改善肠微生物群的益生菌的制作方法
专利名称：改善肠微生物群的益生菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及向没有同胞的婴儿施用能促进早期双歧杆菌促进性(bifidogenic) 肠微生物区系的益生菌。
背景技术：
认为即将出生前的婴儿的胃肠道是无菌的。在正常出生过程中，其遇到来自母 亲消化道、皮肤和母体环境的细菌并且这些细菌开始建群。2-4周龄的、健康的、自然分 娩的、母乳喂养的婴儿的粪便微生物群可作为该年龄组的最佳微生物群，其中双歧杆菌属 (Bifidobacteria)菌种占有优势地位，带有一些乳杆菌属(LactcAacilli)菌种和更少量 的拟杆菌属(Bacteroides)菌种诸如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，而没有潜在病 原体诸如梭菌属(Clostridia)。在大约2岁完成断奶后，开始建立与成人模式相似的肠微 生物群模式。应当注意的是，在健康的、自然分娩的、母乳喂养的婴儿中，双歧杆菌占婴儿肠道 总细菌的60-90%，形成微生物群的基础。母乳喂养还促进肠道屏障的发展，其与占主导的 双歧杆菌一起使得吸收增强，从而利用摄取的营养。Penders等人研究了广泛范围的外界影响对婴儿早期肠微生物群的组成的影响。 他们鉴定了作为微生物群组成最重要的决定因素的分娩模式、婴儿喂养的类型、孕龄、婴儿 住院治疗和婴儿的抗生素使用，尤其提及了与母乳喂养的婴儿相比只用配方奶粉喂养的 婴儿更常定植大肠杆菌、艰难梭菌(C. difficile)、拟杆菌属(Bacteroides)和乳杆菌属， 且还提及与没有同胞的婴儿相比有年长同胞的婴儿具有略高量的双歧杆菌(Penders等 人，"Factors Influencing the Composition of the Intestinal Microbiota in Early Infancy (影响婴儿早期肠内微生物群的组成的因素)”，Pediatrics第118卷，第2期，2006 年8月)。这种同胞的影响被假定为生命早期感染的标志。更近以来，在对瑞典、意大利和英国的婴儿的微生物群和特应性湿疹的发展的大 规模研究中，Adlerberth等人提出没有同胞的婴儿(S卩，头胎的或唯一的婴儿)的建群模式 与剖腹生产的婴儿相似(Adlerberth等人，"gut microbiota and development of atopic eczema in 3 European birth cohorts (3组欧洲出生群组中的肠微生物群和特应性湿疹的 发展)”，J. Allergy Clin. Immunol. 2007 ；120 :343-350)。“同胞效应”还显示在特应性皮炎的发病率中。例如，Koppelman等人使用多重回 归分析显示具有年长同胞与特应性逆相关(Koppelman等人，“Sibling effect on atopy in children of patients with asthma(关于儿童哮喘患者中特应性的同胞效应)”， Clin. Exp. Allergy, 2003 ；33 :170-175)。其它的研究也显示了哮喘和哮鸣的同胞效应 (Crane 等人，“Asthma and having siblings (哮喘和具有同胞)” BMJ，1994 ;309 :272, Bennis 等人,“The prevalence of adolescent asthma in Rabat. A study conducted in secondary schools (拉巴特的青少年哮喘的流行。在中学中进行的一项研究)” Rev. Mal. Respir. 1992；9 :163-169)。更近以来，Gibbs等人还观测到随出生顺序增加特应性皮炎发生降低(Gibbs等
4Α "Atopic dermatitis and the hygiene hypothesis -.a case-control study (特应j"生 皮炎和卫生学假设理论一项病例对照研究)Int. J. Epidemio. 2004 ；33 =199-207)。该现 象被认为可能与头胎婴儿中较低的感染发生率有关。然而，感染措施均未降低特应性皮炎 的可能性，意味着较年轻同胞中特应性的发生率的降低不能明确地通过较高的感染发生率 而解释。对所有的婴儿都推荐母乳喂养。然而，在一些情况下由于医学原因母乳喂养不充 足或不成功或者母亲选择不进行母乳喂养。为这些情况开发了婴儿配方产品。最近，某些细菌菌株引起了大量关注，因为已经发现如果将其摄取后，其展 现出对人有价值的性质。具体而言，已发现乳杆菌属(LactcAacilli)和双歧杆菌属 (Bifidobacteria)的特定的菌株能够建群于肠，以减少致病菌附着肠上皮的能力，从而具 有免疫调节作用并帮助保持健康。此类细菌有时被称为益生菌，且已经提出将益生菌加入 婴儿配方产品中。为鉴别新的益生菌菌株已进行了大量的研究。例如，EP 0 199 535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903和WO 00/53200公开了乳杆菌属和双歧杆菌属的特定菌
株及其有益的作用。肠微生物群在将不消化的寡糖和多糖水解为可吸收的单糖的过程中以及通过直 接作用于绒毛上皮而活化脂蛋白酯酶的过程中发挥重要作用。此外，最经已经证明人乳不 仅含有寡糖，还含有双歧杆菌。同时，基因组研究已经令人信服地显示了存在于母乳喂养的 婴儿的肠道中的双歧杆菌诸如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是特别为利用母乳 寡糖作为营养素而准备的。长双歧杆菌也适合大肠中的条件，在大肠中从可缓慢吸收的碳 水化合物中进行能量吸收。简而言之，越来越多出现的证据表明生命早期适合的肠微生物群的建立对之后的 健康发展可能有重要意义。因此明确地是，需要提供在婴儿中促进快速建立适合的肠微生 物群的方法，其在所述婴儿中不会因为任何原因自然发生。发明概述如上文所提及，对于婴儿，最佳的肠微生物群包括60-90%的双歧杆菌、主要是短 双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)和长双 歧杆菌。本发明人令人惊奇地发现施用益生菌(包括但不必定限于以上提及的双歧杆菌属 菌种)在有需要的婴儿(例如没有同胞的婴儿)中促进早期双歧杆菌促进性肠微生物群的发展。因此，本发明提供了益生菌在制备用于促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促 进性肠微生物群的发展的药物或治疗性营养组合物中的应用。本发明还提供了益生菌在制备用于降低没有同胞的婴儿中后来出现变态反应和/ 或哮喘的风险的药物或治疗性营养组合物中的应用。在另一个方面，本发明提供了益生菌在制备用于预防或治疗没有同胞的婴儿中病 原性感染的药物或治疗性营养组合物中的应用。本发明还涉及促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠微生物群发展的 方法，其包括向有需要的没有同胞的婴儿提供治疗量的益生菌。本发明还涉及降低没有同胞的婴儿中后来出现变态反应和/或哮喘的风险的方法，其包括向有需要的没有同胞的婴儿提供治疗量的益生菌。不希望受理论束缚，本发明人相信向没有同胞的婴儿施用益生菌以一些尚未被完 全理解的方式促使婴儿的胃肠道准备好，以有利于之后的通常在健康、自然分娩的婴儿的 消化道中发现的那些双歧杆菌属菌种的建群。应当注意的是促进所述益生的菌种的建群既 不是所述施用的目的也不是其作用，而是为了促进其它种类益生菌的建群，以达到与在健 康、母乳喂养、自然分娩的有同胞婴儿中所发现的相当的早期双歧杆菌促进性肠微生物群。 接着，所述对双歧杆菌的促进导致对病原性感染诸如轮状病毒腹泻的抵抗以及免疫系统的 发展，因而降低之后出现过敏性症状的风险(如例如由特应性皮炎或哮喘所显示的那样)。发明详述在本说明书中，下列术语具有以下含义“早期双歧杆菌促进性肠微生物群”是指至多12月龄的婴儿的肠微生物群，其中双 歧杆菌属占优势地位，诸如短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌，并排除诸如梭菌属和 链球菌属(Streptococci)的菌种的可估计的菌群，所述肠微生物群与在同龄的自然分娩、 母乳喂养的婴儿中发现的肠微生物群总体上相当。“婴儿”是指12月龄以下的儿童；“没有同胞的婴儿”是指头胎的或唯一的婴儿或者仅与成人一起生活的婴儿。“益生元”是指一种不可消化的食品成分，其通过选择性刺激一种或有限数量的 细菌在结肠中的生长和/或活性来对宿主产生有益影响，从而改善宿主健康(Gibson和 Roberfroid"Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept of Prebiotics (人结肠微生物菌群的膳食调节引介益生元概念)”J. Nutr 125 1401-1412)。“益生菌”是指是对宿主健康或保持良好状态具有有益作用的微生物细胞制剂或 微生物细胞组分(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人，“Probiotics :how should they be defined (益生菌它们应当如何定义)”Trends Food Sci. Technol. 1999 :10 107-10)。“N-乙酰化的寡糖”是指具有N-乙酰基的寡糖；“寡糖”是指聚合度(DP)为2至20的碳水化合物，其包括端值，但不包括乳糖；“唾液酸化的寡糖”是指具有带有相关电荷的唾液酸残基的寡糖。除非另有说明，否则所有提及的百分比为以重量计的百分比。