使用哺乳动物β防御素治疗炎性疾病的制作方法

专利名称：：使用哺乳动物β防御素治疗炎性疾病的制作方法使用哺乳动物β防御素治疗炎性疾病涉及序列表本申请含有呈计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文中。发明背景发明领域本发明涉及通过施用哺乳动物β防御素而抑制肿瘤坏死因子α(TNF-alpha或TNF-α)活性，其在多种病症的治疗(包括与发炎相关之病理学病状的治疗)中具有效用。背景人防御素在许多其它元件中，先天免疫的关键组分为个别显示相当大选择性但集体能够快速杀死广谱的细菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更为突出，且其有可能由所有多细胞生物体产生。在人类中，优势AMP为防御素。人防御素为阳离子小肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键之拓扑学可分为α-防御素及β-防御素。α-防御素可进一步细分为首先自嗜中性粒细胞颗粒分离的α-防御素(ΗΝΡ1-4)及由Paneth细胞在小肠隐窝中表达的α-防御素(HD5及HD6)。β-防御素主要由多种组织及器官中的上皮细胞产生，所述组织及器官包括皮肤、气管、胃肠道、泌尿生殖系统、肾、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(bestcharacterized)成员为hBDl_3。然而，使用多种生物信息学工具，已在人基因组中注释了几乎40个编码推定β-防御素同源物的开放阅读框。一些人防御素是组成型产生的，而其它是由促炎性细胞因子或外源微生物产物诱导的。已经越来越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有宽范围的免疫调节/替代性质。所述性质包括诱导多种趋化因子及细胞因子、趋化活性及细胞凋亡活性，诱导前列腺素、组胺及白细胞三烯释放，抑制补体，通过铎样受体(toll-likereceptor)信号传导刺激树突细胞成熟，以及刺激由嗜中性粒细胞的病原体清除。此外，人防御素也在伤口愈合、上皮及成纤维细胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管发生(vasculogenesis)中起作用。有越来越多的人防御素在许多感染性及炎性疾病中发挥重要作用的证据。发炎和/或感染皮肤中通常观察到人防御素之过表达，很可能是因为由微生物组分或内源性促炎性细胞因子局部诱导。在牛皮癣(psoriasis)中，hBD2及hBD3过于充足，且在患有寻常痤疮(acnevulgaris)或浅表性毛囊炎(superficialfolliculitis)的患者的受损上皮中观察到hBD2的显著上调。另一方面，异位性/特应性皮炎(topicdermatitis)与hBD2及hBD3的下调相关。回肠克罗恩氏病(Crohn'sdisease)与HD5及HD6的缺陷表达相关，且在结肠中的克罗恩氏病中，hBD2-4的表达下调。细胞因子细胞因子为来自高级真核生物的小的分泌多肽，其负责细胞间信号转导且影响其它细胞之生长、分裂和功能。它们是有效的多效性多肽，其例如经由相应受体充当局部或全身性细胞间调控因子，且因此在许多生物过程(如免疫、发炎及造血)中起关键作用。细胞因子由多样细胞类型产生，所述细胞类型包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞/单核细胞及淋巴细胞。TNF-α涉及多种生理病原性过程且可如在宿主防御中具有保护性或如在自体免疫中具有有害性。TNF-α为关键细胞因子之一，其引发且维持发炎反应，且已证明TNF-a失活在下调与自体免疫疾病相关之炎性反应中是重要的。感染后，巨噬细胞大量分泌TNF-α且TNF-α通过刺激内皮细胞产生粘附分子及通过产生为趋化细胞因子之趋化因子来介导嗜中性粒细胞及巨噬细胞募集(recruitment)至感染部位。TNF-α有助于活化白血球及其它炎性细胞且增加损伤组织内之血管渗透性。TNF-α主要由巨噬细胞、单核细胞及树突细胞产生，但也可由多种其它细胞类型产生，所述细胞类型包括淋巴样细胞、肥大细胞、内皮细胞、心肌细胞、脂肪组织、成纤维细胞及神经元组织。当前的抗炎药通过与TNF-α结合且因此阻止TNF_a向细胞表面上TNF_a之受体传导信号来阻断TNF-a之作用。该类型之阻断具有某些严重的副作用，其中一些为感染，如肺结核、败血症及真菌感染且可能使癌症发病率增加。IL-10,也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，也作为抗炎细胞因子是免疫调控的关键参与者。该细胞因子由数种细胞类型产生，所述细胞类型包括单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、树突细胞及肥大细胞。该细胞因子在免疫调控及发炎作用中具有多效性效应。其下调促炎性细胞因子、由Thl/Thl7细胞分泌之细胞因子、MHC第II类Ag及共刺激分子于抗原呈递细胞上的表达。IL-10也由称为调控T细胞(Tregs)之T细胞群体分泌。所述细胞不阻止最初T细胞活化；相反，其抑制持续反应且阻止慢性和潜在破坏性的反应。在周边中，一些T细胞被抗原及IL-10或TGF-β诱导成为Tregs。IL-10诱导之Tregs为⑶4+/⑶25+/Foxp3-且称为Trl细胞。所述细胞通过分泌IL-10抑制免疫反应。最近研究已公开在鉴别Thl7细胞时T细胞效应子谱系之多样化大于Thl/Th2/Treg。已显示该亚群在先前归因于Thl系之数种自体免疫疾病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣及多发性硬化)中呈病原性。由Thl7分泌之细胞因子也被IL-10下调，且阻断TNF通过使Thl7细胞失活而预防牛皮癣。IL-10之总体活性为抗炎性，且已在数个动物研究中显示预防发炎及损伤，然而因为IL-10施用途径及其生物半衰期方面的困难，所以临床IL-10治疗仍然不足。使用人防御素治疗发炎引人关注的是，小肠中克罗恩氏病与潘纳斯细胞(panethcell)a-防御素HD5及HD6之水平降低相关，而结肠中克罗恩氏病与β-防御素hBD2及hBD3之产生减少相关(Gersemann等，2008；Wehkamp等，2005)。此外，已有力地证明克罗恩氏病之发病机制中涉及肠微生物区(Swidsinski等，2002)。所述研究人员通过使用荧光原位杂交显示在活性克罗恩氏病中，观察到粘膜相关且具侵袭性之细菌之急剧增加，而正常小肠上皮及大肠上皮中无所述细菌。这些观察结果一起合并成一个假设，该假设表明在健康人中，沿肠上皮屏障之适当水平之防御素起作用以控制腔内(luminal)细菌之组成及数目且使其不粘附及入侵粘膜而触发发炎(Wang等，2007)。另一方面，在能力不足以产生保护性水平之分泌防御素的人中，抗微生物防御与腔内细菌之间的平衡会改变。结果，这使得细菌入侵基础(underlying)肠组织，从而诱导炎性状态，而这又可能发展成克罗恩氏病。基于该假设，WO2007/081486公开了数种人防御素在炎性肠病之治疗中之用途。发明者提出以使防御素在肠腔中之适当位置释放之配制物形式经口向克罗恩氏病患者施用的防御素将减少入侵细菌之数目，重建正常上皮屏障功能且因此降低炎性疾病之严重性。