含鲨肉提取物和蘑菇提取物的抗癌组合物的制作方法
专利名称：含鲨肉提取物和蘑菇提取物的抗癌组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含协同有效量的鲨肉提取物和蘑菇提取物的抗癌组合物。特别地，本发明涉及包含鲨肉提取物和来自朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌(Phellinus linteus)提取物的组合物。本发明也涉及使用本发明的组合物治疗或预防癌症尤其是黑素瘤的方法。
背景技术：
血管发生是新血管的生长和增殖。在很多生理和病理状况中血管发生起重要作用。在健康身体中，在创伤愈合的增殖期间出现血管发生，用于在损伤或损害之后恢复血液向组织流动，还出现在女性每月生殖周期和妊娠期间。
健康身体通过一系列“开”和“关”转换器(switch)控制血管发生。已知“开”转换器是刺激血管发生的生长因子，“关”转换器被称为血管发生抑制剂。在正常健康身体中，血管发生生长因子和血管发生抑制剂的表达被精确地平衡，以促进血管发生的活化和抑制。
血管发生对于癌肿的存活和生长是非常重要的。相对于非癌性生长和器官，这些肿瘤具有高新陈代谢速率，因此肿瘤需要更多的血以满足它们更高的营养需要。因此抑制血管发生是控制或预防肿瘤生长的一种机制。
一段时间以来已经知道鲨鱼软骨具有抗血管发生活性。最近的工作已经显示鲨肉提取物具有显著的抗血管发生活性。因此，这些物质被认为在癌症的治疗和预防中具有有益作用。
蘑菇裂蹄针层孔菌在南朝鲜生产并且其具有作为药用产品的声誉。申请人已经研究了裂蹄针层孔菌的乙醇提取物。在以前，这种蘑菇的医药特性被认为是由于其存在β-葡聚糖。然而，这种乙醇提取物含有很少或不含β-葡聚糖。
在正在进行的对新的和有用的抗癌剂的搜索中，申请人调查了鲨肉提取物和其它天然产物提取物的混合物。申请人吃惊的发现，相对于单独的鲨肉提取物或单独的裂蹄针层孔菌提取物，包含鲨肉提取物和裂蹄针层孔菌提取物的组合物显示出增强的抗癌活性。申请人也发现这种与鲨肉提取物的令人吃惊的协同活性并不限于裂蹄针层孔菌提取物，还包括其它蘑菇种的提取物。
因此，本发明的一个目的是提供含有鲨肉提取物和蘑菇提取物的组合物，其可用于预防或治疗癌症，或至少提供一种有用的选择。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种含有具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物，其中每种提取物以协同有效量存在。
蘑菇提取物可以是表现出抗癌活性的任何蘑菇的提取物，但是优选是来自伞菌属(Agaricus)蘑菇(姬松茸(Agaricus blazei murill))、灰树花(Maitake)蘑菇(贝叶多孔菌Grifola frondosa)、或朝鲜蘑菇(裂蹄针层孔菌)的提取物。在本发明的一个优选实施方案中，所述蘑菇是朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌。
鲨肉提取物对蘑菇提取物的比率优选是4∶1-24∶1，最优选为约9∶1。进一步优选通过乙醇提取来制备蘑菇提取物。
优选的是，蘑菇提取物很少含或不含β-葡聚糖。还优选的是，蘑菇提取物富含脂质，其中主要的脂质是固醇。
优选通过乙醇提取法制备鲨肉提取物。该肉可以来自任何的角鲨(dogfish)、rig(lemonfish)、翅鲨(school shark)、魔鬼鲨(ghost shark)、灰鲭鲨(mako)、蓝鲨(blue shark)、象鼻鲨(elephant fish)、salmonshark、和黑鳍礁鲨(blacktip reef shark)。
本发明的提取物优选与食用油混合，比如橄榄油。
所述组合物可以配制为任何施用形式，但是优选口服或局部施用。所述组合物可以是用于口服施用的胶囊形式。所述组合物可以是用于局部施用的乳膏或软膏形式。
在另一方面，本发明提供预防或治疗癌症的方法，包括向对象施用有效量的本发明组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述癌症是黑素瘤或肺癌。
在另一方面，本发明提供本发明的组合物在制备预防或治疗癌症，优选黑素瘤或肺癌，的药物中的用途。
具体实施例方式
本发明涉及鲨肉提取物和蘑菇提取物，尤其是朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌，的协同作用组合物，所述组合物适用于预防或治疗癌症。
本文所用术语“提取物”意指通过任何提取方法获得的物质，无论粗提取物是否已经通过常用方法如色谱和过滤进行分级或者纯化。提取方法包括，但不限于溶剂提取。可以使用任何适合的溶剂。溶剂可以是有机溶剂或者水性溶剂、或者有机和水性溶剂的混合物。乙醇是典型使用的有机溶剂(或者水乙醇混合物)，但也可以使用其他有机溶剂。提取溶剂也可以是超临界流体如超临界CO2。
本文使用的术语“鲨肉”意指任何鲨鱼或者鲨鱼样生物的任何肉(meat or flesh)，所述鲨鱼样生物包括但不限于，角鲨(dogfish)、rig(lemonfish)、翅鲨(school shark)、魔鬼鲨(ghost shark)、灰鲭鲨(mako)、蓝鲨(blue shark)、象鼻鲨(elephant fish)、salmon shark、和黑鳍礁鲨(blacktip reef shark)。
可以通过任何溶剂提取技术获得鲨肉提取物，但是通常用乙醇进行提取。
本文所用“朝鲜蘑菇提取物”表示裂蹄针层孔菌的菌丝和/或菌丝体(子实体)的提取物。尽管本领域的技术人员将理解可以使用许多提取方法来制备朝鲜蘑菇提取物，但是通过乙醇提取是优选的提取方法，以产生很少含或不含β-葡聚糖的提取物。
申请人已经发现包含鲨肉提取物和朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌提取物的组合物在小鼠实验黑素瘤中对肿瘤生长具有显著作用。
小鼠黑素瘤细胞经皮下注射到正常未添加饮食的小鼠中。肿瘤生长快速，以致于经过21天70％肿瘤的尺寸超过200mm2。
小鼠被分成4个实验组(组1-未添加，组2-饮食中添加1ml/100ml(1％)鲨肉提取物，组3-饮食中添加1ml/100ml(1％)朝鲜蘑菇提取物，组4-饮食中添加1ml/100ml(1％)的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v))。
与未添加的组相比，鲨肉提取物对黑素瘤生长显示非常小的作用，3周后80％的肿瘤大于200mm2。1％相对低剂量的朝鲜蘑菇提取物确实具有积极作用。在3周结束时，50％小鼠的肿瘤尺寸小于200mm2。
令人感兴趣的是，如果鲨提取物和朝鲜蘑菇提取物以9∶1的比率组合，就有实质上改善的作用。10个小鼠中只有一个的肿瘤尺寸大于200mm2。这对接受未添加饮食的对照组来说，是显著的改进。此外，对于单独使用鲨肉提取物的组获得的结果来说，这也是一种改进。这个结果是最令人吃惊的，因为单独添加鲨肉提取物没有影响肿瘤大小。仍然是这个组，其接受90％相同剂量水平的鲨肉提取物，具有显著更好的结果。这是由于蘑菇提取物的存在。这种作用大于二者加和作用所产生的作用。这种协同机制是本发明的基础。
肿瘤的平均尺寸与存活模式平行。在实验结束时，鲨肉提取物饲喂组中的肿瘤平均尺寸是对照组的88.8％。对于接受朝鲜蘑菇提取物(1％的饮用水)的组，在实验结束时平均肿瘤尺寸减小了35.4％，其具有显著差异。这种组合的作用是甚至进一步减小肿瘤尺寸。当鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物被一起饲喂时，平均肿瘤尺寸仅是对照组的48.6％。这表明鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物的组合使平均肿瘤尺寸减小超过一半。
总之，单独喂饲鲨肉提取物对肿瘤生长或小鼠存活有很小影响。单独喂饲蘑菇提取物对减小肿瘤尺寸有一些作用。然而，最明显的是，鲨提取物和朝鲜蘑菇提取物的组合减小肿瘤平均尺寸到未处理对照组的仅50％。
此外，与对照组中10只中死去8只的结果比较，10只中只死去1只动物，动物的存活预期要好得多。
本发明进一步参考以下实施例进行描述。应该理解的是本发明并不限于这些实施例。
实施例实施例1提取物的制备实施例1.1鲨肉提取物的制备在典型的提取中，来自一或多个鲨的肉片用搅拌器减小尺寸，冷冻干燥，粉碎，然后与溶剂如乙醇混合。混合物通常在室温下搅拌1-24小时。随后通过过滤从肉中去除溶剂。溶剂与肉混合的步骤任选地被重复。随后通过蒸发去除溶剂，从而得到油状物的鲨肉提取物。随后此油状物可以与载体如橄榄油混合。
在以下实施例中应用的鲨肉提取物是用乙醇提取、接下来去除溶剂并按9∶1的重量比(橄榄油对提取物)加入橄榄油而获得的提取物。
实施例1.2蘑菇提取物的制备用无水乙醇以20∶1(v/w)的比率在接近20℃条件下提取干蘑菇粉18小时。离心去除残渣并过滤上清液。随后通过蒸发去除乙醇，使得上清液的体积减少约40倍。用橄榄油以9体积橄榄油对1体积蘑菇提取物的比率稀释所得浓缩物。以5％终浓度(w/w)加入维生素E。接下来进一步浓缩去除残留乙醇，随后进行过滤。
