抑郁症的生物标记的制作方法
专利名称：抑郁症的生物标记的制作方法
技术领域：
已经鉴定了与非抑郁受试者的脑组织样品相比，在患有迟发性抑郁症 (late-onset depression)的受试者脑组织样品中被上调或被下调的生物标记。本发明提 供了筛选方法，以鉴定可用于治疗、预防和诊断迟发性抑郁症的化合物。本发明也提供可用 于治疗、预防和诊断迟发性抑郁症的方法。相关领域的描述有15%的美国人在其生命中的某一点受到抑郁症的影响，在任意指定的某一天就 有1亿人受到影响。发病年龄分布相当均勻并可突然在某些天发病或持续数年。超过半数 经历重性抑郁症(major depression)的人仅有一次发作。然而，随着每次连续发作，下次 发作时有15%的危险将成为躁狂症，诊断为双相性精神障碍。最终，大约15-20%重性抑郁 症患者变为慢性抑郁并且约15%重性抑郁症患者可能自杀(男性自杀率通常是女性的2 倍)。目前，对于涉及抑郁症的神经生物学仅有有限的了解，但是日益明确的是，该疾病 是多层面的并且可能涉及大量因素，这些因素或协同作用或独立作用而导致情感变化。抑 郁症是一种复杂障碍，并非受控于单一病理学，这样单一病理学可用作标记，用于治疗、诊 断和筛选的目的。涉及了许多神经递质系统，对若干靶标已经进行了广泛研究并导致产 生一定范围的治疗选项。目前可用的治疗包括单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、三环抗抑郁药 (TCA)、特异性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、去甲肾上腺素能再摄取抑制剂(NRI)、5-羟 色胺去甲肾上腺素能再摄取抑制剂(SNRI)和去甲肾上腺素多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)。 然而，现有抗抑郁药并不令人满意，因为它们有许多副作用，而且因患者病史和所治疗的确 切病症的不同而具有不同功效。大量的先期研究已经分析了在抑郁症病理学具有相关性的组织中的基因表达分 布型。US20050209181公开了在作为涉及精神分裂症的途径或通路的下列10个脑区中 的基因表达的DNA微阵列分析前扣带回皮层(anteriorcingulate cortex)、背外侧前 额叶皮层、杏仁体、小脑皮层、嗅内区皮质、颞上回、顶叶皮层、伏隔核、腹侧丘脑、中丘脑和 /或海马。该专利申请也教导差异表达的基因也可能与抑郁症有关。在US20050209181 中鉴定的基因实例由下列GenBank ID号表示NM_007274，NM_004068, AL120173, AL581768, AF151034, BE677131, D63412, BC004443, ΝΜ_003458, ΝΜ_006317, ΝΜ_014962, U73304, BC004271, AL120332, AL022718, NM_006429, NM_000729, NM_001819, NM_024709, AL522296, AL134612, AI879661, AI141670, NM_017594, NM_004411, NM_014210, AI868167, AI826799,NM_021952,AW269335,NM_001975,NM_001978,NM_001958,NM_018315, AU145019, NM_002006, NM_022003, NM_000810, NM_000817, NM_000818, AL567302, NM_002045, BE670563, BC002666, AF200715, NM_005346, AI218219, AI810712, AL136591, BE617588, NM_138339, AI634532, NM-000194, BF346014, AL566367, AL136636, NM_021219, AB028968, AA736604, AA284075, NM_007054, NM_001290, NM_002347, NM_002415, N22468, U89330,W37431, AI693178, NM_006178, R38624, ΝΜ_016588, AF251061, NM_005382, AL537457, R38389, AF397394, BG285881, AB033605, NM_002796, NM_002849, AB037734, NM_002590, BFl12006， NM_006695, AI888503, AB014560, BC000314, NM_006054, N95026, NM_014575, NM_003469, NM_003026, AK000478, NM_005563, NM_007029, NM_030795, NM_001047, AL359592, AW139618, AV723167, BG260394, NM_003182, NM_017714, NM_014765, AB017269, AL565074, AF141349, AL565749, BF338045, NM_003366, NM_006876, AK023015, U73304。W02008020435公开了可用于治疗抑郁症的所谓“抑郁相关”基因的抑制剂。 W02008020435的抑郁相关基因的实例由以下GenBank ID号鉴别NM_000436，NM_001677, NM_004734, NM_004438, NM_000806， NM_000810, NM_000817， NM_000828, NM_006159, NM_002522， NM_002816, NM_002796, NM_002849， NM_021007, NM_020309， NM_004209, NM_002228oW00058473教导了与多种疾病状态(其中之一是抑郁症)相关的核酸和多肽。在 W00058473 中引用的 GenBank ID 号的实例如下AB002384、AB020690 (也在 W02007136797 中)、AC004010(也在 US20030220489 中；US20070172830 ；W00216387 ；W00134769 ； W00134628 ；W00132910。US20070172830公开了发现其表达与抑郁症相关的大量基因。这些实例由下列 GenBank ID 号鉴别AF035321、AC004010、AD001527。US20070172830 并未明确涉及抑郁症， 但提出所鉴定的基因可用于治疗各种各样的疾病状态，包括抑郁症。W02004047727使用DNA微阵列来研究经诊断患有抑郁症的患者尸体解剖的脑部 的表达分布型。该工作集中在3个脑区前扣带回皮层、背外侧前额叶皮层和小脑。这些标 记的实例由下列 GenBank ID 号鉴别:M95585、U35139、AL049650、AL022718。这些基因表达研究都没有明确指出与迟发性抑郁症的关联。在罹患迟发性抑郁症 的患者中大约有三分之一对初期抗抑郁药治疗无反应，同时他们仍然对复发、慢性和痴呆 具有非常高的危险(Cole 等，American Journal of Psychiatry 156，1182-1189 (1999))。 因此，就发病率和致死率以及健康和社会护理负担而言，迟发性抑郁症涉及相当高的费 用。在老年人中，抑郁症是仅次于痴呆的第二大最常见精神障碍，累及大约3%的65岁以 上的老人，还有12%罹患较轻的但仍会令人衰弱的抑郁症(Beekman等，British Journal of Psychiatry 174, 307-311 (1999)) 0迟发性抑郁症的神经生物学基础仍有大部分尚 未研究过，阻碍了对有效治疗的开发。已经提出，与年轻患者的抑郁症相比，对迟发性抑 郁症的临床管理应当根据其具体病理生理特征而定制(Thomas等，American Journal of Psychiatry157,1682-1684(2000) ；Thomas φ, British Journal of Psychiatryl81, 129-134(2002))。因此，在迟发性抑郁症的治疗和诊断中，需要具有特定应用的临床策略。发明概述目前已经证明，与非抑郁受试者相比，在迟发性抑郁症患者脑中有多种基因存在 差异表达。提供了筛选方法，用于鉴定用于治疗、预防或诊断迟发性抑郁症的化合物。也提 供可用于治疗、预防和诊断迟发性抑郁症的方法。本发明具有如下优势其提供了与迟发性 抑郁症的病理生理学明确相关的生物标记。发明详述
体内成像方法本发明提供用于判定受试者是否患有或易患迟发性抑郁症的体内成像方法，所述 方法包括下列步骤(i)将体内成像剂给予所述受试者，其中所述体内成像剂包含与多核苷酸或多肽 选择性缔合的化合物，所述多核苷酸或多肽由基因编码，所述基因选自本文的表2或表5中 所列举的那些，并且其中所述化合物用体内成像部分标记；(ii)让所述体内成像剂与在所述受试者组织中表达的所述多核苷酸和/或所述 多肽选择性缔合；(iii)通过体内成像方法检测由所述体内成像部分所发射的信号；和，(iv)产生代表所述信号的位置和/或数量的图像。本文所用的术语“^M^”是指这样的无创性技术该技术在给予体内成像剂之 后，产生受试者内部的全部或部分的图像。本发明的“警试者(患者)”优诜是哺乳动物,最优诜是完整的哺乳动物机体体内。 在一个特别优选的实施方案中，受试者是人，尤其是疑似患有或易患迟发性抑郁症的人。术 语“―”是指受试者完全因为遗传因素而具有发展疾病状态的易感性；按照一般的说法是 “天然”而非“后天(nurture)，，的。“迟发件抑郁症”是指首发于60岁以及以上人群的重性抑郁障碍。术语“重性抑郁 障碍”是指涉及任何下列症状的心境障碍持续悲伤、焦虑或“空虚”感；绝望感或悲观感； 负罪感、无价值感或无助感；对曾经享受的嗜好和活动(包括性)丧失兴趣或愉悦、活力下 降，疲劳，“慢下来”，难以集中注意力、回忆或做决定，失眠、过早觉醒或嗜睡，食欲和/或体 重减轻或者过度饱食和体重增加，想死或自杀或有自杀企图，烦躁或易激怒，或者对治疗无 反应的持续的身体症状，例如头痛、消化失调和慢性疼痛。“| ”体内成像剂优选通过胃肠外进行，最优选通过静脉内进行。静脉内途径代 表向所述受试者全身递送体内成像剂的最有效方式。本发明的体内成像剂优选以药用组合 物形式来给予，所述组合物包含体内成像剂以及生物相容性载体。“生物相容性载体”是流 体，尤其是液体，其中悬浮或溶解了体内成像剂，使组合物是生理上可耐受的，即可给予哺 乳动物体内而没有毒性或过度不适感。生物相容性载体介质适宜是注射用载体液，例如无 菌的、无热原的注射用水；水溶液，例如盐水(其可最好是经过平衡的，使注射用终产物是 等渗或不是低渗的)；一种或多种以下物质的水溶液张力调节剂(例如血浆阳离子与生物 相容性抗衡离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例 如甘油)或其它非离子型多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)。生物相容性载体介质也 可包括生物相容性有机溶剂，例如乙醇。这些有机溶剂可用于溶解更亲脂的化合物或制剂。 优选，生物相容性载体介质是无热原的注射用水、等渗盐水或乙醇水溶液。供静脉内注射用 生物相容性载体介质的PH的合适范围是4. 0-10. 5。体内成像剂所包含的“化合物”可以是生物分子、小分子、适体、反义mRNA、小干扰 RNA或抗体。术语“牛物分子，，包括例如以下分子如脂质、核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、 多肽、蛋白质、碳水化合物和无机分子。术语“小分子”是指分子量介于100-1000道尔顿之 间的有机化合物。术语“_”是指由免疫系统细胞产生的蛋白质或是指其与抗原结合的 片段。术语“反义mRNA”是指与ιΗ常加工为mRNA并翻译的链互补、或与其区域互补的RNA分子。术语是指人工核酸结合剂(参见例如Ellington和Szostak(1990)Nature 346 818-822)。术语“小干扰RNA”是指诱导序列特异性转录后基因沉默的双链RNA (参见 例如Elbashir等(2001)Genes Dev. 15 188-200) 优选，体内成像剂所包含的化合物是小 分子或生物分子，最优选小分子。适用于脑组织成像的体内成像剂的具体特征在以下有更 详细讨论。术语“诜择件缔合”是指体内成像剂与目标靶标的结合，所沭目标靶标即是由本文 所述的基因优先于其它组织编码的多核苷酸或多肽，以便有利于通过本发明的方法来鉴别 靶组织和非靶组织。可采用结合测定，例如下述涉及本发明筛选方法的那些测定，来测定体 内成像剂与目标靶标的结合。术语“^MSM”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合 物。具体的核酸序列也包括其保守修饰的变体，例如简并密码子取代、等位基因、直向同源 物、单核苷酸多态性和互补序列以及明确指出的序列。具体地讲，可通过产生一个或多个 所选(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，达到简并密 码子取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 5081 (1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes8 :91_98 (1994))。术语“核酸”可用于 指基因、互补脱氧核糖核酸(cDNA)和由基因编码的信使核糖核酸(mRNA)。术语“^li”是指氨基酸残基的聚合物。该术语用于这样的氨基酸聚合物其中一 个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物；以及用于天然存在的氨 基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的该术语包括任何长度的氨基酸链， 包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过其价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在的和合 成的氨基酸、以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，后者以类似于天然存在的氨基酸的方式 起作用。