根据WO2007/081486，防御素之功能在于直接靶向且杀死腔中之细菌，从而阻止其入侵上皮组织。即，防御素完全起抗感染化合物作用。关于W0/2007/081486，令人惊讶的是胃肠外施用之hBD2能够降低小鼠中DSS诱导之结肠炎的严重性，因为通过使用该施用途径，肽从未遇到腔内细菌。另外，我们此处显示hBD2之作用为减小由PBMC分泌之促炎性细胞因子TNFa、IL-Iβ及IL-23之水平。已知这些细胞因子是许多炎性疾病包括炎性肠病中的关键参与者。多于十年已知的是，除抗微生物功能外，防御素也具有多种免疫调节功能。然而，大部分关于人防御素之免疫调节性质之著作描述其主要具有促炎性或免疫增强功能(参见例如，Niyonsaba等，2007；Bowdish等，2006；Lehrer,2004)。因此，确实出乎意料的是胃肠外施用之hBD2能够降低炎性肠病中的疾病严重性。首先，当胃肠外施用时，hBD2决不会到达肠腔从而遇到参与诱导疾病之有害细菌。此外，基于大部分公开之文献，如此处所提供之著作中所观察到的，将预期进入血流之防御素将诱导促炎性而非抗炎性反应。发明详述为帮助理解优选实施方案，本文提供某些定义。如本文所用之术语“TNF-α活性”为广义术语且对本领域的普通技术人员而言为一般且习惯之含义给出(且不局限于特定或定制之含义)，且系指(但不限于)至少部分由肿瘤坏死因子α介导之活性或作用。如本文所用之术语“抑制子”为广义术语且对本领域的普通技术人员而言为一般且习惯之含义给出(且不局限于特定或定制之含义)，且系指(但不限于)可降低TNF-α之至少一种活性之分子(例如，天然或合成化合物)。换言之，若在有抑制子进行之测定中，与无抑制子进行之测定相比，所测量到之TNF-α之量、TNF-α活性或细胞外和/或细胞内检测出之TNF-α存在统计学上显著的变化，则“抑制子”改变活性。一般而言，TNF-α抑制子例如通过减少TNF-α之分泌降低TNF-α之生理功能，且因此适用于治疗TNF-α可直接或间接为病原性之疾病。如本文所用之术语“IL-10活性”为广义术语且对本领域的普通技术人员而言为一般且习惯之含义给出(且不局限于特定或定制之含义)，且系指(但不限于)至少部分由白介素-10介导之活性或作用。如本文所用之术语“诱导剂(inducer)”为广义术语且对本领域的普通技术人员而言为一般且习惯之含义给出(且不局限于特定或定制之含义)，且系指(但不限于)可增加IL-10之至少一种活性之分子(例如，天然或合成化合物)。换言之，若在有诱导剂进行之测定中，与无诱导剂进行之测定相比，所测量之IL-10之量、IL-10活性或细胞外和/或细胞内检测出之IL-10存在统计学上显著的变化，则“诱导剂”改变活性。一般而言，IL-10诱导剂增加IL-10之生理功能，且因此适用于治疗受IL-10影响之疾病。术语“修饰”在本文中意指人β防御素2之任何化学修饰。修饰可为氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链之置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特性之非天然氨基酸。详言之，修饰可为酰胺化，如C-末端酰胺化。如本文所用之术语“防御素”系指本领域的技术人员公认属于抗微生物肽之防御素类之多肽。为确定多肽是否为根据本发明之防御素，可通过使用免费可用之HMMER软件包将氨基酸序列与PFAM数据库之隐马尔可夫模型序型(hiddenmarkovmodelprofile)(HMM序型)比较。PFAM防御素家族包括例如防御素-1或“哺乳动物防御素”(登录号PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登录号PF00711)。本发明之防御素属于β防御素类。β防御素类之防御素享有共同的结构特征，如半胱氨酸模式。根据本发明之防御素之实例包括人β防御素1(hBDl；参见SEQIDNO:1)、人β防御素2(hBD2；参见SEQIDN0:2)、人β防御素3(hBD3；参见SEQIDN0:3)、人β防御素4_4；参见SEQIDNO4)及小鼠β防御素3(mBD3；参见SEQIDNO6)。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277;http://emboss,org)，优选3.0.0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口延伸罚分(0.5)及EBL0SUM62(BL0SUM62之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同残基X100)/(比对长度_比对中之缺口总数)。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，同上；http://emboss,org)、优选3.0.0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口扩展罚分(0.5)及EDNAFULL(NCBINUC4.4之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。如本文所用之术语“经分离变体”或“经分离多肽”系指自来源分离之变体或多肽。在一方面中，如SDS-PAGE所测定的，变体或多肽为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，且最优选至少90%纯。术语“基本上纯的多肽”在本文中表示含有按重量计至多10%、优选至多8%、更优选至多6%、更优选至多5%、更优选至多4%、更优选至多3%、甚至更优选至多2%、最优选至多且甚至最优选至多0.5%与之天然或重组相关之其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽按制备物中所存在之总多肽物质之重量计为至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99.5%纯且甚至最优选100%纯。本发明之多肽优选呈实质上纯的形式。此可例如通过由众所周知之重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。哺乳动物β防御素本发明涉及哺乳动物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治疗与TNF-α之(病原性)水平增加相关的疾病，如炎性疾病中的医药用途。治疗优选与降低所治疗组织中之TNF-α活性相关。因此，本发明之哺乳动物β防御素也称为TNF-α抑制子。在一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO6中之任一氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDN0:3和/或SEQIDNO4中之任一氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1(SEQIDNO:1)、人β防御素2(SEQIDNO:2)、人β防御素3(SEQIDNO:3)、人β防御素4(SEQIDNO4)、人β防御素4之变体(SEQIDNO5)和/或小鼠β防御素3(SEQIDNO6)组成。