酰化肽或蛋白的方法
专利名称：酰化肽或蛋白的方法
技术领域：
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两 个或多个反应性的亲核官能团。
背景技术：
已经批准许多肽用于医疗实践，并且这些肽可以通过重组DNA技术在合适的宿主细胞 中制备，或可以通过非常确实的肽合成技术合成法制备它们。然而，天然的肽以及其类似物 倾向于显示出高清除率，这在许多在长时间内需要高的肽血浆浓度的临床适应症中是无法 接受的。已经发现，肽和肽类似物的各种衍生作用可以以良好的趋势影响肽的清除率，例 如，W098/08871、W098/08872、W099/43708、EP 1227107 和 W000/55119 中所描述的内容。这 种衍生作用之一是将亲脂性的酰基引入到了治疗肽中，导致合乎需要的长效作用特性(相 对于非酰化的肽)。由此，频率更小地给予治疗蛋白改善了患者对处方治疗的依从性，并且 还可以降低所给予的肽的数量。为了使治疗用的肽经济上切实可行，制备肽的成本以及肽的治疗剂量是关键性的 因素。在制备治疗用肽期间的主要成本是从杂质中分离靶蛋白所要求的纯化步骤，其与靶 蛋白密切相关。这些纯化步骤通常利用色谱法进行，这意味着昂贵的色谱基质和溶剂，以及 总产率被降低。将酰基引入到具有一个以上的亲核原子(例如，一个以上的胺)的肽或蛋白的一 个或多个位点中，会使粗品混合物中的产物-相关杂质的产物混合物增多，所述相关杂质 与目标化合物极其相似，这就造成产物损失，并因此需要更困难的纯化步骤。本发明的目标是提供有效、稳健和经济的方法，以便通过间隔基将亲脂性基团引 入到肽或蛋白中。所述间隔基可以例如由一个或多个8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸部分和谷氨 酸组成。与其它已知的方法相比，该方法更具特异性、更稳健，由此导致高产率，并降低密切 相关杂质的形成。达到了制备酰化肽或蛋白的成本明显减少的目的。为了使能够获得治疗 的患者数量最大，以及为了利用替代性递送途径(与皮下注射相比，这种递送途径具有更 低的生物利用率)例如透皮、肺或口服递送的益处，价格低廉的酰化肽是高度合乎需要的。本发明由此提供了具有惊人的高选择性的选择性地酰化肽或蛋白中赖氨酸残基 的ε-氨基的方法。本发明概述
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两 个或多个反应性的亲核官能团。在一方面，该方法包括
a)在水介质中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化剂反应
权利要求
1.选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个 反应性的亲核官能团，该方法包括a)在水性介质中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化试剂反应
2.按照权利要求1的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋 白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中所述反应性亲核官能团是氨基。
3.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的PH值在pHIO和 pH12之间。
4.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在酰化过程期间的反应混合物的温度 在-5°C和50°C之间，例如在0°C和50°C之间。
5.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在30和60分钟之间的期间内加入试 剂。
6.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中，在加入酰化试剂之后，使所述酰化反 应混合物在0和M小时之间保持反应。
7.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中，在加入酰化试剂之后，立即通过将PH 值调节至pH6. 5-9. 0来终止反应，例如，调节至例如pH7. 5-8. 0。
8.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中肽或蛋白以至少5.0 mg/ml的浓度存在于反应混合物中。
9.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中反应混合物包含缓冲液。
10.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中以溶液形式加入酰化试剂，该溶液包 含溶解在惰性溶剂中的酰化试剂。
11.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中步骤(a)的反应是使用1:1至1:5摩 尔比的蛋白和式I的酰化剂来进行的。
12.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是适合于治疗糖 尿病的肽或蛋白。
13.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是适合于治疗肥 胖症的肽或蛋白。
14.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是胰高血糖素样 肽或胰岛素。
15.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中获得N-酰化的肽或蛋白，其包含至少 一个没有被酰化的游离氨基。
全文摘要
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性的亲核官能团。
文档编号A61K47/48GK102149411SQ200980135621
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月11日 优先权日2008年9月12日
发明者A·K·彼得森, C·U·杰森, C·克里斯滕森, H·瓦洛雷, J·L·索伦森, P·马德森, R·塞维林森, S·基达尔, T·M·塔格莫塞 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司
技术领域：