实施例2鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物—小鼠黑素瘤研究建立5-7周龄CB51小鼠(5个雄性，5个雌性)的四个组。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮食按以下所示进行添加组A-对照组(无添加)，组B-饮食中添加1ml/100ml(1％)的鲨肉提取物，组C-饮食中添加1ml/100ml(1％)的朝鲜蘑菇提取物，
组D-饮食中添加1ml/100ml(1％)的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v)。
在将1×105黑素瘤B16细胞注射到每只小鼠左肋之前一天，开始饲喂添加饮食。每两天测量水的消耗并且用新鲜的添加水替换添加水。由此来确定剂量。此外，在整个实验期间，每天对小鼠进行称重。注射细胞后每天测量每个肿瘤的尺寸并确定其面积。一旦肿瘤超过200mm2，对小鼠进行安乐死。每只小鼠被处死后，切除肿瘤并保存在福尔马林中。在21天实验周期结束时，从存活小鼠切除每个肿瘤并称重。在切除前对每个肿瘤周围的淋巴量进行定性评价。安乐死以后，每个动物的尸体进行尸体解剖并对器官进行检查，以查找转移和其它总体病理改变的证据。应该对脾和胃肠道特别注意。使用Student t-检验对数据进行统计学显著改变的分析，当概率小于0.05时被认为具有显著性。
实施例2.1肿瘤称重在处死时，从每个小鼠切除肿瘤并称重(表1)。
表1肿瘤的重量(平均值(g)±SEM)
*p＜0.05鲨肉提取物确实使肿瘤平均重量减少了约22％，但是这不具有统计学显著性。朝鲜蘑菇提取物更加有效。喂食这种提取物的小鼠的肿瘤平均重量减小了约30％，但是这种降低没有统计学显著性。然而，喂食鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物的小鼠的肿瘤重量平均减少了40％，这是显著的减少。
实施例2.3肿瘤尺寸在整个实验期间计算肿瘤的平均面积。在只接受鲨肉提取物的组(组B)中，肿瘤的尺寸与未处理组相比没有显著差异。在实验结束时，这个组的肿瘤平均尺寸仅比对照组约低11％。
然而，对于接受朝鲜蘑菇提取物的组，在实验结束时，肿瘤平均尺寸减小35％。这是具有统计学显著性(p＜0.025)的结果。对于接受鲨肉提取物/朝鲜蘑菇提取物混合物的小鼠，肿瘤平均尺寸减小50％。这个结果具有高度统计学显著性(p＜0.0025)。
实施例2.4存活率第一个被处死的动物来自组B。这发生在实验开始后的17天。在18天时，对照组和组D处死了第一个动物。在19天时，组C处死了第一个动物。然而，在剩下的时间中来自组B的小鼠稳定地被处死，以致于实验结束时只剩下两只小鼠。相比较而言，实验结束时对照组(组A)10只小鼠中有3只存活。事实上，在17天后的每个点，组A存活的小鼠都比组B存活的小鼠多。也就是说，喂食鲨肉提取物的小鼠比对照组小鼠的存活率更差。
直到19天时，只接受蘑菇提取物的小鼠(组C)中才出现第一例死亡，并且此后死亡数稳步增加，以致于21天时只有50％的小鼠存活。对于对照组(组A)和只接受鲨肉提取物的组(组B)这是一种改进。
然而，对于接受鲨肉提取物和蘑菇提取物的混合物的组，与任何其它组比较，其存活率都有明显改进。在19天时一只小鼠被处死，并且在实验期间其是仅有的死亡例。在研究结束时，组D中90％的小鼠仍然存活。
实施例3鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物—最佳比率在确定9∶1比率(重量)的鲨肉提取物/朝鲜蘑菇提取物对小鼠黑素瘤的作用之后，对7∶3比率的提取物进行比较研究。
建立三组6-12周龄CB51小鼠(5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮用水按如下所示进行添加组A-对照组(3％乙醇中的1％橄榄油)；组B-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v)；组C-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(7∶3v/v)。
使用在实施例2中描述的方法，但是从细胞注射后第8天开始，每天测量每个肿瘤生长的尺寸并确定其面积，并且实验周期为16天。
实施例3.1肿瘤尺寸在实验结束时测量每个肿瘤的尺寸并且计算每组的平均值。结果总结于表2中。
表2肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在所有时间，接受9∶1提取物混合物组的肿瘤尺寸小于不接受任何处理的小鼠中。尽管实验结束时只有6.3％的差异，但是在肿瘤生长期间差异更加明显。例如在13天时，经处理动物中肿瘤尺寸小了62％。9∶1提取物混合物显著抑制了黑素瘤的生长速率。相比较，在开始的12天中，7∶3提取物混合物对生长速率没有影响。也就是说，它没有表现出抑制作用。在此之后，未处理肿瘤的生长速率减慢，但是接受提取物混合物的小鼠的生长速率以更快速率继续。在实验结束时，该组(7∶3)的肿瘤平均尺寸比未处理小鼠大14.5％。因此对抑制黑素瘤优选9∶1提取物混合物。
实施例3.2存活率在14天时，50％用7∶3提取物混合物处理的动物存活，对比未处理组只有30％的动物存活。在第16天实验结束时，未处理动物没有存活，然而该处理组中有30％的动物存活。
然而，用9∶1提取物混合物处理的小鼠比未处理动物和接受7∶3提取物混合物动物的存活率更好。在14天时，该组中90％的动物仍然存活，并且在实验结束时50％的动物仍然存活。
实施例3.3血管形成处死每只小鼠时，评估原发性肿瘤周围血管形成的程度。结果显示在表3中。
表3血管形成的程度0(可忽略的)-3(广泛的)级别的分级
9∶1提取物混合物比7∶3提取物混合物显示出对血管形成更强的抑制作用。
实施例3.4转移在对照组中(组A)，两只雄性小鼠显示出转移性生长。在一只中，在黑素瘤部位附近有4处皮肤损伤。在另一只中，在皮肤附近有3处并且在肝中有另外5处。在该组的雌性动物中，2只显示出转移。一只在肝中有5处损伤并在肾中有2处损伤，另一只在黑素瘤附近的皮肤中和另外在肺中。
在用9∶1提取物混合物喂饲的组(组B)中，所有的雄性和5只雌性中的3只都证实了有转移性生长。在雄性中，一只小鼠在脾中有非常大的生长(器官的约25％)以及在皮肤中有3处。第二只雄性小鼠有体积占约10％的脾损伤以及一处在皮肤中。第三只有2处小的脾损伤。该组中另外2只雄性小鼠被证实有皮肤转移。三只雌性小鼠在脾中有非常大的肿瘤(大于器官大小的20％)。令人感兴趣的是，在接受该添加饮食的雌性小鼠中，没有包括皮肤肿瘤在内的其它转移。
在喂饲7∶3提取物混合物的组(组C)中，在雄性小鼠中只有一例转移性生长(肺部肿瘤)。5只雌性小鼠中的2只中，每只在皮肤中有单个转移，并且一只具有很大的脾新生物和另一只具有肺肿瘤。
实施例4鲨肉提取物和灰树花蘑菇提取物—最佳比率建立三组6-12周龄CB51小鼠(5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮用水按如下所示进行添加组A-对照组(无添加)；组B-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1v/v)；组C-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(7∶3v/v)。
使用在实施例2中描述的方法，但是在黑素瘤细胞注射之前1天开始饲喂，从细胞注射后第8天起每天测量每个肿瘤生长的尺寸并确定其面积，实验周期为16天。
实施例4.1肿瘤尺寸实验结束时测量每个肿瘤的尺寸并计算每组的平均值。结果总结于表4中。
表4肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在所有时间点，接受9∶1提取物混合物组的肿瘤尺寸小于不接受任何处理的小鼠。尽管在实验结束时差异只有12.8％，但是在肿瘤生长期间该差异更加明显。例如在13天时，在经处理动物中的肿瘤平均尺寸小了54％，这是实质上的尺寸减小。9∶1提取物混合物显著抑制了黑素瘤的生长速率。相比较而言，7∶3提取物混合物显示出刺激生长。在所有时间点，在这些小鼠中的肿瘤平均尺寸大于对照组中的那些。在13天时，肿瘤尺寸大了26.9％；在16天时大了55.6％。
实施例4.2存活率接受7∶3提取物混合物的小鼠有最差的存活率。除了在第14天时以外，其存活率都比不接受任何处理的小鼠更差。然而，在大部分时间点，添加有9∶1提取物混合物的组中的存活水平都比对照组的要好。接受所述9∶1混合物的小鼠比接受7∶3提取物混合物的小鼠具有更好的存活率。
实施例4.3血管形成在处死每只小鼠时，评估原发性肿瘤周围血管形成的程度。结果显示在表5中。
表5血管形成的程度0(可忽略的)-3(广泛的)级别的分级
基于该对比研究，9∶1提取物混合物显示出抑制血管形成的作用，尽管不是强抑制作用。发现7∶3提取物混合物有刺激作用(13.4％)。
实施例4.4转移在对照组(组A)中，雄性小鼠中有一只在脾中出现转移性生长，覆盖约25％的脾。在该组的雌性小鼠中，2只显示出脾转移。一只的损伤占器官的约12％，另一只占约25％。在添加有9∶1提取物混合物的组中，3只雄性小鼠证实有脾的转移性生长。所有的都有非常大的生长(接近器官的25％)。一只雌性小鼠有非常增大的脾。令人感兴趣的是，在接受此添加的雌性小鼠中没有其它转移。在添加有7∶3提取物混合物的组中，在雄性小鼠中，只有1例转移性生长。这是非常接近原发性损伤的皮肤肿瘤。该组5只雌性小鼠中的1只具有占脾约25％的大脾新生物。
