Hsp70作为酶促活性调节物的应用的制作方法
专利名称：Hsp70作为酶促活性调节物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过利用分子伴侣Hsp70和溶酶体的磷脂二(单酰基甘油)磷酸酯 (BMP，还被称为LBPA)之间的相互作用来调节酶活性的领域。Hsp70-BMP相互作用调节了溶 酶体区室中与BMP相互作用的酶的活性，因此本发明提供了用于逆转溶酶体贮积病理的方 式(means) 0
背景技术：
分子伴侣见于发生蛋白构象重排的细胞的所有区室中，虽然蛋白合成是细胞内不 折叠肽的主要来源，但当面临高温或可能使蛋白结构易变并由此易于不折叠和集聚的其它 刺激物的冲击时，细胞利用包括产生保护蛋白在内的特定细胞反应进行应对。这种反应是 可以在从原核生物至真核生物的各种细胞类型中观察到的现象，被称为热休克反应或热应 激反应。由这种反应诱导的蛋白被称为热休克蛋白(HSP)，其具有几个家族。伴侣分子家族的主要实例是Hsp70蛋白。除了作为伴侣分子外，最近还发现该家 族参与细胞稳态的其它方面一一最明显地通过其抗凋亡性质，其在免疫中的功能以及癌细 胞对Hsp70上调的明显依赖性。此外，Hsp70还可以在保护溶酶体完整性方面发挥作用。然 而其分子机制仍不清楚。溶酶体贮积病是一类罕见疾病，特征是物质在溶酶体区室中集聚并引起溶酶体区 室不稳定，由此对受影响的个体具有破坏性作用。由于物质代谢中涉及的酶缺陷而使该物 质在溶酶体区室中集聚。迄今为止，对于多数溶酶体贮积病还没有可用的治疗方法。这类疾病的根本原因 是特定溶酶体酶不能够高效地代谢诸如脂质的特定溶酶体物质。因此，已经针对这些疾病 中包括戈谢病(Gaucher disease)和法布里病(Fabry disease)的亚组采用通过向患者提 供重组酶的酶替代疗法(ERT)。然而，ERT是一种费用非常昂贵的治疗形式，这可能限制了 其在某些领域的应用，并且ERT还仅对已经产生重组酶的特定类型的疾病有效。本发明旨 在提供用于治疗溶酶体贮积症的新方法。发明概述在本发明中，通过提供对Hsp70和细胞膜(尤其是质膜和溶酶体膜)结合的分子 基础的理解，公开了 Hsp70促进溶酶体膜稳定性的分子基础。由文献已知Hsp70可以在保护溶酶体完整性中发挥作用，然而其分子机制仍不清 楚。此外，对于是否这种作用是主要的应激可诱导的Hsp70(HspAlA/AlB，在本研究中称为 Hsp70)所特有的或者是否其它Hsp70家族成员也可能具有相同性质的问题，仍未得到解答。
这些未解答的问题促成了本发明的主要目的之一，即研究Hsp70的溶酶体保护作 用的分子基础。为此，建立了产生重组Hsp70及其突变体的方法，即基于碘克沙醇梯度超 离心的亚细胞分级(subcellular fractionation)方案。在光致氧化诱导的溶酶体通透 化的基础上建立了直接评价溶酶体膜完整性的实验，该实验使得可进行实时显微法评价 Hsp70和其它成分敏化或保护溶酶体膜的能力的作用。在包括脂质体90°光散射测定、色 氨酸荧光移位和表面等离子共振(BIAcore)的多种体外系统中都对重组Hsp70和突变体与 多种脂质之间的相互作用进行了研究。Hsp70的计算机(in silico)静电表面模建有助于 Hsp70-BMP相互作用的概念性模型的建立。为了证明在体外系统中证实的脂质相互作用的 体内相关性，着眼于关于BMP和Hsp70两个组分的BMP-Hsp70相互作用。为了进一步证明 利用这种机制的可行性，对施用顺钼诱导的细胞死亡模型进行了表征，并在癌细胞系和未 转化细胞系两种细胞系中的所述细胞死亡系统中靶向溶酶体Hsp70。为了解决Hsp70对溶酶体膜稳定性的作用的分子基础，本发明人试图建立可消 除胞质的Hsp70的影响的系统，即需要使Hsp70直接靶向溶酶体。Nylandsted et al.的 电子显微照片显示Hsp70可存在于溶酶体内，因此本发明人决定建立用于产生重组人 Hsp70(rHsp70)的方法，并期望利用细胞内吞机器作为直接向溶酶体递送rHsp70的途径。 本发明人在此绕开了向Hsp70添加可能破坏功能的溶酶体分选信号的需要，并避免了由于 过表达而可能引起的并发症。内吞方法还可以滴定rHsp70的量，并且从更长远的观点出发 开启了研究细胞外Hsp70的摄取机制的可能性。为了验证Hsp70的内吞，在建立Hsp70产生方法后，用荧光团Alexa Fluor 488 对其进行标记(Hsp70-AF488)。共聚焦成像显示，确实可以这种方式使rHsp70靶向至溶 酶体。为了评价对溶酶体膜稳定性的影响，本发明人接着建立了在单个溶酶体的水平上 定量溶酶体膜通透化的方法，并利用该方法评价了细胞内吞的rHsp70的作用。这些方法 形成了实施例1和2的基础，在实施例1和2中，本发明人证明，Hsp70通过与内溶酶体 (endo-lysosomal)阴离子磷脂二(单酰基-甘油)磷酸酯(BMP)的pH依赖性高亲和结合 而对溶酶体进行稳定，从而增强了细胞的存活。Hsp70带正电荷的AIPase结构域负责结合， 但还需要底物结合功能域以有效稳定溶酶体。有趣的是，这种相互作用以及其产生的保护 作用取决于位于AIPase结构域的带正电荷的楔形内的色氨酸90。重要的是，所述细胞保护 作用可以通过rHsp70的细胞内吞递送而获得，并且尤其是通过BMP抗体或Hsp70抑制剂的 细胞外施用而逆转。此外，本发明人还试图将Hsp70的溶酶体膜保护机制与肿瘤产生和程序性细胞 死亡相关联。因此，本发明人表征了通过施用常规化疗剂顺钼启动的细胞死亡程序，并发 现其与caspases无关，但特征在于蛋白酶的溶酶体释放。转基因Hsp70以及细胞内吞的 Hsp70能够通过稳定溶酶体膜而增强细胞在面临顺钼攻击时的存活。有趣的是，本发明人 证明，靶向溶酶体Hsp70本身或者其在溶酶体中的相互作用物二(单酰基-甘油)磷酸酯 (BMP)使转化的前列腺细胞系对顺钼变得敏感(未转化的细胞没有这种变化)，从而为利用 BMP-Hsp70相互作用作为癌症治疗的药理学靶标提供了实验证据。有趣的是，虽然Hsp70_2与Hsp70具有86%的氨基酸同源性，但Hsp70_2不能直接 保护溶酶体膜。然而，缺失Hsp70-2也导致溶酶体膜通透化，并促进细胞的程序性死亡。这 种作用不依赖于Hsp70-2与溶酶体区室之间的直接相互作用，而是通过晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)的下调(响应Hsp70-2的缺失)关联起来。本研究的方法和结果将在实施例部分进行更详细的阐述。在本发明中阐明了 Hsp70通过与溶酶体BMP的相互作用增强溶酶体稳定性的细胞 保护作用的分子基础，这些发现为治疗性靶向溶酶体贮积病提供了基础。本发明现在已经证明，令人惊奇地，向细胞提供重组Hsp70有效逆转溶酶体贮 积病(如本发明证明的尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)和法伯氏病(Farber disease))的病理。此外，向细胞提供Hsp70诱导剂苯甲醇有效逆转溶酶体贮积病(如本发 明证明的尼曼-皮克病)的病理。因此，本发明提供了通过提供Hsp70或其功能片段或变体，或者通过提供Hsp70诱 导物或辅诱导物(co-inducer)而直接或间接提高有此需要的个体中Hsp70的细胞内浓度 和/或活性来治疗溶酶体贮积病的方法。一方面，本发明涉及能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用 作药物或用于溶酶体贮积症的治疗。在一个实施方式中，所述生物活性剂为Hsp70或其功能片段或变体。在另一个实施方式中，所述生物活性剂为Hsp70诱导物或辅诱导物。另一方面，本发明提供了治疗溶酶体贮积病的方法，其包括向有此需要的个体施 用本发明的生物活性剂。在一个实施方式中，所述治疗为预防、治愈或改善。在一个实施方式中，所述溶酶体贮积病选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病 (Krabbe disease)、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病(Sialidosis)、异染性脑白质营养不 良和鞘脂激活蛋白(saposin)缺乏病。在另一个实施方式中，所述溶酶体贮积病的特征在于具有所述疾病病理涉及的缺 陷酶的残留酶促活性。本发明还涉及治疗溶酶体贮积病的方法，其包括施用本发明的生物活性剂和至少 一种其它治疗形式(modality)的组合。本发明再一方面提供了调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP(二(单酰 基甘油)磷酸酯)相互作用，所述方法包括以下步骤i)施用本发明的生物活性剂，ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，禾口iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。另一方面，本发明涉及Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。一方面，本发明涉及调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所 述方法包括施用Hsp70或其功能片段或变体并由此调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的 步骤，其中所述Hsp70或其功能片段或变体是适合使BMP和Hsp70或所述功能片段或变体 之间相互作用的形式。优选地，Hsp70或所述其功能片段或变体与BMP形成共价或非共价 复合物。优选地，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。优选地，所述鞘脂激活蛋白(Saposin)选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂 激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
优选地，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α -半乳糖苷酶、β -半 乳糖苷酶、β -半乳糖苷神经酰胺酶、葡糖神经酰胺酶和酸性神经酰胺酶。优选地，所述酶促活性的调节是上调所述酶的酶促活性。另一方面，本发明涉及Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。优选地，所述 Hsp70或其功能片段或变体可用于治疗、减缓或预防溶酶体贮积症，例如尼曼-皮克病、戈 谢病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病。另一方面，本发明涉及提高化合物的摄取的方法，所述方法包括施用所述化合物 和Hsp70或其功能片段或变体的步骤。在一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变 体与所述化合物共价结合。在另一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变体与所述 化合物非共价结合。本发明的实施方式涉及上调与溶酶体贮积症(例如尼曼-皮克病、戈谢病、法伯氏 病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病)相关的酶的酶促活性的方法。优选地，所述溶酶 体贮积症为尼曼-皮克病。由于所述溶酶体贮积症由酶促活性不足引起，因此本发明的目的是提高所述酶促 活性，从而减轻或治愈所述病症。已经证明，Hsp70与BMP相互作用。由于BMP作为其它多种蛋白的辅因子，Hsp70和 BMP之间的相互作用可以调节所述其它多种蛋白的功能。例如，BiflMtSaSMase的辅因子。 因此，Hsp70和BMP之间的相互作用可以提高aSMase的活性。由于尼曼-皮克病与aSMase 活性的降低有关，因此Hsp70可以通过提高aSMase的活性来减轻或治愈尼曼-皮克病。类 似地，BMP作为鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D的辅因 子发挥作用。这些鞘脂激活蛋白在其它溶菌酶贮积症中均有涉及，因此Hsp70可以通过提 高鞘脂激活蛋白或与所述鞘脂激活蛋白相关的酶的活性来减轻或治愈其它溶酶体贮积症。在本发明的一个实施方式中，在溶酶体贮积症的治疗中同时施用Hsp70和酶替代 疗法。在这种方式中，由于Hsp70的酶激活作用，因此可以显著降低所必需的酶量。在另一个实施方式中，使用Hsp70促进酶替代疗法中酶的摄取，由此提高被相关 细胞摄取的酶量。定义和简称aSMase/ASMADD70 AIF AO Apaf-I Bag-I Bcl-2 Bid BMP CARD Caspase CHIP
酸性鞘磷脂酶
