捕获，如上文所述(本发明的第五方面)。在这 种纯化方法之前，可对含有病毒颗粒的液体进行过滤(例如，以除去细胞碎片)和/或超滤 (通常具有较大的分子量截断值，如> 300kDa>、500kDa或更高)和/或渗滤(如本发明 的第五个方面所述)。病毒灭活本发明的方法通常包括灭活病毒以去除其感染性的步骤。灭活病毒的化学方法包 括用有效量的以下一种或多种物质处理去污剂、甲醛(如福尔马林)、β-丙内酯、亚甲基 蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意组合。本领域已知其它病毒灭活方法，例如二乙 胺、乙酰氮丙啶、或Y辐照或UV照射。用β-氮丙啶处理尤其有用，如参考文献68所述。在本发明的一些实施方式中， β“氮丙啶可存在于磷酸盐缓冲液中。
在灭活之前的步骤中，通常如上文所述浓缩病毒颗粒。裂解用去污剂(离子型或非离子型)和/或溶剂处理纯化的病毒颗粒产生亚病毒颗 粒制品可获得裂解病毒颗粒。如上所述，裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，包括“吐 温-醚”法。裂解通常在完整的感染性或非感染性病毒颗粒上进行。这种破坏导致病毒蛋 白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。BEGRIVAC 、FLUARIXtm、FLUZONE 和FLUSHIELD 产品是裂解疫苗。合适的裂解剂包括但不限于乙醚、聚山梨酸酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三丁酯、聚 氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、 十二烷基肌氨酸钠、溴化十六烷基三甲基铵(如Cetavlon )、磷酸三丁酯、十四烷基三甲 铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇 (如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通NlO 1)、壬基酚聚醚-9 (NP9) Sympatens-NP/090、 聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂 解方法使用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，最初病毒颗粒纯化过程中(例如在蔗糖密度梯 度溶液中)发生裂解。优选的裂解剂是离子型(例如，阳离子型)去污剂，如溴化十六烷基三甲基铵 (CTAB)。裂解可在存在缓冲液，如磷酸盐缓冲液时进行。缓冲液宜具有微酸性PH，如在7. 1 和9. 0之间，在7. 2和8. 0之间，或者约7. 5。裂解通常是水溶液中发生，如缓冲的水溶液。如上所述，溶液的离子强度为IOOmM 或更高，例如彡 200mM、彡 300mM、彡 400mM、彡 500mM、彡 600mM、彡 700mM、彡 800mM，等等。去污剂交换裂解步骤之后通常通过吸附除去裂解去污剂。例如，参考文献14报道了在CTAB/ 吐温裂解步骤之后加入安伯莱特XAD-4(—种交联的大网络芳香聚合物)以除去去污剂。然 后通过过滤除去该聚合物。一些情况下，需要将去污剂保留在最终的药物制剂中以溶解某些活性成分。在此 例中，从病毒颗粒制备流感抗原的以前方法在离子型裂解去污剂(如CTAB)之前或与之同 时加入了非离子型去污剂(如聚山梨酸酯)。然后彻底除去离子型去污剂(例如通过安伯 莱特吸附)，但出于溶解目的保留了非离子型去污剂。也可采用非离子型去污剂来溶解抗 原，从而，在除去离子型去污剂期间不吸附它们，例如，确保安伯莱特吸附除去CTAB但不除 去血凝素。这种方法的一个问题是，很难达到非离子型去污剂的所需终浓度，因为在裂解之 后保留在溶液中的非离子型去污剂的量取决于裂解步骤之前存在的蛋白质、脂质等的量 加入物质的水平越低则非离子型去污剂的残余浓度越高，反之亦然。为避免该问题，在本发明的一些实施方式中，在裂解步骤之前不使病毒颗粒接触 去污剂。裂解时使病毒颗粒接触所需浓度的第一去污剂(例如离子型去污剂，如CTAB)。然 后除去第一去污剂，但替换成第二去污剂(例如非离子型去污剂，如聚山梨酸酯80)，即将 第一去污剂换成第二去污剂。该步骤可包括在除去第一去污剂的同时加入第二去污剂； 加入第二去污剂，随后除去第一去污剂；或者除去第一去污剂随后加入第二去污剂。交换之
10后存在的第二去污剂的量可能低于、高于或等于交换之前存在的第一去污剂的量。但重要 的是，该步骤之后残余的第二去污剂的浓度是可控且可确定的(例如，相对于流感抗原的 量)，而过早加入第二去污剂可导致除去裂解去污剂之后剩余的量可变。裂解之后不一定要立即发生去污剂交换。例如，在裂解之后但在去污剂交换之前 可能需要进一步纯化抗原，例如可以从裂解病毒颗粒中纯化表面抗原(见下文)再进行交 换。对裂解病毒颗粒的进一步处理本发明提供了流感病毒裂解工艺的各种改进，因此可用来制造裂解病毒疫苗。然 而，除此之外，可进一步处理按照本发明制备的裂解病毒颗粒以提供，例如，纯化的流感病 毒表面抗原(血凝素以及通常还包括神经氨酸酶)。如上所述，制备该类疫苗的方法是本领 域熟知的，FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 产品都是此类疫苗。例如，可采用超离心裂 解病毒颗粒来制备纯化的表面抗原。类似地，可对裂解病毒颗粒进行区带梯度离心(见参 考文献9的实施例1)。因此，本发明的分裂流感病毒颗粒的方法可作为制备裂解病毒疫苗或制备纯化表 面抗原疫苗的总过程的一部分。在该过程中，将通过以本发明所述方法分裂流感病毒颗粒 的方法从病毒获得含有血凝素的抗原制品。然后用所述含有血凝素的抗原制品来制备疫 苗，也如本文所述。HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考一般通过SRID试验测定的HA水平 使疫苗标准化。现有疫苗一般含有约15 μ g HA/毒株，但(例如)儿童使用时，或者在大流行 情况下，或当使用佐剂时也可采用较低剂量。采用了分数剂量如( S卩7. 5 μ g HA/毒株)、 1/4和1/8，以及较高剂量(如3x或9x剂量[69，70])。因此，疫苗可包含0. 1-150 μ g HA/ 流感毒株，优选 0. 1-50 μ g,例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g 等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7. 5、约5、约3. 8、约1. 9、约1.5yg等 /毒株。用于儿童时理想剂量是1.5 μ g/毒株。疫苗可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病 毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收 获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。对于含有一种以上流感毒株抗原的疫苗而言， 本发明的方法可在制备单价原料抗原期间使用，然后混合多个单价原料而制成多价疫苗。 因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原(含有血凝素的抗原制品)的步骤。本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。 例如，已知修饰HA以去除导致病毒在禽类动物中具有高度致病性的决定簇(如HAl和HA2 之间切割位点周围的超碱性区域(hyper-basicregion))，因为这些决定簇可导致病毒不能 在鸡蛋中生长。疫苗可包含基质蛋白以便受益于定位在该抗原内的额外的T细胞表位。因此，包 含血细胞凝集素和神经氨酸酶的疫苗还可包含Ml和/或M2基质蛋白。有用的基质片段披 露于参考文献71。也可存在核蛋白。佐剂本发明疫苗组合物可包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的 免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。可用于本发明的疫苗佐剂包括但不限于
