二胺类β的制作方法
专利名称：二胺类β的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的β2肾上腺素能受体激动剂。本发明还涉及包含这类化合物的药物组合物、用这类化合物治疗与β2肾上腺素能受体活性相关的疾病的方法以及适用于制备这类化合物的方法和中间体。
背景技术：
β2肾上腺素能受体激动剂被认为是治疗肺的疾病如哮喘和慢性阻塞性肺病(包括慢性支气管炎和肺气肿)的有效药物。β2肾上腺素能受体激动剂还可用于治疗早产，而且潜在地适用于治疗神经障碍和心脏障碍。尽管使用某些β2肾上腺素能受体激动剂已取得了成功，但目前药剂的作用持续时间、效能、选择性和/或开始仍不够理想。因此，需要另外的具有改进的性能(如改进的作用持续时间、效能、选择性和/或开始)的β2肾上腺素能受体激动剂。
发明概述本发明提供了新的具有β2肾上腺素能受体激动剂活性的化合物。除了其它的性质以外，本发明的化合物是强效的和选择性的β2肾上腺素能受体激动剂。此外，已证明本发明的示范性化合物具有令人惊讶的和出乎意料长的作用持续时间，其允许每日一次，或者甚至更不频繁的给药。
因此，本发明提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体
其中R1、R2、R3和R4中的每一个独立选自氢、羟基、氨基、卤素、-CH2OH和-NHCHO，或者R1和R2连在一起选自-NHC(＝O)CH＝CH-、-CH＝CHC(＝O)NH-、-NHC(＝O)S-和-SC(＝O)NH-；R5选自氢、-ORa和-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是氢或者C1-3烷基；n是0到7的整数；m是0到5的整数；并且R6、R7、R8、R9和R10中的每一个独立地是氢或C1-6烷基；条件是当m是0时，R5是氢。
本发明还提供了含有本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明进一步提供了含有本发明的化合物和一种或多种其它治疗剂的组合以及含有本发明的化合物、一种或多种其它治疗剂和药学上可接受的的载体的药物组合物。
本发明还提供了治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况(condition)(例如，肺的疾病如哮喘或慢性阻塞性肺病、早产、神经障碍、心脏障碍或炎症)的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予治疗有效量的本发明的化合物。特别地，本发明提供了治疗哺乳动物的哮喘或慢性阻塞性肺病的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予治疗有效量的本发明的化合物。
本发明进一步提供了治疗的方法，该方法包括给予治疗有效量的本发明的化合物和一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明还提供了治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予治疗有效量的本发明的药物组合物。
本发明的化合物还可以被用作研究工具，即，用于研究生物系统或样品，或用于研究其它化学化合物的活性。因此，在本发明方法方面的另一方面，本发明提供了使用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，作为研究生物系统或样品或用于发现新的β2肾上腺素能受体激动剂的研究工具的方法。
在分开的和不同的方面，本发明还提供了本文所述的合成方法和中间体，其适用于制备本发明的化合物。
本发明还提供了用于医学治疗中的如本文所述的本发明的化合物，以及本发明的化合物在制备用于治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况(例如，肺的疾病如哮喘或慢性阻塞性肺病、早产、神经障碍、心脏障碍或炎症)的哺乳动物的制剂或药物中的用途。
发明详述本发明提供了新的式(I)的二胺类β2肾上腺素能受体激动剂，或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。下面的取代基和值打算提供本发明不同方面的典型实例。这些典型的值打算进一步定义这样的方面，而不打算排除其它的值或限制本发明的范围。
在本发明的一个特定方面，R1是卤素、-CH2OH或-NHCHO。
在其它的特定方面，R1是氯、-CH2OH或-NHCHO；或R1是-CH2OH或-NHCHO。
在一个特定方面，R2是氢。
在一个特定方面，R3是羟基或氨基；在另一个特定方面，R3是羟基。
在一个特定方面，R4是氢或卤素；或R4是氢或氯。
在一个特定方面，R1是-NHCHO，R3是羟基，并且R2和R4分别是氢。
在另一个特定方面，R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-，R3是羟基，并且R4是氢。
在另一个特定方面，R1是-CH2OH，R3是羟基，并且R2和R4分别是氢。
在还一个特定方面，R1和R4是氯，R3是氨基，并且R2是氢。
在又一个特定方面，R1和R2连在一起是-NHC(＝O)S-或-SC(＝O)NH-，R3是羟基，并且R4是氢。
在一个特定方面，R5是氢或-ORa。在这方面内典型的R5值包括，但不限于氢、羟基、甲氧基和乙氧基。
在另一个特定方面，R5是氢或-NRaRb。在这方面内典型的R5值包括，但不限于氢、氨基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基和二乙氨基。
在另一个特定方面，R5是氢。
在一个特定方面，R7是氢。
在另一个特定方面，R7是甲基。
在一个特定方面，R8是氢。
在另一个特定方面，R8是甲基。
在一个特定方面，R9是氢。
在另一个特定方面，R9是甲基。
在一个特定方面，R10是氢。
在另一个特定方面，R10是氢。
在一个特定方面，n是2、3、4、5或6。
在另一个特定方面，n是4。
在一个特定方面，m是0、1、2或3。
在另一个特定方面，m是1。
在一个方面，本发明提供了式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体
其中R1是-CH2OH或-NHCHO，并且R2是氢；或R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-；n是2到6的整数；m是0到3的整数。
可以特别提及以下的化合物8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮； 其中，化学命名法符合自动命名程序AutoNom，其由MDLInformation Systems，GmbH(Frankfurt，德国)提供。
如上所举例说明的，本发明的化合物包含一个或多个手性中心。因此，除非另外指出，本发明包括外消旋混合物、纯的立体异构体(即，单个的对映异构体或非对映异构体)，以及这类异构体的立体异构体-富集的混合物。当显示特定的立体异构体时，本领域的技术人员将会理解，除非另外指出，少量的其它立体异构体可以存在于本发明的组合物中，条件是这类其它异构体的存在不消除该组合物作为整体的效用。
特别的是，本发明的化合物含有手性中心，该手性中心在式(I)和(II)中与羟基连接的亚烷基碳上。当使用立体异构体的混合物时，在带有羟基的手性中心为(R)定向的立体异构体的量大于对应的(S)立体异构体的量是有利的。当比较相同化合物的立体异构体时，(R)立体异构体相对于(S)立体异构体来说是优选的。
定义当描述本发明的化合物、组合物和方法时，除非另外指出，下面的术语具有下面的含义。
术语“烷基”意思是指一价饱和的烃基，其可以是直链或支链的或其组合。除非另有定义，这样的烷基典型地包含1-10个碳原予。作为实例，典型的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
术语“卤素”意思是指氟、氯、溴或碘。
在此所用的术语“治疗”意思是指患者如哺乳动物(尤其是人)的疾病或医学病况的治疗，其包括(a)防止疾病或医学病况的发生，即，患者的预防性治疗；(b)改善疾病或医学病况，即，消除患者的疾病或医学病况或引起患者的疾病或医学病况的消退；(c)抑制疾病或医学病况，即，减缓或阻止患者的疾病或医学病况的发展；或(d)减轻患者的疾病或医学病况的症状。
术语“治疗有效量”意思是指当向需要治疗的患者给药时，足以实现治疗的量。
术语“与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况”包括目前所知的或在将来发现的与β2肾上腺素能受体活性有关的所有疾病状态和/或病况。这样的疾病状态包括，但不限于，肺的疾病如哮喘和慢性阻塞性肺病(包括慢性支气管炎和肺气肿)，以及神经障碍和心脏障碍。还已知β2肾上腺素能受体活性与早产(参见美国专利号5,872,126)和某些类型的炎症(参见国际专利申请公开号WO99/30703和美国专利号5,290,815)有关。
术语“药学上可接受的盐”是指由对于向患者如哺乳动物给药来说可接受的碱或酸制备的盐。这样的盐可以来源于药学上可接受的无机或有机碱以及来源于药学上可接受的无机或有机酸。
衍生自药学上可接受的酸的盐包括，但不限于乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、延胡索酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、半乳糖二酸、硝酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、昔萘酸(1-羟基-2-萘甲酸)盐等。特别感兴趣的是衍生自延胡索酸、氢溴酸、盐酸、乙酸、硫酸、甲磺酸、昔萘酸和酒石酸盐。
衍生自药学上可接受的无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、三价铁、二价铁、锂、镁、三价锰、二价锰、钾、钠、锌等盐。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括取代的胺、环胺、天然存在的胺等等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、胆碱、N，N′-二苄基亚乙基二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉，哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等的盐。
术语“溶剂合物”意思是指由一个或多个溶质分子，即，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，和一个或多个溶剂的分子形成的络合物或聚集体。这样的溶剂合物通常是具有基本上固定的溶质和溶剂摩尔比的结晶固体。作为实例，典型的溶剂包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸等等。当溶剂是水时，形成的溶剂合物是水合物。
将要理解，术语“或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体”打算包括盐、溶剂合物和立体异构体的所有排列，如式(I)的化合物的立体异构体的药学上可接受的盐的溶剂合物。
术语“离去基团”意思是指在取代反应如亲核取代反应中可以被另外的官能团或原子置换的官能团或原子。作为实例，典型的离去基团包括Cl、Br、I基团；磺酸酯基团如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、对硝基苯磺酸酯等等；和酰氧基如乙酰氧基、三氟乙酸基等等。
术语“氨基保护基”意思是指适于防止在氨基氮上的不希望的反应的保护基团。典型的氨基保护基团包括，但不限于甲酰基；酰基，例如烷酰基如乙酰基；烷氧羰基如叔丁氧羰基(Boc)；芳基甲氧羰基如苄氧羰基(Cbz)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)、和1，1-二-(4′-甲氧基苯基)甲基；甲硅烷基如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBS)；等等。
术语“羟基保护基”意思是指适于防止在羟基上的不希望的反应的保护基团。典型的羟基保护基团包括，但不限于烷基如甲基、乙基和叔丁基；酰基，例如烷酰基如乙酰基；芳基甲基如苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)和二苯基甲基(二苯甲基、DPM)；甲硅烷基如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBS)；等等。
一般合成程序使用下面的一般方法和程序，由容易得到的原料可以制备本发明的化合物。尽管在以下的方案中举例说明了本发明的特定方面，但是本领域的技术人员将认识到，采用在此描述的方法或通过使用本领域技术人员已知的其它方法、试剂和原料，可以制备本发明的所有方面。还将理解，当给出典型或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，除非另外说明，也可以使用其他工艺条件。最佳的反应条件可以随使用的特定反应物或溶剂而变化，但是本领域的技术人员通过常规优化程序可以确定这样的反应条件。
此外，如对本领技术人员来说将是显而易见的，为了防止某些官能团经受不希望的反应，常规的保护基可能是必需的。用于特定官能团的适合保护基的选择以及保护和脱保护的适宜条件，是本领域中所熟知的。例如，在T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups inOrganic Snthesis，第三版，Wiley，纽约1999，以及其中引用的参考文献中描述了许多保护基及其引入和脱去。
在一个合成的方法中，按照方案A中所说明的制备式(I)和(II)的化合物。(除非另外指出，下述的方案中所示的取代基和变量具有如上所提供的定义)。
方案A 其中P1表示羟基保护基，P2表示羟基保护基，并且L表示离去基团，例如溴。变量R11可以是氢，或R11可以是P3，其中P3表示氨基保护基。
如方案A中所示，使式1的化合物首先和二胺2反应得到式3的中间体。通常，这个反应在极性、非质子传递溶剂中进行，任选在碱存在下和加热。保护基P1通常是甲硅烷基保护基，通常使用氟化物试剂，例如三氢氟化三乙胺，或酸，将它从式3的中间体上脱去，提供式4的中间体。保护基P2通常是苄基保护基，通常使用路易斯酸或通过使用炭上钯催化剂的氢化，将它从式4的中间体上脱去。当R11是氨基保护基P3时，可以选择该保护基，使得可以在与用于羟基保护基P1的那些相同的脱保护条件下将它脱去。例如，当P1是苄基时，苄氧基羰基(Cbz)可被用作P3并且用路易斯酸，例如三氯化硼，或通过氢化处理中间体4，可提供所述产物。
通过本领域中已知的程序，以及例如在美国专利第6,653,323B2和6,670,376B1号(通过参考将它们并入本文)及其中的参考文献中描述的程序，轻易地制备在本申请中描述的反应中使用的式1化合物。
可以由可轻易获得的原料制备式2的中间体。例如，在方案B中举例说明了用于制备中间体2′(其中R11表示氨基保护基P3的中间体)的程序。
方案B
在方案B中，P4表示氨基保护基，例如，叔丁氧基羰基(Boc)基团。
通常在还原剂，例如氰基硼氢化钠的存在下，将保护的二胺5与醛6偶合，提供式7的中间体。将保护基P3加到中间体7的内部氮原子上形成中间体8。选择保护基P3，使得可以在P3的存在下选择性地脱去保护基P4。例如，当Cbz被用作P3时，通常在碱，例如氢氧化钠存在下用苄基氯甲酸酯处理中间体7，形成中间体8，例如，在酸性条件下从中间体8上脱去保护基P4，形成中间体2′。
在方案C中举例说明了制备中间体2″(其中R11表示氢的中间体)的程序。
方案C 根据方案C，将保护的氨基取代的羧酸9与胺10偶合，提供酰胺中间体11。该反应通常在偶合剂，例如，1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(EDC)的存在下进行，并且可以使用催化剂，例如，1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)。在适当的条件下将中间体11脱保护，提供式12的中间体，例如，使用硼烷还原剂或氢化锂铝将式12的中间体还原，形成中间体2″。
在下面的实施例中描述了关于用于制备本发明的典型化合物或其中间体的具体反应条件和其它程序的进一步细节。
因此，在方法方面，本发明提供了制备式(I)的化合物，或其盐或立体异构体或保护的衍生物的方法，该方法包括如下步骤使式(III)的化合物 其中P1是羟基-保护基，L是离去基团，R6为式(I)中所定义，R1a、R2a、R3a和R4a中的每一个被定义为与式(I)中的R1、R2、R3和R4相同，或R1a、R2a、R3a和R4a中的每一个独立地是-OP2，其中P2是羟基-保护基，与式(IV)的化合物反应 其中R5、R7、R8、R9、R10、n和m如式(I)中所定义并且R11是氢或P3，其中P3是氨基-保护基，提供式(V)的化合物
除去保护基P1提供式(VI)的化合物 (VI)；并且当R1a、R2a、R3a或R4a中的任一个是-OP2时或当R11是P3时，除去保护基P2和P3，如果存在，提供式(I)的化合物，或其盐或立体异构体。
药物组合物本发明还提供了包含本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。因此，该化合物，优选以药学上可接受的盐的形式，可以配制成任何适合的给药形式，如口服或胃肠外给药，或吸入给药。
作为说明，化合物可以与常规药物载体和赋形剂混合，并以散剂、片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂和糯米纸囊剂等形式使用。这样的药物组合物将包含约0.05-约90％重量的活性化合物，更通常的是约0.1-约30％。药物组合物可以包含常规的载体和赋形剂，如玉米淀粉或明胶、乳糖、硫酸镁、硬脂酸镁、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和藻酸。常用于本发明制剂中的崩解剂包括交联羧甲基纤维素、微晶纤维素、玉米淀粉、羟乙酸淀粉钠和藻酸。
液体组合物一般由在适合液体载体中的化合物或其药学上可接受的盐的混悬剂或溶液组成，所述液体载体例如乙醇、甘油、山梨糖醇、非水溶剂如聚乙二醇、油类或水，任选含悬浮剂、增溶剂(如环糊精)、防腐剂、表面活性剂、湿润剂、矫味剂或着色剂。选择性地，液体制剂可以由可重构的粉末制得。
例如，含活性化合物、悬浮剂、蔗糖和增甜剂的粉末可以用水重构形成混悬液；糖浆剂可以由含活性成分、蔗糖和增甜剂的粉末制得。
片剂形式的组合物可以采用任何合适的常规用于制备固体组合物的药物载体进行制备。所述载体的实例包括硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素和粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮。片剂还可以提供有彩色薄膜包衣，或作为载体的一部分的内含颜色。此外，活性化合物可以配制成受控释放的剂型如含亲水或疏水基质的片剂。
胶囊剂形式的组合物，可以采用常规的胶囊化程序制得，例如将活性化合物和赋形剂掺入硬明胶胶囊中。或者地，可以制备活性化合物和高分子量聚乙二醇的半固体基质，并将其装填入硬明胶胶囊中；或可以制备活性化合物的聚乙二醇的溶液或可食用油，例如液体石蜡或分级分离的椰子油的混悬液，并将其装入软明胶胶囊中。