益生菌可以是任何具有确定的益生特性的乳酸菌或双歧杆菌，其能够促进早期双 歧杆菌促进性肠微生物群的发展。合适的益生性乳酸菌包括鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)ATCC 53103，其例如可以以LGG商品名从芬兰的Valio Oy获得，还包括鼠李糖 乳杆菌 CGMCC 1. 3724、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC 55730 和罗伊乳杆菌 DSM 17938(从 Biogaia 获得)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) CNCM 1-2116。合适的益生性双歧杆菌菌株包括婴儿双岐杆菌35624、由日本的Morinaga Milk Industry有限公司以商品名BB536出售的长双歧杆菌ATCC BAA-999、由Danisco以商品名 Bb-03出售的短双歧杆菌菌株、由Morinaga以商品名M-16V出售的短双歧杆菌菌株、和由 Institut Rosell (Lallemand)以商品名R0070出售的短双歧杆菌菌株。特别优选的益生菌 为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CNCM 1-3446，例如由丹麦的 Christian Hansen 公司以商品名恥12出售。可以使用合适的益生性乳酸菌和双歧杆菌的混合物。
合适的益生菌的每日剂量是10e3至IOell集落形成单位(cfu)，更优选的是10e7 至 IOelOcfUo优选在分娩刚结束后及其后的婴儿生命的至少最初两个月向婴儿施用益生菌。更 优选继续施用益生菌直至婴儿年龄达6个月。优选乳双歧杆菌CNCM 1-3446与益生元共同施用。适合的益生元包括某些寡糖， 诸如低聚果糖(FOS)和半乳寡糖(GOS)。可以使用益生元的组合，诸如90% GOS与10%短 链低聚果糖(诸如商品名为Beneo P95的产品)或与10%菊粉(诸如商品名为Beneo丨 HP、ST或HSI的产品)。特别优选的益生元是寡糖混合物，其包含5-70wt%的至少一种选自GalNAc α 1， 3Gal β l，4Glc 禾口 Gal β l，6GalNAca l,3Gal β l，4Glc 的 N-乙酰化的寡糖、20_90wt % 的至 少一种选自 Gal β l，6Gal、Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Glc、Gal β l，3Gal β 1， 3Glc、Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β 1， 4Glc、Gal β l,3Gal β l,6Gal β l，4Glc 和 Gal β l,3Gal β l,3Gal β l，4Glc 的中性寡糖和
至少一种选自 NeuAca 2，3Gal3 l，4Glc 和 NeuAc α 2，6Gal β l，4Glc 的唾液酸化 的寡糖。所述寡糖混合物在W02007/090894中有更详尽的描述，其内容被引入本文作为参 考，且在下文被称为“上文所述的寡糖混合物”。适合的N-乙酰化的寡糖包括 GalNAc α l,3Gal β l，4GlcfPGal3 l，6GalNAca 1， 3Gal β l，4Glc。N-乙酰化的寡糖可通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰 基-葡萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用而制备。同样地，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和 /或N-乙酰基-糖基转移酶可用于该目的。N-乙酰化的寡糖还可使用相应的酶类(重组 体或天然的)通过发酵技术和/或微生物发酵制备。在后者的情况下微生物可表达其天然 的酶和底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混 合培养物。N-乙酰化的寡糖的形成能由始于从DP = 1起的任何聚合度(DP)的受体底物开 始。另一个选择是将己酮糖(例如果糖)(游离或与寡糖(例如乳果糖)结合)化学转换 为N-乙酰基己糖胺或包含寡糖的N-乙酰基己糖胺，如feodnigg，T.M. ；Stutz,A. Ε. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38 :827-828 中所描述。适合的半乳寡糖包括Gal β l，6Gal、Gal β l,6Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β 1， 6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、Gal β l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β l,6Gal β l，4Glc、 Gal β l,6Gal β l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,3Gal β l,6Gal β l,4Glc, Gal β l,3Gal β 1， 3Gal β l，4Glc、Gal β l，4Gal β l，4Glc 和 Gal β l，4Gal β l，4Gal β l，4Glc。合成的半乳寡 糖诸如 Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Glc、Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β 1， 6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc 禾口 Gal β l，3Gal β l，6Gal β 1， 4Glc、Gal β l，4Gal3 l，4Glc 禾口 Gal β l，4Gal3 l，4Gal3 1，4Glc 及其混合物可以以商品名 Vivinal 和 Elix，or 购得。寡糖的其它供应商有 Dextra Laboratories.Sigma-A 1 drich Chemie GmbH和Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd。或者，特定的糖基转移酶诸如半乳糖基转移 酶可用于制备中性寡糖。适合的唾液酸化的寡糖包括 NeuAc α 2，3Gal β 1，4Glc 和 NeuAc α 2，6Gal β 1， 4Glc。这些唾液酸化的寡糖可通过色谱或过滤技术由天然来源诸如动物乳中分离。或者， 其可通过生物技术使用特定的唾液酸转移酶经基于酶(重组体或天然酶)的发酵技术或经微生物发酵技术来制备。在后者的情况下微生物可表达其天然的酶和底物或可对其进行改 造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。唾液酸基-寡糖 的形成能由始于从DP = 1起的任何聚合度(DP)的受体底物开始。在一个实施方案中，营养组合物包含3. 0至12. 0%的寡糖混合物、更优选4. 0至 7.0%的寡糖混合物。在一个实施方案中，营养组合物包含至少0. 03wt %的N-乙酰化的寡糖、至少 3. Owt %的半乳寡糖和至少0. 08wt%的唾液酸化的寡糖，更优选至少0. (Mwt %的N-乙酰化 的寡糖、至少4. 0wt%的半乳寡糖和至少0. 09wt%的唾液酸化的寡糖。在本发明的一个实施方案中，配方产品会包含2. 5至15. 的寡糖混合物，其 由N-乙酰化的寡糖、半乳寡糖和唾液酸化的寡糖以以下的量组成至少0. 02wt%的N-乙 酰化的寡糖、至少2. Owt %的半乳寡糖和至少0. (Mwt %的唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰 化的寡糖占所述寡糖混合物的0. 5至4. 0%、所述半乳寡糖占所述寡糖混合物的92. 0至 98. 5%且所述唾液酸化的寡糖占所述寡糖混合物的1. 0至4. 0%。在本发明的一个实施方案中，上文所述的寡糖混合物包含10-70wt%的所详述的 N-乙酰化的寡糖、20-80wt %的所详述的中性寡糖和10-50wt %的所详述的唾液酸化的寡 糖。更优选所述混合物包含15-40wt%的N-乙酰化的寡糖、40-60wt%的其它中性寡糖和 15-30Wt%的唾液酸化的寡糖。特别优选的混合物包含30wt%的N-乙酰化的寡糖、50wt% 的中性寡糖和20wt%的唾液酸化的寡糖。或者，上文所述的寡糖混合物可适宜地包含5-20wt%的所详述的N-乙酰化的寡 糖、60-90wt%的所详述的中性寡糖和5-30wt%的所详述的唾液酸化的寡糖。上文所述的寡糖混合物可由一种或多种动物乳制备。所述乳可来自任何哺乳动 物，特别是来自奶牛、山羊、水牛、马、象、骆驼或绵羊。作为选择地，上文所述的寡糖混合物可通过购买和混合单独组分而制备。例如，合 成的半乳寡糖诸如 Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Glc，Gal β l，3Gal β l，4Glc， Gal β l，6Galβ l，6Galβ l，4Glc，Gal β l，6Galβ l，3Galβ l，4Glc 禾口 Gal β l，3Galβ 1， 6Gal β l,4Glc及其混合物可以以商品名Vivinal⑧和Elix’ or 购得。