纳米晶体纳米乳剂的制作方法
专利名称：纳米晶体纳米乳剂的制作方法
纳米晶体纳米乳剂本发明涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其应用于生物学和医药领域内。本发 明还涉及这些制剂的制备方法及其应用，特别是在医学成像中的应用。[现有技术]纳米晶体，例如发光半导体纳米晶体，也称作量子颗粒或量子点，具有显著的光化 学和光物理学特性以及良好的稳定性，这意味着其应用在生物学和医药领域中是极为有益 的。因此，在大量应用中提出了用纳米晶体有利地替代通常使用的有机化合物，例如 特别是在如下应用中-使用氧化铁纳米晶体的磁共振成像(MRI)(Wagner, V.等人，The emerging nanomedicine landscape, Nat Biotechnol. ,2006,24(10) :ρ·1211-12171)；-使用发光半导体纳米晶体的荧光成像和光疗法(Azzazy，H.Μ. Ε.， Μ. Μ. H. Mansour, and S. C. Kazmierczak, From diagnostics totherapy :prospects of quantum dots, Clinical Biochemistry, 2007,40 :p.917-927)；-热疗法禾口 / 或光学成像(Loo, C.等人，Immunotargetednanoshells for integrated cancer imaging and therapy. NanoLett. , 2005, 5 (4) :p. 709-711) JlKiSi用金 纳米晶体的 身寸线(Kim,D.等人,Antibiofouling polymer-coated gold nanoparticles as acontrast agent for in vivo X-ray computed tomography imaging, J. Am. Chem. Soc.，2007，129 :ρ·7661-7665)。这些应用一般涉及对患者给予纳米晶体，例如通过注射。因此，必须提供这些稳定 和适合于注射的、特别是生物相容性的纳米晶体制剂。在合成后，一般得到有机配体稳定的形式的纳米晶体，这使得能够控制其生长。可 以通过用在一端上对纳米晶体表面具有亲和力、而在另一端上对水介质具有亲和力的双功 能配体替代所述配体，从而在生物相容性水介质中增溶纳米晶体。然而，得到的水性制剂仍然不稳定。实际上，配体与存在于介质中的其他分子竞争 且ρΗ、温度或乃至存在的氧的任意改变都可能使溶液不稳定并且导致纳米晶体絮凝。就这 些纳米晶体而言，还观察到不需要的蛋白质或DNA非特异性吸收。最终，纳米晶体的内在特 性可以在这种类型的制剂中变性，例如影响发光半导体纳米晶体的量子收率。为了更好地稳定纳米晶体和保护其特性，建议将它们包囊在不同系统中，例如一 层两亲配体、无机壳或乃至较大的纳米系统。因此，Schroeder等人描述了将发光半导体纳米晶体包囊在脂质胶束中folate mediated tumor cell uptake of quantum dotsentrapped in lipid nanoparticles, J. Control. Release, 2007，124 :p. 28-340通过在将成分在氯仿中混合后离心、蒸发溶剂和 重新混悬于水中得到纳米粒，称作脂质滴(Iipodots)。就此而言，纳米粒的大小分布是极大 的，60-200nm。认为发光半导体纳米晶体实际上被包囊在胶束中，然后形成较大的聚集物， 这可以解释观察到的荧光明显受到抑制(-98. 5% )。此外，S.K. Mandal 等人(Langmuir 2005，21，4175-4179)描述了将氧化铁纳米晶体和荧光半导体纳米晶体联合包囊(jointencapsulation)在辛烷纳米乳剂中。然而，这种 类型的乳剂因存在辛烷而不是生物相容性的。[技术问题]因此，需要提供适合于生物学和医药领域、特别是医学成像领域中特定需求的纳 米晶体制剂。更具体地说，需求生物相容性、稳定和保护纳米晶体内在特性的制剂。最终，提供能够在体内成像或治疗区域靶向生物分布的制剂是有益的。[发明概述]本发明提出了，将纳米晶体包囊在具有特别稳定配方并且仅使用对人体注射批准 的成分制备的纳米乳剂的油分散相中。本发明的第一个方面还涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其包含连续的 水相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质 (Solubilising lipid)，且其中水相包含助表面活性剂。纳米晶体特别由金属或氧化物形成并且可以是导体或半导体。本发明特别涉及发 光纳米晶体。两亲脂质优选是磷脂。增溶脂质有利地包含至少一种脂肪酸甘油酯且优选至少一 种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。此外，纳米晶体制剂的油相还可以包含至少 一种油。助表面活性剂优选包含至少一种环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元形成 的链。助表面活性剂有利地选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和 聚乙二醇醚类和脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。