可以包括的片剂粘合剂是阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其它硬脂酸金属盐、硬脂酸、硅油(silicone fluid)、滑石、蜡、油和胶态二氧化硅。
也可以使用娇味剂如薄荷、冬青油，樱桃娇味剂等。另外，可能需要加入着色剂使剂型在外观上更吸引人或有助于产品的鉴别。
当胃肠外给予时是有效的本发明的化合物及其药学上可接受的盐，可以配制成肌肉内、鞘内或静脉内给药。
用于肌内或鞘内给药的典型的组合物将由活性成分在油，例如花生油或芝麻油中的混悬液或溶液组成。用于静脉内或鞘内给药的典型的组合物将由无菌等渗的水溶液组成，其含有例如活性成分和葡萄糖或氯化钠或葡萄糖和氯化钠的混合物。其它实例是乳酸林格注射液，加葡萄糖的乳酸格林注射液、含葡萄糖的Normosol-M、Isolyte E、酰化格林注射液等等。任选地，共溶剂例如聚乙二醇；螯合剂例如乙二胺四乙酸；增溶剂例如环糊精；和抗氧化剂例如焦亚硫酸钠，可以包括在制剂中。或者，溶液可以冷冻干燥，随后在给药前用适合的溶剂重构。
局部给药有效的本发明的化合物及其药学上可接受的盐可以配制为透皮组合物或透皮传送系统(“贴剂”)。这样的组合物包括，例如背衬、活性化合物储库、控制膜、衬垫和触压粘合剂。所述透皮贴剂可用于提供以受控的量连续或不连续的输注本发明的化合物。用于药用物质传送的透皮贴剂的构建和用途是本领域中熟知的。例如，参见美国专利号5,023,252。这类贴剂可以构建成用于连续的、脉冲式或视需要递送药用物质。
给予本发明的化合物的一个优选的方式是吸入。吸入是有效的直接传送药剂至呼吸道的方式。有三种一般类型的药物吸入装置雾化器吸入器、干粉吸入器(DPI)和定量吸入器(MDI)。常规雾化器装置产生高速的气流，其引起治疗剂像雾一样喷雾，其被带进患者的呼吸道。治疗剂配制成液体形式如可呼吸大小的微粉化颗粒的溶液或混悬液，其中微粉化通常定义为具有约90％或更多的直径小于约10μm的颗粒。
常规雾化器装置中使用的典型的制剂是活性剂药用盐的等渗水溶液，活性剂的浓度介于约0.05μg/mL至约1mg/mL之间。适合的雾化器装置能从商业上购得，例如，PARI GmbH(Starnberg，德国)。其它雾化器装置已经公开于例如美国专利号6,123,068中。
DPI通常以自由流动的粉末的形式给予治疗剂，在吸入的时候该粉末可以分散于患者的气流中。使用外部的能量源来分散粉末的可替代性的DPI装置也被开发。为了得到自由流动的粉末，治疗剂可以用适合的赋形剂(例如，乳糖或淀粉)来配制。例如，干粉制剂可以通过将干的乳糖颗粒与本发明的化合物(即，活性剂)适合形式，通常是药学上可接受的盐的微粉化的颗粒混合，再干掺合来制得。选择性地，药剂可以不用赋形剂进行配制。制剂装入干粉分配器中，或装入用于干粉传送装置的吸入药筒或胶囊中。
可商购的DPI传送装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)(参见，例如美国专利号5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利号6,378,519)；Turbuhaler(AstraZeneca，Wilmington，DE)(参见，例如美国专利号4,524,769)；和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利号4,353,365)。适合的DPI装置的进一步实例描述于美国专利号5,415,162、5,239,993和5,715,810，以及其中的参考文献。
MDI通常用压缩的推进剂气体排放出计量量的治疗剂。用于MDI给药的制剂包括在液化的推进剂中的活性成分的溶液或混悬液。尽管含氯氟烃如CCl3F，已被常规用作推进剂，但由于对于这类物质对臭氧层的不利影响的担心，开发了采用氢氟烷烃(HFA)如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a)和1，1，1，2，3，3，3，-七氟-正丙烷(HFA 227)的制剂。用于MDI给药的HFA制剂的另外的组分包括共溶剂如乙醇或戊烷，和表面活性剂如脱水山梨醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油(参见，例如美国专利号5,225,183、EP0717987A2和WO92/22286)。
因此，用于MDI给药的适合的制剂可以包括约0.001％-约2％重量的本发明化合物，约0％-约20％重量的乙醇和约0％-约5％重量的表面活性剂，剩余物是HFA推进剂。在一个制备制剂的方法中，将冷冻或加压的氢氟烷烃加入含本晶型、乙醇(假如存在)和表面活性剂(假如存在)的管瓶中。为了制备混悬液，以微粉化颗粒形式提供所述化合物(通常为盐形式)。将制剂装入气雾剂罐中，所述罐形成了MDI装置的一部分。美国专利号6,006,745和6,143,227提供了专门为与HFA推进剂一起使用而开发的MDI装置的实例。
在可替代的制剂中，通过在活性化合物的药用盐的微粉化颗粒上喷雾干燥表面活性剂的包衣，制得混悬剂制剂(参见，例如WO99/53901和WO00/61108)。关于制备可呼吸的颗粒的方法的另外的实施例与适于吸入给药的制剂和装置参见美国专利号6,268,533、5,983,956、5,874,063和6,221,398，WO99/55319和WO00/30614。
应该理解的是，适于特定给药方式的本发明化合物的任何形式(即，游离碱、药用盐或溶剂合物)，可以用于上面讨论的药物组合物中。
预期活性化合物在广泛的剂量范围内是有效的，并以治疗有效量给药。然而，应当理解，实际给药的化合物的量是由医生按照有关的情况(包括将要治疗的病况、选择的给药途径、给予的实际化合物及其相对活性、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重性等)来决定的。
化合物可以周期性的剂量给药每周一次、每周多次、每日一次或每日多次剂量。治疗方案可能要求在很长的时间阶段给药(例如几周或数月)，或治疗方案可能要求长期给药。
吸入给药的治疗剂的合适剂量是约0.05μg/天-约1000μg/天的一般范围，包括约0.1μg/天-约500μg/天。应当理解的是，在确定吸入给药的合适剂量时，要考虑有特定的传送装置特色的传送到肺的活性剂的部分。口服给药的合适剂量是约0.05μg/天-约100mg/天的一般范围，优选是约0.5μg/天-约1000μg/天。
除了其它性质以外，本发明的化合物表现出令人惊讶和出人意料的作用持续时间。如在以下生物测定法中描述的，本发明的化合物在支气管保护的动物模型中证明作用持续时间大于24小时。本发明的化合物是强效的和选择性的β2肾上腺素能受体激动剂。特别地，与β1和β3肾上腺素能受体比较，本发明的化合物对β2肾上腺素能受体有选择性。
因此本发明提供了一种治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物给于治疗有效量的本发明的化合物或含本发明化合物的药物组合物。
本活性剂还可以用作另外含一种或多种其它治疗剂的组合的一部分。例如，本活性剂可以与一种或多种治疗剂联合给药，所述治疗剂选自抗炎药(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药(NSAIDs)、抗胆碱能药(特别是毒蕈碱性受体拮抗剂)、其它β2肾上腺素能受体激动剂、抗感染药(例如，抗生素或抗病毒药)或抗组胺剂。因此，在进一步方面，本发明提供包含本发明的化合物和一种或多种治疗剂(例如，抗炎药、抗胆碱能药、另外的β2肾上腺素能受体激动剂、抗感染药或抗组胺剂)的组合。
其它的治疗剂可以药学上可接受的盐或溶剂合物的形式使用。合适时，其它治疗剂可以光学纯的立体异构体形式使用。
适合的抗炎药包括皮质类固醇和NSAIDs。可以与本发明的化合物联合使用的合适的皮质类固醇为那些口服和吸入的皮质类固醇及其具有抗炎活性的前药。实例包括甲基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯、倍氯米松酯(例如，17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩松、莫米松酯(例如，糠酸酯)、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德、丙酸布替可特、RPR-106541和ST-126。优选的皮质类固醇包括丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯和6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯，更优选6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯。
合适的NSAIDs包括色甘酸钠、奈多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱、PDE4抑制剂或者混合的PDE3/PDE4抑制剂)、白三烯拮抗剂(例如，孟鲁司特)、白三烯合成抑制剂、iNOS抑制剂、蛋白酶抑制剂如类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺苷2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂，如白介素抗体(αIL抗体)、特别地αIL-4疗法、αIL-13疗法或其组合)；或者细胞因子合成抑制剂。合适的其它的β2-肾上腺素受体激动剂包括沙美特罗(例如昔萘酸盐形式)、沙丁胺醇(例如硫酸盐或者游离碱形式)、福美特罗(例如富马酸盐形式)、非诺特罗或者特布他林及其盐。
还感兴趣的是本活性剂与磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂组合的用途。典型的磷酸二酯酶-4(PDE4)抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂包括，但是不限于，顺式4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-甲酸、2-甲氧甲酰-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-酮、顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-醇]、顺式-4-氰基-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-1-甲酸等，或其药学上可接受的盐。其它典型的PDE4或混合的PDE4/PDE3抑制剂包括AWD-12-281(elbion)、NCS-613(INSERM)、D-4418(Chiroscience和Schering-Plough)、CI-1018或PD-168787(Pfizer)、WO99/16766中公开的苯并间二氧杂环戊二烯化合物(Kyowa Hakko)、K-34(Kyowa Hakko)、V-11294A(Napp)、罗氟司特(Byk-Gulden)、WO99/47505中公开的pthalazinone化合物(Byk-Gulden)、Pumafentrine(Byk-Gulden，目前为Altana)、阿罗茶碱(Almirall-Prodesfarma)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe Seiyaku)和T2585(TanabeSeiyaku)。
合适的抗胆碱能药是充当毒蕈碱受体拮抗剂的那些化合物，特别是为M1、M2或M3受体或其组合的拮抗剂的那些化合物。示范性化合物包括颠茄植物的生物碱类，例如阿托品、东莨菪碱、后马托品、莨菪碱；这些化合物通常是作为叔胺的盐而给药的。这些药物、特别是盐形式可容易从大量商业来源获得或者可以利用文献资料制备或制得，也就是阿托品-CAS-51-55-8或者CAS-51-48-1(无水形式)，硫酸阿托品-CAS-5908-99-6；氧阿托品-CAS-4438-22-6或者其HCl盐-CAS-4574-60-1和甲硝阿托品-CAS-52-88-0。
后马托品-CAS-87-00-3，氢溴酸盐-CAS-51-56-9，甲基溴化物盐-CAS-80-49-9。
莨菪碱(d，l)-CAS-101-31-5，氢溴酸盐-CAS-306-03-6和硫酸盐-CAS-6835-16-1。
东莨菪碱-CAS-51-34-3，氢溴酸盐-CAS-6533-68-2，甲基溴化物盐-CAS-155-41-9。
优选的抗胆碱能药包括以爱全乐(Atrovent)的名称销售的异丙托铵(例如溴化物形式)，氧托铵(例如溴化物形式)和噻托铵(例如溴化物形式)(CAS-139404-48-1)。感兴趣的还有甲胺太林(CAS-53-46-3)、溴化丙胺太林(CAS-50-34-9)、甲溴辛托品或Valpin50(CAS-80-50-2)、克利溴铵(Quarzan，CAS-3485-62-9)、copyrrolate(Robinul)、异丙碘铵(CAS-71-81-8)、溴美喷酯(美国专利2,918,408)、曲地氯胺(Pathilone，CAS-4310-35-4)和甲硫己环铵(Tral，CAS-115-63-9)。还参见盐酸环喷托酯(CAS-5870-29-1)、托品酰胺(CAS-1508-75-4)、盐酸苯海索(CAS-144-11-6)、哌仑西平(CAS-29868-97-1)、替仑西平(CAS-80880-90-9)、AF-DX116或者美索曲明和在WO01/04118中公开的化合物，其公开通过引用结合到本文中。
合适的抗组胺药(也称作H1-受体拮抗剂)包括大量已知抑制H1-受体并且对于人类使用是安全的拮抗剂的任何一种或者多种。它们都是组胺与H1-受体相互作用的可逆的、竞争性抑制剂。大多数为第一代拮抗剂的这些抑制剂的大部分，基于它们的核心结构被表征为乙醇胺类、乙二胺类和烷基胺类。另外，其它的第一代抗组胺药包括可以基于它们的结构被表征为哌嗪和吩噻嗪类的那些。第二代拮抗剂，其为非-镇静的，具有类似的结构-活性关系，因为它们保留了核心亚乙基(烷基胺类)或者模拟具有哌嗪或者哌啶的叔胺基团。举例说明的拮抗剂如下乙醇胺类马来酸卡比沙明、富马酸氯马斯汀、盐酸苯海拉明和茶苯海明。
乙二胺类马来酸吡拉明、曲吡那敏HCl和枸橼酸曲吡那敏。
烷基胺类氯吡那敏及其盐例如马来酸盐和阿伐斯汀。
哌嗪类羟嗪HCl、双羟萘酸羟嗪、赛克利嗪HCl、乳酸赛克利嗪、美克洛嗪HCl和西替利嗪HCl。
哌啶类阿司咪唑、左卡巴司汀HCl、氯雷他定或其脱乙酯基类似物，和特非那定和盐酸非索非那定或者另一种药学上可接受的盐。
盐酸氮卓斯汀也是一种H1受体拮抗剂，它可以与本发明的化合物联合使用。
优选的抗组胺药的实例包括美沙吡林和氯雷他定。
因此，本发明在进一步方面提供一种含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与皮质类固醇的组合。特别地，本发明提供一种组合，其中皮质类固醇是丙酸氟替卡松或其中皮质类固醇是6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯或6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与PDE4抑制剂的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与抗胆碱能药的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体和抗组胺剂的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体连同PDE4抑制剂和皮质类固醇的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体连同抗胆碱能药和皮质类固醇的组合。
如以上组合中所用的，术语“式(I)的化合物”包括式(II)的化合物及其优选的组，和任何单独公开的一种或多种化合物。
因此，本发明还提供了药物组合物，它包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与一种或多种如以上所述的其它治疗剂。
这类组合的单个化合物可以以分开或者组合的药物制剂顺序或者同时给药。已知治疗剂的合适剂量容易被本领域技术人员意识到。因此，本发明的治疗方法包括这类组合的单个化合物以分开或者组合的药物制剂顺序或者同时给药。
因此，根据进一步方面，本发明提供治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括向该哺乳动物给予治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与治疗可接受量的一种或多种其它治疗剂。
由于本发明的化合物是β2肾上腺素能受体激动剂，这类化合物还可以用作调查或研究含有β2肾上腺素能受体的生物系统或样品的研究工具，或用来发现新的β2肾上腺素能受体激动剂。而且，因为与在其它β肾上腺素能亚型上的结合和功能活性比较，本发明的化合物表现出对β2肾上腺素能受体的选择性，所以这类化合物还可用于研究生物系统或样品中β2肾上腺素能受体的选择性激动的作用。任何含β2肾上腺素能受体的合适的生物系统或样品可用于这类研究中，该研究可以在体外或体内进行。
适合于这类研究的典型的生物系统和样品包括，但不限于细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、哺乳动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪等)等等。采用常规的操作和装置，如放射配基结合试验和功能测定，例如如下所述的配基-介导的细胞内环腺苷酸(cAMP)变化的测定或相似性质的测定，来测定激动β2肾上腺素能受体的效应。本发明化合物的β2肾上腺素能受体激动量通常是在约1毫微摩尔至约1000毫微摩尔的范围。当本发明的化合物用作发现新的β2肾上腺素能受体激动剂的研究工具时，作为分开的实施方式本发明还包括，对比数据(使用合适的测定)的产生和鉴定目标试验化合物的试验数据的分析。
下面的非限制性实施例说明了本发明的典型药物组合物。用于本发明活性化合物的制剂的另外适合的载体也可以在RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，第二十版，Lippincott Williams &Wilkins，Philadelphia，PA，2000中找到。
制剂实施例A这个实施例说明了用于本发明化合物口服给药的典型药物组合物的制备。
成分每片的量，(mg)
活性成分1乳糖，喷雾干燥的148硬脂酸镁2
将上述成分混合，并引入硬壳明胶胶囊内。
制剂实施例B这个实施例说明了用于本发明化合物口服给药的另一个典型药物组合物的制备。
成分每片的量，(mg)
活性成分1玉米淀粉50乳糖145硬脂酸镁5
将以上成分密切混合并压成单刻痕的片剂。
制剂实施例C这个实施例说明了用于本发明化合物口服给药的典型药物组合物的制备。
制备具有以下组成的口服混悬剂。
成分活性化合物 3mg富马酸 0.5g氯化钠 2.0g尼泊金甲酯 0.1g砂糖 25.5g山梨糖醇(70％溶液) 12.85g硅酸镁铝K(Vanderbilt Co.)1.0g娇味剂 0.035mL着色剂 0.5mg蒸馏水 适量至100mL
