2-((杂)芳基)-苯并噁唑化合物及其衍生物、组合物以及用于稳定和抑制甲状腺素转运蛋...的制作方法
专利名称：2-((杂)芳基)-苯并噁唑化合物及其衍生物、组合物以及用于稳定和抑制甲状腺素转运蛋 ...的制作方法
在此要求美国临时申请序列号60/573,720的优先权，其申请日为2004年5月20日，标题为“化合物、组合物以及用于稳定和抑制甲状腺素转运蛋白错重叠的方法”。上述申请在此通过参考而全部引入。
发明领域 在此提供了通常与蛋白错重叠相关的化合物、组合物和方法。更具体地，在此提供了苯并噁唑化合物、组合物以及用于稳定甲状腺素转运蛋白、抑制甲状腺素转运蛋白错重叠、抑制甲状腺素转运蛋白纤维化和淀粉样蛋白(anyloid)形成和治疗与其相关的淀粉样疾病的方法。
背景技术：
甲状腺素转运蛋白(transthyretin，TTR)是存在于血浆和中枢脊髓液中的55kDa均四聚蛋白。TTR的功能是转运L-甲状腺素(T4)和全-视黄醇结合蛋白(RBP)。TTR是超过20个非同源致淀粉样蛋白之一，其可转化为纤丝和其它聚集体从而在人体内导致疾病病理。这些疾病似乎并非是因蛋白聚集的功能损失而引起的。实际上，聚集似乎通过尚不明确的机理引起神经元/细胞功能障碍。
在变性病情中，限制野生型TTR四聚体解聚的速率以及快速的单体错重叠可导致错装配成淀粉样蛋白，公认将引起老年全身性淀粉样疾病(SSA)。超过80个TTR变异体之一的解聚和错重叠导致许多家族性淀粉样变性，包括家族性淀粉样多发性神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。
TTR四聚体具有两个C2对称的T4-结合位点。已知T4的负协同结合稳定了TTR四聚体并抑制了淀粉样纤维化形成。不幸地，在人血浆中仅有低于1％的TTR具有与其结合的T4，因为相对于TTR，甲状腺素-结合球蛋白(TBG)对于T4具有更高的亲和力。因此，相对于TTR的血浆浓度(3.6-7.2μM)，T4的血浆浓度更低(0.1M)。
发明简介 本文提供了在动力学上稳定天然态的甲状腺素转运蛋白从而抑制蛋白错重叠的化合物。蛋白错重叠在许多疾病过程中起作用，包括甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病。通过抑制甲状腺素转运蛋白错重叠，可干预或治疗这样的疾病、缓解症状和/或有时可预防或治愈疾病。
本文描述了治疗、预防或改善TTR淀粉样变性的一种或多种症状的化合物、组合物和方法。TTR淀粉样变性通常在5-10岁导致死亡，直至最近，仍被认为是不可治愈的。肝移植是在家族性淀粉样多发性神经病病例内用野生型(WT)等位基因替换疾病相关等位基因的有效方法，因为肝脏通常是致淀粉样TTR的来源。尽管肝移植是有效的基因治疗方式，但其仍存有问题。移植是复杂的，其需要对于受者和供者均进行侵入性外科手术、长期的移植后免疫抑制治疗、供者短缺、成本昂贵、而且因为大量的TTR淀粉样变性患者的疾病进程使得其不适于移植。不幸地，在某些肝移植后的家族性患者体内心肌淀粉样变性继续恶化，因为WT TTR通常持续沉积。移植也不能缓解TTR在中枢神经系统(CNS)的沉积，这是由于其是由脉络丛合成。对于多数流行的TTR疾病、老年全身性淀粉样变性(SSA)(因为WTTTR沉积而影响到大约高达25％的80岁以上老年人)、以及对于家族性淀粉样心肌病(包括V122I携带者，V122I是在3.9％非裔美国人体内识别的突变体)，移植并不是行得通的选择。
在一种实施方案中，用于本文组合物和方法的化合物具有式I结构
或
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)n-C(R6)(NH2)-COOH； X是O、S或NR11； R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、COOH、CONR7R8、烷基、卤代烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3； Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代； Ar是芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代； R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基； R5是烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基或芳烷基； R6是天然存在的α-氨基羧酸的侧链； R7和R8各自独立选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基； R9和R10各自独立是氢、卤素、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基； R11是氢或烷基；以及 n是0-3的整数。
在一种实施方案中，Het是嘧啶基、吡啶基、呋喃基或噻吩基。在另一种实施方案中，Het是吡啶基。
在另一种实施方案中，R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、COOH、CONR7R8、烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3。
在一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是Cl、F或CF3。在另一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯。在另一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不全是氢。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH或CONH2时，那么R1、R2和R3不是烷基、环烷基、烷氧基、COOH、其中R时烷基或OH的COOR。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且X是NH时，那么R1、R2和R3不是4-CN。在另一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH时，那么R1、R2和R3不是CN。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH或CONH2，那么R1、R2和R3不是烷基、烷氧基、环烷氧基或CN。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH或CONH2，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、4-烷氧基或4-环烷氧基。
本文还提供了包含本文所提供化合物的药物组合物。
还提供了稳定组织或生物液中甲状腺素转运蛋白并由此抑制错重叠的方法。通常，该方法包括给予组织或生物液稳定量的本文所提供的化合物，这些化合物结合甲状腺素转运蛋白并通过动力学上稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体解聚。
由此，在疾病组织中稳定甲状腺素转运蛋白的方法改善了错重叠并减轻了相关疾病的症状，取决于不同疾病，还可有助于治愈疾病。本文还涉及在组织和/或细胞内抑制甲状腺素转运蛋白错重叠。错重叠的程度，以及由此通过本方法所达到的抑制程度，可通过多种方法进行评价，比如实施例和国际专利申请号WO2004/056315中所述的。上述参考申请在此通过参考全部引入。
本文还提供了治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样蛋白病的一种或多种症状的方法，该方法包括给予治疗有效量的本文所提供的化合物。在一种实施方案中，该化合物通过动力学上稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体分解。甲状腺素转运蛋白淀粉样蛋白病例如可以是家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性。其它的甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病包括但不限于阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob病)、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤(例如参见国际专利申请公开号WO 98/27972和WO95/12815)。
提供通过给予本文所提供化合物治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导的疾病或紊乱的一种或多种症状的方法。甲状腺素转运蛋白介导的疾病和紊乱包括但不限于肥胖症(例如参见国际专利申请公开号WO02/059621)。
还提供了使用本文所提供化合物或组合物稳定TTR四聚体的方法。还提供了使用本文所提供化合物或组合物抑制TTR淀粉样形成的方法。
还提供了本文所述任一化合物或药物组合物在治疗、预防或改三甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(即，家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状中的用途。
还提供了本文所述任一化合物或药物组合物在制备用于治疗、预防或改三甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(如，家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状的药物中的用途。
还提供了制造品、包含包装材料、包装材料内的在此提供的化合物或其药学上可接受的衍生物，其有效地预防TTR错重叠或者治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状，以及指示化合物或组合物或其药学上可接受的衍生物用于调节TTR重叠或用于治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状的标签。
发明详述 A.定义 除非另有定义，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员常规理解的含义。所有专利、申请、公开的申请或其它公开在此通过参考全部引入。当本文某一术语具有多种定义时，除非另有说明，优选本节中的定义。
如本文所用，甲状腺素转运蛋白或TTR是55kDa的均四聚体，特征为2，2，2对称，在二聚体-二聚体界面具有两个同样的漏斗型结合位点，其中甲状腺激素(T4)可结合于血浆和CSF中。TTR通常与低于1当量的全视黄醇结合蛋白相结合。TTR是127-残基蛋白，其在生理条件下四聚化。TTR在血浆中用作甲状腺素的三级转运子且在脑脊液中用作初级载体。TTR通过其与视黄醛结合蛋白的联合也可转运视黄醛。TTR在低pH处形成淀粉样。
如本文所用，化合物的药学上可接受的衍生物包括其盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酯、半缩醛、半缩酮、溶剂化物、水化物或前药。这样的衍生物可由本领域技术人员使用已知的衍生方法方便地制备。所制备的化合物可以施用于动物或人而基本无毒性作用且是药学活性物或前药。药学上可接受的盐包括但不限于胺盐，比如但不限于N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、铵、二乙醇胺和其它羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对-氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它烷基胺，哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；金属盐，比如但不限于锂盐、钾盐和钠盐；碱土金属盐，比如但不限于钡盐、钙盐和镁盐；过渡金属盐，比如但不限于锌盐；以及其它金属盐，比如但不限于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；还包括但不限于矿酸盐，比如但不限于盐酸盐和硫酸盐；有机酸盐，比如但不限于乙酸、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。其它药学上可接受的盐包括酸性盐比如醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、十二硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、乙二酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐与十一酸盐；碱性盐包括铵盐、碱金属盐、比如钠与钾盐、碱土金属盐、比如钙与镁盐、有机碱盐、比如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺，以及与氨基酸比如精氨酸、赖氨酸形成的盐，等等。此外，碱性含氮基团可以被比如低级烷基卤化物季铵化，比如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯，比如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯，长链卤化物比如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基卤化物比如苄基和苯乙基溴化物等。由此可获得水或油溶性或可分散产物。药学上可接受的酯包括但不限于酸性基团的烷基、链烯基、炔基和环烷基酯、酸性基团包括但不限于羧酸、磷酸、亚磷酸、磺酸、亚磺酸和硼酸。药学上可接受的烯醇醚包括但不限于式C＝C(OR)的衍生物，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基或环烷基。药学上可接受的烯醇酯包括但不限于式C＝C(OC(O)R)衍生物，R是氢、烷基、链烯基、炔基或环烷基。药学上可接受的溶剂化物和水化物是化合物与一个或多个溶剂或水分子的复合物，或1-约100，或1-约10，或1-约2、3或4个溶剂或水分子。
如本文所用，治疗意指缓解或有效改变疾病或紊乱的一种或多种症状的方式。治疗还包括任何在药学上使用本文的组合物，比如用于治疗TTR介导的疾病或紊乱，或牵涉TTR包括TTR错重叠的疾病或紊乱。
如本文所用，通过给予具体化合物或药物组合物改善具体紊乱的症状是指任何的减轻，无论持久的或临时的、持续的或暂时的，其得益于施用该组合物或与其相关。
如本文所用IC50是指一种量，在测量试验中，具体的测试化合物达到最大应答如抑制TTR错重叠的50％抑制率时的浓度或剂量。
如本文所用，EC50是指在某一具体应答的50％最大表达处显示剂量-依赖应答的具体化合物浓度或量，该具体应答由具体化合物诱导、刺激或加强。
如本文所用，前药是在体内施用时通过一或多个步骤或过程或其它方式代谢而转化为生物学上、药学上或治疗学上的活性化合物形式的化合物。为了制备前药，修饰药学上活性化合物以使得经代谢过程将重新生成活性化合物。可设计前药以改变药物的代谢稳定性或转运特性，从而掩蔽副作用或毒性，改善药物气味或改变药物的其它特征或性质。基于在体内的药物动力学过程和药物代谢知识，本领域技术人员一旦知晓药学上活性化合物，就可设计该化合物的前药(例如参见，Nogrady(1985)Medicinal ChemistryA Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages 388-392)。
应理解到本文所提供化合物可包含手性中心。这些手性中心可以是(R)或(S)构型，或可以是其混合物。由此，本文所提供化合物可以是对映体纯的，或是立体异构体或非对映体混合物。对于氨基酸残基，这些残基可以是L-或D-形式。天然存在的氨基酸残基的构象通常为L。当没有指定时，残基为L型。如本文所用，术语“氨基酸”是指α-氨基酸，其是外消旋体、或是D-或L-构型。氨基酸名称前的名称″d″(如，dAla、dSer、dVal，等)是指氨基酸的D-异构体。氨基酸名称前的名称″dl″(如，dlPip)是指氨基酸的L-和D-异构体的混合物。应理解到本文所提供化合物的手性中心可在体内被差向异构化。这样，本领域技术人员将认识到给予(R)型化合物，由于化合物在体内被差向异构化，相当于给予其(S)型。
如本文所用，基本上纯的意指通过本领域技术人员用于检测杂质的标准的分析方法比如薄层层析(TLC)、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)进行测定时，足够均匀地表现出不含易于检测的杂质，或者足够纯以至进一步纯化后将检测不出物质的理化性质(比如酶促和生物活性)发生改变。纯化化合物以制备基本上化学纯化合物的方法为本领域技术人员所知。但基本上化学纯化合物可以是立体异构体混合物。此时，进一步纯化可能提高化合物的特异活性。
如本文所用，烷基、链烯基和炔基碳链，除非另有指明，包含1-20个碳原子，或1或2-16个碳原子，是直链或支链的。在某些实施方案中，2-20个碳原子的链烯基碳链包含1-5个双键。在某些实施方案中，2-20个碳原子的炔基碳链包含1-8个三键，在某些实施方案中，2-16个碳原子的炔基碳链包含1-5个三键。本文的烷基、链烯基和炔基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、叔戊基、异己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)。如本文所用，低级烷基、低级链烯基和低级炔基是指含有约1或约2个碳原子、最多约6个碳原子的碳链。如本文所用，“链烯炔基(alk(en)(yn)yl)”是指包含至少一个双键和至少一个三键的烃基。
如本文所用，“环烷基”是指饱和单-或多-环系，某些实施例方案为3-10个碳原子，某些实施方案为3-6个碳原子；环烯基和环炔基是指各自包括至少一个双键和至少一个三键的单-或多环系。环烯基和环炔基在某些实施方案中可包含3-10个碳原子，具有环烯基，在其它实施方案中，包含4-7个碳原子和环炔基，在其它实施方案中，包含8-10个碳原子。环烷基、环烯基和环炔基的环系可由一个或两个或多个环构成，这些环可以以稠合、桥连或螺连的方式连接在一起。“环烯炔基(cycloalk(en)(yn)yl)”是指包含至少一个双键和至少一个三键的环烷基。
如本文所用，“芳基”是指包含6-19个碳原子的芳香单环或多环基团。芳基包括但不限于比如未取代或取代的芴基(fluorenyl)、未取代或取代的苯基以及未取代或取代的萘基。
如本文所用，“杂芳基”是指例如约5-约15元单环或多环芳环系，其中在环系中有一个或多个例如1-3个原子是杂原子，即，碳以外的原子，包括但不限于氮、氧或硫。杂芳基可任选与苯环稠合。杂芳基包括但不限于呋喃基、咪唑基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、喹啉基和异喹啉基。
如本文所用，“杂芳鎓”基是一个或多个杂原子带正电荷的杂芳基。
如本文所用，“杂环基”是指单环或多环非芳香环系，例如3-10元，又例如4-7元、再例如5-6元，其中在环系中的一个或多个例如1-3个原子是杂原子，即，碳以外的原子，包括但不限于氮、氧或硫。当杂原子是氮时，氮原子任选被烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、杂环基烷基、酰基、胍基取代，或者氮原子可以被季铵化形成铵基，其中取代基选自上述取代基。
如本文所用，“芳烷基”是指烷基中的一个氢原子被芳基取代的烷基。
如本文所用，“杂芳烷基”是指烷基中的一个氢原子被杂芳基取代的烷基。
如本文所用，“卤素”、“卤原子”或“卤化物”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用，拟卤素或拟卤化物基是性能与卤素基本相似的基团。这样的化合物可以以与卤化物相同的方法使用或处理。拟卤化物包括但不限于氰化物、氰酸酯、硫氰酸酯、硒氰酸酯、三氟甲氧基和叠氮。
如本文所用，“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤原子取代的烷基。这样的基团包括但不限于氯甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟乙基。
如本文所用，“卤烷氧基”是指其中R是卤代烷基的RO-。
如本文所用，“亚磺酰基”或“亚硫酰基”是指-S(O)-。如本文所用，“磺酰基”或“砜基”是指-S(O)2-。如本文所用，“磺基”是指-S(O)2O-。
如本文所用，“羧基”是指二价基团-C(O)O-。
如本文所用，“氨基羰基”是指-C(O)NH2。
如本文所用，“烷基氨基羰基”是指其中R是烷基包括低级烷基的-C(O)NHR。如本文所用，“二烷基氨基羰基”是指其中R′和R独立是烷基包括低级烷基的-C(O)NR′R；“羧酰胺”是指其中R′和R独立是烷基包括低级烷基的-NR′COR。
如本文所用，“二芳基氨基羰基”是指其中R和R′独立选自芳基包括低级芳基比如苯基的-C(O)NRR′。
如本文所用，“芳基烷基氨基羰基”是指R和R′之一选自芳基包括低级芳基比如苯基且R和R′之一是烷基包括低级烷基的-C(O)NRR′。
如本文所用，“芳基氨基羰基”是指其中R是芳基包括低级芳基比如苯基的-C(O)NHR。
如本文所用，“羟基羰基”是指-COOH。
如本文所用，“烷氧羰基”是指其中R是烷基包括低级烷基的-C(O)OR。
如本文所用，“芳氧羰基”是指其中R是芳基包括低级芳基比如苯基的-C(O)OR。
如本文所用，“烷氧”和“烷硫”是指其中R是烷基包括低级烷基的RO-和RS-。
如本文所用，“芳氧”和“芳硫”是指R是芳基包括低级芳基比如苯基的RO-和RS-。
如本文所用，“亚烷基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有1-约20个碳原子，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚烷基包括低级亚烷基。任选沿着该亚烷基插入一个或多个氧、硫包括S(＝O)和S(＝O)2基团、或取代或未取代的氮原子包括-NR-和-N+RR-基团，其中氮取代基是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或COR′，其中R′是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、-OY或-NYY，其中Y是氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基。亚烷基包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-(CH2)3-)、甲撑二氧基(-O-CH2-O-)和乙撑二氧基(-O-(CH2)2-O-)。术语“低级亚烷基”是指具有1-6个碳原子的亚烷基。在某些实施方案中，亚烷基是低级亚烷基，包括1-3个碳原子的亚烷基。
如本文所用，“氮杂亚烷基”是指-(CRR)n-NR-(CRR)m-，其中n和m各自独立是0-4的整数。如本文所用，“氧杂亚烷基”是指-(CRR)n-O-(CRR)m-，其中n和m各自独立是0-4的整数。如本文所用，“硫代亚烷基”是指-(CRR)n-S-(CRR)m-、-(CRR)n-S(＝O)-(CRR)m-和-(CRR)n-S(＝O)2-(CRR)m-，其中n和m各自独立是0-4的整数。
如本文所用，“亚链烯基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有2-约20个碳原子和至少一个双键，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚链烯基包括低级亚链烯基。任选沿着该亚链烯基插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亚链烯基包括但不限于-CH＝CH-CH＝CH-和-CH＝CH-CH2-。术语“低级亚链烯基”是指具有2-6个碳原子的亚链烯基。在某些实施方案中，亚链烯基是低级亚链烯基，包括3-4个碳原子的亚链烯基。
如本文所用，“亚炔基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有2-约20个碳原子和至少一个三键，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚炔烯基烯包括低级亚烯基。任选沿着该亚烯基插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亚炔基包括但不限于-C≡C-C≡C-、-C≡C-和-C≡C-CH2-。术语“低级亚烯基”是指具有2-6个碳原子的亚炔基。在某些实施方案中，亚炔基是低级亚炔基，包括3-4个碳原子的亚炔基。
如本文所用，“亚链烯炔基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有2-约20个碳原子以及至少一个三键和至少一个双键，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚链烯炔烯基包括低级亚链烯炔基。任选沿着该亚链烯炔基插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亚链烯炔基包括但不限于-C＝C-(CH2)n-C≡C-，其中n是1或2。术语“低级亚链烯炔基”是指具有高至6个碳原子的亚链烯炔基。在某些实施方案中，亚链烯炔基是低级亚炔基，包括约4个碳原子的亚链烯炔基。
如本文所用，“环亚烷基”是指二价的饱和的单-或多环环系，例如具有3-10个碳原子，再例如3-6个碳原子；环亚烯基和环亚炔基是指各自包括至少一个双键和至少一个三键的二价单-或多环环系。环亚烯基和环亚炔基例如可以包含3-10个碳原子，环亚烯基例如包含4-7个碳原子以及环亚炔基例如包含8-10个碳原子。环亚烷基、环亚烯基和环亚炔基的环系可以由一个环或两个或多个环构成，这些环可以以稠合、桥连或螺连的方式连接在一起。“环亚链烯炔基”是指包含至少一个双键和至少一个三键的环亚烷基。
如本文所用，“亚芳基”是指单环或多环例如单环的二价芳基，例如具有5-约20个碳原子和至少一个芳环，又例如5-12个碳原子。在其它实施方案中，亚芳基包括低级亚芳基。亚芳基包括但不限于1，2-、1，3-和1，4-亚苯基。术语“低级亚芳基”是指具有6个碳原子的亚芳基。
如本文所用，“亚杂芳基”是指二价的单环或多环芳香环系，例如约5-约15个环原子，其中一个或多个例如1-3个环系原子是杂原子，即，除碳外的元素，包括但不限于氮、氧或硫。术语“低级亚杂芳基”是指具有5或6个环原子的亚杂芳基。
如本文所用，“亚杂环基”是指二价的单环或多环非芳香环系，例如3-10元、例如4-7元、又例如5-6元，其中一个或多个包括1-3个环系原子是杂原子，即，除碳外的元素，包括但不限于氮、氧或硫。
