使用哺乳动物β防御素的炎性肠病的治疗的制作方法
专利名称：使用哺乳动物β防御素的炎性肠病的治疗的制作方法
使用哺乳动物β防御素的炎性肠病的治疗涉及序列表本申请含有呈计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文中。发明背景发明领域本发明涉及通过施用哺乳动物β防御素而预防与治疗炎性肠病。背景人防御素在许多其它元件中，先天免疫的关键组分为个别显示相当大选择性但集体能够快速杀死广谱的细菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更为突出，且其有可能由所有多细胞生物体产生。在人类中，优势AMP为防御素。人防御素为阳离子小肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键之拓扑学可分为α-防御素及β-防御素。α-防御素可进一步细分为首先自嗜中性粒细胞颗粒分离的α-防御素 (ΗΝΡ1-4)及由Paneth细胞在小肠隐窝中表达的α -防御素(HD5及HD6)。β -防御素主要由多种组织及器官中的上皮细胞产生，所述组织及器官包括皮肤、气管、胃肠道、泌尿生殖系统、肾、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成员为hBDl_3。 然而，使用多种生物信息学工具，已在人基因组中注释了几乎40个编码推定β -防御素同源物的开放阅读框。一些人防御素是组成型产生的，而其它是由促炎性细胞因子或外源微生物产物诱导的。已经越来越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有宽范围的免疫调节/替代性质。所述性质包括诱导多种趋化因子及细胞因子、趋化活性及细胞凋亡活性，诱导前列腺素、组胺及白细胞三烯释放，抑制补体，通过铎样受体(toll-like receptor)信号传导刺激树突细胞成熟，以及刺激由嗜中性粒细胞的病原体清除。此外，人防御素也在伤口愈合、上皮及成纤维细胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管发生(vasculogenesis) 中起作用。有越来越多的人防御素在许多感染性及炎性疾病中发挥重要作用的证据。发炎和 /或感染皮肤中通常观察到人防御素之过表达，很可能是因为由微生物组分或内源性促炎性细胞因子局部诱导。在牛皮癣(psoriasis)中，hBD2及hBD3过于充足，且在患有寻常痤疮(acne vulgaris)或浅表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受损上皮中观察到hBD2的显著上调。另一方面，异位性/特应性皮炎(topic dermatitis)与hBD2及 hBD3的下调相关。回肠克罗恩氏病(Crohn' s disease)与HD5及HD6的缺陷表达相关， 且在结肠中的克罗恩氏病中，hBD2-4的表达下调。细胞因子细胞因子为来自高级真核生物的小的分泌多肽，其负责细胞间信号转导且影响其它细胞之生长、分裂和功能。它们是有效的多效性多肽，其例如经由相应受体充当局部或全身性细胞间调控因子，且因此在许多生物过程(如免疫、发炎及造血)中起关键作用。细胞因子由多样细胞类型产生，所述细胞类型包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞/ 单核细胞及淋巴细胞。 TNF-α涉及多种生理病原性过程且可如在宿主防御中具有保护性或如在自体免疫中具有有害性。TNF-α为关键细胞因子之一，其引发且维持发炎反应，且已证明TNF-a 失活在下调与自体免疫疾病相关之炎性反应中是重要的。感染后，巨噬细胞大量分泌 TNF-α且TNF-α通过刺激内皮细胞产生粘附分子及通过产生作为趋化细胞因子之趋化因子来介导嗜中性粒细胞及巨噬细胞募集(recruitment)至感染部位。TNF-α有助于活化白血球及其它炎性细胞且增加损伤组织内之血管渗透性。TNF-α主要由巨噬细胞、单核细胞及树突细胞产生，但也可由多种其它细胞类型产生，所述细胞类型包括淋巴样细胞、肥大细胞、内皮细胞、心肌细胞、脂肪组织、成纤维细胞及神经元组织。当前的抗炎药通过与TNF-α结合且因此阻止TNF_a向细胞表面上TNF_a之受体传导信号来阻断TNF-a之作用。该类型之阻断具有某些严重的副作用，其中一些为感染，如肺结核、败血症及真菌感染且可能使癌症发病率增加。IL-10,也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，也作为抗炎细胞因子是免疫调控的关键参与者。该细胞因子由数种细胞类型产生，所述细胞类型包括单核细胞、巨噬细胞、 T细胞、B细胞、树突细胞及肥大细胞。该细胞因子在免疫调控及发炎作用中具有多效性效应。其下调促炎性细胞因子、由Thl/Thl7细胞分泌之细胞因子、MHC第II类Ag及共刺激分子于抗原呈递细胞上的表达。IL-10也由称为调控T细胞(Tregs)之T细胞群体分泌。 所述细胞不阻止最初T细胞活化；相反，其抑制持续反应且阻止慢性和潜在破坏性的反应。 