一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂及其制备和应用方法
专利名称：一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂及其制备和应用方法
技术领域：
本发明涉及一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂及其制备和应用方法。
技术背景
马尾松(Pinus massoniana)是我国南方主要的速生用材树种，也是重要的造纸原料。耐干旱瘠薄，为酸性土荒山荒地造林的先锋树种，产于秦岭、淮河流域以南，东起沿海低山丘陵，西至川西大相岭东坡，南达华南南部，台湾有少量分布。经济价值高，用途广，其木材供建筑、家具及水中工程用，根部可培养茯苓，树干可供采割松脂，树皮可制胶粘剂和人造板，松枝、松针、松籽、花粉、球果等均可利用。随着社会的发展，人们对木材和纸张的需求不断增加，马尾松种植面积不断扩大，这种短周期工业用材林的集约经营，导致马尾松林地土壤肥力衰退。此外，我国南方贫瘠山地的马尾松，远看成林近看不成材，干旱和营养贫乏是限制马尾松速生丰产的主要原因。为了维护土壤养分平衡，保证速生丰产，科学施肥已成为亟待研究解决的问题。
我国林木施肥工作始于上世纪50年代，对马尾松施肥研究的文献不多，从已经进行的研究表明，我国南方马尾松林区的土壤大都表现出缺磷少钾中等氮的特点，马尾松施肥以磷肥为主，配合施氮、钾肥。马尾松属典型的外生菌根营养型树种，菌根在马尾松生长过程中作用重大，而菌根本身就是一种活物质肥料。优良的外生菌根真菌可以扩大根系吸收面，增加对土壤中营养元素(特别是磷)的吸收能力。具有合成生物活性物质的能力(如合成维生素、赤霉素、细胞分裂素、植物生长激素、酶类以及抗生素等)，不仅能促进植物良好生长，而且能提高植物的抗逆性和适应性。可见，实现幼苗人工菌根化在马尾松造林中十分重要，而其菌剂的研制也备受人们关注。然而，目前国内外生产的含有菌根菌的菌剂大多为单一纯培养体接种物，缺少树木所需要的营养元素，植株生长效果不十分明显，成本高， 推广受限。研制含有外生菌根真菌与溶磷、解钾等功能菌，Ca、Mg、Cu等中微量元素的高效复合菌剂，将会更有效地发挥外生菌根菌的作用。马尾松外生菌根菌和溶磷菌、解钾菌等能建立互相促进的良好互生关系，作为马尾松复合微生物颗粒剂的组成部分可调整土壤微生态失调、促进植株生长和治病、防病作用。在生物改良土壤等措施的基础上，合理施用化肥， 可迅速补充土壤养分，保证林木速生丰产，这是培肥地力的必要手段。同时，随着氮、磷、钾大量元素肥料施用量的增加，以及伴随林木的生长，土壤中的中微量元素往往得不到及时补充，严重影响了大量元素作用的充分发挥和马尾松产量的进一步提高，因此添加中微量元素十分必要。
本发明在于提供一种马尾松复合微生物颗粒剂，促进马尾松根系对所需营养元素的吸收，提高营养元素的利用效率，进而促进马尾松生长。增强土壤保持水肥的能力，补充土壤养分，改善土壤微生态，在防治土壤地力衰退方面意义重大。且材料来源方便，成本低廉，肥效好。发明内容
本发明的目的之一是提供一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂。
本发明的目的之二是提供上述促进马尾松复合微生物颗粒剂的制备和应用方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂，包括包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物、氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素和土壤改良剂，所述的菌根菌为粘盖牛肝菌(Suillus bovinus(Pers.)Roussel)保藏编号CFCC 87555，和彩色豆马勃菌(Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker&Couch)保藏编号:CFCC8029 中一种或两种的混合；所述的溶磷菌为黄褐假单胞菌O^eudomonas fulva)yL14，保藏编号为CCTCC M 2011356 ；所述的解钾菌为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏编号ACCC 01434。所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分 包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物 16-64 %氮肥磷肥钾肥中微量元素土壤改良剂4-20% 6-22% 6-22% 2-6% 10-20%,所述的复合微生物颗粒剂优选包括以下重量百分比成分 包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物30-35%氮肥磷肥钾肥中微量元素12-15% 15-18% 15-18% 4-6%土壤改良剂12-18%。所述的复合微生物颗粒剂进一步优选包括以下重量百分比成分 包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物32% 氮肥14%磷肥17%钾肥17%中微量元素5%土壤改良剂15%。所述的包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物的制备过程如下1)将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球； 将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数分别达到25-30亿个/ml。2)含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备将泥炭土、玉米粉和膨润土粉的混合物研磨，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液吸附到混合物上，拌勻；
3)包膜
包膜材料用膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，将包膜材料与含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物混合即可。
