生产糖胺聚糖的方法
专利名称：生产糖胺聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及生产糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)组合物的方法，优选包括抗 凝血糖胺聚糖的组合物，如肝素。尤其优选从非哺乳类海洋动物中提取的糖胺聚糖组合物， 如鱼类或磷虾。
背景技术：
糖胺聚糖包括两个亚类，即半乳糖胺聚糖(galactosaminoglycan)和葡萄糖胺聚 糖(glucosaminoglycan)。肝素是给一类具有抗凝血特性的硫酸葡萄糖胺聚糖的名称。除 了肝素之外，其它的抗凝血硫酸葡萄糖胺聚糖(通常被称为类肝素(heparinoid))也被 熟知，例如硫酸乙酰肝素(h印aran sulphate) 0这些也被用于实现抗凝血或抗调理作用 (anti-opsonization)效果。然而，肝素是此类中最具商业重要性。抗凝血糖胺聚糖是具有重复的硫酸二糖单元的多糖，其多糖结构可以另外包含其 它的寡糖亚结构，例如现已知的结合于抗凝血酶的戊糖单元。因此，除了其三硫酸二糖重复 单元外，肝素还含有另外的寡糖单元，如二硫酸寡糖。而且一些肝素包含作为抗凝血酶高亲 和结合位点的戊糖，含有这种抗凝血酶戊糖结合位点的肝素为高亲和肝素。不同的糖胺聚糖在糖间键(inter-saccharide bond)和糖环替代物上不同。此外， 对于特定的动物物种，链的长度会变化。因此，糖胺聚糖具有一定的分子量分布而不是特定 的分子量，即它们是多分散的。肝素具有聚合性结构，因此肝素组合物通常包含具有一定分子量范围的肝 素，典型地从3kD至40kD。具有这样宽分子量范围的肝素通常被称为未分级肝素 (unfractionated h印arin，UFH)。作为目前在商业上所用的，未分级肝素典型地具有在5. 0 到40kDa范围内的分子量。近年来低分子量肝素(LMWH)，即含有低分子量肝素的材料的生产和使用受到极大 的关注，所述低分子量典型地小于8kDa，尤其是至少60% (摩尔百分比)具有低于SkDa分 子量的肝素。低分子量肝素具有至少70单位/mg的抗因子活性效力，抗fe因子活性与 抗IIa因子活性的比值至少为1. 5。低分子量肝素可以通过多种方法从天然的未分级肝素中生产，例如，通过化学 裂解或酶促裂解进行分级或解聚，如通过亚硝酸解聚、用过氧化氢进行氧化解聚、用亚 硝酸异戊酯进行去氨基裂解、肝素苄酯的β-消除碱裂解(alkalinebeta-eliminative cleavage)、用Cu2+和过氧化氢进行氧化解聚或者通过肝素酶消化。极低分子量肝素(VLMWH)的合成生产也得到越来越多的关注。我们先前已经公开 过从海洋动物，特别是鱼类提取的肝素天生地具有高含量的低分子量肝素，而且，令人惊奇 地还具有高含量的极低分子量肝素，即具有分子量少于3kDa的肝素(见WO 2006/120425， 该专利的内容在此引入作为参考)。鉴于已被察觉的跨物种的病毒和朊病毒感染的可能性，对于源自哺乳动物的糖胺 聚糖的应用越来越关注。海洋的糖胺聚糖(例如，从海洋动物中提取的肝素)因此提供了替代品。海洋的肝素的提取在WO 02/076475中有描述，该专利的内容在此引入作为参考。以前的从海洋的材料中提取糖胺聚糖的方法包括离子交换层析、电泳分离、在不 同的有机溶剂中连续沉淀和许多其它方法，包括那些在从动物源中提取的现有技术中描述 的方法。这些技术中的很多技术是耗费时间的、效率低的。因此，存在海洋源糖胺聚糖生产 的替代方法的需求。例如，AT-琼脂糖凝胶层析只能提纯肝素中的高亲和部分，而申请人已 经发现常规的基于珠体的离子交换系统(bead-based ionexchange system)也能结合不需 要的化合物，如脂类。此外，在这些已知的技术中，冲洗必须持续的进行一段时间，而且为了 将糖胺聚糖从层析柱上洗脱需要大量的缓冲溶液(这使得进一步处理费力)。这会导致诸 如氧化、沉淀、失活等问题。申请人:进一步确认从海洋动物材料来的糖胺聚糖的提取的现有方法可能遭遇一 些问题，如不能实施的长处理时间(即多达几天，那样能导致腐烂的鱼废弃物发臭)，最终 产品的低的总体活性。因此，鉴于海洋的肝素的上述优点，但与目前的提取方法相关的问题，存在海洋源 糖胺聚糖生产的替代方法的需要。我们已经惊奇的发现，在从非哺乳类海洋动物材料来的 糖胺聚糖的提取中，利用层析基质，如膜吸附器，特别是阴离子交换膜吸附器进行层析给常 规提取技术提供了合适的替代。该技术容易按比例放大和自动化，而且还惊奇地发现具有 突出的纯度和高活性的产品能被简单并高效地生产。
发明内容
因此，从一个方面来说，本发明提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的方 法包括利用层析基质将包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料勻浆进行层析，优选以膜吸 附器形式。从另一个方面说，本发明提供了一种从包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料中 提取糖胺聚糖的方法，所述方法包括使所述动物材料的勻浆化而且利用层析基质将勻浆进 行层析，优选以膜吸附器形式。在一个优选的方面，所述勻浆被重复施用于层析基质。优选地，所述层析基质是膜吸附器。多个膜吸附器给予传统的基于珠体的层析柱 (bead-based chromatography column) 一个替代。它们典型地基于化学稳定的纤维膜，多 种层析配体能与纤维膜共价结合。所述膜以与离子交换层析类似的方式，通过靶分子(凭 借它们的功能基团)与配体的可逆结合来典型地实现分离。典型的配体类型是强/弱阴离 子或阳离子交换配体、金属螯合物、环氧化物和乙醛配体。阳离子交换膜包括配体，配体包含阴离子功能基团，如-SO3_、-OPO3_和_C00_，又如 羧甲基(CM)、磺酸丙酰基(SP)和甲基磺酸盐(S)。阴离子交换膜典型地包含具有阳离子功 能基团的配体，阳离子功能基团如-NHR2+和-NR3+,又如二乙氨基乙基(DEAE)、四级氨乙基 (QAE)、季铵(Q)。在本发明中季铵(Q)特别优选使用。膜吸附器是大孔型的，而且其主要动力效应被认为是对流和快速的膜扩散(film diffusion) 0所述吸附器允许大的流速范围，没有在常规的层析珠/树脂等上发现的扩散 限制。膜吸附器能在多种层析应用中使用。目前用途为从药物蛋白中去除DNA、病毒和内
4毒素，从溶液中纯化病毒、蛋白质和肽。将这种技术应用于多糖所实现的优点以前没有被察 知。一次性使用的、抛弃式的膜吸附器是可利用的，同样地在适当处理后能被重新使 用的膜也是可利用的。用于本发明方法的合适的系统是可从赛多利斯(Sartorius)(如 Sartobind Anion Direct)得到的Sartobind膜吸附器。膜吸附器依据本发明的使用消除 了与基于珠体的层析系统有关的昂贵、耗时的层析柱包装和清洗验证的需求。它还允许尽 量减少所需的缓冲液的数量和体积。膜吸附器在层析中的使用允许减少处理时间和缓冲液 用量。吸附器允许大的流速范围，具有强结合能力。其开放结构允许采用宽范围的体积、流 速等，而且为样品/配体相互作用提供了一个的大的表面积。本发明中的方法可以是批量方法，也可以是柱法(column process) 0床体积 (bedvolume)的变化允许所述技术有很高的灵活性，并且容易按比例放大。以膜吸附器获得 的高容量生产能力使得本发明中的方法与常规方法相比具有高产量。优选地，所述勻浆从动物材料的废弃物中提取，例如去掉肌肉组织后(例如为了 用作人类的食物)的非哺乳类海洋动物。所述的非哺乳类海洋动物材料包括源于淡水和咸水中的鱼类(fish)、贝类 (shellfish)和甲壳类(crustacean)，如磷虾(krill)。优选用作哺乳动物食物来源或用作鱼粉(fish meal)、鱼饵和鱼油原材料的非哺 乳类海洋动物。特别优选地，用养殖的非哺乳类海洋动物。合适的非哺乳类海洋动物的例子包括对虾(prawn)、小虾(shrimp)、磷虾 (krill)、鲤鱼(carp)、鈀鱼(barbell)和其它鲤鱼科鱼类；鳕鱼(cod)、狗鳕(hake)、黑线 鳕(haddock)；比目鱼(flounder)；大比目鱼(halibut)；鳎鱼(sole)；鲱鱼(herring)； 沙丁鱼(sardine)；鲚鱼(anchovy)；鰺鱼(jack)；鲻鱼(mullet)；刀鱼(saury)；鲭鱼 (mackerel)；杖鱼(snoek)；带鱼(cutlass fish)；红触(red fish)；售卢鱼(bass) ； M 鱼(eel)(如河鳗(river eel)、康吉鳗(conger)等)；匙吻鲟(paddlefish)；罗非鱼 (tilapia)和其它棘鳍类热带淡水鱼；金枪鱼(tuna)；鲣鱼(bonito)；旗鱼(bill fish)； 海河洄游鱼类(diadromous fish)；等等。