在周边中，一些T细胞被抗原及IL-10或TGF-β诱导成为Tregs。IL-10诱导之Tregs为 ⑶4+/⑶25+/Foxp3-且称为Trl细胞。所述细胞通过分泌IL-10抑制免疫反应。最近研究已公开在鉴定Thl7细胞时T细胞效应子谱系之多样化大于Thl/Th2/Treg。已显示该亚群在先前归因于Thl系之数种自体免疫疾病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣及多发性硬化)中呈病原性。由Thl7分泌之细胞因子也被IL-10下调，且阻断TNF通过使Thl7细胞失活而预防牛皮癣。IL-10之总体活性为抗炎性，且已在数个动物研究中显示预防发炎及损伤，然而因为IL-10施用途径及其生物半衰期方面的困难，所以临床IL-10治疗仍然不足。炎性肠病炎性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)定义为来源模糊的慢性、复发性肠发炎。IBD指两种不同的病症克罗恩氏病与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)。两种疾病似乎皆由于在肠中的炎性反应之过度活化。此炎性级联(cascade)被认为通过促炎性细胞因子之作用与淋巴细胞亚组之选择性活化而永存。在患有IBD的患者中，肠之内衬之溃疡与发炎导致腹痛、腹泻、和直肠出血之症状。溃疡性结肠炎在大肠中发生，而在克罗恩氏病中，疾病可涉及整个GI道以及小肠与大肠。对于大多数的患者而言，IBD为慢性病况，其症状持续数月至数年。其在年轻成人最常见，但可于任何年龄发生。其在世界各地发现，但于工业化国家(例如美国、英国、与北欧)最常见。其在犹太裔人口中特别常见且在发生率也有种族差异。IBD之临床症状为间歇性直肠出血、狭窄性腹痛、体重丧失与腹泻。 IBD之诊断基于临床症状，使用钡灌肠，但直接可视化(乙状结肠镜或结肠镜)为最精确的测试。长期IBD为结肠癌之风险因子，且治疗IBD可涉及药物治疗与手术。有些患UC的患者仅在直肠具有疾病(直肠炎)。其它患UC的患者具有限于直肠与邻近的左结肠的疾病(直肠乙状结肠炎)。又其它者具有整个结肠之UC(普遍性IBD)。 UC之症状一般在患有更广泛疾病(较大部分的结肠牵涉疾病)者更严重。对于具有限于直肠的疾病(直肠炎)或限于左结肠之末端的UC(直肠乙状结肠炎)的患者，预后比具有全结肠UC者佳。使用口服药物治疗或灌肠的短暂周期性治疗可能已足够。在所述具有更广泛疾病者，来自发炎肠的血液丧失可导致贫血，且可能需要以铁补给或甚至输血治疗。罕见地，当发炎变得非常严重时，结肠可剧烈地膨胀成大尺寸。此病况称为毒性巨结肠。患有毒性巨结肠的患者有发烧、腹痛与膨胀、脱水与营养失调而极端不健康。除非患者因药物治疗而快速改善，通常需要手术以预防结肠破裂。克罗恩氏病可于胃肠道之所有区域发生。在此疾病中，胃肠道由于发炎阻塞且纤维化在大多数患者中发生。肉芽肿与瘘管形成为克罗恩氏病之常见并发症。疾病进展结果包括静脉内出血、手术与结肠造口术。IBD可通过药物而治疗。最常用以治疗IBD的药物为抗发炎药物，如水杨酸盐。水杨酸盐制备物已有效治疗轻度至中度疾病。当药物长期使用时，其等也可减少疾病爆发之频率。水杨酸盐之实例包括柳氮磺吡啶、奥沙拉秦、和美沙拉秦。所有此等药物皆以口服以高剂量给予以实现最大治疗利益。此等药物并非没有副作用。当以高剂量服用时，柳氮磺吡啶可造成胃不适，且一些水杨酸盐制备物已被报导会罕见地造成轻度肾脏发炎。皮质类固醇在治疗IBD中比水杨酸盐更有潜力且更快速起作用，但潜在地副作用对将皮质类固醇用于具有更严重疾病的患者造成限制。皮质类固醇之副作用通常于长期使用发生。其等包括使骨骼变细且使皮肤变薄、感染、糖尿病、肌肉消耗、使脸变圆、精神病混乱、与(罕见发生)髋关节破坏。在不对水杨酸盐或皮质类固醇反应的IBD患者中，则使用抑制免疫系统的药物。 免疫抑制剂之实例包括硫唑嘌呤与6-巯嘌呤。用于此情况的免疫抑制剂帮助控制IBD且允许逐渐减少或排除皮质类固醇。然而，免疫抑制剂使患者免疫缺损且易受许多其它疾病影响。用于研究IBD的广为认可的模型之一为DSS结肠炎小鼠模型，如于Kawada等 “Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease", World J.Gastroenterol. , Vol. 13 (42), pp. 5581-5593 (2007)；以及 Wirtz 与 Neurath "Mouse models of inflammatory bowel disease”，Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 59 (11), 1073-1083 (2007)中所述。明显地，有对于能够预防与治疗IBD的药剂之巨大需要。使用人防御素治疗炎性肠病引人关注的是，小肠中的克罗恩氏病与潘纳斯细胞(Paneth cell) α -防御素HD5 及HD6之水平降低相关，而结肠中的克罗恩氏病与β -防御素hBD2及hBD3之产生减少相关(Gersemarm等，2008 ；Wehkamp等，2005)。