·包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考 文献72公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适形 式(如凝胶、晶体、无定形等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属 盐的颗粒[73]。可使称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，仅为方便使用， 因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献157的第9章]。本 发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的 佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷 酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间 的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝 的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2 1，例如彡5 1、 彡6 1、彡7 1、彡8 1、彡9 1等。给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于IOmg/ ml，例如彡 5mg/ml、彡 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、彡 lmg/ml 等。优选范围是 0. 3-lmg/ ml。最大值优选为0. 85毫克/剂量。-皂苷[参考文献157的第22章]是在许多种类 植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的留醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了 作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria) Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜 (Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草 (Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质 制剂，例如ISC0M。QS21以商标Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。 已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH_A、QH-B和QH-C。皂 苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献144。74.皂苷制剂也可包含留醇，如胆固醇 [75]。·皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参 考文献157的第23章]。ISCOM—般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何 已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文 献75-77中进一步描述了 ISC0M。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[78]。开发基于皂苷 的佐剂的综述可参见参考文献79和80。·细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒 素〃 CT"或百日咳毒素〃 PT")，尤其是其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72[81]或 CT-E29H[82]的突变毒素。参考文献83中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐 剂，参考文献84中描述了将其用作胃肠道外佐剂。·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[85]或壳聚糖及其衍生物 [86]。 由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己 酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100ηπι-150μπι，更优选约 200nm-30 μ m,最优选约500nm-10 μ m的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处 理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。·脂质体(参考文献157第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见 参考文献87-89所述。·胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙
12酰_去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞 壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(〃 DTP-DPP〃或〃 TheramideTM// )和 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1' -2' -二棕榈酰-sn-甘 油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。·聚氧(polyoxidonium)聚合物[90，91]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。 甲基肌苷5'-单磷酸酯(〃 MIMP“ )[92]。·多聚羟化吡咯双烷类化合物[93]，如下式化合物式中，R选自氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环 烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于木麻黄 (casuarine)、木麻黄_6_ α -D-吡喃葡萄糖、3_表-木麻黄、7_表-木麻黄、3，7_ 二表-木 麻黄等。 ⑶Id配体，如α-糖基神经酰胺[113-120](例如α -半乳糖苷神经酰胺)、含有 植物鞘氨醇的α -糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-l-0-(a -D-半乳糖苷吡喃糖 基)-2- (N- 二十六烷基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CR0NY-101、3 “ -0-磺基-半乳糖苷 神经酰胺，等等。· y 菊粉[102]或其衍生物，如 algammulin。 水包油乳液。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面 活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。进一步的细节如下。·免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于 鸟嘌呤残基的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)、或CpI基序(含有连接于肌苷的胞 嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡 核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双 链或(除RNA外)单链。参考文献103、104和105公开了可能的类似取代，例如用2’ -脱 氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献106-111中进一步讨论了 CpG寡核苷酸的佐剂作用。 CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [112]。CpG序列可特异性诱导Thl免 疫应答，例如CpG-A ODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN0参考文献113-115中讨论了 CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A 0DN。优选构建 CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接 形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献112和116-118。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称 为 ProMune (科雷制药集团公司(Coley Pharmaceutical Group, Inc.))。另一种是 CpG 1826。或者或此外，为了使用CpG序列，可使用TpG序列[119]，这些寡核苷酸可不含非甲 基化CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一个以上连续的胸 腺嘧啶核苷酸(例如，参考文献119所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可能含有> 25%胸腺嘧啶(例如> 35%、> 40%、> 50%、> 60%、> 80%等)。例如，它可能含有一 个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献119所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成 中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它 们可含有少于100个核苷酸。基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为ic-31 [120]。因此，本发 明佐剂可包含⑴和(ii)的混合物(i)包含至少一个(优选多个)CpI基序的寡核 苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如包含至少一个(优选多个) Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20个氨基酸)。