预防感染的营养物的制作方法
专利名称：预防感染的营养物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于降低肠道屏障通透性和/或治疗或预防感染的营养组合物， 特别是婴儿营养物。
背景技术：
新生儿的肠道屏障发育不完全。由于肠道屏障减弱或肠道通透性提高，新生儿易 患细菌移位、毒素移位和过敏原移位。与母乳喂养的婴儿相比，常规婴儿配方喂养的婴儿有 甚至更高的肠道通透性功能。一个解决办法是使用益生菌(probiotic bacteria)来治疗 与肠道通透性提高相关的疾病。但是，本身作为活微生物的益生菌在肠道屏障功能减弱的 受试者中的使用可能是不安全，因为在一些病例中，这些益生菌本身能穿过肠道屏障移位 并引起其全身感染。另一个解决办法是使用益生素(prebiotics)。EP 1815755公开了一种营养组合物，所述营养组合物含有长链多不饱和脂肪酸和 两种不同的非消化性低聚糖用于改善屏障功能。EP 1320375公开了膳食纤维——特别是果聚糖——用于制备一种用来抑制致病 性细菌全身生长的组合物的用途。WO 2004/112509涉及一种组合物，该组合物是用于诱导一种与母乳喂养中观察 到的肠道屏障成熟模式类似的肠道屏障成熟模式，并且可以提高肠道屏障成熟度，所述组 合物包含特定成分的结合物，所述特定成分被设计以在整个胃肠道提供协同作用和屏障功 能。WO 2005/039319涉及一种用于非母乳喂养或部分母乳喂养的婴儿的制品，该制品 包含短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和非消化性碳水化合物混合物，还涉及所述制 品用于治疗或预防非母乳喂养或部分母乳喂养的婴儿的免疫病症的用途。WO 2007/067053公开了含有源自植物的益生元菊糖、半乳糖醛酸低聚糖和经由乳 糖合成的益生元转半乳糖低聚糖(transgalacto-oligosaccharide)的婴儿配方来减少感染。WO 2004/069156公开了使用灭活的细菌。Heyman et al,2005, Acta Paediatr. 94 :34-36 公开了一种用双歧杆菌和嗜热链 球菌(Str印tococcus thermophilus)发酵并加热/脱水灭活微生物的乳配方的作用，即降 低肠道对大分子的通透性并增强肠道屏障对食物蛋白质的抗性。但是，还需要进一步开发婴儿配方来改善肠道屏障功能和减少感染。
发明内容
本发明人惊讶地发现i)和ii)的结合物可以协同地提高对感染的抗性， 其中i)是通过以下步骤获得的产物将水性底物与双歧杆菌孵育，然后通过对所 述孵育混合物加热灭活双歧杆菌，并且/或者通过离心和/或过滤从所述孵育混合 物除去双歧杆菌细胞，其中所述底物选自下列物质的至少一种乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖；ii)是至少两种不同的非 消化性碳水化合物，其中至少一种碳水化合物，优选两种碳水化合物选自低聚果糖 (fructo-oligosaccharides)> 1 1 ^ H (galacto-oligosaccharides)> M M ^ H (gluco-oligosaccharides) > 1 1 H 才立·{白 H (arabino-oligosaccharides) > 1 1 1ξ[" MMW (mannan-oligosaccharides) > 1 1 7^ H (xylo-oligosaccharides) > jS: M
H (fuco-o ligosacchar ides) > 1 1 H Ji fQ ^L IK H (arabinogalacto-o ligosacc harides)、低聚葡糖甘露聚糖(glucomanno-oligosaccharides)、低聚半乳甘露聚糖 (galactomanno-oligosaccharides)、丰帛〒H (raff inose) >(Iactosucrose)、L
低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液酸(sialic acid)。与食用单组分的动物相比，在食用所述组 合物的动物中观察到穿过肠道屏障的细菌移位减少。这表明肠道屏障功能增强或肠道屏障 通透性降低。上文定义的成分i)和ii)的结合物之间的协同作用是意料之外的。不能简单的 将其解释为共存作用，即其中非消化性碳水化合物(ii)特异性地刺激存在于同一制品中 有益微生物的生长，原因是在本发明的制品中不存在双歧杆菌活细胞。除去和/或灭活活的双歧杆菌细胞具有更进一步的益处，即所述组合物可经巴氏 法灭菌(pasteurised)和/或灭菌(sterilised)，从而减少被有害微生物污染的机会。这 对于婴儿尤其有利，因为婴儿肠道通透性高。此外，由于双歧杆菌被除去或灭活，它们本身 不再能引起感染。另外一个益处是可以更好地控制每位人受试者所接受的生物活性成分的剂量。同 样有利地，产品的贮存更容易并且费用降低。此外，贮存的产品中有利地不会出现后酸化， 从而避免了与蛋白凝聚和不良口味相关的不良反应。还有另一个益处，即灭活的和/或除 去的双歧杆菌不再能够分解和消耗非消化性碳水化合物。本发明的制品适合用于治疗和/或预防感染，特别是全身感染；用于预防和/或治 疗腹泻；用于减少细菌移位，优选减少细菌穿过肠道屏障移位；和/或用于改善肠道屏障功 能。
具体实施例方式本发明涉及一种制造制品的方法，包括步骤a:将水性底物与双歧杆菌孵育以得到孵育混合物，其中所述底物是选自下列物质 的至少一种乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖；b 通过加热所述孵育混合物灭活所述双歧杆菌，并且/或者通过离心和/或过滤 从所述孵育混合物中除去双歧杆菌细胞；以及C 将包含步骤a或步骤b得到的混合物——优选步骤b得到的混合物——的组合 物与至少两种非消化性碳水化合物结合，所述非消化性碳水化合物的至少一种，优选两种 选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露聚糖、低聚木糖、低聚岩 藻糖、低聚阿拉伯半乳聚糖、低聚葡糖甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、棉子糖、乳蔗糖、含有 低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液酸。在一方面，本发明涉及一种通过本发明的方法得到的制品。在一个实施方案中，本 发明涉及一种营养组合物，其包含通过本发明的方法得到的制品，或由通过本发明的方法得到的制品组成。本发明还涉及一种用于治疗和/或预防哺乳动物疾病的方法，所述方法包括将本 发明的制品给予所述哺乳动物。本发明还涉及一种向婴儿提供营养物的方法，所述方法包括将本发明的制品或含 有本发明制品的营养组合物给予所述婴儿。包含将底物与双歧杆菌孵育的方法本发明涉及一种可通过将水性底物与双歧杆菌孵育获得的制品，或一种通过将 水性底物与双歧杆菌孵育获得的制品，其中所述水性底物包含选自下列物质的至少一种 乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖(下文称作步骤 (a))。将可从步骤(a)获得的，或从步骤(a)获得的孵育混合物用于步骤(b)的处理，步 骤(b)包括通过加热来灭活双歧杆菌的步骤和/或通过离心和/或过滤来除去双歧杆菌的 步骤。进行步骤(b)是为了减少所述制品中的活双歧杆菌数量，优选地减少至少90%，更 优选减少至少99%。在一个实施方案中，所述孵育步骤包括一个发酵步骤和/或生物转化 (bioconversion)步骤。在发酵过程中，将所述水性底物被所述双歧杆菌发酵。在生物转化 过程中，将所述水性底物被所述双歧杆菌生物转化。通过本发明的方法可得到的或得到的(下文中在仅提到“得到的”时，也意 味着“可得到的”)制品优选地包含细菌细胞碎片如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸 (lipoteichoic acid，LTA)、脂蛋白、DNA和/或荚膜多糖。这些碎片可引起免疫学反应。使 用通过将水性底物和双歧杆菌孵育之后灭活和/或除去双歧杆菌而得到的产物是有利的， 因为这样可产生更高的细菌细胞碎片浓度，所述水性底物包含选自下列物质的至少一种 乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖。在将水性底物与 双歧杆菌孵育时，可形成另外的生物活性化合物，例如有机酸、生物活性肽和/或寡聚糖， 它们都会刺激免疫系统。当使用市售的益生菌制品时，益生菌细胞通常会被洗涤并且被从 包含细菌细胞碎片的水性生长培养基中分离，从而大大减少或甚至消除含有细菌细胞碎片 的孵育底物上清液。在本发明中就不会这样。完整的(活或死)细胞的存在并不是免疫反 应所必需的；在本发明的与双歧杆菌孵育步骤后，水性底物本身已经对免疫系统具有有益 作用。双歧杆菌和链球菌用于本发明方法的双歧杆菌优选地被以单独培养物或混合培养物的形式提 供。双歧杆菌是革兰氏阳性、厌氧的、杆状产乳酸细菌。本发明的双歧杆菌种与各 个双歧杆菌种的株系类型相比优选地具有至少95%的16S rRNA序列同一性，更优 选至少97 %的同一性，如各种手册中对这方面的定义，所述手册例如Sambrook，J.， Fritsch, Ε. F., 禾口 Maniatis, Τ. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor (N. Y.) Laboratory Press。优选使用的双歧杆菌还记 载于 Scardovi, V. Genus Bifidobacterium, p. 1418-p. 1434.见Bergey ‘ s manual of systematic Bacteriology. Vol. 2. Sneath, P. H. A. , N. S. Mair, M. E. Sharpe and J. G. Holt (ed.). Baltimore :ffilliams&ffilkins. 1986. 635p0 制备本发明的制品中使用 的双歧杆菌优选是选自下列的至少一种双歧杆菌短双歧杆菌(B. breve)、婴儿双歧杆菌 (B. infantis)、双歧双歧杆菌(B. bifidum)、链状双歧杆菌(B. catenulatum)、青春双歧杆
6菌(B. adolescentis)、嗜热双歧杆菌(B. thermophilum)、高卢双歧杆菌(B. gallicum)、动 物双歧杆菌或乳双歧杆菌(B.animalisor lactis)、角双歧杆菌(B. angulatum)、假链状 双歧杆菌(B. pseudocatenulatum)、热嗜酸双歧杆菌(B. thermacidophilum)和长双歧杆 菌(B. longum)，更优选短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、双歧双歧杆菌、链状双歧杆菌和长双 歧杆菌，更优选长双歧杆菌和短双歧杆菌，甚至更优选短双歧杆菌，最优选由Compagnie Gervais Danone 于 1999 年 5 月 31 日保藏于法国巴黎 Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms van Institute Pasteur 白勺失豆双 1 木干胃 1—2219。1 WO 2004/093899中被公开。所述组合物优选地还包含一种通过将水性底物与链球菌孵育，并优选之后灭活 和/或除去链球菌得到的产物，所述水性底物包含选自下列物质的至少一种乳、乳蛋白、 乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和乳糖，优选选自乳清和乳糖 的至少一种。链球菌是革兰氏阳性、厌氧的、球状产乳酸菌。本发明的链球菌种与各个链 球菌种的株系类型相比优选地具有至少95%的16S rRNA序列同一性，更优选至少97%的 同一性，如各种手册中对这方面的定义，所述手册例如Sambrook，J.，Fritsch, Ε. F.，and Maniatis, Τ. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd ed.，ColdSpring Harbor (N. Y. )Laboratory Press0通过将水性底物和链球菌孵育之后灭活所述链球菌得 到产物的生产过程优选地以选自下列的链球菌进行唾液链球菌(S. salivarius)和嗜热 链球菌(S. thermophilus)，更优选嗜热链球菌，甚至更优选嗜热链球菌株系CNCM 1-1620 或株系CNCM 1-1470，最优选株系CNCM 1-1620。嗜热链球菌株系CNCMI-1620和1-1470 可有利地产生大量的β-半乳糖苷酶。嗜热链球菌CNCM 1-1620由Compagnie Gervais Danone根据布达佩斯条约于1995年8月23日保藏于法国巴黎Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms van Institute Pasteur。 口誉热链球菌 CNGM 1-1620 由Compagnie Gervais Danone根据布达佩斯条约于1994年8月25日保藏于法国巴黎 Collection Nationale de Cultures de Microorganisms vanlnstitute Pasteur。 株系在EP 778885中被公开。加工步骤a)孵育水性底物步骤(a)优选通过如下方式进行al将双歧杆菌以IX IO2至IX IO11Cfu双歧杆菌/ml的浓度接种于水性底物中，所 述水性底物PH为4至8，并包含选自下列物质的至少一种乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水 解产物、酪蛋白水解产物和乳糖。a2有氧或无氧条件下于20°C至50°C的温度下在所述水性培养基中孵育所述双歧 杆菌至少浊。待与双歧杆菌孵育的水性底物包含至少一种，更优选至少两种选自以下的物质 乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖。底物优选地不包含完整的 酪蛋白。已发现，当水性底物含有大量完整的酪蛋白时会形成较少的免疫刺激物质。因此， 所述水性底物优选包含少于25g/l酪蛋白，更优选少于15g/l，甚至更优选少于5g/l，最优 选少于lg/Ι的完整酪蛋白。所述水性底物因此更优选包含乳清和/或乳清蛋白和/或乳 清蛋白水解产物。乳可以是全脂乳、半脱脂乳和/或脱脂乳。优选使用脱脂乳。乳清可以是甜乳清