天然存在的氨基酸是由遗传密码所编码的那些，以及后期被修饰的那些氨基酸， 例如羟脯氨酸、y_羧基谷氨酸盐和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的 氨基酸相同的基本化学结构(即α-碳与氢、羧基、氨基和R基结合)的化合物，例如高丝 氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(例如正亮 氨酸)或修饰的肽主链，但仍保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本 文中可以用公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来表示。当多核苷酸是由基因“编遇”时，这是指该基因包含以下所需的信息⑴通过复 制获得脱氧核糖核酸(DNA)互补链，或(ii)通过转录获得mRNA。也包括从mRNA逆转录 到cDNA。当多肽是由基因“编码”时，这是指该基因包含以下所需信息(i)通过转录获得 mRNAdn (ii)通过翻译从所述mRNA获得所述多肽。术语“复制”、“转录”和“翻译”采用它 们在本发明领域中所接受的含义。也就是说，复制是DNA拷贝成DNA的过程，转录是DNA拷 贝成mRNA的过程，而翻译则是当mRNA的信息用作蛋白质合成的模板时。术语“基因”是指渉及产牛多肽链的DNA区段；它包括前导区和随后的编码区(前 导区和拖曳区)以及介于各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。仅有少数例 外，体内每个细胞都含有一整套染色体和相同的基因。然而，这些基因仅有一部分开启，正 是这些的亚类给每种细胞类型赋予独特性质。“基因表达”是这样的术语它用于描 述DNA内所含信息(储存的遗传信息)转录成为信使RNA(mRNA)分子，然后再翻译为蛋白质而行使大部分关键性的细胞功能。细胞所产生的mRNA的种类和数量反映了哪些基因被 表达，这又提供了细胞对其改变的需求是如何反应的相关信息。基因表达是一种高度复杂 并受到严格控制的过程，允许细胞对环境刺激和其自身变化需求产生动态反应。该机制起 到开/关转换作用，以控制在细胞中哪些基因被表达以及体量控制，即如有必要，增加或降 低特定基因的表达水平。“体内成像部分”是在将其给予所述受试者之后，可在该受试者机体外部检测的任 何物质。体内成像部分的存在提供了所成像的组织中多肽或多核苷酸数量的检测指标。术 语“用体内成像部分来标记，，是指体内成像部分可以是化合物的组成部分，或者可以是与化 合物缀合的单独实体。当体内成像部分与化合物缀合时，任选的接头部分将载体和体内成 像部分连接在一起。在给予步骤之后和检测步骤之前，允许体内成像剂与所述多核苷酸和/或所述多 肽选择性缔合。例如，当受试者是完整哺乳动物时，体内成像剂将会在哺乳动物体内动态移 动，与其中的不同组织接触。一旦体内成像剂接触表达所述多核苷酸和/或所述多肽的组 织时，就会发生特异性相互作用，使体内成像剂从所述组织中清除比从其它组织中清除需 要更长时间，因此确保产生代表特异性缔合的体内成像剂的图像。术语“_”用于描述缔合在一起，以行使特定生物学功能的细胞集合。本发明受 试者的基本组织类型是上皮组织、神经组织、结缔组织、肌肉组织和脉管组织。本发明体内 成像方法上下文中优选的组织是脑组织。通过所述体内成像部分的存在，来保证与所述受试者的所述多核苷酸或多肽选择 性缔合的体内成像剂水平的“检测”步骤。合适的体内成像技术是这样的技术该技术可检 测由所述体内成像部分发射的信号，并产生表示所述受试者所述组织中存在的体内成像部 分的位置和/或数量的数据。例如，SPECT可用作体内成像部分发射γ射线的检测技术。本发明体内成像方法的上下文中优选的脑区是前扣带和伏隔核。这两个脑区都与 抑郁症的临床症状相关，并且在本文证明与迟发性抑郁症中改变的基因表达有关。当成像 的脑区是前扣带时，优选的基因是选自表3所列举那些的基因。当成像的脑区是伏隔核时， 优选的基因是选自表6所列举那些的基因。具体的需求要求体内成像剂适用于成像脑组织。与身体的其它部分相比，在脑中， 内皮细胞通过“紧密连接(tight junction)”的方式更紧密地包裹在一起，所述紧密连接是 形成相邻上皮细胞间的密封，阻止大部分溶解分子从上皮层的一侧跨越到另一侧的多功能 复合物。这个所谓的血脑屏障(BBB)阻止所有分子运动，除了通过脂溶性方式跨越细胞膜 的那些分子(例如氧气、二氧化碳、乙醇和留体激素)和通过特殊转运系统而允许的那些分 子(例如糖和某些氨基酸)之外。分子量大于500道尔顿的物质通常不能通过被动扩散方 式跨越BBB，而较小分子通常是可以的。除了紧密连接的作用阻止了在内皮细胞间的转运之 外，还有两种机制可阻止被动扩散。在脑内围绕毛细血管的神经胶质细胞是亲水性分子的 第二屏障，而且脑内的低浓度间隙蛋白也能阻止亲水性分子通过。通过测定辛醇_水的分配系数(P)，通常可评价脂溶性，通常表示为Iogltl值，在本 文中称为“logP”。辛醇-水的分配系数表示物质在有机相与水相之间的分布。IogP提供 了测定化合物的亲脂性或亲水性的简单方式。比例定义为
分配=[辛醇中存在的化合物]/[水中存在的化合物]该等式可表示为Log分配=Iogltl[辛醇中存在的化合物]/[水中存在的化合物]简而言之，IogP计算的正数越大，化合物亲脂性就越大。对于潜在的新型药用化 合物而言，通常求出IogP的计算值，因为它提供了化合物在给予后在体内将会怎样分配到 各区室(compartmentalised)的相关知识。适用于本发明的体内成像剂的IogP范围为1. 0-4. 5，优选范围为1. 0-3. 5，最优选 范围为2. 0-3. 5。在体外和体内评价之前，可以先获取估计IogP值(AlogP98)，例如使用DS MedChem Explorer软件(Accelerys)。除了有利于CNS穿透之外，该范围内的亲脂性还允许 体内成像的快速清除，这在放射性卤素是相对短寿命的放射性同位素例如18F时特别重要。可通过使用Accelerys DS MedChem Explorer软件，与文献比较体内脑穿透数据， 用计算机(in silico)评价特定体内成像剂的BBB穿透特性。“logBbR”是[脑浓度]/[血 浓度]的log1(l。用于本发明方法的体内成像剂的IogBbR的合适范围为0.0-1.0，优选范围 为0. 3-1. 0，最优选范围为0. 5-0. 7。用于本发明体内成像方法的优选的体内成像部分选自(i)放射性金属离子；(ii)顺磁性金属离子；(iii)发射、射线的放射性卤素；(iv)发射正电子的放射性非金属；和，(ν)超极化NMR-活性核。当体内成像部分是放射性金属离子即射电金属时，合适的射电金属可以是正电子 发射体，例如 64CU、48V、52Fe、55C0、94mTc 或 68Ga ；或者 Y -发射体，例如 99mTC、mIn、113mIn 或 67Ga。 优选的射电金属是99mTc、64CU、68Ga和mIn。最优选的射电金属是Y _发射体，尤其是99mTc。当体内成像部分是顺磁性金属离子时，合适的这类金属离子包括Gd(III)、 Mn (II)、Cu (II)、Cr (III)、Fe (III)、Co (II)、Er (II)、Ni (II)、Eu (III)或 Dy(III)。优选的 顺磁性金属离子是Gd(III)、Mn (II)和Fe (III)，尤其优选Gd (III)。当体内成像部分是发射Y射线的放射性卤素时，放射性卤素适宜选自1231、1311或 77Br。125I虽然在本文所述的体外筛选方法适用于作为可检测标记，但不适用于作为体内成 像部分。优选的发射Y射线的放射性卤素是1231。当体内成像部分是发射正电子的放射性非金属时，合适的这类正电子发射体包 括=Hd15CK17FJ8FJ5BiN76Br或124L优选的发射正电子的放射性非金属是"C、13N、18F和 124I，尤其是11C和18F,最尤其是18F。当体内成像部分是超极化NMR-活性核时，这类NMR-活性核具有非零核自旋，包括 13C、15N、19F、29Si和31P。这其中，优选13C。术语“超极化”是指NMR-活性核的极化度增强，超 出了它的饱和极化(equilibrium polarisation) 0 13C的天然丰度(相对于12C)约为1%, 在超极化之前，合适的13C标记的化合物可适当地富集到至少5%的丰度，优选至少50%，最 优选至少90%。本发明体内成像剂的至少一个碳原子适宜富集13C,然后再超极化。本发明优选的体内成像部分是在以无创性方式体内给予之后，能够在外部检测的 那些，例如通过SPECT、PET和MRI。体内成像用的最优选的体内成像部分是放射性的，尤其是放射性金属离子、发射Y射线的放射性卤素和发射正电子的放射性非金属，尤其是那些 适合用SPECT或PET来成像的那些。本发明优选的体内成像剂在体内不容易进行代谢，因此最优选在人体内的半衰期 为60-240分钟。体内成像剂优选通过肾脏排泄(即表现出尿排泄)。体内成像剂在患病病 灶处的优选信号-背景比至少为1. 5，最优选至少为5，尤其优选至少为10。当体内成像剂 包含放射性同位素时，体内成像剂(其是非特异性结合或在体内游离)峰水平的一半的清 除，优选发生的时间周期小于等于体内成像部分的放射性同位素的放射性衰变半衰期。此外，体内成像剂的分子量适宜至多为5000道尔顿。优选，分子量范围为 100-3000道尔顿，最优选为200-1000道尔顿。此外，和如上所述，对于适用于脑组织成像的 体内成像剂而言，需要体内成像剂的分子量小于500道尔顿。体内成像剂的尤其优选的分 子量范围因此为200-500道尔顿。当体内成像剂包含多肽和体内成像部分时，体内成像部分通过多肽的N-端或 C-端、或者通过任何氨基酸侧链来缀合。优选，体内成像部分通过N-端或C-端与多肽缀 合，任选通过接头，例如聚乙二醇接头。或者，体内成像剂的官能团可包含体内成像部分。当官能团包含体内成像部分时， 这表明体内成像部分构成体内成像剂的部分化学结构。例如，体内成像部分可以是其水平 显著超过所述同位素天然丰度水平的放射性同位素。同位素的这类升高或富集水平适宜为 所述同位素天然丰度水平的至少5倍，优选至少10倍，最优选至少20倍，和理想的是至少 50倍；或以这样的水平存在其中所述同位素富集水平为90-100%。这类官能团的实例包 括具有升高水平的123I的碘代苯基，具有升高水平的11C的CH3基团，和具有升高水平的18F 的氟代烷基，使得成像部分是在化学结构内的同位素标记的11C原子或18F原子。可使用本发明的筛选方法，鉴定并获取与由本文定义的基因所编码的多核苷酸或 多肽选择性缔合的化合物，所述方法在下文有更详细描述。当所述筛选方法是结合测定时， 需要化合物与目标靶标的结合具有纳摩尔浓度的效力，即其解离常数(Kd)介于0. Ol-IOOnM 之间，优选介于0. Ol-IOnM之间，和最优选介于0. 01-1. OnM之间。可便利地通过使前体化合 物与合适来源的所需体内成像部分反应，进行这样的化合物标记，以提供体内成像剂。“前 体化合物”包括成像剂的未标记衍生物，其经设计使得与体内成像部分的便利化学形式的 化学反应以位点特异性方式发生；可以在最少数量的步骤中进行(理想的是单个步骤)；和 无需显著的纯化(理想的是无需进一步纯化)，以得到所需的体内成像剂。这类前体化合物 是合成的，并可便利地以良好的化学纯度而获取。前体化合物可任选包含保护基团，用于保 护前体化合物的某些官能团。术语“保护基团”是指这样的基团所述基团可抑制或阻止不想要的化学反应，但 其经设计具有足够的反应性，使其可在不改变分子的其它部分的足够温和的条件下，从所 述官能团上裂解下来。脱保护后，就得到所需体内成像剂。保护基团是本领域技术人员众 所周知的并适宜选自对于胺基，Boc (其中Boc是叔丁氧基羰基)、Fmoc (其中Fmoc是芴 基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4_ 二甲基-2，6-二氧代亚环 己基)乙基]或Npys (即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)；和对于羧基，甲酯、叔丁酯或苄酯。 对于羟基，合适的保护基团是甲基、乙基或叔丁基；烷氧基甲基或烷氧基乙基；苄基；乙酰 基；苯甲酰基；三苯甲基(Trt)或三烷基甲硅烷基，例如四丁基二甲基甲硅烷基。对于巯基，合适的保护基团是三苯甲基和4-甲氧基苄基。其它保护基团的使用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis', TheorodoraW. Greene 禾口 Peter G. M. Wuts,(第 3 版，John ffiley&Sons,1999)。当体内成像部分是金属离子(例如用于SPECT的99mTc或用于MRI的Gd(III)) 时，体内成像剂优选包含放射性金属离子与合成配体的金属络合物。术语“金属络合物” 是指金属离子与一个或多个配体的配位络合物。强烈优诜金属络合物是“杭转移盩合 (transchelation)，，的，即不容易与其它可能的竞争性配体对金属配位位置进行配体交换。 可能的竞争性配体包括在体外制备中的其它赋形剂(例如用于制备的辐射防护剂或抗微 生物防腐剂)，或体内的内源化合物(例如谷胱甘肽、转铁蛋白或血浆蛋白)。术语“佥成” 具有其常规含义，即人造的，与从天然来源例如从哺乳动物体内分离的相反。这类化合物具 有这样的优势它们的制备和杂质分布可以完全控制。可用于本发明的形成抗转移螯合的金属络合物的合适配体包括螯合剂，其中 2-6个、优选2-4个金属供体原子是这样排列的使得5元或6元螯合环产生(通过具有连 接碳原子或非配位杂原子的金属供体原子的非配位主链)；或包含与金属离子强烈结合的 供体原子的单齿配位体，例如异腈类、膦类或二氮烯化物(diazenides)。可与金属良好结 合成为螯合剂组成部分的供体原子类型的实例是胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成这类强 金属络合物，甚至单齿或二齿膦都形成合适的金属络合物。异腈和二氮烯化物的线性几何 构型使它们自身不容易结合到螯合剂中，因此通常用作单齿配位体。合适的异腈的实例包 括简单的烷基异腈例如叔丁基异腈，以及醚取代的异腈例如MIBI (即1-异氰基-2-甲氧 基-2-甲基丙烷)。合适的膦类的实例包括替曲膦和单齿膦类例如三(3-甲氧基丙基)膦。 合适的二氮烯化物的实例包括HYNIC系列配体，即胼取代的吡啶或烟酰胺。上述配体特别适合于络合锝例如94mTc或99mTc,更充分的描述可参见Jurisson等 [Chem. Rev. ,99, 2205-2218 (1999) ] 0配体也可用于其它金属，例如铜(64Cu或67Cu)、钒(例 如48V)、铁(例如52Fe)或钴(例如55Co)。其它合适的配体描述于Sandoz WO 91/01144，其包括特别适于铟、钇和钆的配体， 尤其是大环氨基羧酸酯配体和氨基膦酸配体。形成钆的非离子型(即中性)金属络合物的 配体是已知的并描述于US4885363。对于钆，特别优选的是包括以下物质的螯合物DTPA、 乙二胺四乙酸(EDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷_1，4，7， 10-四乙酸(DOTA)、10- (2-羟基丙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷_1，4，7-三乙酸(D03A) 和这些物质的衍生物。当体内成像部分是放射性卤素时，优选的前体化合物是包含经历亲电或亲核的放 射性卤化或者经历与带标记的醛或酮的缩合的衍生物的那些。第一类的实例是(a)有机金属衍生物例如三烷基锡烷(例如三甲基甲锡烷基或三丁基甲锡烷基) 或三烷基硅烷(例如三甲基甲硅烷基)，或有机硼化合物(例如硼酸酯(boronate ester) 或有机三氟硼酸酉旨(organotrifluoroborate))；(b)用于卤素交换的非放射性烷基溴或者用于亲核碘化反应的对甲苯磺酸烷基 酯、甲磺酸烷基酯或三氟甲磺酸烷基酯；(c)向亲核碘化活化的芳环(例如芳基碘餘〗盐芳基重氮物、芳基三烷基铵盐或硝 基芳基衍生物)。