寡糖的其他的供 应商有 Dextra Laboratories、Sigma-Aldrich Chemie GmbH 禾口 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd。或者，特定的糖基转移酶，诸如半乳糖基转移酶可用于制备中性寡糖。N-乙酰化的寡糖可通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰基-葡 萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用而制备。同样地，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或 N-乙酰基-糖基转移酶可用于该目的。N-乙酰化的寡糖还可使用相应的酶类(重组体或天 然的)通过发酵技术和/或微生物发酵制备。在后者的情况下微生物可表达其天然的酶和 底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。 N-乙酰化的寡糖的形成能由始于从DP= 1起的任何聚合度(DP)的受体底物开始。另一个 选择是将己酮糖(例如果糖)(游离或与寡糖(例如乳果糖)结合)化学转换为N-乙酰基 己糖胺或包含寡糖的N-乙酰基己糖胺，如Wrodnigg, Τ. M. ；Stutz, Α. E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38 :827-828 中所描述。唾液酸化的寡糖3、唾液酸基-乳糖和6、唾液酸基-乳糖可通过色谱或过滤技术 由天然来源诸如动物乳中分离。或者，其可通过生物技术使用特定的唾液酸转移酶经基于酶的发酵技术(重组体或天然酶)或经微生物发酵技术来制备。在后者的情况下微生物可 表达其天然的酶和底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养 物和/或混合培养物。唾液酸基寡糖的形成能由始于从DP= 1起的任何聚合度(DP)的受 体底物开始。益生菌可直接施用于婴儿，或如果是母乳喂养时经由母亲施用。如果经由母亲施 用，益生菌可以以例如片剂、胶囊、锭剂、咀嚼胶或液体形式作为补充剂提供给母亲。所述补 充剂优选还包含上文所述的寡糖混合物，其量为10e3至IOellcfu/日。补充剂可另外包含 保护性水胶体(诸如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包胶剂/材料、壁/壳材料、 基质化合物、包衣剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、 填充剂、辅助化合物(co-compound)、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、味道掩蔽 剂、增重剂、成凝胶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗菌剂。补充剂还可包含常规的药物添加剂 和辅助剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑 石粉、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、矫味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲齐U、 润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。在所有情况下，所述另外的成分将考虑其对预期接受者 的适合性来选择。或者，益生菌可以以治疗性营养组合物的形式向哺乳的女性施用。该组合物可以 是营养完全的配方产品。根据本发明向泌乳女性施用的营养完全的配方产品可以包含蛋白质源。任何合适 的膳食蛋白质都可以施用，例如动物蛋白质(如乳蛋白质、肉蛋白质和卵蛋白质)、植物蛋 白质(如大豆蛋白质、小麦蛋白质、大米蛋白质和豌豆蛋白质)、游离氨基酸的混合物、或其 组合。乳蛋白质如酪蛋白和乳清，以及大豆蛋白质是特别优选的。组合物还可包含碳水化 合物源和脂肪源。如果配方产品除了 DHA之外还包含脂肪源，则脂肪源优选提供配方产品能量的 5%至40% ；例如能量的20%至30%。可使用芥花籽油、玉米油和高油酸向日葵油的混合 物得到合适的脂肪谱。可将碳水化合物源加入配方产品中。其优选提供配方产品能量的40%至80%。可 使用任何合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精及 其混合物。需要时也可加入膳食纤维。膳食纤维通过小肠而未被酶消化，是天然的膨胀剂 和轻泻剂。膳食纤维可以是可溶的或不溶的，通常，优选两种类型的混合物。合适的膳食纤 维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、低聚果糖和半乳寡糖。如果存在纤维， 则优选纤维含量在所消耗的配方产品的2和40g/l之间，更优选在4和10g/l之间。此外， 配方产品还优选以每升复原配方产品0. 2至5克的量包含上文所述的寡糖混合物、优选以 1至2g/l的量包含上文所述的寡糖混合物。根据政府机构如USRDA的建议，配方产品还可包含矿物质和微量营养素如微量元 素和维生素。例如，配方产品的每日剂量可包含一种或多种在所示范围的下列微量营养素 300 至 500mg 钙、50 至 IOOmg 镁、150 至 250mg 磷、5 至 20mg 铁、1 至 7mg 锌、0. 1 至 0. 3mg 铜、 50至200 μ g碘、5至15 μ g硒、1000至3000 μ g β胡萝卜素、10至80mg维生素C、1至^ig 维生素B1、0. 5至1. 5mg维生素B6、0. 5至^ig维生素B2、5至18mg烟酸、0. 5至2. 0 μ g维 生素B12、100至800 μ g叶酸、30至70 μ g生物素、1至5 μ g维生素D、3至IOIU维生素E。
需要时，可向配方产品中加入一种或多种食品级乳化剂；例如双乙酰酒石酸单甘 油酯和双乙酰酒石酸双甘油酯、卵磷脂和甘油单酯和甘油二酯。同样，可包括合适的盐和稳 定剂。配方产品优选经肠施用；例如以粉末的形式，用乳或水使其复原。或者，在非母乳喂养的婴儿的情况中，益生菌可作为补充剂施用，例如以IOelOcfu 的日剂量溶于水中并用勺施用。对于非母乳喂养的婴儿，益生菌可方便地以婴儿配方产品形式施用。根据本发明使用的婴儿配方产品可包含不超过2. 0g/100千卡、优选1.8至 2.0g/100千卡的量的蛋白质源。虽然优选以重量计50%以上的蛋白质源是乳清蛋白，但是 对于本发明，认为蛋白质的类型不是关键的，只要满足必需氨基酸含量的最低需求，并且保 证令人满意的生长即可。因此，可使用基于乳清、酪蛋白及其混合物的蛋白质源，以及基于 大豆的蛋白质源。至于乳清蛋白质，该蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或其混合物，并且可 以以任何需要的比例包含α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。蛋白质可以是完整的蛋白质或经水解的蛋白质，或完整的和经水解的蛋白质的混 合物。可能希望提供部分水解的蛋白质(水解程度在2和20%之间)，例如对于认为有发生 牛奶变态反应危险的婴儿而言如此。如果需要经水解的蛋白质，则根据需要和根据本领域 所已知的进行水解操作。例如，可通过在一个或多个步骤中酶促水解乳清片段来制备乳清 蛋白水解物。如果用作起始材料的乳清片段基本上不含乳糖，那么发现该蛋白质在水解过 程中受到较少的赖氨酸阻断。这使得赖氨酸阻断的程度能够从以总赖氨酸的重量计约15% 减少至以赖氨酸重量计少于约10%;例如以赖氨酸重量计约7%，这极大地提高了蛋白质源 的营养价值。婴儿配方产品可包含碳水化合物源。尽管优选的碳水化合物源是乳糖，但是可以 使用在婴儿配方产品中常规存在的任何碳水化合物源如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉及其 混合物。优选地，碳水化合物源提供配方产品总能量的35至65%。婴儿配方产品可包含脂质源。脂质源可以是适合用于婴儿配方产品的任何脂质 或脂肪。优选的脂肪源包括棕榈油酸甘油酯、高油酸向日葵油和高油酸红花油。也可加入 必需脂肪酸亚油酸和α -亚麻酸，同样可加入少量的包含大量预制的花生四烯酸和二十二 碳六烯酸的油，诸如鱼油或微生物油。总之，脂肪含量优选诸如贡献配方产品总能量的30 至55%。脂肪源优选η-6比η-3脂肪酸的比率为约5 1至约15 1，例如约8 1至约 10 1。婴儿配方产品也可包含认为在日常饮食中是必需的所有维生素和矿物质，并且以 营养显著的量包含之。已确定了某些维生素和矿物质的最小需要量。任选存在于婴儿配方 产品中的矿物质、维生素和其他营养素的实例包括维生素Α、维生素Bi、维生素Β2、维生素 Β6、维生素Β12、维生素Ε、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆 碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉碱。通常以盐的形 式加入矿物质。特定矿物质和其他维生素的存在和量将根据预期婴儿群体而变化。优选地，婴儿配方产品会以每升复原配方产品0. 2至5克的量包含上文所述的寡 糖混合物、优选1至2g/l的量包含上文所述的寡糖混合物。婴儿配方产品可任选包含具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。上述婴儿配方产品和营养配方产品都可以以任何合适的方法制备。例如，它们可 通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适当的比例混合在一起来制备。