同时诱导CTL和γδT细胞的方法
专利名称：同时诱导CTL和γδT细胞的方法
技术领域：
本发明涉及在癌治疗中同时且有效地培养抗原特异的CTL和γ δτ细胞的技术。 更具体地，本发明涉及使用该培养技术培养的细胞的医药用途。
背景技术：
近来，免疫细胞疗法作为包括癌症在内的难治性疾病的新疗法而受到关注。免疫 细胞疗法是收集并活化患者自身的免疫细胞，特别是白细胞，然后再将它们返回患者体内 来人工地增强免疫力。与常规的抗癌剂治疗等比较，这种疗法具有减少的副作用的优点。作为免疫细胞疗法，活化自体淋巴细胞的疗法已经普及，所述疗法涉及体外用淋 巴因子实施抗原非特异地活化淋巴细胞，然后将它们返回身体；但是，需要获得利用细胞毒 性T淋巴细胞(下文中称为CTL)的疗法，其中所述细胞毒性T淋巴细胞具有更强的细胞毒 活性并特异地识别和破坏病变。这里，作为当前尝试的利用CTL的治疗法，例如采用直接将癌抗原肽等施与患者 的方法；但是，在这种情况下，由于患者通常具有低下的免疫力，其诱导CTL的能力需要提 高。因此，有树状细胞疫苗疗法等，所述疗法涉及将抗原与抗原呈递细胞如树状细胞(下文 中也称为DC)等接触，并因此强烈地引起细胞呈递抗原，由DC在体内诱导疾病抗原特异的 CTL。下面显示的是一些目前诱导疾病抗原特异的CTL的典型方法。例如，在非专利文献1和2中，将9-mer肽如特定疾病抗原的表位添加至外周血单 核细胞来尝试由其诱导CTL。此外，在非专利文献3和4中，从外周血单核细胞获得DC并向 其添加抗原肽，来赋予抗原呈递功能；将自外周血淋巴细胞分离的CD8阳性T细胞与所获得 的DC —同培养来诱导疾病抗原特异的CTL。进一步地，在非专利文献5中，使用获自造血前体细胞的DC和抗原肽进行DC接 种，然后将向其添加了抗原的单核细胞来源的DC与分离自外周血单核细胞的CD8阳性T细 胞共培养以诱导抗原特异的CTL。从上述例子中它们的用途可以获知，在其它抗原呈递细胞中，树状细胞具有高的 抗原呈递能力并且能够诱导疾病抗原特异的CTL，因此，正在进行获得它们的技术开发。但是，为了获得用于树状细胞接种的树状细胞，通常需要收集人外周血，从外周血 分离称为单核细胞的细胞，并在添加IL-4、GM-CSF等后培养它们。该方法繁琐并且目前存 在这样的问题，取决于细胞培养技术人员的水平，所培养细胞的数量和功能是变化的。Y δ T细胞是非肽抗原活化的细胞，是负责天然免疫的细胞；近来发现这些细胞 对癌细胞具有MHC非限制性细胞毒活性(非特异的活性)。因此，研究了使用这些Y δΤ细 胞的强抗癌活性的免疫疗法。由于Y δ T细胞通过识别非肽抗原而活化，它们可以被例如烷基胺或二膦酸作为 非肽抗原刺激，从而活化和/或增殖；已经在体外引起分离自外周血的Y ST细胞识别非肽 抗原来研究其活化和/或增殖(例如，非专利文献6)。
但是，问题是γ δ T细胞通常在外周血中以仅1至5%的量存在，收集少量的血液 然后从其活化和/或增殖Y ST细胞不能确保Y δT细胞的纯度和数量足够用于治疗。增 加自患者收集的血液量来确保Y ST细胞的纯度和数量足够用于治疗也有对患者是一个 很大的负担的问题。专利文献1也公开了通过添加二膦酸至外周血单核细胞来活化和/或增殖Y δ T 细胞的方法。因此更有效的细胞培养和利用对免疫细胞疗法是重要的；现在正在进行多种多样 的方法和技术的研发。此外，在免疫细胞疗法中现在是主要培养一种类型的细胞并用于治疗；但是，考虑 到如上所述的例如疾病抗原特异的CTL以MHC限制性方式，例如，特异地针对MHC I类呈递 的抗原，攻击目标细胞或组织；和、S T细胞以MHC非限制性方式攻击细胞或组织，可以混 合多种细胞并用于治疗。但是，在实践中，对于培养多种类型的免疫细胞用于治疗，不得不对多种细胞类型 同时平行地实施培养步骤。适用于每一类型细胞的培养条件相互间不相同；如果使用常规 的适用于一种类型细胞的培养方法，它将非常难于例如同时且有效地培养足够数量的疾病 抗原特异的CTL和γ δ T细胞来发挥治疗效果；目前还没有这样的有效培养方法和诱导方 法。现有技术文献专利文献专利文献1 :W0 2006/006720非专利文献非专利文献 1 =Sugiyama H.等人，Cancer Immunol. Immunother.，2002 年 12 月； 51(11-12) :614-20. Epub，2002 年 10 月 18 日。非专利文献2 =Appella E.等人，J. Immunol.，1995 年 3 月 1 日；154(5) :2257-65非专利文献3 =Fujita S.等人，Blood，2000 年 1 月 1 日；95(1) :286_93。非专利文献4 =Yasukawa M.等人，Clin. Cancer Res.，2002 年 8 月；8(8) 2626-31。非专利文献5 =Palucka AK.等人，J. Exp. Med.，2004 年 6 月 7 日；199 (11) 1503-11，Epub，2004 年 6 月 1 日.非专利文献 6:Fumi Miyagawa 等人，The Journal of Immunology, 2001 ； 166 (9) 5508-5514。发明概述技术问题鉴于上述情形，本发明的课题是在一步培养中同时且有效地诱导和培养足够数量 的疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞用于发挥治疗效果。解决问题的手段本发明人为了解决这些问题进行了多种研究，并发明了本发明。本发明如下。(1)同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法，特征在于，包括以下步骤 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并培养所得到的外周血；( 根据项(1)的同时诱导
4疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中添加疾病抗原和氨基二膦酸的步骤在培养 开始第1日实施；(3)根据项(1)或(2)的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方 法，其中氨基二膦酸是帕米膦酸(pamidronic acid)、阿仑膦酸(alendronic acid)、唑来膦 酸(zoledronic acid)、禾丨J塞膦酸(risedronic acid)、伊班膦酸(ibandronic acid)、英卡 膦酸(incadronic acid)、其盐和/或其水合物；(4)根据项(1)至( 任一项的同时诱导 疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中疾病抗原是癌抗原；(5)根据项(1)至(4) 任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中同时添加疾病抗原和氨 基二膦酸；(6)医药品，其包含通过项⑴至(5)任一项的方法获得的疾病抗原特异的CTL 和Y δΤ细胞；和(7)治疗/预防方法，其包括施与通过项(1)至( 任一项的方法获得的 疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞。作为研究结果，本发明人发现在外周血中通过氨基二膦酸活化的Y δ T细胞增殖 并且这些活化和增殖的Y S T细胞显示发挥APC(抗原呈递细胞)的功能，其呈递疾病抗原 并也促进疾病抗原特异的CTL的诱导，从而完成了本发明。发明的效果在用于疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的培养和诱导的常规方法中，通过多个 步骤获得所希望的细胞和然后开始培养；但是，本发明在一步培养中能够同时且有效地提 供疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞，无需自外周血分离细胞；并且甚至能够获得含有大量 治疗效果极好的细胞的细胞群体。通过这种诱导方法获得的疾病抗原特异的CTL和γ δ T 细胞的混合细胞群体能够提供较施与单一种免疫细胞作为医药品的常规治疗而言更高效 的治疗。特别地，至今为止CTL的诱导需要以下步骤(1)从血液分离单核细胞；(2)添加 细胞因子来诱导树状细胞；(3)用抗原脉冲树状细胞；和(4)共培养抗原脉冲的树状细胞和 淋巴细胞来诱导CTL。但是，使用本发明能够省略诱导树状细胞的步骤，这能减轻工作量，也 能减少污染风险，并能进一步地将树状细胞诱导期间(约7天)缩短。实施发明的最佳方案以下对本发明的实施方案进行说明。<第一实施方案本发明的同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法>本发明的同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法(下文中也简称为 “本发明的诱导方法”)的特征在于包括以下步骤，添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并 培养所得到的外周血。虽然一直以来在相同培养步骤中获得治疗有效量的疾病抗原特异的CTL和Y δ T 细胞是非常困难的，但是本发明的诱导方法使得这些类型的细胞通过上述步骤简单高效地获得。根据本发明的诱导方法，将外周血中的Y δ T细胞用氨基二膦酸活化和增殖，并 且这些活化且增殖的Y S T细胞也显示发挥APC的功能，其呈递疾病抗原并诱导疾病抗原 特异的CTL。此外，具有APC功能的γ δ T细胞不仅只是作为APC发挥作用，而且甚至在疾 病抗原特异的CTL增殖后γ δ T细胞仍继续增殖，从而使得能获得发挥治疗效果的足够量 的这两种类型的细胞。以下描述本发明的诱导方法的具体操作。
1)收集血液来提供外周血。所需要的量是15至25mL。这个量使得能够合适地培 养血液。但是，不将培养开始时的外周血的足够量限制在此范围，并且由于较大量的血液收 集增加了收集的疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的数量，优选地收集较大量的血液，条件 是对所收集血液的供体的负担小。2)通过例如密度梯度离心获得外周血单核细胞。能够获得的外周血单核细胞数量 是从15至25mL外周血获得约1至2X IO7个外周血单核细胞。3)将2)中获得的外周血单核细胞悬浮在培养基AIM-V(Invitrogen)中。本文中 将悬浮了外周血单核细胞的溶液称为细胞悬液。除了上述培养基之外，也可以使用市售的 用于细胞培养的培养基如RPMI-1640培养基(Invitrogen) ,Dulbecco改良的Eagle培养基 (Invitrogen ；下文中称为DMEM)、或Iscove培养基(Invitrogen ；下文中称为IMEM)。4)将幻中获得的细胞悬液接种在烧瓶、袋或板中。