如本文所用，“取代的烷基”、“取代的链烯基”、“取代的炔基”、“取代环烷基”、“取代的环烯基”、“取代的环炔基”、“取代的芳基”、“取代的杂芳基”、“取代的杂环基”、“取代的亚烷基”、“取代的亚链烯基”、“取代的亚炔基”、“取代的环亚烷基”、“取代的环亚烯基”、“取代的环亚炔基”、“取代的亚芳基”、“取代的亚杂芳基”和“取代的亚杂环基”是指各自被一个或多个取代基例如一、二、三或四个取代基取代的烷基、链烯基、炔基、环烷基、环炔基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、亚烷基、亚炔基、亚链烯基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、亚芳基、亚杂芳基和亚杂环基，其中取代基如本文定义，例如选自Q1。
如本文所用，“烷叉基”是指二价基团，比如＝CR′R″，其与另一基团的一个原子相连，形成双键。烷叉基包括但不限于甲叉基(＝CH2)和乙叉基(＝CHCH3)。如本文所用，“芳基烷叉基”是指其中R′或R″是芳基的烷叉基。环烷叉基是其中R′与R″相连形成碳环的那些基团。“杂环叉基(Heterocyclylidene)”是指其中R′和R″至少之一在链中包含杂原子且R′与R″相连形成杂环的那些基团。
如本文所用，“酰胺”是指二价基团-C(O)NH-。“硫代酰胺”是指二价基团-C(S)NH-。“氧基酰胺(Oxyamido)”是指二价基团-OC(O)NH-。“硫酰胺(Thiaamido)”是指二价基团-SC(O)NH-。“二硫酰胺(dithiaamido)”是指二价基团-SC(S)NH-。“脲基(Ureido)”是指二价基团-HNC(O)NH-。“硫脲基(Thioureido)”是指二价基团-HNC(S)NH-。
如本文所用，“氨基脲(semicarbazide)”是指-NHC(O)NHNH-。“肼甲酸(Carbazate)”是指二价基团-OC(O)NHNH-。“异硫肼甲酸(Isothiocarbazate)”是指二价基团-OC(S)NHNH-。“磺酰肼(sulfonylhydrazide)”是指二价基团-SO2NHNH-。“酰肼”是指二价基团-C(O)NHNH-。“偶氮”是指二价基团-N＝N-。“肼基”是指二价基团-NH-NH-。
当没有指定任何给定的取代基的数目时(如，卤代烷基)，可以存在有一个或多个取代基。例如，“卤代烷基”可以包括一个或多个相同或不同的卤原子。又例如，“C1-3烷氧苯基”可以包括一个或多个相同或不同的包含一个、两个或三个碳原子的烷氧基。
如本文所用，任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写，除非另有说明，均与它们常规使用的、公认的缩写或IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(参见(1972)Biochem.11942-944)相一致。
B.TTR和淀粉样蛋白病 至少某些淀粉样蛋白病显示了是由超过20种非同源蛋白或蛋白片段的任何之一沉积而引起的，最终导致纤丝交联-β-层四级结构。由正常重叠的蛋白如甲状腺素转运蛋白蛋白形成淀粉样纤丝时需要蛋白错重叠以形成装配-竞争中间体。甲状腺素转运蛋白蛋白(TTR)淀粉样化的过程表明引起三种不同的淀粉样疾病--老年全身性淀粉样变性(SSA)、家族性淀粉样多神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。SSA与野生型TTR的沉积相关，而FAP和FAC则是由超过80种TTR变异体之一的淀粉样化引起的。例如参见，Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-60；Kelly，J.W.Curr.Opin.Struct.Biol.1996，6，11-7；Liu，K.；et al.Nat.Struct.Biol.2000，7，754-7；Westermark，P.；et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-5；Saraiva，M.J.；et al.J.Clin.Invest.1985，76，2171-7；Jacobson，D.R.；et al.N.Engl.J.Med.1997，336，466-73；Buxbaum，J.N.；Tagoe，C.E.Ann.Rev.Med.2000，51，543-569以及Saraiva，M.J.Hum.Mutat.1995，5，191-6，其各自在此全部引入作为参考。
TTR是55kDa的均四聚体，特征为2，2，2对称，在二聚体-二聚体界面具有两个同样的漏斗型结合位点，其中甲状腺激素(T4)可结合于血浆和CSF中。TTR通常与低于1当量的全视黄醇结合蛋白相结合。TTR错重叠包括四聚体解聚成单体，随后单体内的三级结构改变，使得蛋白可能错装配，最终淀粉样变性。FAP的可行疗法采用了由肝移植介导的基因疗法以使用野生型(WT)蛋白替代血液中的TTR变异体。对于多数FAC或SSA患者而言，该治疗不可行，原因是多数患者超过60岁且因为他们的健康状况和受损的心功能而无法成为肝移植的候选人。此外，与FAP相关的若干TTP变异体，在肝移植后发生了进行性淀粉样心肌病，wt TTR在心肌组织沉积，导致死亡。肝移植疗法对于约10种TTR变异体也将无效，因为该TTR由脉络丛合成，其在柔脑脊膜中沉积淀粉样纤丝，导致CNS疾病。因此，需要开发通用的非侵入性药物治疗策略。还需要非蛋白、非肽或非核苷的药物。例如参见，Blake，C.C.；et al.J.Mol.Biol.1978，121，339-56；Wojtczak，A.；et al.Acta Crystallogr.，Sect.D 1996，758-810；Monaco，H.L.；Rizzi，M.；Coda，A.Science 1995，268，1039-41；Lai，Z.；Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry1996，35，6470-82；Holmgren，G.；et al.Lancet 1993，341，1113-6；Suhr，O.B.；Ericzon，B.G.；Friman，S.Liver Transpl.2002，8，787-94；Dubrey，S.W.；et al.Transplantation 1997，64，74-80；Yazaki，M.；et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，702-6；和Cornwell，C.G.III；et al.Am.J.ofmed.1983，75，618-623，各文献通过参考在此全部引入。
C.化合物 在一种实施方案中，用于本文所提供的组合物和方法中的化合物具有式IA结构
其中Y是COOH、四唑基、CONHOH、B(OH)2OH； X是O；以及 R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH、B(OH)2或CF3。
在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中Y是COOH。在另一实施方案中，Y是四唑基、B(OH)2或CONHOH。在另一实施方案中，Y是OH。
在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和OH。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中其中R1、R2和R3各自独立选自氢和CF3。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1和R2各自独立是氢且R3是CF3。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH和B(OH)2。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、Br和I。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和OH。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和B(OH)2。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1和R2各自是卤素且R3是B(OH)2。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1和R2各自是卤素且R3是H。
在另一实施方案中，化合物具有下式结构，
在另一实施方案中，本文提供的化合物具有下式结构
或其药学上可接受的衍生物，其中Het、X和Y如本文其它地方定义。
在另一实施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。在另一实施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、烷基或卤代烷基取代。在另一实施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任选被三氟甲基、氯或甲基取代。
在另一实施方案中，本文所提供化合物选自
D.化合物的制备 本文所提供的化合物可通过下面所示的和实施例中的方法制备，或通过本领域技术人员公知的其它方法制备。这些合成方法中的起始物可以是通过商业渠道获得(如，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)。
试剂和溶剂购自Aldrich，Lancaster，Acros，Combi-Blocks，Matrix和Pfaltz-Bauer。THF和CH2Cl2经Al2O3干燥。其它溶剂和试剂由供应商提供且除非另有说明无需进一步纯化即可使用。使用在硅胶60F254预铺板上的分析型薄层色谱(TLC)采用购自EM Science的荧光显示器监测反应。观察TLC板时的同时，进行UV荧光、磷钼酸处理随后加热、或者钼酸铈铵处理随后加热。进行快速层析时使用EM Science的硅胶60(230-400目)。对于文中所述结论必要的新化合物的纯度经HPLC测定。进行正相HPLC时使用Waters 600泵/控制器，Waters 996光电二极管排列检测器和WatersNovaPak硅胶柱。所用的溶剂系统是己烷和乙酸乙酯，洗脱梯度在30分钟从50∶50己烷∶乙酸乙酯至0∶100己烷∶乙酸乙酯。进行反相HPLC时使用Waters 600泵/控制器，Waters 2487双波长检测器和Vydac蛋白和肽C18柱。溶剂系统A是含0.5％三氟乙酸的95∶5水∶乙腈，溶剂B是含0.5％三氟乙酸的5∶95水∶乙腈。梯度洗脱在20分钟由100∶0 A∶B-0∶100 A∶B并于100％B维持10分钟。在AVIV Instruments波谱仪202SF模式上进行圆二色谱。在Varian FT NMR波谱仪上以400MHz质子频率剂量NMR谱。除非另有说明，参照作为内化学位移标准的CHCl3(7.26ppm)以每百万份(ppm)为单位记录质子化学位移。以赫兹(Hz)为单位记录偶合常数。除非另有说明，参照作为内化学位移标准的CDCl3(77.23ppm)以每百万份(ppm)为单位记录碳化学位移。
苯并噁唑合成的一般方法 氨基羟基苯甲酸(0.2mmol)在THF(3mL)中的混合物相继经吡啶(500μl，0.6mmol)和所需的酰氯(0.2mmol)处理。于环境温度搅拌反应10h，回流1h，真空浓缩，无需纯化用于后面步骤中。
将对-甲苯磺酸单水合物(380.4mg，2.0mmol)加入粗反应混合物的二甲苯(5mL)溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。12h后，将反应物冷至环境温度，用NaOH(2mL，1N)猝灭，分离各相。水层经HCI(1N)酸化至pH2并用EtOAc(4×3mL)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将所得残留物溶解于MeOH∶苯(2mL；1∶4)的混合物中，于25℃用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)处理，通过TLC监测反应过程(通常在0.5h后反应完全)。真空浓缩反应混合物，残留物经层析(10-25％EtOAc/己烷梯度)得到所需的苯并噁唑甲酯。
将苯并噁唑甲酯溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)混合物中并用LiOH.H2O(4当量)处理。于环境温度搅拌反应物并经TLC监测。反应完全后，混合物经1N HCI酸化至pH2，用EtOAc(4×)萃取。合并的有机层经MgS04干燥，过滤并浓缩。残留物经制备薄层层析(4.9％MeOH，95％CH2Cl2，0.1％HOAc)得到产物，为白色固体。
可供选择地，化合物可如下所示制备。
氨基羟基苯甲酸(0.2mmol)在THF(3mL)中的混合物相继经吡啶(500μl，0.6mmol)和所需的酰氯(0.2mmol)处理。于环境温度搅拌反应10h，回流1h，真空浓缩，无需纯化用于后面步骤中。
将对-甲苯磺酸单水合物(380.4mg，2.0mmol)加入粗反应混合物的二甲苯(5mL)溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。12h后，将反应物冷至环境温度，用NaOH(2mL，1N)猝灭，分离各相。水层经HCI(1N)酸化至pH2并用EtOAc(4×3mL)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。(不必含水操作)将所得残留物溶解于MeOH∶苯(2mL；1∶4)的混合物中，于25℃用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)处理，通过TLC监测反应过程(通常在0.5h后反应完全)。真空浓缩反应混合物，残留物经层析(10-25％EtOAc/己烷梯度)得到所需的苯并噁唑甲酯。将苯并噁唑甲酯溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)混合物中并用LiOH·H2O(4当量)处理。于环境温度搅拌反应物并经TLC监测。反应完全后，混合物经1N HCI酸化至pH2，用EtOAc(4×)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。残留物经制备薄层层析(4.9％MeOH，95％CH2Cl2，0.1％HOAc)得到产物，为白色固体。
可供选择的路线 在共沸除去水的二甲苯中进行反应。含水操作后，过滤沉淀的固体并溶解于乙酸乙酯中，用己烷稀释，搅拌30分钟，然后滤除沉淀物并浓缩滤液至10ml，过滤固体沉淀得到纯化合物为乳酪色(cream color)固体。
E.药物组合物的配制 本文提供的药物组合物包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的本文提供的一种或多种化合物，其适用于预防、治疗、或缓解与甲状腺素转运蛋白(TTR)错重叠相关或牵涉TTR错重叠的疾病或紊乱的一种或多种症状。与TTR错重叠相关的疾病或紊乱包括但不限于家族性淀粉样多发性神经病、家族性淀粉样心肌病、老年全身性淀粉样变性、阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob disease)、多发性神经病、II型糖尿病、甲状腺髓质瘤和肥胖症。适用于给予本文提供化合物的载体包括本领域技术人员已知的适用于具体给药方式的任何载体。
此外，可将化合物配制为组合物中的单一药学活性成分或可与其它活性成分相联合。
组合物包含本文提供的一种或多种化合物。在一种实施方案中，这些化合物被配制在适宜的药物制剂中，比如溶液、悬浮液、片剂、分散片、丸剂、胶囊、粉末剂、缓释制剂或酏剂，口服或胃肠外给药的无菌溶液或悬浮液，以及透皮补片制剂或干粉吸入剂。在一种实施方案中，使用本领域公知的技术和方法将上述化合物被配制在药物组合物中(例如参见，AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms，Fourth Edition 1985，126)。
在这些组合物中，将有效浓度的一种或多种化合物或其药学上可接受的衍生物与适宜的药学载体相混合。如上所述，这些化合物可以被衍生为相应的盐、酯、烯醇醚或酯、缩醛、缩酮、原酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂化物、水合物或配制之前的前药。组合物中化合物的浓度，在给药后，可有效释放以治疗、预防或改善与甲状腺素转运蛋白(TTR)错重叠相关或牵涉TTR错重叠的疾病或紊乱的一种或多种症状。
在一种实施方案，将组合物配制为单一剂量给药。配制组合物时，将一定重量的化合物溶解于、悬浮、分散或混合于所选载体中，其浓度足以减轻、预防所治疗病情或缓解一种或多种症状。
在药学上可接受载体内包含的活性化合物的量足以对于所治疗的患者产生治疗有益效果而没有不合意的副作用。通过在体外和体内体系中测试化合物然后由此外推用于人的剂量，即可凭经验确定治疗有效浓度。
药物组合物中活性化合物的浓度将取决于活性化合物的吸收、灭活和排泄速率、化合物的理化特性、剂量方案、给药量以及本领域技术人员已知的其它因素。例如，使给药量足以缓解与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的疾病或紊乱的一种或多种症状，如本文所述。
在一种实施方案中，治疗有效量将产生约0.1ng/ml-约50-100μg/ml的活性成分血浆浓度。在另一种实施方案中，药物组合物将提供约0.001mg-约2000mg化合物每千克体重每天的剂量。
制备药物剂量单位形式以提供约0.01mg、0.1mg或1mg-约500mg、1000mg或2000mg以及在一种实施方案中约10mg-约500mg活性成分或必要成分组合的每剂量单位形式。
活性成分可以一次给药，或可分成若干较小剂量间隔给药。应理解到，准确剂量和疗程是所治疗疾病的函数，可使用已知的测试法或由体内或体外测试数据外推而凭经验确定。应注意，浓度和剂量值还可随着所缓和的病情的严重程度而改变。还应理解到对于任何具体受试者，应根据个体需要和给药者或监督者的专业判断随着时间调整特定的剂量方案，在此阐明的浓度范围仅是例示性的且不意在限制所要求的组合物的范围和实践。
在化合物的溶解度不足的情况下，可以使用增加化合物溶解度的方法。这些方法为本领域技术人员已知且包括但不限于使用辅溶剂比如二甲基亚砜(DMSO)、使用表面活性剂比如
、或在碳酸氢钠水溶液中溶解。还可使用这些化合物的衍生物比如化合物的前药配制有效的药物组合物。
在混合或加入化合物时，所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等。所得混合物的形式取决于大量因素，包括预期的给药方式和化合物在所选载体或媒介内的溶解度。有效浓度足以充分缓解疾病症状、所治疗的紊乱或病情并可凭经验确定。
以单位剂型将药物组合物提供给人和动物，比如包含适宜量化合物或其药学上可接受衍生物的片剂、胶囊、丸剂、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或悬浮液、口服溶液或悬浮液以及油-水乳剂。在一种实施方案中，药学上有疗效的活性化合物或其衍生物被配制于单位剂型或多剂型内或以此给药。本文所用的单位剂型是指适用于人或动物受试者的物理上分离且如本领域已知分别包装的单位。各单位剂量包含预定量的治疗活性化合物，其足以产生所需的疗效，且与所需的药物载体、媒介物或稀释剂相联合。单位剂型例如包括安瓿和注射器以及分别包装的片剂或胶囊。单位剂型可以分份或多次给药。多剂型是包装在单一容器中的多个同样的单位剂型，其以分离的单位剂型给药。多剂型例如包括小瓶、片剂或胶囊瓶或品脱或加仑瓶。由此，多剂型是在包装中无法分离的多个单位剂量。
液态药学上可给药的组合物例如可以通过溶解、分散或混合上述活性化合物与载体中任选的药物辅料如水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等从而形成溶液或悬浮液而制备。需要时，所给药的药物组合物还可包含少量无毒的辅助物比如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等试剂。
制备这些剂型的实际方法对于本领域技术人员是已知的或是显然的，例如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，15th Edition，1975。
可制备包含0.005％-100％活性成分且余量由无毒载体构成的剂型或组合物。本领域技术人员已知制备这些组合物的方法。所述组合物可包含0.001％-100％活性成分，在一种实施方案中为0.1-95％，在另一种实施方案中为75-85％。
1、口服给药的组合物 口服药物剂型是固体、凝胶或液体。固体剂型是片剂、胶囊、颗粒剂或散装粉末剂。口服片剂的类型包括压缩、可咀嚼的锭剂和肠溶包衣、糖包衣或膜包衣的片剂。胶囊可以是硬或软明胶胶囊，同时颗粒和粉末可以以非泡腾或联合有本领域技术人员已知的其它成分的泡腾形式提供。
a.口服的固体组合物 在某些实施方案中，制剂是固体剂型，在一种实施方案中是胶囊或片剂。片剂、丸剂、胶囊、药片等可包含一种或多种下列组分下列成分或类似性质的化合物粘合剂、润滑剂、稀释剂、助流剂、崩解剂、着色剂、甜味剂、增香剂、润湿剂、催吐剂层和膜包衣。粘合剂例如包括微晶纤维素、黄蓍树胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、凝胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯基吡咯烷酮、交联聚乙烯聚吡咯烷酮、蔗糖与浆糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或者钙、石松子(lycopodium)与硬脂酸。稀释剂例如包括乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露糖醇与磷酸二钙。助流剂包括但不局限于胶体二氧化硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟基乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、皂土、甲纤维素、琼脂与羧甲基纤维素。着色剂例如包括任何批准的经证明是水溶性的FD和C染料及其混合物；以及悬浮于氧化铝水合物上的水不溶性FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露糖醇与人造的甜味剂比如糖精，以及许多喷雾干燥香料。增香剂包括从植物比如果实中提取的天然香料和能产生欣快感的合成化合物的混合物比如但不限胡椒薄荷与水杨酸甲酯。润湿剂包括单硬脂酸丙二醇酯、单油酸山梨醇酐酯、二甘醇月桂酸酯与聚氧化乙烯月桂醚。催吐层包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、氨合物虫胶与醋酞纤维素。膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和乙酸酞酸纤维素。
化合物或其药学上可接受的衍生物可在防止其接触胃酸环境的组合物中提供。例如，组合物可以被配制于肠溶衣内，在胃内保持了其完整性并在肠内释放活性化合物。组合物还可与抗酸剂或其它这样的成分联合配制。
当单位剂型是胶囊时，除上述类型物质外，其可包含液体载体比如脂肪油。此外，单位剂型可包含多种修改剂型物理形式的其它物质，例如糖和其它肠溶试剂的包衣。这些化合物还可作为酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片口香糖等。除了活性化合物，糖浆可包含作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂和芳香剂。
活性物还可与不损害所需作用的其它活性物混合，或与补充所需作用的物质比如抗酸剂、H2阻滞剂和利尿剂。活性成分是本文所述的化合物或其药学上可接受的衍生物。可包括更高浓度，高达98％重量份的活性成分。
在所有实施方案中，为了修改或延缓活性成分的溶解，片剂和胶囊剂可如本领域技术人员已知的方式包衣。由此，例如可用常规的肠溶可消化包衣比如水杨酸苯酯、蜡和乙酸酞酸纤维素进行包衣。
b.口服的液体组合物 液体口服剂型包括水溶液、乳剂、悬浮剂、由非泡腾颗粒再构成的溶液和/或悬浮液。水溶液例如包括酏剂和糖浆。乳剂可以是水包油或油包水。
酏剂是澄清的、甜的或水醇制剂。用于酏剂的药学上可接受的载体包括溶剂。糖浆可以是糖如蔗糖的浓水溶液并可包含防腐剂。乳剂是两相体系，其中一种液体以小颗粒形式分散在另一液体中。用于乳剂的药学上可接受的载体是非水液体、乳化剂和防腐剂。用于非泡腾颗粒再构成液体口服剂型的药学上可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。用于泡腾颗粒再构成液体口服剂型的药学上可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。着色剂和芳香剂用于上述所有剂型中。
溶剂包括甘油、山梨醇、乙醇和糖浆。防腐剂例如包括甘油、对羟苯甲酸甲酯和丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和醇。用于乳剂的非水溶液例如包括矿油和棉花籽油。乳化剂例如包括凝胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、皂土和表面活性剂比如聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯。悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、黄蓍胶、硅酸镁铝与阿拉伯胶。
甜味剂包括蔗糖、糖浆、甘油和人造甜味剂比如糖精。润湿剂包括单硬脂酸丙二醇酯、单油酸山梨醇酐酯、二甘醇月桂酸酯和聚氧化乙烯月桂基醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括批准的经证明是水溶性的FD和C染料及其混合物。芳香剂包括从植物如果实提取的天然香料和产生欣快味觉的合成化合物的掺合物。
对于固体剂型，在例如碳酸丙烯、植物油或甘油三酯中溶液或悬浮液是包封在明胶胶囊内的一种实施方案。该溶液及其制剂和包封，公开于美国专利号4,328,245、4,409,239和4,410,545中。对于液体剂型，例如在丙二醇中的溶液可经足量的药学上可接受的液体载体如水稀释从而便于测量给药。