合适的鱼类的具体例子是比目鱼、大比目鱼、 鳎鱼、鳕鱼、狗鳕、黑线鳕、鲈鱼、鰺鱼、鲻鱼、刀鱼、鲱鱼、沙丁鱼、鲚鱼、金枪鱼、鲣鱼、旗鱼、 鲭鱼、杖鱼、鲨鱼(shark)、鳐鱼(ray)、胡瓜鱼(capelin)、鲱属小海鱼(sprat)、小沙丁 鱼(brisling)、鳊鱼(bream)、长身鳕鱼(ling)、狼鱼(wolff ish)、鲑鱼(salmon)、鳟鱼 (trout)、银鳟(coho)和奇努克鱼(chinook)。尤其优选所用的非哺乳类海洋动物是鳟 鱼、鲑鱼、鳕鱼或鲱鱼，更尤其是鲑鱼或磷虾。特别优选磷虾，例如南极磷虾(Euphausia superba)、^Cii羊 粦虫下(Euphausia pacif ica)禾口；I匕丰及 粦虫下(Meganyctiphanes norvegica)。用于作为肝素提取原料的包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物废弃物典型地从头 部、皮肤、鳃或内脏器官中选择。尤其优选单独采用鳃、头部和内脏器官。从文献中得知处 理鱼类废弃物的方法，如W02004/049818。通过标准方法制备所述动物材料的勻浆，例如物理或化学的预处理，例如浸软、酸 处理或碱处理等，特别是磨碎和混合。为了去除颗粒物质，所述勻浆可被进一步处理，例如通过离心和/或过滤。然而， 通常这不总是必要的，例如我们已惊奇地发现粗勻浆能被直接施用于膜(常规的层析一般需要更进广泛的预处理步骤)。然而，在本发明的方法中，特别是如果原料是鱼鳃材料，优选 离心或其它方式将勻浆去除细小物。在一个尤其优选的实施方式中，在施用于膜系统之前，为了消化在所述勻浆中存 在的蛋白质，用酶处理所述勻浆，尤其是蛋白酶，如木瓜蛋白酶。为了使蛋白质失活，作为选 择或附加地，所述勻浆可被加热到50至200°C，优选70至120°C，尤其优选，80至100°C，例 如，在80°C左右。曲型地样品的pH值应被调整，使得它至少高于或低于所要的糖胺聚糖等电点 1.0(分别为阴离子交换和阳离子交换)。对于本发明的糖胺聚糖的提取，优选阴离子交换， 在这种情况下，优选5左右的PH值。在样品施用以前，膜的pH值可稳定，例如通过平衡缓冲液(equilibrium buffer) 0用于标准层析分离技术的平衡缓冲液(和其它条件、方法)可被用于本发明的 方法。例如，对于阴离子交换，合适的缓冲液(缓冲液可包括盐，如NaCl)是NH4Ac/HAC、 Bis-Tris/HCl 和柠檬酸盐缓冲液，如 5mM 的 NH4Ac/HAc、IOmM NaCl/25mMNH4Ac/HAcU0mM NaCl/25mM Bis-Tris/HCl和IOmM NaCV25mM柠檬酸盐缓冲液。当使用阳离子交换膜时， 在本发明中所用的合适的平衡缓冲液是柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙二酸盐、MES、磷酸盐寸。对于阴离子交换，平衡缓冲液的pH值应为4. 5至10，优选5至6. 5，例如在5. 5左 右。对于阳离子交换，需要更低的PH值，例如1至4，优选的在2左右。本发明的方法使样品(勻浆)能够被再循环，因此，样品与基质的接触便能被控 制。所述的再循环实施能以任何方便的方式实现，例如，通过将入口管道和出口管道置于同 一容器中。所述勻浆因此能被重复施用于层析基质。优选地，通过在循环所述勻浆的方式， 所述勻浆重复施用于所述基质(例如膜吸附器)。也就是说，将流体(即未结合于基质的任 何材料)重新施用于基质，优选立即跟随它离开膜吸附器(即在洗脱液洗脱之前)。尤其优 选，所述勻浆被再循环，即在被结合的复合物被洗脱之前，重复地施用于基质若干分钟(例 如达到4小时)。典型的施用时间是5分钟至3小时，优选15分钟至2小时，更优选30分 钟至1.5小时，尤其优选45分钟至1小时。对于2.5ml膜，在再循环模式中达30分钟，典 型的滞留时间是2. 8s左右。因此，从另一个方面来说，本发明提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的 方法包括利用层析基质将包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料的勻浆进行层析，其中， 所述的勻浆被重复施用于所述的基质。在这种实施方式中，所述基质优选以和此处描述的 一样的膜吸附器方式。在样品被施用于膜之后，不管是一次性流过，还是用如上面所描述的循环实施方 法，所述被结合的糖胺聚糖复合物能被洗脱。洗脱可利用逐步增加离子强度和/或改变PH 值，或合适的梯度来被实现。优选地，洗脱利用合适的洗脱缓冲液来实施。显然，这些将取 决于固定相的性质。对于阴离子交换，洗脱缓冲液的PH值应为4. 5至10，优选5至6. 5，例 如在5. 5左右。依据本发明，用于阴离子交换方法的合适的洗脱缓冲液是那些在其中流动相反离 子浓度被增加的缓冲液。这被添加NaCl到平衡缓冲液方便地实现了。1-15M，优选2-20M， 例如3-4M的NaCl典型地用于阴离子交换方法，例如含有1_4M NaCl的5mM NH4Ac/HAc、含有 3M NaCl 的 25mM NH4Ac/HAc、含有 IOmM NaCl 的 25mM 柠檬酸盐缓冲液、3. 5M NaCl/5mM 柠 檬酸盐缓冲液。当采用阳离子交换时，本发明所用的合适的洗脱缓冲液是柠檬酸盐、甲酸 盐、乙酸盐、丙二酸盐、MES、磷酸盐。在这两种情况下，pH值与上面概述的平衡缓冲液的列 出的PH值相同。所述方法的包含糖胺聚糖的组合物在进一步处理之前可被浓缩、脱盐和/或干 燥。优选冷冻干燥。在一个优选的实施方式中，洗脱液被脱盐，例如用密理博(Millipore) 公司的Amicon stirred cell超滤器与Nanomax-50滤膜，然后冷冻干燥。当脱盐而且将施 用于尺寸排阻层析(size exclusion chromatography)的层析柱(例如G-75S印hadex层 析柱)的被重新溶解的样品减到最少时，如果未分级肝素将被分级，这种方法特别有用。通过在合适的缓冲液中清洗使得所述膜再生，洗脱后的所述膜能被再利用。此外，在洗脱步骤后，流体(即不管是通过一次性施用还是利用再循环，已被实施 于膜但没有结合的材料)能被重复施用于膜。通过这种方式，同样的勻浆能被利用直到所 要的糖胺聚糖的绝大部分已被分离。在本发明的另一个方面，多于一个膜吸附器被采用，这些膜吸附器能被成列或成 行设置。可根据样品的体积选择膜容量，因此这种方法容易按比例放大。典型的床容积在 从5至2500ml的范围中，然而膜表面积典型地从200cm3至10m3。本发明允许采用比常规的离子层析更高的流速。这取决于膜的容量。对于2.5ml 的膜，典型的流速是5至60ml/min，尤其是10至50ml，尤其优选20至40ml/min，例如在 30ml/min 左右。再循环时间和流速可根据需要调整。与所述基质接触的样品的总量就是再循环时 间和流速的乘积。样品在膜上的接触度被定义为(再循环时间X流速)/基质容积。例如，在25ml/ min再循环1小时，导致1500ml体积与基质接触(60minX 25ml/min)。对于2. 5ml的膜，这 等于值为600的接触度(即每ml膜有600ml)。优选地，此处定义的接触度为50至3000， 优选200至1000，尤其是400至800，更尤其是500至700，特别是在600左右。在本发明的方法的任何阶段，为了避免任何不需要的分解，可采用抗氧化剂。在强阴离子条件下，典型的膜结合容量(cm3)大于0. SmgBSA，在强阳离子条件下， 大于0. 8mg溶菌酶。典型的静态结合容量(mg/设备容积)大于7ang/2. 5ml，大于720mg/25ml，大于 7200mg/250ml ；离子容量(cm3)通常在4-6 μ equiv左右。优选地，原料流在被间隔装置隔开的膜层上切向流过。通过本发明方法提取的糖胺聚糖优选葡萄糖胺聚糖，尤其是那些具有抗凝血特 性，特别是肝素、类肝素或低分子量肝素、低分子量类肝素，或其两种或多种混合物。