5)将氨基二膦酸以浓度0. 05至100 μ Μ,优选地0. 1至30 μ M添加至接种在烧瓶、 袋或板中的外周血单核细胞。本文中，二膦酸是焦磷酸的类似物，并且是焦磷酸骨架P-O-P的0(氧原子)被 C(碳原子)替换后的化合物(P-C-P)。二膦酸通常用作骨质疏松的治疗药。氨基二膦酸是 指二膦酸中具有N(氮原子)的化合物。例如，不特别限制在本发明中使用的氨基二膦酸； 可以使用在WO 2006/006720和W02007/(^9689中公开的氨基二膦酸等。其具体例子包括 帕米膦酸、其盐和/或它们的水合物；阿仑膦酸、其盐和/或它们的水合物；和唑来膦酸、其 盐和/或它们的水合物。氨基二膦酸的浓度，对帕米膦酸、其盐和/或它们的水合物优选地 是1至30 μ M，对阿仑膦酸、其盐和/或它们的水合物优选地是1至30 μ Μ，和对唑来膦酸、 其盐和/或它们的水合物优选地是0. 1至10 μ Μ。在本文中，以添加5 μ M唑来膦酸作为例 子。6)在添加幻中的氨基二膦酸时，一同添加疾病抗原。在本文中，“疾病”是例如癌 症或感染症。不特别地限制癌症，包括任意癌症；例如难治性癌症。感染症的例子包括病毒 感染症如AIDS或者乙型或丙型肝炎、细胞感染、细菌感染、真菌感染或原虫感染。作为抗原的形式，根据需要可以使用肽、蛋白质等。也可以使用癌细胞或感染细胞 的细胞裂解物、凋亡细胞、坏死细胞和它们的热处理产物等。抗原可以是来自患者(例如，通过外科手术从患者分离出的肿瘤组织等)的、或者 是合成的。与使用自患者自身癌组织等收获癌抗原相比较，使用合成肽能够减轻患者的负 担。添加的量，如果是肽的话，添加0. 02 M 2 μ g/ml左右。例如，添加2μ g/ml。不特别地限制氨基二膦酸和疾病抗原的添加顺序，它们可以同时添加，或者先添 加任一者；但是，优选同时添加。6)此外，向上述培养基中添加IL-2至浓度为50至2000U/mL，更优选地400至 1000U/mL。7)添加IL-2后，在；34至38°C，更优选地在37°C，在2至10%，更优选地5% CO2 存在下培养。此时，根据所培养细胞的数量，适当地添加培养基。此外，随着培养基的增加， 适当地添加IL-2至浓度为50至2000U/mL，更优选地400至1000U/mL。8)进一步地，向上述培养液添加0. 1至20%量的血清。作为血清，可以使用例如胎牛血清(下文中称为FCQ、AB血清或者自体血浆。以这种方式，当培养期间是7天或7天以上时，能够以高纯度获得包含疾病抗原特 异的CTL和γ δ T细胞的细胞群体；但是，培养优选地进行约14天，以进一步地增加细胞数。在上述培养步骤期间优选地将血浆添加至培养液。添加时间大概是在培养开始后 0至100小时，使得能够满意地进行培养。<第二实施方案包含疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的医药品>本发明的医药品是包含疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的医药品，是在培养开 始时通过添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血而进行培养获得的医药品。现有的免疫细胞疗法使用单一类型的细胞，或者通过在施用时混合分别培养的细 胞后或同时地添加分别培养的细胞而使用多种类型的细胞。相反，本发明的医药品是通过本发明的诱导方法同时培养疾病抗原特异的CTL和
YS T细胞，这使得能够非常简单地获得较多的细胞数。使用此类医药品具有这样的优点， 它比常规使用的单一类型的免疫细胞具有更高的治疗功效，因为疾病抗原特异的CTL和
YST细胞之间的协同作用。下面具体描述本发明的医药品。1)通过本发明的培养方法获得的细胞通过离心法等回收。2)将回收的细胞用洗净液洗净。洗净液优选地是与细胞渗透压相等的等渗液，并 且更优选地是能够用于医药品的液体。在本文中，考虑到它施用至患者，优选使用例如生理 盐水或PBS (磷酸盐缓冲的生理盐水)。3)洗净后获得的主要含有疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的淋巴细胞群体通过 离心法等回收，并悬浮于用作医药品的液体例如生理盐水中，以制备本发明的医药品。在本 文中，用于悬浮的液体的用量根据施用的细胞数和施用方法进行适当的调整。本发明的医药品中所使用的主要含有疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的淋巴细 胞群体的细胞数根据施用方法、疾病的类型、患者的症状等合适地选择；但是，它通常优选 地是IO8至IO12个/人，更优选地IO9个/人或以上。4)随后，将它们悬浮在生理盐水中以提供本发明的医药品。本发明的医药品能够 用作癌症或感染症的治疗剂/预防剂。此处，在用作癌症的治疗剂/预防剂的情形，也可以将本发明的医药品与细胞因 子如IL-2或IL-12组合。另外，在作为病毒感染症的治疗剂/预防剂的情形，也可以将本发明的医药品与 干扰素-Y (IFN-y)等组合。5)施用方法可以是例如静脉内、皮内、皮下等的注射；直接注射入病变部位；或者 通过点滴而全身施用。此外，也可以通过病变部位附近的动脉注入。<第三实施方案施与疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的治疗/预防方法>本发明的治疗/预防方法是涉及施与疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的治疗/ 预防方法，其中所述疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞是通过在培养开始时添加疾病抗原 和氨基二膦酸至外周血来培养而获得的。本发明的治疗/预防方法具体说明如下。