可供选择地，制备液体或半固体口服制剂时，可将活性化合物或盐溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)和其它这样的载体中，并在硬或软明胶胶囊壳中包封这些溶液或悬浮液。其它有用的制剂包括美国专利号RE28,819和4,358,603中阐述的那些。简言之，这些制剂包括但不限于包含本文提供的化合物、二烷基化单-或多-亚烷基二醇，包括但不限于1，2-二氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的大约平均分子量，一种或多种抗氧化剂比如丁酸化的羟基甲苯(BHT)、丁酸化的羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、氢醌、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、马来酸、山梨醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯、二硫代氨基甲酸酯。
其它制剂包括但不限于包括药学上可接受的缩醛的含水醇溶液。用于这些制剂的醇是任何药学上可接受的水混溶溶剂，其具有一个或多个羟基，包括但不限于丙二醇和乙醇。缩醛包括但不限于低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛比如乙醛二乙基缩醛。
2、注射剂、溶液和乳剂 此处还涉及胃肠外给药，在一种实施方案中的特征为皮下、肌内或静脉内注射。注射剂可被制备为常规形式，为液体溶液或悬浮液，适于在注射前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或为乳剂。注射剂、溶液和乳剂还包含一种或多种赋形剂。适宜的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。此外，需要时，所给予的药物组合物还可包含少量非毒性辅助物比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它这样的物质如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
在此还涉及缓慢释放或延迟释放系统的植入剂，从而维持恒定水平的剂量(例如参见美国专利号3,710,795)。简言之，将本文提供的化合物分散于固体惰性基质内，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、可塑的或不可塑的聚氯乙稀、可塑的尼龙、可塑的聚亚乙基对苯二酸、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水聚合物比如丙烯酸和甲基丙烯酸酯的水凝胶、胶原、交联聚乙烯醇和交联部分水解的聚乙酸乙烯酯，其被外围的聚合膜如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅烷、氯丁橡胶、氯化的聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯、亚乙烯基氯化物、乙烯和丙烯的共聚物、聚乙烯对苯二酸盐离聚物、丁基橡胶表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和在体液中不溶的乙烯/乙烯基氧基乙醇共聚物所包围。这些化合物以控释速率步骤扩散通过外部的聚合物膜。包含在这些胃肠外组合物中的活性化合物的百分比高度取决于其特定形式以及化合物的活性和受试者的需要。
组合物的胃肠外给予包括静脉内、皮下和肌内给药。胃肠外给药的制剂包括便于注射的无菌溶液、便于恰在使用前与溶剂相混合的无菌干燥可溶产品比如冻干粉，包括皮下片、便于注射的无菌悬浮液、便于恰在使用前与媒介物相混合的无菌干燥不溶产品和无菌乳剂。溶液可以是水溶液或非水溶液。
如果静脉内给药，适宜的载体包括生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS)，包含增稠剂和增溶剂的溶液比如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
药学上可接受的用于肠胃外制剂的载体包括含水媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、多价螯合剂或者螯合剂及其它药学上可接受的物质。
含水媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射、葡萄糖与乳酸盐林格注射液。非水的肠胃外媒介物包括植物源的固定油类、棉子油、玉米油、芝麻油与花生油。必须将抑菌或抑霉剂浓度的抗微生物剂加入到被包装在成倍剂量容器内的肠胃外制剂中，包括石炭酸或者甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、对-羟基苯甲酸甲酯或丙酯、硫柳汞、氯苄烷铵与氯化苄乙氧铵。等渗剂包括氯化钠与葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐与柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮与分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素与聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯85(TWEEN 80)。金属离子的多价螯合剂或者螯合剂包括乙二胺四乙酸。药物载体还包括用于水溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇与丙二醇；以及用于pH调整的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或者乳酸。
调整药学活性化合物的浓度以使得注射剂提供有效量从而产生所需的药理作用。准确剂量取决于患者或动物的年龄、体重和病情，这是本领域已知的。
将单位剂量的胃肠外制剂包装于安瓿、小瓶或带针头的注射剂中。胃肠外给药的所有剂型必须是无菌的，如本领域已知和实践的那样。
如所举例说明的，包含活性化合物的无菌水溶液的静脉内或动脉内灌注是有效的给药方式。另一实施方案是无菌水溶液或油溶液或悬浮液，其包含必要的活性物从而产生所需药理学作用。
注射剂被设计为局部和全身给药。在一种实施方案中，治疗有效剂量被配制为包含至少约0.1％w/w高至约90％w/w或更高的浓度，在某些实施方案中给予所治疗的组织超过1％w/w的活性物质。
化合物可以以微粉化或其它适当形式悬浮，或可经衍生以产生溶解性更佳的活性产物或产生前药。所得混合物的形式取决于许多因素，包括预期的给药方法和化合物在所选载体或媒介物中的溶解度。有效浓度足以缓解病情的症状并可凭经验确定。
3、冻干粉 本文还关注冻干粉，其可重构成溶液、乳剂和其它混合物给药。它们还可重构并被配制为固体或凝胶。
制备无菌、冻干粉时，在适宜溶剂中溶解本文提供的化合物或其药学上可接受的衍生物。溶剂可包含改善稳定性的赋形剂或者其它药理学成分粉末或由粉末制备的重构溶液。可用的赋形剂包括但不限于葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖和其它适宜的试剂。在一种实施方案中，于约中性pH处，溶剂还可包含缓冲剂比如柠檬酸盐、磷酸钠或钾或本领域技术人员已知的其它缓冲剂。随后无菌过滤溶液并接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干就提供了所需的剂型。在一种实施方案中，所得溶液将被分配于小瓶内从而冻干。各小瓶将包含单一剂量或多级的化合物。冻干粉可在适当条件下储存，比如于约4℃至室温。
该冻干粉与注射用水重构成用于胃肠外给药的制剂。为了重构，将冻干粉加入无菌水或其它适宜载体中。准确量取决于所需的化合物。该量可凭经验确定。
4、局部给药 如局部和全身给药所述制备局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂等等并可以被配制为乳剂、凝胶剂、膏剂、乳剂、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂(irrigation)、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤补片或者任何其它适于局部给药的制剂。
可将化合物或其药学上可接受的衍生物配制为局部施用的气雾剂，比如吸入剂(例如参见美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其公开给予适用于治疗炎症疾病特别是哮喘的甾类的气雾剂)。这些给予呼吸道的制剂可以是气雾剂或喷雾溶液的形式，或可以是单独或与其它惰性载体比如乳糖相混合的用于吹入的微粉粉末。此时，制剂的颗粒，在一种实施方案中直径低于50微米，在一种实施方案中低于10微米。
化合物可被配制为局部(local or topical)施用，比如以凝胶、乳剂和洗剂的形式局部施用于皮肤和粘膜，比如眼中，以及施用于眼或脑池内(intracisternal)或脊柱内施用。局部给药涉及透皮给药以及眼或粘膜给药或吸入治疗。还可给予单独的或与其它药学上可接受赋形剂相混合的活性化合物的鼻腔溶液。
这些溶液，特别是预期用于眼科的那些，可以被配制为0.01％-10％等渗溶液、pH约为5-7，含有适当盐。
5、用于其它给药途径的组合物 本文还涉及其它的给药途径比如包括离子电渗疗法和电泳装置的透皮补片、口腔和直肠给药。
透皮补片，包括离子电渗疗法(iotophoretic)和电泳装置为本领域技术人员已知。例如，这些补片公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中。
例如，用于直肠给药的药物剂型是全身效果的直肠栓剂、胶囊和片剂。本文所用的直肠意指用于插入直肠的固体，其在体温处熔融或软化从而释放一种或多种药理上或治疗上有效的活性成分。用于直肠的药学上可接受的物质是基质或媒介物以及提高熔点的试剂。基质例如包括可可油(可可脂)、甘油-明胶、碳蜡(聚乙二醇)和脂肪酸单-、二-和甘油三酯的适当混合物。可使用多种基质的联合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸油和蜡。直肠栓剂可通过压制法或模铸法制备。直肠栓剂的重量，在一种实施方案中为约2-3gm。
使用同样的药学上可接受物质并通过与配制口服制剂相同的方法制造用于直肠给药的片剂和胶囊。
6、靶向制剂 本文所提供的化合物或其药学上可接受的衍生物还可被配制为靶向所治疗受试者身体的具体组织、受体或其它区域。许多这样的靶向方法为本领域技术人员公知。所有这样的靶向方法在此意在用于本组合物。靶向方法的非限制性实例例如参见美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。
在一种实施方案中，脂质体悬浮液，包括靶向组织的脂质体，比如靶向肿瘤的脂质体，还可适用作药学上可接受的载体。还可根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，脂质体可如美国专利号4,522,811所述制备。简言之，脂质体比如多层囊泡(MLV′s)可通过在烧瓶内干燥鸭蛋磷脂酰胆碱和脑磷脂酰丝氨酸(7∶3摩尔比)而形成。将本文提供化合物加入到不含二价阳离子的磷酸缓冲盐水(PBS)中溶液并振动烧瓶直至脂膜分散。洗涤所得囊泡以除去未包封的化合物、离心成球，然后再悬浮于PBS中。
7、制造品 化合物或药学上可接受的衍生物可被包装成制造品，其包含包装材料、包装材料内的在此提供的化合物或其药学上可接受的衍生物，其有效地预防TTR错重叠或者治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状，以及指示化合物或组合物或其药学上可接受的衍生物用于调节TTR重叠或用于治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状的标签。
在此提供的制造品包含包装材料。用于包装药品的包装材料也为本领域技术人员所知。例如参见美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药物包装材料例如包括但不限于泡包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶容器、注射器、瓶子和适于所选制剂以及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。在此涉及这里提供的化合物和组合物的大量制剂，其作为对于其中涉及TTR错重叠作为介导或有助于症状或病因的任何疾病或紊乱的许多疗法。
F.化合物活性的评价 使用了许多体外测试来评价化合物稳定甲状腺素转运蛋白四聚体或预防纤丝形成的能力。这些测试包括纤丝形成测验、血浆选择性测验、甲状腺素转运蛋白化合物复合物三维结构的确定(如，通过X-射线结晶图)、甲状腺素转运蛋白四聚体解聚或纤丝形成的动力学、以及例如通过离心或热量测定而确定甲状腺素转运蛋白化合物相互作用的化学计量和能量。体外测验的例示性细节示于实施例中。
用于筛选法中的甲状腺素转运蛋白可以是野生型甲状腺素转运蛋白或甲状腺素转运蛋白突变体，比如天然存在的甲状腺素转运蛋白突变体，其在病因上与出现甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病比如家族性淀粉样多发性神经病或家族性淀粉样心肌病相关。例示性的天然存在的甲状腺素转运蛋白突变体包括但不限于V122I、V30M、L55P(突变体的命名描述了相对于野生型在所述氨基酸位置的取代基，例如参见Saraiva et al.(2001)Hum.Mut.17493-503)。
对于有效抵抗TTR淀粉样变性的化合物，其必须强烈地选择性结合TTR，由此在血浆中其在所有其它血浆蛋白存在下区分出TTR。由此，使用两种测验评价化合物。第一种测验是停滞纤丝形成测验，已进行过深入描述。在该测验中，以3.6或7.2μM将测试化合物加入3.6μM的TTR溶液中。在这两种浓度下，有足够的测试化合物负载于TTR的一个或两个结合位点。然后通过将pH降低至4.4(在此pH下，TTR淀粉化形成的速率最大)而将溶液置于致淀粉样条件下。72h后，测量了TTR溶液(其与TTR聚集相关)与测试化合物(T测试)的浊度并与不含任何测试化合物的溶液(T对照)进行了比较。抑制纤丝形成的程度根据含有和不含测试化合物的浊度差异而计算 抑制率＝(T对照-T测试)/(T对照)×100％ 高抑制率表明化合物活性很强。
第二种测验是由本实验室新近开发的抗体俘获法，从而测量测试化合物在人血浆内在存在所有其它血浆蛋白下与TTR相结合的能力。在该测验中，将测试化合物溶解于10.8μM人血浆中(约3倍TTR浓度)并培育24h。然后使用结合于琼脂糖树脂的多克隆TTR抗体免疫沉淀TTR和任何结合的小分子。洗涤树脂后，在高pH下解聚抗体-TTR复合物，由在HPLC中它们的峰面积确定TTR相对于测试化合物的化学计量。
在第一种测验中的高活性可以定义为在7.2μM处＞90％抑制和在3.6μM处＞60％抑制。在第二种测验中，其定义为＞1测试化合物结合于每当量TTR四聚体。
G.化合物和组合物的使用方法 还提供了在组织或生理液体内稳定甲状腺素转运蛋白并由此抑制错重叠的方法。通常，方法涉及给予组织或生理液体稳定量的本文提供的化合物，结合于甲状腺素转运蛋白并通过动力学稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体解聚。
由此，在疾病组织内稳定甲状腺素转运蛋白的方法改善了错重叠并减轻了相关疾病的症状，根据疾病的不同情况可以有助于治愈该疾病。在此还虑及在组织和/或细胞内已知甲状腺素转运蛋白错重叠。错重叠的程度和由此本发明化合物所达到的抑制程度可通过多种方法评价，比如在实施例和国际专利申请号WO2004/056315中描述的那些。上述参考的申请文件在此通过参考而全部引入。
在此还提供了治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的一种或多种症状的方法，该方法涉及给予治疗有效量的在此提供的化合物。在一种实施方案中，化合物通过动力学稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体解聚。甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病例如可以是家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性。其它的甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病包括但不限于阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob disease)、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤(例如参见国际专利申请公开号WO 98/27972和WO95/12815)。
提供了通过给予在此提供的化合物而治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导的疾病或紊乱的一种或多种症状的方法。甲状腺素转运蛋白介导的疾病和紊乱包括但不限于肥胖症(例如参见国际专利申请公开号WO02/059621)。
还提供了使用在此提供的化合物或组合物稳定TTR四聚体的方法。还提供了使用在此提供的化合物或组合物抑制TTR淀粉样形成的方法。
在此还提供了在此所述的任何化合物或药物组合物用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(如家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状的用途。
在此还提供了在此所述的任何化合物或药物组合物在制造用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(如家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状的药物中的用途。
H.联合疗法 在此提供了化合物和组合物可以作为单一疗法或与其它活性成分相联合而给药。例如，化合物和组合物可以与已知用于治疗淀粉样变性和淀粉样紊乱的其它化合物相联合，包括但不限于国际专利申请公开号WO98/27972、WO 02/059621和WO 95/12815以及W02004/056315中公开的那些。用于联合疗法的其它活性成分包括但不限于
和批准用于治疗淀粉样变性的其它产品，淀粉样变性包括但不限于家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性、阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob disease)、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤。用于联合疗法的其它活性成分包括但不限于批准用于肥胖症的产品。
仅是为了举例说明的目的提供了下面的实施例，并非意在限制本发明的范围。
实施例1
步骤1
将SOCl2(15ml)加入2-氯-4-甲氧基苯甲酸(.285gm)中并在搅拌条件下于90℃回流3小时。真空蒸发反应混合物并用于进一步的反应。
得到(粗品)--.313gm。
步骤2
将4-氨基-3-羟基苯甲酸(.234gm)、T.H.F(15ml)和吡啶(.37ml)的混合物加入粗酰氯(.313gm)中并于80℃回流过夜。将反应混合物倾入水中，然后用乙醚萃取并蒸发得到酰胺。
得到--.8gm。
步骤3
将酰胺(.8gm)溶解于联苯基醚(25ml)中，向其中加入PTSA(68mg)，在回流条件下于220℃回流过夜。一旦反应完成，通过过滤收集产物并用己烷和乙醚洗涤。
得到--.405gm。
步骤4
将酸(.405gm)溶解于15ml T.H.F中，向溶液中加入.424ml的T.M.S-CHN2并在搅拌条件下保持过夜。反应混合物经快速色谱法用5％己烷的乙酸乙酯溶液纯化。
得到--.107gm。
步骤5
将甲基酯(.090gm)溶解于10ml的T.H.F∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)中，向其中加入LiOH.H2O(0.048gm)并搅拌4小时。一旦反应完成，稀释反应混合物并用1N HCl酸化，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤并真空浓缩。得到浅黄色固体。
得到--.084gm。
收率％--97.67％。
终化合物 颜色-浅黄色 状态-固体 重量-84gm。
实施例2
步骤1
将2-氯-4-羟基苯甲酸(.5gm)溶解于DMF(10ml)中，向其加入K2CO3(1.201克)然后搅拌下于0℃下加入溴苄(.688ml)(逐滴)，保持1小时。反应完成后，加入水并用乙酸乙酯萃取，盐水溶液洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩。此后经快速层析纯化，用己烷.乙酸乙酯溶液(5％)洗脱。
得到--.930gm。
步骤2
将二苄基酯(.5克)溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)10ml中。向其加入LiOH.H2O(.24克)，室温搅拌4小时，一旦完成，反应混合物经水稀释并用1N HCl酸化，乙酸乙酯萃取，盐水溶液洗涤，真空浓缩得到浅黄色固体。
得到--.157gm。
步骤3
将亚硫酰氯加入酸中，随后加入一滴DMF，在回流条件下于80℃搅拌4小时。真空蒸发反应物，粗酰氯用于进一步反应。
步骤4
4-氨基-3-羟基苯甲酸(.122克)的THF(15ml)溶液相继经吡啶(.19ml)处理。将酰氯溶解于THF中，于0℃逐滴加入上述混合物中，室温搅拌过夜，真空蒸发，粗产物用于进一步反应。
得到--.485克。
步骤5
将酰胺(.485克)溶解于DPE中，向其加入PTSA(10摩尔％)，于200-220℃回流3小时。得到含有所需产物与副产物混合物的固体。
得到--.430克。
步骤6
将酸(.430克)溶解于DMF(20ml)中，向其加入K2CO3(.57克)，然后在搅拌下于0℃逐滴加入溴苄(.35ml)并保持1小时，反应完成后，加入水，用乙酸乙酯萃取，盐水溶液洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩。此后，使用7％己烷的乙酸乙酯溶液将粗产物经快速层析纯化。
得到--.469克。
步骤7
将二苄基酯(.170克)溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)中，向其加入LiOH.H2O(.061克)，室温搅拌4小时。一旦完成，反应混合物经水稀释并用1N HCl酸化，经乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤，真空浓缩。其经乙酸乙酯洗涤，结果得到白色固体。
得到--.044克。
终化合物 颜色-白色 熔点-226.2℃ 重量-43mg。
实施例3
4-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-羟基-苯甲酸的制备
向搅拌着的3-氨基-4-羟基苯甲酸(0.185g，0.0012摩尔)和吡啶(0.287g，0.00363摩尔)的18.5ml干燥THF溶液中加入4-氰基苯甲酰氯(0.2g，0.0012摩尔)，该溶液在氮氛下于室温搅拌10小时，然后回流3小时。反应混合物经旋转蒸发，残留物在水中形成淤浆，过滤得到酰胺(0.18g)，其无需进一步纯化而用于下一步骤。
2-(4-氰基-苯基)-苯并噁唑-5-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于30ml二甲苯中，加入40mg对甲苯磺酸。然后于160℃回流反应混合物12小时。于冷却过滤RM。使残留物在乙醚中形成淤浆，再次过滤。然后在1.5N HCl中搅拌残留物30分钟并在乙酸乙酯中萃取，经无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到0.045g纯标题化合物。
实施例4
4-羟基-3-(4-三氟甲氧基-苯甲酰氨基)-苯甲酸的制备
向搅拌着的3-氨基-4-羟基苯甲酸(0.136，0.00089摩尔)和吡啶(0.211g，0.00267摩尔)的13ml干燥THF溶液中加入4-三氟甲氧基苯甲酰氯(0.2g，0.00089摩尔)，在氮氛中室温搅拌该溶液10小时，然后回流3小时。旋转蒸发反应混合物，残留物在水中形成淤浆，过滤得到酰胺(0.175g)，其无需进一步纯化用于下一步骤。
2-(4-三氟甲氧基-苯基)-苯并噁唑-5-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于30ml二甲苯中，加入40mg对甲苯磺酸。然后于160℃回流反应混合物12小时。于冷却过滤RM。使残留物在乙醚中形成淤浆，过滤得到纯标题化合物(70mg)。
实施例5
步骤1
将硝基化合物溶解于甲醇中并加入SnCl2.2H2O，加热回流，在2小时内反应完全。彻底浓缩溶剂，加入冷水，用乙酸乙酯洗涤。用碳酸氢盐溶液碱化水层，用乙酸乙酯萃取。有机层分别经D.M.水和盐水溶液洗涤。经Na2SO4洗涤并浓缩。
属性固体 收率％82.8％ 纯度91.64％。
步骤2
氨基羟基苯甲腈(步骤1)的THF溶液相继经吡啶和酰氯处理。室温搅拌反应混合物14小时，真空浓缩，无需纯化用于下一步骤。
步骤3
将PTSA.H2O加入粗酰胺(步骤2)的二甲苯溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。16小时后，冷至室温，真空浓缩。残留物经层析(5-10％EtOAc/己烷)得到所要的环化氰基产物 属性白色固体 收率％53％ 纯度100％。
步骤4
将苯甲腈(步骤3)化合物和NH4Cl置于DMF中。将混合物冷至0℃，在5-6分钟内按份加入NaN3。反应混合物于0℃搅拌5分钟，于室温搅拌15分钟。将反应混合物于40℃加热1h，然后在3h内缓慢升至90℃。反应混合物于90℃搅拌20h，然后冷至0-5℃。反应物经水猝灭，用1N HCl调节pH至2，用EtOAc萃取。合并的有机层经水洗涤，干燥，浓缩得到胶状物，真空下彻底干燥2h得到浅棕色固体。固体经5％己烷∶EtAc混合物洗涤，干燥。
属性浅棕色固体 收率％60.9％ 纯度99.8％。
实施例6
步骤1
将硝基化合物溶解于甲醇中并加入SnCl2.2H2O，加热回流，在2小时内反应完全。彻底浓缩溶剂，加入冷水，用乙酸乙酯洗涤。用碳酸氢盐溶液碱化水层，用乙酸乙酯萃取。有机层分别经D.M.水和盐水溶液洗涤。经Na2SO4洗涤并浓缩。
属性固体 收率％82.8％ 纯度91.64％。
步骤2
将氨基羟基苯甲腈的THF溶液相继经吡啶和所需的酰氯处理。室温搅拌反应混合物14小时，真空浓缩，加入乙酸乙酯，用1％HCl和盐水洗涤。经Na2SO4干燥，浓缩。
属性固体 收率％66％ 纯度88.9％。
步骤3
将PTSA.H2O加入粗反应混合物的二甲苯溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。16小时后，冷至室温，真空浓缩。残留物经层析(5-10％EtOAc/己烷)得到所要的环化的氰基产物。