优选 地，葡萄糖胺聚糖是硫酸糖胺聚糖(sulphated GAG)，特别是肝素或低分子量肝素，尤其优 选葡萄糖胺聚糖是高亲和性糖胺聚糖。就“抗凝血”而言，它的意思是糖胺聚糖具有结合于抗凝血酶、间α-胰蛋白酶抑 制剂、Xa因子和其它哺乳动物肝素能结合的蛋白质的能力，例如被固定于基质(如凝胶基质)和/或延缓或阻止人的血浆凝结或延长哺乳动物(例如小鼠)出血的能力。糖胺聚糖，特别是抗凝血糖胺聚糖或葡萄糖胺聚糖，尤其优选从磷虾中提取的肝 素，其本身具有新颖性和创新性，因此构成本发明的另一个方面。优选通过此处描述的方 法提取的这些糖胺聚糖，然而可采用任何合适的提取方法，例如载于W002/076475和WO 2006/120425的那些方法。上面提到的磷虾糖胺聚糖产品和本发明的方法的产品共同构成本发明的另一个 方面。这些产品可被进一步处理，例如，制得的未分级肝素组合物能被处理(如分级或解 聚)以产生富集或耗尽低分子量肝素和/或极低分子量肝素等的组合物。所述分级和富集 或耗尽它们的组合物共同构成本发明的另一个方面。依据本发明，本发明的产品在提取后能以天然形成的形式使用，如未分级肝素。然 而，可作为选择地，本发明的产品可被转化成盐的形式，优选用生理上可耐受的抗衡离子 (例如钠、钙、镁、钾、铵或葡甲胺)，或被衍生，例如，促使其结合于一项医疗设备的表面，或 进行分子量分级或解聚(例如生产一种符合低分子量肝素的定义的糖胺聚糖分级产品)。 正如此处描述的方法得到的产品一样，这些衍生产品优选生理耐受的。优选地，层析方法获得的产品然后被分级和/或解聚。优选地，分级通过过滤(如膜过滤)或层析实现，尤其优选利用尺寸排阻层析、离 子交换层析或样品置换层析(sample displacement chromatography)。合适的方法被载于 WO 2006/120425。在本发明一个优选的实施方式中，海洋的糖胺聚糖组合物在进一步处理，如分级， 之前被浓缩和脱盐。尤其优选的是，本发明中的海洋的糖胺聚糖通过膜过滤去除低分子量成分，例如 分子量低于抗凝血酶结合五聚物(antithrombin binding pentamer，分子量为17^Da)， 典型地采用分子量阻隔IkDa的膜(如Filtron/^all公司的omega-lkultrasette，密理博 (Millipore)公司的Pellicon IkDa cut-off)。尤其优选的还有，海洋的糖胺聚糖通过膜 过滤去除高分子量成分，例如用分子量阻隔为3000Da的膜(例如用Filtron/I^ll公司的 Omega Centramate Suspended Screen 0S005C11P1)，这使得除了未分级肝素产品外，富集 低分子量肝素和/或极低分子量肝素的分级产品的生产成为可能。为了给满足各种需求提 供糖胺聚糖组合物，这种分级产品可单独使用，组合(例如在组合治疗中)或混合使用。例 如，所述产品可被分级以生产富集低分子量肝素或极低分子量肝素的分级产品。剩下的分 级产品，不是耗尽低分子量肝素就是耗尽极低分子量肝素，可保留而且单独使用或添加到 另外未分级产品中。通过这种方式，尽量减少产品的浪费。根据本发明的方法生产的组合物和此处描述的组合物(不管是未分级肝素还 是遵照上面阐述的分级步骤得到的)可被干燥或可被配制以供使用，例如用稀释剂、载 体或活性药物物质，而且能被用作(优选在用液相载体配制后)医疗仪器表面的涂层 (coating)，例如导尿管或植入管。这样的组合物和具有涂层的仪器构成了本发明的另一个 方面，其制备方法同样地构成了本发明的另一个方面，例如通过混合或被覆。从另一个方面来说，本发明提供通过此处描述的方法生产的非哺乳类海洋动物糖 胺聚糖组合物，可选择进一步包含生理上可接受的载体或辅剂和/或药物物质，而且可选 择被覆于底物上。这种应用于药物或治疗的组合物构成了本发明的另一个方面。
从另一个方面来说，本发明提供了一种磷虾糖胺聚糖组合物，可选择进一步包括 生理上可接受的载体或辅剂和/或药物物质，而且选择被覆于底物上。这种应用于药物或 治疗的组合物构成了本发明的另一个方面。还从另一个方面来说，本发明提供了依据本发明的或依据本发明的方法生产的组 合物或其盐或其衍生产品在哺乳动物医疗方面的用途，特别是人类，例如，组合物或用于在 人类或非人类动物实验对象身上进行手术、治疗、预防或诊断或血液接触的设备。在一个优 选的方面，组合物被分级(例如，根据活性或分子量)以提供富集某种分级产品的组合物， 例如极低分子量肝素。从另一个方面来说，本发明提供了一种通过此处描述的方法生产的，包括磷虾糖 胺聚糖或非哺乳类海洋动物糖胺聚糖的药物组合物或其盐或其衍生产品，连同生理耐受的 载体或辅剂，而且也可选择连同治疗的或预防疾病的药物物质。根据本发明的糖胺聚糖组合物可进一步包含常规的哺乳类糖胺聚糖组合物中的 非糖胺聚糖成分，例如水(优选注射用水)、乙醇、缓冲液、渗透压调节剂、防腐剂等。除了用作抗凝血剂之外，本发明的糖胺聚糖可被用作抗血栓药、抗动脉硬化药、补 体抑制物、抗炎、抗癌剂、抗病毒剂、抗痴呆剂(例如，抗老年痴呆剂)、抗朊病毒剂、抗寄生 药、调理作用抑制物、生物材料、血管生产调节物和用于治疗血管供血不足、伤口和免疫反 应紊乱(例如AIDS)等。它们可以通过肠道或不通过肠道给药，例如口服或皮下给药或结 合在能植入组织或循环系统的物体或药物材料上。除了这些治疗和手术用途之外，本发明的糖胺聚糖可用于诊断目的，例如诊断检 测和肝素所适用或当前所用的非药物用途。因此从另一个方面来说，本发明提供一种包括 抗凝血剂的诊断检测试剂盒，特征在于所述的抗凝血剂是据本发明记载的糖胺聚糖。本发明的方法已经在哺乳动物材料上实施，并且已被发现同样适用于哺乳动物材 料，和适用于非哺乳类海洋动物源的材料一样。用作据本发明的这方面记载的肝素生产/ 提取原料的包含糖胺聚糖的哺乳动物材料优选肉类处理的废弃物，例如在提取食物原料后 的废弃物。肠道，是为优选的材料源，优选牛的或猪的肠道。上面提到的方法、产品和用途， 利用哺乳动物材料(优选是非人类哺乳动物的肠道材料)而不是用非哺乳类海洋动物材 料，因此构成了本发明的另一个方面。因此，从另一个方面来说，本发明提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的 方法包括利用膜吸附器形式的层析基质将包含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析。也 提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的方法包括利用层析基质(优选膜吸附器) 将包含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析，其中，所述的勻浆重复施用于所述的基质。优选地，从其取得哺乳动物材料的哺乳动物是非人类的哺乳动物。合适的哺乳动 物例子包括牛、山羊、绵羊、鹿、猪、猪科动物(swine)、野猪(boar)等。尤其优选牛的和猪的 材料。此中所提及的文献特此引入作为参考。
具体实施例方式本发明现进一步描述，如下的非限制性的实施例作为参考。在所有的实施例中，所 用的泵是Masterflex I/P泵，除了洗脱用法玛西亚(Pharmacia)公司的P_1蠕动泵之外；所用的膜是2. 5ml的Sartobind Anion Direct强碱性阴离子交换膜。实施例1鲑鱼肠道提取物鲑鱼肠道提取物通过在Milli-Q超纯水中勻浆化280g鲑鱼肠道来制备。通过咔 唑法(carbazole method)测定的糖胺聚糖的理论量计算为98mg (注因为糖胺聚糖含有糖 醛酸，咔唑检验(carbazole test)结果是红色/紫色)。在55°C用木瓜蛋白酶降解蛋白质，然后加热至80°C使蛋白质失活。通过尼龙过滤 去除粗颗粒，然后通过添加0. 5M乙酸铵/乙酸(pH5. 5)至25mM(乙酸盐的最终浓度)并添 加NaCl (最终浓度为IOmM)将提取物的pH值向5. 5调整，pH值测量为6. 08。洗脱1 得到的提取物在膜上以25ml/min左右再循环(通过将入口管道和出口管 道浸在同一个烧杯中)达64分钟，然后用150-200ml平衡缓冲液(25mM乙酸盐/乙酸/IOmM NaCl, ρΗ5· 5)清洗，再用20ml含有3M NaCl的5mM NH4Ac/HAc (pH5. 5)实施洗脱(洗出液 1)。洗脱2 然后用平衡缓冲液清洗膜，而且再一次施用提取物(即来自洗脱1的流 体)，这个时间为45分钟。用平衡缓冲液(150-200ml)清洗它，而且让它静置过夜。然后用 20ml 含有 3M NaCl 的 5mM NH4Ac/HAc (pH5. 