7(sweet whey)、酸乳清(acid whey)或通过例如过滤除去酪蛋白的乳清或乳清渗透物(whey permeate)。乳清优选以每升(1)水性底物3至80g干重的浓度存在，更优选每升40至60g。 优选使用乳清蛋白浓缩物。优选使用乳清蛋白水解产物并以每升水性底物2至80g干重的 量存在，更优选5至15g/l。乳糖优选以每升(1)水性底物5至50g干重的量存在，更优选 1至30g/l。水性底物优选包含缓冲盐以使pH保持在需要的范围内。优选将磷酸二氢钠和 磷酸二氢钾用作缓冲盐，优选的量为0. 5至5g/l，更优选1. 5至3g/l。所述水性底物优选 含有每升水性底物0. 1至0. 5g的量的半胱氨酸，更优选0. 2至0. 4g/l。半胱氨酸的存在导 致水性底物的低氧化还原势，这有利于产乳酸菌的活性，特别有利于双歧杆菌的活性。所述 水性底物优选包含每升水性底物0. 5至5g的量的酵母提取物，更优选1. 5至3g/l。酵母提 取物对产乳酸菌来说是酶辅助因子和生长因子的丰富来源。酵母提取物的存在将增强双歧 杆菌生物的生物转化和/或发酵。所述待孵育的水性底物优选包含高浓度的固体，优选以体积计超过20重量％的 固体，更优选超过40重量％的固体。在进行后面的处理步骤——例如喷雾干燥、离心或过 滤时，高浓度是有利的。为了除去不需要的活菌，可适当地在孵育步骤前将所述水性底物以巴氏法灭菌。 为了灭活酶，可适当地将孵育后的产物以巴氏法灭菌。合适的酶灭活在75°C下进行1分钟。 合适的酶灭活在75°C下进行3分钟。在孵育步骤之前和/或之后可以适当地将所述水性底 物勻浆化。勻浆化形成更稳定的产物，特别是在脂肪(脂质)存在的情况下。孵育密度优选每ml水性底物1 X IO2至1 X IO11Cfu双歧杆菌，优选每ml水性底物 1 X IO4至1 X IO10Cfu双歧杆菌，更优选每ml水性底物1 X IO7至1 X IO9Cfu双歧杆菌。本领 域中已知得到待孵育于水性底物中的浓缩双歧杆菌起始培养物的方法。孵育后双歧杆菌的 终细菌密度优选为1 X IO3至1 X IO11CfVml水性底物，更优选1 X IO4至1 X 109cfu/ml水性 底物。与双歧杆菌孵育优选在约20°C至50°C的温度下进行，更优选30°C至45°C，甚至更 有选约37°C至42 °C。对于双歧杆菌的生长和/或活性来说，最适温度是37°C至42 °C。与双歧杆菌的孵育优选在厌氧条件下进行，因为双歧杆菌的生长和许多双歧杆菌 酶的酶活性在有氧条件下受抑制。但是，并不总是需要进行酸化。因此，在一个实施方案中， 孵育步骤合适地在有氧条件下进行。与双歧杆菌的孵育优选于pH 4至8下进行，更优选pH 5. 6至7. 5，甚至更有选pH 6至7. 5。这样的pH不会诱发蛋白质沉淀和/或不良口味，而同时双歧杆菌能够和所述水 性底物相互作用。孵育时间优选是至少2小时，优选4至48小时，更优选6至M小时，甚至更优选6 至15小时。足够长的时间可使得在双歧杆菌和所述底物之间发生较大程度的相互作用并 且/或者可较大程度地产生细胞碎片例如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸(LTA)、脂蛋白、 DNA和/或荚膜多糖，而由于经济原因孵育时间不必要过长。灭活和/或物理除去双歧杆菌活细胞的方法在本发明的方法的步骤(b)中，在步骤a)孵育后优选将双歧杆菌的活细胞基本 上全部除去，例如通过加热处理进行灭活和/或物理移除。所述细胞优选通过加热处理 进行灭活。所述双歧杆菌优选在孵育步骤a)后被加热杀死。优选的加热杀死方式是巴
8氏灭菌法、灭菌(sterilization)、超高温处理、在双歧杆菌无法存活的温度下进行喷雾蒸 煮(spray cooking)和/或喷雾干燥。所述加热处理优选在至少50°C下进行，更优选至少 65°C。所述加热处理优选进行至少5分钟，更优选至少10分钟。所述加热处理优选在至少 50°C下进行至少5分钟，更优选在至少65°C下进行至少10分钟。所述加热处理优选优选在 至少75°C下进行至少1分钟，更优选在至少75°C下进行至少3分钟。优选通过物理除去法例如过滤和/或离心从所述孵育产物中除去双歧杆菌的完 整细胞，例如在3000g下离心1小时，完整细胞保留在片状沉淀物或滞留物(retentate) 中，而通过将乳和/或源自乳的底物与双歧杆菌孵育并随后灭活双歧杆菌细胞碎片得到的 产物保留在上清液和/或滤出液中。所述加热灭活和/或物理除去活细胞使得在所述处理后活双歧杆菌的量低于本 领域已知的常规平皿培养技术使用的检出限(detectionlimit)。以每克组合物干重计，所 述检出限少于IO4Cfu双歧杆菌活细胞，更优选少于103cfu/g。因此，在本发明的一个实施 方案中，所述在步骤b后的制品优选地每g干重制品含有少于IO3Cfu双歧杆菌活细胞。所 述加热灭活和/或除去步骤优选使得至少90%，更优选至少99%存在于所述步骤a)后孵 育混合物中的细胞被除去。对活细胞进行灭活的要求具有这样的优点，即最终的营养组合物在产生后可被巴 氏法灭菌和/或灭菌，从而减少有害微生物污染的机会。因此，本发明使得即用型的液体配 方能在室温下制备并保存。此外，可以更容易地控制每位人受试者所接受的生物活性组分 的剂量，这是因为在液体产品中不会出现更进一步的生长，在人受试者肠道内也不会出现 生长。后者是一种取决于个体肠道环境的可变因子，因此可导致在个体受试者中的有益效 果的程度差异。还有一个优点是灭活的和/或除去的双歧杆菌和链球菌不再能够降解和消 耗所述非消化性碳水化合物。另外的优点是所述营养组合物可以更易于保存，并且费用降低，因为不需要采取 专门的预防措施来使双歧杆菌的生存能力保持在一个可接受的水平。对于水活度高于0. 3 的产物尤其如此。在保存的高水活度产品中和/或在粉末状营养组合物以水配制后食用前 的阶段中还不会发生后酸化。与蛋白凝聚和不良口味相关的不良反应也以该方式被避免。另外成分的添加以及其他任选的加工步骤上述加工步骤b)之后任选可以是以下一个或多个步骤i)孵育后将所述产物超滤通过截留限值(cut-off threshold)为100到300kDa 的滤膜，目的是得到浓缩的滞留物。所述膜优选聚醚砜膜，并且过滤优选在低于60°C的温度 下进行。ii)用水洗涤浓缩的滞留物。iii)将所述浓缩的滞留物脱水，优选通过冷冻干燥进行。iv)将所述脱水的滞留物溶解到缓冲液中，优选pH 6-8的Tris缓冲液。ν)在排阻限值(exclusion threshold)为600kDa的柱——优选右旋糖酐或琼脂 糖柱例如Superdex 200上，对所述滞留物溶液进行凝胶排阻色谱。vi)在色谱结束回后收过滤部分或排阻部分。vii)用截留限值为IOkDa的膜将产品脱盐。在色谱结束后回收排阻部分。
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这些步骤优选在无菌条件下进行。在步骤a)后可加入有利于得到所需最终营养 组合物的其他成分，优选在临进行步骤b)之前或在加工步骤b)之后。这些成分优选在步 骤b)之后加入。对一种婴儿乳配方而言，可加入一些本领域公知的成分例如脱脂乳、乳清、 乳糖、植物脂肪、矿物质和维生素。优选将一种含有乳清、乳清蛋白和/或乳清蛋白水解产物的水性底物用巴氏法 灭菌、冷却并且与一种或多种双歧杆菌株系孵育，所述双歧杆菌优选短双歧杆菌株系CNCM 1-2219，在此基础上将孵育产物加热并保存。任选地将所述孵育产物与组成所述营养组合 物的其他成分混合。可包含或不包含脂肪组分，但优选在这个阶段不加入脂肪组分。优选 将所述混合物预热，随后顺次(in-line)加入脂肪(在本文中也使用术语“脂质”)、勻浆、 热处理并干燥。另一种用于制备本发明的孵育产物的优选方法公开于W001/01785中，更具体是 在实施例1和2中。另一种用于制备本发明的孵育产物的优选方法记载于WO 2004/093899 中，更具体是在实施例1中。对得到所需的最终营养组合物可能有利的其他成分可在加工步骤a)或b)后加 入。这些成分优选在步骤b)后加入。对于婴儿乳配方而言，可加入一些本领域公知的成分 例如脱脂乳、乳清、乳糖、植物脂肪、矿物质和维生素。以步骤b得到制品的干重计，所述终营养组合物优选包含5至100重量％，更优选 5至99. 5重量％，更优选5至95重量％，甚至更优选5至80重量％，甚至更优选5至40重 量％，最优选10至40重量％。所述终营养组合物每IOOml中优选包含0. 5至20重量％的 由步骤b得到的产物，每IOOml中更优选0. 5至14重量％，更优选1至10重量％，甚至更 有选1至5重量％。以所述终组合物的干重计，本发明的终营养组合物优选包含从每g中多于 1 X IO3Cfu,更优选多于1 X IO4Cfu,甚至更优选多于1 X IO5Cfu的双歧杆菌得到的灭活双歧 杆菌和/或源自双歧杆菌的细菌碎片。以所述终组合物的干重计，所述灭活双歧杆菌和/ 或源自双歧杆菌的碎片优选从每g中少于1 X IO11Cfu,更优选少于1 X IO10Cfu,甚至更有选 少于IXlO9Cfu的双歧杆菌得到。这些数值可通过如下方式计算测定存在于步骤a)的孵 育之后和步骤b)之前的混合物中的双歧杆菌的量，并且随后以干重计有多少克本发明的 制品存在于所述最终组合物中。对得到所需终营养组合物可能有利的其他成分可在加工步骤a)或b)之后加入。 这些成分优选在步骤a)之后加入。对于婴儿乳配方而言，可加入一些本领域公知的成分例 如脱脂乳、乳清、乳糖、植物脂肪、矿物质和维生素。所述方法优选包括如下的其他步骤d:将底物与嗜热链球菌孵育以得到孵育混合物，其中嗜热链球菌优选嗜热链球菌 株系CNCM 1-1620或株系CNCM 1_1470，其中所述底物选自乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清 蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和乳糖，和e 通过加热步骤e的孵育混合物灭活所述嗜热链球菌和/或通过离心和/或过滤 从步骤e的孵育混合物中除去嗜热链球菌细胞。步骤e和b优选同时进行。优选通过物理 除去法例如过滤和/或离心从所述孵育产物中除去链球菌的完整细胞，例如在3000g下离 心1小时，完整细胞保留在片状沉淀物或滞留物中，而通过将乳和/或源自乳的底物与链球菌孵育并随后灭活链球菌细胞碎片得到的产物保留在上清液和/或滤出液中。所述加热灭活和/或物理除去活细胞使得在所述处理之后活链球菌的量低于 本领域已知的常规平皿培养技术使用的检出限。以每克干重组合物计，所述检出限少于 IO4Cfu链球菌活细胞，更优选少于103cfu/g。因此，在本发明的一个实施方案中，所述步骤 e)后的制品优选每g干重制品含有少于IO3Cfu活链球菌。加热灭活和/或除去步骤优选 地使得存在于步骤d)后的孵育混合物中的细胞中至少90%，更优选至少99%被除去。用于以本发明的嗜热链球菌株系制备孵育产物的另一种优选方法被公开于EP 0778885中，更具体是在实施例5和6中。用于以本发明的嗜热链球菌株系制备孵育产物的 另一种优选方法公开于FR2723960的实施例2至6中。优选将含有乳清、乳清蛋白和/或乳清蛋白水解产物的底物用巴氏法灭菌、冷却 并与一种或多种双歧杆菌株系孵育，所述双歧杆菌株系优选短双歧杆菌株系CNCM 1-2219， 在此基础上对所得孵育产物进行加热处理并保存。优选将含有乳清和/或乳糖的第二种水 性底物与嗜热链球菌孵育，所述嗜热链球菌优选株系CNCM 1-1620或株系CNCMI-1470。随 后，优选将所述两种孵育产物混合在一起并且与其他构成所述营养组合物的组分。可加入 或不加入脂肪组分，但是优选这个阶段仍不加入脂肪组分。优选将所述混合物预热，随后顺 次加入脂肪(在本文中也使用术语“脂质”)、勻浆、热处理并干燥。孵育步骤d可与步骤a中用双歧杆菌的孵育步骤同时进行。优选将嗜热链球菌 的孵育和双歧杆菌的孵育在不同处理步骤中进行。分别孵育可实现每种不同细菌的最佳 条件并/或防止释放免疫刺激组分的不同细菌的不利干扰。优选将所述底物与链球菌孵 育后得到的孵育混合物加入步骤a、步骤b或步骤c中得到的混合物中，更优步骤a)后加 入。当本发明的组合物还包含与嗜热链球菌孵育后得到的混合物时，出现对迟发型超敏反 应(delayed hyper hypersensitivity response)的改善效应。因此,在一个实施方案中， 本发明的方法包括另一步骤f 将步骤d或e——优选步骤d——中得到的孵育混合物与步 骤a、b或c——优选步骤a——中得到的孵育混合物结合。在一个实施方案中，将步骤d中 得到的孵育混合物与步骤a中得到的孵育混合物组合物结合，并且步骤b和步骤e同时进 行。以步骤d得到的制品的干重计，终营养组合物优选包含2至94. 5%，更优选5至 80重量％，甚至更优选5至40重量％。终营养组合物优选每IOOml包含0. 2至20重量0Z0 的步骤d得到的产物，每IOOml更优选0. 5至14重量％，更优选1至10重量％，甚至更优 选1至5重量％。非消化性碳水化合物本发明的方法得到的制品包含至少两种不同的非消化性碳水化合物。所述非消化 性碳水化合物在加工步骤c)中加入。所述非消化性碳水化合物可有利地刺激免疫系统。这 种刺激可通过以下方式实现改善肠道微生物群(intestinal microbiota)和/或经对免 疫系统的直接效应。两种不同的非消化性碳水化合物的存在可改善肠道菌群和/或协同地 刺激免疫系统。存在两种非消化性碳水化合物，和通过将水性底物与双歧杆菌孵育并随后灭活和 /或除去所述双歧杆菌得到的产物可在较大程度上提高对感染的抗性。这两种化合物之间 的提高效应是意想不到的并且不能用共存作用来解释，即所述非消化性碳水化合物特异性