1)通过本发明的培养方法获得的细胞通过离心法等收集。2)用洗净液洗收集的细胞。洗净液优选地是与细胞渗透压相等的等渗液，并且更 优选地是能够用于医药品的液体。在本文中，考虑到它施用至患者，优选使用例如生理盐水 或PBS (磷酸盐缓冲的生理盐水)。3)洗净后获得的主要含有疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的淋巴细胞群体通 过离心法等回收，并悬浮于用作医药品的液体例如生理盐水中，以制备用于本发明的治疗/ 预防方法中的细胞悬液。此时，用于悬浮的液体的用量根据施用的细胞数和施用方法进行 适当的调整。用于本发明的治疗/预防方法中的主要含有疾病抗原特异的CTL和、δΤ细胞的 淋巴细胞群体的细胞数根据施用方法、疾病的类型、患者的症状等合适地选择；但是，它通 常优选地是IO8至IO12个/人，更优选地IO9个/人或以上。4)随后，将它们悬浮在生理盐水中以提供细胞悬液。此处，在用于治疗或预防癌症的情形，也可以将本发明的医药品与细胞因子如 IL-2 或 IL-12 组合。另外，在用于治疗或预防病毒感染症的情形，也可以将本发明的医药品与干扰 素1 (IFN-y)等组合。5)施用方法可以是例如静脉内、皮内、皮下等的注射；直接注射入病变部位；或者 通过点滴而全身施用。此外，也可以通过病变部位附近的动脉注入。以下参考实施例详细地描述本发明。但是，应理解本发明并不限于此。实施例1本发明的培养/诱导方法1)自健康人供体收集外周血Gani)并使用用于血细胞分离的密度梯度溶液从其 分离外周血单核细胞。2)将所得的外周血单核细胞悬浮在AIM-V中。3)将这些外周血单核细胞(8Χ IO6个/4mL)接种在6孔板(SUMIL0N)中。向其添加 1000U/mL IL-2，再向其添加 5μΜ 唑来膦酸(Ζ0ΜΕΤΑ(商标名))禾Π 2 μ g/ml Mart-I (A27L, 序列ELAGIGILTV)作为肽，然后在37°C和5% CO2浓度条件下开始培养。4)进一步地，在培养开始后添加10%量的AB血清。5)根据细胞的增殖，添加含有1000U/mL IL-2的AIM-V和AB血清，然后培养14天。6)如上所述培养7天或14天后获得的细胞群体中，疾病抗原特异的CD8阳性T细 胞的百分数和表达TCRV γ 9的细胞的百分数使用抗CD8抗体(BD Pharmingen)、T-Select HLA-A * (^OlMart-IjTetramerELAGIGILTV(MBL)、抗 TCRV γ 9 抗体(Beckman Coulter)和抗 CD3抗体(Beckman Coulter)通过荧光活化的细胞分选仪(下文中称为FACS ；EpicsXL-MCL ADC, Beckman Coulter)测定。通过测定获得的值如下所示。[表 1]培养第7天和第14天时单核细胞中含有的疾病抗原特异的CD8阳性T细胞的百
分数(％ )
权利要求
1.同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ τ细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血和培养所得到的外周血。
2.根据权利要求1的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ T细胞的方法，其中添加疾 病抗原和氨基二膦酸的步骤在培养的第1日实施。
3.根据权利要求1或2的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδΤ细胞的方法，其中氨 基二膦酸是帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、其盐和/或其 水合物。
4.根据权利要求1至3任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ T细胞的方法， 其中疾病抗原是癌抗原。
5.根据权利要求1至4任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ T细胞的方法， 其中同时添加疾病抗原和氨基二膦酸。
6.医药品，其包含通过权利要求1至5任一项的方法获得的疾病抗原特异的CTL和 Y δ T细胞。
7.治疗/预防方法，其包括施与通过权利要求1至5任一项的方法获得的疾病抗原特 异的CTL和γ δ T细胞。
全文摘要
本申请公开了简便且有效地在一个培养步骤中培养疾病抗原特异的CTL和γδT细胞的方法；以及使用通过所述方法产生的细胞的医药品和治疗/预防方法。收集血液并且自该血液分离外周血单核细胞。在培养开始时向外周血单核细胞添加氨基二膦酸和疾病抗原，通过进行预定期间的细胞培养来同时增殖/诱导疾病抗原特异的CTL和γδT细胞直至细胞数达到对于疾病治疗有效的值。由此产生的CTL和γδT细胞用于治疗。
文档编号A61K35/14GK102137925SQ20098013342
公开日2011年7月27日 申请日期2009年6月30日 优先权日2008年7月1日