在一甚至更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素KSEQIDΝ0:1)、人β防御素2(SEQIDN0:2)、人β防御素3(SEQIDNO3)和/或人β防御素4(SEQIDNO4)组成。在另一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQIDNO:2之氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQIDNO2)组成。在又一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效变体组成。优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效变体组成。更优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能等效变体组成。本发明之哺乳动物β防御素也称为优选实施方案之化合物。在本发明之上下文中，哺乳动物(例如人)β防御素之“功能等效变体(functionallyequivalentvariant)”为展现与哺乳动物(例如人)β防御素(如人β防御素2)大致相同之对TNF-α活性之功效的经修饰哺乳动物(例如人)β防御素。更优选地，其也展现与哺乳动物(例如人)β防御素(如人β防御素2)大致相同之对IL-10活性之功效。根据本发明，哺乳动物(例如人)β防御素(如人β防御素2)之功能等效变体与哺乳动物(例如人)β防御素氨基酸序列(如SEQIDNO2)相比可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰且尤其1个氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是性质上较不重要的，其为不显著影响多肽之折迭和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；单缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多约20-25个残基之小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而有利于纯化之小延伸，如多聚组氨酸标记、抗原表位或结合域。保守取代的实例为在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并由，例如，Neurath和Hill，1979在TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最通常发生的交换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烧羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定哺乳动物β防御素中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，TNF-α活性之抑制)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.2714699-4708必需氨基酸的身份(identity)也可由分析与相关于哺乳动物β防御素之多肽的同一性来推断。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53_57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991,Biochem.3010832-10837；美国专利5，223，409号；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。本发明之多肽之N-末端延伸可合适地由1至50个氨基酸、优选2-20个氨基酸、尤其3-15个氨基酸组成。在一实施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一实施方案中，N-末端延伸包含如下文进一步定义之kex2或kex2_样切割位点。在一优选实施方案中，N-末端延伸为包含至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途TNF-α抑制子具有多种可应用之用途，如上所述。本领域的技术人员应认识到，当相对于TNF-α对照水平观察到统计学上显著的变化(减小)时，发生抑制。发现人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3及人β防御素4之变体可在LPS-及LTA-攻击的细胞中降低TNF-α活性且诱导IL-10活性。另外，发现人β防御素2可在LPS-及LTA-攻击的细胞中减少IL-23分泌；且发现小鼠β防御素3可降低鼠类和人LPS-及LTA-攻击的细胞中之TNF活性。这些发现支持了所测试之哺乳动物β防御素展现优异的抗炎活性，尤其在自体免疫疾病或病症中展现抗炎活性。可使用优选实施方案之药物组合物治疗由TNF-α活性介导之病症。也提供治疗由TNF-α活性介导之病症之方法，该治疗包含向需要该治疗之受试者施用有效量之例如呈药物组合物形式之哺乳动物β防御素，如人β防御素2。也提供的是哺乳动物β防御素(如人β防御素2)，其用于制造药物；及哺乳动物β防御素(如人β防御素2)之用途，其用于制造用于治疗由TNF-α活性介导之病症的药物，例如药物组合物。治疗包括治疗已有疾病或病症以及预防(prophylaxis(prevention))疾病或病症。在一实施方案中，治疗导致所治疗组织中TNF-α活性降低，优选TNF-α活性降低且IL-10活性增加。可用优选实施方案之化合物例如通过抑制(inhibition或suppression)TNF-α活性而治疗之疾病或病症包括由TNF-α活性介导之疾病或病症。优选地，这些病症之治疗可受益于TNF-α活性降低和/或IL-10活性增加。所述疾病或病症包括炎性疾病或病症、过敏性疾病及自体免疫疾病。更详言之，病症或疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化)、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮、(急性)肾小球性肾炎、哮喘(如支气管哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、炎性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn'sDisease))、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎(例如炎性皮炎)、异位性/特应性皮炎、毛发脱落、鼻炎(过敏性)、过敏性结膜炎、重症肌无力、硬化性皮炎、肉状瘤病、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、青少年特发性关节炎、格雷夫斯病(Gravesdisease)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)及贝塞特氏病(Behcetdisease)。