根据一个实施方案，纳米晶体制剂包含官能化的分散的相，例如通过接枝两亲脂 质或助表面活性剂于生物配体。本发明第二个方面涉及纳米晶体制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水 相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤(i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和适量纳米晶体的油相；(ii)制备包含助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力的作用下将油相分散在水相中，以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。剪力作用优选通过超声处理产生。有利地通过将全部或一些成分放入适合溶剂的 溶液中且然后蒸发溶剂制备油相。本发明的最后一个方面涉及本发明纳米晶体制剂在医学成像、热疗法或光疗法中 的应用。特别地，纳米乳剂有利地显示贮存过程中(> 3个月)极佳的胶体稳定性和良好 的包囊纳米晶体的能力以及在分散相中增加的浓度。在应用过程中，在将纳米粒静脉内注 入有机体(隐身特征(stealthycharacter))后还观察到长血浆寿命。一般而言，本发明的纳米乳剂适用于生物学和医学领域内，特别是通过注射，因为 可以使用对人体注射批准的成分制备它。在本申请中，纳米乳剂能够通过控制纳米乳剂作为载体的生物分布来管理纳米晶体的生物分布。由此能够避免纳米晶体被免疫系统快速识别与产生的血液循环中的寿命减 少。分散相形成的纳米粒在静脉内注射后具有长血浆寿命。这一结果可能因纳米乳剂 的低ζ电位(zeta potential)导致。ζ电位是影响纳米乳剂的生物分布的参数，由此在 接触细胞时，正ζ电位由此促进胞吞作用。纳米乳剂的分散相可易于在表面上被生物配体官能化，以便使纳米晶体输送逐步 靶向于被成像或治疗的组织。由于连续水相中助表面活性剂的浓度增加，所以纳米乳剂还显示具有极小直径的 分散相。包囊具有3-12nm平均直径的纳米晶体的纳米乳剂由此典型地具有小于50nm且优 选30-40nm的平均直径。所述纳米乳剂有利地具有增加浓度的分散相，例如相对于纳米乳剂重量的大于 10%,且特别是20-40%重量。最终，可以通简单生产方法得到提出的纳米乳剂，这种生产方法是低廉的、可以快 速进行并且是稳定的，因为它对所用制剂的变化不敏感。[本发明的公开内容][定义]在本文件的含义中，术语“纳米乳剂”意指具有至少两相的组合物，所述两 相一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是 20-100nm,且最优选 20_70nm(参见文章 C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and Μ. J. Garcia-CeIma, Curr Opin Colloid In，2005，10，102—110)。在本文件的含义中，术语“脂质”表示全部脂肪和油或包含存在于动物脂肪和植物 油中的脂肪酸的物质。它们是主要由碳、氢和氧形成并且具有低于水的密度的疏水或两亲 分子。所述脂质在室温(25°C )可以是固态、为蜡或作为油的液体形式。术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。最常见的是，磷脂 类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。具体的磷脂 类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。术语“卵磷脂”意指磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸酯、甘油和两种脂肪酸形成的脂 质。更广泛地说，它包括从生命来源、植物或动物来源提取的磷脂类，条件是它们主要由磷 脂酰胆碱组成。这些卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物组成。术语“脂肪酸”意指具有至少4个碳原子的碳链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有418 个碳原子(一般是偶数)的碳链。长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且极长链脂肪酸 是具有22个以上碳原子的那些。术语“表面活性剂”意指具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型 和水/油-型界面具有特异性亲和力，使得它们降低这些界面的自由能并且稳定分散的系 统。术语“助表面活性剂”意指与另一种表面活性剂一起起作用以进一步降低界面能 量的表面活性剂。术语“生物配体”意指以特异性方式识别一般细排列在胞表面上的受体的任意分子。