步骤幻中将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物，再研磨至50目；所述的菌根菌制成的液体悬浮液和溶磷菌、解钾菌菌液总体积混合物 =1 5-20mL/g ；
步骤幻中包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可。
所述的氮肥包括尿素；
所述的磷肥包括磷酸二氢钾、过磷酸钙、磷酸二铵中的一种或几种的混合；
所述的钾肥包括硫酸钾、氯化钾中的一种或两种的混合。
所述的中微量元素包括硝酸钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、硼酸中的一种或几种的混合ο
所述的土壤改良剂包括膨润土、沸石、泥炭中的一种或几种的混合。
上述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂的制备方法，包括如下步骤
1)菌种发酵
将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球；
将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数量分别达到25-30亿个/ml ；
2)包膜的含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备
将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物，再研磨至 50目，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液混合，得到的菌液总体积混合物=1 5-20mL/g拌勻，得含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物，备用；
包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可；
3)然后加入氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素、土壤改良剂，混合，造粒，干燥。
可以将上述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂直接施用于种植马尾松的周围土壤。
与现有情况相比，本发明具有如下优点
(1)实现了马尾松外生菌根菌和多种功能菌的有效复合，有效菌、中微量元素和化学肥料的复合。( 采用本发明的复合微生物颗粒剂能促进马尾松根系对所需营养元素的吸收，提高营养元素的利用效率，促进马尾松生长。(3)增强土壤保持水肥的能力，补充土壤养分，改善土壤微生态，在防治土壤地力衰退方面意义重大。(4)材料来源方便，成本低廉， 肥效好，利于推广应用等。
本发明所述的溶磷菌为黄褐假单胞菌O^seudomonas fulva) yL14,已于2011年10 月18日在中国湖北省武汉市的“中国典型培养物保藏中心”进行了专利程序的保藏，保藏号为CCTCC M 2011356 ；筛选及鉴定过程如下
1材料与方法
1. 1 供试土样
采集中南林业科技大学衡山县项目实验基地马尾松根际土壤，马尾松林龄分别为 2年、10年、15年、20年和25年。土壤采集每块实验样地内随机选取5个样点，每个点采用四点取样法，先除去表层枯枝落叶及杂草，掘出面积为IOX IOcm或15X 15cm、深度为 0-20cm的土坑，取带根土样500g左右，放入无菌封口聚乙烯袋中，4°C保存备用。
1. 2培养基
溶磷菌筛选培养基NBRIP培养基，其组成及配方见参考文献；保存培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
1. 3溶磷菌的分离与纯化
溶磷菌的分离采用10倍稀释法，分别取浓度为10_3、10_4、10_5的稀释液0. Iml在无菌NBRIP平板上均勻涂布，28°C倒置培养7d，选具有透明圈的菌落进行分离纯化。
1. 4溶磷菌溶磷能力测定
1. 4. 1定性测定
用接种环取一环纯分离物采用点接种法培养于NBRIP平板培养基上，于培养箱中倒置培养10(1，分别第4(1、6(1、8(1、10(1测定溶磷圈直径(D)、菌落直径(d)，根据是否产生溶磷圈判断菌株有无溶磷能力，根据(D/d)值大小来初步确定菌株的溶磷能力。
1. 4. 2定量测定
取ImL 0D600nm值为0. 6的菌悬液接种于50mL灭菌的液体培养基中，同时做不接菌对照，设3次重复实验。摇床恒温培养7d(160r/min)。将发酵液在4°C，离心 (lOOOOr/minUOmin，取上清液。上清液含磷量用钼锑抗比色法测定，pH值用酸度计测定 (PHS-25酸度计)。
1. 5菌株的鉴定
1. 5. 1形态特征
将纯化的分离物接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，于培养箱中倒置培养 24-4他，观察并记录菌落形态、干湿状况、透明度、颜色等。
1.5. 2生理生化特征
生理生化实验参照伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)的方法进行。
1. 5. 316S rDNA的扩增与测序
采用CTAB法抽提菌株yL14的总DNA，细菌16S rDNA通用引物27F 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，1429R :5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，用于 PCR 扩增。PCR 反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，循环 24 次；72°C IOmin0 将 PCR 扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。
2结果与分析
2. 1溶磷菌在固体培养基上的溶磷效果
溶磷圈直径⑶与菌落生长直径(d)的比值(以几次测定结果的最大值为准)是表征溶磷菌的相对溶磷能力的一个指标。从表1可以看出分离物yL22、yL18、yL7、yL5溶磷效果较好，其中yL22溶磷效果最好(D/d值> 6)。
表1几种细菌的D/d值
权利要求