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两 个或多个反应性的亲核官能团。
背景技术：
已经批准许多肽用于医疗实践，并且这些肽可以通过重组DNA技术在合适的宿主细胞 中制备，或可以通过非常确实的肽合成技术合成法制备它们。然而，天然的肽以及其类似物 倾向于显示出高清除率，这在许多在长时间内需要高的肽血浆浓度的临床适应症中是无法 接受的。已经发现，肽和肽类似物的各种衍生作用可以以良好的趋势影响肽的清除率，例 如，W098/08871、W098/08872、W099/43708、EP 1227107 和 W000/55119 中所描述的内容。这 种衍生作用之一是将亲脂性的酰基引入到了治疗肽中，导致合乎需要的长效作用特性(相 对于非酰化的肽)。由此，频率更小地给予治疗蛋白改善了患者对处方治疗的依从性，并且 还可以降低所给予的肽的数量。为了使治疗用的肽经济上切实可行，制备肽的成本以及肽的治疗剂量是关键性的 因素。在制备治疗用肽期间的主要成本是从杂质中分离靶蛋白所要求的纯化步骤，其与靶 蛋白密切相关。这些纯化步骤通常利用色谱法进行，这意味着昂贵的色谱基质和溶剂，以及 总产率被降低。将酰基引入到具有一个以上的亲核原子(例如，一个以上的胺)的肽或蛋白的一 个或多个位点中，会使粗品混合物中的产物-相关杂质的产物混合物增多，所述相关杂质 与目标化合物极其相似，这就造成产物损失，并因此需要更困难的纯化步骤。本发明的目标是提供有效、稳健和经济的方法，以便通过间隔基将亲脂性基团引 入到肽或蛋白中。所述间隔基可以例如由一个或多个8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸部分和谷氨 酸组成。与其它已知的方法相比，该方法更具特异性、更稳健，由此导致高产率，并降低密切 相关杂质的形成。达到了制备酰化肽或蛋白的成本明显减少的目的。为了使能够获得治疗 的患者数量最大，以及为了利用替代性递送途径(与皮下注射相比，这种递送途径具有更 低的生物利用率)例如透皮、肺或口服递送的益处，价格低廉的酰化肽是高度合乎需要的。本发明由此提供了具有惊人的高选择性的选择性地酰化肽或蛋白中赖氨酸残基 的ε-氨基的方法。本发明概述
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两 个或多个反应性的亲核官能团。在一方面，该方法包括
a)在水介质中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化剂反应
权利要求
1.选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个 反应性的亲核官能团，该方法包括a)在水性介质中，使具有至少两个反应性亲核官能团的肽或蛋白与通式I的酰化试剂反应
2.按照权利要求1的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所述肽或蛋 白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中所述反应性亲核官能团是氨基。
3.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中含水的反应混合物的PH值在pHIO和 pH12之间。
4.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在酰化过程期间的反应混合物的温度 在-5°C和50°C之间，例如在0°C和50°C之间。
5.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中在30和60分钟之间的期间内加入试 剂。
6.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中，在加入酰化试剂之后，使所述酰化反 应混合物在0和M小时之间保持反应。
7.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中，在加入酰化试剂之后，立即通过将PH 值调节至pH6. 5-9. 0来终止反应，例如，调节至例如pH7. 5-8. 0。
8.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中肽或蛋白以至少5.0 mg/ml的浓度存在于反应混合物中。
9.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中反应混合物包含缓冲液。
10.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中以溶液形式加入酰化试剂，该溶液包 含溶解在惰性溶剂中的酰化试剂。
11.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中步骤(a)的反应是使用1:1至1:5摩 尔比的蛋白和式I的酰化剂来进行的。
12.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是适合于治疗糖 尿病的肽或蛋白。
13.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是适合于治疗肥 胖症的肽或蛋白。
14.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中要被酰化的肽或蛋白是胰高血糖素样 肽或胰岛素。
15.按照前述权利要求任一项的选择性地酰化肽或蛋白中的一个氨基的方法，其中所 述肽或蛋白具有两个或多个反应性亲核官能团，其中获得N-酰化的肽或蛋白，其包含至少 一个没有被酰化的游离氨基。
全文摘要
本发明描述了选择性地酰化肽或蛋白中的氨基的方法，其中所述肽或蛋白具有两个或多个反应性的亲核官能团。
文档编号A61K47/48GK102149411SQ200980135621
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月11日 优先权日2008年9月12日
发明者A·K·彼得森, C·U·杰森, C·克里斯滕森, H·瓦洛雷, J·L·索伦森, P·马德森, R·塞维林森, S·基达尔, T·M·塔格莫塞 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司
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