胰高血糖素/glp-1受体共激动剂的制作方法
专利名称：胰高血糖素/glp-1受体共激动剂的制作方法
胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂相关申请的交叉引用本申请要求享有以下专利申请的优先权2008年6月17日提交的美国临时专利 申请号61/073，沈9、2008年7月3日提交的美国临时专利申请号61/078，168、2008年8月 20日提交的美国临时专利申请号61/090，412和2009年5月12日提交的美国临时专利申 请号61/177，476。每一申请的公开内容以其整体在此明确引作参考。背景前高血糖素原是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中加工形成多种不同 的高血糖素原衍生肽，所述肽包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)、胰高血糖素样 肽-2(GLP1)和泌酸调节肽(OXM)，它们涉及多种多样的生理功能，包括葡萄糖动态平衡、 胰岛素分泌、胃排空和肠道生长以及摄食调节。胰高血糖素是四个氨基酸的肽，其对应于 前高血糖素原的33到61位氨基酸，而产生的GLP-I为对应于前高血糖素原的72到108位 氨基酸的37个氨基酸的肽。GLP-I (7-36)酰胺或GLP-I (7_37)酸是GLP-I的生物学有效形 式，它们显示出针对GLP-I受体的活性基本上相等。当血糖水平降低到不足以提供身体活动的能量时，出现低血糖症。在成年人或10 岁以上的儿童中，除了作为糖尿病治疗的副作用外，低血糖症并不常见，但其可因其它药物 或疾病、缺乏激素或酶或者肿瘤而产生。当血糖开始下降时，由胰腺产生的激素胰高血糖素 给肝脏发出信号以分解肝糖并释放葡萄糖，导致血糖水平上升到正常水平。因此，胰高血糖 素在葡萄糖调节中最公认的作用是抵消胰岛素的作用并维持血糖水平。然而，对于糖尿病 患者，胰高血糖素对低血糖症的这种响应可受到削弱，这使得葡萄糖水平更难回到正常范 围。低血糖症是危及生命的事件，需要立即就医。给予胰高血糖素是已确定的用于治 疗急性低血糖症的施药，其可在给药几分钟内恢复葡萄糖的正常水平。当将胰高血糖素用 于急性医学治疗低血糖症时，用稀酸缓冲液溶解胰高血糖素的结晶形式，并肌肉内注射该 溶液。尽管该治疗有效，但该方法麻烦，并且对于处于半昏迷的人很危险。因此，需要在相 关生理条件下保留或超过母体分子的生物学效能但充分可溶并稳定的胰高血糖素类似物， 可将其预先调配为供注射用的溶液。另外，促使糖尿病患者保持接近正常的血糖水平以延迟或预防微血管并发症。实 现该目的通常需要加强的胰岛素治疗。在努力实现该目标过程中，医生们遭遇到其糖尿病 患者的低血糖症的频率和严重程度大大提高的问题。因此，需要改进的比目前的胰岛素疗 法更不可能诱导低血糖症的用于治疗糖尿病的药物和方法。GLP-I具有与胰高血糖素相比不同的生物活性。其作用包括刺激胰岛素合成和分 泌、抑制胰高血糖素分泌和抑制摄食。业已显示GLP-I在糖尿病患者中减轻高血糖症(高 葡萄糖水平)。与GLP-I享有约50%氨基酸同一性的来自蜥蜴毒液的肽毒蜥外泌肽-4，激 活GLP-I受体并同样显示减轻糖尿病患者的高血糖症。亦有证据表明GLP-I和毒蜥外泌肽-4可降低摄食并促进减重，这种作用不仅仅对 糖尿病患者有益，而且对罹患肥胖症的患者亦有益。肥胖症患者具有更高的糖尿病、高血压、血脂过多症、心血管病和肌骨病的风险。因此，仍需要备选及优选的用于治疗糖尿病和肥胖症的改进的方法。概述如本文所述，提供高效价胰高血糖素激动剂类似物，所述胰高血糖素激动剂类似 物亦表现出提高的针对胰高血糖素肽受体的活性，并在另外的实施方案中，表现出增加的 生物物理学稳定性和/或水溶性。另外，根据本发明的另一方面，提供失去天然胰高血糖素 的针对胰高血糖素受体相对于针对GLP-I受体的选择性的胰高血糖素激动剂类似物，所述 类似物因此表现为这两种受体的共激动剂。在胰高血糖素类似物内所选择的氨基酸修饰可 控制类似物针对GLP-I受体相对于针对胰高血糖素受体的相对活性。因此，本发明又一方 面提供具有以下性质的胰高血糖素共激动剂类似物具有针对胰高血糖素受体比GLP-I受 体更高的活性；对这两种受体具有大约相等的活性；和具有针对GLP-I受体比胰高血糖素 受体更高的活性。可对后一类型的共激动剂进行工程改造以使其对胰高血糖素受体表现出 很小或没有活性，但保留与天然GLP-I相同的或比其更高效价的激活GLP-I受体的能力。任 何这些类似物亦可包括赋予增加生物物理稳定性和/或水溶性的修饰。对胰高血糖素受体和GLP-I受体显示共激动作用的胰高血糖素类似物在若干应 用中有利。首先，利用胰高血糖素治疗低血糖症可过度补偿(overcompensate)低血糖水平 并产生过量的血糖水平。若给予胰高血糖素/GLP-I受体共激动剂，则另外的GLP-I刺激可 缓冲胰高血糖素激动剂的作用以防止因治疗低血糖症而产生的过量的血糖水平。另外如本文所述，当单独给予或与其它抗糖尿病或抗肥胖症治疗联合给予时，本 发明胰高血糖素共激动剂类似物可用于控制高血糖症，或用于诱导减重或防止增重。诱 导减重的另一化合物为泌酸调节肽，这是在小肠中发现的天然存在的消化激素(参见 Diabetes 2005 ;54 :2390-23卯)。泌酸调节肽为37个氨基酸的肽，其含有胰高血糖素 的四个氨基酸序列(即SEQ ID NO :1)，接着是8个氨基酸的羧基末端延伸SEQ ID NO 27 (KRNRNNIA)。尽管本发明涵盖本文所述胰高血糖素类似物可任选与这8个氨基酸的羧基 末端延伸(SEQ ID NO 27)连接，但在本发明某些实施方案中，亦明确涵盖缺乏8个邻接羧 基氨基酸SEQ ID NO :27的类似物及类似物的用途。可通过氨基酸修饰来改造(customize)化合物以便调节所述肽的GLP-1活性，因 此，可裁制(tailor)本发明胰高血糖素类似物以治疗特定病症或疾病。更具体地，本文 提供这样的胰高血糖素类似物，其中每一个类似物表现出分别对胰高血糖素受体和GLP-I 受体特有的相对活性水平。例如，可对各肽进行修饰以产生以下胰高血糖素肽相对于 天然GLP-I针对GLP-I受体具有从至少约(包括至少约1. 5%、2%、5%、7%、10%、 20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,75 % UOO % ,125 % ,150 % ,175 % )到约 200% 或更高活性 的任何活性；和相对于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体具有从至少约(包括约 1. 5%,2%,5%,7%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,75%,100%,125%,150%,175%, 200 %,250 %,300 % ,350 %,400 %,450 % )到约500 %或更高活性的任何活性。在某些实 施方案中，本文所述胰高血糖素肽表现出不大于约100 %、1000 %、10，000 %、100, 000 %或 1，000, 000%的天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，本文所述 胰高血糖素肽表现出不大于约100 %、1000 %、10，000 %、100，000 %或1，000，000 %的天然 GLP-I针对GLP-I受体的活性。天然胰高血糖素的氨基酸序列为SEQ ID NO :1,GLP-1 (7-36)