用于 Hsp70 的源自 AIF 的诱馆(AIF-derived decoy for Hsp70)
凋亡诱导因子
吖啶橙
凋亡蛋白酶激活因子-1
Bcl-2 ^ijliiIitSi=I (Bcl-2 associated athanogene-1)
B细胞淋巴瘤/白雪病2
BH3相互作用结构域凋亡激动蛋白
二(单酰基甘油)磷脂
Caspase
半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 Hsp70-结合蛋白的羧基末端
CytC 细胞色素C
DD 死亡结构域
DED 死亡效应域
dsRNA 双链RNA
eHsp70 细胞外Hsp70
ER 内质网
ERT酶替代疗法
FADD 包含Fas相关死亡结构域的蛋白
HIP Hsp70相互作用蛋白
HRP 辣根过氧化物酶
HS 热休克/热应激
HSE 热休克元件
HSF 热休克因子
Hsp 热休克蛋白
HspBPl 热休克蛋白结合蛋白1
IAP 凋亡蛋白抑制蛋白
iMEF永生化的鼠胚胎成纤维细胞
JNK c-Jun氨基末端激酶
LAMP-I/-2 溶酶体相关膜蛋白-1/-2
LBPA 溶血二磷脂酸(lysobisphospha1
LEDGF 晶状体上皮源性生长因子
LMP 溶酶体膜通透化
MIC-I 巨噬细胞抑制细胞因子1
MOMP 线粒体外膜通透化
MPR甘露糖6-磷酸受体
MTT 3- (4，5- 二甲基-2-噻唑基)-2，
NPD尼曼-皮克病
NPDAA型尼曼-皮克病
NPDBB型尼曼-皮克病
NPDCC型尼曼-皮克病
NPDDD型尼曼-皮克病
PCD 程序性细胞死亡
PKC 蛋白激酶C
POPC 棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱
POPS 棕榈酰-油酰-磷脂酰丝氨酸
RNAi RNA干扰
ROS 活性氧
SD 标准偏差
siRNA 小干扰RNA
Smac/Diablo 第二个线粒体来源的caspase激活因子tBid 截短 BidTNF 肿瘤坏死因子TNFR TNF-受体TRADD TNFR相关死亡结构域蛋白TRAF TNFR 相关因子溶酶体贮积症(LSD)所使用的术语“溶酶体贮积症”和“溶酶体贮积病”同义。Hsp70的功能片段术语“Hsp70的功能片段”解释为表示Hsp70的具有预期功能 的任何片段。与酶促活性的调节有关时，功能片段是能够调节所述酶促活性的片段。与提 高物质的摄取有关时，Hsp70的功能片段是能够提高所述物质的摄取的片段。应该理解，所 述功能片段的精确量化作用可能与全长分子的作用不同。在一些情况下，所述功能片段可 能确实比全长分子更有效。此外，从片段的较小尺寸考虑，使用片段代替全长分子可能是有 利的。Hsp70的功能变体术语“Hsp70的功能变体”解释为表示Hsp70的具有预期功能 的任何变体。与酶促活性的调节有关时，功能变体是能够调节所述酶促活性的变体。与提 高物质的摄取有关时，Hsp70的功能变体是能够提高所述物质的摄取的片段。应该理解，所 述功能变体的精确量化作用可能与全长分子的作用不同。在一些情况下，所述功能变体可 能确实比全长分子更有效。“生物活性剂”(即在生物学上具有活性的物质/试剂)是提供可以通过体内或体 外证明的某些药理学作用(通常为有益作用)的任何试剂、药物、化合物、物质组分或组合 物。在本文中使用的该术语进一步包括在个体中产生局部或全身作用的任何生理学或药理 学活性物质。生物活性剂的另外实例包括，但不限于包含寡糖或由寡糖组成的试剂，包含 多糖或由多糖组成的试剂，包含任选糖基化的肽或由任选糖基化的肽组成的试剂，包含任 选糖基化的多肽或由任选糖基化的多肽组成的试剂，包含核酸或由核酸组成的试剂，包含 寡核苷酸或由寡核苷酸组成的试剂，包含多核苷酸或由多核苷酸组成的试剂，包含脂质或 由脂质组成的试剂，包含脂肪酸或由脂肪酸组成的试剂，包含脂肪酸酯或由脂肪酸酯组成 的试剂，以及包含次级代谢物或由次级代谢物组成的试剂。在个体(例如人和其它任何动 物)的治疗中，生物活性剂可以用于预防疾病、治疗疾病。本文使用的生物活性剂是能够提 高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的物质。本文使用的术语“药”或“药物”包括作用于人或动物体局部或全身的在生物学上、 生理学上或药学上具有活性的物质。本文使用的术语“治疗”和“疗法”等同地表示治愈性治疗、预防性治疗和改善性 治疗或减轻性治疗。该术语包括用于获得可以在临床上建立的有益的或期望的生理学结果 的方法。出于本发明的目的，有益的或预期的临床效果包括，但不限于缓解症状，减小疾病 的程度，稳定(即不恶化)病况，延迟或减慢病况/症状的发展或恶化，改善或减轻病况或 症状，以及不论可测与否的缓和(部分或完全)。本文使用的术语“减轻”及其变式表示，与 不施用本发明组合物相比，生理病况或症状的程度和/或有害表现减少和/或发展时间减 慢或延长。如果根据构成术语“治疗”和“疗法”的定义的标准测定，所治疗的病况有变化，则“治疗效果”或“疗效”是明显的。如果有至少5%的改善，优选10%的改善，更优选至少 25%，甚至更优选至少50%，如至少75%，最优选至少100%的改善，则所治疗的病况有“变 化”。所述变化可基于所治疗个体病况的严重程度的改善，或者基于利用生物活性剂或生物 活性剂和本发明的药物组合物治疗和不治疗的个体群病况改善频率的差异。“生物活性剂”的“药理学上的有效量”、“药学上的有效量”或“生理学上的有效量” 是在使用本发明所述药物组合物时，为在所治疗的个体血流中或作用部位(即肺、胃系统、 结肠系统、前列腺等)提供预期水平的活性剂以产生预期的生理反应所需要的此组合物中 存在的活性剂的量。准确的量将取决于多种因素，例如活性剂、组合物的活性、所采用的递 送装置、组合物的物理特征、计划的患者用法(即每天施用的剂量数)和患者因素等，并且 可以由本领域技术人员根据本文提供的信息而容易地确定。可以在一次给药中，或者通过 多次施用总和为有效量的量(优选在M小时的时间内)而施用“有效量”的生物活性剂。 可以通过用于测定合适量和给药时间的标准临床方法确定有效量。应该理解，“有效量”可 以是由医疗专家和/或个人确定的经验性和/或个性化(根据个案)结果。本文使用的术语“增强”和“提高”有益效果及其变式是指，与安慰剂相比生物活 性剂的治疗效果，或者本发明的药物治疗的治疗效果高于通常利用不含本发明生物活性剂 的药物组合物所获得的治疗效果的提高。作为施用生物活性剂的结果，当治疗效果的强度 和/或程度得到促进和/或提高时，“治疗效果的提高”是明显的。“治疗效果的提高”还包 括治疗益处的时间得到延长。它还可以表现为，与施用不含生物活性剂的较高量的药物组 合物相比，当共同施用所述药物组合物和本发明提供的生物活性剂时获得相同益处和/或 效果所需要的所述药物组合物的量较低。优选但不必需地，所述效果的增强引起对所述药 物组合物单独不能有效治疗或者治疗效果较小的急性症状的治疗。与单独施用药物组合物 相比，当本发明的生物活性剂与药物组合物共同施用时治疗效果具有至少5%的提高，例如 治疗效果具有至少10%的提高，则实现了增强(提高)。优选地，所述提高为至少25%，更 优选至少50 %，甚至更优选至少75 %，最优选至少100 %。本文使用的“共同施用”、“同时施用”或“一起施用”生物活性剂或者生物活性剂 和现有药物是指，在一定时间内施用本发明的一种或多种生物活性剂，或者施用本发明的 一种或多种生物活性剂和现有药物组合物。所述时间优选小于72小时，例如48小时，例如 小于M小时，例如小于12小时，例如小于6小时，如小于3小时。然而，所述术语还表示可 以同时施用所述生物活性剂和治疗性组合物。术语“个体”指脊椎动物，尤其是哺乳动物中的一种，优选包括人在内的灵长类。在 优选的实施方式中，本文使用的个体为任意年龄的人，男性或女性。“有此需要的个体”是指可以从本发明受益的个体。在一个实施方式中，所述有此 需要的个体为患病个体，其中所述疾病为溶酶体贮积病。术语“天然核苷酸”或“核苷酸”是指在自然界中发现的任意四种脱氧核苷酸dA、 dG、dT和dC(DNA的组分)和四种核苷酸A、G、U和C (RNA的组分)。各种天然的核苷酸包括 糖部分(核糖或脱氧核糖)、磷酸部分和天然/标准的碱基部分或基本由上述部分组成。天 然核苷酸根据熟知的碱基配对原则(Watson和Crick)与互补核苷酸结合，其中腺嘌呤(A) 与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，其中相应的碱基对是互 补且反向平行的核苷酸链的一部分。碱基配对引起预定的互补核苷酸之间的特异杂交。碱基配对是酶能够催化合成与模板寡核苷酸互补的寡核苷酸的基础。在这种合成中，结构单 元(通常为A、T、U、C或G的核糖衍生物或脱氧核糖衍生物的三磷酸酯)在模板寡核苷酸的 指导下形成具有正确的互补序列的互补寡核苷酸。互补序列对其寡核苷酸序列的识别由形 成碱基对的相应相互作用碱基介导。实质上，导致碱基配对的具体相互作用由碱基的大小 以及碱基的氢键供体和受体的模式控制。大的嘌呤碱基(A或G)与小的嘧啶碱基(T、U或C) 配对。此外，碱基之间的碱基配对识别还受碱基之间形成的氢键的影响。在Watson-Crick 碱基配对几何中，利用连接两个环原子的中间氢键和在任意一侧结合附加于各所述环的官 能基团的氢键，利用与受体基团配对的供体基团，使六元环(天然寡核苷酸中的嘧啶)与由 稠合六元环和五元环(天然寡核苷酸中的嘌呤)构成的环系统并列。本文使用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段和通过连接、剪切、 核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中任何一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在 的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的 α-对映体形式)或二者的组合的单体构成。修饰核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌 呤碱基部分具有变化。糖修饰包括，例如利用卤素、烷基基团、胺和叠氮基团取代一个或 多个羟基基团，或者可以使糖官能化作醚或酯。此外，还可以用空间上和电子上相似的 结构，例如氮杂-糖和碳环糖类似物取代完整的糖部分。碱基部分的修饰的实例包括烷 基化嘌呤和嘧啶，酰化嘌呤或嘧啶或者其它熟知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸 二酯键或这些连接的类似物进行连接。磷酸二酯键连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫 代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、 phosphoroanilothioate,phosphorani 1 idate和氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”也包括， 例如包含连接至聚酰胺骨架上的天然存在的或修饰的核酸碱基的所谓的“肽核酸”。核酸可 以为单链或双链。术语“核酸分子的互补物”是指与参考核苷酸序列相比具有互补核苷酸序列并且 为反方向的核酸分子。例如，序列5' ATGCACGGG 3'与5' CCCGTGCAT 3'互补。“分离的核酸分子”是指没有整合在生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已 经从细胞的基因组DNA分离的编码生长因子的DNA分子即为分离的DNA分子。分离的核酸 分子的另一个实例是没有整合在生物体的基因组中的化学合成的核酸分子。已经从特定物 种分离的核酸分子小于该物种的染色体的完整DNA分子。“核酸分子构建体”是已经通过人为介入进行修饰从而包含以天然不存在的排列 结合或并列的核酸片段的单链或双链核酸分子。“线性DNA”是指具有游离5’和3’末端的非环状DNA分子。可以通过酶促降解或 物理断裂由闭合的环状DNA分子(例如质粒)制备线性DNA。“互补DNA(cDNA) ”是反转录酶由mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，采用与部 分mRNA互补的引物起始反转录。本领域技术人员还使用术语“cDNA”表示由此类单链DNA 分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还表示由RNA模板合成的cDNA分 子的克隆。“异源DNA”是指在给定宿主细胞中天然不存在的DNA分子或DNA分子群。异源于 具体宿主细胞的DNA分子可以包含源自所述宿主细胞的物种的DNA(内源DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即异源DNA)结合。例如，可以将包含非宿主DNA片段的DNA分子认为是 异源DNA分子，其中所述非宿主DNA片段编码可操作地与包含转录启动子的宿主DNA片段 连接的多肽。