实施例5鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物—最佳剂量因为本研究涉及9∶1比率的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物的5个不同的剂量水平，所以实施两个分开的实验。在两个实验中，提取物混合物作为添加物加到饮用水中。
对于实验1，建立以下的组A.对照组(3％橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.0.03％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.0.1％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；D.0.3％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
对于实验2，建立以下的组A.对照组(3％橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.1.0％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.3.0％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
所建立的每个组含有5-6周龄CB51小鼠(5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食和经添加的饮用水。在1×105黑素瘤细胞注射进每只小鼠左肋前1周，开始喂饲经添加的饮食。每周三次测量水的消耗，并且在每次测量后用新鲜的添加水替换添加水。当添加实验开始时称重每只小鼠，并随后在注射黑素瘤细胞前的即刻、和在7天后和14天后对小鼠称重。从细胞注射后第9天，测量每个肿瘤生长的大小并按公式“体积＝(π×X×Y×Z)/6，其中X是长度，Y是宽度和Z是高度”每天确定其体积。每天进行这些测量，直至实验结束。
实施例5.1肿瘤生长速率在整个实验期间测量每个肿瘤大小并每天计算每组的平均值。结果总结于表6和7。
表6实验1-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
表7实验2-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
向饮用水加入提取物混合物确实减缓了肿瘤的生长速率。在实验1中，其剂量水平非常低，0.03％的剂量(组B)非常有效并且在所有的时间点比未处理小鼠的肿瘤尺寸更小(表7)。例如，在17天时，组B的肿瘤比未处理小鼠(组A)的肿瘤小67.8％。这种差异继续，并且在19天时差异是75.7％，在21天时是41.8％和在23天时是27.5％。
0.1％提取物混合物的有效性(组C)不如更低剂量那样大。在17天时，生长降低约8.7％和在19天时降低约48.9％。在21天和23天时，肿瘤的平均尺寸比对照组的更大。
在17天时，0.3％添加物(组D)达到几乎完全抑制肿瘤的作用(95.9％)。即使在19天时，也有实质的抑制作用。在这些小鼠中的肿瘤尺寸平均来说都有极大的缩减(86.0％)。在21天时，经添加的动物的生长速率仍然小了57.4％，并且在接近研究结束时，它低了31.9％(第23天)。
在实验2中，高剂量的提取物混合物的作用非常显著。例如，在12天时，接受1％添加物的小鼠(组B)的肿瘤平均尺寸比对照动物的小35％。在14天时，此差异是9.4％，和在16天时任何作用都消失。对于提取物混合物的最高剂量，这种差异甚至更加显著。然而在12天时，肿瘤平均尺寸与1％添加物中的尺寸大约是相同的，在14天时它小了27.5％。即使在16天时，肿瘤的平均尺寸比未处理小鼠的小了23％。在此时也与1％剂量水平作用的缺乏形成对比。
因此通过鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物的组合，对于在小鼠中抑制黑素瘤生长有明确的剂量效应，但是从此数据中不能很容易的分辨出最佳剂量。
实施例5.2存活率在实验1中，接受鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物的所有3组比对照组(组A)有更好的存活率。最好的是接受最低水平(组B)的小鼠。
在实验2中，明显的是，从13天开始和以后，接受高剂量提取物混合物的小鼠比未接受处理的小鼠的存活率更高。在1％剂量(组B)和3％剂量(组C)之间没有大的差异。
实施例5.3血管形成在每只小鼠被处死时，评估在原发性肿瘤周围血管形成的程度。结果显示于表8和9。
表8实验1-血管形成的程度
表9实验2-血管形成的程度
在实验1中，对于所有三种添加物，肿瘤外周周围血管形成的程度有实质性降低。在实验结束时，在接受0.03％和0.1％提取物混合物的小鼠中血管密度平均低30％，对于接受0.3％提取物混合物的组(组D)大约低15％。
在实验2中，1％提取物混合物已经可以刺激血管形成的程度，同时与对照组比较3％提取物混合物的水平低8％。然而，这些测量是在研究结束时当所有动物中肿瘤都非常大时进行的。
实施例6鲨肉提取物和灰树花蘑菇提取物—最佳剂量正如实施例5，这些对于鲨肉提取物和灰树花(Grisfola frondosa)蘑菇提取物的组合的研究以两个分开的实验进行。方法与实施例5相同。
对于实验1，建立以下的组A.对照组(3％的橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.0.03％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.0.1％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；D.0.3％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
对于实验2，建立以下的组A.对照组(3％的橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.1.0％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.3.0％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
实施例6.1肿瘤生长速率在接受不同剂量的鲨肉提取物∶灰树花(Grisfola frondosa)蘑菇提取物的动物中的肿瘤生长速率列在表10和11中。
表10实验1-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
两个最低剂量的提取物混合物对小鼠中黑素瘤的生长速率基本上没有作用。尽管在早期的时间点，0.03％提取物混合物(组B)显示出抑制作用，对照动物与接受这两个水平剂量的动物的生长速率几乎相同。
表11实验2-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在实验2中，两个高剂量提取物混合物的作用是相对小的。在肿瘤的主要生长期间，1.0％剂量(组B)是相当值得注意的。在13天时，该组的肿瘤平均尺寸比对照组动物的(组A)小约18.5％，但是15天时，它们具有同样的尺寸，并且在17天时它们增大了约10％。
提取物混合物在小鼠中对黑素瘤生长抑制的最佳剂量约为0.3％。
实施例6.2存活率在实验1中，在0.03％剂量水平的动物(组B)比对照动物的存活率略好。然而，在高3.3倍的剂量水平上(组C)没有同样的存活。组D(0.3％)中的小鼠持续地比组B中的小鼠具有更高的存活率，甚至比对照组(组A)中的那些小鼠更高。
在实验2中，接受高剂量提取物混合物的两组小鼠的存活率都不是很好。在这两种情况中，它们与对照组的存活率相等或非常接近。
在接受0.3％剂量的组中，获得最好的存活率，同样该组显示出对肿瘤生长速率的最强抑制作用。
实施例6.3血管形成在每只小鼠被处死时评估其原发肿瘤外周血管形成的程度。结果显示在表12和13中。
表12实验1-血管形成的程度
表13实验2-血管形成的程度
在实验1中，随着提取物混合物剂量水平的增加，在实验结束时，肿瘤的血管形成稳步降低。接受0.3％提取物混合物的组的血管形成水平低了18.6％。随着添加物剂量的增加，外周肿瘤血管形成成比例的降低，这支持它的抗血管发生作用。
在实验2中，两个剂量的提取物混合物都抑制血管形成。与对照组小鼠(组A)相比，在研究结束时，1.0％剂量(组B)导致血管形成评分降低8％。接受3.0％剂量的那些证实外周血管形成有5.4％的降低。
发现0.3％剂量水平的提取物混合物对于降低向肿瘤的血管供应是最佳的。对于抑制肿瘤的生长速率和提供最好的存活，这也是最佳剂量。
实施例7鲨肉提取物和伞菌蘑菇提取物—最佳剂量如实施例5，这些对于鲨肉提取物和伞菌蘑菇(姬松茸)提取物的组合的研究以两个分开的实验进行。方法与实施例5相同。
对于实验1，建立以下的组