寡核苷酸可以是含有26-聚体序列 5' -(IC)13-3' (SEQ ID NO:—)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨 基酸序列 KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:—)的肽。· 3-0-脱酰化单磷酰脂质A(' 3dMPL'，也称为'MPL ' ) [121-124]。在水性条 件下，3dMPL可形成不同大小，如直径< 150nm或> 500nm的胶束聚集体或颗粒。其中一种 或两种可用于本发明，可通过常规实验选择更好的颗粒。本发明优选使用小颗粒(如小到 足以产生澄清的3dMPL水悬液)，因为它们活性高[125]。优选颗粒的平均直径小于220nm， 更优选小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它们的直径甚至可以小于lOOnm。然而在大 多数情况下，平均直径不小于50nm。·咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特(〃 R-837 “ ) [126，127]、瑞喹莫德 (“R-848" ) [128]和其类似物；及其盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细 节可参见参考文献129-133。 缩氨基硫脲化合物，如参考文献134所述的化合物。参考文献134中也描述了配 制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子， 例如TNF-α中特别有效。色胺酮化合物，如参考文献135所述的化合物。参考文献135中也描述了配制、制 备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如 TNF-α中特别有效。·核苷类似物，如(a)埃索他宾(Isatorabine) (ANA-245 ；7_硫杂_8_氧代鸟苷)
及其前药
权利要求
1.一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不存在去污剂时获 得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病毒颗粒；(iii)用 包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂交换第一去污剂。
2.一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)获得包含流感病毒颗 粒的组合物；(ii)通过接触用离子强度为IOOmM或更高的缓冲液配制的去污剂来裂解所述 病毒颗粒。
3.—种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在存在磷酸盐缓冲液 时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭活所述流感病毒颗粒； 和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。
4.一种制备流感疫苗的方法，其中，(a)通过采用任一项上述权利要求所述方法分裂 流感病毒颗粒的方法而从病毒获得包含血凝素的抗原制品，和(b)所述含血凝素的抗原制 品被用于制备疫苗。
5.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒来自甲型流感病毒。
6.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒来自H5血凝素 亚型甲型流感病毒。
7.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒是从鸡蛋制备的。
8.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒是从哺乳动物 细胞培养物制备的。
9.如权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗含7.5 μ g血凝素/毒株。
10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含水包油乳液。
12.一种在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予通过权利要求4-11中任一 项所述方法制备的疫苗的步骤。
全文摘要
公开了从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的许多改进。裂解步骤之后可以是去污剂交换。裂解可在存在较高离子强度的缓冲液和/或存在磷酸盐缓冲液时进行。
文档编号A61K39/145GK101998990SQ200980110089
公开日2011年3月30日 申请日期2009年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者B·乔布斯特, C·豪斯曼, F·豪斯希尔德 申请人:诺华有限公司
技术领域：
本发明涉及流感疫苗制备领域。
背景技术：
参考文献1的第17和18章描述了目前常规使用的流感疫苗。它们基于活病毒或 灭活病毒，灭活疫苗可以基于完整病毒、‘裂解'病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素以 及也是通常使用的神经氨酸酶)。已知有许多不同的制备裂解抗原疫苗和表面抗原疫苗的方法。例如，各种裂解过 程如参考文献2-8所述，而制备表面抗原疫苗的不同方法披露于参考文献9-14。本发明的目的是提供制造裂解疫苗和表面抗原疫苗的改良方法。
发明内容
发明人曾经对现有的从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的方法设计了许多改进。去污剂使用时间的改进在现有纯化方法中，流感病毒颗粒先接触第一去污剂(例如聚山梨酸酯，如聚山 梨酸酯80)，然后用第二去污剂(例如CTAB)裂解。第一去污剂在病毒灭活之前使用，而第 二去污剂在灭活之后加入。在上述方法中，第二去污剂随后除去，而第一去污剂仍旧保留， 从而有助于抗原溶解。相反，根据本发明的第一个方面，第一去污剂较晚使用，具体地说是在已经用第二 去污剂裂解病毒颗粒之后。这种时间和顺序的变化使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是 对于H5亚型的甲型流感病毒。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流 感病毒颗粒；(iii)用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂 交换第一去污剂。所述去污剂交换步骤可在裂解步骤之后的任何时刻进行，但在病毒颗粒 捕获步骤之前进行较为理想，所述捕获步骤可通过以下方法进行，例如，亲和捕获、伪亲和 捕获、层析或吸附(见下文)。因此，第二去污剂可在裂解之后但在病毒颗粒捕获之前加入。 可在病毒颗粒捕获之后再加入额外量的第二去污剂，尤其是如果之前加入的第二去污剂的 量小于1.5g/L时。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在不存在去污剂 时灭活流感病毒颗粒；用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；以及在裂解后用第 二去污剂交换第一去污剂。
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在第一方面的其它实施方式中，所述第二去污剂是在灭活之后但在裂解之前加入 的。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不 存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病 毒颗粒；(iii)加入第二去污剂但不裂解灭活的病毒颗粒；(iv)在存在第二去污剂时用包 含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(ν)除去第一去污剂同时保留第二去污剂。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在不存在去污剂 时灭活所述流感病毒颗粒；在存在第二去污剂时用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒 颗粒；以及在裂解之后除去第一去污剂同时保留第二去污剂。在改进去污剂使用时间的还有其它实施方式中，去污剂是在病毒颗粒灭活之前、 但在对病毒颗粒进行超滤/渗滤步骤之后加入的。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒 颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组 合物；( )对含有病毒颗粒的组合物进行超滤/渗滤；(iii)在滤过的含有病毒颗粒的组 合物中加入去污剂但不裂解病毒颗粒；和(iv)灭活流感病毒颗粒。该方法还可包括步骤 (ν)用去污剂裂解灭活的病毒颗粒。步骤(ν)中使用的去污剂可以不同于步骤(iii)中使 用的去污剂。可在步骤(ν)之后加入额外量的与步骤(iii)中所用相同的去污剂，尤其是 如果步骤(iii)中去污剂的加入量小于1. 