10酰胺的氨基酸序列为SEQ ID NO 52，GLP-I (7-37)酸的氨基酸序列为SEQ ID NO :50。在例 示性实施方案中，胰高血糖素肽可表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少 10%和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少50%，或天然胰高血糖素针对胰高血糖素受 体活性的至少40%和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少40%，或天然胰高血糖素针对 胰高血糖素受体活性的至少60%和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少60%。可将胰高血糖素肽针对胰高血糖素受体相对于针对GLP-I受体的选择性阐述为 胰高血糖素/GLP-I活性的相对比率(所述肽相对于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体 的活性除以所述肽相对于天然GLP-I针对GLP-I受体的活性)。例如，表现出60%的天然 胰高血糖素针对胰高血糖素受体的活性和60 %的天然GLP-I针对GLP-I受体的活性的胰高 血糖素肽具有1 1的胰高血糖素/GLP-I活性比率。胰高血糖素/GLP-I活性的例示性比 率包括约 1 1、1.5 1、2 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、9 1 或 10 1 或约 1 10、1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、1 4、1 3、1 2 或 1 1.5。举例而 言，10 1的胰高血糖素/GLP-I活性比率表示针对胰高血糖素受体相对于针对GLP-I受体 有10倍的选择性。类似地，10 1的GLP-I/胰高血糖素活性比率表示针对GLP-I受体相 对于针对胰高血糖素受体有10倍的选择性。根据一个实施方案，提供增加效价和任选改进溶解性和稳定性的胰高血糖类似物 素。在一个实施方案中，通过天然胰高血糖素(SEQ ID NO 1)的16位氨基酸修饰来提供提 高的胰高血糖素效价。作为非限制性实例，所述提高效价可通过用以下氨基酸取代天然存 在的16位的丝氨酸来提供谷氨酸；或另一具有长4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸； 或作为备选以下氨基酸中的任何一种谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸或具有含至少一 个杂原子(例如N、0、S、P)的侧链并具有长约4(或3-5)个原子的侧链的带电荷的氨基酸。 在一个实施方案中，提高效价的胰高血糖素激动剂包含肽SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO 5 的胰高血糖素激动剂 类似物。根据一个实施方案，提供相对于野生型胰高血糖素具有提高的针对胰高血糖素受 体的效价的胰高血糖素类似物蛋白质，其中所述肽包含序列SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10，其中所述胰高血糖素肽保留其相对于GLP-I受体对胰高血 糖素受体的选择性。可通过3位氨基酸修饰来降低、保持或提高胰高血糖素受体活性，例如取代3位天 然存在的谷氨酰胺。在一个实施方案中，用酸性、碱性或疏水氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮 氨酸)取代3位氨基酸显示大大降低或破坏胰高血糖素受体活性。用例如谷氨酸、鸟氨酸 或正亮氨酸取代的类似物具有天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的约10 %或更小， 例如约1-10%或约0. 1-10%或大于约0. 但小于约10%，同时表现出GLP-I针对GLP-I 受体活性的至少20%。例如，本文所述例示性类似物具有约0. 5%、约或约7%的天然 胰高血糖素活性，同时表现出GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。在另一实施方案中，胰高血糖素肽3位天然存在的谷氨酰胺可被谷氨酰胺类似物 取代而基本上不损失针对胰高血糖素受体的活性，在某些情况下还提高胰高血糖素受体活 性。例如，在3位包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可表现出约5%、约10%、约20%、约 50%或约85%或更大的天然胰高血糖素(例如SEQ ID NO 1)针对胰高血糖素受体的活性。 在某些实施方案中，在3位包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽，相比于具有与包含谷氨酰胺类似物的肽相同的氨基酸序列但有3位修饰的氨基酸的对应胰高血糖素肽(例如SEQ ID NO :601 或 SEQ ID NO :602)，可表现出约 20%、约 50%、约 75%、约 100%、约 200%或约 500%或更大的针对胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，在3位包含谷氨酰胺类似 物的胰高血糖素肽表现出提高的针对胰高血糖素受体的活性，但该提高的活性不大于天然 胰高血糖素活性的或不大于具有与包含谷氨酰胺类似物的肽相同的氨基酸序列但有3位 修饰的氨基酸的对应胰高血糖素肽活性的1000%、10，000%,100, 000%或1，000, 000%。在某些实施方案中，谷氨酰胺类似物为天然存在的或非天然存在的氨基酸，所述 氨基酸包含结构I、II或III侧链
权利要求
1.包含氨基酸序列SEQID NO :1的胰高血糖素肽，所述胰高血糖素肽具有至多10个 氨基酸修饰并包含用C4-C30脂肪酸酰化或烷化的10位氨基酸。
2.权利要求1的胰高血糖素肽，其中(i)所述胰高血糖素肽包含i位氨基酸和i+4位 氨基酸侧链之间的分子内桥，其中i为12、16、20或所述胰高血糖素肽的16、20、 21或M位中的一个、二个、三个或更多个位置被α，α-二取代氨基酸取代；或(iii)(i) 和(ii)两者。
3.权利要求1或2的胰高血糖素肽，其包含16位Glu和20位Lys，其中任选内酰胺桥 连接所述Glu和Lys。
4.权利要求3的胰高血糖素肽，其进一步包含选自以下的一个或多个修饰17位Glru 18 位 Ala,21 位 Glu,23 位 Ile 和 24 位 Ala。
5.权利要求1-4中任一项的胰高血糖素肽，其包含C-末端酰胺。
6.权利要求1-5中任一项的胰高血糖素肽，其包含在1位、2位或1和2位的氨基酸取 代，其中所述氨基酸取代实现DPP-IV蛋白酶抗性。
7.权利要求6的胰高血糖素肽，其中1位His被选自以下的氨基酸取代D-组氨酸、 α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、Ν_甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、去氨基组氨酸、 羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。
8.权利要求6或7的胰高血糖素肽，其中2位Ser被选自以下的氨基酸取代D_丝氨 酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝取代氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸。
9.被修饰以包含与胰高血糖素肽10位氨基酸共价连接的酰基或烷基的非天然胰高血 糖素肽。
10.权利要求9的胰高血糖素肽，其中所述在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQ ID N0:55或SEQ ID NO :55的类似物，其中所述类似物不是天然存在的肽，所述类似物以选 自以下 1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28 和 29 位的 1-3 处位置的氨基酸修 饰不同于SEQ ID NO :55，并且其中所述胰高血糖素肽表现出天然GLP-I针对GLP-I受体活 性的至少20%.