术语“纳米晶体”意指至少一种尺寸小于IOOnm的单晶。目前可得到的纳米晶体通 常是无机物；然而，也可能涉及有机纳米晶体。纳米晶体可以由纯物质或化合物形成。特别 地，它们还可以是金属或金属氧化物。纳米晶体可以是导体或半导体。就半导体材料而言， 通常也涉及量子颗粒(或量子点或乃至qdots)。纳米晶体因其小尺寸而具有如电位阱这样 的性能，它限制电子的三维空间，在该区域中大小相当于电子的德布罗意(de Broglie)波 长，即在半导体中几个纳米。由于这种限制，所以纳米晶体的电子具有不连续的定量能量水 平，其可以通过改变纳米晶体的大小和形状来控制。[乳剂]本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的具体纳米晶体制剂。该乳剂是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相的或多相的，特别是通过在分散相中 包含第二个水相。纳米晶体因其一般的亲脂性亲和力而被纳米乳剂的油分散相包囊。如上所述，目前有益于生物学和医学领域中应用的纳米晶体主要是无机纳米晶 体。特别地，所述无机材料可以是金属，例如金和银；氧化物，例如氧化铁，特别是磁铁 矿石、磁赤铁矿、氧化钆和氧化铪。本发明特别涉及半导体纳米晶体，甚至更具体地说是发光纳米晶体，特别是荧光 纳米晶体。实际上，荧光纳米晶体在成像领域中是极为有用的标记物。发光半导体纳米晶体吸收和/或发射的光的波长不仅依赖于纳米晶体的大小，而 且依赖于半导体纳米晶体的能量隙。因此，选择能量隙相当于指定应用中的有益波长例如 可见光波长或近红外波长的化合物。用于纳米晶体的有益半导体实例特别是CdS、CdSe, CdTe, InP, PbS、Si、CuInS和 InGa半导体。这些材料可以以纯的形式或混合物形式、掺杂形式或芯/壳类形式的纳米晶 体存在，其中纳米晶体芯被壳包衣，例如由ZnS制成。还可以通过不同方法合成它们(通过有机金属、辐射分解、热液、共沉淀、热解或 溶胶-凝胶过程等)并且也可以商购。一般通过携带至少一种疏水链(优选C8 (或以上)烃链)的配体层稳定商购纳米 晶体。这些疏水链配体可以是，例如脂肪酸、硫醇类、膦类、氧化膦、磷酸酯类、膦酸酯类或具 有脂肪链的胺类。它们可以包含一种或多种能够使它们结合纳米晶体的官能团(例如硫辛 酸、低聚膦类等)。所用配体的实例特别是具有3个C8烃链的氧化三辛基膦(TOPO)。或者， 还可以使用具有一般较长单一疏水脂肪链、例如C14-C22链、特别是C16或C18链的配体。能够包囊在本发明纳米乳剂中的纳米晶体的大小没有特别限定，并且根据商购功 能和其他应用限制进行选择。典型地，纳米晶体具有约Inm-lOOnm、优选2nm-20nm的平均直 径。由于增溶脂质在分散相中的应用，从而能够增加两亲脂质的浓度，所以提出的纳 米乳剂能够包囊增加浓度的纳米晶体。因此，能够得到在同一纳米液滴中包囊多个不同或相同纳米晶体的纳米乳剂。不 同纳米晶体的包囊能够提供多功能纳米乳剂。因此，发射不同量和不同波长的光的发光半 导体纳米晶体的包囊能够提供具有光学“条形码”的纳米粒。
纳米晶体的期望的浓度一般依赖于指定应用。典型地，就在乳剂中的终浓度而言， 油相包含0. l-20nmol/g的纳米晶体，例如0. 001_2nmol/g。可以将由疏水配体层稳定的且分散在有机溶剂中的纳米晶体掺入乳剂的油相，然 后蒸发有机溶剂。所用的有机溶剂可以是，例如甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、 DMSO或DMF。为了避免任何痕量的毒性溶剂，可以首先将纳米晶体转入更好耐受的溶剂，例 如己烷。纳米乳剂的油相还可以包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。为了形成稳定纳米乳剂，一般在组合物中必需包括至少一种两亲脂质作为表面活 性剂。表面活性剂的两亲性使油滴在连续水相中稳定。两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自亲脂部分包含具有8-30个 碳原子的直链或支链饱和或不饱和的化合物。它们可以选自磷脂类、胆固醇、溶脂质 (lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂类，并且可以具有天然或 合成来源；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类， 例如在Span 商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；与聚氧化 乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在Tween 商品名下由ICl Americas, Inc.销售的和在 Triton 下由UnionCarbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月 桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬 脂酸酯；能够使用单独或混合物形式的所述表面活性剂。卵磷脂是优选的两亲脂质。在一个具体的实施方案中，全部或部分两亲脂质可以具有反应官能团，例如马来 酰亚胺、硫醇、胺、酯、羟基胺或醛基团。反应官能团的存在使得官能化合物在界面上接枝。 将反应性两亲脂质掺入界面上形成的层，稳定分散相，其中它易于偶合存在于例如水相中 的反应性化合物。一般而言，油相包含0. 01-99%重量、优选5-75%重量、特别是20_60%重量且最 具体的是33-45%重量的两亲脂质。两亲脂质的量有利地有助于控制得到的纳米乳剂的分散相的大小。本发明的乳剂还包含增溶脂质。该化合物的主要任务在于增溶在纳米乳剂油相中 难溶的两亲脂质。增溶脂质是对两亲脂质具有足够亲和力以使其增溶的脂质。增溶脂质优选在室温 下是固体。就两亲脂质是磷脂的情况而言，可能的增溶脂质特别是甘油衍生物，尤其是通过 用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。