前体优选包括非放射性卤原子，例如芳基碘或芳基溴(以允许放射性卤素交 换)；有机金属前体化合物(例如三烷基锡、三烷基甲硅烷基或有机硼化合物)；或有机前 体，例如三氮烯或用于亲和取代的良好离去基团例如碘每t盐。对于放射性碘化，优选的前体 包括有机金属前体化合物，最优选三烷基锡。前体和将放射性碘导入有机分子中的方法描述于Bolton [J. Lab. Comp. Radiopharm. ,45,485-528 (2002)]。合适的硼酸酯有机硼化合物和它们的制备方法描述于 Kabalka 等[Nucl. Med. Biol. ,29,841-843(2002)和巡，369-373 (2003)]。合适的有机三氟 硼酸酯和它们的制备方法描述于Kabalka等[Nucl. Med. Biol. ,31,935-938 (2004) ] 0可采用18F-氟化物与具有良好离去基团(例如烷基溴、烷基甲磺酸酯基或烷基甲 苯磺酸酯基)的前体中的合适化学基团进行反应，通过直接标记，进行放射性氟化反应。也 可通过N-卤代乙酰基与18F(CH2)3OH反应物的烷基化反应，产生-NH(CO)CH2O(CH2)318F衍生 物，来将18F导入。对于芳基系统，从芳基重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐的18F-氟化 物亲核置换是产生芳基-18F衍生物的合适途径。18F标记的体内成像剂可通过如下方式获得形成18F氟代二烷基胺，随后当18F氟 代二烷基胺与含有例如氯、P(O)Ph3或活化酯的前体反应时形成酰胺。更多的放射性氟化方 法，尤其是适用于肽的放射性氟化方法，描述于WO 03/080544(其使用巯基偶联)和描述于 W004/080492 (其使用氨基氧基偶联)。18F标记衍生物合成途径的更多细节描述于Bolton， J. Lab. Comp. Radiopharm.，45，485-528 (2002)。本发明方法的体内成像剂可通过试剂盒而容易地获取。这样的试剂盒包括合适的 前体化合物，优选呈无菌无热原形式，使得与无菌来源的体内成像部分的反应使用最少数 量的操作就产生所需的体内成像剂。这类考虑在放射性体内成像剂的情况下特别重要，尤 其是当放射性同位素具有相对短的半衰期时，可便于操作并因此降低对放射性药物学家的
辐射剂量。重建这类试剂盒的反应介质优选是生物相容性载体，如本文先前所定义，从而得 到包含所述体内成像剂的药用组合物。在本发明的体内成像方法中，检测步骤之后是产生图像的步骤，该图像表示由体 内成像部分所发射的信号。本发明方法中的这个产生步骤通过计算机来进行，计算机将重 建算法用于所获取的信号数据以得到数据集。然后处理该数据集，产生显示受试者体内目 标区域的图像。这些图像提供可用于迟发性抑郁症的诊断方法的信息。诊断方法另一方面，本发明提供上述关于体内成像方法所定义的体内成像剂，用于迟发性 抑郁症的诊断方法。此外，本发明提供用于诊断迟发性抑郁症的方法，所述方法包括(a)如上定义的体内成像方法；和，(b)将步骤(a)所产生的图像与体内图像比较，该体内图像表示当在非抑郁受试 者中进行所述体内成像方法时，所述体内成像剂的摄取模式(pattern of uptake) 0诊断方法的组织和受试者的合适和优选的实施方案的定义同上述体内成像方法。代表非抑郁受试者的图像中，本文所述多肽或多核苷酸的水平变化(向上或向 下)表明，该受试者患有迟发性抑郁症或处于发展迟发性抑郁症的至少某些方面的危险
12中。当在非抑郁受试者中进行所述体内成像方法时，通过以下方法得到代表所述体内 成像剂的摄取的图像在非抑郁受试者的适当匹配组上进行如上定义的体内成像方法，并 且产生代表所有得到的图像的平均水平的图像。治疗方法可将调节受体活性的化合物给予受试者，用于治疗迟发性抑郁症，所述受体是由 选自表3或表6所列举那些的基因编码。因此，本发明提供用于治疗迟发性抑郁症患者的 方法，所述方法包括给予药用组合物，所述药用组合物包含(a)药物有效量的与多核苷酸或多肽选择性缔合的化合物，所述多核苷酸或多肽 是由选自表3或表6中所列举那些的基因编码；和，(b)生物相容性载体。生物相容性载体是广泛的，如本说明书先前所定义。所选的具体生物相容性载体 部分是由有待给予的具体药用组合物、以及用于给予组合物的具体方法而决定的。因此，有 各种各样的合适药用组合物制剂(参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 17版.1985))。适于给药的制剂包括水和非水溶液、等渗无菌溶液，它们可含有抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂等渗性的溶质；以及水和非水无菌混悬剂，其可包含悬浮剂、增 溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。用于治疗的给药可通过使药物化合物接触有待治疗的组织的任何常用途径来进 行，这是本领域技术人员众所周知的。尽管多于一种途径可用于给予特定组合物，但是一种 特定途径通常可比另一途径提供更直接和更有效的反应。在本发明的实践中，药用组合物 可通过例如以下方式给予口服、鼻内、局部、静脉内、腹膜内或鞘内。可将药用组合物装入 单剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和小瓶中。可从上述种类的无菌粉末、颗粒和片来制 备溶液剂和混悬剂。药用组合物也可作为预制食物或药物的一部分来给予。化合物的“藍 物有效量”是在一段时间内在警试者中足以起到有益反应的剂量。任何患者的最佳剂量水 平将会因各种各样的因素(包括所用的特异性调节剂的功效、患者的年龄、体重、身体活动 和膳食)的不同而异，也取决于与其它药物的可能组合并取决于精神障碍的严重程度。剂 量大小也可由伴随将特定药用组合物给予特定受试者的任何不良副作用的存在、特性和程 度来决定。在确定有待给予的药用组合物的有效量时，医生可评价药用组合物的循环血浆水 平、药用组合物毒性和抗药用组合物抗体的产生。一般而言，对于典型受试者，化合物的剂 量当量为约lng/kg至10mg/kg。为了给予，药用组合物可以按照化合物的LD-50所决定的 速率和化合物在不同浓度时的副作用来给予，当用于群体(mass)和总体健康的受试者时。此外，上述关于本发明体内成像方法所定义的体内成像剂可用于决定是否实施如 上定义的治疗方法的方法，所述决定方法包括(a)如本文中定义的体内成像方法；和，(b)评价步骤(a)的体内成像方法所产生的图像，以决定是否实施所述治疗方法。筛选方法另一方面，本发明提供鉴定与多核苷酸或多肽选择性缔合的化合物的筛选方法， 所述方法包括
(i)使所述化合物与多肽或多核苷酸接触，所述多核苷酸或多肽是由选自表2或 表5中所列举那些的基因编码；和，(ii)测定所述化合物对所述多肽或所述多核苷酸的效应。本发明筛选方法中的“4i^l〖”的合适和优选的方面同以上本发明体内成像方法 所提供的。按照其最广泛含义，所述化合物与多肽或多核苷酸的“_”步骤是指使所述化合 物与所述多肽或多核苷酸彼此进行物理接触。这可在体外或体内完成，更多细节如下所述。“ii^lim^”是所述化合物与所述多核苷酸或所述多肽之间的任何特异性相 互作用。这样的特异性相互作用包括所述化合物与所述多核苷酸或所述多肽的特异性结 合，并包括由所述化合物诱导的对所述多核苷酸或多肽的表达水平或活性的任何调节。“测定”化合物效应的步骤可通过本领域众所周知的方法来讲行。这种众所周知 的筛选方法的一个实例是，在测定步骤中所测的效应是所述化合物与所述多肽或多核苷酸 的结合。这样的结合测定优选涉及本文所述的分离的多肽或多核苷酸与一种或多种化合 物接触，并允许有足够时间让多肽或多核苷酸与化合物形成结合复合物。术语“iM”是 指从其它细胞组分中分离出来，并且也可包括合成的多核苷酸和多肽。可以使用多种已 建立的分析技术中的任一种来检测所形成的任何结合复合物。蛋白质结合测定包括但不 限于测定共沉淀的方法、在非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上测定共迁移的方法和基于蛋白 质印迹测定共迁移的方法(参见例如Bennet和Yamamura，(1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods (神经递质、激素或药物受体的结合方法)” 载于 Neurotransmitter ReceptorBinding(Yamamura,H. I.等编著，第 61-89 页)。用于这 类测定的蛋白质可以是天然表达的、克隆的或合成的。结合测定也可用于例如鉴定与多肽 相互作用的内源蛋白。例如，在结合测定中可鉴定与多肽结合的抗体、受体或其它分子。在 许多情况下，在结合测定中的至少一种反应物包含可检测标记。在该上下文中的术语“ _ 愈”包括化合物、多肽、多核苷酸或用于特异性检测它们的任何抗体。“可检泖丨标记”可以是 具有可检测理化性质的任何物质。因此，可检测标记的存在提供了结合反应物数量的检测 指标。根据所用的具体可检测标记，合适的检测技术用于测定选择性结合的可检测标记的 数量。适用于本发明筛选方法的可检测标记包括通过光谱法、光化学法、生化法、免疫化学 法、电学方法、光学或化学方法在体外可检测的那些，包括⑴磁珠(例如Dynabeads )；(ii)荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)；(iii)放射性标记(例如 3H、125I、35S、14C 或 32P)；(iv)酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)；和，(ν)量热标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。检测这些可检测标记的方式是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，当可检测 标记是放射性标记时，是指用于包括闪烁计数器或如在放射自显影术中的照相胶片在内的 检测。当可检测标记是荧光标记时，可通过用合适波长的光激发荧光染料并检测所得荧光， 对其进行检测。可对荧光进行目测，通过照相胶片、通过使用电子检测器例如电荷耦合器件 (CCD)或光电倍增管等。类似的，可通过提供酶的合适底物并检测所得反应产物，来检测酶学可检测标记。本发明的筛选方法也可优选在体外进行，其中所述多肽或多核苷酸在细胞中表达 并使细胞与化合物接触。这类方法通常涉及进行基于细胞的测定，其中使化合物与表达本 文所述的多肽或多核苷酸的一个或多个细胞接触，然后检测转录产物、翻译产物表达的增 加或减少或者催化产物的增加或减少。本文所述的多核苷酸在细胞中的表达水平可测定如 下通过用与所述多核苷酸的转录物(或互补核酸)特异性杂交的化合物，来测定细胞中表 达的mRNA。可通过裂解细胞并进行RNA印迹或者不裂解细胞而用原位杂交技术，进行测定。可使用免疫学方法对多肽进行测定，其中用化合物探测细胞裂解物，所述化合物 是与所述多肽特异性结合的抗体。可通过测定酶的产物的产生或通过测定底物的消耗，测定多肽的催化活性。活性 是指催化速率或者多肽结合底物(Km)或释放催化产物(Kd)的能力。可按照通用生化分析进行多肽的活性分析。这类测定包括基于细胞的测定以及涉 及纯化或部分纯化的多肽或粗制细胞裂解物的体外测定。测定通常涉及提供已知数量的底 物并以时间的函数定量产物。也可进行筛选方法，其中所述接触步骤包括将所述化合物给予迟发性抑郁症的动 物模型。所用的动物模型通常是任何种类的哺乳动物。优选动物的具体实例包括但不限于 灵长类动物、小鼠和大鼠。在一个实施方案中，将抑郁症(慢性和急性)的大鼠模型(其中 大鼠经历应激)用于筛选。在一个实施方案中，可使用无脊椎动物模型例如果蝇模型，筛选 本文所公开的人类基因的果蝇直向同源物的调节剂。在另一个实施方案中，包括基因敲除 技术在内的转基因动物技术(例如作为与合适的基因打靶载体同源重组的结果)，或基因 过量表达，将会导致多核苷酸或多肽表达的缺失、减少或增加。发现由这些方法所产生的转 基因动物可用作精神障碍的动物模型，并可用于筛选精神障碍的调节剂。可通过同源重组，将标记基因或其它异源基因插入到小鼠基因组的内源基因位 点，制备敲除细胞和转基因小鼠。也可通过用多核苷酸突变形式取代内源多核苷酸，或通过 例如暴露给致癌剂而使内源多核苷酸突变，制备这样的小鼠。在一个优选的实施方案中，在上述任何实施方案中所述的筛选方法涉及使所述化 合物与所述多肽接触，并测定所述化合物对所述多肽的效应。用于本发明的方法本文描述了对在迟发性抑郁症患者脑组织中特异性差异表达的基因表达模式进 行的研究。与抑郁症相关的大的症状谱反映出复杂的遗传学基础和这些受试者中复杂的基 因表达模式。