此外，已有力地证明克罗恩氏病之发病机制中涉及肠微生物区(Swidsinski等，200 。所述研究人员通过使用荧光原位杂交显示在活性克罗恩氏病中，观察到粘膜相关且具侵袭性之细菌之急剧增加，而正常小肠上皮及大肠上皮中无所述细菌。这些观察结果一起合并成一个假设，该假设表明在健康人中，沿肠上皮屏障之适当水平之防御素起作用以控制腔内(luminal)细菌之组成及数目且使其不粘附及入侵粘膜而触发发炎(Wang等，2007)。另一方面，在能力不足以产生保护性水平之分泌防御素的人中，抗微生物防御与腔内细菌之间的平衡会改变。结果，这使得细菌入侵基础 (underlying)肠组织，从而诱导炎性状态，而这又可能发展成克罗恩氏病。 基于该假设，WO 2007/081486公开了数种人防御素在炎性肠病之治疗中之用途。 发明者提出以使防御素在肠腔中之适当位置释放之配制物形式经口向克罗恩氏病患者施用的防御素将减少入侵细菌之数目，重建正常上皮屏障功能且因此降低炎性疾病之严重性。根据WO 2007/081486，防御素之功能在于直接靶向且杀死腔中之细菌，从而阻止其入侵上皮组织。即，防御素完全起抗感染化合物作用。关于W0/2007/081486，令人惊讶的是胃肠外施用之hBD2能够降低小鼠中DSS诱导之结肠炎的严重性，因为通过使用该施用途径，肽从未遇到腔内细菌。另外，我们此处显示hBD2之作用为减小由PBMC分泌之促炎性细胞因子TNFa、IL-I β及IL-23之水平。已知这些细胞因子是许多炎性疾病包括炎性肠病中的关键参与者。多于十年已知的是，除抗微生物功能外，防御素也具有多种免疫调节功能。然而，大部分关于人防御素之免疫调节性质之著作描述其主要具有促炎性或免疫增强功能(参见例如，Niyonsaba 等，2007 ；Bowdish 等，2006 ；Lehrer, 2004)。因此，确实出乎意料的是胃肠外施用之hBD2能够降低炎性肠病中的疾病严重性。 首先，当胃肠外施用时，hBD2决不会到达肠腔从而遇到参与诱导疾病之有害细菌。此外，基于大部分公开之文献，如此处所提供之著作中所观察到的，将预期进入血流之防御素将诱导促炎性而非抗炎性反应。发明详述定义EM:如本文所用之术语“防御素”系指本领域的技术人员公认属于抗微生物肽之防御素类别之多肽。为确定多肽是否为根据本发明之防御素，可通过使用免费可用之 HMMER软件包将氨基酸序列与PFAM数据库之隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)比较。PFAM防御素家族包括例如防御素-1或“哺乳动物防御素”(登录号PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登录号PF00711)。本发明之防御素属于β防御素类。β防御素类之防御素享有共同的结构特征，如半胱氨酸模式。根据本发明之防御素之实例包括人β防御素1 (hBDl ；参见SEQ ID NO :1)、人β 防御素2(hBD2 ；参见SEQ ID N0:2)、人β防御素3 (hBD3 ；参见SEQ ID N0:3)、人β防御素4_4 ；参见SEQ ID NO 4)及小鼠β防御素3(mBD3 ；参见SEQ ID NO 6)。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 276~277 ；http:// emboss, org)，优选3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口延伸罚分(0. 5)及EBL0SUM62 (BL0SUM62 之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同残基X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，同上；http://emboss, org)、优选 3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970， 同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口扩展罚分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4之EMBOSS版本)取代矩阵。使用 Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。经分离多肽如本文所用之术语“经分离变体”或“经分离多肽”系指自来源分离之变体或多肽。在一方面中，如SDS-PAGE所测定的，变体或多肽为至少纯，优选至少5% 纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文中表示含有按重量计至多10%、 优选至多8 %、更优选至多6 %、更优选至多5 %、更优选至多4 %、更优选至多3 %、甚至更优选至多2%、最优选至多且甚至最优选至多0. 