属性白色固体 收率％30.4％ 纯度97.2％。
步骤4
将苯甲腈(步骤3)化合物和NH4Cl置于DMF中。将混合物冷至0℃，在5-6分钟内按份加入NaN3。反应混合物于0℃搅拌5分钟，于室温搅拌15分钟。将反应混合物于40℃加热1h，然后在3h内缓慢升至90℃。反应混合物于90℃搅拌20h，然后冷至0-5℃。反应物经水猝灭，用1N HCl调节pH至2，用EtOAc萃取。合并的有机层经水洗涤，干燥，浓缩得到胶状物，真空下彻底干燥2h得到浅棕色固体。固体经5％己烷∶EtAc混合物洗涤，干燥。
属性浅棕色固体 收率％48％ 纯度99.8％。
实施例7
4-[(6-氯-吡啶-3-羰基)-氨基]-3-羟基-苯甲酸的制备
向搅拌着的4-氨基-3-羟基苯甲酸(0.490g，0.0032摩尔)和吡啶(0.76g，0.0096摩尔)的50ml干燥THF溶液中加入6-氯烟酰氯(0.56g，0.0032摩尔)，氮氛下于室温搅拌溶液10小时，然后回流3小时。旋转蒸发反应混合物，使残留物在水中形成淤浆，过滤得到酰胺(0.8g)，其无需进一步纯化而用于下一步骤。
2-(6-氯-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于75ml二甲苯中，加入150mg对甲苯磺酸。然后在5小时内将反应混合物逐步加热至160℃，保持此温度12小时。于冷却过滤反应混合物。使残留物在乙醚中形成淤浆，过滤得到粗产物，其经制备HPLC纯化得到纯标题化合物。
0.2g粗化合物得到0.55g纯产物。
实施例8
3-羟基-4-[(2-甲基-吡啶-3-羰基)-氨基]-苯甲酸
将2-甲基烟酰氯(0.2g，0.00128摩尔)溶解于30ml干燥的DCM，氮氛下于0℃将N，N′-二异丙基乙胺(0.994g，0.00769摩尔)缓慢加入酰氯溶液中。于0℃将4-氨基-3-羟基苯甲酸(0.196g，0.00128摩尔)的10ml干燥THF溶液缓慢加入上述溶液中。该溶液于0℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。然后用100ml乙酸乙酯稀释反应混合物，搅拌30分钟。经C盐床滤除沉淀的焦油物，有机相经4×20ml水洗涤，2×10ml盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗酰胺(140mg)，其无需进一步纯化而用于环化步骤。
2-(2-甲基-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制备
将粗酰胺溶解于10ml DMSO中，加入40mg对甲苯磺酸。然后将溶液置于微波辐射，短脉冲15分钟。然后将反应混合物冷至室温，倾入搅拌的冰水中。水相经4×50ml乙酸乙酯萃取。有机相经2×20ml水洗涤，盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗产物(100mg)，其经制备HPLC纯化。
200mg的粗2-(2-甲基-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸经制备HPLC纯化得到20mg纯产物。
实施例9
4-[(2，6-二氯-吡啶-4-羰基)-氨基]-3-羟基-苯甲酸
将2-甲基烟酰氯(0.2g，0.00128摩尔)溶解于30ml干燥的DCM中，于0℃氮氛下将N，N′-二异丙基乙胺(0.994g，0.00769摩尔)缓慢加入酰氯溶液中。于0℃将4-氨基-3-羟基苯甲酸(0.196g，0.00128摩尔)的10ml干燥THF缓慢加入上述溶液中。该溶液于0℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。然后用100ml乙酸乙酯稀释反应混合物，搅拌30分钟。经C盐床滤除沉淀的焦油物，有机相经4×20ml水洗涤，2×10ml盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗酰胺(140mg)，其无需进一步纯化而用于环化步骤。
2-(2，6-二氯-吡啶-4-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于25ml二甲苯中，加入40mg对甲苯磺酸。然后在5小时内将反应混合物逐步加热至160℃，保持此温度12小时。过滤冷却的反应混合物。使残留物在乙醚中形成淤浆，过滤得到0.65g纯产物。
本文提供的其它化合物已通过对于上述实施例的些微修改而制备，这些修改在本领域技术人员的知识范围内。这些化合物如下示，给出了观测的熔点。
实施例10 使这里提供的化合物进行停滞纤丝形成测验。化合物经P2O5干燥过夜并溶解于DMSO中至终浓度7.2mM以提供初级储备液(10×储备液)。通过使用DMSO 5倍稀释初级储备液制备二级储备液，终浓度为1.44mM(2×储备液)。如下测量在抑制剂(1.44mM)存在下酸介导的TTR(3.6μM)的淀粉样形成向可使用的UV管中加入495μL 0.4mg/mL WT TTR蛋白在10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA(pH7.6)中溶液以及5μL 1.44mM二级储备抑制剂的DMSO溶液(2×储备液)。混合物经涡混并培育30分钟(25℃)，此时使用500μL的200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA(pH4.2)将pH降低至4.4。将最终的1mL溶液涡混并无需振动于37℃培育72h。72h后，涡混各管以悬浮任何存心的纤丝，于350和400nm处使用紫外-可见分光光度计测量悬浮液的浊度。通过各TTR加抑制剂样品的浊度相对于相同方式制备的样品但不含抑制剂的观察浊度比值、乘以100得到纤丝形成百分比。如上使用1×二级储备液进行使用等摩尔抑制剂和TTR浓度(3.6μM)的纤丝形成测验。通过使用DMSO 10倍稀释7.2mM 10x初级储备液制备1×储备液，最终浓度为0.72mM并用于上述纤丝形成测验。进行所有测验时一式三份，使用野生型TTR测验所有化合物。在测试不含WT TTR的溶液的浊度的试验过程中，发现所有化合物是可溶的，确认了浊度是TTR淀粉样形成结果。
通过抗体俘获/HPLC法评价了血浆中潜在抑制剂与TTR相结合的化学计量。向1.5-mL埃彭道夫管(eppendorf tube)中加入1.0mL人血浆和7.5μL的1.44mM待评价抑制剂的DMSO溶液。于37℃培育溶液并轻微振动24h。将1∶1凝胶∶TSA(Tris盐水)的猝灭琼脂糖凝胶淤浆(125μL)加入溶液中，并于4℃轻微振动1h。离心(16,000×g)溶液，将上清液分为400μL的两份，然后将其加入200μL不同样品的抗-TTR抗体-结合琼脂糖的1∶11凝胶∶TSA淤浆。于4℃轻微振动溶液20分钟，离心(16,000×g)，除去上清液。在4℃下，凝胶经TSA/0.05％皂角苷(3×，10分钟每次)洗涤，随后在4℃下，经1mLTSA(2×，10分钟每次)洗涤。离心(16,000×g)样品，除去最终的洗液，加入155μL 100mM三乙胺，pH11.5，来洗脱TTR并结合来自抗体的抑制剂。于4℃轻微振动30分钟后，离心(16,000×g)洗脱样品，除去包含TTR和抑制剂的145μL上清液。然后如前所述通过反相HPLC分析上清液。例如参见Purkey，H.E.；Dorrell，M.I.；Kelly，J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，5566-71，其通过参考在此全部引入。
通过连接的单体在脲中的伸展评价了TTR四聚体解聚的动力学。缓慢的四聚体解聚无法通过远-UV CD光谱学检测，但其与前述可被远-UV CD方便检测的快速(快500,000-倍)伸展步骤相关。评价TTR四聚体(3.6μM)解聚动力学作为抑制剂的函数时，将3.6μL待测抑制剂的1mM溶液(乙醇)加入到69μL WT TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸钠，100mM KCl，1mMEDTA，pH7.0)，向其加入127.4μL磷酸缓冲液。对于抑制剂浓度(7.2μM)为TTR浓度(3.6μM)两倍时，将7.2μL待测抑制剂的1mM溶液(乙醇)加入到69μL WT TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸钠，100mM KCI，1mM EDTA，pH7.0)中，向其加入123.8μL磷酸缓冲液。将100μL蛋白-待测抑制剂溶液加入600μL 10.3μM脲和300μL磷酸缓冲液中，最终的脲浓度为6.5M。涡混溶液，在下列间隔采集圆二色谱0、5、8、23、46、71、95、118、144和168h。制备包含7.2μL乙醇而非抑制剂的对照品用于比较，在上述同样的时间点采集波谱。在220-213nm采集CD谱，每0.5nm扫描，平均时间为10妙。各波长扫描一次。振幅值在220-213nm之间进行平均从而确定在整个试验期间β-片层的损失程度。
接着在pH4.4处通过浊度测量酸-介导的纤丝形成的速率。化合物经P2O5干燥过夜并溶解于DMSO中至终浓度7.2mM以提供初级储备液(10×储备液)。通过使用DMSO 5倍稀释初级储备液制备二级储备液，终浓度为1.44mM(2×储备液)。采用7.2μM的抑制剂浓度与3.6μM的TTR(四聚体)按照如下所述进行纤丝形成测定向可使用的UV管中加入495μL 0.4mg/mL WTTTR蛋白在10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA(pH7.6)的溶液以及5μL 1.44mM二级储备抑制剂的DMSO溶液(2×储备液)。混合物经涡混并培育30分钟(25℃)，此时使用500μL 200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA(pH4.2)将pH降低至4.4。将最终的1mL溶液涡混并无需振动于37℃培育。溶液经涡混并于350和400nm处测量浊度。在下列间隔收集UV波谱酸化后的0、4、8、24、48、72、96、120、144、168和192h。制备包含5μl DMSO的对照品用于比较，在上述同样的时间点采集波谱。在读数之前制备10组各抑制剂溶液以防止试管干扰。获得UV吸光度后抛弃与时间点相应的试管。使用1×二级抑制剂储备液如上进行应用等摩尔(3.6μM)TTR和抑制剂浓度的纤丝形成测验，储备液如下通过使用DMSO10倍稀释7.2mM 10×初级储备液制备终浓度为0.72mM的储备液，用于上述的纤丝形成测验。在整个试验过程中，发现所有化合物是可溶的，确认了浊度是TTR淀粉样形成结果。
使用浊度测验评价作为TTR淀粉样纤丝抑制剂的所述化合物。酸化经抑制剂预培育(25℃，30分钟)的TTR引发了WT TTR淀粉样变性，酸化时加入缓冲剂使得pH突变至4.4。培育各混合物72h后(37℃)，于350和400nm使用UV-可见分光光度计测量浊度。将所有的淀粉样纤丝形成数据归一化为不存在抑制剂时的WT TTR淀粉样变性，其被指定为100％纤丝形成。由此，5％纤丝形成对应于在72h后抑制了95％WT TTR纤丝形成的化合物。首先于7.2μM的浓度评价各潜在的抑制剂，相应的TTR四聚体浓度为3.6μM。将纤丝形成低于15％的化合物于等于TTR(3.6μM)的浓度再次进行评价以选择具有最高效力的抑制剂。在这些条件下纤丝形成低于40％是良好抑制剂的特征，而40-70％指示了适度的化合物。
对在等于TTR(3.6μM)的浓度保持了纤丝形成低于50％的抑制剂进行了进一步的评价，评价它们在血浆全部其它蛋白中选择性结合TTR的能力。单一的500mg剂量后20h二氟尼柳的血液浓度可超过30μM，或相同剂量后4h可超过300μM。尽管该高水平的延迟血浆浓度表明了出色的生物利用度，但选择性更好的抑制剂将允许更低的剂量和潜在的更少副作用；因此，将人血浆与终浓度为10.8M的该亚组抑制剂一起培育(人血浆中TTR的浓度约为5μM)。然后用树脂-结合的抗体俘获TTR，用TSA溶液(tris盐水)/0.05％皂角苷洗涤固定的TTR三次，随后用TSA洗涤两次。使用100mM三乙胺(pH11.5)从树脂上解离TTR-抑制剂复合物，通过反相HPC分析确定存在的抑制剂相对于TTR的化学计量。每一TTR四聚体可结合最多2当量抑制剂。
材料和方法 甲状腺素转运蛋白抗体的纯化以及与皂角苷的结合 制备、纯化抗体并与琼脂糖偶联。该树脂作为TAS(10mM Tris，pH8.0/140mM NaCl/0.025％NaN3)中的1∶1淤浆储存。此外，通过向树脂而不是抗体偶联200mM Tris，pH8.0而制备猝灭的琼脂糖。
人血浆的制备 在Scripps General Clinical Research Center′s Normal Blood-DrawingProgram从健康志愿者体内抽取全血并移至50mL锥管管中。于25℃，在装备有浮桶式转头的Sorvall RT7台式离心机内于3000RPM(1730×g)离心试管10min以除去残留的细胞。加入叠氮钠得到0.05％溶液。血浆于4℃储存备用。
甲状腺素转运蛋白和结合化合物的免疫沉淀 向2mL的埃彭道夫管内加入1.5mL人血浆和7.5μL待测化合物的2.16mM DMSO溶液。该溶液于37℃培育24h。将1∶1树脂/TSA淤浆(187μL)的猝灭琼脂糖加入该溶液中并于4℃轻微振动1h。离心(16,000×g)溶液，将上清液分成各400μL的3份。将其各自加入200μL 1∶1树脂/TSA淤浆的抗-甲状腺素转运蛋白抗体-结合的琼脂糖并于4℃轻微振动20分钟。离心(16,000×g)样品，除去上清液。树脂于4℃经1mL TSA/0.05％皂角甙(Acros)(3×10分钟)洗涤，再于4℃经1mL TSA(2×10分钟)洗涤。离心(16,000×g)样品，除去最终洗液，加入155μL 100mM三乙胺、pH11.5以稀释TTR并结合抗体的小分子。于4℃轻微振动30分钟后，离心样品(16,000×g)，除去145μL包含TTR和抑制剂的上清液。
甲状腺素转运蛋白和结合化合物的HPLC分析和定量 将来自TTR抗体珠(145μL)的上清洗脱液样品置于Waters 71P自动取样器上。进样的135μL各样品在Keystone 3cm C18反相柱上分离，在8分钟内使用40-100％B梯度(A94.8％H2O/5％乙腈/0.2％TFA；B94.8％乙腈/5％H2O/0.2％TFA)，由Waters 600E多溶剂递送系统控制。于280nm使用Waters 486可调吸收度检测器检测，积分各峰给出TTR和小分子的面积。为了确定各物质的量，在HPLC上注射已知量的四聚TTR或化合物。积分各峰使用Kaleidagraph(Synergy Software)线性回归数据创建标准曲线。使用该标准曲线确定血浆样品中存在的各物质的摩尔数。计算小分子与蛋白的比值以得到血浆中结合于TTR的小分子的化学计量。
甲状腺素转运蛋白淀粉样纤丝形成测验 以720μM的浓度将化合物溶解于DMSO中。将5μL待测化合物的溶液加入到0.5mL 7.2μM TTR在10mM磷酸盐pH7.6、100mM KCl、1mMEDTA缓冲剂的溶液中，允许化合物与TTR一起培育30分钟。加入495μL0.2mM乙酸盐pH4.2、100mM KCl、1mM EDTA，所得终蛋白和抑制剂浓度各自为3.6μM，pH为4.4。然后于37℃培育混合物72h，此后涡混试管3秒，于400nm测量光密度。通过归一化不含抑制剂的TTR的各光密度确定纤丝形成的程度，定义为100％纤丝形成。还测试不含TTR时各化合物的对照溶液，于400nm处几乎没有吸收。
结晶和X-射线数据采集 在悬滴试验中，由相对于2M硫酸铵平衡的5mg/ml(在100mM KCl，100mM磷酸盐，pH7.4，1M硫酸铵)蛋白溶液获得重组TTR结晶。用10倍摩尔过量的配体浸泡结晶从而确保两个结合位点完全饱和，从而制备TTR·配体复合物。使用1∶1丙酮∶水溶液作为浸泡剂。使用偶联了RU200旋转阳极X-射线发生器的DIP2030b成像板体系(MAC Science，Yokohama，Japan)采集收据。将结晶置于作为冷保护剂的巴拉东油(paratone oil)中冷却至120K进行衍射试验。所有TTR·配体复合物的结晶与包含晶胞大小a＝43
、b＝86
、和c＝65
的apo晶型同形。它们属于P21212空间组，在其不对称单元包含一半的同四聚体。数据经DENZO和SCALEPACK还原。
结构确定与优化 将来自蛋白数据库(登录号1BMZ)的TTR的蛋白原子坐标用作优化原生型TTR和TTR-配体复合物的起始模型，使用CNS程序经分子动力学和能量最小化优化。根据在经化合物浸泡或同时共结晶的TTR结晶上采集的衍射数据，计算图谱。对于TTR与化合物的复合物，所得图谱揭示了配体在TTR四聚体的两个结合区的大概位置，峰高超过了5-9r.m.s。为了进一步改善小分子的电子密度并除去模型偏差，将模型进行若干循环的弯曲/振动方案(warp/shake protocol)，其导致图谱的显著改善，尤其是使抑制剂的图谱显著改善。使用这些图谱进行后续模型匹配，将配体分子置于密度中。在所有的三种情况中，通过程序Insight II(Accelrys)计算的抑制剂最小能量构型与图谱最佳拟合。由于沿着结合通道的二重晶体学对称轴，必须施用统计学扰乱模型，在四聚TTR的两个结合位点任一之中产生两种配体结合方式。基于无偏差的电子密度图加入水分子。由于在最终图谱中缺乏可解释的电子密度，在最终模型中不包括9个N-末端和三个C-末端残基。
因为本领域技术人员显然可进行修改，在此要求的主题意在仅通过附录的权利要求进行限制。
权利要求
1.式I化合物或其药学上可接受的衍生物
其中
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；
X是O、S或NR11；
R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、CONR7R8、烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3；
Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
Ar是芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R5是烷基、卤代烷基、环烷基或杂环基；
R6是天然存在的α-氨基羧酸的侧链；
R7和R8各自独立选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R9和R10各自独立是氢、卤素、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R11是氢或烷基；以及
n是0-3的整数；
条件是(i)当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯；(ii)当Y是COOH且在4、5、6或7位且X是O时，那么R1、R2和R3不全是氢；(iii)Y是COOH或CONH2且X是O时，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、3-环烷基、4-烷氧基、4-环烷氧基、2-或4-COOH、4-COOR，其中R是烷基、2-或4-OH；以及(iv)当Y是COOH且X是NH时，那么R1、R2和R3不是4-CN。
2.权利要求1的化合物，具有式IA结构
3.权利要求1或2的化合物，其中
Y是COOH、四唑基、CONHOH、B(OH)2或OH；
X是O；以及
R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH、B(OH)2或CF3。
4.权利要求1-3任一项的化合物，其中Y是COOH。
5.权利要求1-3任一项的化合物，其中Y是四唑基、B(OH)2或CONHOH。
6.权利要求1-3任一项的化合物，其中Y是OH。
7.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和OH。
8.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢和CF3。
9.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和OR5。
10.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自独立是氢且R3是CF3。
11.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和B(OH)2。
12.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、F、Br和I。
13.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和OH。
14.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和B(OH)2
15.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自是卤素且R3是OH。
16.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自是卤素且R3是B(OH)2。
17.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自是卤素且R3是氢。
18.权利要求1-17任一项的化合物，其为下式之一
19.权利要求1-6任一项的化合物，其中Het是嘧啶基、吡啶基、呋喃基或噻吩基。
20.具有下列结构的权利要求19的化合物或其药学上可接受的衍生物
21.权利要求19或20的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基芳基或杂芳基。
22.权利要求19-21任一项的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、烷基或卤代烷基取代。
23.权利要求19-22任一项的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任选被三氟甲基、氯或甲基取代。
24.权利要求1-23任一项的化合物，选自
25.药物组合物，含有权利要求1-24任一项的化合物和药学上可接受的载体。
26.药物组合物，含有药学上可接受的载体和式I化合物或其药学上可接受的衍生物
其中
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；
X是O、S或NR11；
R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、CONR7R8、烷基、卤代烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH、CF3或NR7R8；
Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
Ar是芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R5是烷基、卤代烷基、环烷基或杂环基；
R6是天然存在的α-氨基羧酸的侧链；
R7和R8各自独立选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R9和R10各自独立是氢、卤素、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R11是氢或烷基；以及
n是0-3的整数；
条件是(i)当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯；(ii)当Y是COOH且在4、5、6或7位且X是O时，那么R1、R2和R3不全是氢；(iii)当Y是COOH或CONH2且X是O时，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、3-环烷基、4-烷氧基、4-环烷氧基或4-环烷氧基；以及(iv)当Y是COOH且X是NH时，那么R1、R2和R3不是4-CN。
27.配制成单一剂量给药的权利要求25或权利要求26的药物组合物。
28.稳定组织内或生理液体内甲状腺素转运蛋白的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
29.抑制甲状腺素转运蛋白错重叠的方法，包括用权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物接触甲状腺素转运蛋白。
30.治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的一种或多种症状的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
31.通过动力学稳定原生态甲状腺素转运蛋白四聚体而防止该甲状腺素四聚体解聚的方法，包括用权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物接触四聚体。
32.权利要求30的方法，其中甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病是家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性。
33.权利要求32的方法，其中疾病是阿尔茨海默病、海绵状脑病、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤。
34.治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导的疾病或紊乱的一种或多种症状的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
35.权利要求34的方法，其中疾病是肥胖症。
36.稳定甲状腺素转运蛋白四聚体的方法，包括用权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物接触四聚体。
37.抑制TTR淀粉样形成的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
38.用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的一种或多种症状时的权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
39.权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物在制造用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的药物中的用途。
全文摘要