A.对照组(3％的橄榄油在乙醇(5％的终浓度)中)；B.0.03％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.0.1％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；D.0.3％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
对于实验2，建立以下的组A.对照组(乙醇中3％的橄榄油(5％的终浓度))；B.1.0％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.3.0％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
实施例7.1肿瘤生长率在整个实验期间测量每个肿瘤的尺寸并每天计算每组的平均值。
向饮用水加入提取物混合物确实减缓了黑素瘤的生长速率。在实验1中，其剂量水平非常低，0.03％的剂量(组B)非常有效并且在所有时间点上其肿瘤尺寸比未处理小鼠的肿瘤尺寸更小(表14)。例如，在12天时，肿瘤平均只有一半的尺寸，在14天时大约小20％，和在16天时，对照肿瘤已经变得非常大时，肿瘤的平均尺寸仍然小约20％。
0.1％的剂量对肿瘤的生长速率也是有效的抑制剂。在12天时，该组(组C)中小鼠的肿瘤比对照组的那些平均小25.5％。在14天时，这种降低只有大约4％，并且在16天时它是11％。
在12天时，组D动物(0.3％)的肿瘤在体积上比未处理小鼠的小约38％。然而到14天时，这种差异被缩减到只有9％。
表14实验1-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
表15实验2-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在实验2中，高剂量提取物混合物的作用非常显著。例如，在12天时接受1％剂量(组B)的小鼠的肿瘤平均尺寸比对照动物小67.7％。也就是说，肿瘤只是未处理小鼠肿瘤大小的三分之一。在14天时，这种差异仍然高达35.6％的减小。即使在实验结束时(第16天)，组B的肿瘤仍然小约8.5％。对于最高剂量的提取物混合物，差异也是非常明显的。在第12天时，肿瘤尺寸与1％剂量组大致相同(减小61.2％)，但是在14天时，它小了约37.3％。因此，在这2个剂量水平的反应是大致相同的。在16天时，肿瘤平均尺寸超过未处理小鼠约7.5％。
因此鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物的组合对抑制小鼠中黑素瘤生长有明确的剂量效应。1％和3％的剂量对抑制小鼠黑素瘤的生长速率具有基本相等的作用。除了0.03％的剂量显示出相当强的拮抗作用以外，剂量越低，作用越小。
实施例7.2存活率在实验1中，没有一个组有高存活率。所有4个组都显示出非常相似的存活模式。没有一个存活超过16天。接受更高剂量提取物混合物(实验2)小鼠的存活模式也不够好。同样，对于经添加的和对于对照小鼠，所有动物已经达到上限并且存活的一般模式非常相似。
鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物没有显示出帮助提高患癌小鼠的存活率，尽管它能够非常有效的减慢肿瘤的生长速率。
实施例7.3血管形成在每只小鼠被处死时评估其原发肿瘤外周血管形成的程度。结果显示在表16和17中。
表16实验1-血管形成的程度
表17实验2-血管形成的程度
在实验结束时，低剂量提取物混合物对肿瘤周围血管延长的作用在0.03％剂量中显出11％抑制，但是其它两个剂量(0.1％和0.3％)的作用可以忽略。在研究结束时，0.1％的剂量具有降低血管密度8.7％的作用，然而0.3％剂量的作用可以忽略。
实施例8肺癌研究研究鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)对小鼠肺癌生长的作用。对于此研究，使用裸鼠和人非小细胞肺癌。
建立两组12.5-13.5周龄裸鼠(每组包括5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮用水按如下所示进行添加组A-对照组(在5％乙醇中的3％橄榄油)；组B-饮食中按3ml/100ml(3％)添加在5％乙醇中的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v)。
本实施例样品方法遵照实施例5。
实施例8.1肿瘤生长速率接受不同剂量提取物混合物的动物的肿瘤生长速率显示于表18。
添加有提取物混合物的水可有效降低实验小鼠肺癌的生长。例如，在39天时，在经添加处理的小鼠比对照小鼠的肿瘤平均尺寸小23％。5天后此差异已经增加到41％。在51天时，实验组中的损伤小了30.8％，在56天时经处理的患癌小鼠在体积上仍然小29.5％。
因此，在此剂量水平的提取物混合物非常强效地抑制肺癌生长。
表18肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
实施例8.2存活率接受提取物混合物小鼠的存活率明显好于只接受载体橄榄油的小鼠。在研究结束时(第60天)，这些动物中有50％存活，然而对照组中只有20％的小鼠存活。
实施例8.3血管形成在每只小鼠被处死时评估其原发肿瘤外周血管形成的程度。结果显示在表19中。
表19血管形成的程度
在研究结束当肿瘤很大时，尤其是在对照组中，在它们水中添加有提取物混合物的小鼠中，围绕每个肿瘤的血管形成程度低大约13.3％。这表明添加物发挥了抗血管发生活性。
尽管本发明已经通过实施例的方式进行了说明，应该理解的是不偏离权利要求的范围可以对本发明进行变化和修饰。而且，对于具体特征所存在的已知等同物，这些等同物也被并入本发明，就像在本说明书中具体描述。
工业实用性本发明的组合物具有抗癌特性。它们包含协同有效量的鲨肉提取物和蘑菇提取物。本组合物在治疗和预防癌症尤其是黑素瘤中具有潜在的用途。
权利要求
1.一种含具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物，其中每种提取物以协同有效量存在。
2.根据权利要求1的组合物，其中蘑菇提取物是来自伞菌属蘑菇(姬松茸)、灰树花蘑菇(贝叶多孔菌)、或朝鲜蘑菇(裂蹄针层孔菌)的提取物。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述蘑菇提取物是来自朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌的提取物。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中鲨肉提取物和蘑菇提取物的量的比率范围为4∶1-24∶1。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述比率是约9∶1。
6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中蘑菇提取物是通过乙醇提取蘑菇制备的提取物。
7.根据权利要求6的组合物，其中蘑菇提取物基本不含β-葡聚糖。
8.根据权利要求6的组合物，其中蘑菇提取物含有脂质。
9.根据权利要求8的组合物，其中以最高量存在的脂质是固醇。
10.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中鲨肉提取物是通过乙醇提取鲨肉制备的提取物。
11.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其中鲨肉提取物是来自下组中任意一或多种的肉的提取物角鲨、rig(lemonfish)、翅鲨、魔鬼鲨、灰鲭鲨、蓝鲨、象鼻鲨、salmon shark、和黑鳍礁鲨。
12.根据权利要求1-11中任一项的组合物，其中鲨肉提取物和蘑菇提取物与食用油混合。
13.根据权利要求12的组合物，其中食用油是橄榄油。
14.根据权利要求1-13中任一项的组合物，其被配制成用于口服或局部施用。
15.根据权利要求14的组合物，其被配制为用于局部施用的乳膏或软膏。
16.根据权利要求14的组合物，其被配制在用于口服施用的胶囊中。
17.一种预防或治疗癌症的方法，其包括向对象施用有效量的含具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物，其中每种提取物以协同有效量存在。
18.根据权利要求17的方法，其中癌症是黑素瘤。
19.根据权利要求17的方法，其中癌症是肺癌。
20.含具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，其中每种提取物以协同有效量存在。
21.根据权利要求20的用途，其中癌症是黑素瘤。
22.根据权利要求20的用途，其中癌症是肺癌。
全文摘要
本发明涉及抗癌组合物，其包含协同有效量的鲨肉提取物和蘑菇提取物，尤其是含有鲨肉提取物和朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌(Phellinus linteus)提取物的组合物。本发明也涉及使用本发明的组合物治疗或预防癌症尤其是黑素瘤的方法。
文档编号A61K35/60GK101031312SQ200580024759