TNF-α抑制子可治疗性用于组合物中，所述组合物经配制用于经由任何常规途径施用，常规途径包括肠内(例如经颊、经口、经鼻、经直肠)、胃肠外(例如，静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内)或局部(例如，表皮、鼻内或气管内)。在其它实施方案中，本文中描述之组合物可作为持续释放植入物之一部分施用。在另外的其它实施方案中，可利用提供冷冻干燥物稳定性之适当赋形剂将优选实施方案之组合物配制为冷冻干燥物，且接着复水。含有优选实施方案之TNF-α抑制子之药物组合物可根据常规方法，例如通过混合、造粒、包覆、溶解或冻干过程制造。在另一实施方案中，提供含有一或多种TNF-α抑制子之药物组合物。出于施用之目的，可将优选实施方案之化合物配制为药物组合物。优选实施方案之药物组合物包含一或多种优选实施方案之TNF-α抑制子及药学上可接受之载体和/或稀释剂。TNF-α抑制子优选在药物组合物中以有效治疗特定病症之量，即足以减少TNF-α水平或活性、减缓症状和/或优选具有对患者可接受之毒性之量使用。对于该治疗，适当剂量当然依赖于例如所使用之本发明化合物之化学性质及药物动力学数据、个体宿主、施用模式及接受治疗之病状之性质及严重性而变化。然而，一般而言，为在例如人之较大哺乳动物中获得令人满意的结果，指示每日剂量优选为约0.OOlg至约1.5g、更优选约0.Olg至1.Og；或约0.01mg/kg体重至约20mg/kg体重、更优选约0.lmg/kg体重至约IOmg/kg体重，例如以多至一天四次之分开的剂量施用。优选实施方案之化合物可通过与TNF-α活性之其它调节剂(例如低分子量抑制物)通常使用之类似施用模式及类似剂量向例如人之较大哺乳动物施用。在一些实施方案中，优选实施方案之药物组合物可包括TNF-α抑制子，TNF-α抑制子之量取决于施用途径为每单位剂型约0.5mg或更少至约1500mg或更多，优选约0.5、0.6,0.7,0.8或0.9mg至约150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或IOOOmg,且更优选约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg至约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或lOOmg。然而，在一些实施方案中，比以上所提及之更低或更高的剂量可为优选的。本领域的技术人员可容易地确定适当的浓度及剂量。本领域的技术人员熟悉药学上可接受之载体和/或稀释剂。对于配制成液体溶液之组合物，可接受之载体和/或稀释剂包括盐水及无菌水，且可任选地包括抗氧化剂、缓冲齐、抑菌剂及其它常见添加剂。组合物也可配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固体溶液、悬浮液、分散液、固态分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、凝胶、糊状物、吸入剂粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式)。配制物可含有(除一或多种TNF-α抑制子及其它任选之活性成分外)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖及甜味剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压之盐、缓冲剂、稀释齐U、分散剂及表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或如本领域已知之其它药物赋形剂。本领域的技术人员可进一步以适当方式且根据公认的实践(如Remington'sPharmaceuticalSciences,GennaroH,MackPublishingCo.，Easton,PA1990巾Μδ白勺)MMTNF-α抑制子。TNF-α抑制子可单独使用或以与一种、两种或更多种其它药物化合物或药物物质和/或与一或多种药学上可接受之赋形剂之组合疗法使用。在优选实施方案中，TNF-α抑制子与所使用之常规药物组合提供以治疗TNF-α为病原性或TNF-α在疾病过程中发挥关键或其它作用之疾病或病状。在尤其优选实施方案中，提供包含一或多种TNF-α抑制子与一或多种其它药物化合物组合之药物组合物，该一或多种TNF-α抑制子包括(但不限于)优选实施方案之化合物，该一或多种其它药物化合物包括(但不限于)用于治疗哮喘或其它呼吸道疾病、糖尿病、关节炎或其它炎性疾病、免疫病症或TNF-α为病原性之其它疾病或病症的药物。优选实施方案之TNF-α抑制子可单独或与一或多种其它药物活性剂(例如适用于治疗发炎或相关疾病之药剂)组合用于医药治疗。所述其它药物活性剂包括例如类固醇、糖皮质激素、其它炎性细胞因子之抑制物(例如抗TNF-α抗体、抗IL-I抗体、抗IFN-γ抗体)及其它细胞因子(如IL-IRA或IL-10)及其它TNF-α抑制物。组合疗法可包括两种以上药物活性剂在同一配制物中的固定组合；独立配制物中之两种以上药物活性剂例如与用于共施用之说明书在同一包装中出售的套组；及药物活性剂分开包装但提供同时或连续施用之说明书的自由组合。其它套组元件可包括诊断剂、测定、连续或同时施用之多个剂型、复原药物组合物之冻干或浓缩形式之说明书及物质、施用药物活性剂之装置等。例如，提供一种医药包装，其包含为优选实施方案之化合物之第一药物物质及至少一种第二药物物质以及组合施用之说明书。也提供一种医药包装，其包含优选实施方案之化合物以及与至少一种第二药物物质组合施用之说明书。也提供一种医药包装，其包含至少一种第二药物物质以及与本发明化合物组合施用之说明书。用根据优选实施方案之组合治疗与由组合中之任一组分单独治疗相比可提供改善或优良效果。例如，可使用包含一定量之优选实施方案之化合物及一定量之第二药物物质的药物组合，其中所述量适于产生协同治疗性效应。也提供一种改进优选实施方案之化合物之治疗性效用的方法，该方法包括例如相伴或顺序共施用治疗有效量之优选实施方案之化合物及第二药物物质。也提供一种改进第二药物物质之治疗性效用的方法，该方法包括例如相伴或顺序共施用治疗有效量之优选实施方案之化合物及第二药物物质。本发明与作为组合搭配物(partner)之第二药物的组合可由例如以上关于优选实施方案之化合物所述之任何常规途径施用。第二药物可以适当剂量施用，例如与单一治疗所使用之剂量范围类似的剂量范围或例如在协同作用之情况下，甚至低于常规剂量范围。合适的第二药物物质包括化学治疗药，尤其任何除优选实施方案之TNF-α抑制子以外的化学治疗剂。所述第二药物物质可包括例如抗炎药和/或免疫调节药等。