5)实施洗脱(洗出液 2)。洗脱3 让膜在IM NaOH中静置1小时左右，然后用平衡缓冲液清洗。再一次施用提 取物(即来自洗脱2的流体)55min,用平衡缓冲液清洗，然后在含有3M NaCl的5mM NH4Ac/ HAc (pH5. 5)中洗脱(洗出液3)。洗脱4 用IM NaOH让膜静置1小时左右，然后用平衡缓冲液冲洗。再一次施用提 取物(即来自洗脱3的流体)51min，用平衡缓冲液清洗，然后在含有3MNaCl的5mM NH4Ac/ HAc (pH5. 5)中洗脱(洗出液4)洗脱5 将平衡缓冲液换成25mM NH4Ac/HAc (pH 5. 0)/IOmM NaCl，提取物(即来自 洗脱4的流体)中的pH值调整至4. 96 (用6M HCl)。在膜上循环60min，然后用200ml平 衡缓冲液清洗膜。利用20ml含有3M NaCl的25mM NH4Ac/HAc (pH5. 0)获得洗出液5。洗脱6:提取物(即洗脱5后的流体)的pH值被调整至5.5(用3M NaOH)，膜 在25mM NH4Ac/HAc (pH 5. 5)/10mM NaCl中清洗。在膜上再循环提取物60min。用含有3M NaCl (20ml)的 5mM NH4Ac/HAc (pH5. 5)获得洗出液 6。洗脱7 膜保存在含有20% EtOH的平衡缓冲液中过夜，然后用IM NaOH处理45min 左右，然后清洗。在膜上再循环提取物(即来自洗脱6的流体)60min。用含有3M NaCl (20ml) 的 5mM NH4Ac/HAC (pH5. 5)获得洗出液 7。结果在下表中总结洗出液洗出液体积 (ml)洗出液中肝素 的重量(mg)洗出液中肝素 的浓度 (mg/ml)备注114.20.7940.0559咔唑检验给出呈褐 色的颜色219.00.9740.0513pH6.06在提取物中319.00.7060.0372黄/褐色在检验中418.91.6350.0171520.30.2100.0103pH5.0在提取物中615.50.7220.0460pH5.5在提取物中718.92.0740.1097黄色在检验中合计7.12将集中起来的洗出液(即洗出液1-7混合在一起)浓缩和脱盐，准备生物检验。实施例2鲑鱼肠道提取物(第二部分)已经在膜上过了 7次的鲑鱼勻浆(即实施例1来自洗脱7的流体)保持在4°C， 用Bis-Tris(即二(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)_甲烷)将pH值调整至6.0。用 IMNaOH(中间用25mM Bis-Tris/HCl/10mM NaCl缓冲清洗液，ρΗ6· 0)清洗膜3次，然后用 25mM Bis-Tris/HCl/10mM NaCl (平衡缓冲液，ρΗ6· 0)平衡。在室温下将勻浆在膜上再循环60min，流速为25ml/min。入口和出口管道在同一 烧杯中，与实施例1 一样，入口在底部，出口在项部。用平衡缓冲液清洗后，用含有3M NaCl 的5mM NH4Ac/HAc (pH 5. 5)实施洗脱(跟先前一样)。洗出液的体积是24. 4ml。通过咔唑检验测定的含有糖醛酸的糖胺聚糖的总量是0. 933mg。实施例3将来自实施1的混合的洗出液(1-7)在密理博(Millipore)公司的Pellicon 1000MWC0膜上以切向流浓缩和脱盐。样品(即来自实施例1洗出液的一切东西，具有 IOOODa以上分子量)然后被冷冻干燥，得到的白色粉末样残余物具有630mg的重量。在凝血酶/抗凝血酶检测中(thrombin/antithrombin assay)使用比色凝血酶底 物(colorimetric thrombin substrate)检验一部份冷冻干燥后的洗出物的肝素活性。该 检验揭示强肝素活性。为了定量的肝素活性测定，分析了另一部份冷冻干燥后的洗出物。 21. 5mg部分给出0. 26U/ml (被溶解于Iml)，这等于在630mg中总共有7. 62U。实施例4鲑鱼肠道提取物(第三部分)已经在膜上过了 8次的勻浆(即来自实施例2的流体)在膜上再一次再 循环1小时(在冰箱中贮存4天以后)，采用流速为25ml/min。然后用平衡缓冲液 (25mMBis-Tris (pH6. 0) /IOmM NaCl)清洗勻浆，用含有 3M NaCl 的 5mM NH4Ac/HAc (pH 5. 5) 完成洗脱(跟先前一样)。咔唑检验给出洗出液中总共3. 02mg。如实施例3描述的那样将洗出液脱盐和浓缩。
实施例5鲑鱼鳃提取物鲑鱼鳃提取物通过在Milli-Q超纯水中勻浆化444. 4g鲑鱼鳃来制备(将鳃切割 取出，留下软骨状的坚韧组织(cartilage，gristle))。在55°C用木瓜蛋白酶降解蛋白质， 然后加热至80°C使蛋白质失活。通过尼龙过滤去除粗颗粒。在勻浆中的PH值测量为6.81， 用6M HCl调整pH值至6.0。将勻浆离心(12000rpm，30min)，上清液被保留，而且在每一步洗脱之前在膜上再 循环 60min，流速 25ml/min。洗脱1 清洗并用3M NaCl/5mM Bis-Tris (pH6. 0)实施洗脱(洗出液1)。洗脱2 在下次再循环(来自洗脱1的流体的)前用IM NaOH中处理膜45min，如 上面所述的一样实施清洗和洗脱(洗出液2)。洗脱3 将膜用IMNaOH处理过夜，随后将来自洗脱2的流体再循环，如上面所述的 一样清洗和洗脱(洗出液3)。包含糖醛酸的糖胺聚糖的总量用咔唑检验测定，每一份洗出液测3次
权利要求
1.一种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用膜吸附器形式 的层析基质将包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料勻浆进行层析。
2.—种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用层析基质将包 含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料勻浆进行层析，其中，所述的勻浆重复施用于所述的基质。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述的非哺乳类海洋动物材料是磷虾 材料。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述的非哺乳类海洋动物材料是鲑鱼 材料。
5.一种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用膜吸附器形式 的层析基质将包含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析。
6.一种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用层析基质将包 含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析，其中，所述的勻浆重复施用于所述的基质。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述的哺乳动物肠道包括猪的或牛的 肠道。
8.如权利要求2至4、权利要求6或权利要求7中任一项所述的方法，其中所述的基质 是膜吸附器形式的。
9.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的组合物包含抗凝血糖胺聚糖。
10.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的组合物包含肝素。
11.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的层析基质是阴离子交换膜。
12.如上述权利要求任一项所述的方法，所述方法进一步包括解聚和/或分级。
13.通过上述任一项权利要求所述的方法获得的糖胺聚糖组合物。
14.从磷虾提取的糖胺聚糖，特别是抗凝血糖胺聚糖或葡萄糖胺聚糖，尤其优选肝素。
15.权利要求13或权利要求14的所述产品在医学方面的用途。
16.用于医学的权利要求13或权利要求14的所述产品。
全文摘要
本发明提供了一种生产包括糖胺聚糖的组合物的方法，所述的方法包括利用膜吸附器形式层析基质将包括糖胺聚糖的动物材料匀浆进行层析。
文档编号A61K31/727GK102124032SQ200980128370