公开日2007年9月5日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者保罗·弗兰克·戴维斯 申请人:奥塔哥大学, 免疫研究有限公司
技术领域：
本发明涉及包含协同有效量的鲨肉提取物和蘑菇提取物的抗癌组合物。特别地，本发明涉及包含鲨肉提取物和来自朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌(Phellinus linteus)提取物的组合物。本发明也涉及使用本发明的组合物治疗或预防癌症尤其是黑素瘤的方法。
背景技术：
血管发生是新血管的生长和增殖。在很多生理和病理状况中血管发生起重要作用。在健康身体中，在创伤愈合的增殖期间出现血管发生，用于在损伤或损害之后恢复血液向组织流动，还出现在女性每月生殖周期和妊娠期间。
健康身体通过一系列“开”和“关”转换器(switch)控制血管发生。已知“开”转换器是刺激血管发生的生长因子，“关”转换器被称为血管发生抑制剂。在正常健康身体中，血管发生生长因子和血管发生抑制剂的表达被精确地平衡，以促进血管发生的活化和抑制。
血管发生对于癌肿的存活和生长是非常重要的。相对于非癌性生长和器官，这些肿瘤具有高新陈代谢速率，因此肿瘤需要更多的血以满足它们更高的营养需要。因此抑制血管发生是控制或预防肿瘤生长的一种机制。
一段时间以来已经知道鲨鱼软骨具有抗血管发生活性。最近的工作已经显示鲨肉提取物具有显著的抗血管发生活性。因此，这些物质被认为在癌症的治疗和预防中具有有益作用。
蘑菇裂蹄针层孔菌在南朝鲜生产并且其具有作为药用产品的声誉。申请人已经研究了裂蹄针层孔菌的乙醇提取物。在以前，这种蘑菇的医药特性被认为是由于其存在β-葡聚糖。然而，这种乙醇提取物含有很少或不含β-葡聚糖。
在正在进行的对新的和有用的抗癌剂的搜索中，申请人调查了鲨肉提取物和其它天然产物提取物的混合物。申请人吃惊的发现，相对于单独的鲨肉提取物或单独的裂蹄针层孔菌提取物，包含鲨肉提取物和裂蹄针层孔菌提取物的组合物显示出增强的抗癌活性。申请人也发现这种与鲨肉提取物的令人吃惊的协同活性并不限于裂蹄针层孔菌提取物，还包括其它蘑菇种的提取物。
因此，本发明的一个目的是提供含有鲨肉提取物和蘑菇提取物的组合物，其可用于预防或治疗癌症，或至少提供一种有用的选择。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种含有具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物，其中每种提取物以协同有效量存在。
蘑菇提取物可以是表现出抗癌活性的任何蘑菇的提取物，但是优选是来自伞菌属(Agaricus)蘑菇(姬松茸(Agaricus blazei murill))、灰树花(Maitake)蘑菇(贝叶多孔菌Grifola frondosa)、或朝鲜蘑菇(裂蹄针层孔菌)的提取物。在本发明的一个优选实施方案中，所述蘑菇是朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌。
鲨肉提取物对蘑菇提取物的比率优选是4∶1-24∶1，最优选为约9∶1。进一步优选通过乙醇提取来制备蘑菇提取物。
优选的是，蘑菇提取物很少含或不含β-葡聚糖。还优选的是，蘑菇提取物富含脂质，其中主要的脂质是固醇。
优选通过乙醇提取法制备鲨肉提取物。该肉可以来自任何的角鲨(dogfish)、rig(lemonfish)、翅鲨(school shark)、魔鬼鲨(ghost shark)、灰鲭鲨(mako)、蓝鲨(blue shark)、象鼻鲨(elephant fish)、salmonshark、和黑鳍礁鲨(blacktip reef shark)。
本发明的提取物优选与食用油混合，比如橄榄油。
所述组合物可以配制为任何施用形式，但是优选口服或局部施用。所述组合物可以是用于口服施用的胶囊形式。所述组合物可以是用于局部施用的乳膏或软膏形式。
在另一方面，本发明提供预防或治疗癌症的方法，包括向对象施用有效量的本发明组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述癌症是黑素瘤或肺癌。
在另一方面，本发明提供本发明的组合物在制备预防或治疗癌症，优选黑素瘤或肺癌，的药物中的用途。
具体实施例方式
本发明涉及鲨肉提取物和蘑菇提取物，尤其是朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌，的协同作用组合物，所述组合物适用于预防或治疗癌症。
本文所用术语“提取物”意指通过任何提取方法获得的物质，无论粗提取物是否已经通过常用方法如色谱和过滤进行分级或者纯化。提取方法包括，但不限于溶剂提取。可以使用任何适合的溶剂。溶剂可以是有机溶剂或者水性溶剂、或者有机和水性溶剂的混合物。乙醇是典型使用的有机溶剂(或者水乙醇混合物)，但也可以使用其他有机溶剂。提取溶剂也可以是超临界流体如超临界CO2。
本文使用的术语“鲨肉”意指任何鲨鱼或者鲨鱼样生物的任何肉(meat or flesh)，所述鲨鱼样生物包括但不限于，角鲨(dogfish)、rig(lemonfish)、翅鲨(school shark)、魔鬼鲨(ghost shark)、灰鲭鲨(mako)、蓝鲨(blue shark)、象鼻鲨(elephant fish)、salmon shark、和黑鳍礁鲨(blacktip reef shark)。
可以通过任何溶剂提取技术获得鲨肉提取物，但是通常用乙醇进行提取。
本文所用“朝鲜蘑菇提取物”表示裂蹄针层孔菌的菌丝和/或菌丝体(子实体)的提取物。尽管本领域的技术人员将理解可以使用许多提取方法来制备朝鲜蘑菇提取物，但是通过乙醇提取是优选的提取方法，以产生很少含或不含β-葡聚糖的提取物。
申请人已经发现包含鲨肉提取物和朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌提取物的组合物在小鼠实验黑素瘤中对肿瘤生长具有显著作用。
小鼠黑素瘤细胞经皮下注射到正常未添加饮食的小鼠中。肿瘤生长快速，以致于经过21天70％肿瘤的尺寸超过200mm2。
小鼠被分成4个实验组(组1-未添加，组2-饮食中添加1ml/100ml(1％)鲨肉提取物，组3-饮食中添加1ml/100ml(1％)朝鲜蘑菇提取物，组4-饮食中添加1ml/100ml(1％)的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v))。
与未添加的组相比，鲨肉提取物对黑素瘤生长显示非常小的作用，3周后80％的肿瘤大于200mm2。1％相对低剂量的朝鲜蘑菇提取物确实具有积极作用。在3周结束时，50％小鼠的肿瘤尺寸小于200mm2。
令人感兴趣的是，如果鲨提取物和朝鲜蘑菇提取物以9∶1的比率组合，就有实质上改善的作用。10个小鼠中只有一个的肿瘤尺寸大于200mm2。这对接受未添加饮食的对照组来说，是显著的改进。此外，对于单独使用鲨肉提取物的组获得的结果来说，这也是一种改进。这个结果是最令人吃惊的，因为单独添加鲨肉提取物没有影响肿瘤大小。仍然是这个组，其接受90％相同剂量水平的鲨肉提取物，具有显著更好的结果。这是由于蘑菇提取物的存在。这种作用大于二者加和作用所产生的作用。这种协同机制是本发明的基础。
肿瘤的平均尺寸与存活模式平行。在实验结束时，鲨肉提取物饲喂组中的肿瘤平均尺寸是对照组的88.8％。对于接受朝鲜蘑菇提取物(1％的饮用水)的组，在实验结束时平均肿瘤尺寸减小了35.4％，其具有显著差异。这种组合的作用是甚至进一步减小肿瘤尺寸。当鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物被一起饲喂时，平均肿瘤尺寸仅是对照组的48.6％。这表明鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物的组合使平均肿瘤尺寸减小超过一半。
总之，单独喂饲鲨肉提取物对肿瘤生长或小鼠存活有很小影响。单独喂饲蘑菇提取物对减小肿瘤尺寸有一些作用。然而，最明显的是，鲨提取物和朝鲜蘑菇提取物的组合减小肿瘤平均尺寸到未处理对照组的仅50％。
此外，与对照组中10只中死去8只的结果比较，10只中只死去1只动物，动物的存活预期要好得多。
本发明进一步参考以下实施例进行描述。应该理解的是本发明并不限于这些实施例。
实施例实施例1提取物的制备实施例1.1鲨肉提取物的制备在典型的提取中，来自一或多个鲨的肉片用搅拌器减小尺寸，冷冻干燥，粉碎，然后与溶剂如乙醇混合。混合物通常在室温下搅拌1-24小时。随后通过过滤从肉中去除溶剂。溶剂与肉混合的步骤任选地被重复。随后通过蒸发去除溶剂，从而得到油状物的鲨肉提取物。随后此油状物可以与载体如橄榄油混合。
在以下实施例中应用的鲨肉提取物是用乙醇提取、接下来去除溶剂并按9∶1的重量比(橄榄油对提取物)加入橄榄油而获得的提取物。
实施例1.2蘑菇提取物的制备用无水乙醇以20∶1(v/w)的比率在接近20℃条件下提取干蘑菇粉18小时。离心去除残渣并过滤上清液。随后通过蒸发去除乙醇，使得上清液的体积减少约40倍。用橄榄油以9体积橄榄油对1体积蘑菇提取物的比率稀释所得浓缩物。以5％终浓度(w/w)加入维生素E。接下来进一步浓缩去除残留乙醇，随后进行过滤。