相反，异源DNA分子可以包含可操作地与外源启动子相连的内源基因。作为 另一个示例，如果DNA分子被引入到缺乏野生型基因的突变细胞内，则也可以将包含源自 野生型细胞的所述基因的该DNA分子认为是异源DNA。“多肽”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，优选其仅通过肽键相连。通过 非宿主DNA分子表达产生的多肽为“异源”肽或多肽。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、 肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已经经过翻译后修饰或可以不经过翻译后修饰。翻 译后修饰可以为，例如磷酸化、甲基化和糖基化。术语“表达”是指基因或基因产物的生物合成。“杂交”表示不同来源的核酸链的退火；S卩，在初始时没有配对的两条DNA链的互 补区之间形成碱基对。根据 Sambrook et al. ,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989)，1. 101-1. 104，对术语“在严格条件下的杂 交”进行定义。优选地，在严格条件下的杂交表示，利用IX SSC和0. 1% SDS在50°C、优选 在55 °C、更优选在62 °C且最优选在68°C洗涤1小时后，尤其是在0. 2 X SSC^PO. SDS中 在50°C、优选在55°C、更优选在62°C且最优选在68°C洗涤1小时后，观察到阳性杂交信号。“完全同源”的延长(stretch)定义为配对核苷酸沿着相互作用的核苷酸的序列的 匹配；在天然存在的RNA中，A与U配对，G与C配对。“启动子”为指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码 区，与结构基因的转录起始位点相邻近。在转录起始中发挥作用的启动子内的序列元件通 常以共有核苷酸序列为特征。如果启动子为诱导型启动子，则在对诱导剂的应答中提高转 录速率。相反，如果启动子为组成型启动子，则诱导剂不能调节转录速率。还已知有阻遏型 启动子。“调控元件”是调节启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可以包含与能够排 他地或优先地在特定细胞、组织或器官中进行转录的细胞因子结合的核苷酸序列。这些类 型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“器官特异性”的方式表达的基因
纟口口。“增强子”是一种类型的调控元件，其能够提高转录效率，而不论增强子相对于转 录起始位点的距离或方向。“克隆载体”为具有能够在宿主细胞中自主复制的能力的核酸分子，例如质粒、粘 粒或细菌噬菌体。克隆载体通常包含一个或少数几个限制性内切酶识别位点，该位点允许 以可确定的方式插入核酸分子，而不使载体丧失主要的生物功能；和编码标记基因的核苷 酸序列，该序列适合用于转化有所述克隆载体的细胞的鉴别和筛选。标记基因通常包括提 供四环素或氨苄青霉素抗性的基因。“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包含转 录启动子、基因和转录终止子。基因表达常常处于启动子的控制之下，将此类基因称为“可 操作地连接至”所述启动子上。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件 和核心启动子被可操作地连接。被称作“转录载体”的较简单载体仅能够转录但不能翻译 它们能够在靶细胞中复制但不能表达，其与表达载体不同。转录载体用于扩增其插入物。
“重组宿主”是包含异源核酸分子，例如克隆载体或表达载体的细胞。转染描述的是将外来物质引入真核细胞中。用于非病毒方法的术语“转染”最常 用于指哺乳动物细胞，而术语“转化”优选用于描述非病毒DNA转移至细菌和非动物真核细 胞，例如真菌、藻类和植物。化学方法和物理方法均可以用于转染细胞。“多肽”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，其优选仅通过肽键连接。通过 非宿主DNA分子表达产生的多肽为“异源”肽或多肽。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、 肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已经经过翻译后修饰或可以不经过翻译后修饰。翻 译后修饰可以为，例如磷酸化、甲基化和糖基化。“氨基酸残基”可以为肽键或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨 基酸残基可以为D-构型或L-构型。氨基酸残基包括被包含碳原子或碳原子链的中心部分 分开的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(COOH)，它们的至少之一包括至少一个侧链或 官能团。NH2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基基团，COOH是指存在于氨基酸或肽 的羧基末端的羧基基团。常用术语氨基酸包括天然的或非天然的氨基酸。J. Biol. Chem.， 243 :3552-59 (1969) and adopted in 37 C. F. R. ,section 1.822(b) (2)中列出的标准命名 法的天然氨基酸属于下表1中列出的氨基酸组。非天然氨基酸是未列在表1中的氨基酸。 非天然氨基酸的实例是，例如37 C. F. R. section 1.822(b) (4)中列出的氨基酸，其均通过 引用并入本文。此外，非天然氨基酸残基包括，但不限于经修饰的氨基酸残基、L-氨基酸残 基和D-氨基酸残基的立体异构体。
权利要求
1.能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其作为药物或用于溶酶体 贮积症的治疗。
2.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂为Hsp70或其功能片段或变体。
3.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体与野生型 Hsp70蛋白具有100%的同源性。
4.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体与野生型 Hsp70蛋白具有99. 9-95 %的同源性，例如95-90 %的同源性，如90-85 %的同源性，例如 85-80 %的同源性，如80-75 %的同源性，例如75-60 %的同源性。
5.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70。
6.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70是全长Hsp70。
7.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂为Hsp70的功能片段或变体。
8.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长小于 641个氨基酸，如小于625个氨基酸，例如小于600个氨基酸，如小于575个氨基酸，例如小 于550个氨基酸，如小于525个氨基酸，例如小于500个氨基酸，如小于475个氨基酸，例如 小于450个氨基酸，如小于425个氨基酸，例如小于400个氨基酸，如小于375个氨基酸，例 如小于350个氨基酸，如小于325个氨基酸，例如小于300个氨基酸，如小于275个氨基酸， 例如小于250个氨基酸，如小于225个氨基酸，例如小于200个氨基酸，如小于175个氨基 酸，例如小于150个氨基酸，如小于125个氨基酸，例如小于100个氨基酸，如小于75个氨 基酸，例如小于50个氨基酸，如小于25个氨基酸。
9.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长大于 10个氨基酸，如大于25个氨基酸，例如大于50个氨基酸，如大于75个氨基酸，例如大于100 个氨基酸，如大于125个氨基酸，例如大于150个氨基酸，如大于175个氨基酸，例如大于 200个氨基酸，如大于225个氨基酸，例如大于250个氨基酸，如大于275个氨基酸，例如大 于300个氨基酸，如大于325个氨基酸，例如大于350个氨基酸，如大于375个氨基酸，例如 大于400个氨基酸，如大于425个氨基酸，例如大于450个氨基酸，如大于475个氨基酸，例 如大于500个氨基酸，如大于525个氨基酸，例如大于550个氨基酸，如大于575个氨基酸， 例如大于600个氨基酸，如大于625个氨基酸。
10.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体具有的氨 基酸取代为Hsp70的0. 1-1 %的氨基酸残基，如1-2 %的氨基酸残基，例如2-3 %的氨基 酸残基，如3-4%的氨基酸残基，例如4-5 %的氨基酸残基，如5-10 %的氨基酸残基，例如 10-15%的氨基酸残基，如15-20%的氨基酸残基，例如20-30%的氨基酸残基，如30-40% 的氨基酸残基，例如40-50%的氨基酸残基，如50-60%的氨基酸残基，例如60-70%的氨基 酸残基，如70-80 %的氨基酸残基，例如80-90 %的氨基酸残基，如90-100 %的氨基酸残基。
11.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长 为5-25个氨基酸，如25-50个氨基酸，例如50-75个氨基酸，如75-100个氨基酸，例如 100-125个氨基酸，如125-150个氨基酸，例如150-175个氨基酸，如175-200个氨基酸，例 如200-225个氨基酸，如225-250个氨基酸，例如250-275个氨基酸，如275-300个氨基酸，例如300-325个氨基酸，如325-350个氨基酸，例如350-375个氨基酸，如375-400个氨基 酸，例如400-425个氨基酸，如425-450个氨基酸，例如450-475个氨基酸，如475-500个氨 基酸，例如500-525个氨基酸，如525-550个氨基酸，例如550-575个氨基酸，如575-600个 氨基酸，例如600-625个氨基酸，如625-640个氨基酸。
12.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体包含Hsp70 的AIPase结构域的全部或部分。
13.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体在 Hsp70ATPase结构域的第90位氨基酸位置包含色氨酸。
14.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体为重组 Hsp70 (rHsp70)。
15.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70源自选自人(homosapiens), 小鼠(mus musculus)、牛、狗、大鼠、鼬、猪、绵羊和猴的哺乳动物。
16.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70诱导物或辅诱导物。
17.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70诱导物。
18.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70辅诱导物。
19.如权利要求18所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70辅诱导物是羟胺衍生物。
20.如权利要求19所述的生物活性剂，其中，所述羟胺衍生物选自氯吡哌醇 (BRLP-42)、Arimoclomol(BRX-220)、BRX-345 和 BGP-15。
21.如权利要求19所述的生物活性剂，其中，所述羟胺衍生物是 Arimoclomol(BRX-220)。
22.如权利要求17所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70诱导物是膜流化剂。
23.如权利要求22所述的生物活性剂，其中，所述膜流化剂选自苯甲醇、庚醇、AL721、 二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇、利多卡因、罗哌卡因、布比卡 因和马比佛卡因。