此外，脑途径或通路以及亚细胞途径对于理解精神障碍的发展和诊断而言是 重要的。经选择用于评价的脑区(前扣带(cingulate) (AC)和伏隔核(nucleusaccumbens) (NA))涉及抑郁症的临床症状。脑区中细胞结构的改变、关键性神经递质或相关分子在脑区 的表达、以及脑区中的亚细胞途径，都涉及到抑郁症的发展。通过微阵列表达分析，获取本发明所依据的数据。用于这类分析的阵列称为“表达 芯片”。固定化DNA是从已知基因的mRNA逆转录而来的cDNA，而且至少在某些实验中，与芯 片杂交的对照和样品DNA分别是从正常和患病组织的mRNA逆转录而来的cDNA。如果一个 基因在某种疾病状态中过量表达，则与对照cDNA相比有更多样品cDNA与代表该表达基因 的点杂交。结果，该点发出的红色荧光比绿色荧光的强度更大。一旦研究人员表征了涉及多种疾病的多个基因的表达模式之后，就可使来自任何个体的患病组织的cDNA杂交，以确 定来自个体的基因的表达模式是否与已知疾病的表达模式匹配。如果是这样，则可启动适 用于该疾病的治疗。微阵列方法的有用综述可参见Nature Genetics，1999年1月增刊。与本发明最相 关的是Botwell的文章，在第25-32页，其中描述了如何采用微阵列技术来获取表达数据。 现在提供该技术的概述。DNA “微阵列”是将来自上千个不同基因的序列在固定位置上固定或连接的小的固 体支持物。支持物本身通常是显微镜载玻片，但也可以是硅片或尼龙膜。将DNA印刷、印渍 或甚至直接合成在支持物上。重要的是，微阵列中的基因序列以有序或固定方式连接在它 们的支持物上，因为阵列中各点的位置用于鉴定特定基因序列。各点本身可以是DNA、cDNA 或寡核苷酸。微阵列可由研究人员制备或来自市售，取决于例如可用的成本、时间和人力资 源的问题。Genechip 阵列是市售阵列，是使用结合了光版印刷和组合化学的技术而制备 的(www, affymetrix. com)。每个阵列上至多合成130万个不同的寡核苷酸探针。每个寡核 苷酸位于阵列的特定区域，称为探针室(probe cell)。每个探针室都含有成百上千个至数 百万个给定寡核苷酸的拷贝。为了从mRNA得到cDNA，采用逆转录，这是DNA聚合酶(称为逆转录酶)将单链核 糖核酸(RNA)转录成为双链DNA的过程。通常，在该反应中，聚-T(胸苷)引物用作引物， 因为mRNA具有聚-A (腺苷)尾。输入mRNA的质量是至关重要的，以获得适用于微阵列分析的cDNA。尸体解剖采样 中的RNA完整性可受到死亡前后(pre-mortem andpost-mortem)事件的影响，也受到表达 水平与例如以下混淆因素之间相互关系的影响供体死亡年龄、死前低氧、濒死事件和濒死 期持续时间、脑PH、采样前的死后时间间隔和RNA完整性(Stan等，2006 ；BrainResearch ； 1123(1) :1-11)。因此，重要的是筛选RNA样品，以选择适用于微阵列分析的那些。在评价 RNA质量之前，对样品可以进行简单的pH测定，作为濒死状态的指标。然后，多种方法可用 于测定 RNA 质量(Copois 等，2007J Biotechnol ； 127 (4) :549_59)，其中之一就是 RNA 完整 性数(RIN，Agilent Technologies) 0使用在显微制造的芯片上进行的电泳分离，分离RNA 样品，然后通过激光诱导的荧光检测来测定。生物分析仪软件产生电泳图谱和凝胶类图像 并显示出结果，例如样品浓度和所谓的核糖体比(18S与28S核糖体条带之比)。使用RIN 软件算法进行RNA完整性数据的标准化解释，该算法允许基于从1到10的计数系统，对真 核的总核RNA(riboeukaryotic total RNA)进行分类，其中1是降解最多的分布类型，而10 是最完整的。DNA微阵列技术促进了对DNA序列信息的鉴定和分类，以及这些新基因的功能分 配。微阵列是通过利用给定mRNA分子与其来源的DNA模板特异性结合或杂交的能力而起 作用的。术语“M”是指互补的单链核酸结合或退火成一个双链分子的过程。通过使用 含有多种DNA样品的阵列，就可以通过测定与阵列上各位点结合的mRNA数量，而在单一实 验中测定细胞内成百上千个基因的表达水平。借助于计算机，就可准确测定出结合在微阵 列各点上的mRNA数量，产生细胞中基因表达的分布图。有关核酸杂交的一般性指南可参见Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles ofHybridization and the strategy of nucleic acidassays (杂交原则禾口核酸测定策略的 综述)，，(1993)。通常，选择严格性条件是在指定离子强度、pH下，比特定序列的热解链温 度(Tm)低约5-10°C。Tm是(在指定离子强度、pH和核浓度下)在平衡时，50%探针与靶 标杂交形成靶序列的温度(当靶序列过量存在时，在Tm下，在平衡时有50%探针被占据)。 “严格件”条件将是以下哪㈣条件其中盐浓度小于约1. OM钠离子，通常约0. 01-1. OM钠离 子浓度(或其它10种盐)，在pH 7.0-8. 3，温度至少约为30°C (对于短探针，例如10-50个 核苷酸)和至少约为60°C (对于长探针，例如大于50个核苷酸)。严格性条件也可通过加入去稳定剂例如甲酰胺而达到。对于选择性或特异性杂 交，阳性信号至少是背景的2倍，任选是背景杂交的10倍。示例性的严格性杂交条件可以 如下50%甲酰胺、5X SSC和SDS，在42°C孵育，或5X SSC、1 % SDS，在65°C孵育，并在 0. 2X SSC和0. SDS中在65°C洗涤。这样的洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长 时间。在严格性条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本相同的，如果它们所编码的多肽基 本相同时。这发生在例如当使用遗传密码所能允许的最大密码子简并而产生核酸拷贝时。 在这类情况下，核酸通常在适度的严格性杂交条件下杂交。示例性的“适度的严格性杂交条 件”包括在40%甲酰胺、IM NaClU % SDS的缓冲液中，在37°C杂交，并在IXSSC中在45°C洗 涤。这样的洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。阳性杂交至少是背景的2倍。 普通技术人员将会容易地理解，可使用替代性杂交和洗涤条件以提供类似的严格性条件。杂交步骤完成之后，将微阵列放入由一些激光器、专用显微镜和照相机组成 的“阅读器”或“扫描仪”中。实例包括Packard BioChip成像器、Molecular Dynamics Avalanche和Genetic Microsystems GMS 418阵列扫描仪。荧光标签受到激光器的激 发，显微镜和照相机共同工作而产生数字化阵列图像。典型的微阵列实验产生上千个数 据点，这表明需要用于存储和处理数据的成熟技术。所使用的工具可包括对来自阅读器 的数据进行图像分析的软件，存储和链接信息的数据库，以及将单个克隆(clone)的数据 与网络数据库例如GenBank链接的软件。GenBank序列数据库是开放性入口，是所有公 众可得的核苷酸序列和它们的蛋白质翻译的注释集合(http://www. ncbi.nlm.nih. rov/ sites/entrez ？ db =核苷酸)。该数据库是在国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI))产生的，作为国际核苷酸序列数据库合作项目 (InternationalNucleotide Sequence Database Collaboration,^ INSDC)的 微阵列目前已用于分析采自患有迟发性抑郁症患者脑的尸体解剖样品的mRNA表 达分布型。选择前扣带和伏隔核用于分析，因为已知这些脑区与抑郁症的病理生理学相关。 与正常个体相比，在经诊断患有抑郁症的患者的所选脑区中，在mRNA水平上，已经显示了 许多基因表达的改变(表2和表5，和优选表3和表6)。现在，详细描述用于获取本发明所 依据数据的具体方案。实施例简述实施例1描述了用于对来自抑郁和非抑郁受试者的前扣带样品进行转录组学分 析的方法。实施例2描述了用于对来自抑郁和非抑郁受试者的伏隔核样品进行转录组学分 析的方法。实施例实施例1 前扣带转录组学实施例1⑴样品诜择冷冻脑组织(贮存在-80°C )是来自10名迟发性抑郁症患者的额叶皮层，并且与 10名精神病学上健康的对照受试者在年龄、性别、死后时间间隔和濒死状态上相匹配。所 有受试者都是突然死亡，濒死状态的平均持续时间约7小时(Li等，Hum Mol Genet 13, 609-616(2004))。选择这些数字是为了在微阵列上，在> 士2SD的常规显著性水平上足以 检测组间差异，或使用基于DIGE的蛋白质组学分析。抑郁受试者全都患有DSM-IV重性抑郁 症，而且病例记录回顾证明了这一点，而且他们没有其它精神病。筛选了对照的病例记录， 以确保他们没有任何精神疾病。所有受试者接受尸检和神经病理学检查，没有人具有与痴 呆相符的变化。通过作为濒死状态标志评价pH，筛选组织的适用性。在-80°C贮藏库中获取样 品，再切碎(subdissected)，融化并通过使用UltraTurrax勻浆器以全速勻浆10秒而制备 10%勻浆(例如1克组织加9ml水)。使用经含水标准品标定的氯化银电极，测定样品的 pH。实施例1 (ii)微阵列分析评价之后，有限的样品组可用于分析(参见下表1)。从该样品组，选择膝下前扣带 回皮层(subgenual anterior cingulate cortex)(参见图 1)并在 _20°C进行显微解剖。 将这些样品冻存在-80°C，然后经处理用于RNA分析。为了 RNA的制备，将样品融化，通过 使用UltraTurrax勻浆器以全速勻浆10秒而制备10%勻浆。测定样品pH，再用基于胍的 提取(TriZOL)来提取RNA，并在分离之后在柱(RNEasy，Qiagen)上纯化，以除去低分子量 RNA。使用Agilent生物分析仪，根据清晰的18/26S核糖体条带，测定RNA的质量。表1 经提取用于微阵列分析的前扣带RNA样品
权利要求
1.一种用于判定受试者是否患有或易患迟发性抑郁症的体内成像方法，所述方法包括 下列步骤(i)将体内成像剂给予所述受试者，其中所述体内成像剂包含与多核苷酸或多肽选择 性缔合的化合物，所述多核苷酸或多肽是由选自表2或表5中所列举那些的基因编码，并且 其中所述化合物用体内成像部分标记；( )让所述体内成像剂与在所述受试者组织中表达的所述多核苷酸和/或所述多肽 选择性缔合；(iii)通过体内成像方法检测由所述体内成像部分所发射的信号；和，(iv)产生图像，该图像代表所述信号的位置和/或数量。
2.权利要求1的体内成像方法，其中所述基因选自表3或表6中所列举的那些。
3.权利要求1或2的体内成像方法，其中所述受试者是完整的哺乳动物体体内。
4.权利要求1-3中任一项的体内成像方法，其中所述组织是脑组织。
5.权利要求4的体内成像方法，其中所述脑组织是在前扣带中。
6.权利要求5的体内成像方法，其中所述基因选自表2中所列举的那些。
7.权利要求5的体内成像方法，其中所述基因选自表3中所列举的那些。
8.权利要求4的体内成像方法，其中所述脑组织是在伏隔核中。
9.权利要求8的体内成像方法，其中所述基因选自表5中所列举的那些。
10.权利要求8的体内成像方法，其中所述基因选自表6中所列举的那些。
11.权利要求1-10中任一项的体内成像方法，其中所述体内成像部分选自(i)放射性金属离子；( )顺磁性金属离子；(iii)发射Y射线的放射性卤素；(iv)发射正电子的放射性非金属；和，(ν)超极化NMR-活性核。
12.权利要求11的体内成像方法，其中所述体内成像部分是(i)、(iii)或(iv)之一。
13.一种用于迟发性抑郁症诊断的方法，所述方法包括(a)权利要求1-12中任一项的体内成像方法；和，(b)将步骤(a)产生的图像与体内图像比较，所述体内图像代表当在非抑郁受试者中 进行所述体内成像方法时，所述体内成像剂的摄取模式。
14.一种用于治疗迟发性抑郁症患者的方法，所述方法包括给予药用组合物，所述药用 组合物包含(a)药物有效量的化合物，所述化合物通过与多核苷酸或多肽选择性缔合来调节受体 活性，所述多核苷酸或多肽是由权利要求2、6、7、9和10中任一项的方法中定义的基因编 码；和，(b)生物相容性载体。
15.权利要求1、2、6、7和9-12中任一项的方法中定义的体内成像剂，所述体内成像剂 用于权利要求13的诊断方法。
16.权利要求1、2、6、7和9-12中任一项的方法中定义的体内成像剂，所述体内成像剂 用于决定是否实施权利要求14的治疗方法的方法，所述决定方法包括(a)权利要求1-12中任一项的体内成像方法；和，(b)评价步骤(a)的体内成像方法所产生的图像，以决定是否实施所述治疗方法。
17.一种用于鉴定与多核苷酸或多肽选择性缔合的化合物的筛选方法，所述方法包括(i)使所述化合物与多肽或多核苷酸接触，所述多核苷酸或多肽是由选自表2或表5中 所列举那些的基因编码；和，( )测定所述化合物对所述多肽或所述多核苷酸的效应。
18.权利要求17的筛选方法，其中所述效应是所述化合物与所述多肽或所述多核苷酸 的结合。
19.权利要求17或18的筛选方法，其中所述多肽或多核苷酸是分离的。
20.权利要求17或18的筛选方法，其中所述多肽或多核苷酸在体外细胞中表达。
21.权利要求17或18的筛选方法，其中所述接触步骤包括将所述化合物给予迟发性抑 郁症的动物模型，并且其中所述多肽或所述多核苷酸是在所述动物模型的组织中表达。
22.权利要求21的筛选方法，其中所述迟发性抑郁症动物模型是迟发性抑郁症的灵长 类动物模型、小鼠模型或大鼠模型。
23.权利要求17-22中任一项的筛选方法，其中所述化合物与所述多肽接触。
全文摘要
已经证明了在迟发性抑郁症患者脑中核酸的差异表达。本发明提供可用于判定迟发性抑郁症的方法。本发明也提供用于鉴定用于治疗、预防或诊断迟发性抑郁症的化合物的筛选方法。
文档编号A61K49/00GK102099492SQ200980128367
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者A·托马斯, C·莫里斯, D·希斯科克, P·汉森 申请人:通用电气健康护理有限公司
技术领域：