实施例2鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物—小鼠黑素瘤研究建立5-7周龄CB51小鼠(5个雄性，5个雌性)的四个组。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮食按以下所示进行添加组A-对照组(无添加)，组B-饮食中添加1ml/100ml(1％)的鲨肉提取物，组C-饮食中添加1ml/100ml(1％)的朝鲜蘑菇提取物，
组D-饮食中添加1ml/100ml(1％)的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v)。
在将1×105黑素瘤B16细胞注射到每只小鼠左肋之前一天，开始饲喂添加饮食。每两天测量水的消耗并且用新鲜的添加水替换添加水。由此来确定剂量。此外，在整个实验期间，每天对小鼠进行称重。注射细胞后每天测量每个肿瘤的尺寸并确定其面积。一旦肿瘤超过200mm2，对小鼠进行安乐死。每只小鼠被处死后，切除肿瘤并保存在福尔马林中。在21天实验周期结束时，从存活小鼠切除每个肿瘤并称重。在切除前对每个肿瘤周围的淋巴量进行定性评价。安乐死以后，每个动物的尸体进行尸体解剖并对器官进行检查，以查找转移和其它总体病理改变的证据。应该对脾和胃肠道特别注意。使用Student t-检验对数据进行统计学显著改变的分析，当概率小于0.05时被认为具有显著性。
实施例2.1肿瘤称重在处死时，从每个小鼠切除肿瘤并称重(表1)。
表1肿瘤的重量(平均值(g)±SEM)
*p＜0.05鲨肉提取物确实使肿瘤平均重量减少了约22％，但是这不具有统计学显著性。朝鲜蘑菇提取物更加有效。喂食这种提取物的小鼠的肿瘤平均重量减小了约30％，但是这种降低没有统计学显著性。然而，喂食鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物的小鼠的肿瘤重量平均减少了40％，这是显著的减少。
实施例2.3肿瘤尺寸在整个实验期间计算肿瘤的平均面积。在只接受鲨肉提取物的组(组B)中，肿瘤的尺寸与未处理组相比没有显著差异。在实验结束时，这个组的肿瘤平均尺寸仅比对照组约低11％。
然而，对于接受朝鲜蘑菇提取物的组，在实验结束时，肿瘤平均尺寸减小35％。这是具有统计学显著性(p＜0.025)的结果。对于接受鲨肉提取物/朝鲜蘑菇提取物混合物的小鼠，肿瘤平均尺寸减小50％。这个结果具有高度统计学显著性(p＜0.0025)。
实施例2.4存活率第一个被处死的动物来自组B。这发生在实验开始后的17天。在18天时，对照组和组D处死了第一个动物。在19天时，组C处死了第一个动物。然而，在剩下的时间中来自组B的小鼠稳定地被处死，以致于实验结束时只剩下两只小鼠。相比较而言，实验结束时对照组(组A)10只小鼠中有3只存活。事实上，在17天后的每个点，组A存活的小鼠都比组B存活的小鼠多。也就是说，喂食鲨肉提取物的小鼠比对照组小鼠的存活率更差。
直到19天时，只接受蘑菇提取物的小鼠(组C)中才出现第一例死亡，并且此后死亡数稳步增加，以致于21天时只有50％的小鼠存活。对于对照组(组A)和只接受鲨肉提取物的组(组B)这是一种改进。
然而，对于接受鲨肉提取物和蘑菇提取物的混合物的组，与任何其它组比较，其存活率都有明显改进。在19天时一只小鼠被处死，并且在实验期间其是仅有的死亡例。在研究结束时，组D中90％的小鼠仍然存活。
实施例3鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物—最佳比率在确定9∶1比率(重量)的鲨肉提取物/朝鲜蘑菇提取物对小鼠黑素瘤的作用之后，对7∶3比率的提取物进行比较研究。
建立三组6-12周龄CB51小鼠(5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮用水按如下所示进行添加组A-对照组(3％乙醇中的1％橄榄油)；组B-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v)；组C-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(7∶3v/v)。
使用在实施例2中描述的方法，但是从细胞注射后第8天开始，每天测量每个肿瘤生长的尺寸并确定其面积，并且实验周期为16天。
实施例3.1肿瘤尺寸在实验结束时测量每个肿瘤的尺寸并且计算每组的平均值。结果总结于表2中。
表2肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在所有时间，接受9∶1提取物混合物组的肿瘤尺寸小于不接受任何处理的小鼠中。尽管实验结束时只有6.3％的差异，但是在肿瘤生长期间差异更加明显。例如在13天时，经处理动物中肿瘤尺寸小了62％。9∶1提取物混合物显著抑制了黑素瘤的生长速率。相比较，在开始的12天中，7∶3提取物混合物对生长速率没有影响。也就是说，它没有表现出抑制作用。在此之后，未处理肿瘤的生长速率减慢，但是接受提取物混合物的小鼠的生长速率以更快速率继续。在实验结束时，该组(7∶3)的肿瘤平均尺寸比未处理小鼠大14.5％。因此对抑制黑素瘤优选9∶1提取物混合物。
实施例3.2存活率在14天时，50％用7∶3提取物混合物处理的动物存活，对比未处理组只有30％的动物存活。在第16天实验结束时，未处理动物没有存活，然而该处理组中有30％的动物存活。
然而，用9∶1提取物混合物处理的小鼠比未处理动物和接受7∶3提取物混合物动物的存活率更好。在14天时，该组中90％的动物仍然存活，并且在实验结束时50％的动物仍然存活。
实施例3.3血管形成处死每只小鼠时，评估原发性肿瘤周围血管形成的程度。结果显示在表3中。
表3血管形成的程度0(可忽略的)-3(广泛的)级别的分级
9∶1提取物混合物比7∶3提取物混合物显示出对血管形成更强的抑制作用。
实施例3.4转移在对照组中(组A)，两只雄性小鼠显示出转移性生长。在一只中，在黑素瘤部位附近有4处皮肤损伤。在另一只中，在皮肤附近有3处并且在肝中有另外5处。在该组的雌性动物中，2只显示出转移。一只在肝中有5处损伤并在肾中有2处损伤，另一只在黑素瘤附近的皮肤中和另外在肺中。
在用9∶1提取物混合物喂饲的组(组B)中，所有的雄性和5只雌性中的3只都证实了有转移性生长。在雄性中，一只小鼠在脾中有非常大的生长(器官的约25％)以及在皮肤中有3处。第二只雄性小鼠有体积占约10％的脾损伤以及一处在皮肤中。第三只有2处小的脾损伤。该组中另外2只雄性小鼠被证实有皮肤转移。三只雌性小鼠在脾中有非常大的肿瘤(大于器官大小的20％)。令人感兴趣的是，在接受该添加饮食的雌性小鼠中，没有包括皮肤肿瘤在内的其它转移。
在喂饲7∶3提取物混合物的组(组C)中，在雄性小鼠中只有一例转移性生长(肺部肿瘤)。5只雌性小鼠中的2只中，每只在皮肤中有单个转移，并且一只具有很大的脾新生物和另一只具有肺肿瘤。
实施例4鲨肉提取物和灰树花蘑菇提取物—最佳比率建立三组6-12周龄CB51小鼠(5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮用水按如下所示进行添加组A-对照组(无添加)；组B-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1v/v)；组C-饮食中按1ml/100ml(1％)添加在3％乙醇中的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(7∶3v/v)。
使用在实施例2中描述的方法，但是在黑素瘤细胞注射之前1天开始饲喂，从细胞注射后第8天起每天测量每个肿瘤生长的尺寸并确定其面积，实验周期为16天。
实施例4.1肿瘤尺寸实验结束时测量每个肿瘤的尺寸并计算每组的平均值。结果总结于表4中。
表4肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在所有时间点，接受9∶1提取物混合物组的肿瘤尺寸小于不接受任何处理的小鼠。尽管在实验结束时差异只有12.8％，但是在肿瘤生长期间该差异更加明显。例如在13天时，在经处理动物中的肿瘤平均尺寸小了54％，这是实质上的尺寸减小。9∶1提取物混合物显著抑制了黑素瘤的生长速率。相比较而言，7∶3提取物混合物显示出刺激生长。在所有时间点，在这些小鼠中的肿瘤平均尺寸大于对照组中的那些。在13天时，肿瘤尺寸大了26.9％；在16天时大了55.6％。
实施例4.2存活率接受7∶3提取物混合物的小鼠有最差的存活率。除了在第14天时以外，其存活率都比不接受任何处理的小鼠更差。然而，在大部分时间点，添加有9∶1提取物混合物的组中的存活水平都比对照组的要好。接受所述9∶1混合物的小鼠比接受7∶3提取物混合物的小鼠具有更好的存活率。
实施例4.3血管形成在处死每只小鼠时，评估原发性肿瘤周围血管形成的程度。结果显示在表5中。
表5血管形成的程度0(可忽略的)-3(广泛的)级别的分级
基于该对比研究，9∶1提取物混合物显示出抑制血管形成的作用，尽管不是强抑制作用。发现7∶3提取物混合物有刺激作用(13.4％)。