11.权利要求10的胰高血糖素肽，其中所述被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO55。
12.权利要求10的胰高血糖素肽，其中所述被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO56。
13.权利要求10-12中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽进一步包含选 自以下的与所述胰高血糖素肽羧基末端连接的肽SEQ ID NO :26,SEQ ID NO : 和SEQ ID NO :65ο
14.权利要求11或12的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽进一步包含与所述胰高 血糖素肽羧基末端连接的SEQ ID NO :26。
15.权利要求11-14中任一项的胰高血糖素肽，其包含选自以下的两个氨基酸之间的 内酰胺桥16和20位氨基酸、12和16位氨基酸、20和M位氨基酸及M和28位氨基酸。
16.权利要求15的胰高血糖素肽，其中所述内酰胺桥在16和20位氨基酸之间。
17.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO33。
18.权利要求10的胰高血糖素肽，其中所述观位氨基酸为Asp、Asn或Lys，所述四位 氨基酸为Gly或Thr。
19.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含以1-2个氨 基酸不同于SEQ ID NO 55的SEQ ID NO 55类似物。
20.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含以1个氨基 酸不同于SEQ ID NO 55的SEQ ID NO 55类似物。
21.权利要求20的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :53ο
22.权利要求21的胰高血糖素肽，其中3位氨基酸为谷氨酰胺。
23.权利要求10的胰高血糖素肽，其中3位氨基酸为谷氨酸。
24.权利要求10-11中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰高血 糖素受体活性的至少10%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少50%。
25.权利要求10-11中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰高血 糖素受体活性的至少40%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少40%。
26.权利要求10-11中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰高血 糖素受体活性的至少60%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少60%。
27.权利要求10-21和23中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰 高血糖素受体活性的0. 1-10%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
28.权利要求10-21和23中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰 高血糖素受体活性的1_10%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
29.权利要求10-28中任一项的胰高血糖素肽，其中16位氨基酸为谷氨酸，20位氨基 酸为赖氨酸，C-末端羧酸基团被酰胺取代，任选在所述16位谷氨酸和20位赖氨酸之间具 有内酰胺桥。
30.权利要求四的胰高血糖素肽，其中聚乙二醇链与17、21或对位氨基酸或C-末端 氨基酸的侧链共价连接。
31.权利要求四的胰高血糖素肽，其中观或四位氨基酸包括酸性氨基酸。
32.权利要求10、14、17、29、30和41中任一项的胰高血糖素肽，其中修饰1或2位氨基 酸以使对二肽基肽酶IV裂解表现出降低的敏感性。
33.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列X1X2QGT FTSDY SKYLD ERX5AK DFVX3W LMNX4 (SEQ ID NO 61)或^CJ2QGT FTSDY SKYLD EQ X5AK EFI X3W LMNX4 (SEQ ID NO 62)，前提为当 1、为 Cys-PEG 时，& 不是 Cys-PEG 或 GGPSSGAPPPSC-PEG， 并且当\为丝氨酸时，X1不是组氨酸。
34.权利要求33的胰高血糖素肽，其中\为Cys-PEG。
35.权利要求34的胰高血糖素肽，其中&为GGPSSGAPPPS。
36.权利要求33的胰高血糖素肽，其中&为GGPSSGAPPPSC-PEG。
37.权利要求33-36中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含16和20位氨基酸之间的 内酰胺桥。
38.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-COOH(SEQ ID NO :9)，其中 Xaa 选自 Met、Leu 禾口 Nle0
39.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 43 和 SEQ ID NO 44 的序列。
40.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14 禾口 SEQ ID NO :15 的序列。
41.权利要求32的胰高血糖素肽，其中2位氨基酸选自D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、 缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸。
42.权利要求32的胰高血糖素肽，其中1位氨基酸选自D-组氨酸、去氨基组氨酸、羟 基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α -甲基组氨酸、咪唑乙酸和α， α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。
43.权利要求10-32中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含在所述胰高血糖素肽的 17,21或M位或C-末端氨基酸共价键合的亲水部分。
44.权利要求43的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分为聚乙二醇链。
45.权利要求10或40的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽进一步包含选自SEQID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 65 的序列。
46.权利要求45的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :33，其中观位氨基酸为天冬氨酸，四位氨基酸为甘氨酸，并且氨基酸序列SEQ ID NO 29 与SEQ ID NO 33的羧基末端共价连接。
47.权利要求46的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :64。
48.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO 20，其中20位氨基酸选自精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸。
49.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自以下的 序列SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO :66)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO :67)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-A rg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO :68)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO :69)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :16)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO :17)禾口NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO :18)和 SEQ ID NO :55，其中所述肽的28位Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸；所述肽的四位Xaa为苏氨酸或甘氨 酸；和 R 为 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :29、COOH 或 C0NH2。
50.权利要求49的胰高血糖素肽，其中R为C0NH2。
51.权利要求49的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :10。