已经鉴定了与非抑郁受试者的脑组织样品相比，在患有迟发性抑郁症 (late-onset depression)的受试者脑组织样品中被上调或被下调的生物标记。本发明提 供了筛选方法，以鉴定可用于治疗、预防和诊断迟发性抑郁症的化合物。本发明也提供可用 于治疗、预防和诊断迟发性抑郁症的方法。相关领域的描述有15%的美国人在其生命中的某一点受到抑郁症的影响，在任意指定的某一天就 有1亿人受到影响。发病年龄分布相当均勻并可突然在某些天发病或持续数年。超过半数 经历重性抑郁症(major depression)的人仅有一次发作。然而，随着每次连续发作，下次 发作时有15%的危险将成为躁狂症，诊断为双相性精神障碍。最终，大约15-20%重性抑郁 症患者变为慢性抑郁并且约15%重性抑郁症患者可能自杀(男性自杀率通常是女性的2 倍)。目前，对于涉及抑郁症的神经生物学仅有有限的了解，但是日益明确的是，该疾病 是多层面的并且可能涉及大量因素，这些因素或协同作用或独立作用而导致情感变化。抑 郁症是一种复杂障碍，并非受控于单一病理学，这样单一病理学可用作标记，用于治疗、诊 断和筛选的目的。涉及了许多神经递质系统，对若干靶标已经进行了广泛研究并导致产 生一定范围的治疗选项。目前可用的治疗包括单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、三环抗抑郁药 (TCA)、特异性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、去甲肾上腺素能再摄取抑制剂(NRI)、5-羟 色胺去甲肾上腺素能再摄取抑制剂(SNRI)和去甲肾上腺素多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)。 然而，现有抗抑郁药并不令人满意，因为它们有许多副作用，而且因患者病史和所治疗的确 切病症的不同而具有不同功效。大量的先期研究已经分析了在抑郁症病理学具有相关性的组织中的基因表达分 布型。US20050209181公开了在作为涉及精神分裂症的途径或通路的下列10个脑区中 的基因表达的DNA微阵列分析前扣带回皮层(anteriorcingulate cortex)、背外侧前 额叶皮层、杏仁体、小脑皮层、嗅内区皮质、颞上回、顶叶皮层、伏隔核、腹侧丘脑、中丘脑和 /或海马。该专利申请也教导差异表达的基因也可能与抑郁症有关。在US20050209181 中鉴定的基因实例由下列GenBank ID号表示NM_007274，NM_004068, AL120173, AL581768, AF151034, BE677131, D63412, BC004443, ΝΜ_003458, ΝΜ_006317, ΝΜ_014962, U73304, BC004271, AL120332, AL022718, NM_006429, NM_000729, NM_001819, NM_024709, AL522296, AL134612, AI879661, AI141670, NM_017594, NM_004411, NM_014210, AI868167, AI826799,NM_021952,AW269335,NM_001975,NM_001978,NM_001958,NM_018315, AU145019, NM_002006, NM_022003, NM_000810, NM_000817, NM_000818, AL567302, NM_002045, BE670563, BC002666, AF200715, NM_005346, AI218219, AI810712, AL136591, BE617588, NM_138339, AI634532, NM-000194, BF346014, AL566367, AL136636, NM_021219, AB028968, AA736604, AA284075, NM_007054, NM_001290, NM_002347, NM_002415, N22468, U89330,W37431, AI693178, NM_006178, R38624, ΝΜ_016588, AF251061, NM_005382, AL537457, R38389, AF397394, BG285881, AB033605, NM_002796, NM_002849, AB037734, NM_002590, BFl12006， NM_006695, AI888503, AB014560, BC000314, NM_006054, N95026, NM_014575, NM_003469, NM_003026, AK000478, NM_005563, NM_007029, NM_030795, NM_001047, AL359592, AW139618, AV723167, BG260394, NM_003182, NM_017714, NM_014765, AB017269, AL565074, AF141349, AL565749, BF338045, NM_003366, NM_006876, AK023015, U73304。W02008020435公开了可用于治疗抑郁症的所谓“抑郁相关”基因的抑制剂。 W02008020435的抑郁相关基因的实例由以下GenBank ID号鉴别NM_000436，NM_001677, NM_004734, NM_004438, NM_000806， NM_000810, NM_000817， NM_000828, NM_006159, NM_002522， NM_002816, NM_002796, NM_002849， NM_021007, NM_020309， NM_004209, NM_002228oW00058473教导了与多种疾病状态(其中之一是抑郁症)相关的核酸和多肽。在 W00058473 中引用的 GenBank ID 号的实例如下AB002384、AB020690 (也在 W02007136797 中)、AC004010(也在 US20030220489 中；US20070172830 ；W00216387 ；W00134769 ； W00134628 ；W00132910。US20070172830公开了发现其表达与抑郁症相关的大量基因。这些实例由下列 GenBank ID 号鉴别AF035321、AC004010、AD001527。US20070172830 并未明确涉及抑郁症， 但提出所鉴定的基因可用于治疗各种各样的疾病状态，包括抑郁症。W02004047727使用DNA微阵列来研究经诊断患有抑郁症的患者尸体解剖的脑部 的表达分布型。该工作集中在3个脑区前扣带回皮层、背外侧前额叶皮层和小脑。这些标 记的实例由下列 GenBank ID 号鉴别:M95585、U35139、AL049650、AL022718。这些基因表达研究都没有明确指出与迟发性抑郁症的关联。在罹患迟发性抑郁症 的患者中大约有三分之一对初期抗抑郁药治疗无反应，同时他们仍然对复发、慢性和痴呆 具有非常高的危险(Cole 等，American Journal of Psychiatry 156，1182-1189 (1999))。 因此，就发病率和致死率以及健康和社会护理负担而言，迟发性抑郁症涉及相当高的费 用。在老年人中，抑郁症是仅次于痴呆的第二大最常见精神障碍，累及大约3%的65岁以 上的老人，还有12%罹患较轻的但仍会令人衰弱的抑郁症(Beekman等，British Journal of Psychiatry 174, 307-311 (1999)) 0迟发性抑郁症的神经生物学基础仍有大部分尚 未研究过，阻碍了对有效治疗的开发。已经提出，与年轻患者的抑郁症相比，对迟发性抑 郁症的临床管理应当根据其具体病理生理特征而定制(Thomas等，American Journal of Psychiatry157,1682-1684(2000) ；Thomas φ, British Journal of Psychiatryl81, 129-134(2002))。因此，在迟发性抑郁症的治疗和诊断中，需要具有特定应用的临床策略。发明概述目前已经证明，与非抑郁受试者相比，在迟发性抑郁症患者脑中有多种基因存在 差异表达。提供了筛选方法，用于鉴定用于治疗、预防或诊断迟发性抑郁症的化合物。也提 供可用于治疗、预防和诊断迟发性抑郁症的方法。本发明具有如下优势其提供了与迟发性 抑郁症的病理生理学明确相关的生物标记。发明详述
体内成像方法本发明提供用于判定受试者是否患有或易患迟发性抑郁症的体内成像方法，所述 方法包括下列步骤(i)将体内成像剂给予所述受试者，其中所述体内成像剂包含与多核苷酸或多肽 选择性缔合的化合物，所述多核苷酸或多肽由基因编码，所述基因选自本文的表2或表5中 所列举的那些，并且其中所述化合物用体内成像部分标记；(ii)让所述体内成像剂与在所述受试者组织中表达的所述多核苷酸和/或所述 多肽选择性缔合；(iii)通过体内成像方法检测由所述体内成像部分所发射的信号；和，(iv)产生代表所述信号的位置和/或数量的图像。本文所用的术语“^M^”是指这样的无创性技术该技术在给予体内成像剂之 后，产生受试者内部的全部或部分的图像。本发明的“警试者(患者)”优诜是哺乳动物,最优诜是完整的哺乳动物机体体内。 在一个特别优选的实施方案中，受试者是人，尤其是疑似患有或易患迟发性抑郁症的人。术 语“―”是指受试者完全因为遗传因素而具有发展疾病状态的易感性；按照一般的说法是 “天然”而非“后天(nurture)，，的。“迟发件抑郁症”是指首发于60岁以及以上人群的重性抑郁障碍。术语“重性抑郁 障碍”是指涉及任何下列症状的心境障碍持续悲伤、焦虑或“空虚”感；绝望感或悲观感； 负罪感、无价值感或无助感；对曾经享受的嗜好和活动(包括性)丧失兴趣或愉悦、活力下 降，疲劳，“慢下来”，难以集中注意力、回忆或做决定，失眠、过早觉醒或嗜睡，食欲和/或体 重减轻或者过度饱食和体重增加，想死或自杀或有自杀企图，烦躁或易激怒，或者对治疗无 反应的持续的身体症状，例如头痛、消化失调和慢性疼痛。“| ”体内成像剂优选通过胃肠外进行，最优选通过静脉内进行。静脉内途径代 表向所述受试者全身递送体内成像剂的最有效方式。本发明的体内成像剂优选以药用组合 物形式来给予，所述组合物包含体内成像剂以及生物相容性载体。“生物相容性载体”是流 体，尤其是液体，其中悬浮或溶解了体内成像剂，使组合物是生理上可耐受的，即可给予哺 乳动物体内而没有毒性或过度不适感。生物相容性载体介质适宜是注射用载体液，例如无 菌的、无热原的注射用水；水溶液，例如盐水(其可最好是经过平衡的，使注射用终产物是 等渗或不是低渗的)；一种或多种以下物质的水溶液张力调节剂(例如血浆阳离子与生物 相容性抗衡离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例 如甘油)或其它非离子型多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)。生物相容性载体介质也 可包括生物相容性有机溶剂，例如乙醇。这些有机溶剂可用于溶解更亲脂的化合物或制剂。 优选，生物相容性载体介质是无热原的注射用水、等渗盐水或乙醇水溶液。供静脉内注射用 生物相容性载体介质的PH的合适范围是4. 0-10. 5。体内成像剂所包含的“化合物”可以是生物分子、小分子、适体、反义mRNA、小干扰 RNA或抗体。术语“牛物分子，，包括例如以下分子如脂质、核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、 多肽、蛋白质、碳水化合物和无机分子。术语“小分子”是指分子量介于100-1000道尔顿之 间的有机化合物。术语“_”是指由免疫系统细胞产生的蛋白质或是指其与抗原结合的 片段。术语“反义mRNA”是指与ιΗ常加工为mRNA并翻译的链互补、或与其区域互补的RNA分子。术语是指人工核酸结合剂(参见例如Ellington和Szostak(1990)Nature 346 818-822)。术语“小干扰RNA”是指诱导序列特异性转录后基因沉默的双链RNA (参见 例如Elbashir等(2001)Genes Dev. 15 188-200) 优选，体内成像剂所包含的化合物是小 分子或生物分子，最优选小分子。适用于脑组织成像的体内成像剂的具体特征在以下有更 详细讨论。术语“诜择件缔合”是指体内成像剂与目标靶标的结合，所沭目标靶标即是由本文 所述的基因优先于其它组织编码的多核苷酸或多肽，以便有利于通过本发明的方法来鉴别 靶组织和非靶组织。可采用结合测定，例如下述涉及本发明筛选方法的那些测定，来测定体 内成像剂与目标靶标的结合。术语“^MSM”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合 物。具体的核酸序列也包括其保守修饰的变体，例如简并密码子取代、等位基因、直向同源 物、单核苷酸多态性和互补序列以及明确指出的序列。具体地讲，可通过产生一个或多个 所选(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，达到简并密 码子取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 5081 (1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes8 :91_98 (1994))。术语“核酸”可用于 指基因、互补脱氧核糖核酸(cDNA)和由基因编码的信使核糖核酸(mRNA)。术语“^li”是指氨基酸残基的聚合物。该术语用于这样的氨基酸聚合物其中一 个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物；以及用于天然存在的氨 基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的该术语包括任何长度的氨基酸链， 包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过其价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在的和合 成的氨基酸、以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，后者以类似于天然存在的氨基酸的方式 起作用。