所用的增溶脂质有利地依赖于所用两亲脂质而被选择。它一般具有类似的化学结 构以便带来期望的增溶。它可以是油或蜡。增溶脂质优选在室温(20°C)下是固体，而在体 温(37 °C )下是液体。优选的增溶脂质，特别是磷脂类，是脂肪酸甘油酯类，特别是饱和脂肪酸甘油酯 类，且特别是包含8-18个碳原子、甚至更优选12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。有 利的是包括不同甘油酯的混合物。优选包括包含至少10%重量的C12脂肪酸、至少5%重量的C14脂肪酸、至少5%重量的C16脂肪酸和至少5%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。优选包括包含0% -20%重量的C8脂肪酸、0% -20%重量的ClO脂肪酸、 10% -70%重量的C12脂肪酸、5% -30%重量的C14脂肪酸、5% -30%重量的C16脂肪酸和 5% -30%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。特别优选由fettef0SS6在商品名Suppocire NC下销售的半合成甘油酯混合 物，其在室温下是固体并且批准应用于人体注射。NSuppocire 型甘油酯类通过直接酯 化脂肪酸和甘油得到。它们是C8-C18饱和脂肪酸的半合成甘油酯类，其中定性-定量组成 如下表所示。上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应受限于具 体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得 到的芯具有增加的内在黏度，未显示结晶性。结晶对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为 它一般导致液滴聚集和/或导致被包囊的分子从液滴中排出。这些特性由此提高了随时间 推移的纳米乳剂物理稳定性和纳米晶体的包囊稳定性。增溶脂质的量随存在于油相中的两亲脂质的类型和量而广泛改变。一般而言，油 相包含1-99%重量、优选5-80%重量且特别是40-75%重量的增溶脂质。表1 来自feittefoss6的Suppocire NC 的脂肪酸组成
权利要求
1.纳米乳剂形式的金属、金属氧化物或半导体纳米晶体制剂，其包含连续的水相和至 少一种分散的油相，其中油相包含至少一种磷脂和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质包含 至少一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯，且其中水相包含助表面活性剂。
2.权利要求1的纳米晶体制剂，其中纳米晶体是发光的。
3.权利要求1或权利要求2的纳米晶体制剂，其中油相还包含至少一种油。
4.权利要求1-3任一项的纳米晶体制剂，其中助表面活性剂包含至少一种环氧乙烷单 元或环氧乙烷和环氧丙烷单元形成的链。
5.权利要求4的纳米晶体制剂，其中助表面活性剂选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰 乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类和脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙 烷嵌段共聚物。
6.权利要求1-5任一项的纳米晶体制剂，其特征在于分散的相被官能化。
7.金属、金属氧化物或半导体纳米晶体制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的 水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤(i)制备包含适量纳米晶体、磷脂和至少一种增溶脂质的油相，所述增溶脂质包含至少 一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯；( )制备包含助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力的作用下将油相分散在水相中，以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
8.权利要求7的制备方法，其中剪力作用通过超声处理产生。
9.权利要求7或权利要求8的制备方法，其中通过将全部或一些成分放入适合的溶剂 中形成溶液且然后蒸发溶剂制备油相。
10.权利要求1-6任一项的纳米晶体制剂，其用于医学成像、热疗法或光疗法。
11.光疗或热疗治疗方法，其包含对有此需要的哺乳动物给予有效治疗量的权利要求 1-6任一项的制剂。
12.诊断方法，其包含给哺乳动物施用权利要求1-6任一项的制剂。
全文摘要
本发明涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其包含连续水相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含助表面活性剂。本发明还涉及所述制剂的生产方法和在医学成像、热疗法或光疗法领域中的应用。
文档编号A61K9/107GK102143764SQ200980134621
公开日2011年8月3日 申请日期2009年8月14日 优先权日2008年8月14日
发明者I·泰克希尔-诺盖斯, M·古泰耶, T·达奥 申请人:原子能及能源替代委员会