11地刺激存在于同一制品中有益微生物的生长，原因是在孵育的乳和/或乳衍生产品中不存 在活的双歧杆菌。本发明中使用的术语“低聚糖(oligosaccharide) ”是指聚合度(DP)为2至250， 优选DP为2至100，更优选DP为2至60，甚至更优选DP为2至10的碳水化合物。如果本 发明的制品中包含DP为2至100的低聚糖，那么这包括含有DP为2至5、DP为50至70和 DP为7至60的低聚糖的组合物。本发明中使用的术语“非消化性碳水化合物”是指这样的 碳水化合物，即在肠道内不被存在于人上消化道(小肠和胃)内的酸或消化酶的作用消化、 但更优选被人肠道微生物发酵的碳水化合物。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糊精被认为 是可消化的。本发明的非消化性碳水化合物优选是可溶的。本文所用的术语“可溶”在提及碳 水化合物时是指根据L. Prosky et al, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71，1017-1023 (1988)描述 的方法所述碳水化合物是可溶的。本发明中不同的非消化性碳水化合物涉及单糖单位组成不同和/或聚合度(DP) 不同的非消化性碳水化合物。当以总摩尔单糖单位计，单糖组成有至少差异30mol%、更 优选至少差异50mOl%时，两种非消化性碳水化合物在单糖组成不同。例如，平均组成为 Glu-Gal3的低聚半乳糖和平均组成为Glu-Fru3的低聚果糖差异75mol%。如果两种非消化 性碳水化合物的平均DP的差异超过5个单糖单位，优选超过10个单位，甚至更优选超过15 个单位，则所述两种碳水化合物的DP不同。例如，平均DP为4的水解菊糖和平均DP为25 的长链菊糖的DP差异21单位。所述非消化性碳水化合物是选自如下的至少一种，更优选至少两种低聚果糖、 低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露聚糖、低聚木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉 伯半乳聚糖、低聚葡糖甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、含有低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液 酸。本发明的制品优选包含低聚果糖、低聚半乳糖和/或低聚半乳糖醛酸，更优选低聚半乳 糖，最优选低聚半乳糖。低聚果糖类包括菊糖，低聚半乳糖类包括反式低聚半乳糖或 β-低聚半乳糖，低聚葡萄糖类包括龙胆低聚糖(gentio-oligosaccharides)、黑曲霉寡糖 (nigero-oligosaccharides)、环糊精/[氏聚|| (cyclodextrin-oligosaccharides)禾口聚葡 萄糖(polydextrose)，低聚阿拉伯半乳聚糖类包括阿拉伯树胶(gum acacia)，低聚半乳甘 露聚糖类部分地包括部分水解的瓜尔胶(guar gum)。为了进一步进行改进，本发明的非消化性碳水化合物优选具有相对高含量的短链 低聚糖，因为这些碳水化合物对双歧杆菌的生长有强刺激作用。因此，在本发明制品中优选 至少10重量％的非消化性碳水化合物具有2至5 (即，2、3、4和/或5)的DP，并且至少5 重量％的非消化性碳水化合物具有10至60的DP。优选至少50重量％，更优选至少75重 量％的所述非消化性碳水化合物具有2至9(即，2、3、4、5、6、7、8和/或9)的DP。本发明的方法得到的制品更优选包含低聚半乳糖。所述低聚半乳糖优选地选自 β -低聚半乳糖、乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose (LNT))、乳糖-N-新四糖(neo-LNT)、 岩藻糖基乳糖(fucosyl-lactose)、岩藻糖基化LNT(fuc0Sylated LNT)和岩藻糖基化新 LNT(fucosylatedneo-LNT)0在一个特别优选的实施方案中，本发明的制品包含β -低聚 半乳糖。本发明使用的低聚半乳糖是指聚合度(DP)为2至20的由以单体亚基计超 过50 %，优选超过65 %半乳糖单位组成的低聚糖，其中至少50 %，更优选至少75 %，甚至更优选90%的半乳糖单位经β-糖苷键，优选β _1，4糖苷键连接在一起。在人乳低聚糖中 也主要是β-键。平均DP优选在3至6范围内。葡萄糖单位可存在于半乳糖单位链的还 原端。低聚半乳糖有时也指反式低聚半乳糖(TOS)。低聚半乳糖的一个合适来源 是Vivinal GOS (可市购于荷兰兹沃勒Borculo Domo hgredients)。其他合适来源有 Oligomate (Yakult) ,Cupoligo (Nissin)和 Bi2muno (Classado)。已发现 β-低聚半乳糖可 刺激产乳酸菌，特别是双歧杆菌的生长。通过本发明的方法得到的制品优选包含低聚果糖。本发明使用的低聚果糖是指由 以单体亚基计超过50 %，优选超过65 %的果糖单位组成的碳水化合物，其中至少50 %，更 优选至少75%，甚至更优选90%的果糖单位经β-糖苷键，优选β _2，1糖苷键连接在一 起。果糖单位可存在于果糖单位链的还原端。所述低聚果糖优选具有2至250，更优选2至 100，甚至更优选10至60的DP或平均DP。低聚果糖可包括果聚糖、水解果聚糖、菊糖、水 解菊糖和合成低聚果糖。所述制品优选包含平均聚合度(DP)为3至6的短链低聚果糖，更 优选水解菊糖或合成低聚果糖。所述制品优选包含平均DP大于20的长链低聚果糖。所述 制品优选包含短链和长链低聚果糖。适用于本发明方法的低聚果糖还可容易地市购，例如 RaftilineHP (Orafti)。通过本发明的方法得到的所述制品更优选包含低聚半乳糖和低聚果糖，更优选长 链低聚果糖，的结合物。这样的混合物协同地刺激健康肠道微生物群，特别是双歧杆菌，的 生长。通过本发明的方法得到的所述制品优选包含糖醛酸低聚糖，更优选甘露糖醛酸 (mannonuric acid)低聚糖和/或半乳糖醛酸低聚糖，甚至更优选半乳糖醛酸。在本发明 中使用的糖醛酸低聚糖这一术语是指这样的一种低聚糖，即其中至少50%的存在于所述低 聚糖中的单糖单位是糖醛酸。在本发明中使用的半乳糖醛酸低聚糖这一术语是指一种低聚 糖，其中至少50%的存在于所述低聚糖中的单糖单位是半乳糖醛酸。在本发明中使用的半 乳糖醛酸低聚糖优选通过降解果胶、果胶酸盐(pectate)和/或聚半乳糖醛酸来制备。降 解的果胶优选通过对水果和/或蔬菜果胶，更优选苹果、柑橘和/或甜菜果胶，进行水解和/ 或β消去反应来制备，甚至更优选用至少一种裂解酶降解的苹果、柑橘和/或甜菜果胶。在 一个优选实施方案中，所述半乳糖醛酸低聚糖的至少一个末端半乳糖醛酸单位具有双键。 所述双键可有效地防止所述致病细菌对肠道上皮细胞的附着。优选一个末端半乳糖醛酸单 位包含C4-C5双键。所述半乳糖醛酸低聚糖可被衍生化。所述半乳糖醛酸低聚糖可被甲氧 基化和/或酰胺化。所述半乳糖醛酸低聚糖的特征优选在于大于20%，优选大于50%，甚 至优选大于70 %的甲氧基化度。糖醛酸低聚糖可有利地降低致病微生物对肠道上皮细胞的 粘附。此外，糖醛酸低聚糖可通过增强Thl反应刺激免疫系统。因此，在一个实施方案中，通过本发明的方法得到并用于本发明的制品优选包含 至少低聚半乳糖。在一个实施方案中，通过本发明的方法得到并用于本发明的制品优 选包含至少短链低聚果糖和/或长链低聚果糖，优选长链低聚果糖。在一个实施方案中，通 过本发明的方法得到并用于本发明的制品优选包含至少糖醛酸低聚糖。在一个实施方案 中，用于本发明的制品优选包含至少低聚半乳糖，以及至少短链低聚果糖或长链低聚 果糖或者两者。在一个实施方案中，用于本发明的制品优选包含至少低聚半乳糖和至 少糖醛酸低聚糖。在一个实施方案中，用于本发明的制品优选包含至少短链低聚果糖和糖
13醛酸低聚糖，或者长链低聚果糖和糖醛酸低聚糖。在一个实施方案中，用于本发明的制品优 选包含至少β-低聚半乳糖、短链低聚果糖和糖醛酸低聚糖，或者至少β-低聚半乳糖、长 链低聚果糖和糖醛酸低聚糖。两种不同非消化性碳水化合物——优选β -低聚半乳糖和低聚果糖——的混合物 之间的重量比率优选在20至0. 05之间，更优选在20至1之间。β -低聚半乳糖更类似人 乳低聚糖。本发明的制品优选包含DP为2-10的β -低聚半乳糖和/或DP为2-60的低聚 果糖。已发现这种结合物可协同地改善双歧杆菌和乳酸杆菌(lactcAacilli)。这三种非消 化性低聚糖的存在甚至可进一步刺激双歧杆菌。反式低聚半乳糖低聚果糖糖醛酸低聚 糖的重量比优选为(20至2) 1 (1至20)，更优选(12至7) 1 (1至3)。由通过本发明的方法得到的制品组成或包含通过本发明的方法得到的制品的终 营养组合物优选地每IOOml包含SOmg至2g非消化性碳水化合物，更优选150mg至1. 50g, 甚至更优选300mg至lg。以干重计，所述营养组合物优选包含0. 25重量％至20重量％，更 优选0. 5重量％至10重量％，甚至更优选1. 5重量％至7. 5重量％非消化性碳水化合物。 较低含量的非消化性碳水化合物在刺激免疫系统和/或微生物群中有益细菌时效应较低， 而过高含量将导致胃气胀和腹部不适的副作用。所述两种不同非消化性碳水化合物在步骤a)之后加入(即步骤C)，优选在临进 行步骤b)之前或在步骤b)之后立即加入，优选在步骤b)之后进行步骤c)，优选在步骤e) 之后进行步骤c)，即在通过热处理灭活之后和/或在除去双歧杆菌和任选的嗜热链球菌之后。通过本发明的方法得到的制品优选包含一种与短双歧杆菌，更优选株系CNCM 1-2219孵育的水性底物和至少一种，优选两种，非消化性碳水化合物，所述底物包含至少一 种选自乳、乳蛋白质、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物和乳糖的物质，所述非消化性碳水 化合物选自低聚半乳糖和低聚果糖。在一方面，本发明涉及本发明的方法，其中在步骤c中加入仅一种非消化性碳水 化合物。所述的仅一种非消化性碳水化合物是低聚果糖时特别有利。在一方面，本发明涉及一种通过上述的本发明的方法得到的制品。在一个实施方 案中，由通过本发明的方法得到的制品组成或包含通过本发明的方法得到的制品的终营养 组合物每IOOg组合物的干重包含0. 5至IOg上文定义的非消化性碳水化合物。在一个实 施方案中，由通过本发明的方法得到的制品组成或包含通过本发明的方法得到的制品的最 终营养组合物在20°C下和在IOOiT1剪切速率下粘度为1至60mPa. s。上述方法优选包括一个干燥步骤。干燥步骤是本领域公知的。一个合适的干燥步 骤是喷雾干燥。所述干燥步骤优选以这样的方式进行，即干燥的产物是含有少于10重量％ 水，更优选少于5重量％，的粉末。所述干燥步骤优选在步骤C后进行。或者，所述干燥步 骤可在步骤b之后和/或步骤e之后进行，之后将所述非消化性碳水化合物干燥地混入所 述产物。营养物已发现本发明的制品可被有利地应用于食品，例如婴儿食品和病人食品 (clinical food)。本发明的制品或含有本发明制品的组合物优选经肠给予，更优选口服给 予。所述组合物优选是完全营养物。
所述营养物优选适合给予婴儿。本发明的营养组合物更优选是一种婴儿配方或较 大婴儿配方(follow on formula) 0本发明的组合物可有利地用作婴儿的完全营养物。本发明的组合物优选是一种婴儿营养物，以所述婴儿营养物干重计包含i)总和为0. 5至10重量％的低聚半乳糖和低聚果糖，和ii)5至99. 5重量％的根据本发明的方法步骤b后得到的制品，其中在步骤a中的 双歧杆菌属于短双歧杆菌种，优选短双歧杆菌株系CNCM 1-2219iii)和任选2至94. 5重量％的步骤e后得到的制品。这样的营养物优选包含脂质、蛋白质和碳水化合物并且优选以液体形式给予。本 发明使用的术语“液体食品”包括干食品(例如粉末)，附有将所述干燥食品混合物与一种 合适液体(例如水)相混合的说明书。因此，本发明的营养组合物优选地包含以总热量计5%至60%的脂质，以总热量 计5%至60%的蛋白质，以总热量计15%至90%的可消化性碳水化合物。当意欲提供给成 人受试者时，本发明的组合物优选包含以总热量计5%至30%的脂质，以总热量计15%至 40%的蛋白质和以总热量计25%至75%可消化性碳水化合物。当意欲提供给婴儿时，本发 明的组合物优选包含以总热量计30%至60%的脂质，以总热量计5%至15%的蛋白质和以 总热量计25%至75%的可消化性碳水化合物，更优选以总热量计35%至50%的脂质，以总 热量计7. 5%至12. 5%的蛋白质和以总热量计40%至55%的可消化性碳水化合物。为基 于总热量计算％蛋白质，需要考虑由蛋白质、多肽和氨基酸提供的总能量。所述脂质优选包含植物油。所指植物脂质优选是至少一种选自如下的油大豆油、 棕榈油、椰子油、红花油、葵花子油、玉米油、菜籽油和卵磷脂。优选使用一种植物脂质与至 少一种选自鱼油以及含ω-3的植物油、藻油和细菌油的油的组合物。在一个优选的实施方 案中，本发明的方法还包括给予长链多不饱和酸(LC-PUFA)。由于人们认为LC-PUFA以一种 不同于非消化性碳水化合物和所述产物(通过将乳和/或源自乳的底物与双歧杆菌孵育并 随后灭活双歧杆菌而得到的)的机制作用于免疫系统，本发明与LC-PUFA的结合被认为可 协同地作用。本发明的营养组合物优选包含，当意欲提供给成人时，以总热量计5%至60%的 脂质，优选以总热量计5%至30%脂质；当意欲提供给婴儿时，优选以总热量计30%至60% 脂质，更优选以总热量计35 %至50 %脂质。所述营养制品使用的蛋白质优选选自非人动物蛋白(例如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋 白)、植物蛋白(例如大豆蛋白、小麦蛋白、稻蛋白和豌豆蛋白)，上述蛋白质的水解产物、游 离氨基酸以及蛋白质、水解产物和游离氨基酸的混合物。