天然存在的氨基酸是由遗传密码所编码的那些，以及后期被修饰的那些氨基酸， 例如羟脯氨酸、y_羧基谷氨酸盐和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的 氨基酸相同的基本化学结构(即α-碳与氢、羧基、氨基和R基结合)的化合物，例如高丝 氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(例如正亮 氨酸)或修饰的肽主链，但仍保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本 文中可以用公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来表示。当多核苷酸是由基因“编遇”时，这是指该基因包含以下所需的信息⑴通过复 制获得脱氧核糖核酸(DNA)互补链，或(ii)通过转录获得mRNA。也包括从mRNA逆转录 到cDNA。当多肽是由基因“编码”时，这是指该基因包含以下所需信息(i)通过转录获得 mRNAdn (ii)通过翻译从所述mRNA获得所述多肽。术语“复制”、“转录”和“翻译”采用它 们在本发明领域中所接受的含义。也就是说，复制是DNA拷贝成DNA的过程，转录是DNA拷 贝成mRNA的过程，而翻译则是当mRNA的信息用作蛋白质合成的模板时。术语“基因”是指渉及产牛多肽链的DNA区段；它包括前导区和随后的编码区(前 导区和拖曳区)以及介于各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。仅有少数例 外，体内每个细胞都含有一整套染色体和相同的基因。然而，这些基因仅有一部分开启，正 是这些的亚类给每种细胞类型赋予独特性质。“基因表达”是这样的术语它用于描 述DNA内所含信息(储存的遗传信息)转录成为信使RNA(mRNA)分子，然后再翻译为蛋白质而行使大部分关键性的细胞功能。细胞所产生的mRNA的种类和数量反映了哪些基因被 表达，这又提供了细胞对其改变的需求是如何反应的相关信息。基因表达是一种高度复杂 并受到严格控制的过程，允许细胞对环境刺激和其自身变化需求产生动态反应。该机制起 到开/关转换作用，以控制在细胞中哪些基因被表达以及体量控制，即如有必要，增加或降 低特定基因的表达水平。“体内成像部分”是在将其给予所述受试者之后，可在该受试者机体外部检测的任 何物质。体内成像部分的存在提供了所成像的组织中多肽或多核苷酸数量的检测指标。术 语“用体内成像部分来标记，，是指体内成像部分可以是化合物的组成部分，或者可以是与化 合物缀合的单独实体。当体内成像部分与化合物缀合时，任选的接头部分将载体和体内成 像部分连接在一起。在给予步骤之后和检测步骤之前，允许体内成像剂与所述多核苷酸和/或所述多 肽选择性缔合。例如，当受试者是完整哺乳动物时，体内成像剂将会在哺乳动物体内动态移 动，与其中的不同组织接触。一旦体内成像剂接触表达所述多核苷酸和/或所述多肽的组 织时，就会发生特异性相互作用，使体内成像剂从所述组织中清除比从其它组织中清除需 要更长时间，因此确保产生代表特异性缔合的体内成像剂的图像。术语“_”用于描述缔合在一起，以行使特定生物学功能的细胞集合。本发明受 试者的基本组织类型是上皮组织、神经组织、结缔组织、肌肉组织和脉管组织。本发明体内 成像方法上下文中优选的组织是脑组织。通过所述体内成像部分的存在，来保证与所述受试者的所述多核苷酸或多肽选择 性缔合的体内成像剂水平的“检测”步骤。合适的体内成像技术是这样的技术该技术可检 测由所述体内成像部分发射的信号，并产生表示所述受试者所述组织中存在的体内成像部 分的位置和/或数量的数据。例如，SPECT可用作体内成像部分发射γ射线的检测技术。本发明体内成像方法的上下文中优选的脑区是前扣带和伏隔核。这两个脑区都与 抑郁症的临床症状相关，并且在本文证明与迟发性抑郁症中改变的基因表达有关。当成像 的脑区是前扣带时，优选的基因是选自表3所列举那些的基因。当成像的脑区是伏隔核时， 优选的基因是选自表6所列举那些的基因。具体的需求要求体内成像剂适用于成像脑组织。与身体的其它部分相比，在脑中， 内皮细胞通过“紧密连接(tight junction)”的方式更紧密地包裹在一起，所述紧密连接是 形成相邻上皮细胞间的密封，阻止大部分溶解分子从上皮层的一侧跨越到另一侧的多功能 复合物。这个所谓的血脑屏障(BBB)阻止所有分子运动，除了通过脂溶性方式跨越细胞膜 的那些分子(例如氧气、二氧化碳、乙醇和留体激素)和通过特殊转运系统而允许的那些分 子(例如糖和某些氨基酸)之外。分子量大于500道尔顿的物质通常不能通过被动扩散方 式跨越BBB，而较小分子通常是可以的。除了紧密连接的作用阻止了在内皮细胞间的转运之 外，还有两种机制可阻止被动扩散。在脑内围绕毛细血管的神经胶质细胞是亲水性分子的 第二屏障，而且脑内的低浓度间隙蛋白也能阻止亲水性分子通过。通过测定辛醇_水的分配系数(P)，通常可评价脂溶性，通常表示为Iogltl值，在本 文中称为“logP”。辛醇-水的分配系数表示物质在有机相与水相之间的分布。IogP提供 了测定化合物的亲脂性或亲水性的简单方式。比例定义为
分配=[辛醇中存在的化合物]/[水中存在的化合物]该等式可表示为Log分配=Iogltl[辛醇中存在的化合物]/[水中存在的化合物]简而言之，IogP计算的正数越大，化合物亲脂性就越大。对于潜在的新型药用化 合物而言，通常求出IogP的计算值，因为它提供了化合物在给予后在体内将会怎样分配到 各区室(compartmentalised)的相关知识。适用于本发明的体内成像剂的IogP范围为1. 0-4. 5，优选范围为1. 0-3. 5，最优选 范围为2. 0-3. 5。在体外和体内评价之前，可以先获取估计IogP值(AlogP98)，例如使用DS MedChem Explorer软件(Accelerys)。除了有利于CNS穿透之外，该范围内的亲脂性还允许 体内成像的快速清除，这在放射性卤素是相对短寿命的放射性同位素例如18F时特别重要。可通过使用Accelerys DS MedChem Explorer软件，与文献比较体内脑穿透数据， 用计算机(in silico)评价特定体内成像剂的BBB穿透特性。“logBbR”是[脑浓度]/[血 浓度]的log1(l。用于本发明方法的体内成像剂的IogBbR的合适范围为0.0-1.0，优选范围 为0. 3-1. 0，最优选范围为0. 5-0. 7。用于本发明体内成像方法的优选的体内成像部分选自(i)放射性金属离子；(ii)顺磁性金属离子；(iii)发射、射线的放射性卤素；(iv)发射正电子的放射性非金属；和，(ν)超极化NMR-活性核。当体内成像部分是放射性金属离子即射电金属时，合适的射电金属可以是正电子 发射体，例如 64CU、48V、52Fe、55C0、94mTc 或 68Ga ；或者 Y -发射体，例如 99mTC、mIn、113mIn 或 67Ga。 优选的射电金属是99mTc、64CU、68Ga和mIn。最优选的射电金属是Y _发射体，尤其是99mTc。当体内成像部分是顺磁性金属离子时，合适的这类金属离子包括Gd(III)、 Mn (II)、Cu (II)、Cr (III)、Fe (III)、Co (II)、Er (II)、Ni (II)、Eu (III)或 Dy(III)。优选的 顺磁性金属离子是Gd(III)、Mn (II)和Fe (III)，尤其优选Gd (III)。当体内成像部分是发射Y射线的放射性卤素时，放射性卤素适宜选自1231、1311或 77Br。125I虽然在本文所述的体外筛选方法适用于作为可检测标记，但不适用于作为体内成 像部分。优选的发射Y射线的放射性卤素是1231。当体内成像部分是发射正电子的放射性非金属时，合适的这类正电子发射体包 括=Hd15CK17FJ8FJ5BiN76Br或124L优选的发射正电子的放射性非金属是"C、13N、18F和 124I，尤其是11C和18F,最尤其是18F。当体内成像部分是超极化NMR-活性核时，这类NMR-活性核具有非零核自旋，包括 13C、15N、19F、29Si和31P。这其中，优选13C。术语“超极化”是指NMR-活性核的极化度增强，超 出了它的饱和极化(equilibrium polarisation) 0 13C的天然丰度(相对于12C)约为1%, 在超极化之前，合适的13C标记的化合物可适当地富集到至少5%的丰度，优选至少50%，最 优选至少90%。本发明体内成像剂的至少一个碳原子适宜富集13C,然后再超极化。本发明优选的体内成像部分是在以无创性方式体内给予之后，能够在外部检测的 那些，例如通过SPECT、PET和MRI。体内成像用的最优选的体内成像部分是放射性的，尤其是放射性金属离子、发射Y射线的放射性卤素和发射正电子的放射性非金属，尤其是那些 适合用SPECT或PET来成像的那些。本发明优选的体内成像剂在体内不容易进行代谢，因此最优选在人体内的半衰期 为60-240分钟。体内成像剂优选通过肾脏排泄(即表现出尿排泄)。体内成像剂在患病病 灶处的优选信号-背景比至少为1. 5，最优选至少为5，尤其优选至少为10。当体内成像剂 包含放射性同位素时，体内成像剂(其是非特异性结合或在体内游离)峰水平的一半的清 除，优选发生的时间周期小于等于体内成像部分的放射性同位素的放射性衰变半衰期。此外，体内成像剂的分子量适宜至多为5000道尔顿。优选，分子量范围为 100-3000道尔顿，最优选为200-1000道尔顿。此外，和如上所述，对于适用于脑组织成像的 体内成像剂而言，需要体内成像剂的分子量小于500道尔顿。体内成像剂的尤其优选的分 子量范围因此为200-500道尔顿。当体内成像剂包含多肽和体内成像部分时，体内成像部分通过多肽的N-端或 C-端、或者通过任何氨基酸侧链来缀合。优选，体内成像部分通过N-端或C-端与多肽缀 合，任选通过接头，例如聚乙二醇接头。或者，体内成像剂的官能团可包含体内成像部分。当官能团包含体内成像部分时， 这表明体内成像部分构成体内成像剂的部分化学结构。例如，体内成像部分可以是其水平 显著超过所述同位素天然丰度水平的放射性同位素。同位素的这类升高或富集水平适宜为 所述同位素天然丰度水平的至少5倍，优选至少10倍，最优选至少20倍，和理想的是至少 50倍；或以这样的水平存在其中所述同位素富集水平为90-100%。这类官能团的实例包 括具有升高水平的123I的碘代苯基，具有升高水平的11C的CH3基团，和具有升高水平的18F 的氟代烷基，使得成像部分是在化学结构内的同位素标记的11C原子或18F原子。可使用本发明的筛选方法，鉴定并获取与由本文定义的基因所编码的多核苷酸或 多肽选择性缔合的化合物，所述方法在下文有更详细描述。当所述筛选方法是结合测定时， 需要化合物与目标靶标的结合具有纳摩尔浓度的效力，即其解离常数(Kd)介于0. Ol-IOOnM 之间，优选介于0. Ol-IOnM之间，和最优选介于0. 01-1. OnM之间。可便利地通过使前体化合 物与合适来源的所需体内成像部分反应，进行这样的化合物标记，以提供体内成像剂。“前 体化合物”包括成像剂的未标记衍生物，其经设计使得与体内成像部分的便利化学形式的 化学反应以位点特异性方式发生；可以在最少数量的步骤中进行(理想的是单个步骤)；和 无需显著的纯化(理想的是无需进一步纯化)，以得到所需的体内成像剂。这类前体化合物 是合成的，并可便利地以良好的化学纯度而获取。前体化合物可任选包含保护基团，用于保 护前体化合物的某些官能团。术语“保护基团”是指这样的基团所述基团可抑制或阻止不想要的化学反应，但 其经设计具有足够的反应性，使其可在不改变分子的其它部分的足够温和的条件下，从所 述官能团上裂解下来。脱保护后，就得到所需体内成像剂。保护基团是本领域技术人员众 所周知的并适宜选自对于胺基，Boc (其中Boc是叔丁氧基羰基)、Fmoc (其中Fmoc是芴 基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4_ 二甲基-2，6-二氧代亚环 己基)乙基]或Npys (即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)；和对于羧基，甲酯、叔丁酯或苄酯。 对于羟基，合适的保护基团是甲基、乙基或叔丁基；烷氧基甲基或烷氧基乙基；苄基；乙酰 基；苯甲酰基；三苯甲基(Trt)或三烷基甲硅烷基，例如四丁基二甲基甲硅烷基。对于巯基，合适的保护基团是三苯甲基和4-甲氧基苄基。其它保护基团的使用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis', TheorodoraW. Greene 禾口 Peter G. M. Wuts,(第 3 版，John ffiley&Sons,1999)。当体内成像部分是金属离子(例如用于SPECT的99mTc或用于MRI的Gd(III)) 时，体内成像剂优选包含放射性金属离子与合成配体的金属络合物。术语“金属络合物” 是指金属离子与一个或多个配体的配位络合物。强烈优诜金属络合物是“杭转移盩合 (transchelation)，，的，即不容易与其它可能的竞争性配体对金属配位位置进行配体交换。 可能的竞争性配体包括在体外制备中的其它赋形剂(例如用于制备的辐射防护剂或抗微 生物防腐剂)，或体内的内源化合物(例如谷胱甘肽、转铁蛋白或血浆蛋白)。术语“佥成” 具有其常规含义，即人造的，与从天然来源例如从哺乳动物体内分离的相反。这类化合物具 有这样的优势它们的制备和杂质分布可以完全控制。可用于本发明的形成抗转移螯合的金属络合物的合适配体包括螯合剂，其中 2-6个、优选2-4个金属供体原子是这样排列的使得5元或6元螯合环产生(通过具有连 接碳原子或非配位杂原子的金属供体原子的非配位主链)；或包含与金属离子强烈结合的 供体原子的单齿配位体，例如异腈类、膦类或二氮烯化物(diazenides)。可与金属良好结 合成为螯合剂组成部分的供体原子类型的实例是胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成这类强 金属络合物，甚至单齿或二齿膦都形成合适的金属络合物。异腈和二氮烯化物的线性几何 构型使它们自身不容易结合到螯合剂中，因此通常用作单齿配位体。合适的异腈的实例包 括简单的烷基异腈例如叔丁基异腈，以及醚取代的异腈例如MIBI (即1-异氰基-2-甲氧 基-2-甲基丙烷)。合适的膦类的实例包括替曲膦和单齿膦类例如三(3-甲氧基丙基)膦。 合适的二氮烯化物的实例包括HYNIC系列配体，即胼取代的吡啶或烟酰胺。上述配体特别适合于络合锝例如94mTc或99mTc,更充分的描述可参见Jurisson等 [Chem. Rev. ,99, 2205-2218 (1999) ] 0配体也可用于其它金属，例如铜(64Cu或67Cu)、钒(例 如48V)、铁(例如52Fe)或钴(例如55Co)。其它合适的配体描述于Sandoz WO 91/01144，其包括特别适于铟、钇和钆的配体， 尤其是大环氨基羧酸酯配体和氨基膦酸配体。形成钆的非离子型(即中性)金属络合物的 配体是已知的并描述于US4885363。对于钆，特别优选的是包括以下物质的螯合物DTPA、 乙二胺四乙酸(EDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷_1，4，7， 10-四乙酸(DOTA)、10- (2-羟基丙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷_1，4，7-三乙酸(D03A) 和这些物质的衍生物。当体内成像部分是放射性卤素时，优选的前体化合物是包含经历亲电或亲核的放 射性卤化或者经历与带标记的醛或酮的缩合的衍生物的那些。第一类的实例是(a)有机金属衍生物例如三烷基锡烷(例如三甲基甲锡烷基或三丁基甲锡烷基) 或三烷基硅烷(例如三甲基甲硅烷基)，或有机硼化合物(例如硼酸酯(boronate ester) 或有机三氟硼酸酉旨(organotrifluoroborate))；(b)用于卤素交换的非放射性烷基溴或者用于亲核碘化反应的对甲苯磺酸烷基 酯、甲磺酸烷基酯或三氟甲磺酸烷基酯；(c)向亲核碘化活化的芳环(例如芳基碘餘〗盐芳基重氮物、芳基三烷基铵盐或硝 基芳基衍生物)。