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者拉格纳·弗兰格斯罗德 申请人:赫普马林公司
技术领域：
本发明涉及生产糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)组合物的方法，优选包括抗 凝血糖胺聚糖的组合物，如肝素。尤其优选从非哺乳类海洋动物中提取的糖胺聚糖组合物， 如鱼类或磷虾。
背景技术：
糖胺聚糖包括两个亚类，即半乳糖胺聚糖(galactosaminoglycan)和葡萄糖胺聚 糖(glucosaminoglycan)。肝素是给一类具有抗凝血特性的硫酸葡萄糖胺聚糖的名称。除 了肝素之外，其它的抗凝血硫酸葡萄糖胺聚糖(通常被称为类肝素(heparinoid))也被 熟知，例如硫酸乙酰肝素(h印aran sulphate) 0这些也被用于实现抗凝血或抗调理作用 (anti-opsonization)效果。然而，肝素是此类中最具商业重要性。抗凝血糖胺聚糖是具有重复的硫酸二糖单元的多糖，其多糖结构可以另外包含其 它的寡糖亚结构，例如现已知的结合于抗凝血酶的戊糖单元。因此，除了其三硫酸二糖重复 单元外，肝素还含有另外的寡糖单元，如二硫酸寡糖。而且一些肝素包含作为抗凝血酶高亲 和结合位点的戊糖，含有这种抗凝血酶戊糖结合位点的肝素为高亲和肝素。不同的糖胺聚糖在糖间键(inter-saccharide bond)和糖环替代物上不同。此外， 对于特定的动物物种，链的长度会变化。因此，糖胺聚糖具有一定的分子量分布而不是特定 的分子量，即它们是多分散的。肝素具有聚合性结构，因此肝素组合物通常包含具有一定分子量范围的肝 素，典型地从3kD至40kD。具有这样宽分子量范围的肝素通常被称为未分级肝素 (unfractionated h印arin，UFH)。作为目前在商业上所用的，未分级肝素典型地具有在5. 0 到40kDa范围内的分子量。近年来低分子量肝素(LMWH)，即含有低分子量肝素的材料的生产和使用受到极大 的关注，所述低分子量典型地小于8kDa，尤其是至少60% (摩尔百分比)具有低于SkDa分 子量的肝素。低分子量肝素具有至少70单位/mg的抗因子活性效力，抗fe因子活性与 抗IIa因子活性的比值至少为1. 5。低分子量肝素可以通过多种方法从天然的未分级肝素中生产，例如，通过化学 裂解或酶促裂解进行分级或解聚，如通过亚硝酸解聚、用过氧化氢进行氧化解聚、用亚 硝酸异戊酯进行去氨基裂解、肝素苄酯的β-消除碱裂解(alkalinebeta-eliminative cleavage)、用Cu2+和过氧化氢进行氧化解聚或者通过肝素酶消化。极低分子量肝素(VLMWH)的合成生产也得到越来越多的关注。我们先前已经公开 过从海洋动物，特别是鱼类提取的肝素天生地具有高含量的低分子量肝素，而且，令人惊奇 地还具有高含量的极低分子量肝素，即具有分子量少于3kDa的肝素(见WO 2006/120425， 该专利的内容在此引入作为参考)。鉴于已被察觉的跨物种的病毒和朊病毒感染的可能性，对于源自哺乳动物的糖胺 聚糖的应用越来越关注。海洋的糖胺聚糖(例如，从海洋动物中提取的肝素)因此提供了替代品。海洋的肝素的提取在WO 02/076475中有描述，该专利的内容在此引入作为参考。以前的从海洋的材料中提取糖胺聚糖的方法包括离子交换层析、电泳分离、在不 同的有机溶剂中连续沉淀和许多其它方法，包括那些在从动物源中提取的现有技术中描述 的方法。这些技术中的很多技术是耗费时间的、效率低的。因此，存在海洋源糖胺聚糖生产 的替代方法的需求。例如，AT-琼脂糖凝胶层析只能提纯肝素中的高亲和部分，而申请人已 经发现常规的基于珠体的离子交换系统(bead-based ionexchange system)也能结合不需 要的化合物，如脂类。此外，在这些已知的技术中，冲洗必须持续的进行一段时间，而且为了 将糖胺聚糖从层析柱上洗脱需要大量的缓冲溶液(这使得进一步处理费力)。这会导致诸 如氧化、沉淀、失活等问题。申请人:进一步确认从海洋动物材料来的糖胺聚糖的提取的现有方法可能遭遇一 些问题，如不能实施的长处理时间(即多达几天，那样能导致腐烂的鱼废弃物发臭)，最终 产品的低的总体活性。因此，鉴于海洋的肝素的上述优点，但与目前的提取方法相关的问题，存在海洋源 糖胺聚糖生产的替代方法的需要。我们已经惊奇的发现，在从非哺乳类海洋动物材料来的 糖胺聚糖的提取中，利用层析基质，如膜吸附器，特别是阴离子交换膜吸附器进行层析给常 规提取技术提供了合适的替代。该技术容易按比例放大和自动化，而且还惊奇地发现具有 突出的纯度和高活性的产品能被简单并高效地生产。
发明内容
因此，从一个方面来说，本发明提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的方 法包括利用层析基质将包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料勻浆进行层析，优选以膜吸 附器形式。从另一个方面说，本发明提供了一种从包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料中 提取糖胺聚糖的方法，所述方法包括使所述动物材料的勻浆化而且利用层析基质将勻浆进 行层析，优选以膜吸附器形式。在一个优选的方面，所述勻浆被重复施用于层析基质。优选地，所述层析基质是膜吸附器。多个膜吸附器给予传统的基于珠体的层析柱 (bead-based chromatography column) 一个替代。它们典型地基于化学稳定的纤维膜，多 种层析配体能与纤维膜共价结合。所述膜以与离子交换层析类似的方式，通过靶分子(凭 借它们的功能基团)与配体的可逆结合来典型地实现分离。典型的配体类型是强/弱阴离 子或阳离子交换配体、金属螯合物、环氧化物和乙醛配体。阳离子交换膜包括配体，配体包含阴离子功能基团，如-SO3_、-OPO3_和_C00_，又如 羧甲基(CM)、磺酸丙酰基(SP)和甲基磺酸盐(S)。阴离子交换膜典型地包含具有阳离子功 能基团的配体，阳离子功能基团如-NHR2+和-NR3+,又如二乙氨基乙基(DEAE)、四级氨乙基 (QAE)、季铵(Q)。在本发明中季铵(Q)特别优选使用。膜吸附器是大孔型的，而且其主要动力效应被认为是对流和快速的膜扩散(film diffusion) 0所述吸附器允许大的流速范围，没有在常规的层析珠/树脂等上发现的扩散 限制。膜吸附器能在多种层析应用中使用。目前用途为从药物蛋白中去除DNA、病毒和内
4毒素，从溶液中纯化病毒、蛋白质和肽。将这种技术应用于多糖所实现的优点以前没有被察 知。一次性使用的、抛弃式的膜吸附器是可利用的，同样地在适当处理后能被重新使 用的膜也是可利用的。用于本发明方法的合适的系统是可从赛多利斯(Sartorius)(如 Sartobind Anion Direct)得到的Sartobind膜吸附器。膜吸附器依据本发明的使用消除 了与基于珠体的层析系统有关的昂贵、耗时的层析柱包装和清洗验证的需求。它还允许尽 量减少所需的缓冲液的数量和体积。膜吸附器在层析中的使用允许减少处理时间和缓冲液 用量。吸附器允许大的流速范围，具有强结合能力。其开放结构允许采用宽范围的体积、流 速等，而且为样品/配体相互作用提供了一个的大的表面积。本发明中的方法可以是批量方法，也可以是柱法(column process) 0床体积 (bedvolume)的变化允许所述技术有很高的灵活性，并且容易按比例放大。以膜吸附器获得 的高容量生产能力使得本发明中的方法与常规方法相比具有高产量。优选地，所述勻浆从动物材料的废弃物中提取，例如去掉肌肉组织后(例如为了 用作人类的食物)的非哺乳类海洋动物。所述的非哺乳类海洋动物材料包括源于淡水和咸水中的鱼类(fish)、贝类 (shellfish)和甲壳类(crustacean)，如磷虾(krill)。优选用作哺乳动物食物来源或用作鱼粉(fish meal)、鱼饵和鱼油原材料的非哺 乳类海洋动物。特别优选地，用养殖的非哺乳类海洋动物。合适的非哺乳类海洋动物的例子包括对虾(prawn)、小虾(shrimp)、磷虾 (krill)、鲤鱼(carp)、鈀鱼(barbell)和其它鲤鱼科鱼类；鳕鱼(cod)、狗鳕(hake)、黑线 鳕(haddock)；比目鱼(flounder)；大比目鱼(halibut)；鳎鱼(sole)；鲱鱼(herring)； 沙丁鱼(sardine)；鲚鱼(anchovy)；鰺鱼(jack)；鲻鱼(mullet)；刀鱼(saury)；鲭鱼 (mackerel)；杖鱼(snoek)；带鱼(cutlass fish)；红触(red fish)；售卢鱼(bass) ； M 鱼(eel)(如河鳗(river eel)、康吉鳗(conger)等)；匙吻鲟(paddlefish)；罗非鱼 (tilapia)和其它棘鳍类热带淡水鱼；金枪鱼(tuna)；鲣鱼(bonito)；旗鱼(bill fish)； 海河洄游鱼类(diadromous fish)；等等。