特别优选牛乳蛋白，例如酪蛋白和 乳清蛋白。由于本发明的组合物适合用于降低过敏反应，特别婴儿的过敏反应，所述蛋白质 优选选自水解乳蛋白。本发明的组合物优选包含水解酪蛋白和/或水解乳清蛋白、水解植 物蛋白和/或游离氨基酸，最优选水解乳清蛋白。使用这些蛋白质可进一步降低过敏反应。 使用这些水解蛋白质可有利地改善对饮食蛋白质组分的吸收。这对于婴儿和患病受试者尤 其有利。本发明的营养组合物优选包含，当意欲提供给成人受试者时，以总热量计5%至 6%的蛋白质，优选以总热量计15%至40%的蛋白质；并且当意欲提供给婴儿时，优选以总 热量计5%至15%的蛋白质，更优选以总热量计7. 5%至12. 5%的蛋白质。为基于总热量计算<%蛋白质，需要考虑由蛋白质、多肽和氨基酸提供的总能量。可以将可消化性碳水化合物源加入到所述营养配方中。可使用任何合适可消化性 碳水化合物(源)，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、固态玉米糖浆和麦芽糊精，以及上述物质 的混合物。因此，本发明营养混合物优选包含以总热量计15%至90%的碳水化合物，更优 选以总热量计25%至75%的碳水化合物，更优选以总热量计40%至55%的碳水化合物。本发明的营养组合物优选为液体形式。它优选具有限定的粘度。已经发现本发明 的方法可提供粘度足够低的液体营养物这样它可被用作例如液体婴儿食品和液体病人食 品，所述食品可通过奶嘴、管或吸管来喂食，同时保持低粘度。在一个优选的实施方案中，本 发明的组合物在20°C下并且在IOOiT1剪切速率下的粘度低于600mPa. s，优选低于250mPas， 更优选低于60mPa. s，甚至更优选低于35mPa. s，最优选低于6mPa. s。所有在本文中使用 的术语粘度是指通过下述方法确定的物理参数所述粘度可使用Carri-Med CSL流变仪 (Carri-Med CSLrheometer)测定。使用的几何结构为圆锥形(6cm 2度丙烯酸树脂锥(6cm 2deg acrylic cone))，将盘和几何结构之间的空隙设定为55um。将0至150s—1的线性连 续斜剪切速率(ramp shear rate)应用20秒。应注意，本发明还涵盖粉末形式的组合物， 并配备用于制备水溶液的说明书，例如通过以某一比例加入水中，仁厚形成指定的粘性。大便不规律(例如便硬(Hard stools)、大便量不足(insufficientstool volume)、腹泻)在很多婴儿和接受流食的患病受试者中是一个主要问题。已经发现大 便问题可通过给予液体食品形式的本发明的制品来减少，所述制品的重量渗透摩尔浓度 (osmolality)为 50 至 500m0sm/kg，更优选 100 至 400m0sm/kgo鉴于上述，还重要的是，所述液体食品不具有过多的热量密度，但仍可提供足够的 热量来供给受试者。因此，所述液体食品优选具有0. 1至2. 5kcal/ml的热量密度，甚至更 优选0. 5至1. 5kcal/ml的热量密度。当用作婴儿配方时，所述热量密度最优选为0. 6至 0.8kcal/ml。^M已经发现通过本发明的方法得到的本发明的制品可协同地减少细菌移位和/或 降低肠道通透性。本发明的制品可有利地用于治疗和/或预防疾病，因而本发明涉及一种用于治疗 和/或预防哺乳动物疾病的方法，所述方法包括将本发明制品给予所述哺乳动物。换言之， 本发明还涉及本发明的制品用于制备用于治疗和/或预防疾病的组合物，优选营养组合物 的用途。换言之，本发明涉及一种含有用于治疗和/或预防疾病的本发明制品的制品或营 养组合物。所述哺乳动物优选是人，甚至更优选为人婴儿。因此，本发明还涉及本发明的制 品用于制备用于治疗和/或预防婴儿疾病的组合物，优选营养组合物的用途。或者换言之， 本发明涉及含有本发明制品的用于治疗和/或预防婴儿疾病的制品或营养组合物。在本发明的文本中，婴儿是年龄0至6岁，优选年龄0至4岁，优选年龄0至2岁， 优选年龄0至1岁。本发明还涉及一种为婴儿提供营养物的方法，所述方法包括为所述婴儿提供本发 明的制品或营养组合物。换言之，本发明还涉及本发明的制品用于制备为婴儿提供营养的 营养组合物的用途。换言之，本发明涉及一种含有本发明制品的用于为婴儿提供营养物的 制品或营养组合物。
已经发现本发明的制品可减少细菌从肠道穿过肠道屏障的移位。这种移位 可能是细胞旁(paracellular)移位，例如通过紧密连接(tightjunctions)，或是跨细 胞(transcellular)移位，例如使用(条件)致病细菌时观察到的细菌移位。本发明 制品因此可有利地用于治疗和/或预防细菌移位，特别是致病菌和条件致病菌例如大 肠杆菌(E.coli)，属于沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Siigella)、弯曲杆菌属 (CampylcAacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和利斯特氏菌属(Listeria)、铜绿假单胞 菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、肠杆 菌属(EntercAacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)的种，更优选假单胞菌属和沙门氏菌 属。条件致病菌是不入侵正常健康受试者，但遇到免疫系统受到抑制或受损或者肠道屏障 受损的受试者时则变为致病菌的细菌。免疫系统受损的受试者的实例有中性粒细胞减少 肿瘤(neutropenic oncology)患者、囊性纤维病(cystic fibrosis)患者、艾滋病患者 和HIV感染者。肠道屏障受损的受试者的实例有烧伤患者、出血性休克患者和危重病患者 (critically ill patients)。研究所述制品对肠道屏障功能和/或成熟的合适模型系统包括肠上皮细胞的 transwell单层、使用培养的肠上皮细胞或肠上皮组织的尤斯室(Ussing chambers)和 动物模型。在这样的模型中，可测定transwell电经上皮电阻(transwell electrical transepithelial electricalresistance)或者分子的移位和/或细菌的移位。实施 例1中公开了一种合适的动物模型。另一个合适的动物模型公开于Koh et al,2005, Infection&Immunity 73 :2262-2272本发明的制品适合用于治疗和/或预防感染。本发明的制品可有利地用于治疗 和/或预防肠道感染、全身感染和/或呼吸道感染，特别是由致病菌或条件致病菌引起的感 染。本发明的制品适合用于治疗和/或预防腹泻，特别是由致病菌或条件致病菌引起的腹 泻。在本发明的文本中，“预防”疾病或某种病症也是指“对处于疾病或某种病症风险 的患者进行治疗”。已经发现本发明制品可减少细菌从肠道穿越肠道屏障进行移位。因此，本发明的 制品适合用于改善肠道屏障功能，用于增进肠道屏障成熟和/或降低肠道屏障通透性。因 此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的制品用于制备用于改善肠道屏障功能、增进肠 道屏障成熟和/或降低肠道屏障通透性的组合物的用途。换言之，本发明涉及的本发明的 制品用于改善肠道屏障功能、增进肠道屏障成熟和/或降低肠道屏障通透性。肠道屏障功 能的改善、肠道屏障成熟的增进和/或肠道屏障通透性的降低优选地向母乳喂养的健康婴 儿中观察到的水平变化。实施例1 以产乳酸菌和非消化性碳水化合物孵育的源自乳的产物对感染的增强 效应雄性BALB/c小鼠，每组η = 25并且年龄3_4周、不受限(at lib)如下饮食4周。1与婴儿乳配方feillia Apaisia 1以1 1 (w/w)混合的AIN-93 (平衡的半合成 啮齿云力物食品(balanced semi-synthetic rodent chow))。Apaisia 1 是一种市售的含有 孵育的水性底物(含有乳、乳蛋白质、乳清、乳清蛋白和/或乳糖)的IMF，所述孵育的水性 底物是通过分别与嗜热链球菌CNCM-1620和短双歧杆菌CNCM 1-2219孵育得到。在这种制品中，在步骤a)和d)中得到的嗜热链球菌和短双歧杆菌孵育混合物分别在孵育步骤(步 骤b)和e)后被立即加热杀死。以IMF干重计，与短双歧杆菌孵育的水性底物混合物的终 含量是约16重量％。2与婴儿乳配方feillia Apaisia 1以1 1 (w/w)混合的AIN-93 (平衡的半合成啮 齿动物食品)，其中加入以干重计2重量％非消化性碳水化合物(GF)混合物(步骤d)，所述 组合物含有w/w/比例为9 1的反式低聚半乳糖(来源=Vivinal G0S)和菊糖(Raftilin HP)。GF在鼠饮食中终浓度为1重量％。3AIN_93(平衡的半合成啮齿动物食品)，其中加入了脂肪和乳糖以使脂肪和乳糖 的含量与饮食1和2中的相同。表1示出了测试的饮食的组成。所有饮食中的碳水化合物、乳糖、脂肪、蛋白质和 纤维的量是相当的。表1 测试的饮食的组成
饮食TOS 菊糖 9 lw/w生物转化产物1+21重量％+3然后，经口填喂肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis) LMG22715 (0. 2ml 缓冲物 中2X105cfu/鼠)引入沙门氏菌感染。在感染6天后处死小鼠，将细菌向器官的移位作为 主要测量参数。在感染期间饮食方案不变。还测量了疾病打分。所述疾病打分是一种基于 体重减轻、活动性、警觉性和皮毛状况的疾病指标。结果在引入感染之前的时间段内，所有组的食物摄取和生长情况是相当的。表2示出了一般健康和细菌向不同器官的移位(BT)的结果。由于另外存在GFJi 2中的疾病打分和细菌向肝脏和脾脏移位比组1的低。由于GF，组2中向肝脏、脾脏、肺和 肾脏的BT对数值比组1低。表2 在34天时的疾病打分和细菌移位(以对数表示的每g组织中的cfu对数)。
18
权利要求
1.一种制造制品的方法，包括步骤a 将水性底物与双歧杆菌(bifidobacteria)孵育以得到孵育混合物，其中所述水性 底物包含选自下列物质的至少一种乳、乳蛋白质、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪 蛋白水解产物和乳糖；b 通过加热所述孵育混合物来灭活所述双歧杆菌，并且/或者通过离心和/或过滤来 从所述孵育混合物中除去所述双歧杆菌；c 将含有步骤a得到的或步骤b得到的混合物一优选步骤b得到的混合物一的组 合物与至少两种不同的非消化性碳水化合物结合，其中所述非消化性碳水化合物的至少一 种，优选两种，选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露聚糖、低聚 木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉伯半乳聚糖、低聚葡糖甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、棉子糖、 乳蔗糖、含有低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液酸。
2.权利要求1的方法，其中所述双歧杆菌属于短双歧杆菌种(speciesB.breve)，优选 短双歧杆菌CNCM 1-2219。
3.前述权利要求任一项的方法，还包括以下步骤d:将底物与嗜热链球菌(Str印tococcus thermophilus)孵育，优选嗜热链球菌株系 CNCM 1-1620或CNCM 1_1470，以得到孵育混合物，其中所述底物选自乳、乳蛋白质、乳清、乳 清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和乳糖；和e 通过将步骤d的孵育混合物加热来灭活嗜热链球菌和/或通过离心和/或过滤来从 步骤e的孵育混合物中除去嗜热链球菌细胞，f 将从步骤d或e，优选步骤d，得到的孵育混合物与从步骤a、b或c，优选步骤a，得到 的孵育混合物结合。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述非消化性碳水化合物至少一种，优选至少两 种，选自低聚半乳糖和低聚果糖。
5.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b后的制品包含以每g所述制品干重计少于 IO3Cfu的活双歧杆菌。
6.前述权利要求任一项的方法，还包括一个干燥步骤。
7.前述权利要求任一项的方法，其中在步骤c中仅加入一种非消化性碳水化合物，所 述非消化性碳水化合物是低聚果糖。
8.可通过前述权利要求任一项的方法得到的制品。
9.含有权利要求8的制品或由权利要求8的制品组成的营养组合物。
10.权利要求9的组合物，包含以每IOOg所述组合物干重计0.5至IOg非消化性碳水 化合物。
11.婴儿营养物，包含以所述婴儿营养物干重计a)总和为0.5至10重量％的低聚半乳糖和低聚果糖，和b)5至99.5重量％的在权利要求1至5任一项步骤b后得到的制品，其中步骤a中的 双歧杆菌属于短双歧杆菌种，c)和任选的2至94.5重量％的在权利要求3至6任一项步骤e后得到的制品。
12.权利要求9-11的任一项的组合物，用于为婴儿提供营养物。
13.权利要求9-12的任一项的组合物，用于治疗和/或预防疾病。
14.权利要求8-13的任一项的组合物或制品，用于治疗和/或预防感染和/或腹泻。
15.权利要求8-14的任一项的组合物或制品，用于治疗和/或预防细菌移位。
16.权利要求8-14的任一项的组合物或制品，用于改善肠道屏障功能、增进肠道屏障 成熟和/或降低肠道屏障通透性。
全文摘要
一种营养组合物，包含非消化性碳水化合物与通过孵育水性底物和双歧杆菌所得到的制品，以及任选的通过孵育水性底物和嗜热链球菌所得到的制品的结合物。所述结合物可减少细菌移位并改善肠道屏障功能。
文档编号A61K31/733GK102065867SQ200980122242
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者C·J·P·凡林波特, F·里克罗伊科斯, J·科诺尔, V·皮泰 申请人:N.V.努特里奇亚