可与优选实施方案之化合物组合使用之抗炎药和/或免疫调节药包括例如mTOR抑制物，包括雷帕霉素(rapamycin)，例如40_0_(2-羟基乙基)-雷帕霉素、32-脱氧雷帕霉素、16-0-取代的雷帕霉素(如16-戊-2-炔基氧基-32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氢-40-0-(2-羟基乙基)_雷帕霉素)、40-[3_羟基_2-(羟基-iEtaethyl)-2-甲基丙酸酯]_雷帕霉素(也称为CCI779)、40-erhoi-(四唑基)-雷帕霉素(也称为ABT578)、所谓雷帕霉素类似物(rapalog)如PCT国际申请第WO98/02441号、PCT国际申请第WO01/14387号及PCT国际申请第W003/64383号中所公开之类似物(如AP23573)及以名称TAFA-93及biolimus(biolimusA9)公开之化合物；钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制物，例如环孢素A或506；具有免疫抑制性质之子囊霉素，例如ABT-281、ASM981；皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；来氟米特(leflunomide)；咪唑立宾(mizoribine)；霉酚酸或盐；霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolatemofetil)；15-脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualine)或其免疫抑制物同源物、类似物或衍生物；bcr-abl酪氨酸激酶抑制物；c-kit受体酪氨酸激酶抑制物；PDGF受体酪氨酸激酶抑制物，例如Gleevec(伊马替尼(imatinib))；p38MAP激酶抑制物、VEGF受体酪氨酸激酶抑制物、PKC抑制物，例如PCT国际申请第WO02/38561号或PCT国际申请第WO03/82859号中所公开之抑制物，例如实施例56或70之化合物；JAK3激酶抑制物，例如N-苯甲基-3，4-二羟基-亚苄基-氰基乙酰胺α-氰基-(3，4_二羟基)]-N-苯甲基肉桂酰胺(TyrphostinAG490)、灵菌红素25-C(PNUI56804)、[4-(4‘-羟基苯基)-胺基_6，7-二甲氧基喹唑啉](WHI-PI31)、[4-(3'-溴-4'-羟基苯基)-胺基-6，7-二甲氧基喹唑啉](冊1寸154)、[4-(3'，5-二溴-4‘-羟基苯基)_胺基-6，7-二甲氧基喹唑啉]WHI-P97、KRX_211、3_{(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_4_基)-胺基]-哌啶-1-基}-3-氧代-prorhoionitrile(呈游离形式或药学上可接受之盐形式(例如单柠檬酸盐)(也称为CP-690,550))或PCT国际申请第WO2004/052359号或PCT国际申请第WO2005/066156号中所公开之化合物；SIP受体激动剂或调节剂，例如任选经磷酸化之FTY720或其类似物，例如任选经磷酸化之2-胺基-2-[4-(3-苯甲氧基苯基硫基)-2-氯苯基]乙基-1，3-丙二醇或1-{4-[1-(4-环己基-3-三氟甲基-苯甲氧基亚胺基)_乙基]-2-乙基-苯甲基}-吖丁啶-3-羧酸或其药学上可接受之盐；免疫抑制单克隆抗体，例如白血球受体之单克隆抗体,例如Blys/BAFF受体、MHC,CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、⑶80、⑶86、IL-12受体、IL-17受体、IL-23受体或其配体；其它免疫调节化合物，例如具有CTLA4或其突变体之细胞外域之至少一部分的重组结合分子，例如与非CTLA4蛋白质序列连接之CTLA4或其突变体之至少细胞外部分，例如CTLA41g(例如指定为ATCC68629)或其突变体，例如LEA29Y；粘附分子抑制物，例如LFA-I拮抗剂、ICAM-I或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂、CCR9拮抗剂、MIF抑制物、5-胺基水杨酸盐(5-ASA)齐IJ，如柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、Azulfidine(柳氮磺吡啶)、Asacol(安萨科)⑧、Dipentum(奥柳氮钠)、Pentasa(颇得斯安)、Rowasa、Canasa、Colazal，例如含美沙拉秦(mesalamine)药物，例如美沙拉秦与肝素之组合；TNF-α抑制物或抑制子，例如除本发明之TNF-α抑制物或抑制子以外，如结合TNF-α之抗体，例如英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)、氧化氮释放型非类固醇抗炎药(NSAID)，例如包括COX抑制型NO供体型药物(CINOD)；磷酸二酯酶，例如PDE4B抑制物、胱天蛋白酶抑制物；“多功能抗炎”药(MFAID)，例如胞质磷脂酶A2(cPLA2)抑制物，如与糖胺聚糖连接之膜锚定的磷脂酶A2抑制物。在其它优选实施方案中，一或多种优选实施方案之TNF-α抑制化合物与一或多种非类固醇抗炎药(NSAID)或治疗关节炎或其它炎性疾病之其它药物化合物组合提供。优选化合物包括(但不限于)塞来考昔(celecoxib)；罗非考昔(rofecoxib)；NSAID，例如阿司匹林(aspirin)、塞来考昔、三水杨酸胆碱镁(cholinemagnesiumtrisalicylate)、双氯芬酸钾(diclofenacpotassium)、双氯芬酸钠(diclofenacsodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮基布洛芬(ketoprofen)、酮洛酸(ketorolac)、甲芬那酸(melenamicacid)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxensodium)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、罗非考昔、双水杨酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、及托美丁(tolmetin)；及皮质类固醇(corticosteroid)，例如可的松(cortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲拨尼龙(methylprednisolone)、拨尼松(prednisone)、拨尼松龙(prednisolone)、倍他米松(betamethesone)、二丙酸氯地米松(beclomethasonedipropionate)、布地奈德(budesonide)、地塞米松磷酸钠(dexamethasonesodiumphosphate)、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、倍他米松(betamethasone)、氟轻松(fluocinolone)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、二丙酸倍他米松(betamethasonedipropionate)、戊酸倍他米松(betamethasonevalerate)、地奈德(desonide)、去轻米松(desoximetasone)、肤轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、丙酸氯倍他索(clobetasolpropionate)及地塞米松(dexamethasone)。