52.权利要求49的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :11ο
53.权利要求50的胰高血糖素肽，其中所述肽进一步包含与16、17、21或对位氨基酸 残基或C-末端氨基酸共价键合的聚乙二醇链，前提为当所述肽包含SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12或SEQ ID NO 13时，所述聚乙二醇链与17、21或M位氨基酸残基共 价键合，当所述肽包含SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :15时，所述聚乙二醇链与16、17或21 位氨基酸残基共价键合，当所述肽包含SEQ ID NO :55时，所述聚乙二醇链与21或M位氨 基酸共价键合，并且当所述肽包含SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17或SEQ ID N0:18时，所述 聚乙二醇链与17或21位氨基酸残基共价键合。
54.权利要求53的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有选自约1，000-约5，000道 尔顿范围的分子量。
55.权利要求53的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有约40，000道尔顿的分子量。
56.权利要求48的胰高血糖素肽，其中所述肽进一步包含添加到所述肽的羧基末端的 另外的氨基酸，所述另外的氨基酸包含取代天然氨基酸的末端羧酸基团的酰胺基团。
57.权利要求49的胰高血糖素肽，其进一步包含与所述胰高血糖素肽的四位氨基酸键 合的延伸肽，所述延伸肽包含选自SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28的氨基 酸序列。
58.权利要求57的胰高血糖素肽，其中观位氨基酸为天冬氨酸，四位氨基酸为甘氨 酸，并且SEQ ID NO : 氨基酸序列与所述胰高血糖素肽的四位氨基酸共价连接。
59.权利要求1的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含以下序列或 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO. 4的胰高血糖素激动剂类似物NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa-Xaa-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :2)；NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa-Arg-A rg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :3)；或NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-T-Leu-Asp-Xaa-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :4)；其中R为COOH或CONH2,并且所述胰高血糖素肽的17、21或M位氨基酸残基或C-末 端氨基酸的侧链进一步包含与所述氨基酸残基共价键合的亲水部分。
60.权利要求59的胰高血糖素肽，其中R为CONH2,并且所述亲水部分为聚乙二醇链。
61.权利要求60的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQID NO 23, SEQ ID NO 24 和 SEQ ID NO 25 的序列。
62.权利要求61的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有选自约1，000-约5，000道尔顿范围的分子量。
63.权利要求61的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有至少约20，000道尔顿的分子量。
64.权利要求1的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自由SEQ ID NO 70到SEQ ID NO :514和SEQ ID NO :534表示的任何序列的序列。
65.权利要求10-64中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽以不超过10个 氨基酸修饰不同于SEQ ID NO :1。
66.权利要求1-65中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽的10位氨基酸为 式I、式II或式III氨基酸。
67.权利要求66的胰高血糖素肽，其中所述式I氨基酸为Lys。
68.权利要求1-67中任一项的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C8-CM脂肪酸。
69.权利要求1-68中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含在所述胰高血糖素肽10位 氨基酸和所述酰基或烷基之间的间隔物。
70.权利要求69的胰高血糖素肽，其中所述间隔物长度为3-10个原子。
71.权利要求70的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为氨基酸或二肽。
72.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物选自以下氨基酸Trp、Asp和Cys。
73.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为氨基酸Glu。
74.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为6-氨基己酸。
75.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为选自以下的二肽:Ala-Ala、 β -Ala- β -Ala、Leu-Leu、Pro-Pro 禾口 γ -Glu- y -Glu。
76.权利要求69-75中任一项的胰高血糖素肽，其中所述间隔物和所述酰基或烷基的 总长为约14-约观个原子。
77.权利要求76的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C12-C18脂肪酰基。
78.权利要求77的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C14或C16。
79.权利要求1-78中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽包含亲水部分。
80.权利要求79的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分为PEG。
81.权利要求1-80中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽包含两个酰基。
82.以不超过10个氨基酸修饰不同于SEQID NO 1的非天然胰高血糖素肽，所述非天 然胰高血糖素肽包含AIB在16、20、21和/或M位中的一个或多个氨基酸取代，其中所述 胰高血糖素肽表现出天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
83.权利要求82的胰高血糖素肽，其包含使对二肽基肽酶IV裂解的敏感性降低的1位 和/或2位氨基酸修饰。
84.权利要求82或83的胰高血糖素肽，其包含取代C-末端羧酸酯的酰胺。
85.权利要求82-84中任一项的胰高血糖素肽，其包含16位AIB。
86.权利要求82-85中任一项的胰高血糖素肽，其包含2位AIB。
87.权利要求82-86中任一项的胰高血糖素肽，其包含20位AIB。
88.权利要求82-87中任一项的胰高血糖素肽，其包含与胰高血糖素肽的10位氨基酸 共价连接的酰基或烷基。
89.权利要求88的胰高血糖素肽，其中所述酰基或烷基对天然存在的氨基酸为非天然的。
90.权利要求88或89的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽的10位氨基酸为式I、式II 或式III氨基酸。
91.权利要求90的胰高血糖素肽，其中所述式I氨基酸为Lys。
92.权利要求88的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C8-C20脂肪酸。
93.权利要求88-92中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含10位氨基酸和所述酰基 或烷基之间的间隔物。
94.权利要求93的胰高血糖素肽，其中所述间隔物长度为3-10个原子。
95.权利要求94的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为氨基酸或二肽。
96.权利要求95的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为6-氨基己酸。
97.权利要求95的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为选自以下的二肽Ala-Ala、 β -Ala- β -Ala、Leu-Leu、Pro-Pro 禾口 γ -Glu- y -Glu0
98.权利要求93-97中任一项的胰高血糖素肽，其中所述间隔物和所述酰基的总长为 约14-约28个原子。
99.权利要求98的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C12-C18脂肪酸。