5g/L时。在之前去污剂的加入量小于1. 5g/L时再加入额外量的去污剂的实施方式中，额 外的加入可在进一步超滤/渗滤步骤之前进行。裂解过程的改进流感疫苗的裂解过程涉及用增溶浓度的去污剂处理病毒颗粒。合适的去污剂包括 聚山梨酸酯类(吐温类)[6]、曲通X-100[6，10，15]、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB) [9，16] 和脱氧胆酸盐[2，17]。在现有纯化过程中，在存在20mM Tris/HCl时接触去污剂而裂解流感病毒颗粒。相 反，根据本发明的第二个方面，在存在具有较高离子强度缓冲液时使用去污剂。因此，本发 明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)获得包含流感病毒 颗粒的组合物；(ii)通过接触用离子强度为IOOmM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解 所述病毒颗粒。这种升高的离子强度使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型 的甲型流感病毒。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的缓冲液的离子强度至少为100mM,例如≥200mM、≥300mM、≥400mM、 ≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM,等等。可通过各种途径获得这种较高的离子强度， 例如使用单价离子(如NaCl)、二价离子(如硫酸盐)、三价离子(如磷酸盐)，等等。使用 三价离子是提高离子强度的便捷方法。一种适用的缓冲液，尤其是当用于基于CTAB的裂解 过程时，是用50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5配制的200福NaCl。在裂解过程中升高离子强度 时需要小心，尤其对于细胞培养物中生长的病毒，以免造成在随后的处理步骤中需要保留 的DNA大量溶解。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于用离子强度为 100mM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解病毒颗粒。
磷酸盐缓冲液在现有纯化过程中，在用Tris缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗粒。 相反，根据本发明的第三个方面，在用磷酸盐缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗 粒。这种缓冲液变化使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在存在磷酸盐缓冲液时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭 活所述流感病毒颗粒；和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的磷酸盐缓冲液 的PH值在6. 5和8. 5之间，例如在7. 0和8. 0之间，或者约7. 5。本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于灭活和随后的裂 解病毒颗粒都在存在磷酸盐缓冲液时进行。超滤膜在现有纯化工艺中，半纯化的裂解后流感病毒表面抗原用聚苯醚砜(PES)膜超滤 /渗滤进一步纯化。相反，根据本发明的第四个方面，超滤采用的是纤维素膜。这种膜的变 化降低了疏水性和蛋白质保留，使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型 流感病毒。因此，本发明提供了一种从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述糖蛋白 的方法，包括用纤维素膜超滤所述混合物的步骤。通过这种方法获得的纯化糖蛋白可用于 制备流感疫苗。本发明还提供了一种通过超滤从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述 糖蛋白的方法，改进之处包括采用纤维素超滤膜。可使用各种类型的纤维素膜。这些膜可基于纤维素本身、纤维素酯(例如二乙酸 酯、三乙酸酯、硝酸酯，等等)或其混合物。例如，参考文献18披露了具有非纤维性聚合微孔 基底的膜，膜层由纤维素和/或乙酸纤维素形成。所述膜层的厚度在1-20微米之间，并且 可以延伸入微孔基底5-30微米。参考文献19披露了基于三乙酸纤维素的不对称超滤膜， 该膜任选被至多达30%的二乙酸纤维素取代。参考文献20披露了形式为中空纤维的渗滤 膜，其具有乙酸纤维素或乙酸纤维素衍生物构成的连续内腔。在第一层析步骤之前加入额外处理步骤在现有纯化工艺中，为从细胞培养物发酵培养基组分中分离流感病毒颗粒，流感 病毒颗粒是从树脂上的培养收获物中捕获的。已经观察到某些毒株不能完全结合于树脂。根据本发明的第四个方面，在捕获步骤之前将病毒收获物进行超滤/渗滤到低电 导率缓冲液中。根据流感病毒毒株不同，该初始步骤可使抗原产量提高至多达10倍，且对 于不结合于捕获剂的病毒颗粒尤其有用。因此，本发明提供了一种处理含有流感病毒颗粒的液体培养基的方法，包括超滤 所述液体培养基的步骤以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒渗余物。然后进一步处理 该渗余物，例如通过亲和捕获、吸附、层析等等。本发明还提供了一种从含有流感病毒颗粒的液体培养基中分离流感病毒颗粒的 方法，改进之处在于在分离之前对所述液体培养基进行渗滤以提供包含低电导率缓冲液的 含病毒颗粒渗余物。
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本发明还提供了一种从含有病毒颗粒的液体培养基中分离流感病毒颗粒的方法， 所述方法包括以下步骤(i)渗滤该液体培养基以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒 渗余物；和然后(ii)通过选自亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附的方法从渗余物中捕获 病毒颗粒。通过这些方法获得的渗余物和病毒颗粒可用于制备流感疫苗。渗滤利用透性膜滤器根据溶液和悬浮液组分的分子大小将它们分离。小组分可通 过膜形成滤液，而较大的组分(如病毒颗粒)则无法通过而被保留。可利用渗滤来降低盐、 溶剂或液体培养基中其它低分子量种类的浓度，并任选用来引入新的种类(例如用来交换 缓冲液)。渗滤可以是连续或不连续的。连续渗滤包括以与滤液生成速度基本相同的速度 在缓冲液或样品中加水来洗出最初的低分子量种类。如果将缓冲液用于渗滤，则样品中的 新缓冲盐的浓度会以与被除去种类的浓度成反比的速度提高。采用连续渗滤，用所选缓冲 液进行6当量样品体积洗涤后通常可除去超过100%可渗透溶质中的99. 5%。不连续渗滤 用大量的水或缓冲液稀释样品，然后浓缩回原始体积。本发明优选不连续渗滤。典型的培 养基渗滤包括至少2(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多)倍渗滤体积(即在渗滤开始时至少 2x样品体积)。渗滤可采用任何合适的膜(例如，PES、纤维素等，如上文所述)以任何合适方式 (例如，中空、盒式、螺旋等等)进行。所述膜保留病毒颗粒的截断值为，例如，500kDa。渗滤步骤可在超滤步骤之前进行，例如，以便浓缩液体培养基。浓度将通常浓缩至 少2倍，例如，> 2倍、> 3倍、> 4倍、> 5倍、> 10倍，等等。超滤/浓缩和随后的渗滤可 采用相同设备进行。渗滤之前进行浓缩能降低完成渗滤所需的液体体积，因此是有利的。渗滤之后的渗余物含有低电导率缓冲液。合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris/ HCl缓冲液、TES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液，等 等。渗余物的电导率通常小于20mS/cm，例如0. 5-10mS/cm，或者是1.0-1.4mS/cm。可采用 IOmM磷酸盐缓冲液。可采用亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附从渗滤渗余物中捕获病毒颗粒。已知适 用于流感病毒的合适技术。例如，已知可采用欧卫矛(Euonymuseuropaeus)凝集素[21]或 用Cellufine Sulfate(CS)或硫酸化S印hadex柱进行亲和捕获或伪亲和捕获。可吸附于， 例如，聚电解质[22]、硫酸钡[23]或磷酸钙[24]，等等。在使用捕获材料之前用渗余物中 存在的低电导率缓冲液进行平衡是有益的。因此，例如，可用IOmM磷酸盐缓冲液平衡捕获 树脂。相同的缓冲液也可用来洗涤捕获材料，然后释放捕获的病毒颗粒。流感病毒本发明可用来从包括甲型、乙型和丙型流感病毒在内的任何合适的流感病毒中制 备抗原。尤其可用于感染人类的甲型病毒株。用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种A 型流感毒株(Hmi和H3N2)和一种B型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明可使用这种流 行间病毒，但也可使用来自大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触的毒株) 的病毒，尤其是甲型流感病毒。因此，本发明可采用选自下组的任何甲型流感病毒血凝素亚 型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16。所述病毒可额 外具有以下任何NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