在尤其优选实施方案中，一或多种TNF-α抑制化合物与一或多种β刺激剂、吸入皮质类固醇、抗组织胺剂、激素或治疗哮喘、急性呼吸窘迫或其它呼吸道疾病之其它药物化合物组合提供。优选化合物包括(但不限于)β刺激剂，例如通常开出之支气管扩张药；吸入皮质类固醇，例如倍氯米松、氟替卡松、曲安西龙、莫米松(mometasone)及泼尼松形式(如泼尼松、泼尼松龙及甲泼尼龙)；抗组胺剂，例如阿扎他定(azatadine)、卡比沙、明/伪麻黄喊(carbinoxamine/pseudoephedrine)、西替禾Ijf1秦(cetirizine)、赛庚F(cyproheptadine)、右氣苯敏(dexchlorpheniramine)、与巨索定(fexofenadine)、氯雷他定(Ioratadine)、异丙嗪(promethazine)、曲吡那敏(tripelennamine)、溴苯那敏(brompheniramine)、氯苯那敏(cholopheniramine)、氯马斯汀(clemastine)、苯海拉明(diphenhydramine)；及激素，例如肾上腺素。在尤其优选实施方案中，一或多种TNF-α抑制化合物与一或多种麻醉剂组合提供，该一或多种麻醉剂例如乙醇、布比卡因(bupivacaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、左布比卡因(Ievobupivacaine)、利多卡因(Iidocaine)、甲哌卡因(m印ivacaine)、普鲁卡因(procaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、丁卡因(tetracaine)、地氟烧(desflurane)、异氟烷(isoflurane)、开他敏(ketamine)、丙泊酚(propofol)、七氟烷(sevoflurane)、可待因(codeine)、芬太尼(fentanyl)、氢吗啡酮(hydromorphone)、丁哌卡因(marcaine)、哌替唆(meperidine)、美沙酮(methadone)、吗啡(morphine)、轻考酮(oxycodone)、瑞芬太尼(remifentanil)、舒芬太尼(sufentanil)、布托啡诺(butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)、曲马多(tramadol)、苯佐卡因(benzocaine)、狄步卡因(dibucaine)、氯乙烧(ethylchloride)、赛洛卡因(xylocaine)及非那吡啶(phenazopyridine)。在尤其优选实施方案中，一或多种TNF-α抑制化合物与治疗过敏性肠病(irritableboweldisease)之药物化合物(如硫唑嘌呤或皮质类固醇)组合提供于药物组合物中。在尤其优选实施方案中，一或多种TNF-α抑制化合物与免疫抑制化合物组合提供于药物组合物中，在尤其优选实施方案中，一或多种TNF-α抑制与一或多种治疗自体免疫病症之药物组合提供，所述药物例如生物反应调节剂，如依那西普(etanerc印t)、英夫利昔单抗；及抑制或干扰肿瘤坏死因子之其它化合物。在尤其优选实施方案中，一或多种TNF-α抑制化合物与类固醇组合提供，类固醇包括皮质类固醇，例如可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松、泼尼松龙、倍他米松、二丙酸倍氯米松、布地缩松、地塞米松磷酸钠、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、曲安奈德、倍他米松、氟轻松、醋酸氟轻松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、地奈德、去羟米松、肤轻松、曲安西龙、曲安奈德、丙酸氯倍他索及地塞米松。在某些疾病之治疗中，用TNF-α抑制子与麻醉剂组合治疗患者可为有益的，该麻醉剂例如乙醇、布比卡因、氯普鲁卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、普鲁卡因、罗哌卡因、丁卡因、地氟烷、异氟烷、开他敏、丙泊酚、七氟烷、可待因、芬太尼、氢吗啡酮、丁哌卡因、哌替啶、美沙酮、吗啡、羟考酮、瑞芬太尼、舒芬太尼、布托啡诺、纳布啡、曲马多、苯佐卡因、狄步卡因、氯乙烷、赛洛卡因及非那吡啶。体外合成哺乳动物β防御素如人β防御素2可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成装置是可用的，例如AppliedBiosystems公司、Beckman等之自动合成仪。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸、尤其D-异构物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-异亮氨酸)、非对映异构物、具有不同长度或官能团之侧链等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制备方式将由适宜性、经济性、所需纯度等确定。可提供与包含便于键联的官能团之多种肽或蛋白质之化学连接，所述官能团对于酰胺或经取代胺形成(例如还原胺基化)而言为胺基，对于硫醚或二硫化物形成而言为硫醇基，对于酰胺形成而言为羧基等。如果需要，在合成期间或表达期间可向肽中引入多个允许与其它分子或表面连接之基团。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，组氨酸用于连接于金属离子复合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其类似物。也可根据重组合成之常规方法分离且纯化哺乳动物β防御素。裂解物可由表达宿主制备，且裂解物可使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化。本发明之其它方面及实施方案概述如下权利要求10.—种哺乳动物β防御素，其用于治疗选自下组的炎性疾病或病症类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化)、狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、(急性)肾小球性肾炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、异位性/特应性皮炎、毛发脱落、鼻炎(过敏性)、过敏性结膜炎、重症肌无力、硬皮病、肉状瘤病、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、青少年特发性关节炎、格雷夫斯病、斯耶格伦氏综合征及贝塞特氏病。权利要求11.如权利要求10之哺乳动物β防御素，其系胃肠外施用。权利要求12.如权利要求11之哺乳动物β防御素，其系皮下或静脉内施用。