纳米晶体纳米乳剂本发明涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其应用于生物学和医药领域内。本发 明还涉及这些制剂的制备方法及其应用，特别是在医学成像中的应用。[现有技术]纳米晶体，例如发光半导体纳米晶体，也称作量子颗粒或量子点，具有显著的光化 学和光物理学特性以及良好的稳定性，这意味着其应用在生物学和医药领域中是极为有益 的。因此，在大量应用中提出了用纳米晶体有利地替代通常使用的有机化合物，例如 特别是在如下应用中-使用氧化铁纳米晶体的磁共振成像(MRI)(Wagner, V.等人，The emerging nanomedicine landscape, Nat Biotechnol. ,2006,24(10) :ρ·1211-12171)；-使用发光半导体纳米晶体的荧光成像和光疗法(Azzazy，H.Μ. Ε.， Μ. Μ. H. Mansour, and S. C. Kazmierczak, From diagnostics totherapy :prospects of quantum dots, Clinical Biochemistry, 2007,40 :p.917-927)；-热疗法禾口 / 或光学成像(Loo, C.等人，Immunotargetednanoshells for integrated cancer imaging and therapy. NanoLett. , 2005, 5 (4) :p. 709-711) JlKiSi用金 纳米晶体的 身寸线(Kim,D.等人,Antibiofouling polymer-coated gold nanoparticles as acontrast agent for in vivo X-ray computed tomography imaging, J. Am. Chem. Soc.，2007，129 :ρ·7661-7665)。这些应用一般涉及对患者给予纳米晶体，例如通过注射。因此，必须提供这些稳定 和适合于注射的、特别是生物相容性的纳米晶体制剂。在合成后，一般得到有机配体稳定的形式的纳米晶体，这使得能够控制其生长。可 以通过用在一端上对纳米晶体表面具有亲和力、而在另一端上对水介质具有亲和力的双功 能配体替代所述配体，从而在生物相容性水介质中增溶纳米晶体。然而，得到的水性制剂仍然不稳定。实际上，配体与存在于介质中的其他分子竞争 且ρΗ、温度或乃至存在的氧的任意改变都可能使溶液不稳定并且导致纳米晶体絮凝。就这 些纳米晶体而言，还观察到不需要的蛋白质或DNA非特异性吸收。最终，纳米晶体的内在特 性可以在这种类型的制剂中变性，例如影响发光半导体纳米晶体的量子收率。为了更好地稳定纳米晶体和保护其特性，建议将它们包囊在不同系统中，例如一 层两亲配体、无机壳或乃至较大的纳米系统。因此，Schroeder等人描述了将发光半导体纳米晶体包囊在脂质胶束中folate mediated tumor cell uptake of quantum dotsentrapped in lipid nanoparticles, J. Control. Release, 2007，124 :p. 28-340通过在将成分在氯仿中混合后离心、蒸发溶剂和 重新混悬于水中得到纳米粒，称作脂质滴(Iipodots)。就此而言，纳米粒的大小分布是极大 的，60-200nm。认为发光半导体纳米晶体实际上被包囊在胶束中，然后形成较大的聚集物， 这可以解释观察到的荧光明显受到抑制(-98. 5% )。此外，S.K. Mandal 等人(Langmuir 2005，21，4175-4179)描述了将氧化铁纳米晶体和荧光半导体纳米晶体联合包囊(jointencapsulation)在辛烷纳米乳剂中。然而，这种 类型的乳剂因存在辛烷而不是生物相容性的。[技术问题]因此，需要提供适合于生物学和医药领域、特别是医学成像领域中特定需求的纳 米晶体制剂。更具体地说，需求生物相容性、稳定和保护纳米晶体内在特性的制剂。最终，提供能够在体内成像或治疗区域靶向生物分布的制剂是有益的。[发明概述]本发明提出了，将纳米晶体包囊在具有特别稳定配方并且仅使用对人体注射批准 的成分制备的纳米乳剂的油分散相中。本发明的第一个方面还涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其包含连续的 水相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质 (Solubilising lipid)，且其中水相包含助表面活性剂。纳米晶体特别由金属或氧化物形成并且可以是导体或半导体。本发明特别涉及发 光纳米晶体。两亲脂质优选是磷脂。增溶脂质有利地包含至少一种脂肪酸甘油酯且优选至少一 种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。此外，纳米晶体制剂的油相还可以包含至少 一种油。助表面活性剂优选包含至少一种环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元形成 的链。助表面活性剂有利地选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和 聚乙二醇醚类和脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。根据一个实施方案，纳米晶体制剂包含官能化的分散的相，例如通过接枝两亲脂 质或助表面活性剂于生物配体。