提供了用于稳定甲状腺素转运蛋白以及用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导疾病的一种或多种症状的化合物、组合物和方法。在一种实施方案中，这些化合物是苯并噁唑及相关化合物，其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；X是O、S或NR11；Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；且其中R、R1-R3、R5-R8和R11如申请中定义。
文档编号A61K31/428GK101198598SQ200580024488
公开日2008年6月11日 申请日期2005年5月20日 优先权日2004年5月20日
发明者理查德·拉伯迪尼尔 申请人:弗尔德里克斯制药股份有限公司
在此要求美国临时申请序列号60/573,720的优先权，其申请日为2004年5月20日，标题为“化合物、组合物以及用于稳定和抑制甲状腺素转运蛋白错重叠的方法”。上述申请在此通过参考而全部引入。
发明领域 在此提供了通常与蛋白错重叠相关的化合物、组合物和方法。更具体地，在此提供了苯并噁唑化合物、组合物以及用于稳定甲状腺素转运蛋白、抑制甲状腺素转运蛋白错重叠、抑制甲状腺素转运蛋白纤维化和淀粉样蛋白(anyloid)形成和治疗与其相关的淀粉样疾病的方法。
背景技术：
甲状腺素转运蛋白(transthyretin，TTR)是存在于血浆和中枢脊髓液中的55kDa均四聚蛋白。TTR的功能是转运L-甲状腺素(T4)和全-视黄醇结合蛋白(RBP)。TTR是超过20个非同源致淀粉样蛋白之一，其可转化为纤丝和其它聚集体从而在人体内导致疾病病理。这些疾病似乎并非是因蛋白聚集的功能损失而引起的。实际上，聚集似乎通过尚不明确的机理引起神经元/细胞功能障碍。
在变性病情中，限制野生型TTR四聚体解聚的速率以及快速的单体错重叠可导致错装配成淀粉样蛋白，公认将引起老年全身性淀粉样疾病(SSA)。超过80个TTR变异体之一的解聚和错重叠导致许多家族性淀粉样变性，包括家族性淀粉样多发性神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。
TTR四聚体具有两个C2对称的T4-结合位点。已知T4的负协同结合稳定了TTR四聚体并抑制了淀粉样纤维化形成。不幸地，在人血浆中仅有低于1％的TTR具有与其结合的T4，因为相对于TTR，甲状腺素-结合球蛋白(TBG)对于T4具有更高的亲和力。因此，相对于TTR的血浆浓度(3.6-7.2μM)，T4的血浆浓度更低(0.1M)。
发明简介 本文提供了在动力学上稳定天然态的甲状腺素转运蛋白从而抑制蛋白错重叠的化合物。蛋白错重叠在许多疾病过程中起作用，包括甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病。通过抑制甲状腺素转运蛋白错重叠，可干预或治疗这样的疾病、缓解症状和/或有时可预防或治愈疾病。
本文描述了治疗、预防或改善TTR淀粉样变性的一种或多种症状的化合物、组合物和方法。TTR淀粉样变性通常在5-10岁导致死亡，直至最近，仍被认为是不可治愈的。肝移植是在家族性淀粉样多发性神经病病例内用野生型(WT)等位基因替换疾病相关等位基因的有效方法，因为肝脏通常是致淀粉样TTR的来源。尽管肝移植是有效的基因治疗方式，但其仍存有问题。移植是复杂的，其需要对于受者和供者均进行侵入性外科手术、长期的移植后免疫抑制治疗、供者短缺、成本昂贵、而且因为大量的TTR淀粉样变性患者的疾病进程使得其不适于移植。不幸地，在某些肝移植后的家族性患者体内心肌淀粉样变性继续恶化，因为WT TTR通常持续沉积。移植也不能缓解TTR在中枢神经系统(CNS)的沉积，这是由于其是由脉络丛合成。对于多数流行的TTR疾病、老年全身性淀粉样变性(SSA)(因为WTTTR沉积而影响到大约高达25％的80岁以上老年人)、以及对于家族性淀粉样心肌病(包括V122I携带者，V122I是在3.9％非裔美国人体内识别的突变体)，移植并不是行得通的选择。
在一种实施方案中，用于本文组合物和方法的化合物具有式I结构
或
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)n-C(R6)(NH2)-COOH； X是O、S或NR11； R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、COOH、CONR7R8、烷基、卤代烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3； Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代； Ar是芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代； R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基； R5是烷基、卤代烷基、环烷基、杂环基或芳烷基； R6是天然存在的α-氨基羧酸的侧链； R7和R8各自独立选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基； R9和R10各自独立是氢、卤素、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基； R11是氢或烷基；以及 n是0-3的整数。
在一种实施方案中，Het是嘧啶基、吡啶基、呋喃基或噻吩基。在另一种实施方案中，Het是吡啶基。
在另一种实施方案中，R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、COOH、CONR7R8、烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3。
在一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是Cl、F或CF3。在另一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯。在另一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不全是氢。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH或CONH2时，那么R1、R2和R3不是烷基、环烷基、烷氧基、COOH、其中R时烷基或OH的COOR。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH且X是NH时，那么R1、R2和R3不是4-CN。在另一种实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH时，那么R1、R2和R3不是CN。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH或CONH2，那么R1、R2和R3不是烷基、烷氧基、环烷氧基或CN。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，条件是当Y是COOH或CONH2，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、4-烷氧基或4-环烷氧基。
本文还提供了包含本文所提供化合物的药物组合物。
还提供了稳定组织或生物液中甲状腺素转运蛋白并由此抑制错重叠的方法。通常，该方法包括给予组织或生物液稳定量的本文所提供的化合物，这些化合物结合甲状腺素转运蛋白并通过动力学上稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体解聚。
由此，在疾病组织中稳定甲状腺素转运蛋白的方法改善了错重叠并减轻了相关疾病的症状，取决于不同疾病，还可有助于治愈疾病。本文还涉及在组织和/或细胞内抑制甲状腺素转运蛋白错重叠。错重叠的程度，以及由此通过本方法所达到的抑制程度，可通过多种方法进行评价，比如实施例和国际专利申请号WO2004/056315中所述的。上述参考申请在此通过参考全部引入。
本文还提供了治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样蛋白病的一种或多种症状的方法，该方法包括给予治疗有效量的本文所提供的化合物。在一种实施方案中，该化合物通过动力学上稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体分解。甲状腺素转运蛋白淀粉样蛋白病例如可以是家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性。其它的甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病包括但不限于阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob病)、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤(例如参见国际专利申请公开号WO 98/27972和WO95/12815)。
提供通过给予本文所提供化合物治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导的疾病或紊乱的一种或多种症状的方法。甲状腺素转运蛋白介导的疾病和紊乱包括但不限于肥胖症(例如参见国际专利申请公开号WO02/059621)。
还提供了使用本文所提供化合物或组合物稳定TTR四聚体的方法。还提供了使用本文所提供化合物或组合物抑制TTR淀粉样形成的方法。
还提供了本文所述任一化合物或药物组合物在治疗、预防或改三甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(即，家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状中的用途。
还提供了本文所述任一化合物或药物组合物在制备用于治疗、预防或改三甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(如，家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状的药物中的用途。
还提供了制造品、包含包装材料、包装材料内的在此提供的化合物或其药学上可接受的衍生物，其有效地预防TTR错重叠或者治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状，以及指示化合物或组合物或其药学上可接受的衍生物用于调节TTR重叠或用于治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状的标签。
发明详述 A.定义 除非另有定义，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员常规理解的含义。所有专利、申请、公开的申请或其它公开在此通过参考全部引入。当本文某一术语具有多种定义时，除非另有说明，优选本节中的定义。
如本文所用，甲状腺素转运蛋白或TTR是55kDa的均四聚体，特征为2，2，2对称，在二聚体-二聚体界面具有两个同样的漏斗型结合位点，其中甲状腺激素(T4)可结合于血浆和CSF中。TTR通常与低于1当量的全视黄醇结合蛋白相结合。TTR是127-残基蛋白，其在生理条件下四聚化。TTR在血浆中用作甲状腺素的三级转运子且在脑脊液中用作初级载体。TTR通过其与视黄醛结合蛋白的联合也可转运视黄醛。TTR在低pH处形成淀粉样。
如本文所用，化合物的药学上可接受的衍生物包括其盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酯、半缩醛、半缩酮、溶剂化物、水化物或前药。这样的衍生物可由本领域技术人员使用已知的衍生方法方便地制备。所制备的化合物可以施用于动物或人而基本无毒性作用且是药学活性物或前药。药学上可接受的盐包括但不限于胺盐，比如但不限于N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、铵、二乙醇胺和其它羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对-氯苄基-2-吡咯烷-1′-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它烷基胺，哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；金属盐，比如但不限于锂盐、钾盐和钠盐；碱土金属盐，比如但不限于钡盐、钙盐和镁盐；过渡金属盐，比如但不限于锌盐；以及其它金属盐，比如但不限于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；还包括但不限于矿酸盐，比如但不限于盐酸盐和硫酸盐；有机酸盐，比如但不限于乙酸、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐。其它药学上可接受的盐包括酸性盐比如醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、十二硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、乙二酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐与十一酸盐；碱性盐包括铵盐、碱金属盐、比如钠与钾盐、碱土金属盐、比如钙与镁盐、有机碱盐、比如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺，以及与氨基酸比如精氨酸、赖氨酸形成的盐，等等。此外，碱性含氮基团可以被比如低级烷基卤化物季铵化，比如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯，比如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯，长链卤化物比如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基卤化物比如苄基和苯乙基溴化物等。由此可获得水或油溶性或可分散产物。药学上可接受的酯包括但不限于酸性基团的烷基、链烯基、炔基和环烷基酯、酸性基团包括但不限于羧酸、磷酸、亚磷酸、磺酸、亚磺酸和硼酸。药学上可接受的烯醇醚包括但不限于式C＝C(OR)的衍生物，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基或环烷基。药学上可接受的烯醇酯包括但不限于式C＝C(OC(O)R)衍生物，R是氢、烷基、链烯基、炔基或环烷基。药学上可接受的溶剂化物和水化物是化合物与一个或多个溶剂或水分子的复合物，或1-约100，或1-约10，或1-约2、3或4个溶剂或水分子。
如本文所用，治疗意指缓解或有效改变疾病或紊乱的一种或多种症状的方式。治疗还包括任何在药学上使用本文的组合物，比如用于治疗TTR介导的疾病或紊乱，或牵涉TTR包括TTR错重叠的疾病或紊乱。
如本文所用，通过给予具体化合物或药物组合物改善具体紊乱的症状是指任何的减轻，无论持久的或临时的、持续的或暂时的，其得益于施用该组合物或与其相关。
如本文所用IC50是指一种量，在测量试验中，具体的测试化合物达到最大应答如抑制TTR错重叠的50％抑制率时的浓度或剂量。
如本文所用，EC50是指在某一具体应答的50％最大表达处显示剂量-依赖应答的具体化合物浓度或量，该具体应答由具体化合物诱导、刺激或加强。
如本文所用，前药是在体内施用时通过一或多个步骤或过程或其它方式代谢而转化为生物学上、药学上或治疗学上的活性化合物形式的化合物。为了制备前药，修饰药学上活性化合物以使得经代谢过程将重新生成活性化合物。可设计前药以改变药物的代谢稳定性或转运特性，从而掩蔽副作用或毒性，改善药物气味或改变药物的其它特征或性质。基于在体内的药物动力学过程和药物代谢知识，本领域技术人员一旦知晓药学上活性化合物，就可设计该化合物的前药(例如参见，Nogrady(1985)Medicinal ChemistryA Biochemical Approach，Oxford University Press，New York，pages 388-392)。
应理解到本文所提供化合物可包含手性中心。这些手性中心可以是(R)或(S)构型，或可以是其混合物。由此，本文所提供化合物可以是对映体纯的，或是立体异构体或非对映体混合物。对于氨基酸残基，这些残基可以是L-或D-形式。天然存在的氨基酸残基的构象通常为L。当没有指定时，残基为L型。如本文所用，术语“氨基酸”是指α-氨基酸，其是外消旋体、或是D-或L-构型。氨基酸名称前的名称″d″(如，dAla、dSer、dVal，等)是指氨基酸的D-异构体。氨基酸名称前的名称″dl″(如，dlPip)是指氨基酸的L-和D-异构体的混合物。应理解到本文所提供化合物的手性中心可在体内被差向异构化。这样，本领域技术人员将认识到给予(R)型化合物，由于化合物在体内被差向异构化，相当于给予其(S)型。
如本文所用，基本上纯的意指通过本领域技术人员用于检测杂质的标准的分析方法比如薄层层析(TLC)、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)进行测定时，足够均匀地表现出不含易于检测的杂质，或者足够纯以至进一步纯化后将检测不出物质的理化性质(比如酶促和生物活性)发生改变。纯化化合物以制备基本上化学纯化合物的方法为本领域技术人员所知。但基本上化学纯化合物可以是立体异构体混合物。此时，进一步纯化可能提高化合物的特异活性。
如本文所用，烷基、链烯基和炔基碳链，除非另有指明，包含1-20个碳原子，或1或2-16个碳原子，是直链或支链的。在某些实施方案中，2-20个碳原子的链烯基碳链包含1-5个双键。在某些实施方案中，2-20个碳原子的炔基碳链包含1-8个三键，在某些实施方案中，2-16个碳原子的炔基碳链包含1-5个三键。本文的烷基、链烯基和炔基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、叔戊基、异己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)。如本文所用，低级烷基、低级链烯基和低级炔基是指含有约1或约2个碳原子、最多约6个碳原子的碳链。如本文所用，“链烯炔基(alk(en)(yn)yl)”是指包含至少一个双键和至少一个三键的烃基。
如本文所用，“环烷基”是指饱和单-或多-环系，某些实施例方案为3-10个碳原子，某些实施方案为3-6个碳原子；环烯基和环炔基是指各自包括至少一个双键和至少一个三键的单-或多环系。环烯基和环炔基在某些实施方案中可包含3-10个碳原子，具有环烯基，在其它实施方案中，包含4-7个碳原子和环炔基，在其它实施方案中，包含8-10个碳原子。环烷基、环烯基和环炔基的环系可由一个或两个或多个环构成，这些环可以以稠合、桥连或螺连的方式连接在一起。“环烯炔基(cycloalk(en)(yn)yl)”是指包含至少一个双键和至少一个三键的环烷基。
如本文所用，“芳基”是指包含6-19个碳原子的芳香单环或多环基团。芳基包括但不限于比如未取代或取代的芴基(fluorenyl)、未取代或取代的苯基以及未取代或取代的萘基。
如本文所用，“杂芳基”是指例如约5-约15元单环或多环芳环系，其中在环系中有一个或多个例如1-3个原子是杂原子，即，碳以外的原子，包括但不限于氮、氧或硫。杂芳基可任选与苯环稠合。杂芳基包括但不限于呋喃基、咪唑基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、喹啉基和异喹啉基。
如本文所用，“杂芳鎓”基是一个或多个杂原子带正电荷的杂芳基。
如本文所用，“杂环基”是指单环或多环非芳香环系，例如3-10元，又例如4-7元、再例如5-6元，其中在环系中的一个或多个例如1-3个原子是杂原子，即，碳以外的原子，包括但不限于氮、氧或硫。当杂原子是氮时，氮原子任选被烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、杂环烷基、环烷基烷基、杂环基烷基、酰基、胍基取代，或者氮原子可以被季铵化形成铵基，其中取代基选自上述取代基。
如本文所用，“芳烷基”是指烷基中的一个氢原子被芳基取代的烷基。
如本文所用，“杂芳烷基”是指烷基中的一个氢原子被杂芳基取代的烷基。
如本文所用，“卤素”、“卤原子”或“卤化物”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用，拟卤素或拟卤化物基是性能与卤素基本相似的基团。这样的化合物可以以与卤化物相同的方法使用或处理。拟卤化物包括但不限于氰化物、氰酸酯、硫氰酸酯、硒氰酸酯、三氟甲氧基和叠氮。
如本文所用，“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤原子取代的烷基。这样的基团包括但不限于氯甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟乙基。
如本文所用，“卤烷氧基”是指其中R是卤代烷基的RO-。
如本文所用，“亚磺酰基”或“亚硫酰基”是指-S(O)-。如本文所用，“磺酰基”或“砜基”是指-S(O)2-。如本文所用，“磺基”是指-S(O)2O-。
如本文所用，“羧基”是指二价基团-C(O)O-。
如本文所用，“氨基羰基”是指-C(O)NH2。
如本文所用，“烷基氨基羰基”是指其中R是烷基包括低级烷基的-C(O)NHR。如本文所用，“二烷基氨基羰基”是指其中R′和R独立是烷基包括低级烷基的-C(O)NR′R；“羧酰胺”是指其中R′和R独立是烷基包括低级烷基的-NR′COR。
如本文所用，“二芳基氨基羰基”是指其中R和R′独立选自芳基包括低级芳基比如苯基的-C(O)NRR′。
如本文所用，“芳基烷基氨基羰基”是指R和R′之一选自芳基包括低级芳基比如苯基且R和R′之一是烷基包括低级烷基的-C(O)NRR′。
如本文所用，“芳基氨基羰基”是指其中R是芳基包括低级芳基比如苯基的-C(O)NHR。
如本文所用，“羟基羰基”是指-COOH。
如本文所用，“烷氧羰基”是指其中R是烷基包括低级烷基的-C(O)OR。
如本文所用，“芳氧羰基”是指其中R是芳基包括低级芳基比如苯基的-C(O)OR。
如本文所用，“烷氧”和“烷硫”是指其中R是烷基包括低级烷基的RO-和RS-。
如本文所用，“芳氧”和“芳硫”是指R是芳基包括低级芳基比如苯基的RO-和RS-。
如本文所用，“亚烷基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有1-约20个碳原子，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚烷基包括低级亚烷基。任选沿着该亚烷基插入一个或多个氧、硫包括S(＝O)和S(＝O)2基团、或取代或未取代的氮原子包括-NR-和-N+RR-基团，其中氮取代基是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基或COR′，其中R′是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、-OY或-NYY，其中Y是氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基。亚烷基包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-(CH2)3-)、甲撑二氧基(-O-CH2-O-)和乙撑二氧基(-O-(CH2)2-O-)。术语“低级亚烷基”是指具有1-6个碳原子的亚烷基。在某些实施方案中，亚烷基是低级亚烷基，包括1-3个碳原子的亚烷基。
如本文所用，“氮杂亚烷基”是指-(CRR)n-NR-(CRR)m-，其中n和m各自独立是0-4的整数。如本文所用，“氧杂亚烷基”是指-(CRR)n-O-(CRR)m-，其中n和m各自独立是0-4的整数。如本文所用，“硫代亚烷基”是指-(CRR)n-S-(CRR)m-、-(CRR)n-S(＝O)-(CRR)m-和-(CRR)n-S(＝O)2-(CRR)m-，其中n和m各自独立是0-4的整数。
如本文所用，“亚链烯基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有2-约20个碳原子和至少一个双键，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚链烯基包括低级亚链烯基。任选沿着该亚链烯基插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亚链烯基包括但不限于-CH＝CH-CH＝CH-和-CH＝CH-CH2-。术语“低级亚链烯基”是指具有2-6个碳原子的亚链烯基。在某些实施方案中，亚链烯基是低级亚链烯基，包括3-4个碳原子的亚链烯基。
如本文所用，“亚炔基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有2-约20个碳原子和至少一个三键，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚炔烯基烯包括低级亚烯基。任选沿着该亚烯基插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亚炔基包括但不限于-C≡C-C≡C-、-C≡C-和-C≡C-CH2-。术语“低级亚烯基”是指具有2-6个碳原子的亚炔基。在某些实施方案中，亚炔基是低级亚炔基，包括3-4个碳原子的亚炔基。
如本文所用，“亚链烯炔基”是指直链、支链或环状的，例如直链或支链的，二价脂肪族烃基，例如具有2-约20个碳原子以及至少一个三键和至少一个双键，又例如具有1-12个碳原子。在进一步的实施方案中，亚链烯炔烯基包括低级亚链烯炔基。任选沿着该亚链烯炔基插入一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子，其中氮取代基是烷基。亚链烯炔基包括但不限于-C＝C-(CH2)n-C≡C-，其中n是1或2。术语“低级亚链烯炔基”是指具有高至6个碳原子的亚链烯炔基。在某些实施方案中，亚链烯炔基是低级亚炔基，包括约4个碳原子的亚链烯炔基。
如本文所用，“环亚烷基”是指二价的饱和的单-或多环环系，例如具有3-10个碳原子，再例如3-6个碳原子；环亚烯基和环亚炔基是指各自包括至少一个双键和至少一个三键的二价单-或多环环系。环亚烯基和环亚炔基例如可以包含3-10个碳原子，环亚烯基例如包含4-7个碳原子以及环亚炔基例如包含8-10个碳原子。环亚烷基、环亚烯基和环亚炔基的环系可以由一个环或两个或多个环构成，这些环可以以稠合、桥连或螺连的方式连接在一起。“环亚链烯炔基”是指包含至少一个双键和至少一个三键的环亚烷基。
如本文所用，“亚芳基”是指单环或多环例如单环的二价芳基，例如具有5-约20个碳原子和至少一个芳环，又例如5-12个碳原子。在其它实施方案中，亚芳基包括低级亚芳基。亚芳基包括但不限于1，2-、1，3-和1，4-亚苯基。术语“低级亚芳基”是指具有6个碳原子的亚芳基。