5%与之天然或重组相关之其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽按制备物中所存在之总多肽物质之重量计为至少92 %纯，优选至少94 %纯，更优选至少95 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少97 %纯， 更优选至少98 %纯，甚至更优选至少99 %纯，最优选至少99. 5 %纯且甚至最优选100 %纯。 本发明之多肽优选呈实质上纯的形式。此可例如通过由众所周知之重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。哺乳动物β防御素本发明涉及哺乳动物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治疗炎性肠病(如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)中的医药用途。治疗优选与降低所治疗组织中之TNF-α活性相关。在一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6中之任一氨基酸序列具有至少 80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO 4中之任一氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 1(SEQ ID NO :1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID NO :2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)、人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)、人β防御素4之变体(SEQ ID NO 5)和/或小鼠β防御素3 (SEQ ID NO 6)组成。在一甚至更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 KSEQ ID Ν0:1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID N0:2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)和 / 或人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)组成。
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在另一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO :2之氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO 2)组成。在又一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效变体组成。优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β 防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效变体组成。更优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能等效变体组成。本发 明之哺乳动物β防御素也称为优选实施方案之化合物。在本发明之上下文中，哺乳动物(例如人)β防御素之“功能等效变体 (functionally equivalent variant) ”为对炎性肠病展现与亲本哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之功效的经修饰哺乳动物(例如人)β防御素。优选地，其也展现与哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之对TNF-α活性之功效。根据本发明，哺乳动物(例如人)β防御素之功能等效变体与哺乳动物(例如人) β防御素氨基酸序列相比可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰且尤其1个氨基酸修饰。术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如人)β防御素之任何化学修饰。修饰可为氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链之置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特性之非天然氨基酸。详言之，修饰可为酰胺化，如C-末端酰胺化。