本发明第二个方面涉及纳米晶体制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水 相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤(i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和适量纳米晶体的油相；(ii)制备包含助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力的作用下将油相分散在水相中，以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。剪力作用优选通过超声处理产生。有利地通过将全部或一些成分放入适合溶剂的 溶液中且然后蒸发溶剂制备油相。本发明的最后一个方面涉及本发明纳米晶体制剂在医学成像、热疗法或光疗法中 的应用。特别地，纳米乳剂有利地显示贮存过程中(> 3个月)极佳的胶体稳定性和良好 的包囊纳米晶体的能力以及在分散相中增加的浓度。在应用过程中，在将纳米粒静脉内注 入有机体(隐身特征(stealthycharacter))后还观察到长血浆寿命。一般而言，本发明的纳米乳剂适用于生物学和医学领域内，特别是通过注射，因为 可以使用对人体注射批准的成分制备它。在本申请中，纳米乳剂能够通过控制纳米乳剂作为载体的生物分布来管理纳米晶体的生物分布。由此能够避免纳米晶体被免疫系统快速识别与产生的血液循环中的寿命减 少。分散相形成的纳米粒在静脉内注射后具有长血浆寿命。这一结果可能因纳米乳剂 的低ζ电位(zeta potential)导致。ζ电位是影响纳米乳剂的生物分布的参数，由此在 接触细胞时，正ζ电位由此促进胞吞作用。纳米乳剂的分散相可易于在表面上被生物配体官能化，以便使纳米晶体输送逐步 靶向于被成像或治疗的组织。由于连续水相中助表面活性剂的浓度增加，所以纳米乳剂还显示具有极小直径的 分散相。包囊具有3-12nm平均直径的纳米晶体的纳米乳剂由此典型地具有小于50nm且优 选30-40nm的平均直径。所述纳米乳剂有利地具有增加浓度的分散相，例如相对于纳米乳剂重量的大于 10%,且特别是20-40%重量。最终，可以通简单生产方法得到提出的纳米乳剂，这种生产方法是低廉的、可以快 速进行并且是稳定的，因为它对所用制剂的变化不敏感。[本发明的公开内容][定义]在本文件的含义中，术语“纳米乳剂”意指具有至少两相的组合物，所述两 相一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是 20-100nm,且最优选 20_70nm(参见文章 C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and Μ. J. Garcia-CeIma, Curr Opin Colloid In，2005，10，102—110)。在本文件的含义中，术语“脂质”表示全部脂肪和油或包含存在于动物脂肪和植物 油中的脂肪酸的物质。它们是主要由碳、氢和氧形成并且具有低于水的密度的疏水或两亲 分子。所述脂质在室温(25°C )可以是固态、为蜡或作为油的液体形式。术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。最常见的是，磷脂 类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。具体的磷脂 类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。术语“卵磷脂”意指磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸酯、甘油和两种脂肪酸形成的脂 质。更广泛地说，它包括从生命来源、植物或动物来源提取的磷脂类，条件是它们主要由磷 脂酰胆碱组成。这些卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物组成。术语“脂肪酸”意指具有至少4个碳原子的碳链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有418 个碳原子(一般是偶数)的碳链。长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且极长链脂肪酸 是具有22个以上碳原子的那些。术语“表面活性剂”意指具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型 和水/油-型界面具有特异性亲和力，使得它们降低这些界面的自由能并且稳定分散的系 统。术语“助表面活性剂”意指与另一种表面活性剂一起起作用以进一步降低界面能 量的表面活性剂。术语“生物配体”意指以特异性方式识别一般细排列在胞表面上的受体的任意分子。