制剂实施例D这个实施例说明了含有本发明化合物的典型药物组合物的制备。
制备具有以下组成的缓冲至pH 4的可注射制剂。
成分活性化合物 0.1mg乙酸钠缓冲溶液(0.4M) 2.0mLHCl(1N)适量至pH4水(蒸馏的、无菌的) 适量至20mL
制剂实施例E这个实施例说明了用于注射本发明化合物的典型药物组合物的制备。
通过向1mg的本发明化合物中力加入20mL的无菌水制备重构的溶液。使用前，然后用200mL可与活性化合物配伍的静脉内注射的流体稀释该溶液。该流体选自5％葡萄糖溶液、0.9％氯化钠溶液，或5％葡萄糖和0.9％氯化钠的混合物。其它的实例是乳酸格林注射液、含5％葡萄糖的乳酸格林注射液、含5％葡萄糖的Normosol-M、IsolyteE和酰化的格林注射液。
制剂实施例F这个实施例说明了用于本发明化合物的局部应用的典型药物组合物的制备。
成分 克活性化合物 0.2-10司盘60 2吐温60 2矿物油 5凡士林 10尼泊金甲酯 0.15尼泊金丙酯 0.05BHA(丁基化羟基苯甲醚)0.01水 适量至100
合并以上除水以外的所有成分，并在搅拌下加热至60℃。然后在剧烈搅拌下添加60℃的足量的水以使成分乳化，然后适量添加水至100g。
制剂实施例G这个实施例说明了含有本发明化合物的典型药物组合物的制备。
通过将0.1mg活性化合物的药用盐溶解于用柠檬酸酸化的0.9％氯化钠溶液中，制备用于雾化器中的含水气雾剂制剂。搅拌混合物并超声处理，直到活性盐溶解。通过缓慢加入NaOH调节溶液的pH至3-8的范围。
制剂实施例H这个实施例说明了用于吸入药筒的含本发明化合物的干粉制剂的制备。
用具有下列成分的药物组合物填充明胶吸入药筒。
成分
mg/药筒活性化合物的药用盐0.2乳糖 25
在与乳糖掺合前，先将活性化合物的药用盐微粉化。使用粉剂吸入器给予药筒的内含物。
制剂实施例I这个实施例说明了用于干粉吸入装置中的含本发明化合物的干粉制剂的制备。
制备微粉化的药用盐和乳糖的体积配方(bulk formulation)比为1∶200的药物组合物。把组合物填充入干粉吸入装置，所述装置每剂量能传送约10μg-约100μg的活性药物成分。
制剂实施例J这个实施例说明了用于定量吸入器中的含本发明化合物的制剂的制备。
通过将5g平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒形式的活性化合物分散于胶体溶液中，制成含5％的活性化合物的药用盐、0.5％卵磷脂和0.5％海藻糖的混悬液，所述胶体溶液由0.5g的海藻糖和0.5g的卵磷脂溶解于100mL的软化水中形成。将混悬液喷雾干燥，并将所得的物质微粉化到平均直径小于1.5μm的颗粒。将该颗粒装填入含加压的1，1，1，2-四氟乙烷的罐中。
制剂实施例K这个实施例说明了用于定量吸入器中的含本发明化合物的制剂的制备。
通过将10g平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒形式的活性化合物分散于溶液中，制成含5％的活性化合物的药用盐和0.1％卵磷脂的混悬液，所述溶液由0.2g的卵磷脂溶解于200mL的软化水中形成。将混悬液喷雾干燥，并将所得的物质微粉化至平均直径小于1.5μm的颗粒。将该颗粒装填入含加压的1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷的罐中。
制剂实施例L这个实施例说明了用于吸入药筒中的含有本发明的化合物和皮质类固醇的干粉制剂的制备。
用具有下列成分的药物组合物填充明胶吸入药筒成分
mg/药筒活性化合物的药用盐 0.1皮质类固醇 0.5乳糖 25
在与乳糖掺合前，将活性化合物的药用盐和皮质类固醇微粉化。使用粉末吸入器施用药筒的内容物。
生物学测定法本发明的化合物及其药学上可接受的盐，表现出生物活性，并且适用于医学治疗。化合物结合β2肾上腺素能受体的能力及其选择性、激动剂效价和内在活性，可以用以下的试验A-B证明，或可以使用本领域已知的其它试验证明。
缩写％Eff ％功效ATCC 美国典型培养物保藏中心BSA 牛血清白蛋白cAMP 3′5′-环磷酸腺苷DMEM Dulbecco改进的Eagle培养基DMSO 甲亚砜EDTA 乙二胺四乙酸Emax 最大功效FBS 胎牛血清Gly 甘氨酸HEK-293 人胚肾-293PBS 磷酸盐缓冲盐水rpm 转/分Tris 三(羟甲基)氨基甲烷来自表达人β1或β2肾上腺素能受体的细胞的膜制备物使稳定地表达克隆的人β1或β2肾上腺素能受体的HEK-293衍生的细胞系在存在500μg/mL遗传霉素并含10％透析的FBS的DMEM中分别生长到接近汇合。使用细胞刮板用乙二胺四乙酸1∶5,000(PBS中0.2g/L EDTA)提起细胞单层。通过以1,000rpm离心使细胞沉淀，并且将细胞沉淀在-80℃下冷冻保存或立刻制备膜。就制备而言，将细胞沉淀再悬浮在溶胞缓冲液(10mM的Tris/HCL [email protected]℃，每50mL缓冲液(Roche cat.#1 697498，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)一片“含2mM EDTA的完全性蛋白酶抑制剂混合物片”)中，并在冰上使用吻合紧密的Dounce玻璃匀浆器匀化(冲击20次)。以20,000xg离心匀浆，通过如上所述的再悬浮和离心，用溶胞缓冲液洗涤该沉淀一次。将最后的沉淀再悬浮在膜缓冲液(75mMTris/HCl pH7.4，12.5mM MgCl2，1mM [email protected]℃)。用Bradford的方法(Bradford MM.，Analytical Biochemistry，1976，72，248-54)测定膜悬浮液的蛋白质浓度。在-80℃下以等分试样冷冻保存膜。
试验A对人β1和β2肾上腺素能受体的放射配体结合试验在96-孔微量滴定板中进行结合试验，在测定缓冲液(75mMTris/HCl [email protected]℃，12.5mM MgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA)中总测定体积为100μL，含有5μg膜蛋白(对于含有人β2肾上腺素能受体的膜)，或含有2.5μg膜蛋白(对于含有人β1肾上腺素能受体的膜)。采用[3H]二氢阿普洛尔(NET-720，100Ci/mmol，PerkinElmer LifeSciences Inc.，Boston，MA)以从0.01nM-200nM的10个不同的浓度，进行用于测定放射性配体的Kd值的饱和结合研究。用1nM的[3H]二氢阿普洛尔和从40pM-10μM的10个不同的化合物浓度，进行用于测定化合物pKi值的置换试验。在溶解缓冲液(25mM Gly-HCl，pH3.0，含50％DMSO)中将化合物溶解至浓度为10mM，然后在50mMpH3.0的Gly-HCl中稀释至1mM，并且从这里连续稀释成测定缓冲液。在存在10μM未标记的阿普洛尔的条件下，测定非特异性结合。测定在室温下温育90分钟，通过在预先浸渍在0.3％的聚乙烯亚胺中的GF/B玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)快速过滤终止结合反应。用过滤缓冲液(75mM Tris/HCl，[email protected]℃，12.5mM MgCl2，1mM EDTA)洗涤滤板三次，以除去未结合的放射性。将板干燥、添加50μL的Microscint-20液体闪烁流体(PackardBioScience Co.，Meriden，CT)，并在Packard Topcount液体闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)中对板计数。用GraphPadPrism软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)，使用一位点竞争的3参数模型，通过非线性回归分析来分析结合数据。当在存在10μM阿普洛尔的条件下测定时，将曲线最小值固定为非特异性结合的值。采用Cheng-Prusoff方程式(Cheng Y和Prusoff WH.，Biochemical Pharmacology，1973年，22，23，第3099-108页)，从观察到的IC50值和放射性配体的Kd值计算化合物的Ki值。将受体亚型选择性计算为Ki(β1)/Ki(β2)的比。
将结合结果表达为Ki值的负十对数，pKi。在本试验中具有较高pKi值的化合物对β2肾上腺素能受体具有较高的结合亲和力。
试验B采用分别异源地表达人β1肾上腺素受体、β2肾上腺素受体和β3肾上腺素受体的细胞系的全细胞cAMP快速板(Flashplate)试验使稳定地表达克隆的人β1肾上腺素能受体(克隆H34.1)的HEK-293细胞系在由补充了10％FBS和500μg/mL遗传霉素的DMEM组成的培养基中长到约70％-90％汇合。使稳定地表达克隆的人β2-肾上腺素受体(克隆H24.14)的HEK-293细胞系在相同的培养基中长到完全汇合。使稳定地表达克隆的人β3-肾上腺素受体的CHO-K1细胞系在补充了10％FBS和每第五传代加入的800μg/mL的遗传霉素的Ham’s F-12培养基中长到约70％-90％汇合。在测定前一天，将培养物转换到不含抗生素的相同生长培养基中。
根据制造商的用法说明，采用含有125I-cAMP的快速板腺苷酸环化酶活化测定系统(NEN SMP004，PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)，以放射免疫测定法格式进行cAMP测定。
在测定的当天，用PBS漂洗细胞一次，用乙二胺四乙酸1∶5,000(PBS中0.2g/L EDTA)提起并计数。以1,000rpm离心使细胞沉淀，并将其再悬浮在预加热至37℃的刺激缓冲液中。对于表达β1-肾上腺素受体的细胞来说，将10nM的ICI118,551添加到刺激缓冲液中，并在37℃下温育细胞10分钟。对于分别表达β1-肾上腺素受体、β2-肾上腺素受体和β3-肾上腺素受体的细胞，以30,000、40,000和70,000个细胞/孔的最终浓度使用细胞。将化合物在DMSO溶解至10mM的浓度，然后用50mM pH3.0的Gly-HCl稀释至1mM，并且从这里连续稀释成测定缓冲液(75mM Tris/HCl，[email protected]℃，12.5mM MgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA)。在测定中以10μM到9.5pM范围内的11个不同的浓度测试化合物。在37℃下温育反应10分钟，并且通过加入100μL冰冷的检测缓冲液停止反应。将板密封、在4℃下温育过夜并在第二天上午在topcount闪烁计数器(PackardBioScience Co.，Meriden，CT)中计数。按照制造商的用户手册所描述的，基于观察到的样品的计数和cAMP标准品的计数，计算每毫升反应产生的cAMP的量。用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)，使用S形剂量-响应(希尔斜率＝1)的3参数模型，通过非线性回归分析来分析数据。将激动剂效价表达为pEC50值。将功能β2/β1选择性定义为比值EC50(β1)/EC50(β2)，并且相应地将功能β2/β3选择性定义为比值EC50(β3)/EC50(β2)。
试验C采用内源性地表达人β2肾上腺素能受体的肺上皮细胞系的全细胞cAMP快速板试验为了在表达内源性水平的β2肾上腺素能受体的细胞系中测定激动剂效价和功效(内在活性)，使用人肺上皮细胞系(BEAS-2B)(ATCCCRL-9609，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)(January B等人，British Journal of Pharmacology，1998，123，4，第701-711页)。使细胞在完全的、无血清的培养基(含肾上腺素和维甲酸的LHC-9MEDIUM，cat#181-500，Biosource International，Camarillo，CA)中生长到75％-90％汇合。在测定前一天，将培养基转换为LHC-8(不含肾上腺素或维甲酸，cat#141-500，Biosource International，Camarillo，CA)。
根据制造商的用法说明，采用含有125I-cAMP的快速板腺苷酸环化酶活化测定系统(NEN SMP004，PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)，以放射免疫测定法格式进行cAMP测定。
在测定的当天，细胞用PBS漂洗，通过用含5mM EDTA的PBS刮而提起，并计数。通过以1,000rpm离心使细胞沉淀，并以600,000个细胞/mL的最终浓度将其再悬浮在预加热至37℃的刺激缓冲液中。在测定中以30,000个细胞/孔的最终浓度使用细胞。将化合物在溶解缓冲液(25mM pH3.0的Gly-HCl，含50％DMSO)中溶解至10mM的浓度，然后用50mM pH3.0的Gly-HCl稀释至1mM，并且从这里连续稀释成测定缓冲液(75mM Tris/HCl，[email protected]℃，12.5mMMgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA)。
在测定中，以在10μM到40pM范围内的10个不同的浓度测试化合物。在存在10μM异丙肾上腺素的条件下测定最大响应。在37℃下温育反应10分钟，并通过加入100μL冰冷的检测缓冲液停止反应。把板密封、在4℃下温育过夜并在第二天上午在topcount闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)中计数。按照制造商的用户手册所描述的，基于观察到的样品的计数和cAMP标准品的计数，计算每mL反应产生的cAMP的量。用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)，使用具有可变斜率的S形剂量-响应的4参数模型，通过非线性回归分析来分析数据。由观察到的Emax(拟合曲线的顶点)和对于10μM异丙肾上腺素获得的最大响应的比，计算化合物功效(％Eff)，并将其表达为相对于异丙肾上腺素的％Eff。
试验D豚鼠模型中对抗乙酰胆碱诱导的支气管痉挛的支气管保护的测定通过笼子卡片个体鉴别每组6只体重在250和350克之间的雄性豚鼠的组(Duncan-Hartley(HsdPocDH)Harlan，Madison，WI)。在整个研究中，允许动物随意地获得食物和水。
在全身暴露给药隔室(R & S Molds，San Carlos，CA)中，在10分钟内通过吸入给予试验化合物。安排给药隔室，使得气雾剂从中央歧管被同时递送到6个单独的隔室。60分钟顺应期和10分钟暴露于雾化的注射用水(WFI)后，将豚鼠暴露于试验化合物或载体(WFI)的气雾剂。使用由22psi压力下的气体混合物(CO2＝5％、O2＝21％和N2＝74％)驱动的LC Star喷雾器装置(型号22F51，PARI RespiratoryEquipment，Inc.Midlothian，VA)，由水溶液产生这些气雾剂。在该操作压力下通过雾化器的气体流量是大约3L/分钟。通过正压将所产生的气雾剂驱动到隔室中。在传送气雾化溶液的过程中使用未稀释的空气。在10分钟雾化过程中，雾化了大约1.8mL的溶液。这是通过比较填充的喷雾器的雾化前和雾化后重量，用重量分析法进行测量的。
服药后1.5、24、48和72小时，采用全身体积描记法评价通过吸入给予的化合物的支气管保护作用。在开始肺评估前45分钟，用肌内注射氯胺酮(43.75mg/kg)、赛拉嗪(3.50mg/kg)、乙酰丙嗪(1.05mg/kg)来麻醉每只豚鼠。外科手术部位剃毛并用70％的酒精清洁后，做一个2-5cm的颈前侧面的中线切口。然后，分离颈静脉并用充满生理盐水的聚乙烯导管(PE-50，Becton Dickinson，Sparks，MD)插管，以允许静脉内输注0.1mg/mL的乙酰胆碱(Ach)，(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的盐水溶液。然后，自由地切开气管，并用14G聚四氟乙烯管(#NE-014，Small Parts，Miami Lakes，FL)插管。如果需要，通过另外肌肉内注射前面提及的麻醉剂混合物来保持麻醉。如果动物对捏拧其脚爪有反应或其呼吸率大于100次/分钟，监测并调节麻醉的深度。
一旦完成插管，将动物放置到体积描记器(#PLY3114，BuxcoElectronics，Inc.，Sharon，CT)中，并插入食管压力插管以测量肺驱动压(压力)。将聚四氟乙烯气管导管连到体积描记器的开口，以允许豚鼠呼吸来自隔室外面的房间空气。然后密封隔室。使用加热灯维持体温，并采用10mL校准注射器(#5520系列，Hans Rudolph，KansasCity，MO)，用4mL空气使豚鼠的肺膨胀3次，以确保下气道不会萎陷并且动物不会遭受通气过度。
一旦测定顺应性的基线值在0.3-0.9ml/cm H2O的范围内，并且阻力的基线值每秒0.1-0.199cm H2O/mL的范围内，就开始肺的评估。Buxco肺测量计算机程序使得能够采集并导出肺的值。开始该程序起始实验方案和数据采集。通过Buxco压力传感器测量每次呼吸时在体积描记器内发生的体积随时间的变化。通过对随时间变化的该信号积分，计算每次呼吸的流量的量度。将该信号和肺的驱动压变化(使用Sensym压力传感器(#TRD4100)采集)，通过Buxco(MAX 2270)前置放大器与数据采集界面(#’s SFT3400和SFT3813)相连接。所有其它肺参数从这两个输入信号导出。
采集基线值5分钟，5分钟后用Ach攻击豚鼠。在规定的实验开始后的时间和以下述的剂量从注射泵(sp210iw，World PrecisionInstruments，Inc.，Sarasota，FL)中静脉内输注Ach1分钟在5分钟时1.9μg/分钟、在10分钟时3.8μg/分钟、在15分钟时7.5μg/分钟、在20分钟时15.0μg/分钟、在25分钟时30μg/分钟和在30分钟时60μg/分钟。如果在每个Ach剂量后的3分钟阻力或顺应性没有回到基线值，用来自10mL校准注射器的4mL空气使豚鼠的肺膨胀3次。记录的肺参数包括呼吸频率(呼吸/分钟)、顺应性(mL/cm H2O)和肺阻力(每秒的cm H2O/mL)(Giles等，1971)。一旦在这个实验方案的第35分钟完成了肺功能测量，将豚鼠从体积描记器中取出，通过CO2窒息使之安乐死。
用下列方程式，使用从一系列Ach攻击期间的所述流量和压力导出的肺阻力值，计算量PD2(将其定义为使基线肺阻力加倍所需要的Ach的量)。这是从临床学科中用于计算PC20值的方程式导出的(Am.Thoracic Soc，2000)。
PD2=antilog[logC1+(logC2-logC1)(2R0-R1)R2-R1]]]>其中C1＝倒数第二个Ach浓度(C2前面的浓度)C2＝最后的Ach浓度(导致肺阻力(RL)两倍增加的浓度)R0＝基线RL值R1＝C1后的RL值R2＝C2后的RL值使用单向(One-Way)方差分析，接着使用Bonferroni/Dunn检验的post-hoc分析，进行数据的统计分析。p-值＜0.05被认为是显著的。
使用用于Windows的GraphPad Prism，3.00版本(GraphPadSoftware，San Diego，California)，用四参数对数方程拟合剂量-响应曲线。