合适的鱼类的具体例子是比目鱼、大比目鱼、 鳎鱼、鳕鱼、狗鳕、黑线鳕、鲈鱼、鰺鱼、鲻鱼、刀鱼、鲱鱼、沙丁鱼、鲚鱼、金枪鱼、鲣鱼、旗鱼、 鲭鱼、杖鱼、鲨鱼(shark)、鳐鱼(ray)、胡瓜鱼(capelin)、鲱属小海鱼(sprat)、小沙丁 鱼(brisling)、鳊鱼(bream)、长身鳕鱼(ling)、狼鱼(wolff ish)、鲑鱼(salmon)、鳟鱼 (trout)、银鳟(coho)和奇努克鱼(chinook)。尤其优选所用的非哺乳类海洋动物是鳟 鱼、鲑鱼、鳕鱼或鲱鱼，更尤其是鲑鱼或磷虾。特别优选磷虾，例如南极磷虾(Euphausia superba)、^Cii羊 粦虫下(Euphausia pacif ica)禾口；I匕丰及 粦虫下(Meganyctiphanes norvegica)。用于作为肝素提取原料的包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物废弃物典型地从头 部、皮肤、鳃或内脏器官中选择。尤其优选单独采用鳃、头部和内脏器官。从文献中得知处 理鱼类废弃物的方法，如W02004/049818。通过标准方法制备所述动物材料的勻浆，例如物理或化学的预处理，例如浸软、酸 处理或碱处理等，特别是磨碎和混合。为了去除颗粒物质，所述勻浆可被进一步处理，例如通过离心和/或过滤。然而， 通常这不总是必要的，例如我们已惊奇地发现粗勻浆能被直接施用于膜(常规的层析一般需要更进广泛的预处理步骤)。然而，在本发明的方法中，特别是如果原料是鱼鳃材料，优选 离心或其它方式将勻浆去除细小物。在一个尤其优选的实施方式中，在施用于膜系统之前，为了消化在所述勻浆中存 在的蛋白质，用酶处理所述勻浆，尤其是蛋白酶，如木瓜蛋白酶。为了使蛋白质失活，作为选 择或附加地，所述勻浆可被加热到50至200°C，优选70至120°C，尤其优选，80至100°C，例 如，在80°C左右。曲型地样品的pH值应被调整，使得它至少高于或低于所要的糖胺聚糖等电点 1.0(分别为阴离子交换和阳离子交换)。对于本发明的糖胺聚糖的提取，优选阴离子交换， 在这种情况下，优选5左右的PH值。在样品施用以前，膜的pH值可稳定，例如通过平衡缓冲液(equilibrium buffer) 0用于标准层析分离技术的平衡缓冲液(和其它条件、方法)可被用于本发明的 方法。例如，对于阴离子交换，合适的缓冲液(缓冲液可包括盐，如NaCl)是NH4Ac/HAC、 Bis-Tris/HCl 和柠檬酸盐缓冲液，如 5mM 的 NH4Ac/HAc、IOmM NaCl/25mMNH4Ac/HAcU0mM NaCl/25mM Bis-Tris/HCl和IOmM NaCV25mM柠檬酸盐缓冲液。当使用阳离子交换膜时， 在本发明中所用的合适的平衡缓冲液是柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙二酸盐、MES、磷酸盐寸。对于阴离子交换，平衡缓冲液的pH值应为4. 5至10，优选5至6. 5，例如在5. 5左 右。对于阳离子交换，需要更低的PH值，例如1至4，优选的在2左右。本发明的方法使样品(勻浆)能够被再循环，因此，样品与基质的接触便能被控 制。所述的再循环实施能以任何方便的方式实现，例如，通过将入口管道和出口管道置于同 一容器中。所述勻浆因此能被重复施用于层析基质。优选地，通过在循环所述勻浆的方式， 所述勻浆重复施用于所述基质(例如膜吸附器)。也就是说，将流体(即未结合于基质的任 何材料)重新施用于基质，优选立即跟随它离开膜吸附器(即在洗脱液洗脱之前)。尤其优 选，所述勻浆被再循环，即在被结合的复合物被洗脱之前，重复地施用于基质若干分钟(例 如达到4小时)。典型的施用时间是5分钟至3小时，优选15分钟至2小时，更优选30分 钟至1.5小时，尤其优选45分钟至1小时。对于2.5ml膜，在再循环模式中达30分钟，典 型的滞留时间是2. 8s左右。因此，从另一个方面来说，本发明提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的 方法包括利用层析基质将包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料的勻浆进行层析，其中， 所述的勻浆被重复施用于所述的基质。在这种实施方式中，所述基质优选以和此处描述的 一样的膜吸附器方式。在样品被施用于膜之后，不管是一次性流过，还是用如上面所描述的循环实施方 法，所述被结合的糖胺聚糖复合物能被洗脱。洗脱可利用逐步增加离子强度和/或改变PH 值，或合适的梯度来被实现。优选地，洗脱利用合适的洗脱缓冲液来实施。显然，这些将取 决于固定相的性质。对于阴离子交换，洗脱缓冲液的PH值应为4. 5至10，优选5至6. 5，例 如在5. 5左右。依据本发明，用于阴离子交换方法的合适的洗脱缓冲液是那些在其中流动相反离 子浓度被增加的缓冲液。这被添加NaCl到平衡缓冲液方便地实现了。1-15M，优选2-20M， 例如3-4M的NaCl典型地用于阴离子交换方法，例如含有1_4M NaCl的5mM NH4Ac/HAc、含有 3M NaCl 的 25mM NH4Ac/HAc、含有 IOmM NaCl 的 25mM 柠檬酸盐缓冲液、3. 5M NaCl/5mM 柠 檬酸盐缓冲液。当采用阳离子交换时，本发明所用的合适的洗脱缓冲液是柠檬酸盐、甲酸 盐、乙酸盐、丙二酸盐、MES、磷酸盐。在这两种情况下，pH值与上面概述的平衡缓冲液的列 出的PH值相同。所述方法的包含糖胺聚糖的组合物在进一步处理之前可被浓缩、脱盐和/或干 燥。优选冷冻干燥。在一个优选的实施方式中，洗脱液被脱盐，例如用密理博(Millipore) 公司的Amicon stirred cell超滤器与Nanomax-50滤膜，然后冷冻干燥。当脱盐而且将施 用于尺寸排阻层析(size exclusion chromatography)的层析柱(例如G-75S印hadex层 析柱)的被重新溶解的样品减到最少时，如果未分级肝素将被分级，这种方法特别有用。通过在合适的缓冲液中清洗使得所述膜再生，洗脱后的所述膜能被再利用。此外，在洗脱步骤后，流体(即不管是通过一次性施用还是利用再循环，已被实施 于膜但没有结合的材料)能被重复施用于膜。通过这种方式，同样的勻浆能被利用直到所 要的糖胺聚糖的绝大部分已被分离。在本发明的另一个方面，多于一个膜吸附器被采用，这些膜吸附器能被成列或成 行设置。可根据样品的体积选择膜容量，因此这种方法容易按比例放大。典型的床容积在 从5至2500ml的范围中，然而膜表面积典型地从200cm3至10m3。本发明允许采用比常规的离子层析更高的流速。这取决于膜的容量。对于2.5ml 的膜，典型的流速是5至60ml/min，尤其是10至50ml，尤其优选20至40ml/min，例如在 30ml/min 左右。再循环时间和流速可根据需要调整。与所述基质接触的样品的总量就是再循环时 间和流速的乘积。样品在膜上的接触度被定义为(再循环时间X流速)/基质容积。例如，在25ml/ min再循环1小时，导致1500ml体积与基质接触(60minX 25ml/min)。对于2. 5ml的膜，这 等于值为600的接触度(即每ml膜有600ml)。优选地，此处定义的接触度为50至3000， 优选200至1000，尤其是400至800，更尤其是500至700，特别是在600左右。在本发明的方法的任何阶段，为了避免任何不需要的分解，可采用抗氧化剂。在强阴离子条件下，典型的膜结合容量(cm3)大于0. SmgBSA，在强阳离子条件下， 大于0. 8mg溶菌酶。典型的静态结合容量(mg/设备容积)大于7ang/2. 5ml，大于720mg/25ml，大于 7200mg/250ml ；离子容量(cm3)通常在4-6 μ equiv左右。优选地，原料流在被间隔装置隔开的膜层上切向流过。通过本发明方法提取的糖胺聚糖优选葡萄糖胺聚糖，尤其是那些具有抗凝血特 性，特别是肝素、类肝素或低分子量肝素、低分子量类肝素，或其两种或多种混合物。