术语“纳米晶体”意指至少一种尺寸小于IOOnm的单晶。目前可得到的纳米晶体通 常是无机物；然而，也可能涉及有机纳米晶体。纳米晶体可以由纯物质或化合物形成。特别 地，它们还可以是金属或金属氧化物。纳米晶体可以是导体或半导体。就半导体材料而言， 通常也涉及量子颗粒(或量子点或乃至qdots)。纳米晶体因其小尺寸而具有如电位阱这样 的性能，它限制电子的三维空间，在该区域中大小相当于电子的德布罗意(de Broglie)波 长，即在半导体中几个纳米。由于这种限制，所以纳米晶体的电子具有不连续的定量能量水 平，其可以通过改变纳米晶体的大小和形状来控制。[乳剂]本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的具体纳米晶体制剂。该乳剂是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相的或多相的，特别是通过在分散相中 包含第二个水相。纳米晶体因其一般的亲脂性亲和力而被纳米乳剂的油分散相包囊。如上所述，目前有益于生物学和医学领域中应用的纳米晶体主要是无机纳米晶 体。特别地，所述无机材料可以是金属，例如金和银；氧化物，例如氧化铁，特别是磁铁 矿石、磁赤铁矿、氧化钆和氧化铪。本发明特别涉及半导体纳米晶体，甚至更具体地说是发光纳米晶体，特别是荧光 纳米晶体。实际上，荧光纳米晶体在成像领域中是极为有用的标记物。发光半导体纳米晶体吸收和/或发射的光的波长不仅依赖于纳米晶体的大小，而 且依赖于半导体纳米晶体的能量隙。因此，选择能量隙相当于指定应用中的有益波长例如 可见光波长或近红外波长的化合物。用于纳米晶体的有益半导体实例特别是CdS、CdSe, CdTe, InP, PbS、Si、CuInS和 InGa半导体。这些材料可以以纯的形式或混合物形式、掺杂形式或芯/壳类形式的纳米晶 体存在，其中纳米晶体芯被壳包衣，例如由ZnS制成。还可以通过不同方法合成它们(通过有机金属、辐射分解、热液、共沉淀、热解或 溶胶-凝胶过程等)并且也可以商购。一般通过携带至少一种疏水链(优选C8 (或以上)烃链)的配体层稳定商购纳米 晶体。这些疏水链配体可以是，例如脂肪酸、硫醇类、膦类、氧化膦、磷酸酯类、膦酸酯类或具 有脂肪链的胺类。它们可以包含一种或多种能够使它们结合纳米晶体的官能团(例如硫辛 酸、低聚膦类等)。所用配体的实例特别是具有3个C8烃链的氧化三辛基膦(TOPO)。或者， 还可以使用具有一般较长单一疏水脂肪链、例如C14-C22链、特别是C16或C18链的配体。能够包囊在本发明纳米乳剂中的纳米晶体的大小没有特别限定，并且根据商购功 能和其他应用限制进行选择。典型地，纳米晶体具有约Inm-lOOnm、优选2nm-20nm的平均直 径。由于增溶脂质在分散相中的应用，从而能够增加两亲脂质的浓度，所以提出的纳 米乳剂能够包囊增加浓度的纳米晶体。因此，能够得到在同一纳米液滴中包囊多个不同或相同纳米晶体的纳米乳剂。不 同纳米晶体的包囊能够提供多功能纳米乳剂。因此，发射不同量和不同波长的光的发光半 导体纳米晶体的包囊能够提供具有光学“条形码”的纳米粒。
纳米晶体的期望的浓度一般依赖于指定应用。典型地，就在乳剂中的终浓度而言， 油相包含0. l-20nmol/g的纳米晶体，例如0. 001_2nmol/g。可以将由疏水配体层稳定的且分散在有机溶剂中的纳米晶体掺入乳剂的油相，然 后蒸发有机溶剂。所用的有机溶剂可以是，例如甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、 DMSO或DMF。为了避免任何痕量的毒性溶剂，可以首先将纳米晶体转入更好耐受的溶剂，例 如己烷。纳米乳剂的油相还可以包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质。为了形成稳定纳米乳剂，一般在组合物中必需包括至少一种两亲脂质作为表面活 性剂。表面活性剂的两亲性使油滴在连续水相中稳定。两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自亲脂部分包含具有8-30个 碳原子的直链或支链饱和或不饱和的化合物。它们可以选自磷脂类、胆固醇、溶脂质 (lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂类，并且可以具有天然或 合成来源；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类， 例如在Span 商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；与聚氧化 乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在Tween 商品名下由ICl Americas, Inc.销售的和在 Triton 下由UnionCarbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月 桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬 脂酸酯；能够使用单独或混合物形式的所述表面活性剂。卵磷脂是优选的两亲脂质。在一个具体的实施方案中，全部或部分两亲脂质可以具有反应官能团，例如马来 酰亚胺、硫醇、胺、酯、羟基胺或醛基团。反应官能团的存在使得官能化合物在界面上接枝。 将反应性两亲脂质掺入界面上形成的层，稳定分散相，其中它易于偶合存在于例如水相中 的反应性化合物。一般而言，油相包含0. 01-99%重量、优选5-75%重量、特别是20_60%重量且最 具体的是33-45%重量的两亲脂质。两亲脂质的量有利地有助于控制得到的纳米乳剂的分散相的大小。本发明的乳剂还包含增溶脂质。该化合物的主要任务在于增溶在纳米乳剂油相中 难溶的两亲脂质。增溶脂质是对两亲脂质具有足够亲和力以使其增溶的脂质。增溶脂质优选在室温 下是固体。就两亲脂质是磷脂的情况而言，可能的增溶脂质特别是甘油衍生物，尤其是通过 用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。