技术领域：
本发明涉及一种用于降低肠道屏障通透性和/或治疗或预防感染的营养组合物， 特别是婴儿营养物。
背景技术：
新生儿的肠道屏障发育不完全。由于肠道屏障减弱或肠道通透性提高，新生儿易 患细菌移位、毒素移位和过敏原移位。与母乳喂养的婴儿相比，常规婴儿配方喂养的婴儿有 甚至更高的肠道通透性功能。一个解决办法是使用益生菌(probiotic bacteria)来治疗 与肠道通透性提高相关的疾病。但是，本身作为活微生物的益生菌在肠道屏障功能减弱的 受试者中的使用可能是不安全，因为在一些病例中，这些益生菌本身能穿过肠道屏障移位 并引起其全身感染。另一个解决办法是使用益生素(prebiotics)。EP 1815755公开了一种营养组合物，所述营养组合物含有长链多不饱和脂肪酸和 两种不同的非消化性低聚糖用于改善屏障功能。EP 1320375公开了膳食纤维——特别是果聚糖——用于制备一种用来抑制致病 性细菌全身生长的组合物的用途。WO 2004/112509涉及一种组合物，该组合物是用于诱导一种与母乳喂养中观察 到的肠道屏障成熟模式类似的肠道屏障成熟模式，并且可以提高肠道屏障成熟度，所述组 合物包含特定成分的结合物，所述特定成分被设计以在整个胃肠道提供协同作用和屏障功 能。WO 2005/039319涉及一种用于非母乳喂养或部分母乳喂养的婴儿的制品，该制品 包含短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和非消化性碳水化合物混合物，还涉及所述制 品用于治疗或预防非母乳喂养或部分母乳喂养的婴儿的免疫病症的用途。WO 2007/067053公开了含有源自植物的益生元菊糖、半乳糖醛酸低聚糖和经由乳 糖合成的益生元转半乳糖低聚糖(transgalacto-oligosaccharide)的婴儿配方来减少感染。WO 2004/069156公开了使用灭活的细菌。Heyman et al,2005, Acta Paediatr. 94 :34-36 公开了一种用双歧杆菌和嗜热链 球菌(Str印tococcus thermophilus)发酵并加热/脱水灭活微生物的乳配方的作用，即降 低肠道对大分子的通透性并增强肠道屏障对食物蛋白质的抗性。但是，还需要进一步开发婴儿配方来改善肠道屏障功能和减少感染。
发明内容
本发明人惊讶地发现i)和ii)的结合物可以协同地提高对感染的抗性， 其中i)是通过以下步骤获得的产物将水性底物与双歧杆菌孵育，然后通过对所 述孵育混合物加热灭活双歧杆菌，并且/或者通过离心和/或过滤从所述孵育混合 物除去双歧杆菌细胞，其中所述底物选自下列物质的至少一种乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖；ii)是至少两种不同的非 消化性碳水化合物，其中至少一种碳水化合物，优选两种碳水化合物选自低聚果糖 (fructo-oligosaccharides)> 1 1 ^ H (galacto-oligosaccharides)> M M ^ H (gluco-oligosaccharides) > 1 1 H 才立·{白 H (arabino-oligosaccharides) > 1 1 1ξ[" MMW (mannan-oligosaccharides) > 1 1 7^ H (xylo-oligosaccharides) > jS: M
H (fuco-o ligosacchar ides) > 1 1 H Ji fQ ^L IK H (arabinogalacto-o ligosacc harides)、低聚葡糖甘露聚糖(glucomanno-oligosaccharides)、低聚半乳甘露聚糖 (galactomanno-oligosaccharides)、丰帛〒H (raff inose) >(Iactosucrose)、L
低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液酸(sialic acid)。与食用单组分的动物相比，在食用所述组 合物的动物中观察到穿过肠道屏障的细菌移位减少。这表明肠道屏障功能增强或肠道屏障 通透性降低。上文定义的成分i)和ii)的结合物之间的协同作用是意料之外的。不能简单的 将其解释为共存作用，即其中非消化性碳水化合物(ii)特异性地刺激存在于同一制品中 有益微生物的生长，原因是在本发明的制品中不存在双歧杆菌活细胞。除去和/或灭活活的双歧杆菌细胞具有更进一步的益处，即所述组合物可经巴氏 法灭菌(pasteurised)和/或灭菌(sterilised)，从而减少被有害微生物污染的机会。这 对于婴儿尤其有利，因为婴儿肠道通透性高。此外，由于双歧杆菌被除去或灭活，它们本身 不再能引起感染。另外一个益处是可以更好地控制每位人受试者所接受的生物活性成分的剂量。同 样有利地，产品的贮存更容易并且费用降低。此外，贮存的产品中有利地不会出现后酸化， 从而避免了与蛋白凝聚和不良口味相关的不良反应。还有另一个益处，即灭活的和/或除 去的双歧杆菌不再能够分解和消耗非消化性碳水化合物。本发明的制品适合用于治疗和/或预防感染，特别是全身感染；用于预防和/或治 疗腹泻；用于减少细菌移位，优选减少细菌穿过肠道屏障移位；和/或用于改善肠道屏障功 能。
具体实施例方式本发明涉及一种制造制品的方法，包括步骤a:将水性底物与双歧杆菌孵育以得到孵育混合物，其中所述底物是选自下列物质 的至少一种乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖；b 通过加热所述孵育混合物灭活所述双歧杆菌，并且/或者通过离心和/或过滤 从所述孵育混合物中除去双歧杆菌细胞；以及C 将包含步骤a或步骤b得到的混合物——优选步骤b得到的混合物——的组合 物与至少两种非消化性碳水化合物结合，所述非消化性碳水化合物的至少一种，优选两种 选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露聚糖、低聚木糖、低聚岩 藻糖、低聚阿拉伯半乳聚糖、低聚葡糖甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、棉子糖、乳蔗糖、含有 低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液酸。在一方面，本发明涉及一种通过本发明的方法得到的制品。在一个实施方案中，本 发明涉及一种营养组合物，其包含通过本发明的方法得到的制品，或由通过本发明的方法得到的制品组成。本发明还涉及一种用于治疗和/或预防哺乳动物疾病的方法，所述方法包括将本 发明的制品给予所述哺乳动物。本发明还涉及一种向婴儿提供营养物的方法，所述方法包括将本发明的制品或含 有本发明制品的营养组合物给予所述婴儿。包含将底物与双歧杆菌孵育的方法本发明涉及一种可通过将水性底物与双歧杆菌孵育获得的制品，或一种通过将 水性底物与双歧杆菌孵育获得的制品，其中所述水性底物包含选自下列物质的至少一种 乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖(下文称作步骤 (a))。将可从步骤(a)获得的，或从步骤(a)获得的孵育混合物用于步骤(b)的处理，步 骤(b)包括通过加热来灭活双歧杆菌的步骤和/或通过离心和/或过滤来除去双歧杆菌的 步骤。进行步骤(b)是为了减少所述制品中的活双歧杆菌数量，优选地减少至少90%，更 优选减少至少99%。在一个实施方案中，所述孵育步骤包括一个发酵步骤和/或生物转化 (bioconversion)步骤。在发酵过程中，将所述水性底物被所述双歧杆菌发酵。在生物转化 过程中，将所述水性底物被所述双歧杆菌生物转化。通过本发明的方法可得到的或得到的(下文中在仅提到“得到的”时，也意 味着“可得到的”)制品优选地包含细菌细胞碎片如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸 (lipoteichoic acid，LTA)、脂蛋白、DNA和/或荚膜多糖。这些碎片可引起免疫学反应。使 用通过将水性底物和双歧杆菌孵育之后灭活和/或除去双歧杆菌而得到的产物是有利的， 因为这样可产生更高的细菌细胞碎片浓度，所述水性底物包含选自下列物质的至少一种 乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖。在将水性底物与 双歧杆菌孵育时，可形成另外的生物活性化合物，例如有机酸、生物活性肽和/或寡聚糖， 它们都会刺激免疫系统。当使用市售的益生菌制品时，益生菌细胞通常会被洗涤并且被从 包含细菌细胞碎片的水性生长培养基中分离，从而大大减少或甚至消除含有细菌细胞碎片 的孵育底物上清液。在本发明中就不会这样。完整的(活或死)细胞的存在并不是免疫反 应所必需的；在本发明的与双歧杆菌孵育步骤后，水性底物本身已经对免疫系统具有有益 作用。双歧杆菌和链球菌用于本发明方法的双歧杆菌优选地被以单独培养物或混合培养物的形式提 供。双歧杆菌是革兰氏阳性、厌氧的、杆状产乳酸细菌。本发明的双歧杆菌种与各 个双歧杆菌种的株系类型相比优选地具有至少95%的16S rRNA序列同一性，更优 选至少97 %的同一性，如各种手册中对这方面的定义，所述手册例如Sambrook，J.， Fritsch, Ε. F., 禾口 Maniatis, Τ. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor (N. Y.) Laboratory Press。优选使用的双歧杆菌还记 载于 Scardovi, V. Genus Bifidobacterium, p. 1418-p. 1434.见Bergey ‘ s manual of systematic Bacteriology. Vol. 2. Sneath, P. H. A. , N. S. Mair, M. E. Sharpe and J. G. Holt (ed.). Baltimore :ffilliams&ffilkins. 1986. 635p0 制备本发明的制品中使用 的双歧杆菌优选是选自下列的至少一种双歧杆菌短双歧杆菌(B. breve)、婴儿双歧杆菌 (B. infantis)、双歧双歧杆菌(B. bifidum)、链状双歧杆菌(B. catenulatum)、青春双歧杆
6菌(B. adolescentis)、嗜热双歧杆菌(B. thermophilum)、高卢双歧杆菌(B. gallicum)、动 物双歧杆菌或乳双歧杆菌(B.animalisor lactis)、角双歧杆菌(B. angulatum)、假链状 双歧杆菌(B. pseudocatenulatum)、热嗜酸双歧杆菌(B. thermacidophilum)和长双歧杆 菌(B. longum)，更优选短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、双歧双歧杆菌、链状双歧杆菌和长双 歧杆菌，更优选长双歧杆菌和短双歧杆菌，甚至更优选短双歧杆菌，最优选由Compagnie Gervais Danone 于 1999 年 5 月 31 日保藏于法国巴黎 Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms van Institute Pasteur 白勺失豆双 1 木干胃 1—2219。1 WO 2004/093899中被公开。所述组合物优选地还包含一种通过将水性底物与链球菌孵育，并优选之后灭活 和/或除去链球菌得到的产物，所述水性底物包含选自下列物质的至少一种乳、乳蛋白、 乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和乳糖，优选选自乳清和乳糖 的至少一种。链球菌是革兰氏阳性、厌氧的、球状产乳酸菌。本发明的链球菌种与各个链 球菌种的株系类型相比优选地具有至少95%的16S rRNA序列同一性，更优选至少97%的 同一性，如各种手册中对这方面的定义，所述手册例如Sambrook，J.，Fritsch, Ε. F.，and Maniatis, Τ. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd ed.，ColdSpring Harbor (N. Y. )Laboratory Press0通过将水性底物和链球菌孵育之后灭活所述链球菌得 到产物的生产过程优选地以选自下列的链球菌进行唾液链球菌(S. salivarius)和嗜热 链球菌(S. thermophilus)，更优选嗜热链球菌，甚至更优选嗜热链球菌株系CNCM 1-1620 或株系CNCM 1-1470，最优选株系CNCM 1-1620。嗜热链球菌株系CNCMI-1620和1-1470 可有利地产生大量的β-半乳糖苷酶。嗜热链球菌CNCM 1-1620由Compagnie Gervais Danone根据布达佩斯条约于1995年8月23日保藏于法国巴黎Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms van Institute Pasteur。 口誉热链球菌 CNGM 1-1620 由Compagnie Gervais Danone根据布达佩斯条约于1994年8月25日保藏于法国巴黎 Collection Nationale de Cultures de Microorganisms vanlnstitute Pasteur。 株系在EP 778885中被公开。加工步骤a)孵育水性底物步骤(a)优选通过如下方式进行al将双歧杆菌以IX IO2至IX IO11Cfu双歧杆菌/ml的浓度接种于水性底物中，所 述水性底物PH为4至8，并包含选自下列物质的至少一种乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水 解产物、酪蛋白水解产物和乳糖。a2有氧或无氧条件下于20°C至50°C的温度下在所述水性培养基中孵育所述双歧 杆菌至少浊。待与双歧杆菌孵育的水性底物包含至少一种，更优选至少两种选自以下的物质 乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物和乳糖。底物优选地不包含完整的 酪蛋白。已发现，当水性底物含有大量完整的酪蛋白时会形成较少的免疫刺激物质。因此， 所述水性底物优选包含少于25g/l酪蛋白，更优选少于15g/l，甚至更优选少于5g/l，最优 选少于lg/Ι的完整酪蛋白。所述水性底物因此更优选包含乳清和/或乳清蛋白和/或乳 清蛋白水解产物。乳可以是全脂乳、半脱脂乳和/或脱脂乳。优选使用脱脂乳。乳清可以是甜乳清