Y＝Min+(Max-Min)/(1+10^((logED50-X)*希尔斜率))，其中X是剂量的对数，Y是响应值(PD2)，Y在Min开始并且渐近地接近Max，具有S形。
提供以下实施例用于说明本发明，不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例一般原则除非另外指出，试剂、原料和溶剂从商业供应商购得，例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)和Honeywell Burdick和Jackson(Muskegon，MI)，并且在没有进一步纯化下被使用；反应在氮气氛下进行；用薄层色谱法(二氧化硅TLC)、分析型高效液相色谱法(分析型HPLC)或质谱分析监测反应混合物；反应混合物通常用硅胶急骤柱色谱法或用制备型HPLC，采用以下所述的一般方案提纯；将NMR试样溶解于氘代溶剂(CD3OD、CDCl3或DMSO-d6)中，光谱用Varian Gemini2000仪器(300MHz)在标准参数下获得；采用Perkin Elmer仪器(PE SCIEX API150EX)通过电喷射离子化方法(ESMS)进行质谱分析鉴别。
实施例18-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成a.(6-苯乙氨基己基)-氨基甲酸叔丁基酯的制备将(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁基酯盐酸盐(5g，20mmol)溶解在50％二氯甲烷/甲醇(50mL)中并在环境温度下用苯乙醛(2.3mL，20mmol)处理1小时。添加氰基硼氢化钠(1.2g，19mmol)并搅拌混合物过夜。添加水，接着添加饱和的碳酸氢钠和附加的二氯甲烷。分配混合物，用硫酸钠干燥有机物并在碱压下除去挥发物，以得到标题中间体，在没有进一步纯化下使用该中间体。
b.(6-叔丁氧羰基氨基-己基)苯乙基氨基甲酸苄基酯的制备在环境温度下用苄基氯甲酸酯(2.8mL，20mmol)和氢氧化钠水溶液(1M，30mL)处理前一步骤的产物过夜。用乙酸异丙酯萃取混合物。用柠檬酸水溶液(0.5M)，接着用饱和的碳酸氢钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并在减压下除去挥发物，以得到标题中间体(9g)，在没有进一步纯化下使用它。
c.(6-氨基己基)苯乙基氨基甲酸苄基酯的制备将前一步骤的产物(9g粗的)溶解在二氯甲烷(45mL)中并在环境温度下用三氟乙酸(45mL)处理。在减压下除去挥发物，将残余物溶于水中并用氢氧化钠碱化。用二氯甲烷萃取混合物并用硫酸钠干燥有机物。在减压下除去挥发物得到标题中间体，将其蒸发至干并在没有进一步纯化下使用它。
d.[(R)-2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(8-苄基氧基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-5-基)乙基]-(6-苯乙氨基-己基)氨基甲酸苄基酯的制备在110℃加热前一步骤的产物(6.5g粗的，18mmol)、8-苄基氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(4.5g，9.2mmol)和二甲亚砜(13mL)1小时，然后冷却到环境温度过夜。将混合物在水和乙酸异丙酯之间分配。用饱和的碳酸氢钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干。通过反相HPLC纯化混合物得到标题中间体，为其三氟乙酸盐。
e.[(R)-2-羟基-2-(8-苄基氧基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-5-基)乙基]-(6-苯乙氨基-己基)氨基甲酸苄基酯的制备将前一步骤的产物溶解在四氢呋喃中并在室温下用三氢氟化三乙胺处理，直到通过HPLC判断反应完全。将混合物分配在1M氢氧化钠和乙酸异丙酯之间。用硫酸钠干燥有机物并蒸发至干，得到标题中间体。
f.8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成在室温下将前一步骤的产物(250mg，0.39mmol)溶解在二氯甲烷中，并以等分试样添加三氯化硼(在二氯甲烷中1M)。通过HPLC监测反应，添加附加的三氯化硼，直到判断反应完全。添加10％乙酸水溶液并在减压下除去二氯甲烷。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题化合物，为其双-三氟乙酸盐。
实施例28-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的可替代性合成a.(5-苯乙基氨甲酰基-戊基)氨基甲酸叔丁基酯的制备在氮气下将苯乙胺(340μL，4.3mmol)、6-叔丁氧羰基氨基-己酸(1.0g，4.3mmol)和1-羟基苯并三唑(700mg，5.1mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺中并冷却到0℃。添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐并搅拌混合物过夜，让其温至室温。将混合物分配在水和乙酸异丙酯之间。用0.5M柠檬酸，然后用饱和的碳酸氢钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干。在没有进一步纯化下使用残余物。
b.6-氨基-N-(2-苯乙基)己酰胺的制备将前一步骤的产物溶解在二氯甲烷(10mL)中并在室温下用三氟乙酸(10mL)处理1小时。在减压下除去挥发物并将残余物溶于二氯甲烷中，用1N氢氧化钠洗涤，用硫酸钠干燥并蒸发至干，得到标题中间体(830mg，3.5mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
c.N1-苯乙基己烷-1，6-二胺的制备在氮气和室温下将前一步骤的产物(330mg，1.4mmol)溶解在四氢呋喃(4mL)中并添加硼烷-二甲硫复合物(500μL)。回流混合物过夜，然后在冰浴中冷却。小心地添加甲醇并在减压下除去挥发物。将残余物再溶解在甲醇中并再次浓缩，得到标题中间体(360mg，1.6mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
d.8-苄基氧基-5-[(R)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(200mg，0.91mmol)、8-苄基氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(340mg，0.70mmol)、碳酸氢钠(180mg，2.1mmol)和二甲亚砜(1.7mL)加热到110℃达55分钟，冷却到室温并在乙酸异丙酯和水之间分配。用硫酸钠干燥有机物并蒸发至干。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题中间体，为其双-三氟乙酸盐(75mg，88μmol)。
e.8-苄基氧基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(75mg，88μmol)溶解在四氢呋喃(1mL)中并在室温下用三氢氟化三乙胺(60μL，370μmol)处理18小时。将混合物分配在1M氢氧化钠和乙酸异丙酯之间。用硫酸钠干燥有机物并蒸发至干，得到标题中间体。
f.8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成在室温下将前一步骤的产物溶解在二氯甲烷中并以等分试样添加三氯化硼(在二氯甲烷1M)。通过HPLC监测反应，添加附加的三氯化硼直到判断反应完全。添加10％乙酸水溶液并在减压下除去二氯甲烷。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题化合物，为其双-三氟乙酸盐。C25H33N3O3计算的m/z[M+H+]424.26；实测值424.4。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)10.4(s，2H)，8.6(brs，4H)，8.0(d，1H，J＝9.9Hz)，7.1-7.3(m，5H)，7.0(d，1H，J＝8.2Hz)，6.9(d，1H，J＝8.2hz)，6.4(d，1H，J＝9.9Hz)，6.1(brs，1H)，5.2(brd，1H，J＝8.5Hz)，2.7-3.1(m，10H)，1.4-1.6(m，4H)，1.1-1.3(m，4H)。
比较实施例8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成a.6-苯乙基氧基己腈的制备将6-溴代己腈(3.0mL，23mmol)和四丁级溴化铵(350mg，1.1mmol)溶解在四氢呋喃(5mL)和50％氢氧化钠水溶液(15mL)中。添加苯乙醇(3.0mL，25mmol)，导致沉淀。将混合物加热到65℃，此时固体溶解。在65℃搅拌混合物4小时，然后冷却到室温并放置11天。添加水、己烷和乙酸乙酯并分配混合物。用水、饱和的氯化钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干，得到标题中间体(5.3g，24mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
b.6-苯乙基氧基己胺的制备将前一步骤的产物(5.3g，24mmol)溶解在四氢呋喃(50mL)中并用硼烷-二甲硫复合物(6mL)处理。回流混合物3.5小时，然后添加额外的硼烷-二甲硫复合物(2mL)，再回流混合物20小时，冷却到室温，并小心地添加甲醇。在减压下除去挥发物并从甲醇中再蒸发混合物，得到标题中间体(5.7g，26mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
c.8-苄基氧基-5-[(R)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(3.4g，15mmol)、8-苄基氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(3.4g，7.0mmol)、碳酸氢钠(2.3g，27mmol)和二甲亚砜(7mL)在100℃加热135分钟，然后冷却到室温并让它静置16小时。将混合物分配在水和乙酸异丙酯之间并用水然后用饱和的氯化钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干。通过反相HPLC纯化产物，得到标题中间体，为其三氟乙酸盐(1.5g，2.0mmol)。
d.8-苄基氧基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(1.5g，2.0mmol)溶解在四氢呋喃(15mL)中并用三氢氟化三乙胺(660μL，4.0mmol)在室温下处理3天。将混合物分配在1M氢氧化钠和乙酸乙酯之间。用饱和的氯化钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干，得到标题中间体(1.4g，2.7mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
e.8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成将前一步骤的产物(1.4g，2.7mmol)和炭上氢氧化钯(20％Pd，含湿量～60％，300mg)悬浮在四氢呋喃(30mL)中并在室温和氢气气氛下搅拌两小时。过滤除去钯并在减压下蒸发混合物。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题化合物，为其三氟乙酸盐。C25H32N2O4计算的m/z[M+H+]425.25；实测值425.3。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)10.4(s，1H)，10.4(s，1H)，8.4(brs，2H)，8.0(d，1H，J＝10.2Hz)，7.0-7.2(m，6H)，6.9(d，1H，J＝8.0Hz)，6.5(d，1H，J＝9.9Hz)，6.1(d，1H，J＝3.7Hz)，5.2(m，H)，3.4(t，2H，J＝7.0Hz)，3.2(t，2H，J＝6.6Hz)，2.7-3.0(m，4H)，2.7(t，2H，J＝6.9Hz)，1.3-1.5(m，4H)，1.1-1.2(m，4H)。
实施例4生物学测定结果在上面描述的生物学测定中测试了本发明的典型化合物，实施例1和2的化合物，8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮和比较实施例的化合物，8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮。现将测定的结果总结在下表中。
表1.体外测定结果
表2.体内测定结果
*实施例1中制备的化合物在上述体外结合亲和性测定和功能测定中测试的本发明的化合物对β2肾上腺素能受体具有活性，比较化合物也具有活性。令人意外的是，本发明的化合物证实了在给药后72小时在豚鼠模型中的支气管保护作用，而比较化合物在给药后72小时在体内无活性。另外，本发明的化合物在试验B的功能测定中显示出对β2肾上腺素能受体的优异选择性(与β1和β3受体亚型比较)。所述测定结果显示，本发明提供了强效的和选择性的β2肾上腺素能受体激动剂，其具有异常长的作用持续时间。
尽管已参照本发明的具体实施方案描述了本发明，但是本领域的技术人员应当理解，在不背离本发明的真实精神和范围下，可以进行各种变化并且可以同等方案取代。此外，可以进行很多修饰使特定的情形、材料、物质的组成、方法、方法步骤，适应本发明的目的、精神和范围。所有这类修饰被计划在此附加的权利要求的范围之内。另外，在上文引用的所有的出版物、专利和专利文献在此以全文引入作为参考，好像个别地引入作为参考一样。
权利要求
1.式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体 其中R1、R2、R3、R4中的每一个独立地选自氢、羟基、氨基、卤素、-CH2OH和-NHCHO，或R1和R2连在一起选自-NHC(＝O)CH＝CH-、-CH＝CHC(＝O)NH-、-NHC(＝O)S-和-SC(＝O)NH-；R5选自氢、-ORa和-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是氢或C1-3烷基；n为0到7的整数；m为0到5的整数；并且R6、R7、R8、R9和R10中的每一个独立地是氢或C1-6烷基；条件是当m是0时，R5是氢。
2.权利要求1的化合物，其中R9和R10各是氢。
3.权利要求1或权利要求2的化合物，其中R5和R6各是氢。
4.权利要求1的化合物，它是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体 其中R1是-CH2OH或-NHCHO，并且R2是氢；或R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-；n是2到6的整数；m是0到3的整数。
5.权利要求4的化合物，其中n是4。
6.权利要求4或权利要求5的化合物，其中m是1。
7.权利要求4到6任一项的化合物，其中R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-。
8.权利要求4到7任一项的化合物，其中带有羟基的亚烷基碳上的立体化学是(R)。
9.权利要求1的化合物，其化学名称为8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮；或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
10.一种药物组合物，它包含治疗有效量的权利要求1到9任一项的化合物和药学上可接受的载体。
11.权利要求10的药物组合物，其中该组合物还包含治疗有效量的一种或多种其它治疗剂。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述其它治疗剂是皮质类固醇、抗胆碱能药或PDE4抑制剂。
13.权利要求10到12任一项的药物组合物，其中该组合物被配制用于通过吸入给药。
14.一种组合，它包含权利要求1到9任一项的化合物和一种或多种其它治疗剂。
15.一种组合，它包含权利要求1到9任一项的化合物和选自丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲基酯和6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯的化合物。
16.权利要求1到9任一项所述的化合物，其用于治疗中。
17.权利要求1到9任一项的化合物，或者权利要求14或权利要求15的组合在制备药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述药物用于治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物。
19.权利要求18的用途，其中所述疾病或病况是肺的疾病或病况。
20.权利要求19的用途，其中所述肺的疾病或病况是哮喘或慢性阻塞性肺病。
21.权利要求18的用途，其中所述药物适合于通过吸入给药。
22.权利要求1到9任一项的化合物在制备与一种或多种治疗剂联合给药用于治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的药物中的用途。
23.制备根据权利要求1到9任一项的式(I)化合物的方法，该方法包括(a)使式(III)的化合物 其中P1是羟基保护基，L是离去基团，R1a、R2a、R3a和R4a中的每一个独立地与权利要求1到9任一项中定义的R1、R2、R3和R4相同或为-OP2，其中P2是羟基保护基；与式(IV)的化合物反应 其中R11是氢或P3，其中P3是氨基保护基，提供式(V)的化合物 (b)除去保护基P1，提供式(VI)的化合物 并且(c)当R1a、R2a、R3a或R4a中的任一个是-OP2时，或当R11是P3时，除去保护基P2和P3，如果存在的话，提供式(I)的化合物，或其盐或立体异构体。
24.通过权利要求23的方法制备的产物。
25.一种治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1到9任一项的化合物。
26.权利要求25的方法，它还包括给予治疗有效量的一种或多种其它治疗剂。
27.权利要求26的方法，其中所述其它治疗剂是皮质类固醇、抗胆碱能药或PDE4抑制剂。
28.权利要求25到27任一项的方法，其中该方法包括通过吸入给予化合物。
29.一种研究包含β2肾上腺素能受体的生物系统或样品的方法，该方法包括(a)使所述生物系统或样品与权利要求1到9任一项的化合物接触；并且(b)测定由所述化合物引起的对所述生物系统或样品的作用。
全文摘要
本发明提供了新的β
文档编号A61K31/16GK1984876SQ200580024061
公开日2007年6月20日 申请日期2005年6月2日 优先权日2004年6月3日
发明者M·S·林塞尔 申请人:施万制药
技术领域：