如本文所用，“亚杂芳基”是指二价的单环或多环芳香环系，例如约5-约15个环原子，其中一个或多个例如1-3个环系原子是杂原子，即，除碳外的元素，包括但不限于氮、氧或硫。术语“低级亚杂芳基”是指具有5或6个环原子的亚杂芳基。
如本文所用，“亚杂环基”是指二价的单环或多环非芳香环系，例如3-10元、例如4-7元、又例如5-6元，其中一个或多个包括1-3个环系原子是杂原子，即，除碳外的元素，包括但不限于氮、氧或硫。
如本文所用，“取代的烷基”、“取代的链烯基”、“取代的炔基”、“取代环烷基”、“取代的环烯基”、“取代的环炔基”、“取代的芳基”、“取代的杂芳基”、“取代的杂环基”、“取代的亚烷基”、“取代的亚链烯基”、“取代的亚炔基”、“取代的环亚烷基”、“取代的环亚烯基”、“取代的环亚炔基”、“取代的亚芳基”、“取代的亚杂芳基”和“取代的亚杂环基”是指各自被一个或多个取代基例如一、二、三或四个取代基取代的烷基、链烯基、炔基、环烷基、环炔基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、亚烷基、亚炔基、亚链烯基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、亚芳基、亚杂芳基和亚杂环基，其中取代基如本文定义，例如选自Q1。
如本文所用，“烷叉基”是指二价基团，比如＝CR′R″，其与另一基团的一个原子相连，形成双键。烷叉基包括但不限于甲叉基(＝CH2)和乙叉基(＝CHCH3)。如本文所用，“芳基烷叉基”是指其中R′或R″是芳基的烷叉基。环烷叉基是其中R′与R″相连形成碳环的那些基团。“杂环叉基(Heterocyclylidene)”是指其中R′和R″至少之一在链中包含杂原子且R′与R″相连形成杂环的那些基团。
如本文所用，“酰胺”是指二价基团-C(O)NH-。“硫代酰胺”是指二价基团-C(S)NH-。“氧基酰胺(Oxyamido)”是指二价基团-OC(O)NH-。“硫酰胺(Thiaamido)”是指二价基团-SC(O)NH-。“二硫酰胺(dithiaamido)”是指二价基团-SC(S)NH-。“脲基(Ureido)”是指二价基团-HNC(O)NH-。“硫脲基(Thioureido)”是指二价基团-HNC(S)NH-。
如本文所用，“氨基脲(semicarbazide)”是指-NHC(O)NHNH-。“肼甲酸(Carbazate)”是指二价基团-OC(O)NHNH-。“异硫肼甲酸(Isothiocarbazate)”是指二价基团-OC(S)NHNH-。“磺酰肼(sulfonylhydrazide)”是指二价基团-SO2NHNH-。“酰肼”是指二价基团-C(O)NHNH-。“偶氮”是指二价基团-N＝N-。“肼基”是指二价基团-NH-NH-。
当没有指定任何给定的取代基的数目时(如，卤代烷基)，可以存在有一个或多个取代基。例如，“卤代烷基”可以包括一个或多个相同或不同的卤原子。又例如，“C1-3烷氧苯基”可以包括一个或多个相同或不同的包含一个、两个或三个碳原子的烷氧基。
如本文所用，任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写，除非另有说明，均与它们常规使用的、公认的缩写或IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(参见(1972)Biochem.11942-944)相一致。
B.TTR和淀粉样蛋白病 至少某些淀粉样蛋白病显示了是由超过20种非同源蛋白或蛋白片段的任何之一沉积而引起的，最终导致纤丝交联-β-层四级结构。由正常重叠的蛋白如甲状腺素转运蛋白蛋白形成淀粉样纤丝时需要蛋白错重叠以形成装配-竞争中间体。甲状腺素转运蛋白蛋白(TTR)淀粉样化的过程表明引起三种不同的淀粉样疾病--老年全身性淀粉样变性(SSA)、家族性淀粉样多神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。SSA与野生型TTR的沉积相关，而FAP和FAC则是由超过80种TTR变异体之一的淀粉样化引起的。例如参见，Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-60；Kelly，J.W.Curr.Opin.Struct.Biol.1996，6，11-7；Liu，K.；et al.Nat.Struct.Biol.2000，7，754-7；Westermark，P.；et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-5；Saraiva，M.J.；et al.J.Clin.Invest.1985，76，2171-7；Jacobson，D.R.；et al.N.Engl.J.Med.1997，336，466-73；Buxbaum，J.N.；Tagoe，C.E.Ann.Rev.Med.2000，51，543-569以及Saraiva，M.J.Hum.Mutat.1995，5，191-6，其各自在此全部引入作为参考。
TTR是55kDa的均四聚体，特征为2，2，2对称，在二聚体-二聚体界面具有两个同样的漏斗型结合位点，其中甲状腺激素(T4)可结合于血浆和CSF中。TTR通常与低于1当量的全视黄醇结合蛋白相结合。TTR错重叠包括四聚体解聚成单体，随后单体内的三级结构改变，使得蛋白可能错装配，最终淀粉样变性。FAP的可行疗法采用了由肝移植介导的基因疗法以使用野生型(WT)蛋白替代血液中的TTR变异体。对于多数FAC或SSA患者而言，该治疗不可行，原因是多数患者超过60岁且因为他们的健康状况和受损的心功能而无法成为肝移植的候选人。此外，与FAP相关的若干TTP变异体，在肝移植后发生了进行性淀粉样心肌病，wt TTR在心肌组织沉积，导致死亡。肝移植疗法对于约10种TTR变异体也将无效，因为该TTR由脉络丛合成，其在柔脑脊膜中沉积淀粉样纤丝，导致CNS疾病。因此，需要开发通用的非侵入性药物治疗策略。还需要非蛋白、非肽或非核苷的药物。例如参见，Blake，C.C.；et al.J.Mol.Biol.1978，121，339-56；Wojtczak，A.；et al.Acta Crystallogr.，Sect.D 1996，758-810；Monaco，H.L.；Rizzi，M.；Coda，A.Science 1995，268，1039-41；Lai，Z.；Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry1996，35，6470-82；Holmgren，G.；et al.Lancet 1993，341，1113-6；Suhr，O.B.；Ericzon，B.G.；Friman，S.Liver Transpl.2002，8，787-94；Dubrey，S.W.；et al.Transplantation 1997，64，74-80；Yazaki，M.；et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，702-6；和Cornwell，C.G.III；et al.Am.J.ofmed.1983，75，618-623，各文献通过参考在此全部引入。
C.化合物 在一种实施方案中，用于本文所提供的组合物和方法中的化合物具有式IA结构
其中Y是COOH、四唑基、CONHOH、B(OH)2OH； X是O；以及 R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH、B(OH)2或CF3。
在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中Y是COOH。在另一实施方案中，Y是四唑基、B(OH)2或CONHOH。在另一实施方案中，Y是OH。
在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和OH。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中其中R1、R2和R3各自独立选自氢和CF3。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1和R2各自独立是氢且R3是CF3。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH和B(OH)2。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、Br和I。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和OH。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和B(OH)2。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1和R2各自是卤素且R3是B(OH)2。在另一实施方案中，化合物具有式I结构，其中R1和R2各自是卤素且R3是H。
在另一实施方案中，化合物具有下式结构，
在另一实施方案中，本文提供的化合物具有下式结构
或其药学上可接受的衍生物，其中Het、X和Y如本文其它地方定义。
在另一实施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。在另一实施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、烷基或卤代烷基取代。在另一实施方案中，Het是3-或4-吡啶基，任选被三氟甲基、氯或甲基取代。
在另一实施方案中，本文所提供化合物选自
D.化合物的制备 本文所提供的化合物可通过下面所示的和实施例中的方法制备，或通过本领域技术人员公知的其它方法制备。这些合成方法中的起始物可以是通过商业渠道获得(如，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)。
试剂和溶剂购自Aldrich，Lancaster，Acros，Combi-Blocks，Matrix和Pfaltz-Bauer。THF和CH2Cl2经Al2O3干燥。其它溶剂和试剂由供应商提供且除非另有说明无需进一步纯化即可使用。使用在硅胶60F254预铺板上的分析型薄层色谱(TLC)采用购自EM Science的荧光显示器监测反应。观察TLC板时的同时，进行UV荧光、磷钼酸处理随后加热、或者钼酸铈铵处理随后加热。进行快速层析时使用EM Science的硅胶60(230-400目)。对于文中所述结论必要的新化合物的纯度经HPLC测定。进行正相HPLC时使用Waters 600泵/控制器，Waters 996光电二极管排列检测器和WatersNovaPak硅胶柱。所用的溶剂系统是己烷和乙酸乙酯，洗脱梯度在30分钟从50∶50己烷∶乙酸乙酯至0∶100己烷∶乙酸乙酯。进行反相HPLC时使用Waters 600泵/控制器，Waters 2487双波长检测器和Vydac蛋白和肽C18柱。溶剂系统A是含0.5％三氟乙酸的95∶5水∶乙腈，溶剂B是含0.5％三氟乙酸的5∶95水∶乙腈。梯度洗脱在20分钟由100∶0 A∶B-0∶100 A∶B并于100％B维持10分钟。在AVIV Instruments波谱仪202SF模式上进行圆二色谱。在Varian FT NMR波谱仪上以400MHz质子频率剂量NMR谱。除非另有说明，参照作为内化学位移标准的CHCl3(7.26ppm)以每百万份(ppm)为单位记录质子化学位移。以赫兹(Hz)为单位记录偶合常数。除非另有说明，参照作为内化学位移标准的CDCl3(77.23ppm)以每百万份(ppm)为单位记录碳化学位移。
苯并噁唑合成的一般方法 氨基羟基苯甲酸(0.2mmol)在THF(3mL)中的混合物相继经吡啶(500μl，0.6mmol)和所需的酰氯(0.2mmol)处理。于环境温度搅拌反应10h，回流1h，真空浓缩，无需纯化用于后面步骤中。
将对-甲苯磺酸单水合物(380.4mg，2.0mmol)加入粗反应混合物的二甲苯(5mL)溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。12h后，将反应物冷至环境温度，用NaOH(2mL，1N)猝灭，分离各相。水层经HCI(1N)酸化至pH2并用EtOAc(4×3mL)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将所得残留物溶解于MeOH∶苯(2mL；1∶4)的混合物中，于25℃用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)处理，通过TLC监测反应过程(通常在0.5h后反应完全)。真空浓缩反应混合物，残留物经层析(10-25％EtOAc/己烷梯度)得到所需的苯并噁唑甲酯。
将苯并噁唑甲酯溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)混合物中并用LiOH.H2O(4当量)处理。于环境温度搅拌反应物并经TLC监测。反应完全后，混合物经1N HCI酸化至pH2，用EtOAc(4×)萃取。合并的有机层经MgS04干燥，过滤并浓缩。残留物经制备薄层层析(4.9％MeOH，95％CH2Cl2，0.1％HOAc)得到产物，为白色固体。
可供选择地，化合物可如下所示制备。
氨基羟基苯甲酸(0.2mmol)在THF(3mL)中的混合物相继经吡啶(500μl，0.6mmol)和所需的酰氯(0.2mmol)处理。于环境温度搅拌反应10h，回流1h，真空浓缩，无需纯化用于后面步骤中。
将对-甲苯磺酸单水合物(380.4mg，2.0mmol)加入粗反应混合物的二甲苯(5mL)溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。12h后，将反应物冷至环境温度，用NaOH(2mL，1N)猝灭，分离各相。水层经HCI(1N)酸化至pH2并用EtOAc(4×3mL)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。(不必含水操作)将所得残留物溶解于MeOH∶苯(2mL；1∶4)的混合物中，于25℃用TMS-CHN2(200μL的2.0M己烷溶液，0.4mmol)处理，通过TLC监测反应过程(通常在0.5h后反应完全)。真空浓缩反应混合物，残留物经层析(10-25％EtOAc/己烷梯度)得到所需的苯并噁唑甲酯。将苯并噁唑甲酯溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1，0.07M)混合物中并用LiOH·H2O(4当量)处理。于环境温度搅拌反应物并经TLC监测。反应完全后，混合物经1N HCI酸化至pH2，用EtOAc(4×)萃取。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。残留物经制备薄层层析(4.9％MeOH，95％CH2Cl2，0.1％HOAc)得到产物，为白色固体。
可供选择的路线 在共沸除去水的二甲苯中进行反应。含水操作后，过滤沉淀的固体并溶解于乙酸乙酯中，用己烷稀释，搅拌30分钟，然后滤除沉淀物并浓缩滤液至10ml，过滤固体沉淀得到纯化合物为乳酪色(cream color)固体。
E.药物组合物的配制 本文提供的药物组合物包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的本文提供的一种或多种化合物，其适用于预防、治疗、或缓解与甲状腺素转运蛋白(TTR)错重叠相关或牵涉TTR错重叠的疾病或紊乱的一种或多种症状。与TTR错重叠相关的疾病或紊乱包括但不限于家族性淀粉样多发性神经病、家族性淀粉样心肌病、老年全身性淀粉样变性、阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob disease)、多发性神经病、II型糖尿病、甲状腺髓质瘤和肥胖症。适用于给予本文提供化合物的载体包括本领域技术人员已知的适用于具体给药方式的任何载体。
此外，可将化合物配制为组合物中的单一药学活性成分或可与其它活性成分相联合。
组合物包含本文提供的一种或多种化合物。在一种实施方案中，这些化合物被配制在适宜的药物制剂中，比如溶液、悬浮液、片剂、分散片、丸剂、胶囊、粉末剂、缓释制剂或酏剂，口服或胃肠外给药的无菌溶液或悬浮液，以及透皮补片制剂或干粉吸入剂。在一种实施方案中，使用本领域公知的技术和方法将上述化合物被配制在药物组合物中(例如参见，AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms，Fourth Edition 1985，126)。
在这些组合物中，将有效浓度的一种或多种化合物或其药学上可接受的衍生物与适宜的药学载体相混合。如上所述，这些化合物可以被衍生为相应的盐、酯、烯醇醚或酯、缩醛、缩酮、原酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂化物、水合物或配制之前的前药。组合物中化合物的浓度，在给药后，可有效释放以治疗、预防或改善与甲状腺素转运蛋白(TTR)错重叠相关或牵涉TTR错重叠的疾病或紊乱的一种或多种症状。
在一种实施方案，将组合物配制为单一剂量给药。配制组合物时，将一定重量的化合物溶解于、悬浮、分散或混合于所选载体中，其浓度足以减轻、预防所治疗病情或缓解一种或多种症状。
在药学上可接受载体内包含的活性化合物的量足以对于所治疗的患者产生治疗有益效果而没有不合意的副作用。通过在体外和体内体系中测试化合物然后由此外推用于人的剂量，即可凭经验确定治疗有效浓度。
药物组合物中活性化合物的浓度将取决于活性化合物的吸收、灭活和排泄速率、化合物的理化特性、剂量方案、给药量以及本领域技术人员已知的其它因素。例如，使给药量足以缓解与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的疾病或紊乱的一种或多种症状，如本文所述。
在一种实施方案中，治疗有效量将产生约0.1ng/ml-约50-100μg/ml的活性成分血浆浓度。在另一种实施方案中，药物组合物将提供约0.001mg-约2000mg化合物每千克体重每天的剂量。
制备药物剂量单位形式以提供约0.01mg、0.1mg或1mg-约500mg、1000mg或2000mg以及在一种实施方案中约10mg-约500mg活性成分或必要成分组合的每剂量单位形式。
活性成分可以一次给药，或可分成若干较小剂量间隔给药。应理解到，准确剂量和疗程是所治疗疾病的函数，可使用已知的测试法或由体内或体外测试数据外推而凭经验确定。应注意，浓度和剂量值还可随着所缓和的病情的严重程度而改变。还应理解到对于任何具体受试者，应根据个体需要和给药者或监督者的专业判断随着时间调整特定的剂量方案，在此阐明的浓度范围仅是例示性的且不意在限制所要求的组合物的范围和实践。
在化合物的溶解度不足的情况下，可以使用增加化合物溶解度的方法。这些方法为本领域技术人员已知且包括但不限于使用辅溶剂比如二甲基亚砜(DMSO)、使用表面活性剂比如
、或在碳酸氢钠水溶液中溶解。还可使用这些化合物的衍生物比如化合物的前药配制有效的药物组合物。
在混合或加入化合物时，所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等。所得混合物的形式取决于大量因素，包括预期的给药方式和化合物在所选载体或媒介内的溶解度。有效浓度足以充分缓解疾病症状、所治疗的紊乱或病情并可凭经验确定。
以单位剂型将药物组合物提供给人和动物，比如包含适宜量化合物或其药学上可接受衍生物的片剂、胶囊、丸剂、粉末剂、颗粒剂、无菌胃肠外溶液或悬浮液、口服溶液或悬浮液以及油-水乳剂。在一种实施方案中，药学上有疗效的活性化合物或其衍生物被配制于单位剂型或多剂型内或以此给药。本文所用的单位剂型是指适用于人或动物受试者的物理上分离且如本领域已知分别包装的单位。各单位剂量包含预定量的治疗活性化合物，其足以产生所需的疗效，且与所需的药物载体、媒介物或稀释剂相联合。单位剂型例如包括安瓿和注射器以及分别包装的片剂或胶囊。单位剂型可以分份或多次给药。多剂型是包装在单一容器中的多个同样的单位剂型，其以分离的单位剂型给药。多剂型例如包括小瓶、片剂或胶囊瓶或品脱或加仑瓶。由此，多剂型是在包装中无法分离的多个单位剂量。
液态药学上可给药的组合物例如可以通过溶解、分散或混合上述活性化合物与载体中任选的药物辅料如水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等从而形成溶液或悬浮液而制备。需要时，所给药的药物组合物还可包含少量无毒的辅助物比如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等试剂。
制备这些剂型的实际方法对于本领域技术人员是已知的或是显然的，例如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，15th Edition，1975。
可制备包含0.005％-100％活性成分且余量由无毒载体构成的剂型或组合物。本领域技术人员已知制备这些组合物的方法。所述组合物可包含0.001％-100％活性成分，在一种实施方案中为0.1-95％，在另一种实施方案中为75-85％。
1、口服给药的组合物 口服药物剂型是固体、凝胶或液体。固体剂型是片剂、胶囊、颗粒剂或散装粉末剂。口服片剂的类型包括压缩、可咀嚼的锭剂和肠溶包衣、糖包衣或膜包衣的片剂。胶囊可以是硬或软明胶胶囊，同时颗粒和粉末可以以非泡腾或联合有本领域技术人员已知的其它成分的泡腾形式提供。
a.口服的固体组合物 在某些实施方案中，制剂是固体剂型，在一种实施方案中是胶囊或片剂。片剂、丸剂、胶囊、药片等可包含一种或多种下列组分下列成分或类似性质的化合物粘合剂、润滑剂、稀释剂、助流剂、崩解剂、着色剂、甜味剂、增香剂、润湿剂、催吐剂层和膜包衣。粘合剂例如包括微晶纤维素、黄蓍树胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、凝胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯基吡咯烷酮、交联聚乙烯聚吡咯烷酮、蔗糖与浆糊。润滑剂包括滑石、淀粉、硬脂酸镁或者钙、石松子(lycopodium)与硬脂酸。稀释剂例如包括乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露糖醇与磷酸二钙。助流剂包括但不局限于胶体二氧化硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟基乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、皂土、甲纤维素、琼脂与羧甲基纤维素。着色剂例如包括任何批准的经证明是水溶性的FD和C染料及其混合物；以及悬浮于氧化铝水合物上的水不溶性FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露糖醇与人造的甜味剂比如糖精，以及许多喷雾干燥香料。增香剂包括从植物比如果实中提取的天然香料和能产生欣快感的合成化合物的混合物比如但不限胡椒薄荷与水杨酸甲酯。润湿剂包括单硬脂酸丙二醇酯、单油酸山梨醇酐酯、二甘醇月桂酸酯与聚氧化乙烯月桂醚。催吐层包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、氨合物虫胶与醋酞纤维素。膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和乙酸酞酸纤维素。
化合物或其药学上可接受的衍生物可在防止其接触胃酸环境的组合物中提供。例如，组合物可以被配制于肠溶衣内，在胃内保持了其完整性并在肠内释放活性化合物。组合物还可与抗酸剂或其它这样的成分联合配制。
当单位剂型是胶囊时，除上述类型物质外，其可包含液体载体比如脂肪油。此外，单位剂型可包含多种修改剂型物理形式的其它物质，例如糖和其它肠溶试剂的包衣。这些化合物还可作为酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片口香糖等。除了活性化合物，糖浆可包含作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂和芳香剂。
活性物还可与不损害所需作用的其它活性物混合，或与补充所需作用的物质比如抗酸剂、H2阻滞剂和利尿剂。活性成分是本文所述的化合物或其药学上可接受的衍生物。可包括更高浓度，高达98％重量份的活性成分。
在所有实施方案中，为了修改或延缓活性成分的溶解，片剂和胶囊剂可如本领域技术人员已知的方式包衣。由此，例如可用常规的肠溶可消化包衣比如水杨酸苯酯、蜡和乙酸酞酸纤维素进行包衣。
b.口服的液体组合物 液体口服剂型包括水溶液、乳剂、悬浮剂、由非泡腾颗粒再构成的溶液和/或悬浮液。水溶液例如包括酏剂和糖浆。乳剂可以是水包油或油包水。
酏剂是澄清的、甜的或水醇制剂。用于酏剂的药学上可接受的载体包括溶剂。糖浆可以是糖如蔗糖的浓水溶液并可包含防腐剂。乳剂是两相体系，其中一种液体以小颗粒形式分散在另一液体中。用于乳剂的药学上可接受的载体是非水液体、乳化剂和防腐剂。用于非泡腾颗粒再构成液体口服剂型的药学上可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。用于泡腾颗粒再构成液体口服剂型的药学上可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。着色剂和芳香剂用于上述所有剂型中。
溶剂包括甘油、山梨醇、乙醇和糖浆。防腐剂例如包括甘油、对羟苯甲酸甲酯和丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和醇。用于乳剂的非水溶液例如包括矿油和棉花籽油。乳化剂例如包括凝胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、皂土和表面活性剂比如聚氧化乙烯单油酸山梨醇酐酯。悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、黄蓍胶、硅酸镁铝与阿拉伯胶。
甜味剂包括蔗糖、糖浆、甘油和人造甜味剂比如糖精。润湿剂包括单硬脂酸丙二醇酯、单油酸山梨醇酐酯、二甘醇月桂酸酯和聚氧化乙烯月桂基醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括批准的经证明是水溶性的FD和C染料及其混合物。芳香剂包括从植物如果实提取的天然香料和产生欣快味觉的合成化合物的掺合物。
对于固体剂型，在例如碳酸丙烯、植物油或甘油三酯中溶液或悬浮液是包封在明胶胶囊内的一种实施方案。该溶液及其制剂和包封，公开于美国专利号4,328,245、4,409,239和4,410,545中。对于液体剂型，例如在丙二醇中的溶液可经足量的药学上可接受的液体载体如水稀释从而便于测量给药。