1.一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂，其特征在于，包括包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物、氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素和土壤改良剂，所述的菌根菌为粘盖牛肝菌(Suillus bovinus(Pers.) Roussel)保藏编号CFCC87555，和彩色豆马勃菌(Pisolithus tinctorius (Pers.)Coker&Couch)保藏编号CFCC8(^9 中一种或两种的混合；所述的溶磷菌为黄褐假单胞菌O^eudomonas fulva) yL14，保藏编号为CCTCC M 2011356 ；所述的解钾菌为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏编号ACCC 01434。
2.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物16-64 %氮肥磷肥钾肥中微量元素土壤改良剂4-20% 6-22% 6-22% 2-6% 10-20% ο
3.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物30-35%氮肥磷肥钾肥中微量元素土壤改良剂12-15% 15-18% 15-18% 4-6% 12-18%。
4.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物32% 氮肥14%磷肥17%钾肥17%中微量元素5%土壤改良剂15%。
5.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的包膜了的含菌根菌、 溶磷菌和解钾菌的固体培养物的制备过程如下1)将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球； 将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数量分别达到25-30亿个/ml。2)含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备将泥炭土、玉米粉和膨润土粉的混合物研磨，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液吸附到混合物上，拌勻；3)包膜包膜材料用膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，将包膜材料与含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物混合即可。
6.根据权利要求5所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，步骤2)中将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物， 再研磨至50目；所述的菌根菌制成的液体悬浮液和溶磷菌、解钾菌菌液总体积混合物= 1 5-20mL/g ；步骤幻中包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料 含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可。
7.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于所述的氮肥包括尿素；所述的磷肥包括磷酸二氢钾、过磷酸钙、磷酸二铵中的一种或几种的混合；所述的钾肥包括硫酸钾、氯化钾中的一种或两种的混合。所述的中微量元素包括硝酸钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、硼酸中的一种或几种的混合。所述的土壤改良剂包括膨润土、沸石、泥炭中的一种或几种的混合。
8.权利要求1-7所述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)菌种发酵将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球；将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数量分别达到25-30亿个/ml ；2)包膜的含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物，再研磨至50 目，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液混合，得到的菌液总体积混合物=1 5-20mL/g拌勻，得含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物，备用；包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可；3)然后加入氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素、土壤改良剂，混合，造粒，干燥。
9.权利要求1-7所述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂的应用方法，其特征在于，直接施用于种植马尾松的周围土壤。
10.一种溶磷菌，其特征在于，为黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva) yL14，保藏号为 CCTCC M 2011356。
全文摘要
本发明公开了一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂及其制备和应用方法，含有粘盖牛肝菌属和豆包属中的一种或几种外生菌根真菌作为菌根菌，与溶磷菌黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)yL14，保藏号为CCTCC M2011356、解钾菌的固体培养物用包膜材料包膜后，加入氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素和土壤改良剂，混合造粒而成。采用本发明的复合微生物颗粒剂可促进马尾松根系对营养元素的吸收，提高营养元素的利用效率，促进马尾松生长；增强土壤保持水肥的能力，补充土壤养分，改善土壤微生态，在防治土壤地力衰退方面意义重大；材料来源方便，成本低廉，肥效好，利于推广应用。
文档编号C05G5/00GK102503722SQ20111032695