本发明涉及新的β2肾上腺素能受体激动剂。本发明还涉及包含这类化合物的药物组合物、用这类化合物治疗与β2肾上腺素能受体活性相关的疾病的方法以及适用于制备这类化合物的方法和中间体。
背景技术：
β2肾上腺素能受体激动剂被认为是治疗肺的疾病如哮喘和慢性阻塞性肺病(包括慢性支气管炎和肺气肿)的有效药物。β2肾上腺素能受体激动剂还可用于治疗早产，而且潜在地适用于治疗神经障碍和心脏障碍。尽管使用某些β2肾上腺素能受体激动剂已取得了成功，但目前药剂的作用持续时间、效能、选择性和/或开始仍不够理想。因此，需要另外的具有改进的性能(如改进的作用持续时间、效能、选择性和/或开始)的β2肾上腺素能受体激动剂。
发明概述本发明提供了新的具有β2肾上腺素能受体激动剂活性的化合物。除了其它的性质以外，本发明的化合物是强效的和选择性的β2肾上腺素能受体激动剂。此外，已证明本发明的示范性化合物具有令人惊讶的和出乎意料长的作用持续时间，其允许每日一次，或者甚至更不频繁的给药。
因此，本发明提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体
其中R1、R2、R3和R4中的每一个独立选自氢、羟基、氨基、卤素、-CH2OH和-NHCHO，或者R1和R2连在一起选自-NHC(＝O)CH＝CH-、-CH＝CHC(＝O)NH-、-NHC(＝O)S-和-SC(＝O)NH-；R5选自氢、-ORa和-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是氢或者C1-3烷基；n是0到7的整数；m是0到5的整数；并且R6、R7、R8、R9和R10中的每一个独立地是氢或C1-6烷基；条件是当m是0时，R5是氢。
本发明还提供了含有本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明进一步提供了含有本发明的化合物和一种或多种其它治疗剂的组合以及含有本发明的化合物、一种或多种其它治疗剂和药学上可接受的的载体的药物组合物。
本发明还提供了治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况(condition)(例如，肺的疾病如哮喘或慢性阻塞性肺病、早产、神经障碍、心脏障碍或炎症)的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予治疗有效量的本发明的化合物。特别地，本发明提供了治疗哺乳动物的哮喘或慢性阻塞性肺病的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予治疗有效量的本发明的化合物。
本发明进一步提供了治疗的方法，该方法包括给予治疗有效量的本发明的化合物和一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明还提供了治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予治疗有效量的本发明的药物组合物。
本发明的化合物还可以被用作研究工具，即，用于研究生物系统或样品，或用于研究其它化学化合物的活性。因此，在本发明方法方面的另一方面，本发明提供了使用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体，作为研究生物系统或样品或用于发现新的β2肾上腺素能受体激动剂的研究工具的方法。
在分开的和不同的方面，本发明还提供了本文所述的合成方法和中间体，其适用于制备本发明的化合物。
本发明还提供了用于医学治疗中的如本文所述的本发明的化合物，以及本发明的化合物在制备用于治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况(例如，肺的疾病如哮喘或慢性阻塞性肺病、早产、神经障碍、心脏障碍或炎症)的哺乳动物的制剂或药物中的用途。
发明详述本发明提供了新的式(I)的二胺类β2肾上腺素能受体激动剂，或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。下面的取代基和值打算提供本发明不同方面的典型实例。这些典型的值打算进一步定义这样的方面，而不打算排除其它的值或限制本发明的范围。
在本发明的一个特定方面，R1是卤素、-CH2OH或-NHCHO。
在其它的特定方面，R1是氯、-CH2OH或-NHCHO；或R1是-CH2OH或-NHCHO。
在一个特定方面，R2是氢。
在一个特定方面，R3是羟基或氨基；在另一个特定方面，R3是羟基。
在一个特定方面，R4是氢或卤素；或R4是氢或氯。
在一个特定方面，R1是-NHCHO，R3是羟基，并且R2和R4分别是氢。
在另一个特定方面，R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-，R3是羟基，并且R4是氢。
在另一个特定方面，R1是-CH2OH，R3是羟基，并且R2和R4分别是氢。
在还一个特定方面，R1和R4是氯，R3是氨基，并且R2是氢。
在又一个特定方面，R1和R2连在一起是-NHC(＝O)S-或-SC(＝O)NH-，R3是羟基，并且R4是氢。
在一个特定方面，R5是氢或-ORa。在这方面内典型的R5值包括，但不限于氢、羟基、甲氧基和乙氧基。
在另一个特定方面，R5是氢或-NRaRb。在这方面内典型的R5值包括，但不限于氢、氨基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基和二乙氨基。
在另一个特定方面，R5是氢。
在一个特定方面，R7是氢。
在另一个特定方面，R7是甲基。
在一个特定方面，R8是氢。
在另一个特定方面，R8是甲基。
在一个特定方面，R9是氢。
在另一个特定方面，R9是甲基。
在一个特定方面，R10是氢。
在另一个特定方面，R10是氢。
在一个特定方面，n是2、3、4、5或6。
在另一个特定方面，n是4。
在一个特定方面，m是0、1、2或3。
在另一个特定方面，m是1。
在一个方面，本发明提供了式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体
其中R1是-CH2OH或-NHCHO，并且R2是氢；或R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-；n是2到6的整数；m是0到3的整数。
可以特别提及以下的化合物8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮； 其中，化学命名法符合自动命名程序AutoNom，其由MDLInformation Systems，GmbH(Frankfurt，德国)提供。
如上所举例说明的，本发明的化合物包含一个或多个手性中心。因此，除非另外指出，本发明包括外消旋混合物、纯的立体异构体(即，单个的对映异构体或非对映异构体)，以及这类异构体的立体异构体-富集的混合物。当显示特定的立体异构体时，本领域的技术人员将会理解，除非另外指出，少量的其它立体异构体可以存在于本发明的组合物中，条件是这类其它异构体的存在不消除该组合物作为整体的效用。
特别的是，本发明的化合物含有手性中心，该手性中心在式(I)和(II)中与羟基连接的亚烷基碳上。当使用立体异构体的混合物时，在带有羟基的手性中心为(R)定向的立体异构体的量大于对应的(S)立体异构体的量是有利的。当比较相同化合物的立体异构体时，(R)立体异构体相对于(S)立体异构体来说是优选的。
定义当描述本发明的化合物、组合物和方法时，除非另外指出，下面的术语具有下面的含义。
术语“烷基”意思是指一价饱和的烃基，其可以是直链或支链的或其组合。除非另有定义，这样的烷基典型地包含1-10个碳原予。作为实例，典型的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
术语“卤素”意思是指氟、氯、溴或碘。
在此所用的术语“治疗”意思是指患者如哺乳动物(尤其是人)的疾病或医学病况的治疗，其包括(a)防止疾病或医学病况的发生，即，患者的预防性治疗；(b)改善疾病或医学病况，即，消除患者的疾病或医学病况或引起患者的疾病或医学病况的消退；(c)抑制疾病或医学病况，即，减缓或阻止患者的疾病或医学病况的发展；或(d)减轻患者的疾病或医学病况的症状。
术语“治疗有效量”意思是指当向需要治疗的患者给药时，足以实现治疗的量。
术语“与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况”包括目前所知的或在将来发现的与β2肾上腺素能受体活性有关的所有疾病状态和/或病况。这样的疾病状态包括，但不限于，肺的疾病如哮喘和慢性阻塞性肺病(包括慢性支气管炎和肺气肿)，以及神经障碍和心脏障碍。还已知β2肾上腺素能受体活性与早产(参见美国专利号5,872,126)和某些类型的炎症(参见国际专利申请公开号WO99/30703和美国专利号5,290,815)有关。
术语“药学上可接受的盐”是指由对于向患者如哺乳动物给药来说可接受的碱或酸制备的盐。这样的盐可以来源于药学上可接受的无机或有机碱以及来源于药学上可接受的无机或有机酸。
衍生自药学上可接受的酸的盐包括，但不限于乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、延胡索酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、半乳糖二酸、硝酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、昔萘酸(1-羟基-2-萘甲酸)盐等。特别感兴趣的是衍生自延胡索酸、氢溴酸、盐酸、乙酸、硫酸、甲磺酸、昔萘酸和酒石酸盐。
衍生自药学上可接受的无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、三价铁、二价铁、锂、镁、三价锰、二价锰、钾、钠、锌等盐。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括取代的胺、环胺、天然存在的胺等等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、胆碱、N，N′-二苄基亚乙基二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉，哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等的盐。
术语“溶剂合物”意思是指由一个或多个溶质分子，即，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，和一个或多个溶剂的分子形成的络合物或聚集体。这样的溶剂合物通常是具有基本上固定的溶质和溶剂摩尔比的结晶固体。作为实例，典型的溶剂包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸等等。当溶剂是水时，形成的溶剂合物是水合物。
将要理解，术语“或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体”打算包括盐、溶剂合物和立体异构体的所有排列，如式(I)的化合物的立体异构体的药学上可接受的盐的溶剂合物。
术语“离去基团”意思是指在取代反应如亲核取代反应中可以被另外的官能团或原子置换的官能团或原子。作为实例，典型的离去基团包括Cl、Br、I基团；磺酸酯基团如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、对硝基苯磺酸酯等等；和酰氧基如乙酰氧基、三氟乙酸基等等。
术语“氨基保护基”意思是指适于防止在氨基氮上的不希望的反应的保护基团。典型的氨基保护基团包括，但不限于甲酰基；酰基，例如烷酰基如乙酰基；烷氧羰基如叔丁氧羰基(Boc)；芳基甲氧羰基如苄氧羰基(Cbz)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)、和1，1-二-(4′-甲氧基苯基)甲基；甲硅烷基如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBS)；等等。
术语“羟基保护基”意思是指适于防止在羟基上的不希望的反应的保护基团。典型的羟基保护基团包括，但不限于烷基如甲基、乙基和叔丁基；酰基，例如烷酰基如乙酰基；芳基甲基如苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)和二苯基甲基(二苯甲基、DPM)；甲硅烷基如三甲基硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基硅烷基(TBS)；等等。
一般合成程序使用下面的一般方法和程序，由容易得到的原料可以制备本发明的化合物。尽管在以下的方案中举例说明了本发明的特定方面，但是本领域的技术人员将认识到，采用在此描述的方法或通过使用本领域技术人员已知的其它方法、试剂和原料，可以制备本发明的所有方面。还将理解，当给出典型或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，除非另外说明，也可以使用其他工艺条件。最佳的反应条件可以随使用的特定反应物或溶剂而变化，但是本领域的技术人员通过常规优化程序可以确定这样的反应条件。
此外，如对本领技术人员来说将是显而易见的，为了防止某些官能团经受不希望的反应，常规的保护基可能是必需的。用于特定官能团的适合保护基的选择以及保护和脱保护的适宜条件，是本领域中所熟知的。例如，在T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups inOrganic Snthesis，第三版，Wiley，纽约1999，以及其中引用的参考文献中描述了许多保护基及其引入和脱去。
在一个合成的方法中，按照方案A中所说明的制备式(I)和(II)的化合物。(除非另外指出，下述的方案中所示的取代基和变量具有如上所提供的定义)。
方案A 其中P1表示羟基保护基，P2表示羟基保护基，并且L表示离去基团，例如溴。变量R11可以是氢，或R11可以是P3，其中P3表示氨基保护基。
如方案A中所示，使式1的化合物首先和二胺2反应得到式3的中间体。通常，这个反应在极性、非质子传递溶剂中进行，任选在碱存在下和加热。保护基P1通常是甲硅烷基保护基，通常使用氟化物试剂，例如三氢氟化三乙胺，或酸，将它从式3的中间体上脱去，提供式4的中间体。保护基P2通常是苄基保护基，通常使用路易斯酸或通过使用炭上钯催化剂的氢化，将它从式4的中间体上脱去。当R11是氨基保护基P3时，可以选择该保护基，使得可以在与用于羟基保护基P1的那些相同的脱保护条件下将它脱去。例如，当P1是苄基时，苄氧基羰基(Cbz)可被用作P3并且用路易斯酸，例如三氯化硼，或通过氢化处理中间体4，可提供所述产物。
通过本领域中已知的程序，以及例如在美国专利第6,653,323B2和6,670,376B1号(通过参考将它们并入本文)及其中的参考文献中描述的程序，轻易地制备在本申请中描述的反应中使用的式1化合物。
可以由可轻易获得的原料制备式2的中间体。例如，在方案B中举例说明了用于制备中间体2′(其中R11表示氨基保护基P3的中间体)的程序。
方案B
在方案B中，P4表示氨基保护基，例如，叔丁氧基羰基(Boc)基团。
通常在还原剂，例如氰基硼氢化钠的存在下，将保护的二胺5与醛6偶合，提供式7的中间体。将保护基P3加到中间体7的内部氮原子上形成中间体8。选择保护基P3，使得可以在P3的存在下选择性地脱去保护基P4。例如，当Cbz被用作P3时，通常在碱，例如氢氧化钠存在下用苄基氯甲酸酯处理中间体7，形成中间体8，例如，在酸性条件下从中间体8上脱去保护基P4，形成中间体2′。
在方案C中举例说明了制备中间体2″(其中R11表示氢的中间体)的程序。
方案C 根据方案C，将保护的氨基取代的羧酸9与胺10偶合，提供酰胺中间体11。该反应通常在偶合剂，例如，1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(EDC)的存在下进行，并且可以使用催化剂，例如，1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)。在适当的条件下将中间体11脱保护，提供式12的中间体，例如，使用硼烷还原剂或氢化锂铝将式12的中间体还原，形成中间体2″。
在下面的实施例中描述了关于用于制备本发明的典型化合物或其中间体的具体反应条件和其它程序的进一步细节。
因此，在方法方面，本发明提供了制备式(I)的化合物，或其盐或立体异构体或保护的衍生物的方法，该方法包括如下步骤使式(III)的化合物 其中P1是羟基-保护基，L是离去基团，R6为式(I)中所定义，R1a、R2a、R3a和R4a中的每一个被定义为与式(I)中的R1、R2、R3和R4相同，或R1a、R2a、R3a和R4a中的每一个独立地是-OP2，其中P2是羟基-保护基，与式(IV)的化合物反应 其中R5、R7、R8、R9、R10、n和m如式(I)中所定义并且R11是氢或P3，其中P3是氨基-保护基，提供式(V)的化合物
除去保护基P1提供式(VI)的化合物 (VI)；并且当R1a、R2a、R3a或R4a中的任一个是-OP2时或当R11是P3时，除去保护基P2和P3，如果存在，提供式(I)的化合物，或其盐或立体异构体。
药物组合物本发明还提供了包含本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。因此，该化合物，优选以药学上可接受的盐的形式，可以配制成任何适合的给药形式，如口服或胃肠外给药，或吸入给药。
作为说明，化合物可以与常规药物载体和赋形剂混合，并以散剂、片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂和糯米纸囊剂等形式使用。这样的药物组合物将包含约0.05-约90％重量的活性化合物，更通常的是约0.1-约30％。药物组合物可以包含常规的载体和赋形剂，如玉米淀粉或明胶、乳糖、硫酸镁、硬脂酸镁、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和藻酸。常用于本发明制剂中的崩解剂包括交联羧甲基纤维素、微晶纤维素、玉米淀粉、羟乙酸淀粉钠和藻酸。
液体组合物一般由在适合液体载体中的化合物或其药学上可接受的盐的混悬剂或溶液组成，所述液体载体例如乙醇、甘油、山梨糖醇、非水溶剂如聚乙二醇、油类或水，任选含悬浮剂、增溶剂(如环糊精)、防腐剂、表面活性剂、湿润剂、矫味剂或着色剂。选择性地，液体制剂可以由可重构的粉末制得。
例如，含活性化合物、悬浮剂、蔗糖和增甜剂的粉末可以用水重构形成混悬液；糖浆剂可以由含活性成分、蔗糖和增甜剂的粉末制得。
片剂形式的组合物可以采用任何合适的常规用于制备固体组合物的药物载体进行制备。所述载体的实例包括硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖、微晶纤维素和粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮。片剂还可以提供有彩色薄膜包衣，或作为载体的一部分的内含颜色。此外，活性化合物可以配制成受控释放的剂型如含亲水或疏水基质的片剂。
胶囊剂形式的组合物，可以采用常规的胶囊化程序制得，例如将活性化合物和赋形剂掺入硬明胶胶囊中。或者地，可以制备活性化合物和高分子量聚乙二醇的半固体基质，并将其装填入硬明胶胶囊中；或可以制备活性化合物的聚乙二醇的溶液或可食用油，例如液体石蜡或分级分离的椰子油的混悬液，并将其装入软明胶胶囊中。