可供选择地，制备液体或半固体口服制剂时，可将活性化合物或盐溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)和其它这样的载体中，并在硬或软明胶胶囊壳中包封这些溶液或悬浮液。其它有用的制剂包括美国专利号RE28,819和4,358,603中阐述的那些。简言之，这些制剂包括但不限于包含本文提供的化合物、二烷基化单-或多-亚烷基二醇，包括但不限于1，2-二氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的大约平均分子量，一种或多种抗氧化剂比如丁酸化的羟基甲苯(BHT)、丁酸化的羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、氢醌、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、马来酸、山梨醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯、二硫代氨基甲酸酯。
其它制剂包括但不限于包括药学上可接受的缩醛的含水醇溶液。用于这些制剂的醇是任何药学上可接受的水混溶溶剂，其具有一个或多个羟基，包括但不限于丙二醇和乙醇。缩醛包括但不限于低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛比如乙醛二乙基缩醛。
2、注射剂、溶液和乳剂 此处还涉及胃肠外给药，在一种实施方案中的特征为皮下、肌内或静脉内注射。注射剂可被制备为常规形式，为液体溶液或悬浮液，适于在注射前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或为乳剂。注射剂、溶液和乳剂还包含一种或多种赋形剂。适宜的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。此外，需要时，所给予的药物组合物还可包含少量非毒性辅助物比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它这样的物质如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
在此还涉及缓慢释放或延迟释放系统的植入剂，从而维持恒定水平的剂量(例如参见美国专利号3,710,795)。简言之，将本文提供的化合物分散于固体惰性基质内，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、可塑的或不可塑的聚氯乙稀、可塑的尼龙、可塑的聚亚乙基对苯二酸、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水聚合物比如丙烯酸和甲基丙烯酸酯的水凝胶、胶原、交联聚乙烯醇和交联部分水解的聚乙酸乙烯酯，其被外围的聚合膜如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅烷、氯丁橡胶、氯化的聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯、亚乙烯基氯化物、乙烯和丙烯的共聚物、聚乙烯对苯二酸盐离聚物、丁基橡胶表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和在体液中不溶的乙烯/乙烯基氧基乙醇共聚物所包围。这些化合物以控释速率步骤扩散通过外部的聚合物膜。包含在这些胃肠外组合物中的活性化合物的百分比高度取决于其特定形式以及化合物的活性和受试者的需要。
组合物的胃肠外给予包括静脉内、皮下和肌内给药。胃肠外给药的制剂包括便于注射的无菌溶液、便于恰在使用前与溶剂相混合的无菌干燥可溶产品比如冻干粉，包括皮下片、便于注射的无菌悬浮液、便于恰在使用前与媒介物相混合的无菌干燥不溶产品和无菌乳剂。溶液可以是水溶液或非水溶液。
如果静脉内给药，适宜的载体包括生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS)，包含增稠剂和增溶剂的溶液比如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
药学上可接受的用于肠胃外制剂的载体包括含水媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、多价螯合剂或者螯合剂及其它药学上可接受的物质。
含水媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射、葡萄糖与乳酸盐林格注射液。非水的肠胃外媒介物包括植物源的固定油类、棉子油、玉米油、芝麻油与花生油。必须将抑菌或抑霉剂浓度的抗微生物剂加入到被包装在成倍剂量容器内的肠胃外制剂中，包括石炭酸或者甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、对-羟基苯甲酸甲酯或丙酯、硫柳汞、氯苄烷铵与氯化苄乙氧铵。等渗剂包括氯化钠与葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐与柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮与分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素与聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯85(TWEEN 80)。金属离子的多价螯合剂或者螯合剂包括乙二胺四乙酸。药物载体还包括用于水溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇与丙二醇；以及用于pH调整的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或者乳酸。
调整药学活性化合物的浓度以使得注射剂提供有效量从而产生所需的药理作用。准确剂量取决于患者或动物的年龄、体重和病情，这是本领域已知的。
将单位剂量的胃肠外制剂包装于安瓿、小瓶或带针头的注射剂中。胃肠外给药的所有剂型必须是无菌的，如本领域已知和实践的那样。
如所举例说明的，包含活性化合物的无菌水溶液的静脉内或动脉内灌注是有效的给药方式。另一实施方案是无菌水溶液或油溶液或悬浮液，其包含必要的活性物从而产生所需药理学作用。
注射剂被设计为局部和全身给药。在一种实施方案中，治疗有效剂量被配制为包含至少约0.1％w/w高至约90％w/w或更高的浓度，在某些实施方案中给予所治疗的组织超过1％w/w的活性物质。
化合物可以以微粉化或其它适当形式悬浮，或可经衍生以产生溶解性更佳的活性产物或产生前药。所得混合物的形式取决于许多因素，包括预期的给药方法和化合物在所选载体或媒介物中的溶解度。有效浓度足以缓解病情的症状并可凭经验确定。
3、冻干粉 本文还关注冻干粉，其可重构成溶液、乳剂和其它混合物给药。它们还可重构并被配制为固体或凝胶。
制备无菌、冻干粉时，在适宜溶剂中溶解本文提供的化合物或其药学上可接受的衍生物。溶剂可包含改善稳定性的赋形剂或者其它药理学成分粉末或由粉末制备的重构溶液。可用的赋形剂包括但不限于葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖和其它适宜的试剂。在一种实施方案中，于约中性pH处，溶剂还可包含缓冲剂比如柠檬酸盐、磷酸钠或钾或本领域技术人员已知的其它缓冲剂。随后无菌过滤溶液并接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干就提供了所需的剂型。在一种实施方案中，所得溶液将被分配于小瓶内从而冻干。各小瓶将包含单一剂量或多级的化合物。冻干粉可在适当条件下储存，比如于约4℃至室温。
该冻干粉与注射用水重构成用于胃肠外给药的制剂。为了重构，将冻干粉加入无菌水或其它适宜载体中。准确量取决于所需的化合物。该量可凭经验确定。
4、局部给药 如局部和全身给药所述制备局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂等等并可以被配制为乳剂、凝胶剂、膏剂、乳剂、溶液、酏剂、洗液、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗剂(irrigation)、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤补片或者任何其它适于局部给药的制剂。
可将化合物或其药学上可接受的衍生物配制为局部施用的气雾剂，比如吸入剂(例如参见美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其公开给予适用于治疗炎症疾病特别是哮喘的甾类的气雾剂)。这些给予呼吸道的制剂可以是气雾剂或喷雾溶液的形式，或可以是单独或与其它惰性载体比如乳糖相混合的用于吹入的微粉粉末。此时，制剂的颗粒，在一种实施方案中直径低于50微米，在一种实施方案中低于10微米。
化合物可被配制为局部(local or topical)施用，比如以凝胶、乳剂和洗剂的形式局部施用于皮肤和粘膜，比如眼中，以及施用于眼或脑池内(intracisternal)或脊柱内施用。局部给药涉及透皮给药以及眼或粘膜给药或吸入治疗。还可给予单独的或与其它药学上可接受赋形剂相混合的活性化合物的鼻腔溶液。
这些溶液，特别是预期用于眼科的那些，可以被配制为0.01％-10％等渗溶液、pH约为5-7，含有适当盐。
5、用于其它给药途径的组合物 本文还涉及其它的给药途径比如包括离子电渗疗法和电泳装置的透皮补片、口腔和直肠给药。
透皮补片，包括离子电渗疗法(iotophoretic)和电泳装置为本领域技术人员已知。例如，这些补片公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中。
例如，用于直肠给药的药物剂型是全身效果的直肠栓剂、胶囊和片剂。本文所用的直肠意指用于插入直肠的固体，其在体温处熔融或软化从而释放一种或多种药理上或治疗上有效的活性成分。用于直肠的药学上可接受的物质是基质或媒介物以及提高熔点的试剂。基质例如包括可可油(可可脂)、甘油-明胶、碳蜡(聚乙二醇)和脂肪酸单-、二-和甘油三酯的适当混合物。可使用多种基质的联合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸油和蜡。直肠栓剂可通过压制法或模铸法制备。直肠栓剂的重量，在一种实施方案中为约2-3gm。
使用同样的药学上可接受物质并通过与配制口服制剂相同的方法制造用于直肠给药的片剂和胶囊。
6、靶向制剂 本文所提供的化合物或其药学上可接受的衍生物还可被配制为靶向所治疗受试者身体的具体组织、受体或其它区域。许多这样的靶向方法为本领域技术人员公知。所有这样的靶向方法在此意在用于本组合物。靶向方法的非限制性实例例如参见美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。
在一种实施方案中，脂质体悬浮液，包括靶向组织的脂质体，比如靶向肿瘤的脂质体，还可适用作药学上可接受的载体。还可根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，脂质体可如美国专利号4,522,811所述制备。简言之，脂质体比如多层囊泡(MLV′s)可通过在烧瓶内干燥鸭蛋磷脂酰胆碱和脑磷脂酰丝氨酸(7∶3摩尔比)而形成。将本文提供化合物加入到不含二价阳离子的磷酸缓冲盐水(PBS)中溶液并振动烧瓶直至脂膜分散。洗涤所得囊泡以除去未包封的化合物、离心成球，然后再悬浮于PBS中。
7、制造品 化合物或药学上可接受的衍生物可被包装成制造品，其包含包装材料、包装材料内的在此提供的化合物或其药学上可接受的衍生物，其有效地预防TTR错重叠或者治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状，以及指示化合物或组合物或其药学上可接受的衍生物用于调节TTR重叠或用于治疗、预防或改善与TTR错重叠相关或牵涉TTR错重叠的的疾病或紊乱的一种或多种症状的标签。
在此提供的制造品包含包装材料。用于包装药品的包装材料也为本领域技术人员所知。例如参见美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药物包装材料例如包括但不限于泡包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶容器、注射器、瓶子和适于所选制剂以及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。在此涉及这里提供的化合物和组合物的大量制剂，其作为对于其中涉及TTR错重叠作为介导或有助于症状或病因的任何疾病或紊乱的许多疗法。
F.化合物活性的评价 使用了许多体外测试来评价化合物稳定甲状腺素转运蛋白四聚体或预防纤丝形成的能力。这些测试包括纤丝形成测验、血浆选择性测验、甲状腺素转运蛋白化合物复合物三维结构的确定(如，通过X-射线结晶图)、甲状腺素转运蛋白四聚体解聚或纤丝形成的动力学、以及例如通过离心或热量测定而确定甲状腺素转运蛋白化合物相互作用的化学计量和能量。体外测验的例示性细节示于实施例中。
用于筛选法中的甲状腺素转运蛋白可以是野生型甲状腺素转运蛋白或甲状腺素转运蛋白突变体，比如天然存在的甲状腺素转运蛋白突变体，其在病因上与出现甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病比如家族性淀粉样多发性神经病或家族性淀粉样心肌病相关。例示性的天然存在的甲状腺素转运蛋白突变体包括但不限于V122I、V30M、L55P(突变体的命名描述了相对于野生型在所述氨基酸位置的取代基，例如参见Saraiva et al.(2001)Hum.Mut.17493-503)。
对于有效抵抗TTR淀粉样变性的化合物，其必须强烈地选择性结合TTR，由此在血浆中其在所有其它血浆蛋白存在下区分出TTR。由此，使用两种测验评价化合物。第一种测验是停滞纤丝形成测验，已进行过深入描述。在该测验中，以3.6或7.2μM将测试化合物加入3.6μM的TTR溶液中。在这两种浓度下，有足够的测试化合物负载于TTR的一个或两个结合位点。然后通过将pH降低至4.4(在此pH下，TTR淀粉化形成的速率最大)而将溶液置于致淀粉样条件下。72h后，测量了TTR溶液(其与TTR聚集相关)与测试化合物(T测试)的浊度并与不含任何测试化合物的溶液(T对照)进行了比较。抑制纤丝形成的程度根据含有和不含测试化合物的浊度差异而计算 抑制率＝(T对照-T测试)/(T对照)×100％ 高抑制率表明化合物活性很强。
第二种测验是由本实验室新近开发的抗体俘获法，从而测量测试化合物在人血浆内在存在所有其它血浆蛋白下与TTR相结合的能力。在该测验中，将测试化合物溶解于10.8μM人血浆中(约3倍TTR浓度)并培育24h。然后使用结合于琼脂糖树脂的多克隆TTR抗体免疫沉淀TTR和任何结合的小分子。洗涤树脂后，在高pH下解聚抗体-TTR复合物，由在HPLC中它们的峰面积确定TTR相对于测试化合物的化学计量。
在第一种测验中的高活性可以定义为在7.2μM处＞90％抑制和在3.6μM处＞60％抑制。在第二种测验中，其定义为＞1测试化合物结合于每当量TTR四聚体。
G.化合物和组合物的使用方法 还提供了在组织或生理液体内稳定甲状腺素转运蛋白并由此抑制错重叠的方法。通常，方法涉及给予组织或生理液体稳定量的本文提供的化合物，结合于甲状腺素转运蛋白并通过动力学稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体解聚。
由此，在疾病组织内稳定甲状腺素转运蛋白的方法改善了错重叠并减轻了相关疾病的症状，根据疾病的不同情况可以有助于治愈该疾病。在此还虑及在组织和/或细胞内已知甲状腺素转运蛋白错重叠。错重叠的程度和由此本发明化合物所达到的抑制程度可通过多种方法评价，比如在实施例和国际专利申请号WO2004/056315中描述的那些。上述参考的申请文件在此通过参考而全部引入。
在此还提供了治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的一种或多种症状的方法，该方法涉及给予治疗有效量的在此提供的化合物。在一种实施方案中，化合物通过动力学稳定天然态的甲状腺素转运蛋白四聚体而防止甲状腺素转运蛋白四聚体解聚。甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病例如可以是家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性。其它的甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病包括但不限于阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob disease)、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤(例如参见国际专利申请公开号WO 98/27972和WO95/12815)。
提供了通过给予在此提供的化合物而治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导的疾病或紊乱的一种或多种症状的方法。甲状腺素转运蛋白介导的疾病和紊乱包括但不限于肥胖症(例如参见国际专利申请公开号WO02/059621)。
还提供了使用在此提供的化合物或组合物稳定TTR四聚体的方法。还提供了使用在此提供的化合物或组合物抑制TTR淀粉样形成的方法。
在此还提供了在此所述的任何化合物或药物组合物用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(如家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状的用途。
在此还提供了在此所述的任何化合物或药物组合物在制造用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病(如家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性)的一种或多种症状的药物中的用途。
H.联合疗法 在此提供了化合物和组合物可以作为单一疗法或与其它活性成分相联合而给药。例如，化合物和组合物可以与已知用于治疗淀粉样变性和淀粉样紊乱的其它化合物相联合，包括但不限于国际专利申请公开号WO98/27972、WO 02/059621和WO 95/12815以及W02004/056315中公开的那些。用于联合疗法的其它活性成分包括但不限于
和批准用于治疗淀粉样变性的其它产品，淀粉样变性包括但不限于家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性、阿尔茨海默病、海绵状脑病(Creutzfeldt Jakob disease)、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤。用于联合疗法的其它活性成分包括但不限于批准用于肥胖症的产品。
仅是为了举例说明的目的提供了下面的实施例，并非意在限制本发明的范围。
实施例1
步骤1
将SOCl2(15ml)加入2-氯-4-甲氧基苯甲酸(.285gm)中并在搅拌条件下于90℃回流3小时。真空蒸发反应混合物并用于进一步的反应。
得到(粗品)--.313gm。
步骤2
将4-氨基-3-羟基苯甲酸(.234gm)、T.H.F(15ml)和吡啶(.37ml)的混合物加入粗酰氯(.313gm)中并于80℃回流过夜。将反应混合物倾入水中，然后用乙醚萃取并蒸发得到酰胺。
得到--.8gm。
步骤3
将酰胺(.8gm)溶解于联苯基醚(25ml)中，向其中加入PTSA(68mg)，在回流条件下于220℃回流过夜。一旦反应完成，通过过滤收集产物并用己烷和乙醚洗涤。
得到--.405gm。
步骤4
将酸(.405gm)溶解于15ml T.H.F中，向溶液中加入.424ml的T.M.S-CHN2并在搅拌条件下保持过夜。反应混合物经快速色谱法用5％己烷的乙酸乙酯溶液纯化。
得到--.107gm。
步骤5
将甲基酯(.090gm)溶解于10ml的T.H.F∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)中，向其中加入LiOH.H2O(0.048gm)并搅拌4小时。一旦反应完成，稀释反应混合物并用1N HCl酸化，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤并真空浓缩。得到浅黄色固体。
得到--.084gm。
收率％--97.67％。
终化合物 颜色-浅黄色 状态-固体 重量-84gm。
实施例2
步骤1
将2-氯-4-羟基苯甲酸(.5gm)溶解于DMF(10ml)中，向其加入K2CO3(1.201克)然后搅拌下于0℃下加入溴苄(.688ml)(逐滴)，保持1小时。反应完成后，加入水并用乙酸乙酯萃取，盐水溶液洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩。此后经快速层析纯化，用己烷.乙酸乙酯溶液(5％)洗脱。
得到--.930gm。
步骤2
将二苄基酯(.5克)溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)10ml中。向其加入LiOH.H2O(.24克)，室温搅拌4小时，一旦完成，反应混合物经水稀释并用1N HCl酸化，乙酸乙酯萃取，盐水溶液洗涤，真空浓缩得到浅黄色固体。
得到--.157gm。
步骤3
将亚硫酰氯加入酸中，随后加入一滴DMF，在回流条件下于80℃搅拌4小时。真空蒸发反应物，粗酰氯用于进一步反应。
步骤4
4-氨基-3-羟基苯甲酸(.122克)的THF(15ml)溶液相继经吡啶(.19ml)处理。将酰氯溶解于THF中，于0℃逐滴加入上述混合物中，室温搅拌过夜，真空蒸发，粗产物用于进一步反应。
得到--.485克。
步骤5
将酰胺(.485克)溶解于DPE中，向其加入PTSA(10摩尔％)，于200-220℃回流3小时。得到含有所需产物与副产物混合物的固体。
得到--.430克。
步骤6
将酸(.430克)溶解于DMF(20ml)中，向其加入K2CO3(.57克)，然后在搅拌下于0℃逐滴加入溴苄(.35ml)并保持1小时，反应完成后，加入水，用乙酸乙酯萃取，盐水溶液洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩。此后，使用7％己烷的乙酸乙酯溶液将粗产物经快速层析纯化。
得到--.469克。
步骤7
将二苄基酯(.170克)溶解于THF∶MeOH∶H2O(3∶1∶1)中，向其加入LiOH.H2O(.061克)，室温搅拌4小时。一旦完成，反应混合物经水稀释并用1N HCl酸化，经乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤，真空浓缩。其经乙酸乙酯洗涤，结果得到白色固体。
得到--.044克。
终化合物 颜色-白色 熔点-226.2℃ 重量-43mg。
实施例3
4-(4-氰基-苯甲酰氨基)-3-羟基-苯甲酸的制备
向搅拌着的3-氨基-4-羟基苯甲酸(0.185g，0.0012摩尔)和吡啶(0.287g，0.00363摩尔)的18.5ml干燥THF溶液中加入4-氰基苯甲酰氯(0.2g，0.0012摩尔)，该溶液在氮氛下于室温搅拌10小时，然后回流3小时。反应混合物经旋转蒸发，残留物在水中形成淤浆，过滤得到酰胺(0.18g)，其无需进一步纯化而用于下一步骤。
2-(4-氰基-苯基)-苯并噁唑-5-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于30ml二甲苯中，加入40mg对甲苯磺酸。然后于160℃回流反应混合物12小时。于冷却过滤RM。使残留物在乙醚中形成淤浆，再次过滤。然后在1.5N HCl中搅拌残留物30分钟并在乙酸乙酯中萃取，经无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到0.045g纯标题化合物。
实施例4
4-羟基-3-(4-三氟甲氧基-苯甲酰氨基)-苯甲酸的制备
向搅拌着的3-氨基-4-羟基苯甲酸(0.136，0.00089摩尔)和吡啶(0.211g，0.00267摩尔)的13ml干燥THF溶液中加入4-三氟甲氧基苯甲酰氯(0.2g，0.00089摩尔)，在氮氛中室温搅拌该溶液10小时，然后回流3小时。旋转蒸发反应混合物，残留物在水中形成淤浆，过滤得到酰胺(0.175g)，其无需进一步纯化用于下一步骤。
2-(4-三氟甲氧基-苯基)-苯并噁唑-5-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于30ml二甲苯中，加入40mg对甲苯磺酸。然后于160℃回流反应混合物12小时。于冷却过滤RM。使残留物在乙醚中形成淤浆，过滤得到纯标题化合物(70mg)。
实施例5
步骤1
将硝基化合物溶解于甲醇中并加入SnCl2.2H2O，加热回流，在2小时内反应完全。彻底浓缩溶剂，加入冷水，用乙酸乙酯洗涤。用碳酸氢盐溶液碱化水层，用乙酸乙酯萃取。有机层分别经D.M.水和盐水溶液洗涤。经Na2SO4洗涤并浓缩。
属性固体 收率％82.8％ 纯度91.64％。
步骤2
氨基羟基苯甲腈(步骤1)的THF溶液相继经吡啶和酰氯处理。室温搅拌反应混合物14小时，真空浓缩，无需纯化用于下一步骤。
步骤3
将PTSA.H2O加入粗酰胺(步骤2)的二甲苯溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。16小时后，冷至室温，真空浓缩。残留物经层析(5-10％EtOAc/己烷)得到所要的环化氰基产物 属性白色固体 收率％53％ 纯度100％。
步骤4
将苯甲腈(步骤3)化合物和NH4Cl置于DMF中。将混合物冷至0℃，在5-6分钟内按份加入NaN3。反应混合物于0℃搅拌5分钟，于室温搅拌15分钟。将反应混合物于40℃加热1h，然后在3h内缓慢升至90℃。反应混合物于90℃搅拌20h，然后冷至0-5℃。反应物经水猝灭，用1N HCl调节pH至2，用EtOAc萃取。合并的有机层经水洗涤，干燥，浓缩得到胶状物，真空下彻底干燥2h得到浅棕色固体。固体经5％己烷∶EtAc混合物洗涤，干燥。
属性浅棕色固体 收率％60.9％ 纯度99.8％。
实施例6
步骤1
将硝基化合物溶解于甲醇中并加入SnCl2.2H2O，加热回流，在2小时内反应完全。彻底浓缩溶剂，加入冷水，用乙酸乙酯洗涤。用碳酸氢盐溶液碱化水层，用乙酸乙酯萃取。有机层分别经D.M.水和盐水溶液洗涤。经Na2SO4洗涤并浓缩。
属性固体 收率％82.8％ 纯度91.64％。
步骤2
将氨基羟基苯甲腈的THF溶液相继经吡啶和所需的酰氯处理。室温搅拌反应混合物14小时，真空浓缩，加入乙酸乙酯，用1％HCl和盐水洗涤。经Na2SO4干燥，浓缩。
属性固体 收率％66％ 纯度88.9％。
步骤3
将PTSA.H2O加入粗反应混合物的二甲苯溶液中，回流搅拌所得混合物过夜。16小时后，冷至室温，真空浓缩。残留物经层析(5-10％EtOAc/己烷)得到所要的环化的氰基产物。
属性白色固体 收率％30.4％ 纯度97.2％。
步骤4
将苯甲腈(步骤3)化合物和NH4Cl置于DMF中。将混合物冷至0℃，在5-6分钟内按份加入NaN3。反应混合物于0℃搅拌5分钟，于室温搅拌15分钟。将反应混合物于40℃加热1h，然后在3h内缓慢升至90℃。反应混合物于90℃搅拌20h，然后冷至0-5℃。反应物经水猝灭，用1N HCl调节pH至2，用EtOAc萃取。合并的有机层经水洗涤，干燥，浓缩得到胶状物，真空下彻底干燥2h得到浅棕色固体。固体经5％己烷∶EtAc混合物洗涤，干燥。