权利要求13.如权利要求10至12中任一项之哺乳动物β防御素，其为人β防御素。权利要求14.如权利要求10至13中任一项之哺乳动物β防御素，其与SEQIDNO=USEQIDN0:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4之氨基酸序列具有至少80%的同一性。权利要求15.如权利要求10至14中任一项之哺乳动物β防御素，其为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。权利要求16.如权利要求10至15中任一项之哺乳动物β防御素，其与SEQIDNO2之氨基酸序列具有至少80%的同一性。权利要求17.如权利要求10至16中任一项之哺乳动物β防御素，其为人β防御素2。权利要求18.如权利要求10至17中任一项之哺乳动物β防御素，其中在所治疗组织中TNF-α活性降低。本发明由下列实施例进一步描述，所述实施例不应理解为限制本发明之范围。实施例实施例1人β防御素2(hBD2)之抗炎活性在测试hBD2之免疫调节效应期间，出乎意料地观察到hBD2具有巨大的抗炎潜力。在人PBMC培养物中，观察到用hBD2治疗对LPS、LTA或肽聚糖刺激培养物之细胞因子谱产生重大影响。先前已观察到hBD2能够诱导促炎性细胞因子及趋化因子IL-6、IL-1β、RANTES、IP-IO及IL-8(Niyonsaba等，2007;BoniottoΜ.等，2006)。此处，我们显示hBD2对两种促炎性细胞因子TNF及IL-Iβ具有下调潜力；且hBD2在酯多醣(LPS)、脂磷壁酸(LTA)或肽聚糖(PGN)诱导炎性刺激后也诱导IL-10。IL-10为潜在抗炎细胞因子且因此所得hBD2之效应为抗炎效应。人PBMC、单核细胞细胞系及类树突细胞系(dendritoidcellline)已观察到该结果。材料及方法hBD2之产牛重组产生hBD2。将编码hBD2之合成DNA片段(DNA2.0)克隆入pET_32(+)表达载体(Novagen)中。所得质体编码翻译融合肽，该翻译融合肽含有N-末端硫氧还蛋白部分，继之以his-标记、肠激酶切割位点且最后为hBD2肽。将表达质体转化入大肠杆菌(E.coli)菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨苄青霉素之TB-甘油中将该菌株之过夜培养物稀释100倍且在37°C生长至0D600为约8且用0.5mMIPTG诱导3小时，此后通过离心收获细胞。使用标准规程在Ni-NTA珠(QIAGEN)上纯化his标记之trx_hBD2融合肽。接着将his-标记纯化的融合肽过夜透析于肠激酶缓冲剂(50mMtris-HCKpH7.5)UmMCaCl2)中，且用肠激酶切割以释放成熟hBD2。使用Source15S基质(AmershamBiosciences)通过阳离子交换层析进一步纯化hBD2肽。使用MALDI-T0F质谱验证hBD2之正确分子量。使用相同的规程产生mBD3(参见实施例4)。随后使用与LC-MS及NMR光谱偶联之胰蛋白酶消化验证hBD2分子之适当折迭及二硫桥拓扑学。由制备型RP-HPLC在低pH值自hBD2及mBD3制备物移除内毒素，且由LAL测定(EndosafeKTA2)测定内毒素含量且发现水平低于测定之检测限(0.05EU/mg)。为确定低于内毒素测定之检测限的水平不能刺激PBMC，作以极有效脂多醣(大肠杆菌，0111:B4,SigmaL4391)刺激之滴定曲线。极低水平之该LPS(0.06ng/ml)能够刺激PBMC产生可检测之细胞因子。分离及刺激PBMC自健康志愿者(经丹麦相关伦理委员会批准)抽取外周血。用RPMI1/1(ν/ν)稀释肝素化血液，且在抽取的2小时内使之进行Ficoll密度离心。自个别供体之上层收集血浆且保持在冰上直至其以2%用于培养基中(自体培养基)。将经分离PBMC重悬于自体培养基中且接种于96孔培养板中，每孔255，000个细胞，总体积为200微升。以100、10或1μg/mlhBD2单独刺激或与0.6ng/mL或20ng/mLLPS(大肠杆菌，0111:B4,SigmaL4391)、1.25μg/ml脂磷壁酸(LTA)(来自枯草杆菌(B.subtilis)，SigmaL3265)或40μg/ml肽聚糖(PGN)(来自金黄色葡萄球菌(S.aureus),Sigma77140)一起刺激来自相同供体之PBMC。在最初实验中针对3种不同供体优化用于刺激之浓度，对于LPS，使用两种不同浓度以确保其处于有可能调节之细胞因子水平。在一些实验中，用地塞米松及吲哚美辛单独以及与LPS或LTA—起处理PBMC作为下调炎性细胞因子之对照。在37°C温育24小时后收集上清液，且储存在_80°C直至测量细胞因子。在所有实验中由AlamarBlue(Biosource，DALLl100)测量生存力，且在一些情况下也根据制造商之说明书由MTS(Promega)测量生存力，且在一些实验中，也通过以Nucleocounter计数细胞来判断。培养及刺激MUTZ-3将人骨髓白血病衍生之细胞系MUTZ_3(DSMZ，Braunschweig,Germany)维持在补充有20%[体积/体积(ν/ν)]胎牛血清(SigmaF6178)及40ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems215-GM-050)的a-MEM(SigmaM4526)中。所述祖细胞位于以下说明之单核细胞细胞系中且所述单核细胞用100、10或1μg/mlhBD2单独刺激或与LPS或LTA—起刺激。树突细胞分化为产生类树突细胞系，使人骨髓白血病细胞系MUTZ-3(1XIO5个细胞/毫升)在rhGM-CSF(150ng/ml)及rhlL_4(50ng/ml)存在下分化成不成熟DC历时7天。每2_3天更换培养基。进一步在hBD2存在或不存在下用LPS或LTA刺激分化之细胞系以探索hBD2对树突细胞之效应。细胞因子测量在FACSarray流式细胞仪上根据制造商之说明书(BD)用人发炎细胞计数珠阵列(CBA)通过流式细胞术测量上清液中细胞因子之产生。测量以下细胞因子IL-8、IL-Iβ、IL-10、TNF、IL-12p70、IL-6。在一些实验中，根据制造商之说明书由R&Dsystems之ELISA套组(IL-10、TNF-α、IL-Iβ)测量细胞因子。数据分析所有实验执行至少两次，显示代表性结果。所呈现之数据可以平均值+/_标准偏差(SD)表示。由变量为治疗(hBD2、地塞米松等)及刺激(LPS、LTA、肽聚糖等)之双因子O-way)AN0VA，然后是Bonferroni后检验(post-test)确定统计显著性，如表标注中所报导的。ρ<0.05视为差异显著。MM测试hBD2对经或未经LPS及LTA治疗之人PBMC之效应(表1、2及幻。hBD2之治疗使得所有三个测试浓度之刺激培养物中之TNF显著下调(表1)，该下调对0.6ng/ml之LPS而言及对LTA而言系剂量依赖的。对于IL-Iβ，主要在最高剂量下观察到下调(表2)。引人关注的是IL-10剂量依赖性显著上调(表幻。促炎性细胞因子之下调及抗炎细胞因子之诱导显示hBD2之极强抗炎潜力。由两种不同测定测量生存力以排除hBD2归因于细胞毒性效应之抗炎效应。在表4及表5中，可见hBD2不对细胞产生细胞毒性效应，所观察到之效应为归因于导致细胞增殖之LPS或LTA之刺激的刺激效应。