100.权利要求99的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C14或C16。
101.权利要求82-100中任一项的胰高血糖素肽，其包含亲水部分。
102.权利要求101的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分为聚乙二醇(PEG)。
103.权利要求101或102的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分与M位Cys连接。
104.前述权利要求中任一项的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽包含PEG时， 所述PEG经由硫醚连接与所述胰高血糖素肽的Cys连接，所述硫醚连接通过让所述胰高血 糖素肽与卤代乙酰基-活化的PEG反应来形成。
105.前述权利要求中任一项的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分 时，所述胰高血糖素肽表现出天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
106.权利要求105的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分时，所述 胰高血糖素肽表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少0. 5%。
107.权利要求106的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分时，所述 胰高血糖素肽表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少1%。
108.权利要求107的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分时，所述 胰高血糖素肽表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少5%。
109.包含两个胰高血糖素肽的二聚体，其中至少一个胰高血糖素肽为权利要求1-108 中任一项的胰高血糖素肽，它们通过接头彼此结合。
110.包含权利要求1-108中任一项的胰高血糖素肽、权利要求109的二聚体或其可药 用盐与可药用载体的药物组合物。
111.用预制水性组合物治疗低血糖症的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求 110的药物组合物的步骤。
112.治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求110的药物组合物。
113.引起肠道临时麻痹的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求110的药物组合物。
114.减少增重或诱导减重的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求110的药物组 合物。
全文摘要
本文公开了具有相对于天然胰高血糖素增加的针对胰高血糖素受体效价的经修饰的胰高血糖素肽。通过形成分子内桥或用酰胺基团取代末端羧酸进一步修饰所述胰高血糖素肽，产生表现出胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂活性的肽。可通过聚乙二醇化、酰化、烷化、取代羧基末端氨基酸、C-末端截短或添加选自SEQ ID NO26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO27(KRNRNNIA)和SEQ ID NO28(KRNR)的羧基末端肽来修饰所述多肽，进一步改进这些高效价胰高血糖素类似物的溶解性和稳定性。
文档编号A61K38/00GK102123723SQ200980132562
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月16日 优先权日2008年6月17日
发明者B·C·瓦德, D·L·斯米莱, J·帕特森, J·戴, J·查本内, M·迪马奇, R·D·迪马奇 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司
胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂相关申请的交叉引用本申请要求享有以下专利申请的优先权2008年6月17日提交的美国临时专利 申请号61/073，沈9、2008年7月3日提交的美国临时专利申请号61/078，168、2008年8月 20日提交的美国临时专利申请号61/090，412和2009年5月12日提交的美国临时专利申 请号61/177，476。每一申请的公开内容以其整体在此明确引作参考。背景前高血糖素原是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中加工形成多种不同 的高血糖素原衍生肽，所述肽包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)、胰高血糖素样 肽-2(GLP1)和泌酸调节肽(OXM)，它们涉及多种多样的生理功能，包括葡萄糖动态平衡、 胰岛素分泌、胃排空和肠道生长以及摄食调节。胰高血糖素是四个氨基酸的肽，其对应于 前高血糖素原的33到61位氨基酸，而产生的GLP-I为对应于前高血糖素原的72到108位 氨基酸的37个氨基酸的肽。GLP-I (7-36)酰胺或GLP-I (7_37)酸是GLP-I的生物学有效形 式，它们显示出针对GLP-I受体的活性基本上相等。当血糖水平降低到不足以提供身体活动的能量时，出现低血糖症。在成年人或10 岁以上的儿童中，除了作为糖尿病治疗的副作用外，低血糖症并不常见，但其可因其它药物 或疾病、缺乏激素或酶或者肿瘤而产生。当血糖开始下降时，由胰腺产生的激素胰高血糖素 给肝脏发出信号以分解肝糖并释放葡萄糖，导致血糖水平上升到正常水平。因此，胰高血糖 素在葡萄糖调节中最公认的作用是抵消胰岛素的作用并维持血糖水平。然而，对于糖尿病 患者，胰高血糖素对低血糖症的这种响应可受到削弱，这使得葡萄糖水平更难回到正常范 围。低血糖症是危及生命的事件，需要立即就医。给予胰高血糖素是已确定的用于治 疗急性低血糖症的施药，其可在给药几分钟内恢复葡萄糖的正常水平。当将胰高血糖素用 于急性医学治疗低血糖症时，用稀酸缓冲液溶解胰高血糖素的结晶形式，并肌肉内注射该 溶液。尽管该治疗有效，但该方法麻烦，并且对于处于半昏迷的人很危险。因此，需要在相 关生理条件下保留或超过母体分子的生物学效能但充分可溶并稳定的胰高血糖素类似物， 可将其预先调配为供注射用的溶液。另外，促使糖尿病患者保持接近正常的血糖水平以延迟或预防微血管并发症。实 现该目的通常需要加强的胰岛素治疗。在努力实现该目标过程中，医生们遭遇到其糖尿病 患者的低血糖症的频率和严重程度大大提高的问题。因此，需要改进的比目前的胰岛素疗 法更不可能诱导低血糖症的用于治疗糖尿病的药物和方法。GLP-I具有与胰高血糖素相比不同的生物活性。其作用包括刺激胰岛素合成和分 泌、抑制胰高血糖素分泌和抑制摄食。业已显示GLP-I在糖尿病患者中减轻高血糖症(高 葡萄糖水平)。与GLP-I享有约50%氨基酸同一性的来自蜥蜴毒液的肽毒蜥外泌肽-4，激 活GLP-I受体并同样显示减轻糖尿病患者的高血糖症。亦有证据表明GLP-I和毒蜥外泌肽-4可降低摄食并促进减重，这种作用不仅仅对 糖尿病患者有益，而且对罹患肥胖症的患者亦有益。肥胖症患者具有更高的糖尿病、高血压、血脂过多症、心血管病和肌骨病的风险。因此，仍需要备选及优选的用于治疗糖尿病和肥胖症的改进的方法。概述如本文所述，提供高效价胰高血糖素激动剂类似物，所述胰高血糖素激动剂类似 物亦表现出提高的针对胰高血糖素肽受体的活性，并在另外的实施方案中，表现出增加的 生物物理学稳定性和/或水溶性。另外，根据本发明的另一方面，提供失去天然胰高血糖素 的针对胰高血糖素受体相对于针对GLP-I受体的选择性的胰高血糖素激动剂类似物，所述 类似物因此表现为这两种受体的共激动剂。在胰高血糖素类似物内所选择的氨基酸修饰可 控制类似物针对GLP-I受体相对于针对胰高血糖素受体的相对活性。因此，本发明又一方 面提供具有以下性质的胰高血糖素共激动剂类似物具有针对胰高血糖素受体比GLP-I受 体更高的活性；对这两种受体具有大约相等的活性；和具有针对GLP-I受体比胰高血糖素 受体更高的活性。可对后一类型的共激动剂进行工程改造以使其对胰高血糖素受体表现出 很小或没有活性，但保留与天然GLP-I相同的或比其更高效价的激活GLP-I受体的能力。任 何这些类似物亦可包括赋予增加生物物理稳定性和/或水溶性的修饰。对胰高血糖素受体和GLP-I受体显示共激动作用的胰高血糖素类似物在若干应 用中有利。首先，利用胰高血糖素治疗低血糖症可过度补偿(overcompensate)低血糖水平 并产生过量的血糖水平。若给予胰高血糖素/GLP-I受体共激动剂，则另外的GLP-I刺激可 缓冲胰高血糖素激动剂的作用以防止因治疗低血糖症而产生的过量的血糖水平。另外如本文所述，当单独给予或与其它抗糖尿病或抗肥胖症治疗联合给予时，本 发明胰高血糖素共激动剂类似物可用于控制高血糖症，或用于诱导减重或防止增重。诱 导减重的另一化合物为泌酸调节肽，这是在小肠中发现的天然存在的消化激素(参见 Diabetes 2005 ;54 :2390-23卯)。泌酸调节肽为37个氨基酸的肽，其含有胰高血糖素 的四个氨基酸序列(即SEQ ID NO :1)，接着是8个氨基酸的羧基末端延伸SEQ ID NO 27 (KRNRNNIA)。尽管本发明涵盖本文所述胰高血糖素类似物可任选与这8个氨基酸的羧基 末端延伸(SEQ ID NO 27)连接，但在本发明某些实施方案中，亦明确涵盖缺乏8个邻接羧 基氨基酸SEQ ID NO :27的类似物及类似物的用途。可通过氨基酸修饰来改造(customize)化合物以便调节所述肽的GLP-1活性，因 此，可裁制(tailor)本发明胰高血糖素类似物以治疗特定病症或疾病。