24.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70诱导物或辅诱导物选自依地福 新(ET-18-0CH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱)、塞来昔布、罗非昔布、 乙酰水杨酸、水杨酸钠、吲哚美辛、PGAU PGj2、2-环戊烯-1-酮、过氧化物酶增殖物激活型 受体Y-激动剂、长春新碱、紫杉醇、吡格列酮、卡钼、多柔比星、氟达拉滨、异环磷酰胺、阿 糖胞苷、格尔德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤壳菌素、除莠霉素_A、花生四烯酸、MG132、乳胞 素、DCIC、TLCK和TPCK、替普瑞酮(GGA)、瑞巴匹特、甘珀酸、聚普瑞锌(L-肌肽锌)、地塞米 松、可卡因、烟碱、醇、α -肾上腺素激动剂、环戊烯酮前列腺素、芍药苷、甘草甜素、雷公藤红 素、二氢雷公藤红素、二氢雷公藤红素二乙酸酯和姜黄素。
25.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是亚致死热疗。
26.如权利要求25所述的生物活性剂，其中，所述亚致死热疗包括提高个体的温度至 约38°C的核心温度，如约39°C，例如约40°C，如约41V，例如约42°C，如约43°C的核心温 度。
27.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂包括Hsp70或其功能片段 或变体和Hsp70诱导物或辅诱导物的组合。
28.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂包括Hsp70或其功能片段 或变体和提高Hsp70和BMP之间的相互作用的物质的组合。
29.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述治疗为预防、治愈或改善。
30.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯 氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白 缺乏病。
31.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂经肠胃外施用于有此需要 的个体。
32.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是静脉内、皮下、肌内、动 脉内、皮下或腹膜内注射。
33.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是静脉内输注。
34.如权利要求33所述的生物活性剂，其中，所述静脉内输注进行的时间为10分 钟-20分钟，如20-30分钟，例如30-40分钟，如40-50分钟，例如50-60分钟，如60-90分 钟，例如90-120分钟，如2小时-3小时，例如3-4小时，如4_5小时，例如5_6小时，如6_7 小时，例如7-8小时。
35.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是经粘膜递送。
36.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是舌下递送。
37.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是口含递送。
38.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是吹入递送。
39.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是鼻内递送。
40.Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。
41.调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP(二(单酰基甘油)磷酸酯)相互作 用，所述方法包括以下步骤i)施用权利要求1-39中任一项所述的生物活性剂，ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，和iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述Hsp70与BMP形成共价或非共价复合物。
43.如权利要求41所述的方法，其中，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述鞘脂激活蛋白选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激 活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
45.如权利要求41所述的方法，其中，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶(aSMase)、 酸性神经酰胺酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖神经酰 胺酶、唾液酸酶和芳基硫酸酯酶。
46.如权利要求41所述的方法，其中，所述酶促活性的调节是所述酶促活性的提高。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述酶促活性的提高是提高1-5%，如5-10 %， 例如 10-15 %，如 15-20 %，例如 20-25 %，如 25-30 %，例如 30-35 %，如 35-40 %，例如 40-45 %，如 45-50 %，例如 50-60 %，如 60-70 %，例如 70-80 %，如 80-90 %，例如 90-100 %， 如 100-120 %,例如 120-140 %,如 140-160 %,例如 160-180 %,如 180-200 %,例如 200-250 %，如 250-300 %，例如 300—400 %，如 400—500 %，例如 500—750 %，如 750—1000 %，例如 1000-1500%，如 1500-2000%，例如 2000-5000%
48.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用权利要求1-39中 任一项所述的生物活性剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述治疗为预防、治愈或改善。
50.如权利要求48所述的方法，其中，所述治疗延长了有此需要的所述个体的预期寿命。
51.如权利要求48所述的方法，其中，所述预期寿命提高了6个月-1年，如1年-2年， 例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6_7年，如7-8年，例如8_9年，如9_10 年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如 25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90 年，如90-100年。
52.如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病选自尼曼-皮克病、法伯氏病、 克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白缺乏 病。
53.如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病的特征是在细胞内积聚的鞘 脂增加。
54.如权利要求53所述的方法，其中，所述治疗将细胞内积聚的鞘脂降低了至少5%， 如至少10%，例如至少15%，如至少20%，例如至少25%，如至少30%，例如至少35%，如 至少40%，例如至少45%，如至少50%，例如至少55%，如至少60%，例如至少65%，如至 少70%，例如至少75%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%，例如至少95%，如至少 100%。
55.如权利要求M所述的方法，其中，所述鞘脂选自鞘磷脂、神经酰胺、半乳糖苷神经 酰胺、球形三酰神经酰胺、糖基神经酰胺、GM3和硫脑苷脂。
56.如权利要求48所述的方法，其中，所述生物活性剂被配制为药物组合物。
57.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为A型尼曼-皮克病或B型尼曼-皮克病。
58.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为法伯氏病。
59.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为克拉伯病。
60.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为唾液酸贮积病。
61.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为异染性脑白质营养不良。
62.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为戈谢病。
63.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为法布里病。
64.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为鞘脂激活蛋白缺乏病。
65.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积病的特征是具有与所述疾病病理相关的缺陷酶的残余酶促活性。
66.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述残余酶促 活性为 0. -50%，如 0. 1-1%，例如 1-2%，如 2-3%，例如 3-4%，如 4_5%，例如 5-6%， 如 6-7%，例如 7-8%，如 8-9%，例如 9-10%，如 10-11%，例如 11-12%，如 12-13%，例如 13-14%，如 14-15%，例如 15-20%，如 20-25%，例如 25-30%，如 30-35%，例如 35-40%, 如40-45%，例如45-50%的残余酶促活性。
67.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括施用权利要求1-39中任一项所述的生物 活性剂和至少一种其它治疗形式的组合。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是用于溶酶体贮积 病的常规或已知治疗形式。
69.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式同时或序贯施用。
70.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是酶替代疗法 (ERT)。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述ERT选自Cerezyme (注射用伊米苷酶)、 美格鲁特、Fabrazyme (β半乳糖苷酶)和利甫盖素(α半乳糖苷酶)。
72.如权利要求67所述的方法，其中，向患有戈谢病的个体施用所述生物活性剂和 Cerezyme (注射用伊米苷酶)或美格鲁特的组合。
73.如权利要求67所述的方法，其中，向患有法布里病的个体施用所述生物活性剂和 Fabrazyme (^半乳糖苷酶)或利甫盖素(α乳糖苷酶)的组合。
74.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是止痛物品。
75.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是皮质类固醇。
76.如权利要求56所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是移植。
77.权利要求76所述的方法，其中，所述移植选自骨髓移植、脐带血移植和干细胞移植。
78.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是底物减少疗法。
79.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是对症和支持疗法， 如物理疗法。
全文摘要