所用的增溶脂质有利地依赖于所用两亲脂质而被选择。它一般具有类似的化学结 构以便带来期望的增溶。它可以是油或蜡。增溶脂质优选在室温(20°C)下是固体，而在体 温(37 °C )下是液体。优选的增溶脂质，特别是磷脂类，是脂肪酸甘油酯类，特别是饱和脂肪酸甘油酯 类，且特别是包含8-18个碳原子、甚至更优选12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。有 利的是包括不同甘油酯的混合物。优选包括包含至少10%重量的C12脂肪酸、至少5%重量的C14脂肪酸、至少5%重量的C16脂肪酸和至少5%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。优选包括包含0% -20%重量的C8脂肪酸、0% -20%重量的ClO脂肪酸、 10% -70%重量的C12脂肪酸、5% -30%重量的C14脂肪酸、5% -30%重量的C16脂肪酸和 5% -30%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。特别优选由fettef0SS6在商品名Suppocire NC下销售的半合成甘油酯混合 物，其在室温下是固体并且批准应用于人体注射。NSuppocire 型甘油酯类通过直接酯 化脂肪酸和甘油得到。它们是C8-C18饱和脂肪酸的半合成甘油酯类，其中定性-定量组成 如下表所示。上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应受限于具 体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得 到的芯具有增加的内在黏度，未显示结晶性。结晶对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为 它一般导致液滴聚集和/或导致被包囊的分子从液滴中排出。这些特性由此提高了随时间 推移的纳米乳剂物理稳定性和纳米晶体的包囊稳定性。增溶脂质的量随存在于油相中的两亲脂质的类型和量而广泛改变。一般而言，油 相包含1-99%重量、优选5-80%重量且特别是40-75%重量的增溶脂质。表1 来自feittefoss6的Suppocire NC 的脂肪酸组成
权利要求
1.纳米乳剂形式的金属、金属氧化物或半导体纳米晶体制剂，其包含连续的水相和至 少一种分散的油相，其中油相包含至少一种磷脂和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质包含 至少一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯，且其中水相包含助表面活性剂。
2.权利要求1的纳米晶体制剂，其中纳米晶体是发光的。
3.权利要求1或权利要求2的纳米晶体制剂，其中油相还包含至少一种油。
4.权利要求1-3任一项的纳米晶体制剂，其中助表面活性剂包含至少一种环氧乙烷单 元或环氧乙烷和环氧丙烷单元形成的链。
5.权利要求4的纳米晶体制剂，其中助表面活性剂选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰 乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类和脂肪酸和聚乙二醇酯类，和环氧乙烷和环氧丙 烷嵌段共聚物。
6.权利要求1-5任一项的纳米晶体制剂，其特征在于分散的相被官能化。
7.金属、金属氧化物或半导体纳米晶体制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的 水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤(i)制备包含适量纳米晶体、磷脂和至少一种增溶脂质的油相，所述增溶脂质包含至少 一种包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯；( )制备包含助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力的作用下将油相分散在水相中，以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
8.权利要求7的制备方法，其中剪力作用通过超声处理产生。
9.权利要求7或权利要求8的制备方法，其中通过将全部或一些成分放入适合的溶剂 中形成溶液且然后蒸发溶剂制备油相。
10.权利要求1-6任一项的纳米晶体制剂，其用于医学成像、热疗法或光疗法。
11.光疗或热疗治疗方法，其包含对有此需要的哺乳动物给予有效治疗量的权利要求 1-6任一项的制剂。
12.诊断方法，其包含给哺乳动物施用权利要求1-6任一项的制剂。
全文摘要
本发明涉及纳米乳剂形式的纳米晶体制剂，其包含连续水相和至少一种分散的油相，其中油相包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含助表面活性剂。本发明还涉及所述制剂的生产方法和在医学成像、热疗法或光疗法领域中的应用。
文档编号A61K9/107GK102143764SQ200980134621
公开日2011年8月3日 申请日期2009年8月14日 优先权日2008年8月14日
发明者I·泰克希尔-诺盖斯, M·古泰耶, T·达奥 申请人:原子能及能源替代委员会
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