7(sweet whey)、酸乳清(acid whey)或通过例如过滤除去酪蛋白的乳清或乳清渗透物(whey permeate)。乳清优选以每升(1)水性底物3至80g干重的浓度存在，更优选每升40至60g。 优选使用乳清蛋白浓缩物。优选使用乳清蛋白水解产物并以每升水性底物2至80g干重的 量存在，更优选5至15g/l。乳糖优选以每升(1)水性底物5至50g干重的量存在，更优选 1至30g/l。水性底物优选包含缓冲盐以使pH保持在需要的范围内。优选将磷酸二氢钠和 磷酸二氢钾用作缓冲盐，优选的量为0. 5至5g/l，更优选1. 5至3g/l。所述水性底物优选 含有每升水性底物0. 1至0. 5g的量的半胱氨酸，更优选0. 2至0. 4g/l。半胱氨酸的存在导 致水性底物的低氧化还原势，这有利于产乳酸菌的活性，特别有利于双歧杆菌的活性。所述 水性底物优选包含每升水性底物0. 5至5g的量的酵母提取物，更优选1. 5至3g/l。酵母提 取物对产乳酸菌来说是酶辅助因子和生长因子的丰富来源。酵母提取物的存在将增强双歧 杆菌生物的生物转化和/或发酵。所述待孵育的水性底物优选包含高浓度的固体，优选以体积计超过20重量％的 固体，更优选超过40重量％的固体。在进行后面的处理步骤——例如喷雾干燥、离心或过 滤时，高浓度是有利的。为了除去不需要的活菌，可适当地在孵育步骤前将所述水性底物以巴氏法灭菌。 为了灭活酶，可适当地将孵育后的产物以巴氏法灭菌。合适的酶灭活在75°C下进行1分钟。 合适的酶灭活在75°C下进行3分钟。在孵育步骤之前和/或之后可以适当地将所述水性底 物勻浆化。勻浆化形成更稳定的产物，特别是在脂肪(脂质)存在的情况下。孵育密度优选每ml水性底物1 X IO2至1 X IO11Cfu双歧杆菌，优选每ml水性底物 1 X IO4至1 X IO10Cfu双歧杆菌，更优选每ml水性底物1 X IO7至1 X IO9Cfu双歧杆菌。本领 域中已知得到待孵育于水性底物中的浓缩双歧杆菌起始培养物的方法。孵育后双歧杆菌的 终细菌密度优选为1 X IO3至1 X IO11CfVml水性底物，更优选1 X IO4至1 X 109cfu/ml水性 底物。与双歧杆菌孵育优选在约20°C至50°C的温度下进行，更优选30°C至45°C，甚至更 有选约37°C至42 °C。对于双歧杆菌的生长和/或活性来说，最适温度是37°C至42 °C。与双歧杆菌的孵育优选在厌氧条件下进行，因为双歧杆菌的生长和许多双歧杆菌 酶的酶活性在有氧条件下受抑制。但是，并不总是需要进行酸化。因此，在一个实施方案中， 孵育步骤合适地在有氧条件下进行。与双歧杆菌的孵育优选于pH 4至8下进行，更优选pH 5. 6至7. 5，甚至更有选pH 6至7. 5。这样的pH不会诱发蛋白质沉淀和/或不良口味，而同时双歧杆菌能够和所述水 性底物相互作用。孵育时间优选是至少2小时，优选4至48小时，更优选6至M小时，甚至更优选6 至15小时。足够长的时间可使得在双歧杆菌和所述底物之间发生较大程度的相互作用并 且/或者可较大程度地产生细胞碎片例如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸(LTA)、脂蛋白、 DNA和/或荚膜多糖，而由于经济原因孵育时间不必要过长。灭活和/或物理除去双歧杆菌活细胞的方法在本发明的方法的步骤(b)中，在步骤a)孵育后优选将双歧杆菌的活细胞基本 上全部除去，例如通过加热处理进行灭活和/或物理移除。所述细胞优选通过加热处理 进行灭活。所述双歧杆菌优选在孵育步骤a)后被加热杀死。优选的加热杀死方式是巴
8氏灭菌法、灭菌(sterilization)、超高温处理、在双歧杆菌无法存活的温度下进行喷雾蒸 煮(spray cooking)和/或喷雾干燥。所述加热处理优选在至少50°C下进行，更优选至少 65°C。所述加热处理优选进行至少5分钟，更优选至少10分钟。所述加热处理优选在至少 50°C下进行至少5分钟，更优选在至少65°C下进行至少10分钟。所述加热处理优选优选在 至少75°C下进行至少1分钟，更优选在至少75°C下进行至少3分钟。优选通过物理除去法例如过滤和/或离心从所述孵育产物中除去双歧杆菌的完 整细胞，例如在3000g下离心1小时，完整细胞保留在片状沉淀物或滞留物(retentate) 中，而通过将乳和/或源自乳的底物与双歧杆菌孵育并随后灭活双歧杆菌细胞碎片得到的 产物保留在上清液和/或滤出液中。所述加热灭活和/或物理除去活细胞使得在所述处理后活双歧杆菌的量低于本 领域已知的常规平皿培养技术使用的检出限(detectionlimit)。以每克组合物干重计，所 述检出限少于IO4Cfu双歧杆菌活细胞，更优选少于103cfu/g。因此，在本发明的一个实施 方案中，所述在步骤b后的制品优选地每g干重制品含有少于IO3Cfu双歧杆菌活细胞。所 述加热灭活和/或除去步骤优选使得至少90%，更优选至少99%存在于所述步骤a)后孵 育混合物中的细胞被除去。对活细胞进行灭活的要求具有这样的优点，即最终的营养组合物在产生后可被巴 氏法灭菌和/或灭菌，从而减少有害微生物污染的机会。因此，本发明使得即用型的液体配 方能在室温下制备并保存。此外，可以更容易地控制每位人受试者所接受的生物活性组分 的剂量，这是因为在液体产品中不会出现更进一步的生长，在人受试者肠道内也不会出现 生长。后者是一种取决于个体肠道环境的可变因子，因此可导致在个体受试者中的有益效 果的程度差异。还有一个优点是灭活的和/或除去的双歧杆菌和链球菌不再能够降解和消 耗所述非消化性碳水化合物。另外的优点是所述营养组合物可以更易于保存，并且费用降低，因为不需要采取 专门的预防措施来使双歧杆菌的生存能力保持在一个可接受的水平。对于水活度高于0. 3 的产物尤其如此。在保存的高水活度产品中和/或在粉末状营养组合物以水配制后食用前 的阶段中还不会发生后酸化。与蛋白凝聚和不良口味相关的不良反应也以该方式被避免。另外成分的添加以及其他任选的加工步骤上述加工步骤b)之后任选可以是以下一个或多个步骤i)孵育后将所述产物超滤通过截留限值(cut-off threshold)为100到300kDa 的滤膜，目的是得到浓缩的滞留物。所述膜优选聚醚砜膜，并且过滤优选在低于60°C的温度 下进行。ii)用水洗涤浓缩的滞留物。iii)将所述浓缩的滞留物脱水，优选通过冷冻干燥进行。iv)将所述脱水的滞留物溶解到缓冲液中，优选pH 6-8的Tris缓冲液。ν)在排阻限值(exclusion threshold)为600kDa的柱——优选右旋糖酐或琼脂 糖柱例如Superdex 200上，对所述滞留物溶液进行凝胶排阻色谱。vi)在色谱结束回后收过滤部分或排阻部分。vii)用截留限值为IOkDa的膜将产品脱盐。在色谱结束后回收排阻部分。
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这些步骤优选在无菌条件下进行。在步骤a)后可加入有利于得到所需最终营养 组合物的其他成分，优选在临进行步骤b)之前或在加工步骤b)之后。这些成分优选在步 骤b)之后加入。对一种婴儿乳配方而言，可加入一些本领域公知的成分例如脱脂乳、乳清、 乳糖、植物脂肪、矿物质和维生素。优选将一种含有乳清、乳清蛋白和/或乳清蛋白水解产物的水性底物用巴氏法 灭菌、冷却并且与一种或多种双歧杆菌株系孵育，所述双歧杆菌优选短双歧杆菌株系CNCM 1-2219，在此基础上将孵育产物加热并保存。任选地将所述孵育产物与组成所述营养组合 物的其他成分混合。可包含或不包含脂肪组分，但优选在这个阶段不加入脂肪组分。优选 将所述混合物预热，随后顺次(in-line)加入脂肪(在本文中也使用术语“脂质”)、勻浆、 热处理并干燥。另一种用于制备本发明的孵育产物的优选方法公开于W001/01785中，更具体是 在实施例1和2中。另一种用于制备本发明的孵育产物的优选方法记载于WO 2004/093899 中，更具体是在实施例1中。对得到所需的最终营养组合物可能有利的其他成分可在加工步骤a)或b)后加 入。这些成分优选在步骤b)后加入。对于婴儿乳配方而言，可加入一些本领域公知的成分 例如脱脂乳、乳清、乳糖、植物脂肪、矿物质和维生素。以步骤b得到制品的干重计，所述终营养组合物优选包含5至100重量％，更优选 5至99. 5重量％，更优选5至95重量％，甚至更优选5至80重量％，甚至更优选5至40重 量％，最优选10至40重量％。所述终营养组合物每IOOml中优选包含0. 5至20重量％的 由步骤b得到的产物，每IOOml中更优选0. 5至14重量％，更优选1至10重量％，甚至更 有选1至5重量％。以所述终组合物的干重计，本发明的终营养组合物优选包含从每g中多于 1 X IO3Cfu,更优选多于1 X IO4Cfu,甚至更优选多于1 X IO5Cfu的双歧杆菌得到的灭活双歧 杆菌和/或源自双歧杆菌的细菌碎片。以所述终组合物的干重计，所述灭活双歧杆菌和/ 或源自双歧杆菌的碎片优选从每g中少于1 X IO11Cfu,更优选少于1 X IO10Cfu,甚至更有选 少于IXlO9Cfu的双歧杆菌得到。这些数值可通过如下方式计算测定存在于步骤a)的孵 育之后和步骤b)之前的混合物中的双歧杆菌的量，并且随后以干重计有多少克本发明的 制品存在于所述最终组合物中。对得到所需终营养组合物可能有利的其他成分可在加工步骤a)或b)之后加入。 这些成分优选在步骤a)之后加入。对于婴儿乳配方而言，可加入一些本领域公知的成分例 如脱脂乳、乳清、乳糖、植物脂肪、矿物质和维生素。所述方法优选包括如下的其他步骤d:将底物与嗜热链球菌孵育以得到孵育混合物，其中嗜热链球菌优选嗜热链球菌 株系CNCM 1-1620或株系CNCM 1_1470，其中所述底物选自乳、乳蛋白、乳清、乳清蛋白、乳清 蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和乳糖，和e 通过加热步骤e的孵育混合物灭活所述嗜热链球菌和/或通过离心和/或过滤 从步骤e的孵育混合物中除去嗜热链球菌细胞。步骤e和b优选同时进行。优选通过物理 除去法例如过滤和/或离心从所述孵育产物中除去链球菌的完整细胞，例如在3000g下离 心1小时，完整细胞保留在片状沉淀物或滞留物中，而通过将乳和/或源自乳的底物与链球菌孵育并随后灭活链球菌细胞碎片得到的产物保留在上清液和/或滤出液中。所述加热灭活和/或物理除去活细胞使得在所述处理之后活链球菌的量低于 本领域已知的常规平皿培养技术使用的检出限。以每克干重组合物计，所述检出限少于 IO4Cfu链球菌活细胞，更优选少于103cfu/g。因此，在本发明的一个实施方案中，所述步骤 e)后的制品优选每g干重制品含有少于IO3Cfu活链球菌。加热灭活和/或除去步骤优选 地使得存在于步骤d)后的孵育混合物中的细胞中至少90%，更优选至少99%被除去。用于以本发明的嗜热链球菌株系制备孵育产物的另一种优选方法被公开于EP 0778885中，更具体是在实施例5和6中。用于以本发明的嗜热链球菌株系制备孵育产物的 另一种优选方法公开于FR2723960的实施例2至6中。优选将含有乳清、乳清蛋白和/或乳清蛋白水解产物的底物用巴氏法灭菌、冷却 并与一种或多种双歧杆菌株系孵育，所述双歧杆菌株系优选短双歧杆菌株系CNCM 1-2219， 在此基础上对所得孵育产物进行加热处理并保存。优选将含有乳清和/或乳糖的第二种水 性底物与嗜热链球菌孵育，所述嗜热链球菌优选株系CNCM 1-1620或株系CNCMI-1470。随 后，优选将所述两种孵育产物混合在一起并且与其他构成所述营养组合物的组分。可加入 或不加入脂肪组分，但是优选这个阶段仍不加入脂肪组分。优选将所述混合物预热，随后顺 次加入脂肪(在本文中也使用术语“脂质”)、勻浆、热处理并干燥。孵育步骤d可与步骤a中用双歧杆菌的孵育步骤同时进行。优选将嗜热链球菌 的孵育和双歧杆菌的孵育在不同处理步骤中进行。分别孵育可实现每种不同细菌的最佳 条件并/或防止释放免疫刺激组分的不同细菌的不利干扰。优选将所述底物与链球菌孵 育后得到的孵育混合物加入步骤a、步骤b或步骤c中得到的混合物中，更优步骤a)后加 入。当本发明的组合物还包含与嗜热链球菌孵育后得到的混合物时，出现对迟发型超敏反 应(delayed hyper hypersensitivity response)的改善效应。因此,在一个实施方案中， 本发明的方法包括另一步骤f 将步骤d或e——优选步骤d——中得到的孵育混合物与步 骤a、b或c——优选步骤a——中得到的孵育混合物结合。在一个实施方案中，将步骤d中 得到的孵育混合物与步骤a中得到的孵育混合物组合物结合，并且步骤b和步骤e同时进 行。以步骤d得到的制品的干重计，终营养组合物优选包含2至94. 5%，更优选5至 80重量％，甚至更优选5至40重量％。终营养组合物优选每IOOml包含0. 2至20重量0Z0 的步骤d得到的产物，每IOOml更优选0. 5至14重量％，更优选1至10重量％，甚至更优 选1至5重量％。非消化性碳水化合物本发明的方法得到的制品包含至少两种不同的非消化性碳水化合物。所述非消化 性碳水化合物在加工步骤c)中加入。所述非消化性碳水化合物可有利地刺激免疫系统。这 种刺激可通过以下方式实现改善肠道微生物群(intestinal microbiota)和/或经对免 疫系统的直接效应。两种不同的非消化性碳水化合物的存在可改善肠道菌群和/或协同地 刺激免疫系统。存在两种非消化性碳水化合物，和通过将水性底物与双歧杆菌孵育并随后灭活和 /或除去所述双歧杆菌得到的产物可在较大程度上提高对感染的抗性。这两种化合物之间 的提高效应是意想不到的并且不能用共存作用来解释，即所述非消化性碳水化合物特异性