更具体地，本文 提供这样的胰高血糖素类似物，其中每一个类似物表现出分别对胰高血糖素受体和GLP-I 受体特有的相对活性水平。例如，可对各肽进行修饰以产生以下胰高血糖素肽相对于 天然GLP-I针对GLP-I受体具有从至少约(包括至少约1. 5%、2%、5%、7%、10%、 20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,75 % UOO % ,125 % ,150 % ,175 % )到约 200% 或更高活性 的任何活性；和相对于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体具有从至少约(包括约 1. 5%,2%,5%,7%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,75%,100%,125%,150%,175%, 200 %,250 %,300 % ,350 %,400 %,450 % )到约500 %或更高活性的任何活性。在某些实 施方案中，本文所述胰高血糖素肽表现出不大于约100 %、1000 %、10，000 %、100, 000 %或 1，000, 000%的天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，本文所述 胰高血糖素肽表现出不大于约100 %、1000 %、10，000 %、100，000 %或1，000，000 %的天然 GLP-I针对GLP-I受体的活性。天然胰高血糖素的氨基酸序列为SEQ ID NO :1,GLP-1 (7-36)
10酰胺的氨基酸序列为SEQ ID NO 52，GLP-I (7-37)酸的氨基酸序列为SEQ ID NO :50。在例 示性实施方案中，胰高血糖素肽可表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少 10%和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少50%，或天然胰高血糖素针对胰高血糖素受 体活性的至少40%和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少40%，或天然胰高血糖素针对 胰高血糖素受体活性的至少60%和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少60%。可将胰高血糖素肽针对胰高血糖素受体相对于针对GLP-I受体的选择性阐述为 胰高血糖素/GLP-I活性的相对比率(所述肽相对于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体 的活性除以所述肽相对于天然GLP-I针对GLP-I受体的活性)。例如，表现出60%的天然 胰高血糖素针对胰高血糖素受体的活性和60 %的天然GLP-I针对GLP-I受体的活性的胰高 血糖素肽具有1 1的胰高血糖素/GLP-I活性比率。胰高血糖素/GLP-I活性的例示性比 率包括约 1 1、1.5 1、2 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、9 1 或 10 1 或约 1 10、1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、1 4、1 3、1 2 或 1 1.5。举例而 言，10 1的胰高血糖素/GLP-I活性比率表示针对胰高血糖素受体相对于针对GLP-I受体 有10倍的选择性。类似地，10 1的GLP-I/胰高血糖素活性比率表示针对GLP-I受体相 对于针对胰高血糖素受体有10倍的选择性。根据一个实施方案，提供增加效价和任选改进溶解性和稳定性的胰高血糖类似物 素。在一个实施方案中，通过天然胰高血糖素(SEQ ID NO 1)的16位氨基酸修饰来提供提 高的胰高血糖素效价。作为非限制性实例，所述提高效价可通过用以下氨基酸取代天然存 在的16位的丝氨酸来提供谷氨酸；或另一具有长4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸； 或作为备选以下氨基酸中的任何一种谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸或具有含至少一 个杂原子(例如N、0、S、P)的侧链并具有长约4(或3-5)个原子的侧链的带电荷的氨基酸。 在一个实施方案中，提高效价的胰高血糖素激动剂包含肽SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO 5 的胰高血糖素激动剂 类似物。根据一个实施方案，提供相对于野生型胰高血糖素具有提高的针对胰高血糖素受 体的效价的胰高血糖素类似物蛋白质，其中所述肽包含序列SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10，其中所述胰高血糖素肽保留其相对于GLP-I受体对胰高血 糖素受体的选择性。可通过3位氨基酸修饰来降低、保持或提高胰高血糖素受体活性，例如取代3位天 然存在的谷氨酰胺。在一个实施方案中，用酸性、碱性或疏水氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮 氨酸)取代3位氨基酸显示大大降低或破坏胰高血糖素受体活性。用例如谷氨酸、鸟氨酸 或正亮氨酸取代的类似物具有天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的约10 %或更小， 例如约1-10%或约0. 1-10%或大于约0. 但小于约10%，同时表现出GLP-I针对GLP-I 受体活性的至少20%。例如，本文所述例示性类似物具有约0. 5%、约或约7%的天然 胰高血糖素活性，同时表现出GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。在另一实施方案中，胰高血糖素肽3位天然存在的谷氨酰胺可被谷氨酰胺类似物 取代而基本上不损失针对胰高血糖素受体的活性，在某些情况下还提高胰高血糖素受体活 性。例如，在3位包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可表现出约5%、约10%、约20%、约 50%或约85%或更大的天然胰高血糖素(例如SEQ ID NO 1)针对胰高血糖素受体的活性。 在某些实施方案中，在3位包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽，相比于具有与包含谷氨酰胺类似物的肽相同的氨基酸序列但有3位修饰的氨基酸的对应胰高血糖素肽(例如SEQ ID NO :601 或 SEQ ID NO :602)，可表现出约 20%、约 50%、约 75%、约 100%、约 200%或约 500%或更大的针对胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，在3位包含谷氨酰胺类似 物的胰高血糖素肽表现出提高的针对胰高血糖素受体的活性，但该提高的活性不大于天然 胰高血糖素活性的或不大于具有与包含谷氨酰胺类似物的肽相同的氨基酸序列但有3位 修饰的氨基酸的对应胰高血糖素肽活性的1000%、10，000%,100, 000%或1，000, 000%。在某些实施方案中，谷氨酰胺类似物为天然存在的或非天然存在的氨基酸，所述 氨基酸包含结构I、II或III侧链
权利要求
1.包含氨基酸序列SEQID NO :1的胰高血糖素肽，所述胰高血糖素肽具有至多10个 氨基酸修饰并包含用C4-C30脂肪酸酰化或烷化的10位氨基酸。
2.权利要求1的胰高血糖素肽，其中(i)所述胰高血糖素肽包含i位氨基酸和i+4位 氨基酸侧链之间的分子内桥，其中i为12、16、20或所述胰高血糖素肽的16、20、 21或M位中的一个、二个、三个或更多个位置被α，α-二取代氨基酸取代；或(iii)(i) 和(ii)两者。
3.权利要求1或2的胰高血糖素肽，其包含16位Glu和20位Lys，其中任选内酰胺桥 连接所述Glu和Lys。
4.权利要求3的胰高血糖素肽，其进一步包含选自以下的一个或多个修饰17位Glru 18 位 Ala,21 位 Glu,23 位 Ile 和 24 位 Ala。
5.权利要求1-4中任一项的胰高血糖素肽，其包含C-末端酰胺。
6.权利要求1-5中任一项的胰高血糖素肽，其包含在1位、2位或1和2位的氨基酸取 代，其中所述氨基酸取代实现DPP-IV蛋白酶抗性。
7.权利要求6的胰高血糖素肽，其中1位His被选自以下的氨基酸取代D-组氨酸、 α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、Ν_甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、去氨基组氨酸、 羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。
8.权利要求6或7的胰高血糖素肽，其中2位Ser被选自以下的氨基酸取代D_丝氨 酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝取代氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸。
9.被修饰以包含与胰高血糖素肽10位氨基酸共价连接的酰基或烷基的非天然胰高血 糖素肽。
10.权利要求9的胰高血糖素肽，其中所述在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQ ID N0:55或SEQ ID NO :55的类似物，其中所述类似物不是天然存在的肽，所述类似物以选 自以下 1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28 和 29 位的 1-3 处位置的氨基酸修 饰不同于SEQ ID NO :55，并且其中所述胰高血糖素肽表现出天然GLP-I针对GLP-I受体活 性的至少20%.