优选 地，葡萄糖胺聚糖是硫酸糖胺聚糖(sulphated GAG)，特别是肝素或低分子量肝素，尤其优 选葡萄糖胺聚糖是高亲和性糖胺聚糖。就“抗凝血”而言，它的意思是糖胺聚糖具有结合于抗凝血酶、间α-胰蛋白酶抑 制剂、Xa因子和其它哺乳动物肝素能结合的蛋白质的能力，例如被固定于基质(如凝胶基质)和/或延缓或阻止人的血浆凝结或延长哺乳动物(例如小鼠)出血的能力。糖胺聚糖，特别是抗凝血糖胺聚糖或葡萄糖胺聚糖，尤其优选从磷虾中提取的肝 素，其本身具有新颖性和创新性，因此构成本发明的另一个方面。优选通过此处描述的方 法提取的这些糖胺聚糖，然而可采用任何合适的提取方法，例如载于W002/076475和WO 2006/120425的那些方法。上面提到的磷虾糖胺聚糖产品和本发明的方法的产品共同构成本发明的另一个 方面。这些产品可被进一步处理，例如，制得的未分级肝素组合物能被处理(如分级或解 聚)以产生富集或耗尽低分子量肝素和/或极低分子量肝素等的组合物。所述分级和富集 或耗尽它们的组合物共同构成本发明的另一个方面。依据本发明，本发明的产品在提取后能以天然形成的形式使用，如未分级肝素。然 而，可作为选择地，本发明的产品可被转化成盐的形式，优选用生理上可耐受的抗衡离子 (例如钠、钙、镁、钾、铵或葡甲胺)，或被衍生，例如，促使其结合于一项医疗设备的表面，或 进行分子量分级或解聚(例如生产一种符合低分子量肝素的定义的糖胺聚糖分级产品)。 正如此处描述的方法得到的产品一样，这些衍生产品优选生理耐受的。优选地，层析方法获得的产品然后被分级和/或解聚。优选地，分级通过过滤(如膜过滤)或层析实现，尤其优选利用尺寸排阻层析、离 子交换层析或样品置换层析(sample displacement chromatography)。合适的方法被载于 WO 2006/120425。在本发明一个优选的实施方式中，海洋的糖胺聚糖组合物在进一步处理，如分级， 之前被浓缩和脱盐。尤其优选的是，本发明中的海洋的糖胺聚糖通过膜过滤去除低分子量成分，例如 分子量低于抗凝血酶结合五聚物(antithrombin binding pentamer，分子量为17^Da)， 典型地采用分子量阻隔IkDa的膜(如Filtron/^all公司的omega-lkultrasette，密理博 (Millipore)公司的Pellicon IkDa cut-off)。尤其优选的还有，海洋的糖胺聚糖通过膜 过滤去除高分子量成分，例如用分子量阻隔为3000Da的膜(例如用Filtron/I^ll公司的 Omega Centramate Suspended Screen 0S005C11P1)，这使得除了未分级肝素产品外，富集 低分子量肝素和/或极低分子量肝素的分级产品的生产成为可能。为了给满足各种需求提 供糖胺聚糖组合物，这种分级产品可单独使用，组合(例如在组合治疗中)或混合使用。例 如，所述产品可被分级以生产富集低分子量肝素或极低分子量肝素的分级产品。剩下的分 级产品，不是耗尽低分子量肝素就是耗尽极低分子量肝素，可保留而且单独使用或添加到 另外未分级产品中。通过这种方式，尽量减少产品的浪费。根据本发明的方法生产的组合物和此处描述的组合物(不管是未分级肝素还 是遵照上面阐述的分级步骤得到的)可被干燥或可被配制以供使用，例如用稀释剂、载 体或活性药物物质，而且能被用作(优选在用液相载体配制后)医疗仪器表面的涂层 (coating)，例如导尿管或植入管。这样的组合物和具有涂层的仪器构成了本发明的另一个 方面，其制备方法同样地构成了本发明的另一个方面，例如通过混合或被覆。从另一个方面来说，本发明提供通过此处描述的方法生产的非哺乳类海洋动物糖 胺聚糖组合物，可选择进一步包含生理上可接受的载体或辅剂和/或药物物质，而且可选 择被覆于底物上。这种应用于药物或治疗的组合物构成了本发明的另一个方面。
从另一个方面来说，本发明提供了一种磷虾糖胺聚糖组合物，可选择进一步包括 生理上可接受的载体或辅剂和/或药物物质，而且选择被覆于底物上。这种应用于药物或 治疗的组合物构成了本发明的另一个方面。还从另一个方面来说，本发明提供了依据本发明的或依据本发明的方法生产的组 合物或其盐或其衍生产品在哺乳动物医疗方面的用途，特别是人类，例如，组合物或用于在 人类或非人类动物实验对象身上进行手术、治疗、预防或诊断或血液接触的设备。在一个优 选的方面，组合物被分级(例如，根据活性或分子量)以提供富集某种分级产品的组合物， 例如极低分子量肝素。从另一个方面来说，本发明提供了一种通过此处描述的方法生产的，包括磷虾糖 胺聚糖或非哺乳类海洋动物糖胺聚糖的药物组合物或其盐或其衍生产品，连同生理耐受的 载体或辅剂，而且也可选择连同治疗的或预防疾病的药物物质。根据本发明的糖胺聚糖组合物可进一步包含常规的哺乳类糖胺聚糖组合物中的 非糖胺聚糖成分，例如水(优选注射用水)、乙醇、缓冲液、渗透压调节剂、防腐剂等。除了用作抗凝血剂之外，本发明的糖胺聚糖可被用作抗血栓药、抗动脉硬化药、补 体抑制物、抗炎、抗癌剂、抗病毒剂、抗痴呆剂(例如，抗老年痴呆剂)、抗朊病毒剂、抗寄生 药、调理作用抑制物、生物材料、血管生产调节物和用于治疗血管供血不足、伤口和免疫反 应紊乱(例如AIDS)等。它们可以通过肠道或不通过肠道给药，例如口服或皮下给药或结 合在能植入组织或循环系统的物体或药物材料上。除了这些治疗和手术用途之外，本发明的糖胺聚糖可用于诊断目的，例如诊断检 测和肝素所适用或当前所用的非药物用途。因此从另一个方面来说，本发明提供一种包括 抗凝血剂的诊断检测试剂盒，特征在于所述的抗凝血剂是据本发明记载的糖胺聚糖。本发明的方法已经在哺乳动物材料上实施，并且已被发现同样适用于哺乳动物材 料，和适用于非哺乳类海洋动物源的材料一样。用作据本发明的这方面记载的肝素生产/ 提取原料的包含糖胺聚糖的哺乳动物材料优选肉类处理的废弃物，例如在提取食物原料后 的废弃物。肠道，是为优选的材料源，优选牛的或猪的肠道。上面提到的方法、产品和用途， 利用哺乳动物材料(优选是非人类哺乳动物的肠道材料)而不是用非哺乳类海洋动物材 料，因此构成了本发明的另一个方面。因此，从另一个方面来说，本发明提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的 方法包括利用膜吸附器形式的层析基质将包含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析。也 提供了一种生产糖胺聚糖组合物的方法，所述的方法包括利用层析基质(优选膜吸附器) 将包含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析，其中，所述的勻浆重复施用于所述的基质。优选地，从其取得哺乳动物材料的哺乳动物是非人类的哺乳动物。合适的哺乳动 物例子包括牛、山羊、绵羊、鹿、猪、猪科动物(swine)、野猪(boar)等。尤其优选牛的和猪的 材料。此中所提及的文献特此引入作为参考。
具体实施例方式本发明现进一步描述，如下的非限制性的实施例作为参考。在所有的实施例中，所 用的泵是Masterflex I/P泵，除了洗脱用法玛西亚(Pharmacia)公司的P_1蠕动泵之外；所用的膜是2. 5ml的Sartobind Anion Direct强碱性阴离子交换膜。实施例1鲑鱼肠道提取物鲑鱼肠道提取物通过在Milli-Q超纯水中勻浆化280g鲑鱼肠道来制备。通过咔 唑法(carbazole method)测定的糖胺聚糖的理论量计算为98mg (注因为糖胺聚糖含有糖 醛酸，咔唑检验(carbazole test)结果是红色/紫色)。在55°C用木瓜蛋白酶降解蛋白质，然后加热至80°C使蛋白质失活。通过尼龙过滤 去除粗颗粒，然后通过添加0. 5M乙酸铵/乙酸(pH5. 5)至25mM(乙酸盐的最终浓度)并添 加NaCl (最终浓度为IOmM)将提取物的pH值向5. 5调整，pH值测量为6. 08。洗脱1 得到的提取物在膜上以25ml/min左右再循环(通过将入口管道和出口管 道浸在同一个烧杯中)达64分钟，然后用150-200ml平衡缓冲液(25mM乙酸盐/乙酸/IOmM NaCl, ρΗ5· 5)清洗，再用20ml含有3M NaCl的5mM NH4Ac/HAc (pH5. 5)实施洗脱(洗出液 1)。洗脱2 然后用平衡缓冲液清洗膜，而且再一次施用提取物(即来自洗脱1的流 体)，这个时间为45分钟。用平衡缓冲液(150-200ml)清洗它，而且让它静置过夜。然后用 20ml 含有 3M NaCl 的 5mM NH4Ac/HAc (pH5. 5)实施洗脱(洗出液 2)。