前体优选包括非放射性卤原子，例如芳基碘或芳基溴(以允许放射性卤素交 换)；有机金属前体化合物(例如三烷基锡、三烷基甲硅烷基或有机硼化合物)；或有机前 体，例如三氮烯或用于亲和取代的良好离去基团例如碘每t盐。对于放射性碘化，优选的前体 包括有机金属前体化合物，最优选三烷基锡。前体和将放射性碘导入有机分子中的方法描述于Bolton [J. Lab. Comp. Radiopharm. ,45,485-528 (2002)]。合适的硼酸酯有机硼化合物和它们的制备方法描述于 Kabalka 等[Nucl. Med. Biol. ,29,841-843(2002)和巡，369-373 (2003)]。合适的有机三氟 硼酸酯和它们的制备方法描述于Kabalka等[Nucl. Med. Biol. ,31,935-938 (2004) ] 0可采用18F-氟化物与具有良好离去基团(例如烷基溴、烷基甲磺酸酯基或烷基甲 苯磺酸酯基)的前体中的合适化学基团进行反应，通过直接标记，进行放射性氟化反应。也 可通过N-卤代乙酰基与18F(CH2)3OH反应物的烷基化反应，产生-NH(CO)CH2O(CH2)318F衍生 物，来将18F导入。对于芳基系统，从芳基重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐的18F-氟化 物亲核置换是产生芳基-18F衍生物的合适途径。18F标记的体内成像剂可通过如下方式获得形成18F氟代二烷基胺，随后当18F氟 代二烷基胺与含有例如氯、P(O)Ph3或活化酯的前体反应时形成酰胺。更多的放射性氟化方 法，尤其是适用于肽的放射性氟化方法，描述于WO 03/080544(其使用巯基偶联)和描述于 W004/080492 (其使用氨基氧基偶联)。18F标记衍生物合成途径的更多细节描述于Bolton， J. Lab. Comp. Radiopharm.，45，485-528 (2002)。本发明方法的体内成像剂可通过试剂盒而容易地获取。这样的试剂盒包括合适的 前体化合物，优选呈无菌无热原形式，使得与无菌来源的体内成像部分的反应使用最少数 量的操作就产生所需的体内成像剂。这类考虑在放射性体内成像剂的情况下特别重要，尤 其是当放射性同位素具有相对短的半衰期时，可便于操作并因此降低对放射性药物学家的
辐射剂量。重建这类试剂盒的反应介质优选是生物相容性载体，如本文先前所定义，从而得 到包含所述体内成像剂的药用组合物。在本发明的体内成像方法中，检测步骤之后是产生图像的步骤，该图像表示由体 内成像部分所发射的信号。本发明方法中的这个产生步骤通过计算机来进行，计算机将重 建算法用于所获取的信号数据以得到数据集。然后处理该数据集，产生显示受试者体内目 标区域的图像。这些图像提供可用于迟发性抑郁症的诊断方法的信息。诊断方法另一方面，本发明提供上述关于体内成像方法所定义的体内成像剂，用于迟发性 抑郁症的诊断方法。此外，本发明提供用于诊断迟发性抑郁症的方法，所述方法包括(a)如上定义的体内成像方法；和，(b)将步骤(a)所产生的图像与体内图像比较，该体内图像表示当在非抑郁受试 者中进行所述体内成像方法时，所述体内成像剂的摄取模式(pattern of uptake) 0诊断方法的组织和受试者的合适和优选的实施方案的定义同上述体内成像方法。代表非抑郁受试者的图像中，本文所述多肽或多核苷酸的水平变化(向上或向 下)表明，该受试者患有迟发性抑郁症或处于发展迟发性抑郁症的至少某些方面的危险
12中。当在非抑郁受试者中进行所述体内成像方法时，通过以下方法得到代表所述体内 成像剂的摄取的图像在非抑郁受试者的适当匹配组上进行如上定义的体内成像方法，并 且产生代表所有得到的图像的平均水平的图像。治疗方法可将调节受体活性的化合物给予受试者，用于治疗迟发性抑郁症，所述受体是由 选自表3或表6所列举那些的基因编码。因此，本发明提供用于治疗迟发性抑郁症患者的 方法，所述方法包括给予药用组合物，所述药用组合物包含(a)药物有效量的与多核苷酸或多肽选择性缔合的化合物，所述多核苷酸或多肽 是由选自表3或表6中所列举那些的基因编码；和，(b)生物相容性载体。生物相容性载体是广泛的，如本说明书先前所定义。所选的具体生物相容性载体 部分是由有待给予的具体药用组合物、以及用于给予组合物的具体方法而决定的。因此，有 各种各样的合适药用组合物制剂(参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 17版.1985))。适于给药的制剂包括水和非水溶液、等渗无菌溶液，它们可含有抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂等渗性的溶质；以及水和非水无菌混悬剂，其可包含悬浮剂、增 溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。用于治疗的给药可通过使药物化合物接触有待治疗的组织的任何常用途径来进 行，这是本领域技术人员众所周知的。尽管多于一种途径可用于给予特定组合物，但是一种 特定途径通常可比另一途径提供更直接和更有效的反应。在本发明的实践中，药用组合物 可通过例如以下方式给予口服、鼻内、局部、静脉内、腹膜内或鞘内。可将药用组合物装入 单剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和小瓶中。可从上述种类的无菌粉末、颗粒和片来制 备溶液剂和混悬剂。药用组合物也可作为预制食物或药物的一部分来给予。化合物的“藍 物有效量”是在一段时间内在警试者中足以起到有益反应的剂量。任何患者的最佳剂量水 平将会因各种各样的因素(包括所用的特异性调节剂的功效、患者的年龄、体重、身体活动 和膳食)的不同而异，也取决于与其它药物的可能组合并取决于精神障碍的严重程度。剂 量大小也可由伴随将特定药用组合物给予特定受试者的任何不良副作用的存在、特性和程 度来决定。在确定有待给予的药用组合物的有效量时，医生可评价药用组合物的循环血浆水 平、药用组合物毒性和抗药用组合物抗体的产生。一般而言，对于典型受试者，化合物的剂 量当量为约lng/kg至10mg/kg。为了给予，药用组合物可以按照化合物的LD-50所决定的 速率和化合物在不同浓度时的副作用来给予，当用于群体(mass)和总体健康的受试者时。此外，上述关于本发明体内成像方法所定义的体内成像剂可用于决定是否实施如 上定义的治疗方法的方法，所述决定方法包括(a)如本文中定义的体内成像方法；和，(b)评价步骤(a)的体内成像方法所产生的图像，以决定是否实施所述治疗方法。筛选方法另一方面，本发明提供鉴定与多核苷酸或多肽选择性缔合的化合物的筛选方法， 所述方法包括
(i)使所述化合物与多肽或多核苷酸接触，所述多核苷酸或多肽是由选自表2或 表5中所列举那些的基因编码；和，(ii)测定所述化合物对所述多肽或所述多核苷酸的效应。本发明筛选方法中的“4i^l〖”的合适和优选的方面同以上本发明体内成像方法 所提供的。按照其最广泛含义，所述化合物与多肽或多核苷酸的“_”步骤是指使所述化合 物与所述多肽或多核苷酸彼此进行物理接触。这可在体外或体内完成，更多细节如下所述。“ii^lim^”是所述化合物与所述多核苷酸或所述多肽之间的任何特异性相 互作用。这样的特异性相互作用包括所述化合物与所述多核苷酸或所述多肽的特异性结 合，并包括由所述化合物诱导的对所述多核苷酸或多肽的表达水平或活性的任何调节。“测定”化合物效应的步骤可通过本领域众所周知的方法来讲行。这种众所周知 的筛选方法的一个实例是，在测定步骤中所测的效应是所述化合物与所述多肽或多核苷酸 的结合。这样的结合测定优选涉及本文所述的分离的多肽或多核苷酸与一种或多种化合 物接触，并允许有足够时间让多肽或多核苷酸与化合物形成结合复合物。术语“iM”是 指从其它细胞组分中分离出来，并且也可包括合成的多核苷酸和多肽。可以使用多种已 建立的分析技术中的任一种来检测所形成的任何结合复合物。蛋白质结合测定包括但不 限于测定共沉淀的方法、在非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上测定共迁移的方法和基于蛋白 质印迹测定共迁移的方法(参见例如Bennet和Yamamura，(1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods (神经递质、激素或药物受体的结合方法)” 载于 Neurotransmitter ReceptorBinding(Yamamura,H. I.等编著，第 61-89 页)。用于这 类测定的蛋白质可以是天然表达的、克隆的或合成的。结合测定也可用于例如鉴定与多肽 相互作用的内源蛋白。例如，在结合测定中可鉴定与多肽结合的抗体、受体或其它分子。在 许多情况下，在结合测定中的至少一种反应物包含可检测标记。在该上下文中的术语“ _ 愈”包括化合物、多肽、多核苷酸或用于特异性检测它们的任何抗体。“可检泖丨标记”可以是 具有可检测理化性质的任何物质。因此，可检测标记的存在提供了结合反应物数量的检测 指标。根据所用的具体可检测标记，合适的检测技术用于测定选择性结合的可检测标记的 数量。适用于本发明筛选方法的可检测标记包括通过光谱法、光化学法、生化法、免疫化学 法、电学方法、光学或化学方法在体外可检测的那些，包括⑴磁珠(例如Dynabeads )；(ii)荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)；(iii)放射性标记(例如 3H、125I、35S、14C 或 32P)；(iv)酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)；和，(ν)量热标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。检测这些可检测标记的方式是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，当可检测 标记是放射性标记时，是指用于包括闪烁计数器或如在放射自显影术中的照相胶片在内的 检测。当可检测标记是荧光标记时，可通过用合适波长的光激发荧光染料并检测所得荧光， 对其进行检测。可对荧光进行目测，通过照相胶片、通过使用电子检测器例如电荷耦合器件 (CCD)或光电倍增管等。类似的，可通过提供酶的合适底物并检测所得反应产物，来检测酶学可检测标记。本发明的筛选方法也可优选在体外进行，其中所述多肽或多核苷酸在细胞中表达 并使细胞与化合物接触。这类方法通常涉及进行基于细胞的测定，其中使化合物与表达本 文所述的多肽或多核苷酸的一个或多个细胞接触，然后检测转录产物、翻译产物表达的增 加或减少或者催化产物的增加或减少。本文所述的多核苷酸在细胞中的表达水平可测定如 下通过用与所述多核苷酸的转录物(或互补核酸)特异性杂交的化合物，来测定细胞中表 达的mRNA。可通过裂解细胞并进行RNA印迹或者不裂解细胞而用原位杂交技术，进行测定。可使用免疫学方法对多肽进行测定，其中用化合物探测细胞裂解物，所述化合物 是与所述多肽特异性结合的抗体。可通过测定酶的产物的产生或通过测定底物的消耗，测定多肽的催化活性。活性 是指催化速率或者多肽结合底物(Km)或释放催化产物(Kd)的能力。可按照通用生化分析进行多肽的活性分析。这类测定包括基于细胞的测定以及涉 及纯化或部分纯化的多肽或粗制细胞裂解物的体外测定。测定通常涉及提供已知数量的底 物并以时间的函数定量产物。也可进行筛选方法，其中所述接触步骤包括将所述化合物给予迟发性抑郁症的动 物模型。所用的动物模型通常是任何种类的哺乳动物。优选动物的具体实例包括但不限于 灵长类动物、小鼠和大鼠。在一个实施方案中，将抑郁症(慢性和急性)的大鼠模型(其中 大鼠经历应激)用于筛选。在一个实施方案中，可使用无脊椎动物模型例如果蝇模型，筛选 本文所公开的人类基因的果蝇直向同源物的调节剂。在另一个实施方案中，包括基因敲除 技术在内的转基因动物技术(例如作为与合适的基因打靶载体同源重组的结果)，或基因 过量表达，将会导致多核苷酸或多肽表达的缺失、减少或增加。发现由这些方法所产生的转 基因动物可用作精神障碍的动物模型，并可用于筛选精神障碍的调节剂。可通过同源重组，将标记基因或其它异源基因插入到小鼠基因组的内源基因位 点，制备敲除细胞和转基因小鼠。也可通过用多核苷酸突变形式取代内源多核苷酸，或通过 例如暴露给致癌剂而使内源多核苷酸突变，制备这样的小鼠。在一个优选的实施方案中，在上述任何实施方案中所述的筛选方法涉及使所述化 合物与所述多肽接触，并测定所述化合物对所述多肽的效应。用于本发明的方法本文描述了对在迟发性抑郁症患者脑组织中特异性差异表达的基因表达模式进 行的研究。与抑郁症相关的大的症状谱反映出复杂的遗传学基础和这些受试者中复杂的基 因表达模式。此外，脑途径或通路以及亚细胞途径对于理解精神障碍的发展和诊断而言是 重要的。