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本发明尤其适用大流行甲型流感病毒毒株，如H5W毒株。大流行毒株的特征有 (a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即数十年没有在人群中发现 的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如H5、H6或H9，通常只出现在鸟群 体中)，从而疫苗受者和常规人群对该毒株的血凝素没有免疫力；(b)它能够在人群中水平 传播；和(c)它能使人致病。大流行毒株H2、H5、H7或H9亚型毒株有，例如，H5N1、H5N3、 H9N2.H2N2.H7N1和H7N7毒株。H5亚型的病毒可分成许多进化支，如进化支1或进化支2。 已经鉴定出进化支2的6个亚进化支，其中亚进化支1、2和3具有不同的地理分布，并且由 于它们可感染人类而尤其受到重视。乙型流感病毒通常不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒确实可分成两种不同 的谱系。这些谱系在20世纪80年代晚期出现，具有在抗原性上和/或遗传上明显相互不 同的HA[25]。目前的乙型流感病毒毒株类似于B/Victoria/2/87或B/Yamagata/16/88。 这些毒株在抗原上通常不同，但也可用氨基酸序列的差异来区别两种谱系，例如，B/ Yamagata/16/88样毒株通常(但不是总是)具有氨基酸残基164缺失的HA蛋白，上述编号 是根据‘Lee40’ HA序列定的[26]。本发明可用于任一谱系的乙型流感病毒抗原。流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。 然而，当使用活病毒作为疫苗抗原时这三个特征更加典型。流感病毒可以是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[27]和/或扎那米韦有 抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[28]。可用于本发明的流感病毒可以是再分类毒株，并可通过逆向遗传学技术获得。逆 向遗传学技术[如29-33]能够用质粒在体外制备含有所需基因组区段的流感病毒。该技术 一般包括表达(a)例如，由poll启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子编码所需病毒RNA分子 的DNA分子，和(b)例如，由polll启动子编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两 种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质， 但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的基于质粒的方法[34-36]，这些方法也包括 使用质粒来表达所有或一些病毒蛋白(例如，仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中最 多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，近期方法[37]将多个RNA聚合酶I转录盒 (用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A vRNA区 段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码 1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感々!111 ^转录物的序列)上。参考文献37方法的优选方面包 括(a)PBl、PB2和PA mRNA编码区在同一质粒上；和(b)所有8个vRNA编码区段在同一质 粒上。一个质粒上包含NA和HA区段而另外六个区段位于另一质粒上也可能是有利的。Poll启动子是种特异性的，因此可选择与发生反向遗传学的细胞类型相匹配的启 动子，例如在犬细胞中优选使用犬poll启动子[38，39]。然而，作为使用poll启动子来编 码病毒RNA区段的替换方式，可使用噬菌体聚合酶启动子[40]。例如，可方便地使用SP6、 T3或T7聚合酶的启动子。由于poll启动子的物种特异性，噬菌体聚合酶启动子可能较适 合许多细胞类型，但也必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。在其它技术中，可能使用po 11和po 1II双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和 可表达的mRNA [41，42]。
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因此，流感A病毒可包含来自A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(一般是 来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2再造毒株)。也可包含 来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的再造病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA 区段。甲型流感病毒包括不到6个(即0，1，2，3，4或5)个来自AA/6/60流感病毒(A/ AnnArbor/6/60)的病毒区段。乙型流感病毒包括不到6个(即0，1，2，3，4或5)个来自 AA/1/66流感病毒(B/ArmArbor/1/66)的病毒区段。本发明一般保护免受能够在人之间传 播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含源自哺乳动物(如人)流感病毒的至少一 个RNA区段。它可包含源自禽流感病毒的NS区段。流感病毒生长和病毒颗粒纯化可对含有流感病毒颗粒的原料进行本发明的方法。这些病毒颗粒可以是病毒在卵 (例如，无特定病原体的卵)或在细胞培养物中生长的产物。目前培养流感病毒的标准方法 采用含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。然而，更近一段时间以来，已经在动 物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。用来生长流感病毒的细胞系通常是哺乳动物来源的。合适的哺乳动物细胞来源包 括但不限于仓鼠、牛、灵长动物(包括人和猴)和犬细胞，但不优选使用灵长动物细胞。可 采用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例 子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞， 如Vero细胞系[43-45]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于=MDCK ；CHO ；CLDK ；HKCC ；293T ；BHK ；Vero ； MRC-5 ；PER. C6[46] ；FRhL2 ;WI_38 ；等等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型 培养物保藏中心(ATCC) [47]、Coriell细胞库[48]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。 例如，ATCC供应各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81. 2、CRL1586和CRL-1587，还 供应MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER. C6可获自ECACC，保藏号为96022940。最优选的细胞系是具有哺乳动物类糖基化的细胞系。哺乳动物细胞系的一个较不 优选的替代方式是，可以在禽细胞系上培养[例如参考文献49-51]，包括衍生自鸭(如鸭视 网膜)或鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[49.52]和鸭视网膜细胞[50]。 合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074 [53]。 也可利用鸡胚成纤维细胞(CEF)。然而，除了使用禽细胞，使用哺乳动物细胞意味着疫苗可 不含禽DNA以及卵蛋白(如卵清蛋白和卵类黏蛋白)，从而降低变应原性。用于培养流感病毒的最优选细胞系是衍生自Madin Darby狗肾的MDCK细胞 系[54-57]。原始MDCK细胞系可购自ATCC (CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞 系。例如，参考文献54公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(‘MDCK 33016，，保藏号 DSM ACC 2219)。类似地，参考文献58公开了在无血清培养基(‘B-702，，保藏号FERM BP-7449)中悬浮培养的MDCK衍生细胞系。参考文献59公开了非致瘤性MDCK细胞，包 括 ‘MDCK-S，(ATCC PTA-6500)、‘MDCK-SF 101，(ATCC PTA-6501)、‘MDCK-SF 102，(ATCC PTA-6502)和‘MDCK-SF103，(PTA-6503)。参考文献60公开了非常易于感染的MDCK细胞 系，包括‘MDCK. 5F1，细胞(ATCC CRL12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。也可采用微载体培养。因此，在一些 实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。