11.权利要求10的胰高血糖素肽，其中所述被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO55。
12.权利要求10的胰高血糖素肽，其中所述被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO56。
13.权利要求10-12中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽进一步包含选 自以下的与所述胰高血糖素肽羧基末端连接的肽SEQ ID NO :26,SEQ ID NO : 和SEQ ID NO :65ο
14.权利要求11或12的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽进一步包含与所述胰高 血糖素肽羧基末端连接的SEQ ID NO :26。
15.权利要求11-14中任一项的胰高血糖素肽，其包含选自以下的两个氨基酸之间的 内酰胺桥16和20位氨基酸、12和16位氨基酸、20和M位氨基酸及M和28位氨基酸。
16.权利要求15的胰高血糖素肽，其中所述内酰胺桥在16和20位氨基酸之间。
17.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO33。
18.权利要求10的胰高血糖素肽，其中所述观位氨基酸为Asp、Asn或Lys，所述四位 氨基酸为Gly或Thr。
19.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含以1-2个氨 基酸不同于SEQ ID NO 55的SEQ ID NO 55类似物。
20.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含以1个氨基 酸不同于SEQ ID NO 55的SEQ ID NO 55类似物。
21.权利要求20的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :53ο
22.权利要求21的胰高血糖素肽，其中3位氨基酸为谷氨酰胺。
23.权利要求10的胰高血糖素肽，其中3位氨基酸为谷氨酸。
24.权利要求10-11中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰高血 糖素受体活性的至少10%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少50%。
25.权利要求10-11中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰高血 糖素受体活性的至少40%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少40%。
26.权利要求10-11中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰高血 糖素受体活性的至少60%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少60%。
27.权利要求10-21和23中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰 高血糖素受体活性的0. 1-10%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
28.权利要求10-21和23中任一项的胰高血糖素肽，其表现出天然胰高血糖素针对胰 高血糖素受体活性的1_10%，和天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
29.权利要求10-28中任一项的胰高血糖素肽，其中16位氨基酸为谷氨酸，20位氨基 酸为赖氨酸，C-末端羧酸基团被酰胺取代，任选在所述16位谷氨酸和20位赖氨酸之间具 有内酰胺桥。
30.权利要求四的胰高血糖素肽，其中聚乙二醇链与17、21或对位氨基酸或C-末端 氨基酸的侧链共价连接。
31.权利要求四的胰高血糖素肽，其中观或四位氨基酸包括酸性氨基酸。
32.权利要求10、14、17、29、30和41中任一项的胰高血糖素肽，其中修饰1或2位氨基 酸以使对二肽基肽酶IV裂解表现出降低的敏感性。
33.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列X1X2QGT FTSDY SKYLD ERX5AK DFVX3W LMNX4 (SEQ ID NO 61)或^CJ2QGT FTSDY SKYLD EQ X5AK EFI X3W LMNX4 (SEQ ID NO 62)，前提为当 1、为 Cys-PEG 时，& 不是 Cys-PEG 或 GGPSSGAPPPSC-PEG， 并且当\为丝氨酸时，X1不是组氨酸。
34.权利要求33的胰高血糖素肽，其中\为Cys-PEG。
35.权利要求34的胰高血糖素肽，其中&为GGPSSGAPPPS。
36.权利要求33的胰高血糖素肽，其中&为GGPSSGAPPPSC-PEG。
37.权利要求33-36中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含16和20位氨基酸之间的 内酰胺桥。
38.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-COOH(SEQ ID NO :9)，其中 Xaa 选自 Met、Leu 禾口 Nle0
39.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 43 和 SEQ ID NO 44 的序列。
40.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14 禾口 SEQ ID NO :15 的序列。
41.权利要求32的胰高血糖素肽，其中2位氨基酸选自D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、 缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸。
42.权利要求32的胰高血糖素肽，其中1位氨基酸选自D-组氨酸、去氨基组氨酸、羟 基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α -甲基组氨酸、咪唑乙酸和α， α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。
43.权利要求10-32中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含在所述胰高血糖素肽的 17,21或M位或C-末端氨基酸共价键合的亲水部分。
44.权利要求43的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分为聚乙二醇链。
45.权利要求10或40的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽进一步包含选自SEQID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 65 的序列。
46.权利要求45的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :33，其中观位氨基酸为天冬氨酸，四位氨基酸为甘氨酸，并且氨基酸序列SEQ ID NO 29 与SEQ ID NO 33的羧基末端共价连接。
47.权利要求46的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :64。
48.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含SEQID NO 20，其中20位氨基酸选自精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸。
49.权利要求10的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自以下的 序列SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO :66)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO :67)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-A rg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO :68)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO :69)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :16)、NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO :17)禾口NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQ ID NO :18)和 SEQ ID NO :55，其中所述肽的28位Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸；所述肽的四位Xaa为苏氨酸或甘氨 酸；和 R 为 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :29、COOH 或 C0NH2。
50.权利要求49的胰高血糖素肽，其中R为C0NH2。
51.权利要求49的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :10。
52.权利要求49的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含序列SEQID NO :11ο
53.权利要求50的胰高血糖素肽，其中所述肽进一步包含与16、17、21或对位氨基酸 残基或C-末端氨基酸共价键合的聚乙二醇链，前提为当所述肽包含SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12或SEQ ID NO 13时，所述聚乙二醇链与17、21或M位氨基酸残基共 价键合，当所述肽包含SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :15时，所述聚乙二醇链与16、17或21 位氨基酸残基共价键合，当所述肽包含SEQ ID NO :55时，所述聚乙二醇链与21或M位氨 基酸共价键合，并且当所述肽包含SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17或SEQ ID N0:18时，所述 聚乙二醇链与17或21位氨基酸残基共价键合。
54.权利要求53的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有选自约1，000-约5，000道 尔顿范围的分子量。
55.权利要求53的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有约40，000道尔顿的分子量。
56.权利要求48的胰高血糖素肽，其中所述肽进一步包含添加到所述肽的羧基末端的 另外的氨基酸，所述另外的氨基酸包含取代天然氨基酸的末端羧酸基团的酰胺基团。
57.权利要求49的胰高血糖素肽，其进一步包含与所述胰高血糖素肽的四位氨基酸键 合的延伸肽，所述延伸肽包含选自SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28的氨基 酸序列。