11地刺激存在于同一制品中有益微生物的生长，原因是在孵育的乳和/或乳衍生产品中不存 在活的双歧杆菌。本发明中使用的术语“低聚糖(oligosaccharide) ”是指聚合度(DP)为2至250， 优选DP为2至100，更优选DP为2至60，甚至更优选DP为2至10的碳水化合物。如果本 发明的制品中包含DP为2至100的低聚糖，那么这包括含有DP为2至5、DP为50至70和 DP为7至60的低聚糖的组合物。本发明中使用的术语“非消化性碳水化合物”是指这样的 碳水化合物，即在肠道内不被存在于人上消化道(小肠和胃)内的酸或消化酶的作用消化、 但更优选被人肠道微生物发酵的碳水化合物。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糊精被认为 是可消化的。本发明的非消化性碳水化合物优选是可溶的。本文所用的术语“可溶”在提及碳 水化合物时是指根据L. Prosky et al, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71，1017-1023 (1988)描述 的方法所述碳水化合物是可溶的。本发明中不同的非消化性碳水化合物涉及单糖单位组成不同和/或聚合度(DP) 不同的非消化性碳水化合物。当以总摩尔单糖单位计，单糖组成有至少差异30mol%、更 优选至少差异50mOl%时，两种非消化性碳水化合物在单糖组成不同。例如，平均组成为 Glu-Gal3的低聚半乳糖和平均组成为Glu-Fru3的低聚果糖差异75mol%。如果两种非消化 性碳水化合物的平均DP的差异超过5个单糖单位，优选超过10个单位，甚至更优选超过15 个单位，则所述两种碳水化合物的DP不同。例如，平均DP为4的水解菊糖和平均DP为25 的长链菊糖的DP差异21单位。所述非消化性碳水化合物是选自如下的至少一种，更优选至少两种低聚果糖、 低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露聚糖、低聚木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉 伯半乳聚糖、低聚葡糖甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、含有低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液 酸。本发明的制品优选包含低聚果糖、低聚半乳糖和/或低聚半乳糖醛酸，更优选低聚半乳 糖，最优选低聚半乳糖。低聚果糖类包括菊糖，低聚半乳糖类包括反式低聚半乳糖或 β-低聚半乳糖，低聚葡萄糖类包括龙胆低聚糖(gentio-oligosaccharides)、黑曲霉寡糖 (nigero-oligosaccharides)、环糊精/[氏聚|| (cyclodextrin-oligosaccharides)禾口聚葡 萄糖(polydextrose)，低聚阿拉伯半乳聚糖类包括阿拉伯树胶(gum acacia)，低聚半乳甘 露聚糖类部分地包括部分水解的瓜尔胶(guar gum)。为了进一步进行改进，本发明的非消化性碳水化合物优选具有相对高含量的短链 低聚糖，因为这些碳水化合物对双歧杆菌的生长有强刺激作用。因此，在本发明制品中优选 至少10重量％的非消化性碳水化合物具有2至5 (即，2、3、4和/或5)的DP，并且至少5 重量％的非消化性碳水化合物具有10至60的DP。优选至少50重量％，更优选至少75重 量％的所述非消化性碳水化合物具有2至9(即，2、3、4、5、6、7、8和/或9)的DP。本发明的方法得到的制品更优选包含低聚半乳糖。所述低聚半乳糖优选地选自 β -低聚半乳糖、乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose (LNT))、乳糖-N-新四糖(neo-LNT)、 岩藻糖基乳糖(fucosyl-lactose)、岩藻糖基化LNT(fuc0Sylated LNT)和岩藻糖基化新 LNT(fucosylatedneo-LNT)0在一个特别优选的实施方案中，本发明的制品包含β -低聚 半乳糖。本发明使用的低聚半乳糖是指聚合度(DP)为2至20的由以单体亚基计超 过50 %，优选超过65 %半乳糖单位组成的低聚糖，其中至少50 %，更优选至少75 %，甚至更优选90%的半乳糖单位经β-糖苷键，优选β _1，4糖苷键连接在一起。在人乳低聚糖中 也主要是β-键。平均DP优选在3至6范围内。葡萄糖单位可存在于半乳糖单位链的还 原端。低聚半乳糖有时也指反式低聚半乳糖(TOS)。低聚半乳糖的一个合适来源 是Vivinal GOS (可市购于荷兰兹沃勒Borculo Domo hgredients)。其他合适来源有 Oligomate (Yakult) ,Cupoligo (Nissin)和 Bi2muno (Classado)。已发现 β-低聚半乳糖可 刺激产乳酸菌，特别是双歧杆菌的生长。通过本发明的方法得到的制品优选包含低聚果糖。本发明使用的低聚果糖是指由 以单体亚基计超过50 %，优选超过65 %的果糖单位组成的碳水化合物，其中至少50 %，更 优选至少75%，甚至更优选90%的果糖单位经β-糖苷键，优选β _2，1糖苷键连接在一 起。果糖单位可存在于果糖单位链的还原端。所述低聚果糖优选具有2至250，更优选2至 100，甚至更优选10至60的DP或平均DP。低聚果糖可包括果聚糖、水解果聚糖、菊糖、水 解菊糖和合成低聚果糖。所述制品优选包含平均聚合度(DP)为3至6的短链低聚果糖，更 优选水解菊糖或合成低聚果糖。所述制品优选包含平均DP大于20的长链低聚果糖。所述 制品优选包含短链和长链低聚果糖。适用于本发明方法的低聚果糖还可容易地市购，例如 RaftilineHP (Orafti)。通过本发明的方法得到的所述制品更优选包含低聚半乳糖和低聚果糖，更优选长 链低聚果糖，的结合物。这样的混合物协同地刺激健康肠道微生物群，特别是双歧杆菌，的 生长。通过本发明的方法得到的所述制品优选包含糖醛酸低聚糖，更优选甘露糖醛酸 (mannonuric acid)低聚糖和/或半乳糖醛酸低聚糖，甚至更优选半乳糖醛酸。在本发明 中使用的糖醛酸低聚糖这一术语是指这样的一种低聚糖，即其中至少50%的存在于所述低 聚糖中的单糖单位是糖醛酸。在本发明中使用的半乳糖醛酸低聚糖这一术语是指一种低聚 糖，其中至少50%的存在于所述低聚糖中的单糖单位是半乳糖醛酸。在本发明中使用的半 乳糖醛酸低聚糖优选通过降解果胶、果胶酸盐(pectate)和/或聚半乳糖醛酸来制备。降 解的果胶优选通过对水果和/或蔬菜果胶，更优选苹果、柑橘和/或甜菜果胶，进行水解和/ 或β消去反应来制备，甚至更优选用至少一种裂解酶降解的苹果、柑橘和/或甜菜果胶。在 一个优选实施方案中，所述半乳糖醛酸低聚糖的至少一个末端半乳糖醛酸单位具有双键。 所述双键可有效地防止所述致病细菌对肠道上皮细胞的附着。优选一个末端半乳糖醛酸单 位包含C4-C5双键。所述半乳糖醛酸低聚糖可被衍生化。所述半乳糖醛酸低聚糖可被甲氧 基化和/或酰胺化。所述半乳糖醛酸低聚糖的特征优选在于大于20%，优选大于50%，甚 至优选大于70 %的甲氧基化度。糖醛酸低聚糖可有利地降低致病微生物对肠道上皮细胞的 粘附。此外，糖醛酸低聚糖可通过增强Thl反应刺激免疫系统。因此，在一个实施方案中，通过本发明的方法得到并用于本发明的制品优选包含 至少低聚半乳糖。在一个实施方案中，通过本发明的方法得到并用于本发明的制品优 选包含至少短链低聚果糖和/或长链低聚果糖，优选长链低聚果糖。在一个实施方案中，通 过本发明的方法得到并用于本发明的制品优选包含至少糖醛酸低聚糖。在一个实施方案 中，用于本发明的制品优选包含至少低聚半乳糖，以及至少短链低聚果糖或长链低聚 果糖或者两者。在一个实施方案中，用于本发明的制品优选包含至少低聚半乳糖和至 少糖醛酸低聚糖。在一个实施方案中，用于本发明的制品优选包含至少短链低聚果糖和糖
13醛酸低聚糖，或者长链低聚果糖和糖醛酸低聚糖。在一个实施方案中，用于本发明的制品优 选包含至少β-低聚半乳糖、短链低聚果糖和糖醛酸低聚糖，或者至少β-低聚半乳糖、长 链低聚果糖和糖醛酸低聚糖。两种不同非消化性碳水化合物——优选β -低聚半乳糖和低聚果糖——的混合物 之间的重量比率优选在20至0. 05之间，更优选在20至1之间。β -低聚半乳糖更类似人 乳低聚糖。本发明的制品优选包含DP为2-10的β -低聚半乳糖和/或DP为2-60的低聚 果糖。已发现这种结合物可协同地改善双歧杆菌和乳酸杆菌(lactcAacilli)。这三种非消 化性低聚糖的存在甚至可进一步刺激双歧杆菌。反式低聚半乳糖低聚果糖糖醛酸低聚 糖的重量比优选为(20至2) 1 (1至20)，更优选(12至7) 1 (1至3)。由通过本发明的方法得到的制品组成或包含通过本发明的方法得到的制品的终 营养组合物优选地每IOOml包含SOmg至2g非消化性碳水化合物，更优选150mg至1. 50g, 甚至更优选300mg至lg。以干重计，所述营养组合物优选包含0. 25重量％至20重量％，更 优选0. 5重量％至10重量％，甚至更优选1. 5重量％至7. 5重量％非消化性碳水化合物。 较低含量的非消化性碳水化合物在刺激免疫系统和/或微生物群中有益细菌时效应较低， 而过高含量将导致胃气胀和腹部不适的副作用。所述两种不同非消化性碳水化合物在步骤a)之后加入(即步骤C)，优选在临进 行步骤b)之前或在步骤b)之后立即加入，优选在步骤b)之后进行步骤c)，优选在步骤e) 之后进行步骤c)，即在通过热处理灭活之后和/或在除去双歧杆菌和任选的嗜热链球菌之后。通过本发明的方法得到的制品优选包含一种与短双歧杆菌，更优选株系CNCM 1-2219孵育的水性底物和至少一种，优选两种，非消化性碳水化合物，所述底物包含至少一 种选自乳、乳蛋白质、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物和乳糖的物质，所述非消化性碳水 化合物选自低聚半乳糖和低聚果糖。在一方面，本发明涉及本发明的方法，其中在步骤c中加入仅一种非消化性碳水 化合物。所述的仅一种非消化性碳水化合物是低聚果糖时特别有利。在一方面，本发明涉及一种通过上述的本发明的方法得到的制品。在一个实施方 案中，由通过本发明的方法得到的制品组成或包含通过本发明的方法得到的制品的终营养 组合物每IOOg组合物的干重包含0. 5至IOg上文定义的非消化性碳水化合物。在一个实 施方案中，由通过本发明的方法得到的制品组成或包含通过本发明的方法得到的制品的最 终营养组合物在20°C下和在IOOiT1剪切速率下粘度为1至60mPa. s。上述方法优选包括一个干燥步骤。干燥步骤是本领域公知的。一个合适的干燥步 骤是喷雾干燥。所述干燥步骤优选以这样的方式进行，即干燥的产物是含有少于10重量％ 水，更优选少于5重量％，的粉末。所述干燥步骤优选在步骤C后进行。或者，所述干燥步 骤可在步骤b之后和/或步骤e之后进行，之后将所述非消化性碳水化合物干燥地混入所 述产物。营养物已发现本发明的制品可被有利地应用于食品，例如婴儿食品和病人食品 (clinical food)。本发明的制品或含有本发明制品的组合物优选经肠给予，更优选口服给 予。所述组合物优选是完全营养物。
所述营养物优选适合给予婴儿。本发明的营养组合物更优选是一种婴儿配方或较 大婴儿配方(follow on formula) 0本发明的组合物可有利地用作婴儿的完全营养物。本发明的组合物优选是一种婴儿营养物，以所述婴儿营养物干重计包含i)总和为0. 5至10重量％的低聚半乳糖和低聚果糖，和ii)5至99. 5重量％的根据本发明的方法步骤b后得到的制品，其中在步骤a中的 双歧杆菌属于短双歧杆菌种，优选短双歧杆菌株系CNCM 1-2219iii)和任选2至94. 5重量％的步骤e后得到的制品。这样的营养物优选包含脂质、蛋白质和碳水化合物并且优选以液体形式给予。本 发明使用的术语“液体食品”包括干食品(例如粉末)，附有将所述干燥食品混合物与一种 合适液体(例如水)相混合的说明书。因此，本发明的营养组合物优选地包含以总热量计5%至60%的脂质，以总热量 计5%至60%的蛋白质，以总热量计15%至90%的可消化性碳水化合物。当意欲提供给成 人受试者时，本发明的组合物优选包含以总热量计5%至30%的脂质，以总热量计15%至 40%的蛋白质和以总热量计25%至75%可消化性碳水化合物。当意欲提供给婴儿时，本发 明的组合物优选包含以总热量计30%至60%的脂质，以总热量计5%至15%的蛋白质和以 总热量计25%至75%的可消化性碳水化合物，更优选以总热量计35%至50%的脂质，以总 热量计7. 5%至12. 5%的蛋白质和以总热量计40%至55%的可消化性碳水化合物。为基 于总热量计算％蛋白质，需要考虑由蛋白质、多肽和氨基酸提供的总能量。所述脂质优选包含植物油。所指植物脂质优选是至少一种选自如下的油大豆油、 棕榈油、椰子油、红花油、葵花子油、玉米油、菜籽油和卵磷脂。优选使用一种植物脂质与至 少一种选自鱼油以及含ω-3的植物油、藻油和细菌油的油的组合物。在一个优选的实施方 案中，本发明的方法还包括给予长链多不饱和酸(LC-PUFA)。由于人们认为LC-PUFA以一种 不同于非消化性碳水化合物和所述产物(通过将乳和/或源自乳的底物与双歧杆菌孵育并 随后灭活双歧杆菌而得到的)的机制作用于免疫系统，本发明与LC-PUFA的结合被认为可 协同地作用。本发明的营养组合物优选包含，当意欲提供给成人时，以总热量计5%至60%的 脂质，优选以总热量计5%至30%脂质；当意欲提供给婴儿时，优选以总热量计30%至60% 脂质，更优选以总热量计35 %至50 %脂质。所述营养制品使用的蛋白质优选选自非人动物蛋白(例如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋 白)、植物蛋白(例如大豆蛋白、小麦蛋白、稻蛋白和豌豆蛋白)，上述蛋白质的水解产物、游 离氨基酸以及蛋白质、水解产物和游离氨基酸的混合物。特别优选牛乳蛋白，例如酪蛋白和 乳清蛋白。由于本发明的组合物适合用于降低过敏反应，特别婴儿的过敏反应，所述蛋白质 优选选自水解乳蛋白。