可以包括的片剂粘合剂是阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其它硬脂酸金属盐、硬脂酸、硅油(silicone fluid)、滑石、蜡、油和胶态二氧化硅。
也可以使用娇味剂如薄荷、冬青油，樱桃娇味剂等。另外，可能需要加入着色剂使剂型在外观上更吸引人或有助于产品的鉴别。
当胃肠外给予时是有效的本发明的化合物及其药学上可接受的盐，可以配制成肌肉内、鞘内或静脉内给药。
用于肌内或鞘内给药的典型的组合物将由活性成分在油，例如花生油或芝麻油中的混悬液或溶液组成。用于静脉内或鞘内给药的典型的组合物将由无菌等渗的水溶液组成，其含有例如活性成分和葡萄糖或氯化钠或葡萄糖和氯化钠的混合物。其它实例是乳酸林格注射液，加葡萄糖的乳酸格林注射液、含葡萄糖的Normosol-M、Isolyte E、酰化格林注射液等等。任选地，共溶剂例如聚乙二醇；螯合剂例如乙二胺四乙酸；增溶剂例如环糊精；和抗氧化剂例如焦亚硫酸钠，可以包括在制剂中。或者，溶液可以冷冻干燥，随后在给药前用适合的溶剂重构。
局部给药有效的本发明的化合物及其药学上可接受的盐可以配制为透皮组合物或透皮传送系统(“贴剂”)。这样的组合物包括，例如背衬、活性化合物储库、控制膜、衬垫和触压粘合剂。所述透皮贴剂可用于提供以受控的量连续或不连续的输注本发明的化合物。用于药用物质传送的透皮贴剂的构建和用途是本领域中熟知的。例如，参见美国专利号5,023,252。这类贴剂可以构建成用于连续的、脉冲式或视需要递送药用物质。
给予本发明的化合物的一个优选的方式是吸入。吸入是有效的直接传送药剂至呼吸道的方式。有三种一般类型的药物吸入装置雾化器吸入器、干粉吸入器(DPI)和定量吸入器(MDI)。常规雾化器装置产生高速的气流，其引起治疗剂像雾一样喷雾，其被带进患者的呼吸道。治疗剂配制成液体形式如可呼吸大小的微粉化颗粒的溶液或混悬液，其中微粉化通常定义为具有约90％或更多的直径小于约10μm的颗粒。
常规雾化器装置中使用的典型的制剂是活性剂药用盐的等渗水溶液，活性剂的浓度介于约0.05μg/mL至约1mg/mL之间。适合的雾化器装置能从商业上购得，例如，PARI GmbH(Starnberg，德国)。其它雾化器装置已经公开于例如美国专利号6,123,068中。
DPI通常以自由流动的粉末的形式给予治疗剂，在吸入的时候该粉末可以分散于患者的气流中。使用外部的能量源来分散粉末的可替代性的DPI装置也被开发。为了得到自由流动的粉末，治疗剂可以用适合的赋形剂(例如，乳糖或淀粉)来配制。例如，干粉制剂可以通过将干的乳糖颗粒与本发明的化合物(即，活性剂)适合形式，通常是药学上可接受的盐的微粉化的颗粒混合，再干掺合来制得。选择性地，药剂可以不用赋形剂进行配制。制剂装入干粉分配器中，或装入用于干粉传送装置的吸入药筒或胶囊中。
可商购的DPI传送装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)(参见，例如美国专利号5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利号6,378,519)；Turbuhaler(AstraZeneca，Wilmington，DE)(参见，例如美国专利号4,524,769)；和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利号4,353,365)。适合的DPI装置的进一步实例描述于美国专利号5,415,162、5,239,993和5,715,810，以及其中的参考文献。
MDI通常用压缩的推进剂气体排放出计量量的治疗剂。用于MDI给药的制剂包括在液化的推进剂中的活性成分的溶液或混悬液。尽管含氯氟烃如CCl3F，已被常规用作推进剂，但由于对于这类物质对臭氧层的不利影响的担心，开发了采用氢氟烷烃(HFA)如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134a)和1，1，1，2，3，3，3，-七氟-正丙烷(HFA 227)的制剂。用于MDI给药的HFA制剂的另外的组分包括共溶剂如乙醇或戊烷，和表面活性剂如脱水山梨醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油(参见，例如美国专利号5,225,183、EP0717987A2和WO92/22286)。
因此，用于MDI给药的适合的制剂可以包括约0.001％-约2％重量的本发明化合物，约0％-约20％重量的乙醇和约0％-约5％重量的表面活性剂，剩余物是HFA推进剂。在一个制备制剂的方法中，将冷冻或加压的氢氟烷烃加入含本晶型、乙醇(假如存在)和表面活性剂(假如存在)的管瓶中。为了制备混悬液，以微粉化颗粒形式提供所述化合物(通常为盐形式)。将制剂装入气雾剂罐中，所述罐形成了MDI装置的一部分。美国专利号6,006,745和6,143,227提供了专门为与HFA推进剂一起使用而开发的MDI装置的实例。
在可替代的制剂中，通过在活性化合物的药用盐的微粉化颗粒上喷雾干燥表面活性剂的包衣，制得混悬剂制剂(参见，例如WO99/53901和WO00/61108)。关于制备可呼吸的颗粒的方法的另外的实施例与适于吸入给药的制剂和装置参见美国专利号6,268,533、5,983,956、5,874,063和6,221,398，WO99/55319和WO00/30614。
应该理解的是，适于特定给药方式的本发明化合物的任何形式(即，游离碱、药用盐或溶剂合物)，可以用于上面讨论的药物组合物中。
预期活性化合物在广泛的剂量范围内是有效的，并以治疗有效量给药。然而，应当理解，实际给药的化合物的量是由医生按照有关的情况(包括将要治疗的病况、选择的给药途径、给予的实际化合物及其相对活性、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重性等)来决定的。
化合物可以周期性的剂量给药每周一次、每周多次、每日一次或每日多次剂量。治疗方案可能要求在很长的时间阶段给药(例如几周或数月)，或治疗方案可能要求长期给药。
吸入给药的治疗剂的合适剂量是约0.05μg/天-约1000μg/天的一般范围，包括约0.1μg/天-约500μg/天。应当理解的是，在确定吸入给药的合适剂量时，要考虑有特定的传送装置特色的传送到肺的活性剂的部分。口服给药的合适剂量是约0.05μg/天-约100mg/天的一般范围，优选是约0.5μg/天-约1000μg/天。
除了其它性质以外，本发明的化合物表现出令人惊讶和出人意料的作用持续时间。如在以下生物测定法中描述的，本发明的化合物在支气管保护的动物模型中证明作用持续时间大于24小时。本发明的化合物是强效的和选择性的β2肾上腺素能受体激动剂。特别地，与β1和β3肾上腺素能受体比较，本发明的化合物对β2肾上腺素能受体有选择性。
因此本发明提供了一种治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物给于治疗有效量的本发明的化合物或含本发明化合物的药物组合物。
本活性剂还可以用作另外含一种或多种其它治疗剂的组合的一部分。例如，本活性剂可以与一种或多种治疗剂联合给药，所述治疗剂选自抗炎药(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药(NSAIDs)、抗胆碱能药(特别是毒蕈碱性受体拮抗剂)、其它β2肾上腺素能受体激动剂、抗感染药(例如，抗生素或抗病毒药)或抗组胺剂。因此，在进一步方面，本发明提供包含本发明的化合物和一种或多种治疗剂(例如，抗炎药、抗胆碱能药、另外的β2肾上腺素能受体激动剂、抗感染药或抗组胺剂)的组合。
其它的治疗剂可以药学上可接受的盐或溶剂合物的形式使用。合适时，其它治疗剂可以光学纯的立体异构体形式使用。
适合的抗炎药包括皮质类固醇和NSAIDs。可以与本发明的化合物联合使用的合适的皮质类固醇为那些口服和吸入的皮质类固醇及其具有抗炎活性的前药。实例包括甲基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯、倍氯米松酯(例如，17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德、氟尼缩松、莫米松酯(例如，糠酸酯)、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德、丙酸布替可特、RPR-106541和ST-126。优选的皮质类固醇包括丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯和6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯，更优选6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯。
合适的NSAIDs包括色甘酸钠、奈多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱、PDE4抑制剂或者混合的PDE3/PDE4抑制剂)、白三烯拮抗剂(例如，孟鲁司特)、白三烯合成抑制剂、iNOS抑制剂、蛋白酶抑制剂如类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂(例如腺苷2a激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂，如白介素抗体(αIL抗体)、特别地αIL-4疗法、αIL-13疗法或其组合)；或者细胞因子合成抑制剂。合适的其它的β2-肾上腺素受体激动剂包括沙美特罗(例如昔萘酸盐形式)、沙丁胺醇(例如硫酸盐或者游离碱形式)、福美特罗(例如富马酸盐形式)、非诺特罗或者特布他林及其盐。
还感兴趣的是本活性剂与磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂组合的用途。典型的磷酸二酯酶-4(PDE4)抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂包括，但是不限于，顺式4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-甲酸、2-甲氧甲酰-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-酮、顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-醇]、顺式-4-氰基-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-1-甲酸等，或其药学上可接受的盐。其它典型的PDE4或混合的PDE4/PDE3抑制剂包括AWD-12-281(elbion)、NCS-613(INSERM)、D-4418(Chiroscience和Schering-Plough)、CI-1018或PD-168787(Pfizer)、WO99/16766中公开的苯并间二氧杂环戊二烯化合物(Kyowa Hakko)、K-34(Kyowa Hakko)、V-11294A(Napp)、罗氟司特(Byk-Gulden)、WO99/47505中公开的pthalazinone化合物(Byk-Gulden)、Pumafentrine(Byk-Gulden，目前为Altana)、阿罗茶碱(Almirall-Prodesfarma)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe Seiyaku)和T2585(TanabeSeiyaku)。
合适的抗胆碱能药是充当毒蕈碱受体拮抗剂的那些化合物，特别是为M1、M2或M3受体或其组合的拮抗剂的那些化合物。示范性化合物包括颠茄植物的生物碱类，例如阿托品、东莨菪碱、后马托品、莨菪碱；这些化合物通常是作为叔胺的盐而给药的。这些药物、特别是盐形式可容易从大量商业来源获得或者可以利用文献资料制备或制得，也就是阿托品-CAS-51-55-8或者CAS-51-48-1(无水形式)，硫酸阿托品-CAS-5908-99-6；氧阿托品-CAS-4438-22-6或者其HCl盐-CAS-4574-60-1和甲硝阿托品-CAS-52-88-0。
后马托品-CAS-87-00-3，氢溴酸盐-CAS-51-56-9，甲基溴化物盐-CAS-80-49-9。
莨菪碱(d，l)-CAS-101-31-5，氢溴酸盐-CAS-306-03-6和硫酸盐-CAS-6835-16-1。
东莨菪碱-CAS-51-34-3，氢溴酸盐-CAS-6533-68-2，甲基溴化物盐-CAS-155-41-9。
优选的抗胆碱能药包括以爱全乐(Atrovent)的名称销售的异丙托铵(例如溴化物形式)，氧托铵(例如溴化物形式)和噻托铵(例如溴化物形式)(CAS-139404-48-1)。感兴趣的还有甲胺太林(CAS-53-46-3)、溴化丙胺太林(CAS-50-34-9)、甲溴辛托品或Valpin50(CAS-80-50-2)、克利溴铵(Quarzan，CAS-3485-62-9)、copyrrolate(Robinul)、异丙碘铵(CAS-71-81-8)、溴美喷酯(美国专利2,918,408)、曲地氯胺(Pathilone，CAS-4310-35-4)和甲硫己环铵(Tral，CAS-115-63-9)。还参见盐酸环喷托酯(CAS-5870-29-1)、托品酰胺(CAS-1508-75-4)、盐酸苯海索(CAS-144-11-6)、哌仑西平(CAS-29868-97-1)、替仑西平(CAS-80880-90-9)、AF-DX116或者美索曲明和在WO01/04118中公开的化合物，其公开通过引用结合到本文中。
合适的抗组胺药(也称作H1-受体拮抗剂)包括大量已知抑制H1-受体并且对于人类使用是安全的拮抗剂的任何一种或者多种。它们都是组胺与H1-受体相互作用的可逆的、竞争性抑制剂。大多数为第一代拮抗剂的这些抑制剂的大部分，基于它们的核心结构被表征为乙醇胺类、乙二胺类和烷基胺类。另外，其它的第一代抗组胺药包括可以基于它们的结构被表征为哌嗪和吩噻嗪类的那些。第二代拮抗剂，其为非-镇静的，具有类似的结构-活性关系，因为它们保留了核心亚乙基(烷基胺类)或者模拟具有哌嗪或者哌啶的叔胺基团。举例说明的拮抗剂如下乙醇胺类马来酸卡比沙明、富马酸氯马斯汀、盐酸苯海拉明和茶苯海明。
乙二胺类马来酸吡拉明、曲吡那敏HCl和枸橼酸曲吡那敏。
烷基胺类氯吡那敏及其盐例如马来酸盐和阿伐斯汀。
哌嗪类羟嗪HCl、双羟萘酸羟嗪、赛克利嗪HCl、乳酸赛克利嗪、美克洛嗪HCl和西替利嗪HCl。
哌啶类阿司咪唑、左卡巴司汀HCl、氯雷他定或其脱乙酯基类似物，和特非那定和盐酸非索非那定或者另一种药学上可接受的盐。
盐酸氮卓斯汀也是一种H1受体拮抗剂，它可以与本发明的化合物联合使用。
优选的抗组胺药的实例包括美沙吡林和氯雷他定。
因此，本发明在进一步方面提供一种含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与皮质类固醇的组合。特别地，本发明提供一种组合，其中皮质类固醇是丙酸氟替卡松或其中皮质类固醇是6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲酯或6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与PDE4抑制剂的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与抗胆碱能药的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体和抗组胺剂的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体连同PDE4抑制剂和皮质类固醇的组合。
因此，本发明在进一步方面提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体连同抗胆碱能药和皮质类固醇的组合。
如以上组合中所用的，术语“式(I)的化合物”包括式(II)的化合物及其优选的组，和任何单独公开的一种或多种化合物。
因此，本发明还提供了药物组合物，它包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与一种或多种如以上所述的其它治疗剂。
这类组合的单个化合物可以以分开或者组合的药物制剂顺序或者同时给药。已知治疗剂的合适剂量容易被本领域技术人员意识到。因此，本发明的治疗方法包括这类组合的单个化合物以分开或者组合的药物制剂顺序或者同时给药。
因此，根据进一步方面，本发明提供治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括向该哺乳动物给予治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体与治疗可接受量的一种或多种其它治疗剂。
由于本发明的化合物是β2肾上腺素能受体激动剂，这类化合物还可以用作调查或研究含有β2肾上腺素能受体的生物系统或样品的研究工具，或用来发现新的β2肾上腺素能受体激动剂。而且，因为与在其它β肾上腺素能亚型上的结合和功能活性比较，本发明的化合物表现出对β2肾上腺素能受体的选择性，所以这类化合物还可用于研究生物系统或样品中β2肾上腺素能受体的选择性激动的作用。任何含β2肾上腺素能受体的合适的生物系统或样品可用于这类研究中，该研究可以在体外或体内进行。
适合于这类研究的典型的生物系统和样品包括，但不限于细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、哺乳动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪等)等等。采用常规的操作和装置，如放射配基结合试验和功能测定，例如如下所述的配基-介导的细胞内环腺苷酸(cAMP)变化的测定或相似性质的测定，来测定激动β2肾上腺素能受体的效应。本发明化合物的β2肾上腺素能受体激动量通常是在约1毫微摩尔至约1000毫微摩尔的范围。当本发明的化合物用作发现新的β2肾上腺素能受体激动剂的研究工具时，作为分开的实施方式本发明还包括，对比数据(使用合适的测定)的产生和鉴定目标试验化合物的试验数据的分析。
下面的非限制性实施例说明了本发明的典型药物组合物。用于本发明活性化合物的制剂的另外适合的载体也可以在RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，第二十版，Lippincott Williams &Wilkins，Philadelphia，PA，2000中找到。
制剂实施例A这个实施例说明了用于本发明化合物口服给药的典型药物组合物的制备。
成分每片的量，(mg)
活性成分1乳糖，喷雾干燥的148硬脂酸镁2
将上述成分混合，并引入硬壳明胶胶囊内。
制剂实施例B这个实施例说明了用于本发明化合物口服给药的另一个典型药物组合物的制备。
成分每片的量，(mg)
活性成分1玉米淀粉50乳糖145硬脂酸镁5
将以上成分密切混合并压成单刻痕的片剂。
制剂实施例C这个实施例说明了用于本发明化合物口服给药的典型药物组合物的制备。
制备具有以下组成的口服混悬剂。
成分活性化合物 3mg富马酸 0.5g氯化钠 2.0g尼泊金甲酯 0.1g砂糖 25.5g山梨糖醇(70％溶液) 12.85g硅酸镁铝K(Vanderbilt Co.)1.0g娇味剂 0.035mL着色剂 0.5mg蒸馏水 适量至100mL
制剂实施例D这个实施例说明了含有本发明化合物的典型药物组合物的制备。
