确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法
专利名称：确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法
确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法本发明涉及一种用于在临床前啮齿类动物试验中确定单克隆抗体的抗肿瘤效果 的方法和该方法在减少补充试验中的应用。
背景技术：
用于治疗性的肿瘤疗法的单克隆抗体需经过价格昂贵且费时的评价过程。通常它 们通过，例如，用相应的肿瘤抗原或其抗原片段免疫产生杂交瘤而获得，所述杂交瘤产生针 对所述肿瘤抗原的单克隆抗体。在进行大量的评估之前，必须经过一个费时的纯化过程，随 后先在体外对它们进行评估，继而用于临床前的动物研究。体外研究主要是确定单克隆抗 体与其相应肿瘤抗原结合的亲和力和对人类肿瘤细胞的生长抑制，这是临床前动物试验的 先决条件。然而，已经显示体外肿瘤细胞的生长抑制与在体内异种移植物动物研究中的功 效并不总具有相关性。已经显示在体外具有良好的抗增殖活性的抗体在临床前在体内模型 中是完全失活的，而在体外灭活的抗体可发挥显著的体内功效。因此，总体来说，关于此类 抗体的临床前动物试验是费时费力的，且由于体外研究的较差预测潜能，不得不测试大量 不同的抗体。因此，减少临床前动物试验以及较少的耗时程序在研发抗肿瘤疾病的单克隆 抗体中是一项重要的任务。Staquet 和 Giles-Komar (Hybridoma 2006 ；25 :68-74)中描述了一种体内评估单 克隆抗体的方法。他们把在基质胶中的杂交瘤通过皮下注射进小鼠。四天后，将肿瘤细胞 通过皮下注射进同一小鼠，随时间测量肿瘤生长。与对照的杂交瘤相比，减慢的肿瘤生长或 无肿瘤生长显示了由相应杂交瘤产生的单克隆抗体的抗增殖效果。使用这种方法使得把具 有抗肿瘤活性的抗体从不具有抗肿瘤活性的抗体中区分出来成为可能。然而这种方法允许 在抗增殖潜力的抗体间的区分可能性没有或极低，这些抗体仍然需要从杂交瘤纯化并再次 测试以进一步评估其抗增殖潜能。发明概述本发明的一个方面是用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，该方法包含以下 连续步骤a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小直到肿瘤大小超过IOOmm3 ；c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。与纯化和体外预选后的传统测试和优化相比，根据本发明所述的方法是在免疫后 鉴定、区分和优化新的具有抗肿瘤效果的治疗性抗体更为迅速和有效的方法。本发明的另一方面是所述方法用以减少临床前试验的应用。本发明的详细描述本发明的一个实施方案是用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，该方法包含 以下连续步骤a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小直到肿瘤大小超过IOOmm3 ；
c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。在步骤a)中，优选所述施用是经皮下的、同位的或静脉内注射，更优选的是经皮 下注射，肿瘤细胞是来自于人的，啮齿类动物优选的是小鼠或大鼠，更优选的是小鼠。在步骤b)中，测量肿瘤大小直到肿瘤大小达到100mm3-300mm3。在步骤c)中，优选所述施用是皮下注射在基质胶中或在空心纤维中、更优选在基 质胶中的杂交瘤。任选地，增加另外的步骤e)，其中杀死所述啮齿类动物和并进一步研究副作用。由所述杂交瘤产生的所述单克隆抗体是结合在所述肿瘤细胞的细胞表面表达的 肿瘤抗原的抗体，所述肿瘤细胞用于本发明所述的方法中。在此所用的术语“单克隆抗体”是一致的氨基酸组成的抗体分子的制剂。这些单 克隆抗体由用各自的肿瘤抗原免疫后的杂交瘤产生。可通过任何适当的方法将抗原引入 例如，小鼠或大鼠或其它动物中用于免疫。优选地，单独或联合合适的免疫调节剂(例如 CFA)经脾脏内、静脉内、腹膜内、皮内、肌内、皮下来免疫动物。每一种抗原的剂量优选地在 1-500 μ g范围内。可以分离由此产生的小鼠淋巴细胞并根据标准方案利用PEG或电融合与 人或异源骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。电融合是基于一种可逆性的细胞膜结构变化，包 括它们完整的结构(细胞核，细胞膜，细胞器，细胞质)从而产生一种新的能存活的细胞，所 述结构变化由电场的作用而导致并可应用在广范的细胞种类以融合两种以上同源或异源 的细胞。这导致产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体适合于本发明所述的方法。