如果使用，则可 在此时加入乳化剂。可在此时加入维生素和矿物质，但通常稍后加入以避免热降解。可在 混合之前将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶解入脂肪源。然后可混入水、优选已进行反渗透 的水，来形成液体混合物。水的温度通常是约50°C到约80°C，以帮助成分分散。可使用商 购可得的液化器来形成液体混合物。然后均质化液体混合物；例如分两个阶段进行。然后可热处理液体混合物以减少细菌的载量，例如，可将该液体混合物快速加热 至约80°C至约150°C范围内的温度，处理约5秒至约5分钟。这可通过蒸汽注射、高压釜或 通过换热器进行；例如板式换热器。然后可将液体混合物冷却至约60°C至约85°C ；例如通过瞬时冷却。然后可再次均 质化液体混合物；例如分两个阶段，在第一阶段约IOMPa至约30Mpa，在第二阶段约2MPa至 约lOMpa。然后进一步冷却均质化的混合物以加入任何热敏成分；诸如维生素和矿物质。此 时方便地调整均质化混合物的PH和固体含量。将均质化的混合物转移至合适的干燥装置例如喷雾干燥器或冷冻干燥器，将其转 变为粉末。粉末应当具有低于以重量计约5%的含水量。所选择的益生菌可根据任何合适的方法培养，并通过例如冷冻干燥或喷雾干燥 制备以用于加入营养或婴儿配方产品。或者，可从专业供应商例如Christian Hansen和 Valio购买已经以用于加入至食品例如营养和婴儿配方产品的适合形式制备的细菌制品。 益生菌可以以10e3至10el2cfu/g粉末、更优选10e7至10el2cfu/g的量加入配方产品。本发明参照下面的实施例进一步说明实施例1适合的本发明中使用的婴儿配方产品的组成的实例如下。
营养每 IOOkcal每升能量(kcal)100670蛋白质(g)1. 8312. 3脂肪(g)5. 335. 7亚油酸(g)0. 795. 3α -亚麻酸(mg)101675乳糖ω11. 274. 7矿物质0. 372. 5Na (mg)23150
1权利要求
1.益生菌在制备用于促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠微生物群的发 展的药物或治疗性营养组合物中的应用。
2.益生菌在制备用于降低没有同胞的婴儿中后来出现变态反应的风险的药物或治疗 性营养组合物中的应用。
3.益生菌在制备用于预防或治疗没有同胞的婴儿中病原性感染的药物或治疗性营养 组合物中的应用。
4.权利要求3的应用，其中病原性感染是轮状病毒腹泻。
5.前述权利要求中任意一项的应用，其中益生菌是乳酸菌。
6.权利要求5的应用，其中乳酸菌包括鼠李糖乳杆菌ATCC53103、鼠李糖乳杆菌CGMCC 1. 3724、罗伊乳杆菌ATCC 55730、罗伊乳杆菌DSM 17938或副干酪乳杆菌CNCM 1-2116。
7.权利要求1至4中任意一项的的应用，其中益生菌是双歧杆菌。
8.权利要求7的应用，其中双歧杆菌包括乳双歧杆菌CNCM1-3446、长双歧杆菌ATCC BAA-999、短双歧杆菌菌株恥_03、短双歧杆菌菌株M-16V、婴儿双岐杆菌356 或短双歧杆 菌 R0070。
9.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物或治疗性营养组合物还包含寡糖混合 物，所述寡糖混合物包含5_70衬％的至少一种选自GalNAca l，3Gali3 l，4Glc和Gali^ 1， 6GalNAca l，3Gal3 l，4Glc 的 N-乙酰化的寡糖、20_90wt % 的至少一种选自 Gal β l，6Gal、 Gal β l,6Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β l，6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、Gal β l,3Gal β 1， 4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，3Gal β 1， 6Gal3 l，4Glc 禾口 Gal β l，3Gal3 l，3Gal3 l，4Glc 的中性寡糖和 5_50wt % 的至少一种选自 NeuAca 2，3Gal β l，4Glc 禾口 NeuAc α 2，6Gal β l，4Glc 的唾液酸化的寡糖。
10.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物或治疗性营养组合物还包含寡糖混 合物，所述寡糖混合物包含至少一种N-乙酰化的寡糖，且其中所述寡糖选自=GalNAca 1， 3Gal β l，4Glc、Gal β l，6GalNAca l,3Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal、Gal β l,6Gal β l，4Glc、 Gal β l,6Gal β l，6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、Gal β l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β 1， 6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，3Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β 1， 3Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，4Gal β l，4Glc 禾口 Gal β l，4Gal β l，4Gal β l，4Glc、 GalNAc α l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6GalNAca l,3Gal β l，4Glc、NeuAc α 2,3Gal β l，4Glc、 NeuAca 2,6Gal β l，4Glc、GalNAc α l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6GalNAca l,3Gal β l，4Glc、 Gal β l,6Gal, Gal β l,6Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β l，6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、 Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc、 Gal β l，3Galβ l，6Galβ l，4Glc、Galβ l，3Galβ l，3Galβ l，4Glc、Galβ l，4Galβ l，4Glc 和 Gal β l,4Gal β l,4Gal β 1，4Glc、NeuAc α 2，3Gal β 1，4Glc、NeuAc α 2，6Gal β l，4Glc 或其混 合物。
11.前述权利要求中任意一项的应用，其中组合物基于干物质包含2.5至15. 的 由N-乙酰化的寡糖、半乳寡糖和唾液酸化的寡糖组成的寡糖混合物，条件是所述组合物 包含至少0. 02wt%的N-乙酰化的寡糖、至少2. Owt%的半乳寡糖和至少0. 的唾液酸 化的寡糖并且所述N-乙酰化的寡糖占所述寡糖混合物的0. 5至4. 0%、所述半乳寡糖占所 述寡糖混合物的92. 0至98. 5%且所述唾液酸化的寡糖占所述寡糖混合物的1. 0至4. 0%。
12.前述权利要求中任意一项的组合物，其包含至少0.03wt%的N-乙酰化的寡糖、至 少3. Owt%的半乳寡糖和至少0. 08wt%的唾液酸化的寡糖。
13.前述权利要求中任意一项的组合物，其包含至少0.的N-乙酰化的寡糖、至 少4. Owt%的半乳寡糖和至少0. 09wt%的唾液酸化的寡糖。
14.前述权利要求中任意一项的应用，其中寡糖混合物包含10-70wt%的N-乙酰化的 寡糖、20-80wt %的中性寡糖和10-50wt %的唾液酸化的寡糖。
15.前述权利要求中任意一项的应用，其中寡糖混合物包含15-40wt%的N-乙酰化的 寡糖、40-60Wt%的中性寡糖和15-30Wt%的唾液酸化的寡糖。
16.前述权利要求中任意一项的应用，其中寡糖混合物包含5-20wt%的N-乙酰化的寡 糖、60-90wt %的中性寡糖和5-30wt %的唾液酸化的寡糖。
17.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物或治疗性营养组合物在分娩刚结束后 及其后的至少两个月向婴儿施用。
18.前述权利要求中任意一项的应用，其中在分娩后向婴儿施用所述药物或治疗性营 养组合物至少6个月。
19.前述权利要求中任意一项的应用，其中将益生菌经由母乳喂养的母亲施用于婴儿。
20.前述权利要求中任意一项的应用，其中治疗性营养组合物为婴儿配方产品。
21.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物的每日剂量包含10e5至IOellcfu的益 生菌。
22.前述权利要求中任意一项的应用，其中治疗性营养组合物包含10e3至10el2cfu的 益生菌/g组合物(干重)。
全文摘要
本发明涉及益生菌在制备用于促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠微生物群的发展的药物或治疗性营养组合物中的应用。
文档编号A61K35/74GK102065872SQ200980123923
公开日2011年5月18日 申请日期2009年5月12日 优先权日2008年5月27日