58.权利要求57的胰高血糖素肽，其中观位氨基酸为天冬氨酸，四位氨基酸为甘氨 酸，并且SEQ ID NO : 氨基酸序列与所述胰高血糖素肽的四位氨基酸共价连接。
59.权利要求1的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含以下序列或 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO. 4的胰高血糖素激动剂类似物NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa-Xaa-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :2)；NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa-Arg-A rg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :3)；或NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-T-Leu-Asp-Xaa-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R(SEQ ID NO :4)；其中R为COOH或CONH2,并且所述胰高血糖素肽的17、21或M位氨基酸残基或C-末 端氨基酸的侧链进一步包含与所述氨基酸残基共价键合的亲水部分。
60.权利要求59的胰高血糖素肽，其中R为CONH2,并且所述亲水部分为聚乙二醇链。
61.权利要求60的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQID NO 23, SEQ ID NO 24 和 SEQ ID NO 25 的序列。
62.权利要求61的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有选自约1，000-约5，000道尔顿范围的分子量。
63.权利要求61的胰高血糖素肽，其中所述聚乙二醇链具有至少约20，000道尔顿的分子量。
64.权利要求1的胰高血糖素肽，其中在10位被修饰的胰高血糖素肽包含选自由SEQ ID NO 70到SEQ ID NO :514和SEQ ID NO :534表示的任何序列的序列。
65.权利要求10-64中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽以不超过10个 氨基酸修饰不同于SEQ ID NO :1。
66.权利要求1-65中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽的10位氨基酸为 式I、式II或式III氨基酸。
67.权利要求66的胰高血糖素肽，其中所述式I氨基酸为Lys。
68.权利要求1-67中任一项的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C8-CM脂肪酸。
69.权利要求1-68中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含在所述胰高血糖素肽10位 氨基酸和所述酰基或烷基之间的间隔物。
70.权利要求69的胰高血糖素肽，其中所述间隔物长度为3-10个原子。
71.权利要求70的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为氨基酸或二肽。
72.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物选自以下氨基酸Trp、Asp和Cys。
73.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为氨基酸Glu。
74.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为6-氨基己酸。
75.权利要求71的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为选自以下的二肽:Ala-Ala、 β -Ala- β -Ala、Leu-Leu、Pro-Pro 禾口 γ -Glu- y -Glu。
76.权利要求69-75中任一项的胰高血糖素肽，其中所述间隔物和所述酰基或烷基的 总长为约14-约观个原子。
77.权利要求76的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C12-C18脂肪酰基。
78.权利要求77的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C14或C16。
79.权利要求1-78中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽包含亲水部分。
80.权利要求79的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分为PEG。
81.权利要求1-80中任一项的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽包含两个酰基。
82.以不超过10个氨基酸修饰不同于SEQID NO 1的非天然胰高血糖素肽，所述非天 然胰高血糖素肽包含AIB在16、20、21和/或M位中的一个或多个氨基酸取代，其中所述 胰高血糖素肽表现出天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
83.权利要求82的胰高血糖素肽，其包含使对二肽基肽酶IV裂解的敏感性降低的1位 和/或2位氨基酸修饰。
84.权利要求82或83的胰高血糖素肽，其包含取代C-末端羧酸酯的酰胺。
85.权利要求82-84中任一项的胰高血糖素肽，其包含16位AIB。
86.权利要求82-85中任一项的胰高血糖素肽，其包含2位AIB。
87.权利要求82-86中任一项的胰高血糖素肽，其包含20位AIB。
88.权利要求82-87中任一项的胰高血糖素肽，其包含与胰高血糖素肽的10位氨基酸 共价连接的酰基或烷基。
89.权利要求88的胰高血糖素肽，其中所述酰基或烷基对天然存在的氨基酸为非天然的。
90.权利要求88或89的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽的10位氨基酸为式I、式II 或式III氨基酸。
91.权利要求90的胰高血糖素肽，其中所述式I氨基酸为Lys。
92.权利要求88的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C8-C20脂肪酸。
93.权利要求88-92中任一项的胰高血糖素肽，其进一步包含10位氨基酸和所述酰基 或烷基之间的间隔物。
94.权利要求93的胰高血糖素肽，其中所述间隔物长度为3-10个原子。
95.权利要求94的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为氨基酸或二肽。
96.权利要求95的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为6-氨基己酸。
97.权利要求95的胰高血糖素肽，其中所述间隔物为选自以下的二肽Ala-Ala、 β -Ala- β -Ala、Leu-Leu、Pro-Pro 禾口 γ -Glu- y -Glu0
98.权利要求93-97中任一项的胰高血糖素肽，其中所述间隔物和所述酰基的总长为 约14-约28个原子。
99.权利要求98的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C12-C18脂肪酸。
100.权利要求99的胰高血糖素肽，其中所述酰基为C14或C16。
101.权利要求82-100中任一项的胰高血糖素肽，其包含亲水部分。
102.权利要求101的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分为聚乙二醇(PEG)。
103.权利要求101或102的胰高血糖素肽，其中所述亲水部分与M位Cys连接。
104.前述权利要求中任一项的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽包含PEG时， 所述PEG经由硫醚连接与所述胰高血糖素肽的Cys连接，所述硫醚连接通过让所述胰高血 糖素肽与卤代乙酰基-活化的PEG反应来形成。
105.前述权利要求中任一项的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分 时，所述胰高血糖素肽表现出天然GLP-I针对GLP-I受体活性的至少20%。
106.权利要求105的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分时，所述 胰高血糖素肽表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少0. 5%。
107.权利要求106的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分时，所述 胰高血糖素肽表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少1%。
108.权利要求107的胰高血糖素肽，其中当所述胰高血糖素肽缺乏亲水部分时，所述 胰高血糖素肽表现出天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少5%。
109.包含两个胰高血糖素肽的二聚体，其中至少一个胰高血糖素肽为权利要求1-108 中任一项的胰高血糖素肽，它们通过接头彼此结合。
110.包含权利要求1-108中任一项的胰高血糖素肽、权利要求109的二聚体或其可药 用盐与可药用载体的药物组合物。
111.用预制水性组合物治疗低血糖症的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求 110的药物组合物的步骤。
112.治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求110的药物组合物。
113.引起肠道临时麻痹的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求110的药物组合物。
114.减少增重或诱导减重的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求110的药物组 合物。
全文摘要
本文公开了具有相对于天然胰高血糖素增加的针对胰高血糖素受体效价的经修饰的胰高血糖素肽。通过形成分子内桥或用酰胺基团取代末端羧酸进一步修饰所述胰高血糖素肽，产生表现出胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂活性的肽。可通过聚乙二醇化、酰化、烷化、取代羧基末端氨基酸、C-末端截短或添加选自SEQ ID NO26(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO27(KRNRNNIA)和SEQ ID NO28(KRNR)的羧基末端肽来修饰所述多肽，进一步改进这些高效价胰高血糖素类似物的溶解性和稳定性。
文档编号A61K38/00GK102123723SQ200980132562
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月16日 优先权日2008年6月17日
发明者B·C·瓦德, D·L·斯米莱, J·帕特森, J·戴, J·查本内, M·迪马奇, R·D·迪马奇 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司
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