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优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养细胞系。在本发明中，如果培养 基中没有人或动物来源的血清的添加剂，则称为无血清培养基。生长在该培养物中的细胞 通常本身就含有蛋白质，但无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非 血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等 可能是病毒生长所必需的蛋白质。在病毒复制期间，支持流感病毒复制的细胞系优选低于37°C生长[61](例如， 30-36°C，或约 30°C，31°C，32°C，33°C，34°C，35°C，36°C )。在培养细胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步骤用待培养的菌株接种培 养的细胞，将感染细胞培养所需时间以使病毒增殖，例如通过病毒效价或抗原表达来确 定所需时间(如接种后24-168小时)，然后收获增殖的病毒。用1 500-1 1，优选 1 100-1 5，更优选1 50-1 10的病毒(由PFU或TCID50测定)细胞比接种培养 的细胞。将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，在25-40°C，优选28-37°C下，使病毒 吸附于细胞至少60分钟，但通常小于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用去 除感染的细胞培养物(如单层)，以提高收获的细胞上清液的病毒含量。然后，可灭活或冷 冻储存收获的液体。可以约0. 0001-10、优选0. 002-5、更优选0. 001-2的感染复数(“m. ο. i.“)感染培养的细胞。更优选地，以约0. 01的m. ο. i.感染细胞。可以在感染后30-60 小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收 获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒释放，可以在培养 的任何合适阶段加入蛋白酶，例如在接种前、接种时或接种后[61]。在优选的实施方式中，尤其是采用MDCK细胞时，超过40群体倍增水平时细胞系不 从主工作细胞库传代。病毒接种物以及病毒培养物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹 病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病 毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[62]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。流感病毒在卵或细胞培养物中生长之后可获得含有病毒颗粒的液体。本发明可用 来从这种液体制备抗原，且通常的第一个步骤是从所述液体中纯化(或浓缩)病毒颗粒。 纯化可通过各种方法实现[63，64]。例如，可使用区带离心法[65]，例如采用线性蔗糖梯度 溶液。密度梯度离心可使用差速区带离心或连续流转头[66]。也可采用沉淀法，例如使用 聚乙二醇[67]。可采用亲和捕获或伪亲和捕获，如上文所述(本发明的第五方面)。在这 种纯化方法之前，可对含有病毒颗粒的液体进行过滤(例如，以除去细胞碎片)和/或超滤 (通常具有较大的分子量截断值，如> 300kDa>、500kDa或更高)和/或渗滤(如本发明 的第五个方面所述)。病毒灭活本发明的方法通常包括灭活病毒以去除其感染性的步骤。灭活病毒的化学方法包 括用有效量的以下一种或多种物质处理去污剂、甲醛(如福尔马林)、β-丙内酯、亚甲基 蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意组合。本领域已知其它病毒灭活方法，例如二乙 胺、乙酰氮丙啶、或Y辐照或UV照射。用β-氮丙啶处理尤其有用，如参考文献68所述。在本发明的一些实施方式中， β“氮丙啶可存在于磷酸盐缓冲液中。
在灭活之前的步骤中，通常如上文所述浓缩病毒颗粒。裂解用去污剂(离子型或非离子型)和/或溶剂处理纯化的病毒颗粒产生亚病毒颗 粒制品可获得裂解病毒颗粒。如上所述，裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，包括“吐 温-醚”法。裂解通常在完整的感染性或非感染性病毒颗粒上进行。这种破坏导致病毒蛋 白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。BEGRIVAC 、FLUARIXtm、FLUZONE 和FLUSHIELD 产品是裂解疫苗。合适的裂解剂包括但不限于乙醚、聚山梨酸酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三丁酯、聚 氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、 十二烷基肌氨酸钠、溴化十六烷基三甲基铵(如Cetavlon )、磷酸三丁酯、十四烷基三甲 铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇 (如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通NlO 1)、壬基酚聚醚-9 (NP9) Sympatens-NP/090、 聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂 解方法使用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，最初病毒颗粒纯化过程中(例如在蔗糖密度梯 度溶液中)发生裂解。优选的裂解剂是离子型(例如，阳离子型)去污剂，如溴化十六烷基三甲基铵 (CTAB)。裂解可在存在缓冲液，如磷酸盐缓冲液时进行。缓冲液宜具有微酸性PH，如在7. 1 和9. 0之间，在7. 2和8. 0之间，或者约7. 5。裂解通常是水溶液中发生，如缓冲的水溶液。如上所述，溶液的离子强度为IOOmM 或更高，例如彡 200mM、彡 300mM、彡 400mM、彡 500mM、彡 600mM、彡 700mM、彡 800mM，等等。去污剂交换裂解步骤之后通常通过吸附除去裂解去污剂。例如，参考文献14报道了在CTAB/ 吐温裂解步骤之后加入安伯莱特XAD-4(—种交联的大网络芳香聚合物)以除去去污剂。然 后通过过滤除去该聚合物。一些情况下，需要将去污剂保留在最终的药物制剂中以溶解某些活性成分。在此 例中，从病毒颗粒制备流感抗原的以前方法在离子型裂解去污剂(如CTAB)之前或与之同 时加入了非离子型去污剂(如聚山梨酸酯)。然后彻底除去离子型去污剂(例如通过安伯 莱特吸附)，但出于溶解目的保留了非离子型去污剂。也可采用非离子型去污剂来溶解抗 原，从而，在除去离子型去污剂期间不吸附它们，例如，确保安伯莱特吸附除去CTAB但不除 去血凝素。这种方法的一个问题是，很难达到非离子型去污剂的所需终浓度，因为在裂解之 后保留在溶液中的非离子型去污剂的量取决于裂解步骤之前存在的蛋白质、脂质等的量 加入物质的水平越低则非离子型去污剂的残余浓度越高，反之亦然。为避免该问题，在本发明的一些实施方式中，在裂解步骤之前不使病毒颗粒接触 去污剂。裂解时使病毒颗粒接触所需浓度的第一去污剂(例如离子型去污剂，如CTAB)。然 后除去第一去污剂，但替换成第二去污剂(例如非离子型去污剂，如聚山梨酸酯80)，即将 第一去污剂换成第二去污剂。该步骤可包括在除去第一去污剂的同时加入第二去污剂； 加入第二去污剂，随后除去第一去污剂；或者除去第一去污剂随后加入第二去污剂。交换之