发明者F·罗沙, M-C·菲绍 申请人:雀巢产品技术援助有限公司
技术领域：
本发明涉及向没有同胞的婴儿施用能促进早期双歧杆菌促进性(bifidogenic) 肠微生物区系的益生菌。
背景技术：
认为即将出生前的婴儿的胃肠道是无菌的。在正常出生过程中，其遇到来自母 亲消化道、皮肤和母体环境的细菌并且这些细菌开始建群。2-4周龄的、健康的、自然分 娩的、母乳喂养的婴儿的粪便微生物群可作为该年龄组的最佳微生物群，其中双歧杆菌属 (Bifidobacteria)菌种占有优势地位，带有一些乳杆菌属(LactcAacilli)菌种和更少量 的拟杆菌属(Bacteroides)菌种诸如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，而没有潜在病 原体诸如梭菌属(Clostridia)。在大约2岁完成断奶后，开始建立与成人模式相似的肠微 生物群模式。应当注意的是，在健康的、自然分娩的、母乳喂养的婴儿中，双歧杆菌占婴儿肠道 总细菌的60-90%，形成微生物群的基础。母乳喂养还促进肠道屏障的发展，其与占主导的 双歧杆菌一起使得吸收增强，从而利用摄取的营养。Penders等人研究了广泛范围的外界影响对婴儿早期肠微生物群的组成的影响。 他们鉴定了作为微生物群组成最重要的决定因素的分娩模式、婴儿喂养的类型、孕龄、婴儿 住院治疗和婴儿的抗生素使用，尤其提及了与母乳喂养的婴儿相比只用配方奶粉喂养的 婴儿更常定植大肠杆菌、艰难梭菌(C. difficile)、拟杆菌属(Bacteroides)和乳杆菌属， 且还提及与没有同胞的婴儿相比有年长同胞的婴儿具有略高量的双歧杆菌(Penders等 人，"Factors Influencing the Composition of the Intestinal Microbiota in Early Infancy (影响婴儿早期肠内微生物群的组成的因素)”，Pediatrics第118卷，第2期，2006 年8月)。这种同胞的影响被假定为生命早期感染的标志。更近以来，在对瑞典、意大利和英国的婴儿的微生物群和特应性湿疹的发展的大 规模研究中，Adlerberth等人提出没有同胞的婴儿(S卩，头胎的或唯一的婴儿)的建群模式 与剖腹生产的婴儿相似(Adlerberth等人，"gut microbiota and development of atopic eczema in 3 European birth cohorts (3组欧洲出生群组中的肠微生物群和特应性湿疹的 发展)”，J. Allergy Clin. Immunol. 2007 ；120 :343-350)。“同胞效应”还显示在特应性皮炎的发病率中。例如，Koppelman等人使用多重回 归分析显示具有年长同胞与特应性逆相关(Koppelman等人，“Sibling effect on atopy in children of patients with asthma(关于儿童哮喘患者中特应性的同胞效应)”， Clin. Exp. Allergy, 2003 ；33 :170-175)。其它的研究也显示了哮喘和哮鸣的同胞效应 (Crane 等人，“Asthma and having siblings (哮喘和具有同胞)” BMJ，1994 ;309 :272, Bennis 等人,“The prevalence of adolescent asthma in Rabat. A study conducted in secondary schools (拉巴特的青少年哮喘的流行。在中学中进行的一项研究)” Rev. Mal. Respir. 1992；9 :163-169)。更近以来，Gibbs等人还观测到随出生顺序增加特应性皮炎发生降低(Gibbs等
4Α "Atopic dermatitis and the hygiene hypothesis -.a case-control study (特应j"生 皮炎和卫生学假设理论一项病例对照研究)Int. J. Epidemio. 2004 ；33 =199-207)。该现 象被认为可能与头胎婴儿中较低的感染发生率有关。然而，感染措施均未降低特应性皮炎 的可能性，意味着较年轻同胞中特应性的发生率的降低不能明确地通过较高的感染发生率 而解释。对所有的婴儿都推荐母乳喂养。然而，在一些情况下由于医学原因母乳喂养不充 足或不成功或者母亲选择不进行母乳喂养。为这些情况开发了婴儿配方产品。最近，某些细菌菌株引起了大量关注，因为已经发现如果将其摄取后，其展 现出对人有价值的性质。具体而言，已发现乳杆菌属(LactcAacilli)和双歧杆菌属 (Bifidobacteria)的特定的菌株能够建群于肠，以减少致病菌附着肠上皮的能力，从而具 有免疫调节作用并帮助保持健康。此类细菌有时被称为益生菌，且已经提出将益生菌加入 婴儿配方产品中。为鉴别新的益生菌菌株已进行了大量的研究。例如，EP 0 199 535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903和WO 00/53200公开了乳杆菌属和双歧杆菌属的特定菌
株及其有益的作用。肠微生物群在将不消化的寡糖和多糖水解为可吸收的单糖的过程中以及通过直 接作用于绒毛上皮而活化脂蛋白酯酶的过程中发挥重要作用。此外，最经已经证明人乳不 仅含有寡糖，还含有双歧杆菌。同时，基因组研究已经令人信服地显示了存在于母乳喂养的 婴儿的肠道中的双歧杆菌诸如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是特别为利用母乳 寡糖作为营养素而准备的。长双歧杆菌也适合大肠中的条件，在大肠中从可缓慢吸收的碳 水化合物中进行能量吸收。简而言之，越来越多出现的证据表明生命早期适合的肠微生物群的建立对之后的 健康发展可能有重要意义。因此明确地是，需要提供在婴儿中促进快速建立适合的肠微生 物群的方法，其在所述婴儿中不会因为任何原因自然发生。发明概述如上文所提及，对于婴儿，最佳的肠微生物群包括60-90%的双歧杆菌、主要是短 双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)和长双 歧杆菌。本发明人令人惊奇地发现施用益生菌(包括但不必定限于以上提及的双歧杆菌属 菌种)在有需要的婴儿(例如没有同胞的婴儿)中促进早期双歧杆菌促进性肠微生物群的发展。因此，本发明提供了益生菌在制备用于促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促 进性肠微生物群的发展的药物或治疗性营养组合物中的应用。本发明还提供了益生菌在制备用于降低没有同胞的婴儿中后来出现变态反应和/ 或哮喘的风险的药物或治疗性营养组合物中的应用。在另一个方面，本发明提供了益生菌在制备用于预防或治疗没有同胞的婴儿中病 原性感染的药物或治疗性营养组合物中的应用。本发明还涉及促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠微生物群发展的 方法，其包括向有需要的没有同胞的婴儿提供治疗量的益生菌。本发明还涉及降低没有同胞的婴儿中后来出现变态反应和/或哮喘的风险的方法，其包括向有需要的没有同胞的婴儿提供治疗量的益生菌。不希望受理论束缚，本发明人相信向没有同胞的婴儿施用益生菌以一些尚未被完 全理解的方式促使婴儿的胃肠道准备好，以有利于之后的通常在健康、自然分娩的婴儿的 消化道中发现的那些双歧杆菌属菌种的建群。应当注意的是促进所述益生的菌种的建群既 不是所述施用的目的也不是其作用，而是为了促进其它种类益生菌的建群，以达到与在健 康、母乳喂养、自然分娩的有同胞婴儿中所发现的相当的早期双歧杆菌促进性肠微生物群。 接着，所述对双歧杆菌的促进导致对病原性感染诸如轮状病毒腹泻的抵抗以及免疫系统的 发展，因而降低之后出现过敏性症状的风险(如例如由特应性皮炎或哮喘所显示的那样)。发明详述在本说明书中，下列术语具有以下含义“早期双歧杆菌促进性肠微生物群”是指至多12月龄的婴儿的肠微生物群，其中双 歧杆菌属占优势地位，诸如短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌，并排除诸如梭菌属和 链球菌属(Streptococci)的菌种的可估计的菌群，所述肠微生物群与在同龄的自然分娩、 母乳喂养的婴儿中发现的肠微生物群总体上相当。“婴儿”是指12月龄以下的儿童；“没有同胞的婴儿”是指头胎的或唯一的婴儿或者仅与成人一起生活的婴儿。“益生元”是指一种不可消化的食品成分，其通过选择性刺激一种或有限数量的 细菌在结肠中的生长和/或活性来对宿主产生有益影响，从而改善宿主健康(Gibson和 Roberfroid"Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept of Prebiotics (人结肠微生物菌群的膳食调节引介益生元概念)”J. Nutr 125 1401-1412)。“益生菌”是指是对宿主健康或保持良好状态具有有益作用的微生物细胞制剂或 微生物细胞组分(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人，“Probiotics :how should they be defined (益生菌它们应当如何定义)”Trends Food Sci. Technol. 1999 :10 107-10)。“N-乙酰化的寡糖”是指具有N-乙酰基的寡糖；“寡糖”是指聚合度(DP)为2至20的碳水化合物，其包括端值，但不包括乳糖；“唾液酸化的寡糖”是指具有带有相关电荷的唾液酸残基的寡糖。除非另有说明，否则所有提及的百分比为以重量计的百分比。益生菌可以是任何具有确定的益生特性的乳酸菌或双歧杆菌，其能够促进早期双 歧杆菌促进性肠微生物群的发展。