发明者富山舞, 武藤真人, 贽田美江 申请人:迈世耐特股份公司
技术领域：
本发明涉及在癌治疗中同时且有效地培养抗原特异的CTL和γ δτ细胞的技术。 更具体地，本发明涉及使用该培养技术培养的细胞的医药用途。
背景技术：
近来，免疫细胞疗法作为包括癌症在内的难治性疾病的新疗法而受到关注。免疫 细胞疗法是收集并活化患者自身的免疫细胞，特别是白细胞，然后再将它们返回患者体内 来人工地增强免疫力。与常规的抗癌剂治疗等比较，这种疗法具有减少的副作用的优点。作为免疫细胞疗法，活化自体淋巴细胞的疗法已经普及，所述疗法涉及体外用淋 巴因子实施抗原非特异地活化淋巴细胞，然后将它们返回身体；但是，需要获得利用细胞毒 性T淋巴细胞(下文中称为CTL)的疗法，其中所述细胞毒性T淋巴细胞具有更强的细胞毒 活性并特异地识别和破坏病变。这里，作为当前尝试的利用CTL的治疗法，例如采用直接将癌抗原肽等施与患者 的方法；但是，在这种情况下，由于患者通常具有低下的免疫力，其诱导CTL的能力需要提 高。因此，有树状细胞疫苗疗法等，所述疗法涉及将抗原与抗原呈递细胞如树状细胞(下文 中也称为DC)等接触，并因此强烈地引起细胞呈递抗原，由DC在体内诱导疾病抗原特异的 CTL。下面显示的是一些目前诱导疾病抗原特异的CTL的典型方法。例如，在非专利文献1和2中，将9-mer肽如特定疾病抗原的表位添加至外周血单 核细胞来尝试由其诱导CTL。此外，在非专利文献3和4中，从外周血单核细胞获得DC并向 其添加抗原肽，来赋予抗原呈递功能；将自外周血淋巴细胞分离的CD8阳性T细胞与所获得 的DC —同培养来诱导疾病抗原特异的CTL。进一步地，在非专利文献5中，使用获自造血前体细胞的DC和抗原肽进行DC接 种，然后将向其添加了抗原的单核细胞来源的DC与分离自外周血单核细胞的CD8阳性T细 胞共培养以诱导抗原特异的CTL。从上述例子中它们的用途可以获知，在其它抗原呈递细胞中，树状细胞具有高的 抗原呈递能力并且能够诱导疾病抗原特异的CTL，因此，正在进行获得它们的技术开发。但是，为了获得用于树状细胞接种的树状细胞，通常需要收集人外周血，从外周血 分离称为单核细胞的细胞，并在添加IL-4、GM-CSF等后培养它们。该方法繁琐并且目前存 在这样的问题，取决于细胞培养技术人员的水平，所培养细胞的数量和功能是变化的。Y δ T细胞是非肽抗原活化的细胞，是负责天然免疫的细胞；近来发现这些细胞 对癌细胞具有MHC非限制性细胞毒活性(非特异的活性)。因此，研究了使用这些Y δΤ细 胞的强抗癌活性的免疫疗法。由于Y δ T细胞通过识别非肽抗原而活化，它们可以被例如烷基胺或二膦酸作为 非肽抗原刺激，从而活化和/或增殖；已经在体外引起分离自外周血的Y ST细胞识别非肽 抗原来研究其活化和/或增殖(例如，非专利文献6)。
但是，问题是γ δ T细胞通常在外周血中以仅1至5%的量存在，收集少量的血液 然后从其活化和/或增殖Y ST细胞不能确保Y δT细胞的纯度和数量足够用于治疗。增 加自患者收集的血液量来确保Y ST细胞的纯度和数量足够用于治疗也有对患者是一个 很大的负担的问题。专利文献1也公开了通过添加二膦酸至外周血单核细胞来活化和/或增殖Y δ T 细胞的方法。因此更有效的细胞培养和利用对免疫细胞疗法是重要的；现在正在进行多种多样 的方法和技术的研发。此外，在免疫细胞疗法中现在是主要培养一种类型的细胞并用于治疗；但是，考虑 到如上所述的例如疾病抗原特异的CTL以MHC限制性方式，例如，特异地针对MHC I类呈递 的抗原，攻击目标细胞或组织；和、S T细胞以MHC非限制性方式攻击细胞或组织，可以混 合多种细胞并用于治疗。但是，在实践中，对于培养多种类型的免疫细胞用于治疗，不得不对多种细胞类型 同时平行地实施培养步骤。适用于每一类型细胞的培养条件相互间不相同；如果使用常规 的适用于一种类型细胞的培养方法，它将非常难于例如同时且有效地培养足够数量的疾病 抗原特异的CTL和γ δ T细胞来发挥治疗效果；目前还没有这样的有效培养方法和诱导方 法。现有技术文献专利文献专利文献1 :W0 2006/006720非专利文献非专利文献 1 =Sugiyama H.等人，Cancer Immunol. Immunother.，2002 年 12 月； 51(11-12) :614-20. Epub，2002 年 10 月 18 日。非专利文献2 =Appella E.等人，J. Immunol.，1995 年 3 月 1 日；154(5) :2257-65非专利文献3 =Fujita S.等人，Blood，2000 年 1 月 1 日；95(1) :286_93。非专利文献4 =Yasukawa M.等人，Clin. Cancer Res.，2002 年 8 月；8(8) 2626-31。非专利文献5 =Palucka AK.等人，J. Exp. Med.，2004 年 6 月 7 日；199 (11) 1503-11，Epub，2004 年 6 月 1 日.非专利文献 6:Fumi Miyagawa 等人，The Journal of Immunology, 2001 ； 166 (9) 5508-5514。发明概述技术问题鉴于上述情形，本发明的课题是在一步培养中同时且有效地诱导和培养足够数量 的疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞用于发挥治疗效果。解决问题的手段本发明人为了解决这些问题进行了多种研究，并发明了本发明。本发明如下。(1)同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法，特征在于，包括以下步骤 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并培养所得到的外周血；( 根据项(1)的同时诱导
4疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中添加疾病抗原和氨基二膦酸的步骤在培养 开始第1日实施；(3)根据项(1)或(2)的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方 法，其中氨基二膦酸是帕米膦酸(pamidronic acid)、阿仑膦酸(alendronic acid)、唑来膦 酸(zoledronic acid)、禾丨J塞膦酸(risedronic acid)、伊班膦酸(ibandronic acid)、英卡 膦酸(incadronic acid)、其盐和/或其水合物；(4)根据项(1)至( 任一项的同时诱导 疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中疾病抗原是癌抗原；(5)根据项(1)至(4) 任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的方法，其中同时添加疾病抗原和氨 基二膦酸；(6)医药品，其包含通过项⑴至(5)任一项的方法获得的疾病抗原特异的CTL 和Y δΤ细胞；和(7)治疗/预防方法，其包括施与通过项(1)至( 任一项的方法获得的 疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞。作为研究结果，本发明人发现在外周血中通过氨基二膦酸活化的Y δ T细胞增殖 并且这些活化和增殖的Y S T细胞显示发挥APC(抗原呈递细胞)的功能，其呈递疾病抗原 并也促进疾病抗原特异的CTL的诱导，从而完成了本发明。发明的效果在用于疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的培养和诱导的常规方法中，通过多个 步骤获得所希望的细胞和然后开始培养；但是，本发明在一步培养中能够同时且有效地提 供疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞，无需自外周血分离细胞；并且甚至能够获得含有大量 治疗效果极好的细胞的细胞群体。通过这种诱导方法获得的疾病抗原特异的CTL和γ δ T 细胞的混合细胞群体能够提供较施与单一种免疫细胞作为医药品的常规治疗而言更高效 的治疗。特别地，至今为止CTL的诱导需要以下步骤(1)从血液分离单核细胞；(2)添加 细胞因子来诱导树状细胞；(3)用抗原脉冲树状细胞；和(4)共培养抗原脉冲的树状细胞和 淋巴细胞来诱导CTL。但是，使用本发明能够省略诱导树状细胞的步骤，这能减轻工作量，也 能减少污染风险，并能进一步地将树状细胞诱导期间(约7天)缩短。实施发明的最佳方案以下对本发明的实施方案进行说明。<第一实施方案本发明的同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法>本发明的同时诱导疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的方法(下文中也简称为 “本发明的诱导方法”)的特征在于包括以下步骤，添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并 培养所得到的外周血。虽然一直以来在相同培养步骤中获得治疗有效量的疾病抗原特异的CTL和Y δ T 细胞是非常困难的，但是本发明的诱导方法使得这些类型的细胞通过上述步骤简单高效地获得。根据本发明的诱导方法，将外周血中的Y δ T细胞用氨基二膦酸活化和增殖，并 且这些活化且增殖的Y S T细胞也显示发挥APC的功能，其呈递疾病抗原并诱导疾病抗原 特异的CTL。此外，具有APC功能的γ δ T细胞不仅只是作为APC发挥作用，而且甚至在疾 病抗原特异的CTL增殖后γ δ T细胞仍继续增殖，从而使得能获得发挥治疗效果的足够量 的这两种类型的细胞。以下描述本发明的诱导方法的具体操作。
1)收集血液来提供外周血。所需要的量是15至25mL。这个量使得能够合适地培 养血液。但是，不将培养开始时的外周血的足够量限制在此范围，并且由于较大量的血液收 集增加了收集的疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的数量，优选地收集较大量的血液，条件 是对所收集血液的供体的负担小。2)通过例如密度梯度离心获得外周血单核细胞。能够获得的外周血单核细胞数量 是从15至25mL外周血获得约1至2X IO7个外周血单核细胞。3)将2)中获得的外周血单核细胞悬浮在培养基AIM-V(Invitrogen)中。本文中 将悬浮了外周血单核细胞的溶液称为细胞悬液。除了上述培养基之外，也可以使用市售的 用于细胞培养的培养基如RPMI-1640培养基(Invitrogen) ,Dulbecco改良的Eagle培养基 (Invitrogen ；下文中称为DMEM)、或Iscove培养基(Invitrogen ；下文中称为IMEM)。