实施例4.4转移在对照组(组A)中，雄性小鼠中有一只在脾中出现转移性生长，覆盖约25％的脾。在该组的雌性小鼠中，2只显示出脾转移。一只的损伤占器官的约12％，另一只占约25％。在添加有9∶1提取物混合物的组中，3只雄性小鼠证实有脾的转移性生长。所有的都有非常大的生长(接近器官的25％)。一只雌性小鼠有非常增大的脾。令人感兴趣的是，在接受此添加的雌性小鼠中没有其它转移。在添加有7∶3提取物混合物的组中，在雄性小鼠中，只有1例转移性生长。这是非常接近原发性损伤的皮肤肿瘤。该组5只雌性小鼠中的1只具有占脾约25％的大脾新生物。
实施例5鲨肉提取物和朝鲜蘑菇提取物—最佳剂量因为本研究涉及9∶1比率的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物的5个不同的剂量水平，所以实施两个分开的实验。在两个实验中，提取物混合物作为添加物加到饮用水中。
对于实验1，建立以下的组A.对照组(3％橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.0.03％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.0.1％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；D.0.3％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
对于实验2，建立以下的组A.对照组(3％橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.1.0％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.3.0％的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
所建立的每个组含有5-6周龄CB51小鼠(5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食和经添加的饮用水。在1×105黑素瘤细胞注射进每只小鼠左肋前1周，开始喂饲经添加的饮食。每周三次测量水的消耗，并且在每次测量后用新鲜的添加水替换添加水。当添加实验开始时称重每只小鼠，并随后在注射黑素瘤细胞前的即刻、和在7天后和14天后对小鼠称重。从细胞注射后第9天，测量每个肿瘤生长的大小并按公式“体积＝(π×X×Y×Z)/6，其中X是长度，Y是宽度和Z是高度”每天确定其体积。每天进行这些测量，直至实验结束。
实施例5.1肿瘤生长速率在整个实验期间测量每个肿瘤大小并每天计算每组的平均值。结果总结于表6和7。
表6实验1-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
表7实验2-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
向饮用水加入提取物混合物确实减缓了肿瘤的生长速率。在实验1中，其剂量水平非常低，0.03％的剂量(组B)非常有效并且在所有的时间点比未处理小鼠的肿瘤尺寸更小(表7)。例如，在17天时，组B的肿瘤比未处理小鼠(组A)的肿瘤小67.8％。这种差异继续，并且在19天时差异是75.7％，在21天时是41.8％和在23天时是27.5％。
0.1％提取物混合物的有效性(组C)不如更低剂量那样大。在17天时，生长降低约8.7％和在19天时降低约48.9％。在21天和23天时，肿瘤的平均尺寸比对照组的更大。
在17天时，0.3％添加物(组D)达到几乎完全抑制肿瘤的作用(95.9％)。即使在19天时，也有实质的抑制作用。在这些小鼠中的肿瘤尺寸平均来说都有极大的缩减(86.0％)。在21天时，经添加的动物的生长速率仍然小了57.4％，并且在接近研究结束时，它低了31.9％(第23天)。
在实验2中，高剂量的提取物混合物的作用非常显著。例如，在12天时，接受1％添加物的小鼠(组B)的肿瘤平均尺寸比对照动物的小35％。在14天时，此差异是9.4％，和在16天时任何作用都消失。对于提取物混合物的最高剂量，这种差异甚至更加显著。然而在12天时，肿瘤平均尺寸与1％添加物中的尺寸大约是相同的，在14天时它小了27.5％。即使在16天时，肿瘤的平均尺寸比未处理小鼠的小了23％。在此时也与1％剂量水平作用的缺乏形成对比。
因此通过鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物的组合，对于在小鼠中抑制黑素瘤生长有明确的剂量效应，但是从此数据中不能很容易的分辨出最佳剂量。
实施例5.2存活率在实验1中，接受鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物的所有3组比对照组(组A)有更好的存活率。最好的是接受最低水平(组B)的小鼠。
在实验2中，明显的是，从13天开始和以后，接受高剂量提取物混合物的小鼠比未接受处理的小鼠的存活率更高。在1％剂量(组B)和3％剂量(组C)之间没有大的差异。
实施例5.3血管形成在每只小鼠被处死时，评估在原发性肿瘤周围血管形成的程度。结果显示于表8和9。
表8实验1-血管形成的程度
表9实验2-血管形成的程度
在实验1中，对于所有三种添加物，肿瘤外周周围血管形成的程度有实质性降低。在实验结束时，在接受0.03％和0.1％提取物混合物的小鼠中血管密度平均低30％，对于接受0.3％提取物混合物的组(组D)大约低15％。
在实验2中，1％提取物混合物已经可以刺激血管形成的程度，同时与对照组比较3％提取物混合物的水平低8％。然而，这些测量是在研究结束时当所有动物中肿瘤都非常大时进行的。
实施例6鲨肉提取物和灰树花蘑菇提取物—最佳剂量正如实施例5，这些对于鲨肉提取物和灰树花(Grisfola frondosa)蘑菇提取物的组合的研究以两个分开的实验进行。方法与实施例5相同。
对于实验1，建立以下的组A.对照组(3％的橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.0.03％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.0.1％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；D.0.3％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
对于实验2，建立以下的组A.对照组(3％的橄榄油在乙醇(5％终浓度)中)；B.1.0％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.3.0％的鲨肉提取物∶灰树花蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
实施例6.1肿瘤生长速率在接受不同剂量的鲨肉提取物∶灰树花(Grisfola frondosa)蘑菇提取物的动物中的肿瘤生长速率列在表10和11中。
表10实验1-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
两个最低剂量的提取物混合物对小鼠中黑素瘤的生长速率基本上没有作用。尽管在早期的时间点，0.03％提取物混合物(组B)显示出抑制作用，对照动物与接受这两个水平剂量的动物的生长速率几乎相同。
表11实验2-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在实验2中，两个高剂量提取物混合物的作用是相对小的。在肿瘤的主要生长期间，1.0％剂量(组B)是相当值得注意的。在13天时，该组的肿瘤平均尺寸比对照组动物的(组A)小约18.5％，但是15天时，它们具有同样的尺寸，并且在17天时它们增大了约10％。
提取物混合物在小鼠中对黑素瘤生长抑制的最佳剂量约为0.3％。
实施例6.2存活率在实验1中，在0.03％剂量水平的动物(组B)比对照动物的存活率略好。然而，在高3.3倍的剂量水平上(组C)没有同样的存活。组D(0.3％)中的小鼠持续地比组B中的小鼠具有更高的存活率，甚至比对照组(组A)中的那些小鼠更高。
在实验2中，接受高剂量提取物混合物的两组小鼠的存活率都不是很好。在这两种情况中，它们与对照组的存活率相等或非常接近。
在接受0.3％剂量的组中，获得最好的存活率，同样该组显示出对肿瘤生长速率的最强抑制作用。
实施例6.3血管形成在每只小鼠被处死时评估其原发肿瘤外周血管形成的程度。结果显示在表12和13中。
表12实验1-血管形成的程度
表13实验2-血管形成的程度
在实验1中，随着提取物混合物剂量水平的增加，在实验结束时，肿瘤的血管形成稳步降低。接受0.3％提取物混合物的组的血管形成水平低了18.6％。随着添加物剂量的增加，外周肿瘤血管形成成比例的降低，这支持它的抗血管发生作用。
在实验2中，两个剂量的提取物混合物都抑制血管形成。与对照组小鼠(组A)相比，在研究结束时，1.0％剂量(组B)导致血管形成评分降低8％。接受3.0％剂量的那些证实外周血管形成有5.4％的降低。
发现0.3％剂量水平的提取物混合物对于降低向肿瘤的血管供应是最佳的。对于抑制肿瘤的生长速率和提供最好的存活，这也是最佳剂量。
实施例7鲨肉提取物和伞菌蘑菇提取物—最佳剂量如实施例5，这些对于鲨肉提取物和伞菌蘑菇(姬松茸)提取物的组合的研究以两个分开的实验进行。方法与实施例5相同。
对于实验1，建立以下的组