属性浅棕色固体 收率％48％ 纯度99.8％。
实施例7
4-[(6-氯-吡啶-3-羰基)-氨基]-3-羟基-苯甲酸的制备
向搅拌着的4-氨基-3-羟基苯甲酸(0.490g，0.0032摩尔)和吡啶(0.76g，0.0096摩尔)的50ml干燥THF溶液中加入6-氯烟酰氯(0.56g，0.0032摩尔)，氮氛下于室温搅拌溶液10小时，然后回流3小时。旋转蒸发反应混合物，使残留物在水中形成淤浆，过滤得到酰胺(0.8g)，其无需进一步纯化而用于下一步骤。
2-(6-氯-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于75ml二甲苯中，加入150mg对甲苯磺酸。然后在5小时内将反应混合物逐步加热至160℃，保持此温度12小时。于冷却过滤反应混合物。使残留物在乙醚中形成淤浆，过滤得到粗产物，其经制备HPLC纯化得到纯标题化合物。
0.2g粗化合物得到0.55g纯产物。
实施例8
3-羟基-4-[(2-甲基-吡啶-3-羰基)-氨基]-苯甲酸
将2-甲基烟酰氯(0.2g，0.00128摩尔)溶解于30ml干燥的DCM，氮氛下于0℃将N，N′-二异丙基乙胺(0.994g，0.00769摩尔)缓慢加入酰氯溶液中。于0℃将4-氨基-3-羟基苯甲酸(0.196g，0.00128摩尔)的10ml干燥THF溶液缓慢加入上述溶液中。该溶液于0℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。然后用100ml乙酸乙酯稀释反应混合物，搅拌30分钟。经C盐床滤除沉淀的焦油物，有机相经4×20ml水洗涤，2×10ml盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗酰胺(140mg)，其无需进一步纯化而用于环化步骤。
2-(2-甲基-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制备
将粗酰胺溶解于10ml DMSO中，加入40mg对甲苯磺酸。然后将溶液置于微波辐射，短脉冲15分钟。然后将反应混合物冷至室温，倾入搅拌的冰水中。水相经4×50ml乙酸乙酯萃取。有机相经2×20ml水洗涤，盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗产物(100mg)，其经制备HPLC纯化。
200mg的粗2-(2-甲基-吡啶-3-基)-苯并噁唑-6-羧酸经制备HPLC纯化得到20mg纯产物。
实施例9
4-[(2，6-二氯-吡啶-4-羰基)-氨基]-3-羟基-苯甲酸
将2-甲基烟酰氯(0.2g，0.00128摩尔)溶解于30ml干燥的DCM中，于0℃氮氛下将N，N′-二异丙基乙胺(0.994g，0.00769摩尔)缓慢加入酰氯溶液中。于0℃将4-氨基-3-羟基苯甲酸(0.196g，0.00128摩尔)的10ml干燥THF缓慢加入上述溶液中。该溶液于0℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。然后用100ml乙酸乙酯稀释反应混合物，搅拌30分钟。经C盐床滤除沉淀的焦油物，有机相经4×20ml水洗涤，2×10ml盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸发得到粗酰胺(140mg)，其无需进一步纯化而用于环化步骤。
2-(2，6-二氯-吡啶-4-基)-苯并噁唑-6-羧酸的制备
在装有DEAN-STARCK仪的单颈RB烧瓶中，将上述酰胺悬浮于25ml二甲苯中，加入40mg对甲苯磺酸。然后在5小时内将反应混合物逐步加热至160℃，保持此温度12小时。过滤冷却的反应混合物。使残留物在乙醚中形成淤浆，过滤得到0.65g纯产物。
本文提供的其它化合物已通过对于上述实施例的些微修改而制备，这些修改在本领域技术人员的知识范围内。这些化合物如下示，给出了观测的熔点。
实施例10 使这里提供的化合物进行停滞纤丝形成测验。化合物经P2O5干燥过夜并溶解于DMSO中至终浓度7.2mM以提供初级储备液(10×储备液)。通过使用DMSO 5倍稀释初级储备液制备二级储备液，终浓度为1.44mM(2×储备液)。如下测量在抑制剂(1.44mM)存在下酸介导的TTR(3.6μM)的淀粉样形成向可使用的UV管中加入495μL 0.4mg/mL WT TTR蛋白在10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA(pH7.6)中溶液以及5μL 1.44mM二级储备抑制剂的DMSO溶液(2×储备液)。混合物经涡混并培育30分钟(25℃)，此时使用500μL的200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA(pH4.2)将pH降低至4.4。将最终的1mL溶液涡混并无需振动于37℃培育72h。72h后，涡混各管以悬浮任何存心的纤丝，于350和400nm处使用紫外-可见分光光度计测量悬浮液的浊度。通过各TTR加抑制剂样品的浊度相对于相同方式制备的样品但不含抑制剂的观察浊度比值、乘以100得到纤丝形成百分比。如上使用1×二级储备液进行使用等摩尔抑制剂和TTR浓度(3.6μM)的纤丝形成测验。通过使用DMSO 10倍稀释7.2mM 10x初级储备液制备1×储备液，最终浓度为0.72mM并用于上述纤丝形成测验。进行所有测验时一式三份，使用野生型TTR测验所有化合物。在测试不含WT TTR的溶液的浊度的试验过程中，发现所有化合物是可溶的，确认了浊度是TTR淀粉样形成结果。
通过抗体俘获/HPLC法评价了血浆中潜在抑制剂与TTR相结合的化学计量。向1.5-mL埃彭道夫管(eppendorf tube)中加入1.0mL人血浆和7.5μL的1.44mM待评价抑制剂的DMSO溶液。于37℃培育溶液并轻微振动24h。将1∶1凝胶∶TSA(Tris盐水)的猝灭琼脂糖凝胶淤浆(125μL)加入溶液中，并于4℃轻微振动1h。离心(16,000×g)溶液，将上清液分为400μL的两份，然后将其加入200μL不同样品的抗-TTR抗体-结合琼脂糖的1∶11凝胶∶TSA淤浆。于4℃轻微振动溶液20分钟，离心(16,000×g)，除去上清液。在4℃下，凝胶经TSA/0.05％皂角苷(3×，10分钟每次)洗涤，随后在4℃下，经1mLTSA(2×，10分钟每次)洗涤。离心(16,000×g)样品，除去最终的洗液，加入155μL 100mM三乙胺，pH11.5，来洗脱TTR并结合来自抗体的抑制剂。于4℃轻微振动30分钟后，离心(16,000×g)洗脱样品，除去包含TTR和抑制剂的145μL上清液。然后如前所述通过反相HPLC分析上清液。例如参见Purkey，H.E.；Dorrell，M.I.；Kelly，J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，5566-71，其通过参考在此全部引入。
通过连接的单体在脲中的伸展评价了TTR四聚体解聚的动力学。缓慢的四聚体解聚无法通过远-UV CD光谱学检测，但其与前述可被远-UV CD方便检测的快速(快500,000-倍)伸展步骤相关。评价TTR四聚体(3.6μM)解聚动力学作为抑制剂的函数时，将3.6μL待测抑制剂的1mM溶液(乙醇)加入到69μL WT TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸钠，100mM KCl，1mMEDTA，pH7.0)，向其加入127.4μL磷酸缓冲液。对于抑制剂浓度(7.2μM)为TTR浓度(3.6μM)两倍时，将7.2μL待测抑制剂的1mM溶液(乙醇)加入到69μL WT TTR(2.90mg/mL，10mM磷酸钠，100mM KCI，1mM EDTA，pH7.0)中，向其加入123.8μL磷酸缓冲液。将100μL蛋白-待测抑制剂溶液加入600μL 10.3μM脲和300μL磷酸缓冲液中，最终的脲浓度为6.5M。涡混溶液，在下列间隔采集圆二色谱0、5、8、23、46、71、95、118、144和168h。制备包含7.2μL乙醇而非抑制剂的对照品用于比较，在上述同样的时间点采集波谱。在220-213nm采集CD谱，每0.5nm扫描，平均时间为10妙。各波长扫描一次。振幅值在220-213nm之间进行平均从而确定在整个试验期间β-片层的损失程度。
接着在pH4.4处通过浊度测量酸-介导的纤丝形成的速率。化合物经P2O5干燥过夜并溶解于DMSO中至终浓度7.2mM以提供初级储备液(10×储备液)。通过使用DMSO 5倍稀释初级储备液制备二级储备液，终浓度为1.44mM(2×储备液)。采用7.2μM的抑制剂浓度与3.6μM的TTR(四聚体)按照如下所述进行纤丝形成测定向可使用的UV管中加入495μL 0.4mg/mL WTTTR蛋白在10mM磷酸钠、100mM KCl和1mM EDTA(pH7.6)的溶液以及5μL 1.44mM二级储备抑制剂的DMSO溶液(2×储备液)。混合物经涡混并培育30分钟(25℃)，此时使用500μL 200mM乙酸、100mM KCl和1mM EDTA(pH4.2)将pH降低至4.4。将最终的1mL溶液涡混并无需振动于37℃培育。溶液经涡混并于350和400nm处测量浊度。在下列间隔收集UV波谱酸化后的0、4、8、24、48、72、96、120、144、168和192h。制备包含5μl DMSO的对照品用于比较，在上述同样的时间点采集波谱。在读数之前制备10组各抑制剂溶液以防止试管干扰。获得UV吸光度后抛弃与时间点相应的试管。使用1×二级抑制剂储备液如上进行应用等摩尔(3.6μM)TTR和抑制剂浓度的纤丝形成测验，储备液如下通过使用DMSO10倍稀释7.2mM 10×初级储备液制备终浓度为0.72mM的储备液，用于上述的纤丝形成测验。在整个试验过程中，发现所有化合物是可溶的，确认了浊度是TTR淀粉样形成结果。
使用浊度测验评价作为TTR淀粉样纤丝抑制剂的所述化合物。酸化经抑制剂预培育(25℃，30分钟)的TTR引发了WT TTR淀粉样变性，酸化时加入缓冲剂使得pH突变至4.4。培育各混合物72h后(37℃)，于350和400nm使用UV-可见分光光度计测量浊度。将所有的淀粉样纤丝形成数据归一化为不存在抑制剂时的WT TTR淀粉样变性，其被指定为100％纤丝形成。由此，5％纤丝形成对应于在72h后抑制了95％WT TTR纤丝形成的化合物。首先于7.2μM的浓度评价各潜在的抑制剂，相应的TTR四聚体浓度为3.6μM。将纤丝形成低于15％的化合物于等于TTR(3.6μM)的浓度再次进行评价以选择具有最高效力的抑制剂。在这些条件下纤丝形成低于40％是良好抑制剂的特征，而40-70％指示了适度的化合物。
对在等于TTR(3.6μM)的浓度保持了纤丝形成低于50％的抑制剂进行了进一步的评价，评价它们在血浆全部其它蛋白中选择性结合TTR的能力。单一的500mg剂量后20h二氟尼柳的血液浓度可超过30μM，或相同剂量后4h可超过300μM。尽管该高水平的延迟血浆浓度表明了出色的生物利用度，但选择性更好的抑制剂将允许更低的剂量和潜在的更少副作用；因此，将人血浆与终浓度为10.8M的该亚组抑制剂一起培育(人血浆中TTR的浓度约为5μM)。然后用树脂-结合的抗体俘获TTR，用TSA溶液(tris盐水)/0.05％皂角苷洗涤固定的TTR三次，随后用TSA洗涤两次。使用100mM三乙胺(pH11.5)从树脂上解离TTR-抑制剂复合物，通过反相HPC分析确定存在的抑制剂相对于TTR的化学计量。每一TTR四聚体可结合最多2当量抑制剂。
材料和方法 甲状腺素转运蛋白抗体的纯化以及与皂角苷的结合 制备、纯化抗体并与琼脂糖偶联。该树脂作为TAS(10mM Tris，pH8.0/140mM NaCl/0.025％NaN3)中的1∶1淤浆储存。此外，通过向树脂而不是抗体偶联200mM Tris，pH8.0而制备猝灭的琼脂糖。
人血浆的制备 在Scripps General Clinical Research Center′s Normal Blood-DrawingProgram从健康志愿者体内抽取全血并移至50mL锥管管中。于25℃，在装备有浮桶式转头的Sorvall RT7台式离心机内于3000RPM(1730×g)离心试管10min以除去残留的细胞。加入叠氮钠得到0.05％溶液。血浆于4℃储存备用。
甲状腺素转运蛋白和结合化合物的免疫沉淀 向2mL的埃彭道夫管内加入1.5mL人血浆和7.5μL待测化合物的2.16mM DMSO溶液。该溶液于37℃培育24h。将1∶1树脂/TSA淤浆(187μL)的猝灭琼脂糖加入该溶液中并于4℃轻微振动1h。离心(16,000×g)溶液，将上清液分成各400μL的3份。将其各自加入200μL 1∶1树脂/TSA淤浆的抗-甲状腺素转运蛋白抗体-结合的琼脂糖并于4℃轻微振动20分钟。离心(16,000×g)样品，除去上清液。树脂于4℃经1mL TSA/0.05％皂角甙(Acros)(3×10分钟)洗涤，再于4℃经1mL TSA(2×10分钟)洗涤。离心(16,000×g)样品，除去最终洗液，加入155μL 100mM三乙胺、pH11.5以稀释TTR并结合抗体的小分子。于4℃轻微振动30分钟后，离心样品(16,000×g)，除去145μL包含TTR和抑制剂的上清液。
甲状腺素转运蛋白和结合化合物的HPLC分析和定量 将来自TTR抗体珠(145μL)的上清洗脱液样品置于Waters 71P自动取样器上。进样的135μL各样品在Keystone 3cm C18反相柱上分离，在8分钟内使用40-100％B梯度(A94.8％H2O/5％乙腈/0.2％TFA；B94.8％乙腈/5％H2O/0.2％TFA)，由Waters 600E多溶剂递送系统控制。于280nm使用Waters 486可调吸收度检测器检测，积分各峰给出TTR和小分子的面积。为了确定各物质的量，在HPLC上注射已知量的四聚TTR或化合物。积分各峰使用Kaleidagraph(Synergy Software)线性回归数据创建标准曲线。使用该标准曲线确定血浆样品中存在的各物质的摩尔数。计算小分子与蛋白的比值以得到血浆中结合于TTR的小分子的化学计量。
甲状腺素转运蛋白淀粉样纤丝形成测验 以720μM的浓度将化合物溶解于DMSO中。将5μL待测化合物的溶液加入到0.5mL 7.2μM TTR在10mM磷酸盐pH7.6、100mM KCl、1mMEDTA缓冲剂的溶液中，允许化合物与TTR一起培育30分钟。加入495μL0.2mM乙酸盐pH4.2、100mM KCl、1mM EDTA，所得终蛋白和抑制剂浓度各自为3.6μM，pH为4.4。然后于37℃培育混合物72h，此后涡混试管3秒，于400nm测量光密度。通过归一化不含抑制剂的TTR的各光密度确定纤丝形成的程度，定义为100％纤丝形成。还测试不含TTR时各化合物的对照溶液，于400nm处几乎没有吸收。
结晶和X-射线数据采集 在悬滴试验中，由相对于2M硫酸铵平衡的5mg/ml(在100mM KCl，100mM磷酸盐，pH7.4，1M硫酸铵)蛋白溶液获得重组TTR结晶。用10倍摩尔过量的配体浸泡结晶从而确保两个结合位点完全饱和，从而制备TTR·配体复合物。使用1∶1丙酮∶水溶液作为浸泡剂。使用偶联了RU200旋转阳极X-射线发生器的DIP2030b成像板体系(MAC Science，Yokohama，Japan)采集收据。将结晶置于作为冷保护剂的巴拉东油(paratone oil)中冷却至120K进行衍射试验。所有TTR·配体复合物的结晶与包含晶胞大小a＝43
、b＝86
、和c＝65
的apo晶型同形。它们属于P21212空间组，在其不对称单元包含一半的同四聚体。数据经DENZO和SCALEPACK还原。
结构确定与优化 将来自蛋白数据库(登录号1BMZ)的TTR的蛋白原子坐标用作优化原生型TTR和TTR-配体复合物的起始模型，使用CNS程序经分子动力学和能量最小化优化。根据在经化合物浸泡或同时共结晶的TTR结晶上采集的衍射数据，计算图谱。对于TTR与化合物的复合物，所得图谱揭示了配体在TTR四聚体的两个结合区的大概位置，峰高超过了5-9r.m.s。为了进一步改善小分子的电子密度并除去模型偏差，将模型进行若干循环的弯曲/振动方案(warp/shake protocol)，其导致图谱的显著改善，尤其是使抑制剂的图谱显著改善。使用这些图谱进行后续模型匹配，将配体分子置于密度中。在所有的三种情况中，通过程序Insight II(Accelrys)计算的抑制剂最小能量构型与图谱最佳拟合。由于沿着结合通道的二重晶体学对称轴，必须施用统计学扰乱模型，在四聚TTR的两个结合位点任一之中产生两种配体结合方式。基于无偏差的电子密度图加入水分子。由于在最终图谱中缺乏可解释的电子密度，在最终模型中不包括9个N-末端和三个C-末端残基。
因为本领域技术人员显然可进行修改，在此要求的主题意在仅通过附录的权利要求进行限制。
权利要求
1.式I化合物或其药学上可接受的衍生物
其中
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；
X是O、S或NR11；
R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、CONR7R8、烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH或CF3；
Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
Ar是芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R5是烷基、卤代烷基、环烷基或杂环基；
R6是天然存在的α-氨基羧酸的侧链；
R7和R8各自独立选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R9和R10各自独立是氢、卤素、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R11是氢或烷基；以及
n是0-3的整数；
条件是(i)当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯；(ii)当Y是COOH且在4、5、6或7位且X是O时，那么R1、R2和R3不全是氢；(iii)Y是COOH或CONH2且X是O时，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、3-环烷基、4-烷氧基、4-环烷氧基、2-或4-COOH、4-COOR，其中R是烷基、2-或4-OH；以及(iv)当Y是COOH且X是NH时，那么R1、R2和R3不是4-CN。
2.权利要求1的化合物，具有式IA结构
3.权利要求1或2的化合物，其中
Y是COOH、四唑基、CONHOH、B(OH)2或OH；
X是O；以及
R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH、B(OH)2或CF3。
4.权利要求1-3任一项的化合物，其中Y是COOH。
5.权利要求1-3任一项的化合物，其中Y是四唑基、B(OH)2或CONHOH。
6.权利要求1-3任一项的化合物，其中Y是OH。
7.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和OH。
8.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢和CF3。
9.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和OR5。
10.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自独立是氢且R3是CF3。
11.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素和B(OH)2。
12.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、F、Br和I。
13.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和OH。
14.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1、R2和R3各自独立选自卤素和B(OH)2
15.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自是卤素且R3是OH。
16.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自是卤素且R3是B(OH)2。
17.权利要求1-6任一项的化合物，其中R1和R2各自是卤素且R3是氢。
18.权利要求1-17任一项的化合物，其为下式之一
19.权利要求1-6任一项的化合物，其中Het是嘧啶基、吡啶基、呋喃基或噻吩基。
20.具有下列结构的权利要求19的化合物或其药学上可接受的衍生物
21.权利要求19或20的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代，其中R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基芳基或杂芳基。
22.权利要求19-21任一项的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任选被卤素、烷基或卤代烷基取代。
23.权利要求19-22任一项的化合物，其中Het是3-或4-吡啶基，任选被三氟甲基、氯或甲基取代。
24.权利要求1-23任一项的化合物，选自
25.药物组合物，含有权利要求1-24任一项的化合物和药学上可接受的载体。
26.药物组合物，含有药学上可接受的载体和式I化合物或其药学上可接受的衍生物
其中
其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；
X是O、S或NR11；
R1、R2和R3各自独立选自氢、卤素、OH、OR5、OAr、OHet、OCH2Ar、OCH2Het、CN、B(OH)2、CONR7R8、烷基、卤代烷基、-(CR9R10)nOH、-(CR9R10)nNR7R8、-(CR9R10)nSH、CF3或NR7R8；
Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
Ar是芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；
R是氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R5是烷基、卤代烷基、环烷基或杂环基；
R6是天然存在的α-氨基羧酸的侧链；
R7和R8各自独立选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R9和R10各自独立是氢、卤素、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R11是氢或烷基；以及
n是0-3的整数；
条件是(i)当Y是COOH且在4、5、6或7位时，那么R1、R2和R3不是3，5-二氟、2，6-二氟、2-或3-三氟甲基、3，5-二氯或2，6-二氯；(ii)当Y是COOH且在4、5、6或7位且X是O时，那么R1、R2和R3不全是氢；(iii)当Y是COOH或CONH2且X是O时，那么R1、R2和R3不是3-、4-或5-烷基、3-环烷基、4-烷氧基、4-环烷氧基或4-环烷氧基；以及(iv)当Y是COOH且X是NH时，那么R1、R2和R3不是4-CN。
27.配制成单一剂量给药的权利要求25或权利要求26的药物组合物。
28.稳定组织内或生理液体内甲状腺素转运蛋白的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
29.抑制甲状腺素转运蛋白错重叠的方法，包括用权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物接触甲状腺素转运蛋白。
30.治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的一种或多种症状的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
31.通过动力学稳定原生态甲状腺素转运蛋白四聚体而防止该甲状腺素四聚体解聚的方法，包括用权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物接触四聚体。
32.权利要求30的方法，其中甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病是家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样心肌病或老年全身性淀粉样变性。
33.权利要求32的方法，其中疾病是阿尔茨海默病、海绵状脑病、多发性神经病、II型糖尿病和甲状腺髓质瘤。
34.治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导的疾病或紊乱的一种或多种症状的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
35.权利要求34的方法，其中疾病是肥胖症。
36.稳定甲状腺素转运蛋白四聚体的方法，包括用权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物接触四聚体。
37.抑制TTR淀粉样形成的方法，包括给予权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
38.用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的一种或多种症状时的权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物。
39.权利要求1-24任一项的化合物或权利要求25-27任一项的药物组合物在制造用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白淀粉样疾病的药物中的用途。
全文摘要
提供了用于稳定甲状腺素转运蛋白以及用于治疗、预防或改善甲状腺素转运蛋白介导疾病的一种或多种症状的化合物、组合物和方法。在一种实施方案中，这些化合物是苯并噁唑及相关化合物，其中Y是COOH、COOR5、CONR7R8、四唑基、CONHOH、B(OH)2、CONHSO2Ar、CONHCH(R6)COOH、OH、CH2OH或-(CH2)nC(R6)(NH2)-COOH；X是O、S或NR11；Het是杂芳基，任选被卤素、OR、烷基或卤代烷基取代；且其中R、R1-R3、R5-R8和R11如申请中定义。
文档编号A61K31/428GK101198598SQ200580024488
公开日2008年6月11日 申请日期2005年5月20日 优先权日2004年5月20日
发明者理查德·拉伯迪尼尔 申请人:弗尔德里克斯制药股份有限公司
最新回复(0)