合适的益生性乳酸菌包括鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)ATCC 53103，其例如可以以LGG商品名从芬兰的Valio Oy获得，还包括鼠李糖 乳杆菌 CGMCC 1. 3724、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC 55730 和罗伊乳杆菌 DSM 17938(从 Biogaia 获得)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) CNCM 1-2116。合适的益生性双歧杆菌菌株包括婴儿双岐杆菌35624、由日本的Morinaga Milk Industry有限公司以商品名BB536出售的长双歧杆菌ATCC BAA-999、由Danisco以商品名 Bb-03出售的短双歧杆菌菌株、由Morinaga以商品名M-16V出售的短双歧杆菌菌株、和由 Institut Rosell (Lallemand)以商品名R0070出售的短双歧杆菌菌株。特别优选的益生菌 为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CNCM 1-3446，例如由丹麦的 Christian Hansen 公司以商品名恥12出售。可以使用合适的益生性乳酸菌和双歧杆菌的混合物。
合适的益生菌的每日剂量是10e3至IOell集落形成单位(cfu)，更优选的是10e7 至 IOelOcfUo优选在分娩刚结束后及其后的婴儿生命的至少最初两个月向婴儿施用益生菌。更 优选继续施用益生菌直至婴儿年龄达6个月。优选乳双歧杆菌CNCM 1-3446与益生元共同施用。适合的益生元包括某些寡糖， 诸如低聚果糖(FOS)和半乳寡糖(GOS)。可以使用益生元的组合，诸如90% GOS与10%短 链低聚果糖(诸如商品名为Beneo P95的产品)或与10%菊粉(诸如商品名为Beneo丨 HP、ST或HSI的产品)。特别优选的益生元是寡糖混合物，其包含5-70wt%的至少一种选自GalNAc α 1， 3Gal β l，4Glc 禾口 Gal β l，6GalNAca l,3Gal β l，4Glc 的 N-乙酰化的寡糖、20_90wt % 的至 少一种选自 Gal β l，6Gal、Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Glc、Gal β l，3Gal β 1， 3Glc、Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β 1， 4Glc、Gal β l,3Gal β l,6Gal β l，4Glc 和 Gal β l,3Gal β l,3Gal β l，4Glc 的中性寡糖和
至少一种选自 NeuAca 2，3Gal3 l，4Glc 和 NeuAc α 2，6Gal β l，4Glc 的唾液酸化 的寡糖。所述寡糖混合物在W02007/090894中有更详尽的描述，其内容被引入本文作为参 考，且在下文被称为“上文所述的寡糖混合物”。适合的N-乙酰化的寡糖包括 GalNAc α l,3Gal β l，4GlcfPGal3 l，6GalNAca 1， 3Gal β l，4Glc。N-乙酰化的寡糖可通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰 基-葡萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用而制备。同样地，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和 /或N-乙酰基-糖基转移酶可用于该目的。N-乙酰化的寡糖还可使用相应的酶类(重组 体或天然的)通过发酵技术和/或微生物发酵制备。在后者的情况下微生物可表达其天然 的酶和底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混 合培养物。N-乙酰化的寡糖的形成能由始于从DP = 1起的任何聚合度(DP)的受体底物开 始。另一个选择是将己酮糖(例如果糖)(游离或与寡糖(例如乳果糖)结合)化学转换 为N-乙酰基己糖胺或包含寡糖的N-乙酰基己糖胺，如feodnigg，T.M. ；Stutz,A. Ε. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38 :827-828 中所描述。适合的半乳寡糖包括Gal β l，6Gal、Gal β l,6Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β 1， 6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、Gal β l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β l,6Gal β l，4Glc、 Gal β l,6Gal β l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,3Gal β l,6Gal β l,4Glc, Gal β l,3Gal β 1， 3Gal β l，4Glc、Gal β l，4Gal β l，4Glc 和 Gal β l，4Gal β l，4Gal β l，4Glc。合成的半乳寡 糖诸如 Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Glc、Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β 1， 6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc 禾口 Gal β l，3Gal β l，6Gal β 1， 4Glc、Gal β l，4Gal3 l，4Glc 禾口 Gal β l，4Gal3 l，4Gal3 1，4Glc 及其混合物可以以商品名 Vivinal 和 Elix，or 购得。寡糖的其它供应商有 Dextra Laboratories.Sigma-A 1 drich Chemie GmbH和Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd。或者，特定的糖基转移酶诸如半乳糖基转移 酶可用于制备中性寡糖。适合的唾液酸化的寡糖包括 NeuAc α 2，3Gal β 1，4Glc 和 NeuAc α 2，6Gal β 1， 4Glc。这些唾液酸化的寡糖可通过色谱或过滤技术由天然来源诸如动物乳中分离。或者， 其可通过生物技术使用特定的唾液酸转移酶经基于酶(重组体或天然酶)的发酵技术或经微生物发酵技术来制备。在后者的情况下微生物可表达其天然的酶和底物或可对其进行改 造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。唾液酸基-寡糖 的形成能由始于从DP = 1起的任何聚合度(DP)的受体底物开始。在一个实施方案中，营养组合物包含3. 0至12. 0%的寡糖混合物、更优选4. 0至 7.0%的寡糖混合物。在一个实施方案中，营养组合物包含至少0. 03wt %的N-乙酰化的寡糖、至少 3. Owt %的半乳寡糖和至少0. 08wt%的唾液酸化的寡糖，更优选至少0. (Mwt %的N-乙酰化 的寡糖、至少4. 0wt%的半乳寡糖和至少0. 09wt%的唾液酸化的寡糖。在本发明的一个实施方案中，配方产品会包含2. 5至15. 的寡糖混合物，其 由N-乙酰化的寡糖、半乳寡糖和唾液酸化的寡糖以以下的量组成至少0. 02wt%的N-乙 酰化的寡糖、至少2. Owt %的半乳寡糖和至少0. (Mwt %的唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰 化的寡糖占所述寡糖混合物的0. 5至4. 0%、所述半乳寡糖占所述寡糖混合物的92. 0至 98. 5%且所述唾液酸化的寡糖占所述寡糖混合物的1. 0至4. 0%。在本发明的一个实施方案中，上文所述的寡糖混合物包含10-70wt%的所详述的 N-乙酰化的寡糖、20-80wt %的所详述的中性寡糖和10-50wt %的所详述的唾液酸化的寡 糖。更优选所述混合物包含15-40wt%的N-乙酰化的寡糖、40-60wt%的其它中性寡糖和 15-30Wt%的唾液酸化的寡糖。特别优选的混合物包含30wt%的N-乙酰化的寡糖、50wt% 的中性寡糖和20wt%的唾液酸化的寡糖。或者，上文所述的寡糖混合物可适宜地包含5-20wt%的所详述的N-乙酰化的寡 糖、60-90wt%的所详述的中性寡糖和5-30wt%的所详述的唾液酸化的寡糖。上文所述的寡糖混合物可由一种或多种动物乳制备。所述乳可来自任何哺乳动 物，特别是来自奶牛、山羊、水牛、马、象、骆驼或绵羊。作为选择地，上文所述的寡糖混合物可通过购买和混合单独组分而制备。例如，合 成的半乳寡糖诸如 Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Glc，Gal β l，3Gal β l，4Glc， Gal β l，6Galβ l，6Galβ l，4Glc，Gal β l，6Galβ l，3Galβ l，4Glc 禾口 Gal β l，3Galβ 1， 6Gal β l,4Glc及其混合物可以以商品名Vivinal⑧和Elix’ or 购得。寡糖的其他的供 应商有 Dextra Laboratories、Sigma-Aldrich Chemie GmbH 禾口 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd。或者，特定的糖基转移酶，诸如半乳糖基转移酶可用于制备中性寡糖。N-乙酰化的寡糖可通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰基-葡 萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用而制备。同样地，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或 N-乙酰基-糖基转移酶可用于该目的。N-乙酰化的寡糖还可使用相应的酶类(重组体或天 然的)通过发酵技术和/或微生物发酵制备。在后者的情况下微生物可表达其天然的酶和 底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。 N-乙酰化的寡糖的形成能由始于从DP= 1起的任何聚合度(DP)的受体底物开始。另一个 选择是将己酮糖(例如果糖)(游离或与寡糖(例如乳果糖)结合)化学转换为N-乙酰基 己糖胺或包含寡糖的N-乙酰基己糖胺，如Wrodnigg, Τ. M. ；Stutz, Α. E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38 :827-828 中所描述。唾液酸化的寡糖3、唾液酸基-乳糖和6、唾液酸基-乳糖可通过色谱或过滤技术 由天然来源诸如动物乳中分离。或者，其可通过生物技术使用特定的唾液酸转移酶经基于酶的发酵技术(重组体或天然酶)或经微生物发酵技术来制备。在后者的情况下微生物可 表达其天然的酶和底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养 物和/或混合培养物。唾液酸基寡糖的形成能由始于从DP= 1起的任何聚合度(DP)的受 体底物开始。益生菌可直接施用于婴儿，或如果是母乳喂养时经由母亲施用。如果经由母亲施 用，益生菌可以以例如片剂、胶囊、锭剂、咀嚼胶或液体形式作为补充剂提供给母亲。所述补 充剂优选还包含上文所述的寡糖混合物，其量为10e3至IOellcfu/日。补充剂可另外包含 保护性水胶体(诸如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包胶剂/材料、壁/壳材料、 基质化合物、包衣剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、 填充剂、辅助化合物(co-compound)、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、味道掩蔽 剂、增重剂、成凝胶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗菌剂。补充剂还可包含常规的药物添加剂 和辅助剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑 石粉、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、矫味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲齐U、 润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。在所有情况下，所述另外的成分将考虑其对预期接受者 的适合性来选择。或者，益生菌可以以治疗性营养组合物的形式向哺乳的女性施用。该组合物可以 是营养完全的配方产品。根据本发明向泌乳女性施用的营养完全的配方产品可以包含蛋白质源。任何合适 的膳食蛋白质都可以施用，例如动物蛋白质(如乳蛋白质、肉蛋白质和卵蛋白质)、植物蛋 白质(如大豆蛋白质、小麦蛋白质、大米蛋白质和豌豆蛋白质)、游离氨基酸的混合物、或其 组合。乳蛋白质如酪蛋白和乳清，以及大豆蛋白质是特别优选的。组合物还可包含碳水化 合物源和脂肪源。如果配方产品除了 DHA之外还包含脂肪源，则脂肪源优选提供配方产品能量的 5%至40% ；例如能量的20%至30%。可使用芥花籽油、玉米油和高油酸向日葵油的混合 物得到合适的脂肪谱。可将碳水化合物源加入配方产品中。其优选提供配方产品能量的40%至80%。可 使用任何合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精及 其混合物。需要时也可加入膳食纤维。膳食纤维通过小肠而未被酶消化，是天然的膨胀剂 和轻泻剂。膳食纤维可以是可溶的或不溶的，通常，优选两种类型的混合物。合适的膳食纤 维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、低聚果糖和半乳寡糖。如果存在纤维， 则优选纤维含量在所消耗的配方产品的2和40g/l之间，更优选在4和10g/l之间。此外， 配方产品还优选以每升复原配方产品0. 2至5克的量包含上文所述的寡糖混合物、优选以 1至2g/l的量包含上文所述的寡糖混合物。根据政府机构如USRDA的建议，配方产品还可包含矿物质和微量营养素如微量元 素和维生素。例如，配方产品的每日剂量可包含一种或多种在所示范围的下列微量营养素 300 至 500mg 钙、50 至 IOOmg 镁、150 至 250mg 磷、5 至 20mg 铁、1 至 7mg 锌、0. 1 至 0. 3mg 铜、 50至200 μ g碘、5至15 μ g硒、1000至3000 μ g β胡萝卜素、10至80mg维生素C、1至^ig 维生素B1、0. 5至1. 5mg维生素B6、0. 5至^ig维生素B2、5至18mg烟酸、0. 5至2. 0 μ g维 生素B12、100至800 μ g叶酸、30至70 μ g生物素、1至5 μ g维生素D、3至IOIU维生素E。
需要时，可向配方产品中加入一种或多种食品级乳化剂；例如双乙酰酒石酸单甘 油酯和双乙酰酒石酸双甘油酯、卵磷脂和甘油单酯和甘油二酯。同样，可包括合适的盐和稳 定剂。配方产品优选经肠施用；例如以粉末的形式，用乳或水使其复原。或者，在非母乳喂养的婴儿的情况中，益生菌可作为补充剂施用，例如以IOelOcfu 的日剂量溶于水中并用勺施用。对于非母乳喂养的婴儿，益生菌可方便地以婴儿配方产品形式施用。根据本发明使用的婴儿配方产品可包含不超过2. 0g/100千卡、优选1.8至 2.0g/100千卡的量的蛋白质源。虽然优选以重量计50%以上的蛋白质源是乳清蛋白，但是 对于本发明，认为蛋白质的类型不是关键的，只要满足必需氨基酸含量的最低需求，并且保 证令人满意的生长即可。因此，可使用基于乳清、酪蛋白及其混合物的蛋白质源，以及基于 大豆的蛋白质源。至于乳清蛋白质，该蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或其混合物，并且可 以以任何需要的比例包含α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。蛋白质可以是完整的蛋白质或经水解的蛋白质，或完整的和经水解的蛋白质的混 合物。可能希望提供部分水解的蛋白质(水解程度在2和20%之间)，例如对于认为有发生 牛奶变态反应危险的婴儿而言如此。如果需要经水解的蛋白质，则根据需要和根据本领域 所已知的进行水解操作。例如，可通过在一个或多个步骤中酶促水解乳清片段来制备乳清 蛋白水解物。如果用作起始材料的乳清片段基本上不含乳糖，那么发现该蛋白质在水解过 程中受到较少的赖氨酸阻断。这使得赖氨酸阻断的程度能够从以总赖氨酸的重量计约15% 减少至以赖氨酸重量计少于约10%;例如以赖氨酸重量计约7%，这极大地提高了蛋白质源 的营养价值。婴儿配方产品可包含碳水化合物源。尽管优选的碳水化合物源是乳糖，但是可以 使用在婴儿配方产品中常规存在的任何碳水化合物源如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉及其 混合物。优选地，碳水化合物源提供配方产品总能量的35至65%。婴儿配方产品可包含脂质源。脂质源可以是适合用于婴儿配方产品的任何脂质 或脂肪。优选的脂肪源包括棕榈油酸甘油酯、高油酸向日葵油和高油酸红花油。也可加入 必需脂肪酸亚油酸和α -亚麻酸，同样可加入少量的包含大量预制的花生四烯酸和二十二 碳六烯酸的油，诸如鱼油或微生物油。总之，脂肪含量优选诸如贡献配方产品总能量的30 至55%。脂肪源优选η-6比η-3脂肪酸的比率为约5 1至约15 1，例如约8 1至约 10 1。婴儿配方产品也可包含认为在日常饮食中是必需的所有维生素和矿物质，并且以 营养显著的量包含之。已确定了某些维生素和矿物质的最小需要量。任选存在于婴儿配方 产品中的矿物质、维生素和其他营养素的实例包括维生素Α、维生素Bi、维生素Β2、维生素 Β6、维生素Β12、维生素Ε、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆 碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉碱。通常以盐的形 式加入矿物质。特定矿物质和其他维生素的存在和量将根据预期婴儿群体而变化。优选地，婴儿配方产品会以每升复原配方产品0. 2至5克的量包含上文所述的寡 糖混合物、优选1至2g/l的量包含上文所述的寡糖混合物。婴儿配方产品可任选包含具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。上述婴儿配方产品和营养配方产品都可以以任何合适的方法制备。例如，它们可 通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适当的比例混合在一起来制备。如果使用，则可 在此时加入乳化剂。