经选择用于评价的脑区(前扣带(cingulate) (AC)和伏隔核(nucleusaccumbens) (NA))涉及抑郁症的临床症状。脑区中细胞结构的改变、关键性神经递质或相关分子在脑区 的表达、以及脑区中的亚细胞途径，都涉及到抑郁症的发展。通过微阵列表达分析，获取本发明所依据的数据。用于这类分析的阵列称为“表达 芯片”。固定化DNA是从已知基因的mRNA逆转录而来的cDNA，而且至少在某些实验中，与芯 片杂交的对照和样品DNA分别是从正常和患病组织的mRNA逆转录而来的cDNA。如果一个 基因在某种疾病状态中过量表达，则与对照cDNA相比有更多样品cDNA与代表该表达基因 的点杂交。结果，该点发出的红色荧光比绿色荧光的强度更大。一旦研究人员表征了涉及多种疾病的多个基因的表达模式之后，就可使来自任何个体的患病组织的cDNA杂交，以确 定来自个体的基因的表达模式是否与已知疾病的表达模式匹配。如果是这样，则可启动适 用于该疾病的治疗。微阵列方法的有用综述可参见Nature Genetics，1999年1月增刊。与本发明最相 关的是Botwell的文章，在第25-32页，其中描述了如何采用微阵列技术来获取表达数据。 现在提供该技术的概述。DNA “微阵列”是将来自上千个不同基因的序列在固定位置上固定或连接的小的固 体支持物。支持物本身通常是显微镜载玻片，但也可以是硅片或尼龙膜。将DNA印刷、印渍 或甚至直接合成在支持物上。重要的是，微阵列中的基因序列以有序或固定方式连接在它 们的支持物上，因为阵列中各点的位置用于鉴定特定基因序列。各点本身可以是DNA、cDNA 或寡核苷酸。微阵列可由研究人员制备或来自市售，取决于例如可用的成本、时间和人力资 源的问题。Genechip 阵列是市售阵列，是使用结合了光版印刷和组合化学的技术而制备 的(www, affymetrix. com)。每个阵列上至多合成130万个不同的寡核苷酸探针。每个寡核 苷酸位于阵列的特定区域，称为探针室(probe cell)。每个探针室都含有成百上千个至数 百万个给定寡核苷酸的拷贝。为了从mRNA得到cDNA，采用逆转录，这是DNA聚合酶(称为逆转录酶)将单链核 糖核酸(RNA)转录成为双链DNA的过程。通常，在该反应中，聚-T(胸苷)引物用作引物， 因为mRNA具有聚-A (腺苷)尾。输入mRNA的质量是至关重要的，以获得适用于微阵列分析的cDNA。尸体解剖采样 中的RNA完整性可受到死亡前后(pre-mortem andpost-mortem)事件的影响，也受到表达 水平与例如以下混淆因素之间相互关系的影响供体死亡年龄、死前低氧、濒死事件和濒死 期持续时间、脑PH、采样前的死后时间间隔和RNA完整性(Stan等，2006 ；BrainResearch ； 1123(1) :1-11)。因此，重要的是筛选RNA样品，以选择适用于微阵列分析的那些。在评价 RNA质量之前，对样品可以进行简单的pH测定，作为濒死状态的指标。然后，多种方法可用 于测定 RNA 质量(Copois 等，2007J Biotechnol ； 127 (4) :549_59)，其中之一就是 RNA 完整 性数(RIN，Agilent Technologies) 0使用在显微制造的芯片上进行的电泳分离，分离RNA 样品，然后通过激光诱导的荧光检测来测定。生物分析仪软件产生电泳图谱和凝胶类图像 并显示出结果，例如样品浓度和所谓的核糖体比(18S与28S核糖体条带之比)。使用RIN 软件算法进行RNA完整性数据的标准化解释，该算法允许基于从1到10的计数系统，对真 核的总核RNA(riboeukaryotic total RNA)进行分类，其中1是降解最多的分布类型，而10 是最完整的。DNA微阵列技术促进了对DNA序列信息的鉴定和分类，以及这些新基因的功能分 配。微阵列是通过利用给定mRNA分子与其来源的DNA模板特异性结合或杂交的能力而起 作用的。术语“M”是指互补的单链核酸结合或退火成一个双链分子的过程。通过使用 含有多种DNA样品的阵列，就可以通过测定与阵列上各位点结合的mRNA数量，而在单一实 验中测定细胞内成百上千个基因的表达水平。借助于计算机，就可准确测定出结合在微阵 列各点上的mRNA数量，产生细胞中基因表达的分布图。有关核酸杂交的一般性指南可参见Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles ofHybridization and the strategy of nucleic acidassays (杂交原则禾口核酸测定策略的 综述)，，(1993)。通常，选择严格性条件是在指定离子强度、pH下，比特定序列的热解链温 度(Tm)低约5-10°C。Tm是(在指定离子强度、pH和核浓度下)在平衡时，50%探针与靶 标杂交形成靶序列的温度(当靶序列过量存在时，在Tm下，在平衡时有50%探针被占据)。 “严格件”条件将是以下哪㈣条件其中盐浓度小于约1. OM钠离子，通常约0. 01-1. OM钠离 子浓度(或其它10种盐)，在pH 7.0-8. 3，温度至少约为30°C (对于短探针，例如10-50个 核苷酸)和至少约为60°C (对于长探针，例如大于50个核苷酸)。严格性条件也可通过加入去稳定剂例如甲酰胺而达到。对于选择性或特异性杂 交，阳性信号至少是背景的2倍，任选是背景杂交的10倍。示例性的严格性杂交条件可以 如下50%甲酰胺、5X SSC和SDS，在42°C孵育，或5X SSC、1 % SDS，在65°C孵育，并在 0. 2X SSC和0. SDS中在65°C洗涤。这样的洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长 时间。在严格性条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本相同的，如果它们所编码的多肽基 本相同时。这发生在例如当使用遗传密码所能允许的最大密码子简并而产生核酸拷贝时。 在这类情况下，核酸通常在适度的严格性杂交条件下杂交。示例性的“适度的严格性杂交条 件”包括在40%甲酰胺、IM NaClU % SDS的缓冲液中，在37°C杂交，并在IXSSC中在45°C洗 涤。这样的洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。阳性杂交至少是背景的2倍。 普通技术人员将会容易地理解，可使用替代性杂交和洗涤条件以提供类似的严格性条件。杂交步骤完成之后，将微阵列放入由一些激光器、专用显微镜和照相机组成 的“阅读器”或“扫描仪”中。实例包括Packard BioChip成像器、Molecular Dynamics Avalanche和Genetic Microsystems GMS 418阵列扫描仪。荧光标签受到激光器的激 发，显微镜和照相机共同工作而产生数字化阵列图像。典型的微阵列实验产生上千个数 据点，这表明需要用于存储和处理数据的成熟技术。所使用的工具可包括对来自阅读器 的数据进行图像分析的软件，存储和链接信息的数据库，以及将单个克隆(clone)的数据 与网络数据库例如GenBank链接的软件。GenBank序列数据库是开放性入口，是所有公 众可得的核苷酸序列和它们的蛋白质翻译的注释集合(http://www. ncbi.nlm.nih. rov/ sites/entrez ？ db =核苷酸)。该数据库是在国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI))产生的，作为国际核苷酸序列数据库合作项目 (InternationalNucleotide Sequence Database Collaboration,^ INSDC)的 微阵列目前已用于分析采自患有迟发性抑郁症患者脑的尸体解剖样品的mRNA表 达分布型。选择前扣带和伏隔核用于分析，因为已知这些脑区与抑郁症的病理生理学相关。 与正常个体相比，在经诊断患有抑郁症的患者的所选脑区中，在mRNA水平上，已经显示了 许多基因表达的改变(表2和表5，和优选表3和表6)。现在，详细描述用于获取本发明所 依据数据的具体方案。实施例简述实施例1描述了用于对来自抑郁和非抑郁受试者的前扣带样品进行转录组学分 析的方法。实施例2描述了用于对来自抑郁和非抑郁受试者的伏隔核样品进行转录组学分 析的方法。实施例实施例1 前扣带转录组学实施例1⑴样品诜择冷冻脑组织(贮存在-80°C )是来自10名迟发性抑郁症患者的额叶皮层，并且与 10名精神病学上健康的对照受试者在年龄、性别、死后时间间隔和濒死状态上相匹配。所 有受试者都是突然死亡，濒死状态的平均持续时间约7小时(Li等，Hum Mol Genet 13, 609-616(2004))。选择这些数字是为了在微阵列上，在> 士2SD的常规显著性水平上足以 检测组间差异，或使用基于DIGE的蛋白质组学分析。抑郁受试者全都患有DSM-IV重性抑郁 症，而且病例记录回顾证明了这一点，而且他们没有其它精神病。筛选了对照的病例记录， 以确保他们没有任何精神疾病。所有受试者接受尸检和神经病理学检查，没有人具有与痴 呆相符的变化。通过作为濒死状态标志评价pH，筛选组织的适用性。在-80°C贮藏库中获取样 品，再切碎(subdissected)，融化并通过使用UltraTurrax勻浆器以全速勻浆10秒而制备 10%勻浆(例如1克组织加9ml水)。使用经含水标准品标定的氯化银电极，测定样品的 pH。实施例1 (ii)微阵列分析评价之后，有限的样品组可用于分析(参见下表1)。从该样品组，选择膝下前扣带 回皮层(subgenual anterior cingulate cortex)(参见图 1)并在 _20°C进行显微解剖。 将这些样品冻存在-80°C，然后经处理用于RNA分析。为了 RNA的制备，将样品融化，通过 使用UltraTurrax勻浆器以全速勻浆10秒而制备10%勻浆。测定样品pH，再用基于胍的 提取(TriZOL)来提取RNA，并在分离之后在柱(RNEasy，Qiagen)上纯化，以除去低分子量 RNA。使用Agilent生物分析仪，根据清晰的18/26S核糖体条带，测定RNA的质量。表1 经提取用于微阵列分析的前扣带RNA样品
权利要求
1.一种用于判定受试者是否患有或易患迟发性抑郁症的体内成像方法，所述方法包括 下列步骤(i)将体内成像剂给予所述受试者，其中所述体内成像剂包含与多核苷酸或多肽选择 性缔合的化合物，所述多核苷酸或多肽是由选自表2或表5中所列举那些的基因编码，并且 其中所述化合物用体内成像部分标记；( )让所述体内成像剂与在所述受试者组织中表达的所述多核苷酸和/或所述多肽 选择性缔合；(iii)通过体内成像方法检测由所述体内成像部分所发射的信号；和，(iv)产生图像，该图像代表所述信号的位置和/或数量。
2.权利要求1的体内成像方法，其中所述基因选自表3或表6中所列举的那些。
3.权利要求1或2的体内成像方法，其中所述受试者是完整的哺乳动物体体内。
4.权利要求1-3中任一项的体内成像方法，其中所述组织是脑组织。
5.权利要求4的体内成像方法，其中所述脑组织是在前扣带中。
6.权利要求5的体内成像方法，其中所述基因选自表2中所列举的那些。
7.权利要求5的体内成像方法，其中所述基因选自表3中所列举的那些。
8.权利要求4的体内成像方法，其中所述脑组织是在伏隔核中。
9.权利要求8的体内成像方法，其中所述基因选自表5中所列举的那些。
10.权利要求8的体内成像方法，其中所述基因选自表6中所列举的那些。
11.权利要求1-10中任一项的体内成像方法，其中所述体内成像部分选自(i)放射性金属离子；( )顺磁性金属离子；(iii)发射Y射线的放射性卤素；(iv)发射正电子的放射性非金属；和，(ν)超极化NMR-活性核。
12.权利要求11的体内成像方法，其中所述体内成像部分是(i)、(iii)或(iv)之一。
13.一种用于迟发性抑郁症诊断的方法，所述方法包括(a)权利要求1-12中任一项的体内成像方法；和，(b)将步骤(a)产生的图像与体内图像比较，所述体内图像代表当在非抑郁受试者中 进行所述体内成像方法时，所述体内成像剂的摄取模式。
14.一种用于治疗迟发性抑郁症患者的方法，所述方法包括给予药用组合物，所述药用 组合物包含(a)药物有效量的化合物，所述化合物通过与多核苷酸或多肽选择性缔合来调节受体 活性，所述多核苷酸或多肽是由权利要求2、6、7、9和10中任一项的方法中定义的基因编 码；和，(b)生物相容性载体。
15.权利要求1、2、6、7和9-12中任一项的方法中定义的体内成像剂，所述体内成像剂 用于权利要求13的诊断方法。
16.权利要求1、2、6、7和9-12中任一项的方法中定义的体内成像剂，所述体内成像剂 用于决定是否实施权利要求14的治疗方法的方法，所述决定方法包括(a)权利要求1-12中任一项的体内成像方法；和，(b)评价步骤(a)的体内成像方法所产生的图像，以决定是否实施所述治疗方法。
17.一种用于鉴定与多核苷酸或多肽选择性缔合的化合物的筛选方法，所述方法包括(i)使所述化合物与多肽或多核苷酸接触，所述多核苷酸或多肽是由选自表2或表5中 所列举那些的基因编码；和，( )测定所述化合物对所述多肽或所述多核苷酸的效应。
18.权利要求17的筛选方法，其中所述效应是所述化合物与所述多肽或所述多核苷酸 的结合。
19.权利要求17或18的筛选方法，其中所述多肽或多核苷酸是分离的。
20.权利要求17或18的筛选方法，其中所述多肽或多核苷酸在体外细胞中表达。
21.权利要求17或18的筛选方法，其中所述接触步骤包括将所述化合物给予迟发性抑 郁症的动物模型，并且其中所述多肽或所述多核苷酸是在所述动物模型的组织中表达。
22.权利要求21的筛选方法，其中所述迟发性抑郁症动物模型是迟发性抑郁症的灵长 类动物模型、小鼠模型或大鼠模型。
23.权利要求17-22中任一项的筛选方法，其中所述化合物与所述多肽接触。
全文摘要
已经证明了在迟发性抑郁症患者脑中核酸的差异表达。本发明提供可用于判定迟发性抑郁症的方法。本发明也提供用于鉴定用于治疗、预防或诊断迟发性抑郁症的化合物的筛选方法。
文档编号A61K49/00GK102099492SQ200980128367
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者A·托马斯, C·莫里斯, D·希斯科克, P·汉森 申请人:通用电气健康护理有限公司
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