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者何苑皞, 刘君昂, 周国英, 靳爱仙, 黄鹏飞 申请人:中南林业科技大学
技术领域：
本发明涉及一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂及其制备和应用方法。
技术背景
马尾松(Pinus massoniana)是我国南方主要的速生用材树种，也是重要的造纸原料。耐干旱瘠薄，为酸性土荒山荒地造林的先锋树种，产于秦岭、淮河流域以南，东起沿海低山丘陵，西至川西大相岭东坡，南达华南南部，台湾有少量分布。经济价值高，用途广，其木材供建筑、家具及水中工程用，根部可培养茯苓，树干可供采割松脂，树皮可制胶粘剂和人造板，松枝、松针、松籽、花粉、球果等均可利用。随着社会的发展，人们对木材和纸张的需求不断增加，马尾松种植面积不断扩大，这种短周期工业用材林的集约经营，导致马尾松林地土壤肥力衰退。此外，我国南方贫瘠山地的马尾松，远看成林近看不成材，干旱和营养贫乏是限制马尾松速生丰产的主要原因。为了维护土壤养分平衡，保证速生丰产，科学施肥已成为亟待研究解决的问题。
我国林木施肥工作始于上世纪50年代，对马尾松施肥研究的文献不多，从已经进行的研究表明，我国南方马尾松林区的土壤大都表现出缺磷少钾中等氮的特点，马尾松施肥以磷肥为主，配合施氮、钾肥。马尾松属典型的外生菌根营养型树种，菌根在马尾松生长过程中作用重大，而菌根本身就是一种活物质肥料。优良的外生菌根真菌可以扩大根系吸收面，增加对土壤中营养元素(特别是磷)的吸收能力。具有合成生物活性物质的能力(如合成维生素、赤霉素、细胞分裂素、植物生长激素、酶类以及抗生素等)，不仅能促进植物良好生长，而且能提高植物的抗逆性和适应性。可见，实现幼苗人工菌根化在马尾松造林中十分重要，而其菌剂的研制也备受人们关注。然而，目前国内外生产的含有菌根菌的菌剂大多为单一纯培养体接种物，缺少树木所需要的营养元素，植株生长效果不十分明显，成本高， 推广受限。研制含有外生菌根真菌与溶磷、解钾等功能菌，Ca、Mg、Cu等中微量元素的高效复合菌剂，将会更有效地发挥外生菌根菌的作用。马尾松外生菌根菌和溶磷菌、解钾菌等能建立互相促进的良好互生关系，作为马尾松复合微生物颗粒剂的组成部分可调整土壤微生态失调、促进植株生长和治病、防病作用。在生物改良土壤等措施的基础上，合理施用化肥， 可迅速补充土壤养分，保证林木速生丰产，这是培肥地力的必要手段。同时，随着氮、磷、钾大量元素肥料施用量的增加，以及伴随林木的生长，土壤中的中微量元素往往得不到及时补充，严重影响了大量元素作用的充分发挥和马尾松产量的进一步提高，因此添加中微量元素十分必要。
本发明在于提供一种马尾松复合微生物颗粒剂，促进马尾松根系对所需营养元素的吸收，提高营养元素的利用效率，进而促进马尾松生长。增强土壤保持水肥的能力，补充土壤养分，改善土壤微生态，在防治土壤地力衰退方面意义重大。且材料来源方便，成本低廉，肥效好。发明内容
本发明的目的之一是提供一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂。
本发明的目的之二是提供上述促进马尾松复合微生物颗粒剂的制备和应用方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂，包括包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物、氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素和土壤改良剂，所述的菌根菌为粘盖牛肝菌(Suillus bovinus(Pers.)Roussel)保藏编号CFCC 87555，和彩色豆马勃菌(Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker&Couch)保藏编号:CFCC8029 中一种或两种的混合；所述的溶磷菌为黄褐假单胞菌O^eudomonas fulva)yL14，保藏编号为CCTCC M 2011356 ；所述的解钾菌为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏编号ACCC 01434。所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分 包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物 16-64 %氮肥磷肥钾肥中微量元素土壤改良剂4-20% 6-22% 6-22% 2-6% 10-20%,所述的复合微生物颗粒剂优选包括以下重量百分比成分 包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物30-35%氮肥磷肥钾肥中微量元素12-15% 15-18% 15-18% 4-6%土壤改良剂12-18%。所述的复合微生物颗粒剂进一步优选包括以下重量百分比成分 包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物32% 氮肥14%磷肥17%钾肥17%中微量元素5%土壤改良剂15%。所述的包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物的制备过程如下1)将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球； 将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数分别达到25-30亿个/ml。2)含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备将泥炭土、玉米粉和膨润土粉的混合物研磨，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液吸附到混合物上，拌勻；
3)包膜
包膜材料用膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，将包膜材料与含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物混合即可。
步骤幻中将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物，再研磨至50目；所述的菌根菌制成的液体悬浮液和溶磷菌、解钾菌菌液总体积混合物 =1 5-20mL/g ；