10后存在的第二去污剂的量可能低于、高于或等于交换之前存在的第一去污剂的量。但重要 的是，该步骤之后残余的第二去污剂的浓度是可控且可确定的(例如，相对于流感抗原的 量)，而过早加入第二去污剂可导致除去裂解去污剂之后剩余的量可变。裂解之后不一定要立即发生去污剂交换。例如，在裂解之后但在去污剂交换之前 可能需要进一步纯化抗原，例如可以从裂解病毒颗粒中纯化表面抗原(见下文)再进行交 换。对裂解病毒颗粒的进一步处理本发明提供了流感病毒裂解工艺的各种改进，因此可用来制造裂解病毒疫苗。然 而，除此之外，可进一步处理按照本发明制备的裂解病毒颗粒以提供，例如，纯化的流感病 毒表面抗原(血凝素以及通常还包括神经氨酸酶)。如上所述，制备该类疫苗的方法是本领 域熟知的，FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 产品都是此类疫苗。例如，可采用超离心裂 解病毒颗粒来制备纯化的表面抗原。类似地，可对裂解病毒颗粒进行区带梯度离心(见参 考文献9的实施例1)。因此，本发明的分裂流感病毒颗粒的方法可作为制备裂解病毒疫苗或制备纯化表 面抗原疫苗的总过程的一部分。在该过程中，将通过以本发明所述方法分裂流感病毒颗粒 的方法从病毒获得含有血凝素的抗原制品。然后用所述含有血凝素的抗原制品来制备疫 苗，也如本文所述。HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考一般通过SRID试验测定的HA水平 使疫苗标准化。现有疫苗一般含有约15 μ g HA/毒株，但(例如)儿童使用时，或者在大流行 情况下，或当使用佐剂时也可采用较低剂量。采用了分数剂量如( S卩7. 5 μ g HA/毒株)、 1/4和1/8，以及较高剂量(如3x或9x剂量[69，70])。因此，疫苗可包含0. 1-150 μ g HA/ 流感毒株，优选 0. 1-50 μ g,例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g 等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7. 5、约5、约3. 8、约1. 9、约1.5yg等 /毒株。用于儿童时理想剂量是1.5 μ g/毒株。疫苗可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病 毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收 获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。对于含有一种以上流感毒株抗原的疫苗而言， 本发明的方法可在制备单价原料抗原期间使用，然后混合多个单价原料而制成多价疫苗。 因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原(含有血凝素的抗原制品)的步骤。本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。 例如，已知修饰HA以去除导致病毒在禽类动物中具有高度致病性的决定簇(如HAl和HA2 之间切割位点周围的超碱性区域(hyper-basicregion))，因为这些决定簇可导致病毒不能 在鸡蛋中生长。疫苗可包含基质蛋白以便受益于定位在该抗原内的额外的T细胞表位。因此，包 含血细胞凝集素和神经氨酸酶的疫苗还可包含Ml和/或M2基质蛋白。有用的基质片段披 露于参考文献71。也可存在核蛋白。佐剂本发明疫苗组合物可包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的 免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。可用于本发明的疫苗佐剂包括但不限于
·包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考 文献72公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适形 式(如凝胶、晶体、无定形等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属 盐的颗粒[73]。可使称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，仅为方便使用， 因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献157的第9章]。本 发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的 佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷 酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间 的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝 的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2 1，例如彡5 1、 彡6 1、彡7 1、彡8 1、彡9 1等。给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于IOmg/ ml，例如彡 5mg/ml、彡 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、彡 lmg/ml 等。优选范围是 0. 3-lmg/ ml。最大值优选为0. 85毫克/剂量。-皂苷[参考文献157的第22章]是在许多种类 植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的留醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了 作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria) Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜 (Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草 (Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质 制剂，例如ISC0M。QS21以商标Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。 已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH_A、QH-B和QH-C。皂 苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献144。74.皂苷制剂也可包含留醇，如胆固醇 [75]。·皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参 考文献157的第23章]。ISCOM—般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何 已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文 献75-77中进一步描述了 ISC0M。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[78]。开发基于皂苷 的佐剂的综述可参见参考文献79和80。·细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒 素〃 CT"或百日咳毒素〃 PT")，尤其是其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72[81]或 CT-E29H[82]的突变毒素。参考文献83中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐 剂，参考文献84中描述了将其用作胃肠道外佐剂。·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[85]或壳聚糖及其衍生物 [86]。 由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己 酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100ηπι-150μπι，更优选约 200nm-30 μ m,最优选约500nm-10 μ m的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处 理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。·脂质体(参考文献157第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见 参考文献87-89所述。·胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙
12酰_去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞 壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(〃 DTP-DPP〃或〃 TheramideTM// )和 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1' -2' -二棕榈酰-sn-甘 油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。·聚氧(polyoxidonium)聚合物[90，91]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。 甲基肌苷5'-单磷酸酯(〃 MIMP“ )[92]。·多聚羟化吡咯双烷类化合物[93]，如下式化合物式中，R选自氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环 烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于木麻黄 (casuarine)、木麻黄_6_ α -D-吡喃葡萄糖、3_表-木麻黄、7_表-木麻黄、3，7_ 二表-木 麻黄等。 ⑶Id配体，如α-糖基神经酰胺[113-120](例如α -半乳糖苷神经酰胺)、含有 植物鞘氨醇的α -糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-l-0-(a -D-半乳糖苷吡喃糖 基)-2- (N- 二十六烷基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CR0NY-101、3 “ -0-磺基-半乳糖苷 神经酰胺，等等。· y 菊粉[102]或其衍生物，如 algammulin。 水包油乳液。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面 活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。进一步的细节如下。·免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于 鸟嘌呤残基的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)、或CpI基序(含有连接于肌苷的胞 嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡 核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双 链或(除RNA外)单链。参考文献103、104和105公开了可能的类似取代，例如用2’ -脱 氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献106-111中进一步讨论了 CpG寡核苷酸的佐剂作用。 CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [112]。CpG序列可特异性诱导Thl免 疫应答，例如CpG-A ODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN0参考文献113-115中讨论了 CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A 0DN。优选构建 CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接 形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献112和116-118。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称 为 ProMune (科雷制药集团公司(Coley Pharmaceutical Group, Inc.))。另一种是 CpG 1826。或者或此外，为了使用CpG序列，可使用TpG序列[119]，这些寡核苷酸可不含非甲 基化CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一个以上连续的胸 腺嘧啶核苷酸(例如，参考文献119所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可能含有> 25%胸腺嘧啶(例如> 35%、> 40%、> 50%、> 60%、> 80%等)。例如，它可能含有一 个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献119所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成 中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它 们可含有少于100个核苷酸。基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为ic-31 [120]。因此，本发 明佐剂可包含⑴和(ii)的混合物(i)包含至少一个(优选多个)CpI基序的寡核 苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如包含至少一个(优选多个) Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20个氨基酸)。寡核苷酸可以是含有26-聚体序列 5' -(IC)13-3' (SEQ ID NO:—)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨 基酸序列 KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:—)的肽。· 3-0-脱酰化单磷酰脂质A(' 3dMPL'，也称为'MPL ' ) [121-124]。在水性条 件下，3dMPL可形成不同大小，如直径< 150nm或> 500nm的胶束聚集体或颗粒。其中一种 或两种可用于本发明，可通过常规实验选择更好的颗粒。本发明优选使用小颗粒(如小到 足以产生澄清的3dMPL水悬液)，因为它们活性高[125]。优选颗粒的平均直径小于220nm， 更优选小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它们的直径甚至可以小于lOOnm。然而在大 多数情况下，平均直径不小于50nm。·咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特(〃 R-837 “ ) [126，127]、瑞喹莫德 (“R-848" ) [128]和其类似物；及其盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细 节可参见参考文献129-133。 缩氨基硫脲化合物，如参考文献134所述的化合物。参考文献134中也描述了配 制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子， 例如TNF-α中特别有效。色胺酮化合物，如参考文献135所述的化合物。参考文献135中也描述了配制、制 备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如 TNF-α中特别有效。·核苷类似物，如(a)埃索他宾(Isatorabine) (ANA-245 ；7_硫杂_8_氧代鸟苷)
及其前药
权利要求
1.一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不存在去污剂时获 得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病毒颗粒；(iii)用 包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂交换第一去污剂。
2.一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)获得包含流感病毒颗 粒的组合物；(ii)通过接触用离子强度为IOOmM或更高的缓冲液配制的去污剂来裂解所述 病毒颗粒。
3.—种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在存在磷酸盐缓冲液 时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭活所述流感病毒颗粒； 和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。
4.一种制备流感疫苗的方法，其中，(a)通过采用任一项上述权利要求所述方法分裂 流感病毒颗粒的方法而从病毒获得包含血凝素的抗原制品，和(b)所述含血凝素的抗原制 品被用于制备疫苗。
5.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒来自甲型流感病毒。
6.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒来自H5血凝素 亚型甲型流感病毒。
7.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒是从鸡蛋制备的。
8.如任一项前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒是从哺乳动物 细胞培养物制备的。
9.如权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗含7.5 μ g血凝素/毒株。
10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含水包油乳液。
12.一种在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予通过权利要求4-11中任一 项所述方法制备的疫苗的步骤。
全文摘要
公开了从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的许多改进。裂解步骤之后可以是去污剂交换。裂解可在存在较高离子强度的缓冲液和/或存在磷酸盐缓冲液时进行。
文档编号A61K39/145GK101998990SQ200980110089
公开日2011年3月30日 申请日期2009年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者B·乔布斯特, C·豪斯曼, F·豪斯希尔德 申请人:诺华有限公司
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