在这里所用的术语“结合”或“特异性结合”指在体外测试、优选地，在利用表达 野生型抗原的CHO细胞的基于细胞的ELISA中，抗体与肿瘤抗原的表位的结合。结合是指 10、以下，优选IO-13M-KTi3M的结合亲和力(Kd)。抗体与抗原的结合可以通过BIAcore测试 (Pharmacia Biosensor AB,Uppsala, Sweden)来研究。结合的亲和力用术语ka(来自抗体 /抗原复合物的抗体的结合速率常数)，kD (离解常数)和KD(kD/ka)来定义。由于以下原因，根据本发明所述的方法与传统的测试纯化抗体方法相比代表一种 改进(参见表1)。在抗体纯化前通过优化，只有最有效的抗体，最感兴趣的杂交瘤需要为进 一步的鉴定而纯化，这意味着抗体纯化的数量显著减少，加速了新治疗性抗体的研发和减 少了总体上为治疗性抗体研发所需付出的测试努力(相比于如果必须测试许多纯化的抗 体而言)。另外，常常忽略(这种忽略是由于它们在杂交瘤中的低产率，使得难以获得足够 的纯化抗体，而非由于它们的治疗性能)进行进一步评估的产率低的杂交瘤的抗体更容易 获得评估它们治疗性能的机会。表1 传统方法与新杂交瘤技术的比较
权利要求
1.用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，其包含以下连续步骤a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小，直到肿瘤大小超出IOOmm3;c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于另外的步骤e)将啮齿类动物杀死和进一步研究副作用。
3.减少临床前啮齿类动物试验的方法，其特征在于a)利用根据权利要求1所述的方法，评估由杂交瘤产生的单克隆抗体的抗肿瘤效果，和b)优先考虑1至3种单克隆抗体，优选1种单克隆抗体，用于进一步临床前评估。
全文摘要
本发明涉及一种在临床前啮齿类动物试验中确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法和所述方法在减少补充试验中的应用。
文档编号A61K49/00GK102149413SQ200980135773
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月21日 优先权日2008年9月22日
发明者比吉特·博森梅尔, 瓦莱里娅·利夫可, 维尔纳·朔伊尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法本发明涉及一种用于在临床前啮齿类动物试验中确定单克隆抗体的抗肿瘤效果 的方法和该方法在减少补充试验中的应用。
背景技术：
用于治疗性的肿瘤疗法的单克隆抗体需经过价格昂贵且费时的评价过程。通常它 们通过，例如，用相应的肿瘤抗原或其抗原片段免疫产生杂交瘤而获得，所述杂交瘤产生针 对所述肿瘤抗原的单克隆抗体。在进行大量的评估之前，必须经过一个费时的纯化过程，随 后先在体外对它们进行评估，继而用于临床前的动物研究。体外研究主要是确定单克隆抗 体与其相应肿瘤抗原结合的亲和力和对人类肿瘤细胞的生长抑制，这是临床前动物试验的 先决条件。然而，已经显示体外肿瘤细胞的生长抑制与在体内异种移植物动物研究中的功 效并不总具有相关性。已经显示在体外具有良好的抗增殖活性的抗体在临床前在体内模型 中是完全失活的，而在体外灭活的抗体可发挥显著的体内功效。因此，总体来说，关于此类 抗体的临床前动物试验是费时费力的，且由于体外研究的较差预测潜能，不得不测试大量 不同的抗体。因此，减少临床前动物试验以及较少的耗时程序在研发抗肿瘤疾病的单克隆 抗体中是一项重要的任务。Staquet 和 Giles-Komar (Hybridoma 2006 ；25 :68-74)中描述了一种体内评估单 克隆抗体的方法。他们把在基质胶中的杂交瘤通过皮下注射进小鼠。四天后，将肿瘤细胞 通过皮下注射进同一小鼠，随时间测量肿瘤生长。与对照的杂交瘤相比，减慢的肿瘤生长或 无肿瘤生长显示了由相应杂交瘤产生的单克隆抗体的抗增殖效果。使用这种方法使得把具 有抗肿瘤活性的抗体从不具有抗肿瘤活性的抗体中区分出来成为可能。然而这种方法允许 在抗增殖潜力的抗体间的区分可能性没有或极低，这些抗体仍然需要从杂交瘤纯化并再次 测试以进一步评估其抗增殖潜能。发明概述本发明的一个方面是用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，该方法包含以下 连续步骤a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小直到肿瘤大小超过IOOmm3 ；c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。与纯化和体外预选后的传统测试和优化相比，根据本发明所述的方法是在免疫后 鉴定、区分和优化新的具有抗肿瘤效果的治疗性抗体更为迅速和有效的方法。本发明的另一方面是所述方法用以减少临床前试验的应用。本发明的详细描述本发明的一个实施方案是用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，该方法包含 以下连续步骤a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小直到肿瘤大小超过IOOmm3 ；