本发明涉及用于调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所述方法包括施用或诱导Hsp70或其功能片段或变体并从而调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的步骤，其中所述Hsp70或其功能片段或变体是适合使BMP和Hsp70或所述功能片段或变体之间相互作用的形式。
文档编号A61P3/00GK102123729SQ200980131985
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者托马斯·基尔克高·延森, 玛丽亚·海伦娜·耶泰莱 申请人:奥菲泽米有限公司
技术领域：
本发明涉及通过利用分子伴侣Hsp70和溶酶体的磷脂二(单酰基甘油)磷酸酯 (BMP，还被称为LBPA)之间的相互作用来调节酶活性的领域。Hsp70-BMP相互作用调节了溶 酶体区室中与BMP相互作用的酶的活性，因此本发明提供了用于逆转溶酶体贮积病理的方 式(means) 0
背景技术：
分子伴侣见于发生蛋白构象重排的细胞的所有区室中，虽然蛋白合成是细胞内不 折叠肽的主要来源，但当面临高温或可能使蛋白结构易变并由此易于不折叠和集聚的其它 刺激物的冲击时，细胞利用包括产生保护蛋白在内的特定细胞反应进行应对。这种反应是 可以在从原核生物至真核生物的各种细胞类型中观察到的现象，被称为热休克反应或热应 激反应。由这种反应诱导的蛋白被称为热休克蛋白(HSP)，其具有几个家族。伴侣分子家族的主要实例是Hsp70蛋白。除了作为伴侣分子外，最近还发现该家 族参与细胞稳态的其它方面一一最明显地通过其抗凋亡性质，其在免疫中的功能以及癌细 胞对Hsp70上调的明显依赖性。此外，Hsp70还可以在保护溶酶体完整性方面发挥作用。然 而其分子机制仍不清楚。溶酶体贮积病是一类罕见疾病，特征是物质在溶酶体区室中集聚并引起溶酶体区 室不稳定，由此对受影响的个体具有破坏性作用。由于物质代谢中涉及的酶缺陷而使该物 质在溶酶体区室中集聚。迄今为止，对于多数溶酶体贮积病还没有可用的治疗方法。这类疾病的根本原因 是特定溶酶体酶不能够高效地代谢诸如脂质的特定溶酶体物质。因此，已经针对这些疾病 中包括戈谢病(Gaucher disease)和法布里病(Fabry disease)的亚组采用通过向患者提 供重组酶的酶替代疗法(ERT)。然而，ERT是一种费用非常昂贵的治疗形式，这可能限制了 其在某些领域的应用，并且ERT还仅对已经产生重组酶的特定类型的疾病有效。本发明旨 在提供用于治疗溶酶体贮积症的新方法。发明概述在本发明中，通过提供对Hsp70和细胞膜(尤其是质膜和溶酶体膜)结合的分子 基础的理解，公开了 Hsp70促进溶酶体膜稳定性的分子基础。由文献已知Hsp70可以在保护溶酶体完整性中发挥作用，然而其分子机制仍不清 楚。此外，对于是否这种作用是主要的应激可诱导的Hsp70(HspAlA/AlB，在本研究中称为 Hsp70)所特有的或者是否其它Hsp70家族成员也可能具有相同性质的问题，仍未得到解答。
这些未解答的问题促成了本发明的主要目的之一，即研究Hsp70的溶酶体保护作 用的分子基础。为此，建立了产生重组Hsp70及其突变体的方法，即基于碘克沙醇梯度超 离心的亚细胞分级(subcellular fractionation)方案。在光致氧化诱导的溶酶体通透 化的基础上建立了直接评价溶酶体膜完整性的实验，该实验使得可进行实时显微法评价 Hsp70和其它成分敏化或保护溶酶体膜的能力的作用。在包括脂质体90°光散射测定、色 氨酸荧光移位和表面等离子共振(BIAcore)的多种体外系统中都对重组Hsp70和突变体与 多种脂质之间的相互作用进行了研究。Hsp70的计算机(in silico)静电表面模建有助于 Hsp70-BMP相互作用的概念性模型的建立。为了证明在体外系统中证实的脂质相互作用的 体内相关性，着眼于关于BMP和Hsp70两个组分的BMP-Hsp70相互作用。为了进一步证明 利用这种机制的可行性，对施用顺钼诱导的细胞死亡模型进行了表征，并在癌细胞系和未 转化细胞系两种细胞系中的所述细胞死亡系统中靶向溶酶体Hsp70。为了解决Hsp70对溶酶体膜稳定性的作用的分子基础，本发明人试图建立可消 除胞质的Hsp70的影响的系统，即需要使Hsp70直接靶向溶酶体。Nylandsted et al.的 电子显微照片显示Hsp70可存在于溶酶体内，因此本发明人决定建立用于产生重组人 Hsp70(rHsp70)的方法，并期望利用细胞内吞机器作为直接向溶酶体递送rHsp70的途径。 本发明人在此绕开了向Hsp70添加可能破坏功能的溶酶体分选信号的需要，并避免了由于 过表达而可能引起的并发症。内吞方法还可以滴定rHsp70的量，并且从更长远的观点出发 开启了研究细胞外Hsp70的摄取机制的可能性。为了验证Hsp70的内吞，在建立Hsp70产生方法后，用荧光团Alexa Fluor 488 对其进行标记(Hsp70-AF488)。共聚焦成像显示，确实可以这种方式使rHsp70靶向至溶 酶体。为了评价对溶酶体膜稳定性的影响，本发明人接着建立了在单个溶酶体的水平上 定量溶酶体膜通透化的方法，并利用该方法评价了细胞内吞的rHsp70的作用。这些方法 形成了实施例1和2的基础，在实施例1和2中，本发明人证明，Hsp70通过与内溶酶体 (endo-lysosomal)阴离子磷脂二(单酰基-甘油)磷酸酯(BMP)的pH依赖性高亲和结合 而对溶酶体进行稳定，从而增强了细胞的存活。Hsp70带正电荷的AIPase结构域负责结合， 但还需要底物结合功能域以有效稳定溶酶体。有趣的是，这种相互作用以及其产生的保护 作用取决于位于AIPase结构域的带正电荷的楔形内的色氨酸90。重要的是，所述细胞保护 作用可以通过rHsp70的细胞内吞递送而获得，并且尤其是通过BMP抗体或Hsp70抑制剂的 细胞外施用而逆转。此外，本发明人还试图将Hsp70的溶酶体膜保护机制与肿瘤产生和程序性细胞 死亡相关联。因此，本发明人表征了通过施用常规化疗剂顺钼启动的细胞死亡程序，并发 现其与caspases无关，但特征在于蛋白酶的溶酶体释放。转基因Hsp70以及细胞内吞的 Hsp70能够通过稳定溶酶体膜而增强细胞在面临顺钼攻击时的存活。有趣的是，本发明人 证明，靶向溶酶体Hsp70本身或者其在溶酶体中的相互作用物二(单酰基-甘油)磷酸酯 (BMP)使转化的前列腺细胞系对顺钼变得敏感(未转化的细胞没有这种变化)，从而为利用 BMP-Hsp70相互作用作为癌症治疗的药理学靶标提供了实验证据。有趣的是，虽然Hsp70_2与Hsp70具有86%的氨基酸同源性，但Hsp70_2不能直接 保护溶酶体膜。然而，缺失Hsp70-2也导致溶酶体膜通透化，并促进细胞的程序性死亡。这 种作用不依赖于Hsp70-2与溶酶体区室之间的直接相互作用，而是通过晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)的下调(响应Hsp70-2的缺失)关联起来。本研究的方法和结果将在实施例部分进行更详细的阐述。在本发明中阐明了 Hsp70通过与溶酶体BMP的相互作用增强溶酶体稳定性的细胞 保护作用的分子基础，这些发现为治疗性靶向溶酶体贮积病提供了基础。本发明现在已经证明，令人惊奇地，向细胞提供重组Hsp70有效逆转溶酶体贮 积病(如本发明证明的尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)和法伯氏病(Farber disease))的病理。此外，向细胞提供Hsp70诱导剂苯甲醇有效逆转溶酶体贮积病(如本发 明证明的尼曼-皮克病)的病理。因此，本发明提供了通过提供Hsp70或其功能片段或变体，或者通过提供Hsp70诱 导物或辅诱导物(co-inducer)而直接或间接提高有此需要的个体中Hsp70的细胞内浓度 和/或活性来治疗溶酶体贮积病的方法。一方面，本发明涉及能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其用 作药物或用于溶酶体贮积症的治疗。在一个实施方式中，所述生物活性剂为Hsp70或其功能片段或变体。在另一个实施方式中，所述生物活性剂为Hsp70诱导物或辅诱导物。另一方面，本发明提供了治疗溶酶体贮积病的方法，其包括向有此需要的个体施 用本发明的生物活性剂。在一个实施方式中，所述治疗为预防、治愈或改善。在一个实施方式中，所述溶酶体贮积病选自尼曼-皮克病、法伯氏病、克拉伯病 (Krabbe disease)、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病(Sialidosis)、异染性脑白质营养不 良和鞘脂激活蛋白(saposin)缺乏病。在另一个实施方式中，所述溶酶体贮积病的特征在于具有所述疾病病理涉及的缺 陷酶的残留酶促活性。本发明还涉及治疗溶酶体贮积病的方法，其包括施用本发明的生物活性剂和至少 一种其它治疗形式(modality)的组合。本发明再一方面提供了调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP(二(单酰 基甘油)磷酸酯)相互作用，所述方法包括以下步骤i)施用本发明的生物活性剂，ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，禾口iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。另一方面，本发明涉及Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。一方面，本发明涉及调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所 述方法包括施用Hsp70或其功能片段或变体并由此调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的 步骤，其中所述Hsp70或其功能片段或变体是适合使BMP和Hsp70或所述功能片段或变体 之间相互作用的形式。优选地，Hsp70或所述其功能片段或变体与BMP形成共价或非共价 复合物。优选地，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。优选地，所述鞘脂激活蛋白(Saposin)选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂 激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
优选地，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶、唾液酸酶、α -半乳糖苷酶、β -半 乳糖苷酶、β -半乳糖苷神经酰胺酶、葡糖神经酰胺酶和酸性神经酰胺酶。优选地，所述酶促活性的调节是上调所述酶的酶促活性。另一方面，本发明涉及Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。优选地，所述 Hsp70或其功能片段或变体可用于治疗、减缓或预防溶酶体贮积症，例如尼曼-皮克病、戈 谢病、法伯氏病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病。另一方面，本发明涉及提高化合物的摄取的方法，所述方法包括施用所述化合物 和Hsp70或其功能片段或变体的步骤。在一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变 体与所述化合物共价结合。在另一个实施方式中，所述Hsp70或其功能片段或变体与所述 化合物非共价结合。本发明的实施方式涉及上调与溶酶体贮积症(例如尼曼-皮克病、戈谢病、法伯氏 病、克拉伯病、法布里病和唾液酸贮积病)相关的酶的酶促活性的方法。优选地，所述溶酶 体贮积症为尼曼-皮克病。由于所述溶酶体贮积症由酶促活性不足引起，因此本发明的目的是提高所述酶促 活性，从而减轻或治愈所述病症。已经证明，Hsp70与BMP相互作用。由于BMP作为其它多种蛋白的辅因子，Hsp70和 BMP之间的相互作用可以调节所述其它多种蛋白的功能。例如，BiflMtSaSMase的辅因子。 因此，Hsp70和BMP之间的相互作用可以提高aSMase的活性。由于尼曼-皮克病与aSMase 活性的降低有关，因此Hsp70可以通过提高aSMase的活性来减轻或治愈尼曼-皮克病。类 似地，BMP作为鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D的辅因 子发挥作用。这些鞘脂激活蛋白在其它溶菌酶贮积症中均有涉及，因此Hsp70可以通过提 高鞘脂激活蛋白或与所述鞘脂激活蛋白相关的酶的活性来减轻或治愈其它溶酶体贮积症。在本发明的一个实施方式中，在溶酶体贮积症的治疗中同时施用Hsp70和酶替代 疗法。在这种方式中，由于Hsp70的酶激活作用，因此可以显著降低所必需的酶量。在另一个实施方式中，使用Hsp70促进酶替代疗法中酶的摄取，由此提高被相关 细胞摄取的酶量。定义和简称aSMase/ASMADD70 AIF AO Apaf-I Bag-I Bcl-2 Bid BMP CARD Caspase CHIP