因此，hBD2对所述细胞不具有细胞毒性效应。在表6、7及8中，由ELISA而不是由流式细胞术以细胞计数珠阵列分析另一供体之上清液之细胞因子，此处观察到相同结果，但测定之灵敏度较低且检测限高得多，且因此效应不显著。为测试另一铎样受体配体，研究hBD2对肽聚糖刺激之PBMC的效应(表9及10)。观察到相同结果TNF剂量依赖性下调且IL-10剂量依赖性诱导。作为TNF下调之阳性对照，在测定中测试两种抗炎化合物，地塞米松及吲哚美辛。选择浓度以使化合物无毒且为由于培养基中之溶解度可实现之浓度。经LTA刺激后，仅吲哚美辛抑制TNF(表11)，而地塞米松有效下调TNF产生，IL-Iβ也观察到相同结果(表13)。吲哚美辛为C0X-1及C0X-2抑制物且为用于治疗轻度至中度疼痛之非类固醇抗炎药(NSAID)且有助于减轻关节炎之症状，且地塞米松为主要用于治疗炎性病症之合成糖皮质激素且其在极低剂量下对促炎性细胞因子具有极有效的下调效应(Rowland等，1998)，对于TNF-α及IL-Iβ，我们也观察到相同结果。hBD2与该两种抗炎化合物一样有效或比其更好。在表14及15中，显示了hBD2对单核细胞细胞系中之下调TNF及树突细胞的效应，对PBMC也观察到相同结果。经hBD2及LPS或hBD2及LTA刺激之树突细胞也诱导IL-10(结果未显不)。为排除hBD2与LPS或LTA之结合引起TNF及IL-Iβ之下调，测试hBD2对合成配体(Pam3CSK4(TLR2-TLR1配体)，InvivoGentlrt-pms)所致之PBMC刺激的效应。在经该配体刺激后，hBD2也能够下调TNF，表明LPS或LTA之中和不会引起所观察到的效应(结果未显示)。此外，含有TNF-α及IL-a之细胞因子混合物(cocktail)连同hBD2对树突细胞之刺激与单独用细胞因子混合物之刺激相比对IL-Iβ及IL-8及IL-6具有下调效应。显然，未分析到归因于TNF-α之刺激之对TNF的效应(结果未显示)。表1在hBD2存在及不存在下经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生TNF，所有样本针对相同供体测试，出自5个供体之代表性实验。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，_指由双因子ANOVA分析(各数据组之N=约200)，与各自对照(粗体)相比，ρ<0.001。权利要求1.哺乳动物β防御素在制造用于治疗选自下组的炎性疾病或病症的药物中的用途类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化)、狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、(急性)肾小球性肾炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、异位性/特应性皮炎、毛发脱落、鼻炎(过敏性)、过敏性结膜炎、重症肌无力、硬化性皮炎、肉状瘤病、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、青少年特发性关节炎、格雷夫斯病(Gravesdisease)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)、及贝塞特氏病(Behfetdisease)。2.根据权利要求1的用途，其中该药物是胃肠外施用的。3.根据权利要求2的用途，其中该药物是皮下或静脉内施用的。4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素以约0.001mg/kg体重至约10mg/kg体重，优选约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重的每日剂量施用。5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQIDNO2,SEQIDNO:3或SEQIDNO4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDΝ0:2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素2。10.根据权利要求1-9中任一项的用途，其中TNF-α活性在所治疗的组织中降低。11.一种治疗哺乳动物组织中的炎性疾病或病症的方法，其包括向需要所述治疗的哺乳动物以有效量施用哺乳动物β防御素，其中该炎性疾病或病症选自下组类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化)、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮、(急性)肾小球性肾炎、哮喘(如支气管哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、炎性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn'sdisease))、结肠炎(例如溃疡性结肠炎)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎(例如炎性皮炎)、异位性/特应性皮炎、毛发脱落、鼻炎(过敏性)、过敏性结膜炎、重症肌无力、硬化性皮炎、肉状瘤病、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎、青少年特发性关节炎、格雷夫斯病、斯耶格伦氏综合征、及贝塞特氏病。12.权利要求11的方法，其中该有效量有效降低所治疗组织中之TNF-α活性。13.权利要求11的方法，其中该人β防御素是胃肠外施用的，如皮下或静脉内施用的。14.权利要求11的方法，其中该哺乳动物β防御素以约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重，优选约0.lmg/kg体重至约10mg/kg体重的每日剂量施用。15.权利要求11的方法，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。16.权利要求11的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO4之氨基酸序列具有至少80%的同一性。17.权利要求11的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。18.权利要求11的方法，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。全文摘要本发明系关于使用哺乳动物β防御素抑制TNF-α活性，其在治疗与肿瘤坏死因子α相关之病理学病状具有效用。文档编号A61P19/00GK102159232SQ200980136342公开日2011年8月17日申请日期2009年7月17日优先权日2008年7月18日发明者伯吉特·安德森,卡罗琳·S·布林奇,坦贾·M·R·凯尔,托马斯·克鲁泽,泽伦·凯拉尔夫,珀尔·H·迈金德申请人:诺维信阿德宁生物技术公司