4)将幻中获得的细胞悬液接种在烧瓶、袋或板中。5)将氨基二膦酸以浓度0. 05至100 μ Μ,优选地0. 1至30 μ M添加至接种在烧瓶、 袋或板中的外周血单核细胞。本文中，二膦酸是焦磷酸的类似物，并且是焦磷酸骨架P-O-P的0(氧原子)被 C(碳原子)替换后的化合物(P-C-P)。二膦酸通常用作骨质疏松的治疗药。氨基二膦酸是 指二膦酸中具有N(氮原子)的化合物。例如，不特别限制在本发明中使用的氨基二膦酸； 可以使用在WO 2006/006720和W02007/(^9689中公开的氨基二膦酸等。其具体例子包括 帕米膦酸、其盐和/或它们的水合物；阿仑膦酸、其盐和/或它们的水合物；和唑来膦酸、其 盐和/或它们的水合物。氨基二膦酸的浓度，对帕米膦酸、其盐和/或它们的水合物优选地 是1至30 μ M，对阿仑膦酸、其盐和/或它们的水合物优选地是1至30 μ Μ，和对唑来膦酸、 其盐和/或它们的水合物优选地是0. 1至10 μ Μ。在本文中，以添加5 μ M唑来膦酸作为例 子。6)在添加幻中的氨基二膦酸时，一同添加疾病抗原。在本文中，“疾病”是例如癌 症或感染症。不特别地限制癌症，包括任意癌症；例如难治性癌症。感染症的例子包括病毒 感染症如AIDS或者乙型或丙型肝炎、细胞感染、细菌感染、真菌感染或原虫感染。作为抗原的形式，根据需要可以使用肽、蛋白质等。也可以使用癌细胞或感染细胞 的细胞裂解物、凋亡细胞、坏死细胞和它们的热处理产物等。抗原可以是来自患者(例如，通过外科手术从患者分离出的肿瘤组织等)的、或者 是合成的。与使用自患者自身癌组织等收获癌抗原相比较，使用合成肽能够减轻患者的负 担。添加的量，如果是肽的话，添加0. 02 M 2 μ g/ml左右。例如，添加2μ g/ml。不特别地限制氨基二膦酸和疾病抗原的添加顺序，它们可以同时添加，或者先添 加任一者；但是，优选同时添加。6)此外，向上述培养基中添加IL-2至浓度为50至2000U/mL，更优选地400至 1000U/mL。7)添加IL-2后，在；34至38°C，更优选地在37°C，在2至10%，更优选地5% CO2 存在下培养。此时，根据所培养细胞的数量，适当地添加培养基。此外，随着培养基的增加， 适当地添加IL-2至浓度为50至2000U/mL，更优选地400至1000U/mL。8)进一步地，向上述培养液添加0. 1至20%量的血清。作为血清，可以使用例如胎牛血清(下文中称为FCQ、AB血清或者自体血浆。以这种方式，当培养期间是7天或7天以上时，能够以高纯度获得包含疾病抗原特 异的CTL和γ δ T细胞的细胞群体；但是，培养优选地进行约14天，以进一步地增加细胞数。在上述培养步骤期间优选地将血浆添加至培养液。添加时间大概是在培养开始后 0至100小时，使得能够满意地进行培养。<第二实施方案包含疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的医药品>本发明的医药品是包含疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的医药品，是在培养开 始时通过添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血而进行培养获得的医药品。现有的免疫细胞疗法使用单一类型的细胞，或者通过在施用时混合分别培养的细 胞后或同时地添加分别培养的细胞而使用多种类型的细胞。相反，本发明的医药品是通过本发明的诱导方法同时培养疾病抗原特异的CTL和
YS T细胞，这使得能够非常简单地获得较多的细胞数。使用此类医药品具有这样的优点， 它比常规使用的单一类型的免疫细胞具有更高的治疗功效，因为疾病抗原特异的CTL和
YST细胞之间的协同作用。下面具体描述本发明的医药品。1)通过本发明的培养方法获得的细胞通过离心法等回收。2)将回收的细胞用洗净液洗净。洗净液优选地是与细胞渗透压相等的等渗液，并 且更优选地是能够用于医药品的液体。在本文中，考虑到它施用至患者，优选使用例如生理 盐水或PBS (磷酸盐缓冲的生理盐水)。3)洗净后获得的主要含有疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的淋巴细胞群体通过 离心法等回收，并悬浮于用作医药品的液体例如生理盐水中，以制备本发明的医药品。在本 文中，用于悬浮的液体的用量根据施用的细胞数和施用方法进行适当的调整。本发明的医药品中所使用的主要含有疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的淋巴细 胞群体的细胞数根据施用方法、疾病的类型、患者的症状等合适地选择；但是，它通常优选 地是IO8至IO12个/人，更优选地IO9个/人或以上。4)随后，将它们悬浮在生理盐水中以提供本发明的医药品。本发明的医药品能够 用作癌症或感染症的治疗剂/预防剂。此处，在用作癌症的治疗剂/预防剂的情形，也可以将本发明的医药品与细胞因 子如IL-2或IL-12组合。另外，在作为病毒感染症的治疗剂/预防剂的情形，也可以将本发明的医药品与 干扰素-Y (IFN-y)等组合。5)施用方法可以是例如静脉内、皮内、皮下等的注射；直接注射入病变部位；或者 通过点滴而全身施用。此外，也可以通过病变部位附近的动脉注入。<第三实施方案施与疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的治疗/预防方法>本发明的治疗/预防方法是涉及施与疾病抗原特异的CTL和Y δ T细胞的治疗/ 预防方法，其中所述疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞是通过在培养开始时添加疾病抗原 和氨基二膦酸至外周血来培养而获得的。本发明的治疗/预防方法具体说明如下。