酸性鞘磷脂酶
用于 Hsp70 的源自 AIF 的诱馆(AIF-derived decoy for Hsp70)
凋亡诱导因子
吖啶橙
凋亡蛋白酶激活因子-1
Bcl-2 ^ijliiIitSi=I (Bcl-2 associated athanogene-1)
B细胞淋巴瘤/白雪病2
BH3相互作用结构域凋亡激动蛋白
二(单酰基甘油)磷脂
Caspase
半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 Hsp70-结合蛋白的羧基末端
CytC 细胞色素C
DD 死亡结构域
DED 死亡效应域
dsRNA 双链RNA
eHsp70 细胞外Hsp70
ER 内质网
ERT酶替代疗法
FADD 包含Fas相关死亡结构域的蛋白
HIP Hsp70相互作用蛋白
HRP 辣根过氧化物酶
HS 热休克/热应激
HSE 热休克元件
HSF 热休克因子
Hsp 热休克蛋白
HspBPl 热休克蛋白结合蛋白1
IAP 凋亡蛋白抑制蛋白
iMEF永生化的鼠胚胎成纤维细胞
JNK c-Jun氨基末端激酶
LAMP-I/-2 溶酶体相关膜蛋白-1/-2
LBPA 溶血二磷脂酸(lysobisphospha1
LEDGF 晶状体上皮源性生长因子
LMP 溶酶体膜通透化
MIC-I 巨噬细胞抑制细胞因子1
MOMP 线粒体外膜通透化
MPR甘露糖6-磷酸受体
MTT 3- (4，5- 二甲基-2-噻唑基)-2，
NPD尼曼-皮克病
NPDAA型尼曼-皮克病
NPDBB型尼曼-皮克病
NPDCC型尼曼-皮克病
NPDDD型尼曼-皮克病
PCD 程序性细胞死亡
PKC 蛋白激酶C
POPC 棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱
POPS 棕榈酰-油酰-磷脂酰丝氨酸
RNAi RNA干扰
ROS 活性氧
SD 标准偏差
siRNA 小干扰RNA
Smac/Diablo 第二个线粒体来源的caspase激活因子tBid 截短 BidTNF 肿瘤坏死因子TNFR TNF-受体TRADD TNFR相关死亡结构域蛋白TRAF TNFR 相关因子溶酶体贮积症(LSD)所使用的术语“溶酶体贮积症”和“溶酶体贮积病”同义。Hsp70的功能片段术语“Hsp70的功能片段”解释为表示Hsp70的具有预期功能 的任何片段。与酶促活性的调节有关时，功能片段是能够调节所述酶促活性的片段。与提 高物质的摄取有关时，Hsp70的功能片段是能够提高所述物质的摄取的片段。应该理解，所 述功能片段的精确量化作用可能与全长分子的作用不同。在一些情况下，所述功能片段可 能确实比全长分子更有效。此外，从片段的较小尺寸考虑，使用片段代替全长分子可能是有 利的。Hsp70的功能变体术语“Hsp70的功能变体”解释为表示Hsp70的具有预期功能 的任何变体。与酶促活性的调节有关时，功能变体是能够调节所述酶促活性的变体。与提 高物质的摄取有关时，Hsp70的功能变体是能够提高所述物质的摄取的片段。应该理解，所 述功能变体的精确量化作用可能与全长分子的作用不同。在一些情况下，所述功能变体可 能确实比全长分子更有效。“生物活性剂”(即在生物学上具有活性的物质/试剂)是提供可以通过体内或体 外证明的某些药理学作用(通常为有益作用)的任何试剂、药物、化合物、物质组分或组合 物。在本文中使用的该术语进一步包括在个体中产生局部或全身作用的任何生理学或药理 学活性物质。生物活性剂的另外实例包括，但不限于包含寡糖或由寡糖组成的试剂，包含 多糖或由多糖组成的试剂，包含任选糖基化的肽或由任选糖基化的肽组成的试剂，包含任 选糖基化的多肽或由任选糖基化的多肽组成的试剂，包含核酸或由核酸组成的试剂，包含 寡核苷酸或由寡核苷酸组成的试剂，包含多核苷酸或由多核苷酸组成的试剂，包含脂质或 由脂质组成的试剂，包含脂肪酸或由脂肪酸组成的试剂，包含脂肪酸酯或由脂肪酸酯组成 的试剂，以及包含次级代谢物或由次级代谢物组成的试剂。在个体(例如人和其它任何动 物)的治疗中，生物活性剂可以用于预防疾病、治疗疾病。本文使用的生物活性剂是能够提 高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的物质。本文使用的术语“药”或“药物”包括作用于人或动物体局部或全身的在生物学上、 生理学上或药学上具有活性的物质。本文使用的术语“治疗”和“疗法”等同地表示治愈性治疗、预防性治疗和改善性 治疗或减轻性治疗。该术语包括用于获得可以在临床上建立的有益的或期望的生理学结果 的方法。出于本发明的目的，有益的或预期的临床效果包括，但不限于缓解症状，减小疾病 的程度，稳定(即不恶化)病况，延迟或减慢病况/症状的发展或恶化，改善或减轻病况或 症状，以及不论可测与否的缓和(部分或完全)。本文使用的术语“减轻”及其变式表示，与 不施用本发明组合物相比，生理病况或症状的程度和/或有害表现减少和/或发展时间减 慢或延长。如果根据构成术语“治疗”和“疗法”的定义的标准测定，所治疗的病况有变化，则“治疗效果”或“疗效”是明显的。如果有至少5%的改善，优选10%的改善，更优选至少 25%，甚至更优选至少50%，如至少75%，最优选至少100%的改善，则所治疗的病况有“变 化”。所述变化可基于所治疗个体病况的严重程度的改善，或者基于利用生物活性剂或生物 活性剂和本发明的药物组合物治疗和不治疗的个体群病况改善频率的差异。“生物活性剂”的“药理学上的有效量”、“药学上的有效量”或“生理学上的有效量” 是在使用本发明所述药物组合物时，为在所治疗的个体血流中或作用部位(即肺、胃系统、 结肠系统、前列腺等)提供预期水平的活性剂以产生预期的生理反应所需要的此组合物中 存在的活性剂的量。准确的量将取决于多种因素，例如活性剂、组合物的活性、所采用的递 送装置、组合物的物理特征、计划的患者用法(即每天施用的剂量数)和患者因素等，并且 可以由本领域技术人员根据本文提供的信息而容易地确定。可以在一次给药中，或者通过 多次施用总和为有效量的量(优选在M小时的时间内)而施用“有效量”的生物活性剂。 可以通过用于测定合适量和给药时间的标准临床方法确定有效量。应该理解，“有效量”可 以是由医疗专家和/或个人确定的经验性和/或个性化(根据个案)结果。本文使用的术语“增强”和“提高”有益效果及其变式是指，与安慰剂相比生物活 性剂的治疗效果，或者本发明的药物治疗的治疗效果高于通常利用不含本发明生物活性剂 的药物组合物所获得的治疗效果的提高。作为施用生物活性剂的结果，当治疗效果的强度 和/或程度得到促进和/或提高时，“治疗效果的提高”是明显的。“治疗效果的提高”还包 括治疗益处的时间得到延长。它还可以表现为，与施用不含生物活性剂的较高量的药物组 合物相比，当共同施用所述药物组合物和本发明提供的生物活性剂时获得相同益处和/或 效果所需要的所述药物组合物的量较低。优选但不必需地，所述效果的增强引起对所述药 物组合物单独不能有效治疗或者治疗效果较小的急性症状的治疗。与单独施用药物组合物 相比，当本发明的生物活性剂与药物组合物共同施用时治疗效果具有至少5%的提高，例如 治疗效果具有至少10%的提高，则实现了增强(提高)。优选地，所述提高为至少25%，更 优选至少50 %，甚至更优选至少75 %，最优选至少100 %。本文使用的“共同施用”、“同时施用”或“一起施用”生物活性剂或者生物活性剂 和现有药物是指，在一定时间内施用本发明的一种或多种生物活性剂，或者施用本发明的 一种或多种生物活性剂和现有药物组合物。所述时间优选小于72小时，例如48小时，例如 小于M小时，例如小于12小时，例如小于6小时，如小于3小时。然而，所述术语还表示可 以同时施用所述生物活性剂和治疗性组合物。术语“个体”指脊椎动物，尤其是哺乳动物中的一种，优选包括人在内的灵长类。在 优选的实施方式中，本文使用的个体为任意年龄的人，男性或女性。“有此需要的个体”是指可以从本发明受益的个体。在一个实施方式中，所述有此 需要的个体为患病个体，其中所述疾病为溶酶体贮积病。术语“天然核苷酸”或“核苷酸”是指在自然界中发现的任意四种脱氧核苷酸dA、 dG、dT和dC(DNA的组分)和四种核苷酸A、G、U和C (RNA的组分)。各种天然的核苷酸包括 糖部分(核糖或脱氧核糖)、磷酸部分和天然/标准的碱基部分或基本由上述部分组成。天 然核苷酸根据熟知的碱基配对原则(Watson和Crick)与互补核苷酸结合，其中腺嘌呤(A) 与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，其中相应的碱基对是互 补且反向平行的核苷酸链的一部分。碱基配对引起预定的互补核苷酸之间的特异杂交。碱基配对是酶能够催化合成与模板寡核苷酸互补的寡核苷酸的基础。在这种合成中，结构单 元(通常为A、T、U、C或G的核糖衍生物或脱氧核糖衍生物的三磷酸酯)在模板寡核苷酸的 指导下形成具有正确的互补序列的互补寡核苷酸。互补序列对其寡核苷酸序列的识别由形 成碱基对的相应相互作用碱基介导。实质上，导致碱基配对的具体相互作用由碱基的大小 以及碱基的氢键供体和受体的模式控制。大的嘌呤碱基(A或G)与小的嘧啶碱基(T、U或C) 配对。此外，碱基之间的碱基配对识别还受碱基之间形成的氢键的影响。在Watson-Crick 碱基配对几何中，利用连接两个环原子的中间氢键和在任意一侧结合附加于各所述环的官 能基团的氢键，利用与受体基团配对的供体基团，使六元环(天然寡核苷酸中的嘧啶)与由 稠合六元环和五元环(天然寡核苷酸中的嘌呤)构成的环系统并列。本文使用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或 核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段和通过连接、剪切、 核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中任何一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在 的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的 α-对映体形式)或二者的组合的单体构成。修饰核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌 呤碱基部分具有变化。糖修饰包括，例如利用卤素、烷基基团、胺和叠氮基团取代一个或 多个羟基基团，或者可以使糖官能化作醚或酯。此外，还可以用空间上和电子上相似的 结构，例如氮杂-糖和碳环糖类似物取代完整的糖部分。碱基部分的修饰的实例包括烷 基化嘌呤和嘧啶，酰化嘌呤或嘧啶或者其它熟知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸 二酯键或这些连接的类似物进行连接。磷酸二酯键连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫 代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、 phosphoroanilothioate,phosphorani 1 idate和氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”也包括， 例如包含连接至聚酰胺骨架上的天然存在的或修饰的核酸碱基的所谓的“肽核酸”。核酸可 以为单链或双链。术语“核酸分子的互补物”是指与参考核苷酸序列相比具有互补核苷酸序列并且 为反方向的核酸分子。例如，序列5' ATGCACGGG 3'与5' CCCGTGCAT 3'互补。“分离的核酸分子”是指没有整合在生物体的基因组DNA中的核酸分子。例如，已 经从细胞的基因组DNA分离的编码生长因子的DNA分子即为分离的DNA分子。分离的核酸 分子的另一个实例是没有整合在生物体的基因组中的化学合成的核酸分子。已经从特定物 种分离的核酸分子小于该物种的染色体的完整DNA分子。“核酸分子构建体”是已经通过人为介入进行修饰从而包含以天然不存在的排列 结合或并列的核酸片段的单链或双链核酸分子。“线性DNA”是指具有游离5’和3’末端的非环状DNA分子。可以通过酶促降解或 物理断裂由闭合的环状DNA分子(例如质粒)制备线性DNA。“互补DNA(cDNA) ”是反转录酶由mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，采用与部 分mRNA互补的引物起始反转录。本领域技术人员还使用术语“cDNA”表示由此类单链DNA 分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还表示由RNA模板合成的cDNA分 子的克隆。“异源DNA”是指在给定宿主细胞中天然不存在的DNA分子或DNA分子群。异源于 具体宿主细胞的DNA分子可以包含源自所述宿主细胞的物种的DNA(内源DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即异源DNA)结合。