本发明的组合物优选包含水解酪蛋白和/或水解乳清蛋白、水解植 物蛋白和/或游离氨基酸，最优选水解乳清蛋白。使用这些蛋白质可进一步降低过敏反应。 使用这些水解蛋白质可有利地改善对饮食蛋白质组分的吸收。这对于婴儿和患病受试者尤 其有利。本发明的营养组合物优选包含，当意欲提供给成人受试者时，以总热量计5%至 6%的蛋白质，优选以总热量计15%至40%的蛋白质；并且当意欲提供给婴儿时，优选以总 热量计5%至15%的蛋白质，更优选以总热量计7. 5%至12. 5%的蛋白质。为基于总热量计算<%蛋白质，需要考虑由蛋白质、多肽和氨基酸提供的总能量。可以将可消化性碳水化合物源加入到所述营养配方中。可使用任何合适可消化性 碳水化合物(源)，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、固态玉米糖浆和麦芽糊精，以及上述物质 的混合物。因此，本发明营养混合物优选包含以总热量计15%至90%的碳水化合物，更优 选以总热量计25%至75%的碳水化合物，更优选以总热量计40%至55%的碳水化合物。本发明的营养组合物优选为液体形式。它优选具有限定的粘度。已经发现本发明 的方法可提供粘度足够低的液体营养物这样它可被用作例如液体婴儿食品和液体病人食 品，所述食品可通过奶嘴、管或吸管来喂食，同时保持低粘度。在一个优选的实施方案中，本 发明的组合物在20°C下并且在IOOiT1剪切速率下的粘度低于600mPa. s，优选低于250mPas， 更优选低于60mPa. s，甚至更优选低于35mPa. s，最优选低于6mPa. s。所有在本文中使用 的术语粘度是指通过下述方法确定的物理参数所述粘度可使用Carri-Med CSL流变仪 (Carri-Med CSLrheometer)测定。使用的几何结构为圆锥形(6cm 2度丙烯酸树脂锥(6cm 2deg acrylic cone))，将盘和几何结构之间的空隙设定为55um。将0至150s—1的线性连 续斜剪切速率(ramp shear rate)应用20秒。应注意，本发明还涵盖粉末形式的组合物， 并配备用于制备水溶液的说明书，例如通过以某一比例加入水中，仁厚形成指定的粘性。大便不规律(例如便硬(Hard stools)、大便量不足(insufficientstool volume)、腹泻)在很多婴儿和接受流食的患病受试者中是一个主要问题。已经发现大 便问题可通过给予液体食品形式的本发明的制品来减少，所述制品的重量渗透摩尔浓度 (osmolality)为 50 至 500m0sm/kg，更优选 100 至 400m0sm/kgo鉴于上述，还重要的是，所述液体食品不具有过多的热量密度，但仍可提供足够的 热量来供给受试者。因此，所述液体食品优选具有0. 1至2. 5kcal/ml的热量密度，甚至更 优选0. 5至1. 5kcal/ml的热量密度。当用作婴儿配方时，所述热量密度最优选为0. 6至 0.8kcal/ml。^M已经发现通过本发明的方法得到的本发明的制品可协同地减少细菌移位和/或 降低肠道通透性。本发明的制品可有利地用于治疗和/或预防疾病，因而本发明涉及一种用于治疗 和/或预防哺乳动物疾病的方法，所述方法包括将本发明制品给予所述哺乳动物。换言之， 本发明还涉及本发明的制品用于制备用于治疗和/或预防疾病的组合物，优选营养组合物 的用途。换言之，本发明涉及一种含有用于治疗和/或预防疾病的本发明制品的制品或营 养组合物。所述哺乳动物优选是人，甚至更优选为人婴儿。因此，本发明还涉及本发明的制 品用于制备用于治疗和/或预防婴儿疾病的组合物，优选营养组合物的用途。或者换言之， 本发明涉及含有本发明制品的用于治疗和/或预防婴儿疾病的制品或营养组合物。在本发明的文本中，婴儿是年龄0至6岁，优选年龄0至4岁，优选年龄0至2岁， 优选年龄0至1岁。本发明还涉及一种为婴儿提供营养物的方法，所述方法包括为所述婴儿提供本发 明的制品或营养组合物。换言之，本发明还涉及本发明的制品用于制备为婴儿提供营养的 营养组合物的用途。换言之，本发明涉及一种含有本发明制品的用于为婴儿提供营养物的 制品或营养组合物。
已经发现本发明的制品可减少细菌从肠道穿过肠道屏障的移位。这种移位 可能是细胞旁(paracellular)移位，例如通过紧密连接(tightjunctions)，或是跨细 胞(transcellular)移位，例如使用(条件)致病细菌时观察到的细菌移位。本发明 制品因此可有利地用于治疗和/或预防细菌移位，特别是致病菌和条件致病菌例如大 肠杆菌(E.coli)，属于沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Siigella)、弯曲杆菌属 (CampylcAacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和利斯特氏菌属(Listeria)、铜绿假单胞 菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、肠杆 菌属(EntercAacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)的种，更优选假单胞菌属和沙门氏菌 属。条件致病菌是不入侵正常健康受试者，但遇到免疫系统受到抑制或受损或者肠道屏障 受损的受试者时则变为致病菌的细菌。免疫系统受损的受试者的实例有中性粒细胞减少 肿瘤(neutropenic oncology)患者、囊性纤维病(cystic fibrosis)患者、艾滋病患者 和HIV感染者。肠道屏障受损的受试者的实例有烧伤患者、出血性休克患者和危重病患者 (critically ill patients)。研究所述制品对肠道屏障功能和/或成熟的合适模型系统包括肠上皮细胞的 transwell单层、使用培养的肠上皮细胞或肠上皮组织的尤斯室(Ussing chambers)和 动物模型。在这样的模型中，可测定transwell电经上皮电阻(transwell electrical transepithelial electricalresistance)或者分子的移位和/或细菌的移位。实施 例1中公开了一种合适的动物模型。另一个合适的动物模型公开于Koh et al,2005, Infection&Immunity 73 :2262-2272本发明的制品适合用于治疗和/或预防感染。本发明的制品可有利地用于治疗 和/或预防肠道感染、全身感染和/或呼吸道感染，特别是由致病菌或条件致病菌引起的感 染。本发明的制品适合用于治疗和/或预防腹泻，特别是由致病菌或条件致病菌引起的腹 泻。在本发明的文本中，“预防”疾病或某种病症也是指“对处于疾病或某种病症风险 的患者进行治疗”。已经发现本发明制品可减少细菌从肠道穿越肠道屏障进行移位。因此，本发明的 制品适合用于改善肠道屏障功能，用于增进肠道屏障成熟和/或降低肠道屏障通透性。因 此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的制品用于制备用于改善肠道屏障功能、增进肠 道屏障成熟和/或降低肠道屏障通透性的组合物的用途。换言之，本发明涉及的本发明的 制品用于改善肠道屏障功能、增进肠道屏障成熟和/或降低肠道屏障通透性。肠道屏障功 能的改善、肠道屏障成熟的增进和/或肠道屏障通透性的降低优选地向母乳喂养的健康婴 儿中观察到的水平变化。实施例1 以产乳酸菌和非消化性碳水化合物孵育的源自乳的产物对感染的增强 效应雄性BALB/c小鼠，每组η = 25并且年龄3_4周、不受限(at lib)如下饮食4周。1与婴儿乳配方feillia Apaisia 1以1 1 (w/w)混合的AIN-93 (平衡的半合成 啮齿云力物食品(balanced semi-synthetic rodent chow))。Apaisia 1 是一种市售的含有 孵育的水性底物(含有乳、乳蛋白质、乳清、乳清蛋白和/或乳糖)的IMF，所述孵育的水性 底物是通过分别与嗜热链球菌CNCM-1620和短双歧杆菌CNCM 1-2219孵育得到。在这种制品中，在步骤a)和d)中得到的嗜热链球菌和短双歧杆菌孵育混合物分别在孵育步骤(步 骤b)和e)后被立即加热杀死。以IMF干重计，与短双歧杆菌孵育的水性底物混合物的终 含量是约16重量％。2与婴儿乳配方feillia Apaisia 1以1 1 (w/w)混合的AIN-93 (平衡的半合成啮 齿动物食品)，其中加入以干重计2重量％非消化性碳水化合物(GF)混合物(步骤d)，所述 组合物含有w/w/比例为9 1的反式低聚半乳糖(来源=Vivinal G0S)和菊糖(Raftilin HP)。GF在鼠饮食中终浓度为1重量％。3AIN_93(平衡的半合成啮齿动物食品)，其中加入了脂肪和乳糖以使脂肪和乳糖 的含量与饮食1和2中的相同。表1示出了测试的饮食的组成。所有饮食中的碳水化合物、乳糖、脂肪、蛋白质和 纤维的量是相当的。表1 测试的饮食的组成
饮食TOS 菊糖 9 lw/w生物转化产物1+21重量％+3然后，经口填喂肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis) LMG22715 (0. 2ml 缓冲物 中2X105cfu/鼠)引入沙门氏菌感染。在感染6天后处死小鼠，将细菌向器官的移位作为 主要测量参数。在感染期间饮食方案不变。还测量了疾病打分。所述疾病打分是一种基于 体重减轻、活动性、警觉性和皮毛状况的疾病指标。结果在引入感染之前的时间段内，所有组的食物摄取和生长情况是相当的。表2示出了一般健康和细菌向不同器官的移位(BT)的结果。由于另外存在GFJi 2中的疾病打分和细菌向肝脏和脾脏移位比组1的低。由于GF，组2中向肝脏、脾脏、肺和 肾脏的BT对数值比组1低。表2 在34天时的疾病打分和细菌移位(以对数表示的每g组织中的cfu对数)。
18
权利要求
1.一种制造制品的方法，包括步骤a 将水性底物与双歧杆菌(bifidobacteria)孵育以得到孵育混合物，其中所述水性 底物包含选自下列物质的至少一种乳、乳蛋白质、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪 蛋白水解产物和乳糖；b 通过加热所述孵育混合物来灭活所述双歧杆菌，并且/或者通过离心和/或过滤来 从所述孵育混合物中除去所述双歧杆菌；c 将含有步骤a得到的或步骤b得到的混合物一优选步骤b得到的混合物一的组 合物与至少两种不同的非消化性碳水化合物结合，其中所述非消化性碳水化合物的至少一 种，优选两种，选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚阿拉伯糖、低聚甘露聚糖、低聚 木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉伯半乳聚糖、低聚葡糖甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、棉子糖、 乳蔗糖、含有低聚糖和糖醛酸低聚糖的唾液酸。
2.权利要求1的方法，其中所述双歧杆菌属于短双歧杆菌种(speciesB.breve)，优选 短双歧杆菌CNCM 1-2219。
3.前述权利要求任一项的方法，还包括以下步骤d:将底物与嗜热链球菌(Str印tococcus thermophilus)孵育，优选嗜热链球菌株系 CNCM 1-1620或CNCM 1_1470，以得到孵育混合物，其中所述底物选自乳、乳蛋白质、乳清、乳 清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物和乳糖；和e 通过将步骤d的孵育混合物加热来灭活嗜热链球菌和/或通过离心和/或过滤来从 步骤e的孵育混合物中除去嗜热链球菌细胞，f 将从步骤d或e，优选步骤d，得到的孵育混合物与从步骤a、b或c，优选步骤a，得到 的孵育混合物结合。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述非消化性碳水化合物至少一种，优选至少两 种，选自低聚半乳糖和低聚果糖。
5.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b后的制品包含以每g所述制品干重计少于 IO3Cfu的活双歧杆菌。
6.前述权利要求任一项的方法，还包括一个干燥步骤。
7.前述权利要求任一项的方法，其中在步骤c中仅加入一种非消化性碳水化合物，所 述非消化性碳水化合物是低聚果糖。
8.可通过前述权利要求任一项的方法得到的制品。
9.含有权利要求8的制品或由权利要求8的制品组成的营养组合物。
10.权利要求9的组合物，包含以每IOOg所述组合物干重计0.5至IOg非消化性碳水 化合物。
11.婴儿营养物，包含以所述婴儿营养物干重计a)总和为0.5至10重量％的低聚半乳糖和低聚果糖，和b)5至99.5重量％的在权利要求1至5任一项步骤b后得到的制品，其中步骤a中的 双歧杆菌属于短双歧杆菌种，c)和任选的2至94.5重量％的在权利要求3至6任一项步骤e后得到的制品。
12.权利要求9-11的任一项的组合物，用于为婴儿提供营养物。
13.权利要求9-12的任一项的组合物，用于治疗和/或预防疾病。
14.权利要求8-13的任一项的组合物或制品，用于治疗和/或预防感染和/或腹泻。
15.权利要求8-14的任一项的组合物或制品，用于治疗和/或预防细菌移位。
16.权利要求8-14的任一项的组合物或制品，用于改善肠道屏障功能、增进肠道屏障 成熟和/或降低肠道屏障通透性。
全文摘要
一种营养组合物，包含非消化性碳水化合物与通过孵育水性底物和双歧杆菌所得到的制品，以及任选的通过孵育水性底物和嗜热链球菌所得到的制品的结合物。所述结合物可减少细菌移位并改善肠道屏障功能。
文档编号A61K31/733GK102065867SQ200980122242
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者C·J·P·凡林波特, F·里克罗伊科斯, J·科诺尔, V·皮泰 申请人:N.V.努特里奇亚
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