A.对照组(3％的橄榄油在乙醇(5％的终浓度)中)；B.0.03％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.0.1％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；D.0.3％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
对于实验2，建立以下的组A.对照组(乙醇中3％的橄榄油(5％的终浓度))；B.1.0％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)；C.3.0％的鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物(9∶1)(5％乙醇终浓度)。
实施例7.1肿瘤生长率在整个实验期间测量每个肿瘤的尺寸并每天计算每组的平均值。
向饮用水加入提取物混合物确实减缓了黑素瘤的生长速率。在实验1中，其剂量水平非常低，0.03％的剂量(组B)非常有效并且在所有时间点上其肿瘤尺寸比未处理小鼠的肿瘤尺寸更小(表14)。例如，在12天时，肿瘤平均只有一半的尺寸，在14天时大约小20％，和在16天时，对照肿瘤已经变得非常大时，肿瘤的平均尺寸仍然小约20％。
0.1％的剂量对肿瘤的生长速率也是有效的抑制剂。在12天时，该组(组C)中小鼠的肿瘤比对照组的那些平均小25.5％。在14天时，这种降低只有大约4％，并且在16天时它是11％。
在12天时，组D动物(0.3％)的肿瘤在体积上比未处理小鼠的小约38％。然而到14天时，这种差异被缩减到只有9％。
表14实验1-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
表15实验2-肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
在实验2中，高剂量提取物混合物的作用非常显著。例如，在12天时接受1％剂量(组B)的小鼠的肿瘤平均尺寸比对照动物小67.7％。也就是说，肿瘤只是未处理小鼠肿瘤大小的三分之一。在14天时，这种差异仍然高达35.6％的减小。即使在实验结束时(第16天)，组B的肿瘤仍然小约8.5％。对于最高剂量的提取物混合物，差异也是非常明显的。在第12天时，肿瘤尺寸与1％剂量组大致相同(减小61.2％)，但是在14天时，它小了约37.3％。因此，在这2个剂量水平的反应是大致相同的。在16天时，肿瘤平均尺寸超过未处理小鼠约7.5％。
因此鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物的组合对抑制小鼠中黑素瘤生长有明确的剂量效应。1％和3％的剂量对抑制小鼠黑素瘤的生长速率具有基本相等的作用。除了0.03％的剂量显示出相当强的拮抗作用以外，剂量越低，作用越小。
实施例7.2存活率在实验1中，没有一个组有高存活率。所有4个组都显示出非常相似的存活模式。没有一个存活超过16天。接受更高剂量提取物混合物(实验2)小鼠的存活模式也不够好。同样，对于经添加的和对于对照小鼠，所有动物已经达到上限并且存活的一般模式非常相似。
鲨肉提取物∶伞菌蘑菇提取物没有显示出帮助提高患癌小鼠的存活率，尽管它能够非常有效的减慢肿瘤的生长速率。
实施例7.3血管形成在每只小鼠被处死时评估其原发肿瘤外周血管形成的程度。结果显示在表16和17中。
表16实验1-血管形成的程度
表17实验2-血管形成的程度
在实验结束时，低剂量提取物混合物对肿瘤周围血管延长的作用在0.03％剂量中显出11％抑制，但是其它两个剂量(0.1％和0.3％)的作用可以忽略。在研究结束时，0.1％的剂量具有降低血管密度8.7％的作用，然而0.3％剂量的作用可以忽略。
实施例8肺癌研究研究鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1)对小鼠肺癌生长的作用。对于此研究，使用裸鼠和人非小细胞肺癌。
建立两组12.5-13.5周龄裸鼠(每组包括5只雄性，5只雌性)。它们都不受限制地接受啮齿动物饮食，但是饮用水按如下所示进行添加组A-对照组(在5％乙醇中的3％橄榄油)；组B-饮食中按3ml/100ml(3％)添加在5％乙醇中的鲨肉提取物∶朝鲜蘑菇提取物(9∶1v/v)。
本实施例样品方法遵照实施例5。
实施例8.1肿瘤生长速率接受不同剂量提取物混合物的动物的肿瘤生长速率显示于表18。
添加有提取物混合物的水可有效降低实验小鼠肺癌的生长。例如，在39天时，在经添加处理的小鼠比对照小鼠的肿瘤平均尺寸小23％。5天后此差异已经增加到41％。在51天时，实验组中的损伤小了30.8％，在56天时经处理的患癌小鼠在体积上仍然小29.5％。
因此，在此剂量水平的提取物混合物非常强效地抑制肺癌生长。
表18肿瘤尺寸(体积(mm3)±SEM)
实施例8.2存活率接受提取物混合物小鼠的存活率明显好于只接受载体橄榄油的小鼠。在研究结束时(第60天)，这些动物中有50％存活，然而对照组中只有20％的小鼠存活。
实施例8.3血管形成在每只小鼠被处死时评估其原发肿瘤外周血管形成的程度。结果显示在表19中。
表19血管形成的程度
在研究结束当肿瘤很大时，尤其是在对照组中，在它们水中添加有提取物混合物的小鼠中，围绕每个肿瘤的血管形成程度低大约13.3％。这表明添加物发挥了抗血管发生活性。
尽管本发明已经通过实施例的方式进行了说明，应该理解的是不偏离权利要求的范围可以对本发明进行变化和修饰。而且，对于具体特征所存在的已知等同物，这些等同物也被并入本发明，就像在本说明书中具体描述。
工业实用性本发明的组合物具有抗癌特性。它们包含协同有效量的鲨肉提取物和蘑菇提取物。本组合物在治疗和预防癌症尤其是黑素瘤中具有潜在的用途。
权利要求
1.一种含具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物，其中每种提取物以协同有效量存在。
2.根据权利要求1的组合物，其中蘑菇提取物是来自伞菌属蘑菇(姬松茸)、灰树花蘑菇(贝叶多孔菌)、或朝鲜蘑菇(裂蹄针层孔菌)的提取物。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述蘑菇提取物是来自朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌的提取物。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中鲨肉提取物和蘑菇提取物的量的比率范围为4∶1-24∶1。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述比率是约9∶1。
6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中蘑菇提取物是通过乙醇提取蘑菇制备的提取物。
7.根据权利要求6的组合物，其中蘑菇提取物基本不含β-葡聚糖。
8.根据权利要求6的组合物，其中蘑菇提取物含有脂质。
9.根据权利要求8的组合物，其中以最高量存在的脂质是固醇。
10.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中鲨肉提取物是通过乙醇提取鲨肉制备的提取物。
11.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其中鲨肉提取物是来自下组中任意一或多种的肉的提取物角鲨、rig(lemonfish)、翅鲨、魔鬼鲨、灰鲭鲨、蓝鲨、象鼻鲨、salmon shark、和黑鳍礁鲨。
12.根据权利要求1-11中任一项的组合物，其中鲨肉提取物和蘑菇提取物与食用油混合。
13.根据权利要求12的组合物，其中食用油是橄榄油。
14.根据权利要求1-13中任一项的组合物，其被配制成用于口服或局部施用。
15.根据权利要求14的组合物，其被配制为用于局部施用的乳膏或软膏。
16.根据权利要求14的组合物，其被配制在用于口服施用的胶囊中。
17.一种预防或治疗癌症的方法，其包括向对象施用有效量的含具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物，其中每种提取物以协同有效量存在。
18.根据权利要求17的方法，其中癌症是黑素瘤。
19.根据权利要求17的方法，其中癌症是肺癌。
20.含具有抗癌活性的鲨肉提取物和具有抗癌活性的蘑菇提取物的组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，其中每种提取物以协同有效量存在。
21.根据权利要求20的用途，其中癌症是黑素瘤。
22.根据权利要求20的用途，其中癌症是肺癌。
全文摘要
本发明涉及抗癌组合物，其包含协同有效量的鲨肉提取物和蘑菇提取物，尤其是含有鲨肉提取物和朝鲜蘑菇裂蹄针层孔菌(Phellinus linteus)提取物的组合物。本发明也涉及使用本发明的组合物治疗或预防癌症尤其是黑素瘤的方法。
文档编号A61K35/60GK101031312SQ200580024759
公开日2007年9月5日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者保罗·弗兰克·戴维斯 申请人:奥塔哥大学, 免疫研究有限公司
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