制备具有以下组成的缓冲至pH 4的可注射制剂。
成分活性化合物 0.1mg乙酸钠缓冲溶液(0.4M) 2.0mLHCl(1N)适量至pH4水(蒸馏的、无菌的) 适量至20mL
制剂实施例E这个实施例说明了用于注射本发明化合物的典型药物组合物的制备。
通过向1mg的本发明化合物中力加入20mL的无菌水制备重构的溶液。使用前，然后用200mL可与活性化合物配伍的静脉内注射的流体稀释该溶液。该流体选自5％葡萄糖溶液、0.9％氯化钠溶液，或5％葡萄糖和0.9％氯化钠的混合物。其它的实例是乳酸格林注射液、含5％葡萄糖的乳酸格林注射液、含5％葡萄糖的Normosol-M、IsolyteE和酰化的格林注射液。
制剂实施例F这个实施例说明了用于本发明化合物的局部应用的典型药物组合物的制备。
成分 克活性化合物 0.2-10司盘60 2吐温60 2矿物油 5凡士林 10尼泊金甲酯 0.15尼泊金丙酯 0.05BHA(丁基化羟基苯甲醚)0.01水 适量至100
合并以上除水以外的所有成分，并在搅拌下加热至60℃。然后在剧烈搅拌下添加60℃的足量的水以使成分乳化，然后适量添加水至100g。
制剂实施例G这个实施例说明了含有本发明化合物的典型药物组合物的制备。
通过将0.1mg活性化合物的药用盐溶解于用柠檬酸酸化的0.9％氯化钠溶液中，制备用于雾化器中的含水气雾剂制剂。搅拌混合物并超声处理，直到活性盐溶解。通过缓慢加入NaOH调节溶液的pH至3-8的范围。
制剂实施例H这个实施例说明了用于吸入药筒的含本发明化合物的干粉制剂的制备。
用具有下列成分的药物组合物填充明胶吸入药筒。
成分
mg/药筒活性化合物的药用盐0.2乳糖 25
在与乳糖掺合前，先将活性化合物的药用盐微粉化。使用粉剂吸入器给予药筒的内含物。
制剂实施例I这个实施例说明了用于干粉吸入装置中的含本发明化合物的干粉制剂的制备。
制备微粉化的药用盐和乳糖的体积配方(bulk formulation)比为1∶200的药物组合物。把组合物填充入干粉吸入装置，所述装置每剂量能传送约10μg-约100μg的活性药物成分。
制剂实施例J这个实施例说明了用于定量吸入器中的含本发明化合物的制剂的制备。
通过将5g平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒形式的活性化合物分散于胶体溶液中，制成含5％的活性化合物的药用盐、0.5％卵磷脂和0.5％海藻糖的混悬液，所述胶体溶液由0.5g的海藻糖和0.5g的卵磷脂溶解于100mL的软化水中形成。将混悬液喷雾干燥，并将所得的物质微粉化到平均直径小于1.5μm的颗粒。将该颗粒装填入含加压的1，1，1，2-四氟乙烷的罐中。
制剂实施例K这个实施例说明了用于定量吸入器中的含本发明化合物的制剂的制备。
通过将10g平均尺寸小于10μm的微粉化颗粒形式的活性化合物分散于溶液中，制成含5％的活性化合物的药用盐和0.1％卵磷脂的混悬液，所述溶液由0.2g的卵磷脂溶解于200mL的软化水中形成。将混悬液喷雾干燥，并将所得的物质微粉化至平均直径小于1.5μm的颗粒。将该颗粒装填入含加压的1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷的罐中。
制剂实施例L这个实施例说明了用于吸入药筒中的含有本发明的化合物和皮质类固醇的干粉制剂的制备。
用具有下列成分的药物组合物填充明胶吸入药筒成分
mg/药筒活性化合物的药用盐 0.1皮质类固醇 0.5乳糖 25
在与乳糖掺合前，将活性化合物的药用盐和皮质类固醇微粉化。使用粉末吸入器施用药筒的内容物。
生物学测定法本发明的化合物及其药学上可接受的盐，表现出生物活性，并且适用于医学治疗。化合物结合β2肾上腺素能受体的能力及其选择性、激动剂效价和内在活性，可以用以下的试验A-B证明，或可以使用本领域已知的其它试验证明。
缩写％Eff ％功效ATCC 美国典型培养物保藏中心BSA 牛血清白蛋白cAMP 3′5′-环磷酸腺苷DMEM Dulbecco改进的Eagle培养基DMSO 甲亚砜EDTA 乙二胺四乙酸Emax 最大功效FBS 胎牛血清Gly 甘氨酸HEK-293 人胚肾-293PBS 磷酸盐缓冲盐水rpm 转/分Tris 三(羟甲基)氨基甲烷来自表达人β1或β2肾上腺素能受体的细胞的膜制备物使稳定地表达克隆的人β1或β2肾上腺素能受体的HEK-293衍生的细胞系在存在500μg/mL遗传霉素并含10％透析的FBS的DMEM中分别生长到接近汇合。使用细胞刮板用乙二胺四乙酸1∶5,000(PBS中0.2g/L EDTA)提起细胞单层。通过以1,000rpm离心使细胞沉淀，并且将细胞沉淀在-80℃下冷冻保存或立刻制备膜。就制备而言，将细胞沉淀再悬浮在溶胞缓冲液(10mM的Tris/HCL [email protected]℃，每50mL缓冲液(Roche cat.#1 697498，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)一片“含2mM EDTA的完全性蛋白酶抑制剂混合物片”)中，并在冰上使用吻合紧密的Dounce玻璃匀浆器匀化(冲击20次)。以20,000xg离心匀浆，通过如上所述的再悬浮和离心，用溶胞缓冲液洗涤该沉淀一次。将最后的沉淀再悬浮在膜缓冲液(75mMTris/HCl pH7.4，12.5mM MgCl2，1mM [email protected]℃)。用Bradford的方法(Bradford MM.，Analytical Biochemistry，1976，72，248-54)测定膜悬浮液的蛋白质浓度。在-80℃下以等分试样冷冻保存膜。
试验A对人β1和β2肾上腺素能受体的放射配体结合试验在96-孔微量滴定板中进行结合试验，在测定缓冲液(75mMTris/HCl [email protected]℃，12.5mM MgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA)中总测定体积为100μL，含有5μg膜蛋白(对于含有人β2肾上腺素能受体的膜)，或含有2.5μg膜蛋白(对于含有人β1肾上腺素能受体的膜)。采用[3H]二氢阿普洛尔(NET-720，100Ci/mmol，PerkinElmer LifeSciences Inc.，Boston，MA)以从0.01nM-200nM的10个不同的浓度，进行用于测定放射性配体的Kd值的饱和结合研究。用1nM的[3H]二氢阿普洛尔和从40pM-10μM的10个不同的化合物浓度，进行用于测定化合物pKi值的置换试验。在溶解缓冲液(25mM Gly-HCl，pH3.0，含50％DMSO)中将化合物溶解至浓度为10mM，然后在50mMpH3.0的Gly-HCl中稀释至1mM，并且从这里连续稀释成测定缓冲液。在存在10μM未标记的阿普洛尔的条件下，测定非特异性结合。测定在室温下温育90分钟，通过在预先浸渍在0.3％的聚乙烯亚胺中的GF/B玻璃纤维滤板(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)快速过滤终止结合反应。用过滤缓冲液(75mM Tris/HCl，[email protected]℃，12.5mM MgCl2，1mM EDTA)洗涤滤板三次，以除去未结合的放射性。将板干燥、添加50μL的Microscint-20液体闪烁流体(PackardBioScience Co.，Meriden，CT)，并在Packard Topcount液体闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)中对板计数。用GraphPadPrism软件包(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)，使用一位点竞争的3参数模型，通过非线性回归分析来分析结合数据。当在存在10μM阿普洛尔的条件下测定时，将曲线最小值固定为非特异性结合的值。采用Cheng-Prusoff方程式(Cheng Y和Prusoff WH.，Biochemical Pharmacology，1973年，22，23，第3099-108页)，从观察到的IC50值和放射性配体的Kd值计算化合物的Ki值。将受体亚型选择性计算为Ki(β1)/Ki(β2)的比。
将结合结果表达为Ki值的负十对数，pKi。在本试验中具有较高pKi值的化合物对β2肾上腺素能受体具有较高的结合亲和力。
试验B采用分别异源地表达人β1肾上腺素受体、β2肾上腺素受体和β3肾上腺素受体的细胞系的全细胞cAMP快速板(Flashplate)试验使稳定地表达克隆的人β1肾上腺素能受体(克隆H34.1)的HEK-293细胞系在由补充了10％FBS和500μg/mL遗传霉素的DMEM组成的培养基中长到约70％-90％汇合。使稳定地表达克隆的人β2-肾上腺素受体(克隆H24.14)的HEK-293细胞系在相同的培养基中长到完全汇合。使稳定地表达克隆的人β3-肾上腺素受体的CHO-K1细胞系在补充了10％FBS和每第五传代加入的800μg/mL的遗传霉素的Ham’s F-12培养基中长到约70％-90％汇合。在测定前一天，将培养物转换到不含抗生素的相同生长培养基中。
根据制造商的用法说明，采用含有125I-cAMP的快速板腺苷酸环化酶活化测定系统(NEN SMP004，PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)，以放射免疫测定法格式进行cAMP测定。
在测定的当天，用PBS漂洗细胞一次，用乙二胺四乙酸1∶5,000(PBS中0.2g/L EDTA)提起并计数。以1,000rpm离心使细胞沉淀，并将其再悬浮在预加热至37℃的刺激缓冲液中。对于表达β1-肾上腺素受体的细胞来说，将10nM的ICI118,551添加到刺激缓冲液中，并在37℃下温育细胞10分钟。对于分别表达β1-肾上腺素受体、β2-肾上腺素受体和β3-肾上腺素受体的细胞，以30,000、40,000和70,000个细胞/孔的最终浓度使用细胞。将化合物在DMSO溶解至10mM的浓度，然后用50mM pH3.0的Gly-HCl稀释至1mM，并且从这里连续稀释成测定缓冲液(75mM Tris/HCl，[email protected]℃，12.5mM MgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA)。在测定中以10μM到9.5pM范围内的11个不同的浓度测试化合物。在37℃下温育反应10分钟，并且通过加入100μL冰冷的检测缓冲液停止反应。将板密封、在4℃下温育过夜并在第二天上午在topcount闪烁计数器(PackardBioScience Co.，Meriden，CT)中计数。按照制造商的用户手册所描述的，基于观察到的样品的计数和cAMP标准品的计数，计算每毫升反应产生的cAMP的量。用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)，使用S形剂量-响应(希尔斜率＝1)的3参数模型，通过非线性回归分析来分析数据。将激动剂效价表达为pEC50值。将功能β2/β1选择性定义为比值EC50(β1)/EC50(β2)，并且相应地将功能β2/β3选择性定义为比值EC50(β3)/EC50(β2)。
试验C采用内源性地表达人β2肾上腺素能受体的肺上皮细胞系的全细胞cAMP快速板试验为了在表达内源性水平的β2肾上腺素能受体的细胞系中测定激动剂效价和功效(内在活性)，使用人肺上皮细胞系(BEAS-2B)(ATCCCRL-9609，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)(January B等人，British Journal of Pharmacology，1998，123，4，第701-711页)。使细胞在完全的、无血清的培养基(含肾上腺素和维甲酸的LHC-9MEDIUM，cat#181-500，Biosource International，Camarillo，CA)中生长到75％-90％汇合。在测定前一天，将培养基转换为LHC-8(不含肾上腺素或维甲酸，cat#141-500，Biosource International，Camarillo，CA)。
根据制造商的用法说明，采用含有125I-cAMP的快速板腺苷酸环化酶活化测定系统(NEN SMP004，PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)，以放射免疫测定法格式进行cAMP测定。
在测定的当天，细胞用PBS漂洗，通过用含5mM EDTA的PBS刮而提起，并计数。通过以1,000rpm离心使细胞沉淀，并以600,000个细胞/mL的最终浓度将其再悬浮在预加热至37℃的刺激缓冲液中。在测定中以30,000个细胞/孔的最终浓度使用细胞。将化合物在溶解缓冲液(25mM pH3.0的Gly-HCl，含50％DMSO)中溶解至10mM的浓度，然后用50mM pH3.0的Gly-HCl稀释至1mM，并且从这里连续稀释成测定缓冲液(75mM Tris/HCl，[email protected]℃，12.5mMMgCl2，1mM EDTA，0.2％BSA)。
在测定中，以在10μM到40pM范围内的10个不同的浓度测试化合物。在存在10μM异丙肾上腺素的条件下测定最大响应。在37℃下温育反应10分钟，并通过加入100μL冰冷的检测缓冲液停止反应。把板密封、在4℃下温育过夜并在第二天上午在topcount闪烁计数器(Packard BioScience Co.，Meriden，CT)中计数。按照制造商的用户手册所描述的，基于观察到的样品的计数和cAMP标准品的计数，计算每mL反应产生的cAMP的量。用GraphPad Prism软件包(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)，使用具有可变斜率的S形剂量-响应的4参数模型，通过非线性回归分析来分析数据。由观察到的Emax(拟合曲线的顶点)和对于10μM异丙肾上腺素获得的最大响应的比，计算化合物功效(％Eff)，并将其表达为相对于异丙肾上腺素的％Eff。
试验D豚鼠模型中对抗乙酰胆碱诱导的支气管痉挛的支气管保护的测定通过笼子卡片个体鉴别每组6只体重在250和350克之间的雄性豚鼠的组(Duncan-Hartley(HsdPocDH)Harlan，Madison，WI)。在整个研究中，允许动物随意地获得食物和水。
在全身暴露给药隔室(R & S Molds，San Carlos，CA)中，在10分钟内通过吸入给予试验化合物。安排给药隔室，使得气雾剂从中央歧管被同时递送到6个单独的隔室。60分钟顺应期和10分钟暴露于雾化的注射用水(WFI)后，将豚鼠暴露于试验化合物或载体(WFI)的气雾剂。使用由22psi压力下的气体混合物(CO2＝5％、O2＝21％和N2＝74％)驱动的LC Star喷雾器装置(型号22F51，PARI RespiratoryEquipment，Inc.Midlothian，VA)，由水溶液产生这些气雾剂。在该操作压力下通过雾化器的气体流量是大约3L/分钟。通过正压将所产生的气雾剂驱动到隔室中。在传送气雾化溶液的过程中使用未稀释的空气。在10分钟雾化过程中，雾化了大约1.8mL的溶液。这是通过比较填充的喷雾器的雾化前和雾化后重量，用重量分析法进行测量的。
服药后1.5、24、48和72小时，采用全身体积描记法评价通过吸入给予的化合物的支气管保护作用。在开始肺评估前45分钟，用肌内注射氯胺酮(43.75mg/kg)、赛拉嗪(3.50mg/kg)、乙酰丙嗪(1.05mg/kg)来麻醉每只豚鼠。外科手术部位剃毛并用70％的酒精清洁后，做一个2-5cm的颈前侧面的中线切口。然后，分离颈静脉并用充满生理盐水的聚乙烯导管(PE-50，Becton Dickinson，Sparks，MD)插管，以允许静脉内输注0.1mg/mL的乙酰胆碱(Ach)，(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的盐水溶液。然后，自由地切开气管，并用14G聚四氟乙烯管(#NE-014，Small Parts，Miami Lakes，FL)插管。如果需要，通过另外肌肉内注射前面提及的麻醉剂混合物来保持麻醉。如果动物对捏拧其脚爪有反应或其呼吸率大于100次/分钟，监测并调节麻醉的深度。
一旦完成插管，将动物放置到体积描记器(#PLY3114，BuxcoElectronics，Inc.，Sharon，CT)中，并插入食管压力插管以测量肺驱动压(压力)。将聚四氟乙烯气管导管连到体积描记器的开口，以允许豚鼠呼吸来自隔室外面的房间空气。然后密封隔室。使用加热灯维持体温，并采用10mL校准注射器(#5520系列，Hans Rudolph，KansasCity，MO)，用4mL空气使豚鼠的肺膨胀3次，以确保下气道不会萎陷并且动物不会遭受通气过度。
一旦测定顺应性的基线值在0.3-0.9ml/cm H2O的范围内，并且阻力的基线值每秒0.1-0.199cm H2O/mL的范围内，就开始肺的评估。Buxco肺测量计算机程序使得能够采集并导出肺的值。开始该程序起始实验方案和数据采集。通过Buxco压力传感器测量每次呼吸时在体积描记器内发生的体积随时间的变化。通过对随时间变化的该信号积分，计算每次呼吸的流量的量度。将该信号和肺的驱动压变化(使用Sensym压力传感器(#TRD4100)采集)，通过Buxco(MAX 2270)前置放大器与数据采集界面(#’s SFT3400和SFT3813)相连接。所有其它肺参数从这两个输入信号导出。
采集基线值5分钟，5分钟后用Ach攻击豚鼠。在规定的实验开始后的时间和以下述的剂量从注射泵(sp210iw，World PrecisionInstruments，Inc.，Sarasota，FL)中静脉内输注Ach1分钟在5分钟时1.9μg/分钟、在10分钟时3.8μg/分钟、在15分钟时7.5μg/分钟、在20分钟时15.0μg/分钟、在25分钟时30μg/分钟和在30分钟时60μg/分钟。如果在每个Ach剂量后的3分钟阻力或顺应性没有回到基线值，用来自10mL校准注射器的4mL空气使豚鼠的肺膨胀3次。记录的肺参数包括呼吸频率(呼吸/分钟)、顺应性(mL/cm H2O)和肺阻力(每秒的cm H2O/mL)(Giles等，1971)。一旦在这个实验方案的第35分钟完成了肺功能测量，将豚鼠从体积描记器中取出，通过CO2窒息使之安乐死。
用下列方程式，使用从一系列Ach攻击期间的所述流量和压力导出的肺阻力值，计算量PD2(将其定义为使基线肺阻力加倍所需要的Ach的量)。这是从临床学科中用于计算PC20值的方程式导出的(Am.Thoracic Soc，2000)。
PD2=antilog[logC1+(logC2-logC1)(2R0-R1)R2-R1]]]>其中C1＝倒数第二个Ach浓度(C2前面的浓度)C2＝最后的Ach浓度(导致肺阻力(RL)两倍增加的浓度)R0＝基线RL值R1＝C1后的RL值R2＝C2后的RL值使用单向(One-Way)方差分析，接着使用Bonferroni/Dunn检验的post-hoc分析，进行数据的统计分析。p-值＜0.05被认为是显著的。
使用用于Windows的GraphPad Prism，3.00版本(GraphPadSoftware，San Diego，California)，用四参数对数方程拟合剂量-响应曲线。
Y＝Min+(Max-Min)/(1+10^((logED50-X)*希尔斜率))，其中X是剂量的对数，Y是响应值(PD2)，Y在Min开始并且渐近地接近Max，具有S形。