洗脱3 让膜在IM NaOH中静置1小时左右，然后用平衡缓冲液清洗。再一次施用提 取物(即来自洗脱2的流体)55min,用平衡缓冲液清洗，然后在含有3M NaCl的5mM NH4Ac/ HAc (pH5. 5)中洗脱(洗出液3)。洗脱4 用IM NaOH让膜静置1小时左右，然后用平衡缓冲液冲洗。再一次施用提 取物(即来自洗脱3的流体)51min，用平衡缓冲液清洗，然后在含有3MNaCl的5mM NH4Ac/ HAc (pH5. 5)中洗脱(洗出液4)洗脱5 将平衡缓冲液换成25mM NH4Ac/HAc (pH 5. 0)/IOmM NaCl，提取物(即来自 洗脱4的流体)中的pH值调整至4. 96 (用6M HCl)。在膜上循环60min，然后用200ml平 衡缓冲液清洗膜。利用20ml含有3M NaCl的25mM NH4Ac/HAc (pH5. 0)获得洗出液5。洗脱6:提取物(即洗脱5后的流体)的pH值被调整至5.5(用3M NaOH)，膜 在25mM NH4Ac/HAc (pH 5. 5)/10mM NaCl中清洗。在膜上再循环提取物60min。用含有3M NaCl (20ml)的 5mM NH4Ac/HAc (pH5. 5)获得洗出液 6。洗脱7 膜保存在含有20% EtOH的平衡缓冲液中过夜，然后用IM NaOH处理45min 左右，然后清洗。在膜上再循环提取物(即来自洗脱6的流体)60min。用含有3M NaCl (20ml) 的 5mM NH4Ac/HAC (pH5. 5)获得洗出液 7。结果在下表中总结洗出液洗出液体积 (ml)洗出液中肝素 的重量(mg)洗出液中肝素 的浓度 (mg/ml)备注114.20.7940.0559咔唑检验给出呈褐 色的颜色219.00.9740.0513pH6.06在提取物中319.00.7060.0372黄/褐色在检验中418.91.6350.0171520.30.2100.0103pH5.0在提取物中615.50.7220.0460pH5.5在提取物中718.92.0740.1097黄色在检验中合计7.12将集中起来的洗出液(即洗出液1-7混合在一起)浓缩和脱盐，准备生物检验。实施例2鲑鱼肠道提取物(第二部分)已经在膜上过了 7次的鲑鱼勻浆(即实施例1来自洗脱7的流体)保持在4°C， 用Bis-Tris(即二(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)_甲烷)将pH值调整至6.0。用 IMNaOH(中间用25mM Bis-Tris/HCl/10mM NaCl缓冲清洗液，ρΗ6· 0)清洗膜3次，然后用 25mM Bis-Tris/HCl/10mM NaCl (平衡缓冲液，ρΗ6· 0)平衡。在室温下将勻浆在膜上再循环60min，流速为25ml/min。入口和出口管道在同一 烧杯中，与实施例1 一样，入口在底部，出口在项部。用平衡缓冲液清洗后，用含有3M NaCl 的5mM NH4Ac/HAc (pH 5. 5)实施洗脱(跟先前一样)。洗出液的体积是24. 4ml。通过咔唑检验测定的含有糖醛酸的糖胺聚糖的总量是0. 933mg。实施例3将来自实施1的混合的洗出液(1-7)在密理博(Millipore)公司的Pellicon 1000MWC0膜上以切向流浓缩和脱盐。样品(即来自实施例1洗出液的一切东西，具有 IOOODa以上分子量)然后被冷冻干燥，得到的白色粉末样残余物具有630mg的重量。在凝血酶/抗凝血酶检测中(thrombin/antithrombin assay)使用比色凝血酶底 物(colorimetric thrombin substrate)检验一部份冷冻干燥后的洗出物的肝素活性。该 检验揭示强肝素活性。为了定量的肝素活性测定，分析了另一部份冷冻干燥后的洗出物。 21. 5mg部分给出0. 26U/ml (被溶解于Iml)，这等于在630mg中总共有7. 62U。实施例4鲑鱼肠道提取物(第三部分)已经在膜上过了 8次的勻浆(即来自实施例2的流体)在膜上再一次再 循环1小时(在冰箱中贮存4天以后)，采用流速为25ml/min。然后用平衡缓冲液 (25mMBis-Tris (pH6. 0) /IOmM NaCl)清洗勻浆，用含有 3M NaCl 的 5mM NH4Ac/HAc (pH 5. 5) 完成洗脱(跟先前一样)。咔唑检验给出洗出液中总共3. 02mg。如实施例3描述的那样将洗出液脱盐和浓缩。
实施例5鲑鱼鳃提取物鲑鱼鳃提取物通过在Milli-Q超纯水中勻浆化444. 4g鲑鱼鳃来制备(将鳃切割 取出，留下软骨状的坚韧组织(cartilage，gristle))。在55°C用木瓜蛋白酶降解蛋白质， 然后加热至80°C使蛋白质失活。通过尼龙过滤去除粗颗粒。在勻浆中的PH值测量为6.81， 用6M HCl调整pH值至6.0。将勻浆离心(12000rpm，30min)，上清液被保留，而且在每一步洗脱之前在膜上再 循环 60min，流速 25ml/min。洗脱1 清洗并用3M NaCl/5mM Bis-Tris (pH6. 0)实施洗脱(洗出液1)。洗脱2 在下次再循环(来自洗脱1的流体的)前用IM NaOH中处理膜45min，如 上面所述的一样实施清洗和洗脱(洗出液2)。洗脱3 将膜用IMNaOH处理过夜，随后将来自洗脱2的流体再循环，如上面所述的 一样清洗和洗脱(洗出液3)。包含糖醛酸的糖胺聚糖的总量用咔唑检验测定，每一份洗出液测3次
权利要求
1.一种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用膜吸附器形式 的层析基质将包含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料勻浆进行层析。
2.—种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用层析基质将包 含糖胺聚糖的非哺乳类海洋动物材料勻浆进行层析，其中，所述的勻浆重复施用于所述的基质。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述的非哺乳类海洋动物材料是磷虾 材料。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述的非哺乳类海洋动物材料是鲑鱼 材料。
5.一种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用膜吸附器形式 的层析基质将包含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析。
6.一种生产糖胺聚糖组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括利用层析基质将包 含糖胺聚糖的哺乳动物肠道勻浆进行层析，其中，所述的勻浆重复施用于所述的基质。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述的哺乳动物肠道包括猪的或牛的 肠道。
8.如权利要求2至4、权利要求6或权利要求7中任一项所述的方法，其中所述的基质 是膜吸附器形式的。
9.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的组合物包含抗凝血糖胺聚糖。
10.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的组合物包含肝素。
11.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的层析基质是阴离子交换膜。
12.如上述权利要求任一项所述的方法，所述方法进一步包括解聚和/或分级。
13.通过上述任一项权利要求所述的方法获得的糖胺聚糖组合物。
14.从磷虾提取的糖胺聚糖，特别是抗凝血糖胺聚糖或葡萄糖胺聚糖，尤其优选肝素。
15.权利要求13或权利要求14的所述产品在医学方面的用途。
16.用于医学的权利要求13或权利要求14的所述产品。
全文摘要
本发明提供了一种生产包括糖胺聚糖的组合物的方法，所述的方法包括利用膜吸附器形式层析基质将包括糖胺聚糖的动物材料匀浆进行层析。
文档编号A61K31/727GK102124032SQ200980128370
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者拉格纳·弗兰格斯罗德 申请人:赫普马林公司
最新回复(0)