可在此时加入维生素和矿物质，但通常稍后加入以避免热降解。可在 混合之前将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶解入脂肪源。然后可混入水、优选已进行反渗透 的水，来形成液体混合物。水的温度通常是约50°C到约80°C，以帮助成分分散。可使用商 购可得的液化器来形成液体混合物。然后均质化液体混合物；例如分两个阶段进行。然后可热处理液体混合物以减少细菌的载量，例如，可将该液体混合物快速加热 至约80°C至约150°C范围内的温度，处理约5秒至约5分钟。这可通过蒸汽注射、高压釜或 通过换热器进行；例如板式换热器。然后可将液体混合物冷却至约60°C至约85°C ；例如通过瞬时冷却。然后可再次均 质化液体混合物；例如分两个阶段，在第一阶段约IOMPa至约30Mpa，在第二阶段约2MPa至 约lOMpa。然后进一步冷却均质化的混合物以加入任何热敏成分；诸如维生素和矿物质。此 时方便地调整均质化混合物的PH和固体含量。将均质化的混合物转移至合适的干燥装置例如喷雾干燥器或冷冻干燥器，将其转 变为粉末。粉末应当具有低于以重量计约5%的含水量。所选择的益生菌可根据任何合适的方法培养，并通过例如冷冻干燥或喷雾干燥 制备以用于加入营养或婴儿配方产品。或者，可从专业供应商例如Christian Hansen和 Valio购买已经以用于加入至食品例如营养和婴儿配方产品的适合形式制备的细菌制品。 益生菌可以以10e3至10el2cfu/g粉末、更优选10e7至10el2cfu/g的量加入配方产品。本发明参照下面的实施例进一步说明实施例1适合的本发明中使用的婴儿配方产品的组成的实例如下。
营养每 IOOkcal每升能量(kcal)100670蛋白质(g)1. 8312. 3脂肪(g)5. 335. 7亚油酸(g)0. 795. 3α -亚麻酸(mg)101675乳糖ω11. 274. 7矿物质0. 372. 5Na (mg)23150
1权利要求
1.益生菌在制备用于促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠微生物群的发 展的药物或治疗性营养组合物中的应用。
2.益生菌在制备用于降低没有同胞的婴儿中后来出现变态反应的风险的药物或治疗 性营养组合物中的应用。
3.益生菌在制备用于预防或治疗没有同胞的婴儿中病原性感染的药物或治疗性营养 组合物中的应用。
4.权利要求3的应用，其中病原性感染是轮状病毒腹泻。
5.前述权利要求中任意一项的应用，其中益生菌是乳酸菌。
6.权利要求5的应用，其中乳酸菌包括鼠李糖乳杆菌ATCC53103、鼠李糖乳杆菌CGMCC 1. 3724、罗伊乳杆菌ATCC 55730、罗伊乳杆菌DSM 17938或副干酪乳杆菌CNCM 1-2116。
7.权利要求1至4中任意一项的的应用，其中益生菌是双歧杆菌。
8.权利要求7的应用，其中双歧杆菌包括乳双歧杆菌CNCM1-3446、长双歧杆菌ATCC BAA-999、短双歧杆菌菌株恥_03、短双歧杆菌菌株M-16V、婴儿双岐杆菌356 或短双歧杆 菌 R0070。
9.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物或治疗性营养组合物还包含寡糖混合 物，所述寡糖混合物包含5_70衬％的至少一种选自GalNAca l，3Gali3 l，4Glc和Gali^ 1， 6GalNAca l，3Gal3 l，4Glc 的 N-乙酰化的寡糖、20_90wt % 的至少一种选自 Gal β l，6Gal、 Gal β l,6Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β l，6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、Gal β l,3Gal β 1， 4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，3Gal β 1， 6Gal3 l，4Glc 禾口 Gal β l，3Gal3 l，3Gal3 l，4Glc 的中性寡糖和 5_50wt % 的至少一种选自 NeuAca 2，3Gal β l，4Glc 禾口 NeuAc α 2，6Gal β l，4Glc 的唾液酸化的寡糖。
10.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物或治疗性营养组合物还包含寡糖混 合物，所述寡糖混合物包含至少一种N-乙酰化的寡糖，且其中所述寡糖选自=GalNAca 1， 3Gal β l，4Glc、Gal β l，6GalNAca l,3Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal、Gal β l,6Gal β l，4Glc、 Gal β l,6Gal β l，6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、Gal β l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β 1， 6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，3Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β 1， 3Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，4Gal β l，4Glc 禾口 Gal β l，4Gal β l，4Gal β l，4Glc、 GalNAc α l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6GalNAca l,3Gal β l，4Glc、NeuAc α 2,3Gal β l，4Glc、 NeuAca 2,6Gal β l，4Glc、GalNAc α l,3Gal β l，4Glc、Gal β l,6GalNAca l,3Gal β l，4Glc、 Gal β l,6Gal, Gal β l,6Gal β l，4Glc、Gal β l,6Gal β l，6Glc、Gal β l,3Gal β l，3Glc、 Gal β l，3Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，6Gal β l，4Glc、Gal β l，6Gal β l，3Gal β l，4Glc、 Gal β l，3Galβ l，6Galβ l，4Glc、Galβ l，3Galβ l，3Galβ l，4Glc、Galβ l，4Galβ l，4Glc 和 Gal β l,4Gal β l,4Gal β 1，4Glc、NeuAc α 2，3Gal β 1，4Glc、NeuAc α 2，6Gal β l，4Glc 或其混 合物。
11.前述权利要求中任意一项的应用，其中组合物基于干物质包含2.5至15. 的 由N-乙酰化的寡糖、半乳寡糖和唾液酸化的寡糖组成的寡糖混合物，条件是所述组合物 包含至少0. 02wt%的N-乙酰化的寡糖、至少2. Owt%的半乳寡糖和至少0. 的唾液酸 化的寡糖并且所述N-乙酰化的寡糖占所述寡糖混合物的0. 5至4. 0%、所述半乳寡糖占所 述寡糖混合物的92. 0至98. 5%且所述唾液酸化的寡糖占所述寡糖混合物的1. 0至4. 0%。
12.前述权利要求中任意一项的组合物，其包含至少0.03wt%的N-乙酰化的寡糖、至 少3. Owt%的半乳寡糖和至少0. 08wt%的唾液酸化的寡糖。
13.前述权利要求中任意一项的组合物，其包含至少0.的N-乙酰化的寡糖、至 少4. Owt%的半乳寡糖和至少0. 09wt%的唾液酸化的寡糖。
14.前述权利要求中任意一项的应用，其中寡糖混合物包含10-70wt%的N-乙酰化的 寡糖、20-80wt %的中性寡糖和10-50wt %的唾液酸化的寡糖。
15.前述权利要求中任意一项的应用，其中寡糖混合物包含15-40wt%的N-乙酰化的 寡糖、40-60Wt%的中性寡糖和15-30Wt%的唾液酸化的寡糖。
16.前述权利要求中任意一项的应用，其中寡糖混合物包含5-20wt%的N-乙酰化的寡 糖、60-90wt %的中性寡糖和5-30wt %的唾液酸化的寡糖。
17.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物或治疗性营养组合物在分娩刚结束后 及其后的至少两个月向婴儿施用。
18.前述权利要求中任意一项的应用，其中在分娩后向婴儿施用所述药物或治疗性营 养组合物至少6个月。
19.前述权利要求中任意一项的应用，其中将益生菌经由母乳喂养的母亲施用于婴儿。
20.前述权利要求中任意一项的应用，其中治疗性营养组合物为婴儿配方产品。
21.前述权利要求中任意一项的应用，其中药物的每日剂量包含10e5至IOellcfu的益 生菌。
22.前述权利要求中任意一项的应用，其中治疗性营养组合物包含10e3至10el2cfu的 益生菌/g组合物(干重)。
全文摘要
本发明涉及益生菌在制备用于促进没有同胞的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠微生物群的发展的药物或治疗性营养组合物中的应用。
文档编号A61K35/74GK102065872SQ200980123923
公开日2011年5月18日 申请日期2009年5月12日 优先权日2008年5月27日
发明者F·罗沙, M-C·菲绍 申请人:雀巢产品技术援助有限公司
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