提供以下实施例用于说明本发明，不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例一般原则除非另外指出，试剂、原料和溶剂从商业供应商购得，例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)和Honeywell Burdick和Jackson(Muskegon，MI)，并且在没有进一步纯化下被使用；反应在氮气氛下进行；用薄层色谱法(二氧化硅TLC)、分析型高效液相色谱法(分析型HPLC)或质谱分析监测反应混合物；反应混合物通常用硅胶急骤柱色谱法或用制备型HPLC，采用以下所述的一般方案提纯；将NMR试样溶解于氘代溶剂(CD3OD、CDCl3或DMSO-d6)中，光谱用Varian Gemini2000仪器(300MHz)在标准参数下获得；采用Perkin Elmer仪器(PE SCIEX API150EX)通过电喷射离子化方法(ESMS)进行质谱分析鉴别。
实施例18-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成a.(6-苯乙氨基己基)-氨基甲酸叔丁基酯的制备将(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁基酯盐酸盐(5g，20mmol)溶解在50％二氯甲烷/甲醇(50mL)中并在环境温度下用苯乙醛(2.3mL，20mmol)处理1小时。添加氰基硼氢化钠(1.2g，19mmol)并搅拌混合物过夜。添加水，接着添加饱和的碳酸氢钠和附加的二氯甲烷。分配混合物，用硫酸钠干燥有机物并在碱压下除去挥发物，以得到标题中间体，在没有进一步纯化下使用该中间体。
b.(6-叔丁氧羰基氨基-己基)苯乙基氨基甲酸苄基酯的制备在环境温度下用苄基氯甲酸酯(2.8mL，20mmol)和氢氧化钠水溶液(1M，30mL)处理前一步骤的产物过夜。用乙酸异丙酯萃取混合物。用柠檬酸水溶液(0.5M)，接着用饱和的碳酸氢钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并在减压下除去挥发物，以得到标题中间体(9g)，在没有进一步纯化下使用它。
c.(6-氨基己基)苯乙基氨基甲酸苄基酯的制备将前一步骤的产物(9g粗的)溶解在二氯甲烷(45mL)中并在环境温度下用三氟乙酸(45mL)处理。在减压下除去挥发物，将残余物溶于水中并用氢氧化钠碱化。用二氯甲烷萃取混合物并用硫酸钠干燥有机物。在减压下除去挥发物得到标题中间体，将其蒸发至干并在没有进一步纯化下使用它。
d.[(R)-2-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(8-苄基氧基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-5-基)乙基]-(6-苯乙氨基-己基)氨基甲酸苄基酯的制备在110℃加热前一步骤的产物(6.5g粗的，18mmol)、8-苄基氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(4.5g，9.2mmol)和二甲亚砜(13mL)1小时，然后冷却到环境温度过夜。将混合物在水和乙酸异丙酯之间分配。用饱和的碳酸氢钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干。通过反相HPLC纯化混合物得到标题中间体，为其三氟乙酸盐。
e.[(R)-2-羟基-2-(8-苄基氧基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-5-基)乙基]-(6-苯乙氨基-己基)氨基甲酸苄基酯的制备将前一步骤的产物溶解在四氢呋喃中并在室温下用三氢氟化三乙胺处理，直到通过HPLC判断反应完全。将混合物分配在1M氢氧化钠和乙酸异丙酯之间。用硫酸钠干燥有机物并蒸发至干，得到标题中间体。
f.8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成在室温下将前一步骤的产物(250mg，0.39mmol)溶解在二氯甲烷中，并以等分试样添加三氯化硼(在二氯甲烷中1M)。通过HPLC监测反应，添加附加的三氯化硼，直到判断反应完全。添加10％乙酸水溶液并在减压下除去二氯甲烷。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题化合物，为其双-三氟乙酸盐。
实施例28-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的可替代性合成a.(5-苯乙基氨甲酰基-戊基)氨基甲酸叔丁基酯的制备在氮气下将苯乙胺(340μL，4.3mmol)、6-叔丁氧羰基氨基-己酸(1.0g，4.3mmol)和1-羟基苯并三唑(700mg，5.1mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺中并冷却到0℃。添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐并搅拌混合物过夜，让其温至室温。将混合物分配在水和乙酸异丙酯之间。用0.5M柠檬酸，然后用饱和的碳酸氢钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干。在没有进一步纯化下使用残余物。
b.6-氨基-N-(2-苯乙基)己酰胺的制备将前一步骤的产物溶解在二氯甲烷(10mL)中并在室温下用三氟乙酸(10mL)处理1小时。在减压下除去挥发物并将残余物溶于二氯甲烷中，用1N氢氧化钠洗涤，用硫酸钠干燥并蒸发至干，得到标题中间体(830mg，3.5mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
c.N1-苯乙基己烷-1，6-二胺的制备在氮气和室温下将前一步骤的产物(330mg，1.4mmol)溶解在四氢呋喃(4mL)中并添加硼烷-二甲硫复合物(500μL)。回流混合物过夜，然后在冰浴中冷却。小心地添加甲醇并在减压下除去挥发物。将残余物再溶解在甲醇中并再次浓缩，得到标题中间体(360mg，1.6mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
d.8-苄基氧基-5-[(R)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(200mg，0.91mmol)、8-苄基氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(340mg，0.70mmol)、碳酸氢钠(180mg，2.1mmol)和二甲亚砜(1.7mL)加热到110℃达55分钟，冷却到室温并在乙酸异丙酯和水之间分配。用硫酸钠干燥有机物并蒸发至干。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题中间体，为其双-三氟乙酸盐(75mg，88μmol)。
e.8-苄基氧基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(75mg，88μmol)溶解在四氢呋喃(1mL)中并在室温下用三氢氟化三乙胺(60μL，370μmol)处理18小时。将混合物分配在1M氢氧化钠和乙酸异丙酯之间。用硫酸钠干燥有机物并蒸发至干，得到标题中间体。
f.8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成在室温下将前一步骤的产物溶解在二氯甲烷中并以等分试样添加三氯化硼(在二氯甲烷1M)。通过HPLC监测反应，添加附加的三氯化硼直到判断反应完全。添加10％乙酸水溶液并在减压下除去二氯甲烷。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题化合物，为其双-三氟乙酸盐。C25H33N3O3计算的m/z[M+H+]424.26；实测值424.4。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)10.4(s，2H)，8.6(brs，4H)，8.0(d，1H，J＝9.9Hz)，7.1-7.3(m，5H)，7.0(d，1H，J＝8.2Hz)，6.9(d，1H，J＝8.2hz)，6.4(d，1H，J＝9.9Hz)，6.1(brs，1H)，5.2(brd，1H，J＝8.5Hz)，2.7-3.1(m，10H)，1.4-1.6(m，4H)，1.1-1.3(m，4H)。
比较实施例8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成a.6-苯乙基氧基己腈的制备将6-溴代己腈(3.0mL，23mmol)和四丁级溴化铵(350mg，1.1mmol)溶解在四氢呋喃(5mL)和50％氢氧化钠水溶液(15mL)中。添加苯乙醇(3.0mL，25mmol)，导致沉淀。将混合物加热到65℃，此时固体溶解。在65℃搅拌混合物4小时，然后冷却到室温并放置11天。添加水、己烷和乙酸乙酯并分配混合物。用水、饱和的氯化钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干，得到标题中间体(5.3g，24mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
b.6-苯乙基氧基己胺的制备将前一步骤的产物(5.3g，24mmol)溶解在四氢呋喃(50mL)中并用硼烷-二甲硫复合物(6mL)处理。回流混合物3.5小时，然后添加额外的硼烷-二甲硫复合物(2mL)，再回流混合物20小时，冷却到室温，并小心地添加甲醇。在减压下除去挥发物并从甲醇中再蒸发混合物，得到标题中间体(5.7g，26mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
c.8-苄基氧基-5-[(R)-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(3.4g，15mmol)、8-苄基氧基-5-[(R)-2-溴-1-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)乙基]-1H-喹啉-2-酮(3.4g，7.0mmol)、碳酸氢钠(2.3g，27mmol)和二甲亚砜(7mL)在100℃加热135分钟，然后冷却到室温并让它静置16小时。将混合物分配在水和乙酸异丙酯之间并用水然后用饱和的氯化钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干。通过反相HPLC纯化产物，得到标题中间体，为其三氟乙酸盐(1.5g，2.0mmol)。
d.8-苄基氧基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的制备将前一步骤的产物(1.5g，2.0mmol)溶解在四氢呋喃(15mL)中并用三氢氟化三乙胺(660μL，4.0mmol)在室温下处理3天。将混合物分配在1M氢氧化钠和乙酸乙酯之间。用饱和的氯化钠洗涤有机物，用硫酸钠干燥并蒸发至干，得到标题中间体(1.4g，2.7mmol)，在没有进一步纯化下使用它。
e.8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮的合成将前一步骤的产物(1.4g，2.7mmol)和炭上氢氧化钯(20％Pd，含湿量～60％，300mg)悬浮在四氢呋喃(30mL)中并在室温和氢气气氛下搅拌两小时。过滤除去钯并在减压下蒸发混合物。通过反相HPLC纯化残余物，得到标题化合物，为其三氟乙酸盐。C25H32N2O4计算的m/z[M+H+]425.25；实测值425.3。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)10.4(s，1H)，10.4(s，1H)，8.4(brs，2H)，8.0(d，1H，J＝10.2Hz)，7.0-7.2(m，6H)，6.9(d，1H，J＝8.0Hz)，6.5(d，1H，J＝9.9Hz)，6.1(d，1H，J＝3.7Hz)，5.2(m，H)，3.4(t，2H，J＝7.0Hz)，3.2(t，2H，J＝6.6Hz)，2.7-3.0(m，4H)，2.7(t，2H，J＝6.9Hz)，1.3-1.5(m，4H)，1.1-1.2(m，4H)。
实施例4生物学测定结果在上面描述的生物学测定中测试了本发明的典型化合物，实施例1和2的化合物，8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮和比较实施例的化合物，8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙基氧基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮。现将测定的结果总结在下表中。
表1.体外测定结果
表2.体内测定结果
*实施例1中制备的化合物在上述体外结合亲和性测定和功能测定中测试的本发明的化合物对β2肾上腺素能受体具有活性，比较化合物也具有活性。令人意外的是，本发明的化合物证实了在给药后72小时在豚鼠模型中的支气管保护作用，而比较化合物在给药后72小时在体内无活性。另外，本发明的化合物在试验B的功能测定中显示出对β2肾上腺素能受体的优异选择性(与β1和β3受体亚型比较)。所述测定结果显示，本发明提供了强效的和选择性的β2肾上腺素能受体激动剂，其具有异常长的作用持续时间。
尽管已参照本发明的具体实施方案描述了本发明，但是本领域的技术人员应当理解，在不背离本发明的真实精神和范围下，可以进行各种变化并且可以同等方案取代。此外，可以进行很多修饰使特定的情形、材料、物质的组成、方法、方法步骤，适应本发明的目的、精神和范围。所有这类修饰被计划在此附加的权利要求的范围之内。另外，在上文引用的所有的出版物、专利和专利文献在此以全文引入作为参考，好像个别地引入作为参考一样。
权利要求
1.式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体 其中R1、R2、R3、R4中的每一个独立地选自氢、羟基、氨基、卤素、-CH2OH和-NHCHO，或R1和R2连在一起选自-NHC(＝O)CH＝CH-、-CH＝CHC(＝O)NH-、-NHC(＝O)S-和-SC(＝O)NH-；R5选自氢、-ORa和-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是氢或C1-3烷基；n为0到7的整数；m为0到5的整数；并且R6、R7、R8、R9和R10中的每一个独立地是氢或C1-6烷基；条件是当m是0时，R5是氢。
2.权利要求1的化合物，其中R9和R10各是氢。
3.权利要求1或权利要求2的化合物，其中R5和R6各是氢。
4.权利要求1的化合物，它是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体 其中R1是-CH2OH或-NHCHO，并且R2是氢；或R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-；n是2到6的整数；m是0到3的整数。
5.权利要求4的化合物，其中n是4。
6.权利要求4或权利要求5的化合物，其中m是1。
7.权利要求4到6任一项的化合物，其中R1和R2连在一起是-NHC(＝O)CH＝CH-或-CH＝CHC(＝O)NH-。
8.权利要求4到7任一项的化合物，其中带有羟基的亚烷基碳上的立体化学是(R)。
9.权利要求1的化合物，其化学名称为8-羟基-5-[(R)-1-羟基-2-(6-苯乙氨基-己氨基)乙基]-1H-喹啉-2-酮；或其药学上可接受的盐或溶剂合物或立体异构体。
10.一种药物组合物，它包含治疗有效量的权利要求1到9任一项的化合物和药学上可接受的载体。
11.权利要求10的药物组合物，其中该组合物还包含治疗有效量的一种或多种其它治疗剂。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述其它治疗剂是皮质类固醇、抗胆碱能药或PDE4抑制剂。
13.权利要求10到12任一项的药物组合物，其中该组合物被配制用于通过吸入给药。
14.一种组合，它包含权利要求1到9任一项的化合物和一种或多种其它治疗剂。
15.一种组合，它包含权利要求1到9任一项的化合物和选自丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃基羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-氟代甲基酯和6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羧酸S-(2-氧代-四氢-呋喃-3S-基)酯的化合物。
16.权利要求1到9任一项所述的化合物，其用于治疗中。
17.权利要求1到9任一项的化合物，或者权利要求14或权利要求15的组合在制备药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述药物用于治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物。
19.权利要求18的用途，其中所述疾病或病况是肺的疾病或病况。
20.权利要求19的用途，其中所述肺的疾病或病况是哮喘或慢性阻塞性肺病。
21.权利要求18的用途，其中所述药物适合于通过吸入给药。
22.权利要求1到9任一项的化合物在制备与一种或多种治疗剂联合给药用于治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的药物中的用途。
23.制备根据权利要求1到9任一项的式(I)化合物的方法，该方法包括(a)使式(III)的化合物 其中P1是羟基保护基，L是离去基团，R1a、R2a、R3a和R4a中的每一个独立地与权利要求1到9任一项中定义的R1、R2、R3和R4相同或为-OP2，其中P2是羟基保护基；与式(IV)的化合物反应 其中R11是氢或P3，其中P3是氨基保护基，提供式(V)的化合物 (b)除去保护基P1，提供式(VI)的化合物 并且(c)当R1a、R2a、R3a或R4a中的任一个是-OP2时，或当R11是P3时，除去保护基P2和P3，如果存在的话，提供式(I)的化合物，或其盐或立体异构体。
24.通过权利要求23的方法制备的产物。
25.一种治疗患有与β2肾上腺素能受体活性有关的疾病或病况的哺乳动物的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的权利要求1到9任一项的化合物。
26.权利要求25的方法，它还包括给予治疗有效量的一种或多种其它治疗剂。
27.权利要求26的方法，其中所述其它治疗剂是皮质类固醇、抗胆碱能药或PDE4抑制剂。
28.权利要求25到27任一项的方法，其中该方法包括通过吸入给予化合物。
29.一种研究包含β2肾上腺素能受体的生物系统或样品的方法，该方法包括(a)使所述生物系统或样品与权利要求1到9任一项的化合物接触；并且(b)测定由所述化合物引起的对所述生物系统或样品的作用。
全文摘要
本发明提供了新的β
文档编号A61K31/16GK1984876SQ200580024061
公开日2007年6月20日 申请日期2005年6月2日 优先权日2004年6月3日
发明者M·S·林塞尔 申请人:施万制药
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