例如，可以将包含非宿主DNA片段的DNA分子认为是 异源DNA分子，其中所述非宿主DNA片段编码可操作地与包含转录启动子的宿主DNA片段 连接的多肽。相反，异源DNA分子可以包含可操作地与外源启动子相连的内源基因。作为 另一个示例，如果DNA分子被引入到缺乏野生型基因的突变细胞内，则也可以将包含源自 野生型细胞的所述基因的该DNA分子认为是异源DNA。“多肽”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，优选其仅通过肽键相连。通过 非宿主DNA分子表达产生的多肽为“异源”肽或多肽。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、 肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已经经过翻译后修饰或可以不经过翻译后修饰。翻 译后修饰可以为，例如磷酸化、甲基化和糖基化。术语“表达”是指基因或基因产物的生物合成。“杂交”表示不同来源的核酸链的退火；S卩，在初始时没有配对的两条DNA链的互 补区之间形成碱基对。根据 Sambrook et al. ,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989)，1. 101-1. 104，对术语“在严格条件下的杂 交”进行定义。优选地，在严格条件下的杂交表示，利用IX SSC和0. 1% SDS在50°C、优选 在55 °C、更优选在62 °C且最优选在68°C洗涤1小时后，尤其是在0. 2 X SSC^PO. SDS中 在50°C、优选在55°C、更优选在62°C且最优选在68°C洗涤1小时后，观察到阳性杂交信号。“完全同源”的延长(stretch)定义为配对核苷酸沿着相互作用的核苷酸的序列的 匹配；在天然存在的RNA中，A与U配对，G与C配对。“启动子”为指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码 区，与结构基因的转录起始位点相邻近。在转录起始中发挥作用的启动子内的序列元件通 常以共有核苷酸序列为特征。如果启动子为诱导型启动子，则在对诱导剂的应答中提高转 录速率。相反，如果启动子为组成型启动子，则诱导剂不能调节转录速率。还已知有阻遏型 启动子。“调控元件”是调节启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可以包含与能够排 他地或优先地在特定细胞、组织或器官中进行转录的细胞因子结合的核苷酸序列。这些类 型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“器官特异性”的方式表达的基因
纟口口。“增强子”是一种类型的调控元件，其能够提高转录效率，而不论增强子相对于转 录起始位点的距离或方向。“克隆载体”为具有能够在宿主细胞中自主复制的能力的核酸分子，例如质粒、粘 粒或细菌噬菌体。克隆载体通常包含一个或少数几个限制性内切酶识别位点，该位点允许 以可确定的方式插入核酸分子，而不使载体丧失主要的生物功能；和编码标记基因的核苷 酸序列，该序列适合用于转化有所述克隆载体的细胞的鉴别和筛选。标记基因通常包括提 供四环素或氨苄青霉素抗性的基因。“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包含转 录启动子、基因和转录终止子。基因表达常常处于启动子的控制之下，将此类基因称为“可 操作地连接至”所述启动子上。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则调控元件 和核心启动子被可操作地连接。被称作“转录载体”的较简单载体仅能够转录但不能翻译 它们能够在靶细胞中复制但不能表达，其与表达载体不同。转录载体用于扩增其插入物。
“重组宿主”是包含异源核酸分子，例如克隆载体或表达载体的细胞。转染描述的是将外来物质引入真核细胞中。用于非病毒方法的术语“转染”最常 用于指哺乳动物细胞，而术语“转化”优选用于描述非病毒DNA转移至细菌和非动物真核细 胞，例如真菌、藻类和植物。化学方法和物理方法均可以用于转染细胞。“多肽”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，其优选仅通过肽键连接。通过 非宿主DNA分子表达产生的多肽为“异源”肽或多肽。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、 肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以已经经过翻译后修饰或可以不经过翻译后修饰。翻 译后修饰可以为，例如磷酸化、甲基化和糖基化。“氨基酸残基”可以为肽键或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨 基酸残基可以为D-构型或L-构型。氨基酸残基包括被包含碳原子或碳原子链的中心部分 分开的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(COOH)，它们的至少之一包括至少一个侧链或 官能团。NH2是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基基团，COOH是指存在于氨基酸或肽 的羧基末端的羧基基团。常用术语氨基酸包括天然的或非天然的氨基酸。J. Biol. Chem.， 243 :3552-59 (1969) and adopted in 37 C. F. R. ,section 1.822(b) (2)中列出的标准命名 法的天然氨基酸属于下表1中列出的氨基酸组。非天然氨基酸是未列在表1中的氨基酸。 非天然氨基酸的实例是，例如37 C. F. R. section 1.822(b) (4)中列出的氨基酸，其均通过 引用并入本文。此外，非天然氨基酸残基包括，但不限于经修饰的氨基酸残基、L-氨基酸残 基和D-氨基酸残基的立体异构体。
权利要求
1.能够提高Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，其作为药物或用于溶酶体 贮积症的治疗。
2.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂为Hsp70或其功能片段或变体。
3.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体与野生型 Hsp70蛋白具有100%的同源性。
4.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体与野生型 Hsp70蛋白具有99. 9-95 %的同源性，例如95-90 %的同源性，如90-85 %的同源性，例如 85-80 %的同源性，如80-75 %的同源性，例如75-60 %的同源性。
5.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70。
6.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70是全长Hsp70。
7.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂为Hsp70的功能片段或变体。
8.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长小于 641个氨基酸，如小于625个氨基酸，例如小于600个氨基酸，如小于575个氨基酸，例如小 于550个氨基酸，如小于525个氨基酸，例如小于500个氨基酸，如小于475个氨基酸，例如 小于450个氨基酸，如小于425个氨基酸，例如小于400个氨基酸，如小于375个氨基酸，例 如小于350个氨基酸，如小于325个氨基酸，例如小于300个氨基酸，如小于275个氨基酸， 例如小于250个氨基酸，如小于225个氨基酸，例如小于200个氨基酸，如小于175个氨基 酸，例如小于150个氨基酸，如小于125个氨基酸，例如小于100个氨基酸，如小于75个氨 基酸，例如小于50个氨基酸，如小于25个氨基酸。
9.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长大于 10个氨基酸，如大于25个氨基酸，例如大于50个氨基酸，如大于75个氨基酸，例如大于100 个氨基酸，如大于125个氨基酸，例如大于150个氨基酸，如大于175个氨基酸，例如大于 200个氨基酸，如大于225个氨基酸，例如大于250个氨基酸，如大于275个氨基酸，例如大 于300个氨基酸，如大于325个氨基酸，例如大于350个氨基酸，如大于375个氨基酸，例如 大于400个氨基酸，如大于425个氨基酸，例如大于450个氨基酸，如大于475个氨基酸，例 如大于500个氨基酸，如大于525个氨基酸，例如大于550个氨基酸，如大于575个氨基酸， 例如大于600个氨基酸，如大于625个氨基酸。
10.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体具有的氨 基酸取代为Hsp70的0. 1-1 %的氨基酸残基，如1-2 %的氨基酸残基，例如2-3 %的氨基 酸残基，如3-4%的氨基酸残基，例如4-5 %的氨基酸残基，如5-10 %的氨基酸残基，例如 10-15%的氨基酸残基，如15-20%的氨基酸残基，例如20-30%的氨基酸残基，如30-40% 的氨基酸残基，例如40-50%的氨基酸残基，如50-60%的氨基酸残基，例如60-70%的氨基 酸残基，如70-80 %的氨基酸残基，例如80-90 %的氨基酸残基，如90-100 %的氨基酸残基。
11.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体的全长 为5-25个氨基酸，如25-50个氨基酸，例如50-75个氨基酸，如75-100个氨基酸，例如 100-125个氨基酸，如125-150个氨基酸，例如150-175个氨基酸，如175-200个氨基酸，例 如200-225个氨基酸，如225-250个氨基酸，例如250-275个氨基酸，如275-300个氨基酸，例如300-325个氨基酸，如325-350个氨基酸，例如350-375个氨基酸，如375-400个氨基 酸，例如400-425个氨基酸，如425-450个氨基酸，例如450-475个氨基酸，如475-500个氨 基酸，例如500-525个氨基酸，如525-550个氨基酸，例如550-575个氨基酸，如575-600个 氨基酸，例如600-625个氨基酸，如625-640个氨基酸。
12.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体包含Hsp70 的AIPase结构域的全部或部分。
13.如权利要求7所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70的功能片段或变体在 Hsp70ATPase结构域的第90位氨基酸位置包含色氨酸。
14.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70或其功能片段或变体为重组 Hsp70 (rHsp70)。
15.如权利要求2所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70源自选自人(homosapiens), 小鼠(mus musculus)、牛、狗、大鼠、鼬、猪、绵羊和猴的哺乳动物。
16.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70诱导物或辅诱导物。
17.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70诱导物。
18.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是Hsp70辅诱导物。
19.如权利要求18所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70辅诱导物是羟胺衍生物。
20.如权利要求19所述的生物活性剂，其中，所述羟胺衍生物选自氯吡哌醇 (BRLP-42)、Arimoclomol(BRX-220)、BRX-345 和 BGP-15。
21.如权利要求19所述的生物活性剂，其中，所述羟胺衍生物是 Arimoclomol(BRX-220)。
22.如权利要求17所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70诱导物是膜流化剂。