步骤幻中包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可。
所述的氮肥包括尿素；
所述的磷肥包括磷酸二氢钾、过磷酸钙、磷酸二铵中的一种或几种的混合；
所述的钾肥包括硫酸钾、氯化钾中的一种或两种的混合。
所述的中微量元素包括硝酸钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、硼酸中的一种或几种的混合ο
所述的土壤改良剂包括膨润土、沸石、泥炭中的一种或几种的混合。
上述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂的制备方法，包括如下步骤
1)菌种发酵
将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球；
将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数量分别达到25-30亿个/ml ；
2)包膜的含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备
将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物，再研磨至 50目，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液混合，得到的菌液总体积混合物=1 5-20mL/g拌勻，得含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物，备用；
包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可；
3)然后加入氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素、土壤改良剂，混合，造粒，干燥。
可以将上述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂直接施用于种植马尾松的周围土壤。
与现有情况相比，本发明具有如下优点
(1)实现了马尾松外生菌根菌和多种功能菌的有效复合，有效菌、中微量元素和化学肥料的复合。( 采用本发明的复合微生物颗粒剂能促进马尾松根系对所需营养元素的吸收，提高营养元素的利用效率，促进马尾松生长。(3)增强土壤保持水肥的能力，补充土壤养分，改善土壤微生态，在防治土壤地力衰退方面意义重大。(4)材料来源方便，成本低廉， 肥效好，利于推广应用等。
本发明所述的溶磷菌为黄褐假单胞菌O^seudomonas fulva) yL14,已于2011年10 月18日在中国湖北省武汉市的“中国典型培养物保藏中心”进行了专利程序的保藏，保藏号为CCTCC M 2011356 ；筛选及鉴定过程如下
1材料与方法
1. 1 供试土样
采集中南林业科技大学衡山县项目实验基地马尾松根际土壤，马尾松林龄分别为 2年、10年、15年、20年和25年。土壤采集每块实验样地内随机选取5个样点，每个点采用四点取样法，先除去表层枯枝落叶及杂草，掘出面积为IOX IOcm或15X 15cm、深度为 0-20cm的土坑，取带根土样500g左右，放入无菌封口聚乙烯袋中，4°C保存备用。
1. 2培养基
溶磷菌筛选培养基NBRIP培养基，其组成及配方见参考文献；保存培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
1. 3溶磷菌的分离与纯化
溶磷菌的分离采用10倍稀释法，分别取浓度为10_3、10_4、10_5的稀释液0. Iml在无菌NBRIP平板上均勻涂布，28°C倒置培养7d，选具有透明圈的菌落进行分离纯化。
1. 4溶磷菌溶磷能力测定
1. 4. 1定性测定
用接种环取一环纯分离物采用点接种法培养于NBRIP平板培养基上，于培养箱中倒置培养10(1，分别第4(1、6(1、8(1、10(1测定溶磷圈直径(D)、菌落直径(d)，根据是否产生溶磷圈判断菌株有无溶磷能力，根据(D/d)值大小来初步确定菌株的溶磷能力。
1. 4. 2定量测定
取ImL 0D600nm值为0. 6的菌悬液接种于50mL灭菌的液体培养基中，同时做不接菌对照，设3次重复实验。摇床恒温培养7d(160r/min)。将发酵液在4°C，离心 (lOOOOr/minUOmin，取上清液。上清液含磷量用钼锑抗比色法测定，pH值用酸度计测定 (PHS-25酸度计)。
1. 5菌株的鉴定
1. 5. 1形态特征
将纯化的分离物接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，于培养箱中倒置培养 24-4他，观察并记录菌落形态、干湿状况、透明度、颜色等。
1.5. 2生理生化特征
生理生化实验参照伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)的方法进行。
1. 5. 316S rDNA的扩增与测序
采用CTAB法抽提菌株yL14的总DNA，细菌16S rDNA通用引物27F 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，1429R :5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3，用于 PCR 扩增。PCR 反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，循环 24 次；72°C IOmin0 将 PCR 扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。
2结果与分析
2. 1溶磷菌在固体培养基上的溶磷效果
溶磷圈直径⑶与菌落生长直径(d)的比值(以几次测定结果的最大值为准)是表征溶磷菌的相对溶磷能力的一个指标。从表1可以看出分离物yL22、yL18、yL7、yL5溶磷效果较好，其中yL22溶磷效果最好(D/d值> 6)。
表1几种细菌的D/d值
权利要求