c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。在步骤a)中，优选所述施用是经皮下的、同位的或静脉内注射，更优选的是经皮 下注射，肿瘤细胞是来自于人的，啮齿类动物优选的是小鼠或大鼠，更优选的是小鼠。在步骤b)中，测量肿瘤大小直到肿瘤大小达到100mm3-300mm3。在步骤c)中，优选所述施用是皮下注射在基质胶中或在空心纤维中、更优选在基 质胶中的杂交瘤。任选地，增加另外的步骤e)，其中杀死所述啮齿类动物和并进一步研究副作用。由所述杂交瘤产生的所述单克隆抗体是结合在所述肿瘤细胞的细胞表面表达的 肿瘤抗原的抗体，所述肿瘤细胞用于本发明所述的方法中。在此所用的术语“单克隆抗体”是一致的氨基酸组成的抗体分子的制剂。这些单 克隆抗体由用各自的肿瘤抗原免疫后的杂交瘤产生。可通过任何适当的方法将抗原引入 例如，小鼠或大鼠或其它动物中用于免疫。优选地，单独或联合合适的免疫调节剂(例如 CFA)经脾脏内、静脉内、腹膜内、皮内、肌内、皮下来免疫动物。每一种抗原的剂量优选地在 1-500 μ g范围内。可以分离由此产生的小鼠淋巴细胞并根据标准方案利用PEG或电融合与 人或异源骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。电融合是基于一种可逆性的细胞膜结构变化，包 括它们完整的结构(细胞核，细胞膜，细胞器，细胞质)从而产生一种新的能存活的细胞，所 述结构变化由电场的作用而导致并可应用在广范的细胞种类以融合两种以上同源或异源 的细胞。这导致产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体适合于本发明所述的方法。在这里所用的术语“结合”或“特异性结合”指在体外测试、优选地，在利用表达 野生型抗原的CHO细胞的基于细胞的ELISA中，抗体与肿瘤抗原的表位的结合。结合是指 10、以下，优选IO-13M-KTi3M的结合亲和力(Kd)。抗体与抗原的结合可以通过BIAcore测试 (Pharmacia Biosensor AB,Uppsala, Sweden)来研究。结合的亲和力用术语ka(来自抗体 /抗原复合物的抗体的结合速率常数)，kD (离解常数)和KD(kD/ka)来定义。由于以下原因，根据本发明所述的方法与传统的测试纯化抗体方法相比代表一种 改进(参见表1)。在抗体纯化前通过优化，只有最有效的抗体，最感兴趣的杂交瘤需要为进 一步的鉴定而纯化，这意味着抗体纯化的数量显著减少，加速了新治疗性抗体的研发和减 少了总体上为治疗性抗体研发所需付出的测试努力(相比于如果必须测试许多纯化的抗 体而言)。另外，常常忽略(这种忽略是由于它们在杂交瘤中的低产率，使得难以获得足够 的纯化抗体，而非由于它们的治疗性能)进行进一步评估的产率低的杂交瘤的抗体更容易 获得评估它们治疗性能的机会。表1 传统方法与新杂交瘤技术的比较
权利要求
1.用于确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法，其包含以下连续步骤a)将肿瘤细胞施用于啮齿类动物；b)测量所述啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小，直到肿瘤大小超出IOOmm3;c)将产生所述单克隆抗体的杂交瘤施用于所述啮齿类动物；和d)测量所述负载肿瘤的啮齿类动物依赖时间的肿瘤大小。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于另外的步骤e)将啮齿类动物杀死和进一步研究副作用。
3.减少临床前啮齿类动物试验的方法，其特征在于a)利用根据权利要求1所述的方法，评估由杂交瘤产生的单克隆抗体的抗肿瘤效果，和b)优先考虑1至3种单克隆抗体，优选1种单克隆抗体，用于进一步临床前评估。
全文摘要
本发明涉及一种在临床前啮齿类动物试验中确定单克隆抗体的抗肿瘤效果的方法和所述方法在减少补充试验中的应用。
文档编号A61K49/00GK102149413SQ200980135773
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月21日 优先权日2008年9月22日
发明者比吉特·博森梅尔, 瓦莱里娅·利夫可, 维尔纳·朔伊尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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