1)通过本发明的培养方法获得的细胞通过离心法等收集。2)用洗净液洗收集的细胞。洗净液优选地是与细胞渗透压相等的等渗液，并且更 优选地是能够用于医药品的液体。在本文中，考虑到它施用至患者，优选使用例如生理盐水 或PBS (磷酸盐缓冲的生理盐水)。3)洗净后获得的主要含有疾病抗原特异的CTL和γ δ T细胞的淋巴细胞群体通 过离心法等回收，并悬浮于用作医药品的液体例如生理盐水中，以制备用于本发明的治疗/ 预防方法中的细胞悬液。此时，用于悬浮的液体的用量根据施用的细胞数和施用方法进行 适当的调整。用于本发明的治疗/预防方法中的主要含有疾病抗原特异的CTL和、δΤ细胞的 淋巴细胞群体的细胞数根据施用方法、疾病的类型、患者的症状等合适地选择；但是，它通 常优选地是IO8至IO12个/人，更优选地IO9个/人或以上。4)随后，将它们悬浮在生理盐水中以提供细胞悬液。此处，在用于治疗或预防癌症的情形，也可以将本发明的医药品与细胞因子如 IL-2 或 IL-12 组合。另外，在用于治疗或预防病毒感染症的情形，也可以将本发明的医药品与干扰 素1 (IFN-y)等组合。5)施用方法可以是例如静脉内、皮内、皮下等的注射；直接注射入病变部位；或者 通过点滴而全身施用。此外，也可以通过病变部位附近的动脉注入。以下参考实施例详细地描述本发明。但是，应理解本发明并不限于此。实施例1本发明的培养/诱导方法1)自健康人供体收集外周血Gani)并使用用于血细胞分离的密度梯度溶液从其 分离外周血单核细胞。2)将所得的外周血单核细胞悬浮在AIM-V中。3)将这些外周血单核细胞(8Χ IO6个/4mL)接种在6孔板(SUMIL0N)中。向其添加 1000U/mL IL-2，再向其添加 5μΜ 唑来膦酸(Ζ0ΜΕΤΑ(商标名))禾Π 2 μ g/ml Mart-I (A27L, 序列ELAGIGILTV)作为肽，然后在37°C和5% CO2浓度条件下开始培养。4)进一步地，在培养开始后添加10%量的AB血清。5)根据细胞的增殖，添加含有1000U/mL IL-2的AIM-V和AB血清，然后培养14天。6)如上所述培养7天或14天后获得的细胞群体中，疾病抗原特异的CD8阳性T细 胞的百分数和表达TCRV γ 9的细胞的百分数使用抗CD8抗体(BD Pharmingen)、T-Select HLA-A * (^OlMart-IjTetramerELAGIGILTV(MBL)、抗 TCRV γ 9 抗体(Beckman Coulter)和抗 CD3抗体(Beckman Coulter)通过荧光活化的细胞分选仪(下文中称为FACS ；EpicsXL-MCL ADC, Beckman Coulter)测定。通过测定获得的值如下所示。[表 1]培养第7天和第14天时单核细胞中含有的疾病抗原特异的CD8阳性T细胞的百
分数(％ )
权利要求
1.同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ τ细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血和培养所得到的外周血。
2.根据权利要求1的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ T细胞的方法，其中添加疾 病抗原和氨基二膦酸的步骤在培养的第1日实施。
3.根据权利要求1或2的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδΤ细胞的方法，其中氨 基二膦酸是帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、其盐和/或其 水合物。
4.根据权利要求1至3任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ T细胞的方法， 其中疾病抗原是癌抗原。
5.根据权利要求1至4任一项的同时诱导疾病抗原特异的CTL和γδ T细胞的方法， 其中同时添加疾病抗原和氨基二膦酸。
6.医药品，其包含通过权利要求1至5任一项的方法获得的疾病抗原特异的CTL和 Y δ T细胞。
7.治疗/预防方法，其包括施与通过权利要求1至5任一项的方法获得的疾病抗原特 异的CTL和γ δ T细胞。
全文摘要
本申请公开了简便且有效地在一个培养步骤中培养疾病抗原特异的CTL和γδT细胞的方法；以及使用通过所述方法产生的细胞的医药品和治疗/预防方法。收集血液并且自该血液分离外周血单核细胞。在培养开始时向外周血单核细胞添加氨基二膦酸和疾病抗原，通过进行预定期间的细胞培养来同时增殖/诱导疾病抗原特异的CTL和γδT细胞直至细胞数达到对于疾病治疗有效的值。由此产生的CTL和γδT细胞用于治疗。
文档编号A61K35/14GK102137925SQ20098013342
公开日2011年7月27日 申请日期2009年6月30日 优先权日2008年7月1日
发明者富山舞, 武藤真人, 贽田美江 申请人:迈世耐特股份公司
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