23.如权利要求22所述的生物活性剂，其中，所述膜流化剂选自苯甲醇、庚醇、AL721、 二十二碳六烯酸、脂肪醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇、利多卡因、罗哌卡因、布比卡 因和马比佛卡因。
24.如权利要求16所述的生物活性剂，其中，所述Hsp70诱导物或辅诱导物选自依地福 新(ET-18-0CH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱)、塞来昔布、罗非昔布、 乙酰水杨酸、水杨酸钠、吲哚美辛、PGAU PGj2、2-环戊烯-1-酮、过氧化物酶增殖物激活型 受体Y-激动剂、长春新碱、紫杉醇、吡格列酮、卡钼、多柔比星、氟达拉滨、异环磷酰胺、阿 糖胞苷、格尔德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤壳菌素、除莠霉素_A、花生四烯酸、MG132、乳胞 素、DCIC、TLCK和TPCK、替普瑞酮(GGA)、瑞巴匹特、甘珀酸、聚普瑞锌(L-肌肽锌)、地塞米 松、可卡因、烟碱、醇、α -肾上腺素激动剂、环戊烯酮前列腺素、芍药苷、甘草甜素、雷公藤红 素、二氢雷公藤红素、二氢雷公藤红素二乙酸酯和姜黄素。
25.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂是亚致死热疗。
26.如权利要求25所述的生物活性剂，其中，所述亚致死热疗包括提高个体的温度至 约38°C的核心温度，如约39°C，例如约40°C，如约41V，例如约42°C，如约43°C的核心温 度。
27.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂包括Hsp70或其功能片段 或变体和Hsp70诱导物或辅诱导物的组合。
28.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂包括Hsp70或其功能片段 或变体和提高Hsp70和BMP之间的相互作用的物质的组合。
29.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述治疗为预防、治愈或改善。
30.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述溶酶体贮积症选自尼曼-皮克病、法伯 氏病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白 缺乏病。
31.如权利要求1所述的生物活性剂，其中，所述生物活性剂经肠胃外施用于有此需要 的个体。
32.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是静脉内、皮下、肌内、动 脉内、皮下或腹膜内注射。
33.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是静脉内输注。
34.如权利要求33所述的生物活性剂，其中，所述静脉内输注进行的时间为10分 钟-20分钟，如20-30分钟，例如30-40分钟，如40-50分钟，例如50-60分钟，如60-90分 钟，例如90-120分钟，如2小时-3小时，例如3-4小时，如4_5小时，例如5_6小时，如6_7 小时，例如7-8小时。
35.如权利要求31所述的生物活性剂，其中，所述肠胃外施用是经粘膜递送。
36.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是舌下递送。
37.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是口含递送。
38.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是吹入递送。
39.如权利要求35所述的生物活性剂，其中，所述经粘膜递送是鼻内递送。
40.Hsp70或其功能片段或变体，其用作药物。
41.调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP(二(单酰基甘油)磷酸酯)相互作 用，所述方法包括以下步骤i)施用权利要求1-39中任一项所述的生物活性剂，ii)使BMP和Hsp70之间相互作用，和iii)调节与BMP相互作用的酶的酶促活性。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述Hsp70与BMP形成共价或非共价复合物。
43.如权利要求41所述的方法，其中，BMP与鞘脂激活蛋白相互作用。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述鞘脂激活蛋白选自鞘脂激活蛋白A、鞘脂激 活蛋白B、鞘脂激活蛋白C和鞘脂激活蛋白D。
45.如权利要求41所述的方法，其中，所述酶选自鞘磷脂酶、酸性鞘磷脂酶(aSMase)、 酸性神经酰胺酶、β-半乳糖苷神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖神经酰 胺酶、唾液酸酶和芳基硫酸酯酶。
46.如权利要求41所述的方法，其中，所述酶促活性的调节是所述酶促活性的提高。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述酶促活性的提高是提高1-5%，如5-10 %， 例如 10-15 %，如 15-20 %，例如 20-25 %，如 25-30 %，例如 30-35 %，如 35-40 %，例如 40-45 %，如 45-50 %，例如 50-60 %，如 60-70 %，例如 70-80 %，如 80-90 %，例如 90-100 %， 如 100-120 %,例如 120-140 %,如 140-160 %,例如 160-180 %,如 180-200 %,例如 200-250 %，如 250-300 %，例如 300—400 %，如 400—500 %，例如 500—750 %，如 750—1000 %，例如 1000-1500%，如 1500-2000%，例如 2000-5000%
48.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用权利要求1-39中 任一项所述的生物活性剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述治疗为预防、治愈或改善。
50.如权利要求48所述的方法，其中，所述治疗延长了有此需要的所述个体的预期寿命。
51.如权利要求48所述的方法，其中，所述预期寿命提高了6个月-1年，如1年-2年， 例如2-3年，如3-4年，例如4-5年，如5-6年，例如6_7年，如7-8年，例如8_9年，如9_10 年，例如10-12年，如12-14年，例如14-16年，如16-18年，例如18-20年，如20-25年，例如 25-30年，如30-40年，例如40-50年，如50-60年，例如60-70年，如70-80年，例如80-90 年，如90-100年。
52.如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病选自尼曼-皮克病、法伯氏病、 克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病、异染性脑白质营养不良和鞘脂激活蛋白缺乏 病。
53.如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病的特征是在细胞内积聚的鞘 脂增加。
54.如权利要求53所述的方法，其中，所述治疗将细胞内积聚的鞘脂降低了至少5%， 如至少10%，例如至少15%，如至少20%，例如至少25%，如至少30%，例如至少35%，如 至少40%，例如至少45%，如至少50%，例如至少55%，如至少60%，例如至少65%，如至 少70%，例如至少75%，如至少80%，例如至少85%，如至少90%，例如至少95%，如至少 100%。
55.如权利要求M所述的方法，其中，所述鞘脂选自鞘磷脂、神经酰胺、半乳糖苷神经 酰胺、球形三酰神经酰胺、糖基神经酰胺、GM3和硫脑苷脂。
56.如权利要求48所述的方法，其中，所述生物活性剂被配制为药物组合物。
57.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为A型尼曼-皮克病或B型尼曼-皮克病。
58.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为法伯氏病。
59.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为克拉伯病。
60.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为唾液酸贮积病。
61.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为异染性脑白质营养不良。
62.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为戈谢病。
63.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积症为法布里病。
64.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮积症为鞘脂激活蛋白缺乏病。
65.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述溶酶体贮 积病的特征是具有与所述疾病病理相关的缺陷酶的残余酶促活性。
66.如权利要求1所述的生物活性剂或如权利要求48所述的方法，其中，所述残余酶促 活性为 0. -50%，如 0. 1-1%，例如 1-2%，如 2-3%，例如 3-4%，如 4_5%，例如 5-6%， 如 6-7%，例如 7-8%，如 8-9%，例如 9-10%，如 10-11%，例如 11-12%，如 12-13%，例如 13-14%，如 14-15%，例如 15-20%，如 20-25%，例如 25-30%，如 30-35%，例如 35-40%, 如40-45%，例如45-50%的残余酶促活性。
67.治疗溶酶体贮积病的方法，所述方法包括施用权利要求1-39中任一项所述的生物 活性剂和至少一种其它治疗形式的组合。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是用于溶酶体贮积 病的常规或已知治疗形式。
69.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式同时或序贯施用。
70.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是酶替代疗法 (ERT)。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述ERT选自Cerezyme (注射用伊米苷酶)、 美格鲁特、Fabrazyme (β半乳糖苷酶)和利甫盖素(α半乳糖苷酶)。
72.如权利要求67所述的方法，其中，向患有戈谢病的个体施用所述生物活性剂和 Cerezyme (注射用伊米苷酶)或美格鲁特的组合。
73.如权利要求67所述的方法，其中，向患有法布里病的个体施用所述生物活性剂和 Fabrazyme (^半乳糖苷酶)或利甫盖素(α乳糖苷酶)的组合。
74.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是止痛物品。
75.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是皮质类固醇。
76.如权利要求56所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是移植。
77.权利要求76所述的方法，其中，所述移植选自骨髓移植、脐带血移植和干细胞移植。
78.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是底物减少疗法。
79.如权利要求67所述的方法，其中，所述至少一种其它治疗形式是对症和支持疗法， 如物理疗法。
全文摘要
本发明涉及用于调节酶的酶促活性的方法，其中，所述酶与BMP相互作用，所述方法包括施用或诱导Hsp70或其功能片段或变体并从而调节与BMP相互作用的酶的酶促活性的步骤，其中所述Hsp70或其功能片段或变体是适合使BMP和Hsp70或所述功能片段或变体之间相互作用的形式。
文档编号A61P3/00GK102123729SQ200980131985
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者托马斯·基尔克高·延森, 玛丽亚·海伦娜·耶泰莱 申请人:奥菲泽米有限公司
最新回复(0)