1.一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂，其特征在于，包括包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物、氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素和土壤改良剂，所述的菌根菌为粘盖牛肝菌(Suillus bovinus(Pers.) Roussel)保藏编号CFCC87555，和彩色豆马勃菌(Pisolithus tinctorius (Pers.)Coker&Couch)保藏编号CFCC8(^9 中一种或两种的混合；所述的溶磷菌为黄褐假单胞菌O^eudomonas fulva) yL14，保藏编号为CCTCC M 2011356 ；所述的解钾菌为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏编号ACCC 01434。
2.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物16-64 %氮肥磷肥钾肥中微量元素土壤改良剂4-20% 6-22% 6-22% 2-6% 10-20% ο
3.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物30-35%氮肥磷肥钾肥中微量元素土壤改良剂12-15% 15-18% 15-18% 4-6% 12-18%。
4.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的复合微生物颗粒剂包括以下重量百分比成分包膜了的含菌根菌、溶磷菌和解钾菌的固体培养物32% 氮肥14%磷肥17%钾肥17%中微量元素5%土壤改良剂15%。
5.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，所述的包膜了的含菌根菌、 溶磷菌和解钾菌的固体培养物的制备过程如下1)将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球； 将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数量分别达到25-30亿个/ml。2)含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备将泥炭土、玉米粉和膨润土粉的混合物研磨，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液吸附到混合物上，拌勻；3)包膜包膜材料用膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，将包膜材料与含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物混合即可。
6.根据权利要求5所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于，步骤2)中将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物， 再研磨至50目；所述的菌根菌制成的液体悬浮液和溶磷菌、解钾菌菌液总体积混合物= 1 5-20mL/g ；步骤幻中包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料 含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可。
7.根据权利要求1所述的复合微生物颗粒剂，其特征在于所述的氮肥包括尿素；所述的磷肥包括磷酸二氢钾、过磷酸钙、磷酸二铵中的一种或几种的混合；所述的钾肥包括硫酸钾、氯化钾中的一种或两种的混合。所述的中微量元素包括硝酸钙、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、硼酸中的一种或几种的混合。所述的土壤改良剂包括膨润土、沸石、泥炭中的一种或几种的混合。
8.权利要求1-7所述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)菌种发酵将菌根菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，直至菌丝生长成为菌丝球；将溶磷菌和解钾菌分别单独经过斜面培养、摇床扩大培养，使发酵菌液的活菌数量分别达到25-30亿个/ml ；2)包膜的含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物制备将泥炭土、玉米粉和膨润土粉按照重量比1 1 1-1. 5得到的混合物，再研磨至50 目，拌勻备用；将摇床扩大培养的菌根菌的菌丝球与菌液勻浆，制成液体悬浮液，再和溶磷菌、解钾菌菌液混合，得到的菌液总体积混合物=1 5-20mL/g拌勻，得含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物，备用；包膜材料用90-120目的膨润土粉、高岭土粉、蒙脱粉或硅藻土，按包膜材料含菌根菌、溶磷菌、解钾菌的固体培养物=1-2 10混合5-10分钟即可；3)然后加入氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素、土壤改良剂，混合，造粒，干燥。
9.权利要求1-7所述的促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂的应用方法，其特征在于，直接施用于种植马尾松的周围土壤。
10.一种溶磷菌，其特征在于，为黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva) yL14，保藏号为 CCTCC M 2011356。
全文摘要
本发明公开了一种促进马尾松生长的复合微生物颗粒剂及其制备和应用方法，含有粘盖牛肝菌属和豆包属中的一种或几种外生菌根真菌作为菌根菌，与溶磷菌黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)yL14，保藏号为CCTCC M2011356、解钾菌的固体培养物用包膜材料包膜后，加入氮肥、磷肥、钾肥、中微量元素和土壤改良剂，混合造粒而成。采用本发明的复合微生物颗粒剂可促进马尾松根系对营养元素的吸收，提高营养元素的利用效率，促进马尾松生长；增强土壤保持水肥的能力，补充土壤养分，改善土壤微生态，在防治土壤地力衰退方面意义重大；材料来源方便，成本低廉，肥效好，利于推广应用。
文档编号C05G5/00GK102503722SQ20111032695
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者何苑皞, 刘君昂, 周国英, 靳爱仙, 黄鹏飞 申请人:中南林业科技大学
最新回复(0)