优选地，氨基酸修饰是性质上较不重要的，其为不显著影响多肽之折叠和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；单缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多约20-25个残基之小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而有利于纯化之小延伸，如多聚组氨酸标记、抗原表位或结合域。保守取代的实例为在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸和甲硫氨酸)组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常发生的交换为 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)来鉴定哺乳动物β防御素中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(g卩，TNF-α活性之抑制)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见 Hilton 等，1996，J. Biol. Chem. 271 4699-4708 必需氨基酸的身份(identity)也可由分析与相关于哺乳动物β防御素之多肽的同一性来推断。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413 ；或 W095/2^25 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示 (例如，Lowman 等，1991 ,Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利 5，223，409 号；WO 92/06204) 和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 :127)。本发明之多肽之N-末端延伸可合适地由1至50个氨基酸、优选2-20个氨基酸、 尤其3-15个氨基酸组成。在一实施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一实施方案中，N-末端延伸包含如下文进一步定义之kex2或kex2_样切割位点。在一优选实施方案中，N-末端延伸为包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途已发现人β防御素2在小鼠中于10-天右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导性结肠炎模型中显著地减轻疾病参数之严重性；因此显示作为用于治疗炎性肠病(如溃疡性结肠炎与克罗恩氏病)的药物的强活性。本发明因此提供治疗炎性肠病的方法，该治疗包含向需要该治疗之受试者胃肠外施用有效量之例如药物组合物形式之哺乳动物β防御素，如人β防御素2。也提供的是哺乳动物β防御素(如人β防御素2)，其用于制造胃肠外施用的药物；及哺乳动物β防御素(如人β防御素2)之用途，其用于制造胃肠外施用的药物，例如药物组合物。治疗包括治疗已有疾病或病症以及预防(prophylaxis (prevention))疾病或病症。在一具体实施方案中，治疗使得所治疗组织中诱导之TNF-α活性降低，优选 TNF-α活性降低且IL-10活性增加。哺乳动物β防御素可治疗性用于组合物中，所述组合物经配制用于经由任何常规途径施用，常规途径包括肠内(例如经颊、经口、经鼻、经直肠)、胃肠外(例如，静脉内、 颅内、腹膜内、皮下或肌肉内)或局部(例如，表皮、鼻内或气管内)。在其它具体实施方案中，本文中描述之组合物可作为持续释放植入物之一部分施用。在另外的其它实施方案中，可利用提供冷冻干燥物稳定性之适当赋形剂将优选实施方案之组合物配制为冷冻干燥物，且接着复水。含有哺乳动物β防御素(如人β防御素)之药物组合物可根据常规方法，例如由混合、造粒、包覆、溶解或冻干过程制造。优选具体实施方案之药物组合物包含哺乳动物β防御素(如人β防御素)及药学上可接受之载剂和/或稀释剂。哺乳动物β防御素(如人β防御素)优选在药物组合物中以有效治疗炎性肠病，优选具有对患者可接受之毒性之量使用。对于该治疗，适当剂量当然依赖于例如所使用之本发明化合物之化学性质及药物动力学数据、个体宿主、施用模式及接受治疗之病状之性质及严重性而变化。然而，一般而言，为在较大哺乳动物，例如人中获得令人满意的结果，指示每日剂量优选为约0. OOlg至约1. 5g、更优选约0. Olg至1. Og ；或约0. OOlmg/kg体重至约20mg/kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至20mg/kg体重，更优选约0. lmg/kg体重至约 10mg/kg体重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分开的剂量施用。优选具体实施方案之化合物可以通常使用之类似施用模式及类似剂量向较大哺乳动物，例如人施用。在某些具体实施方案中，优选具体实施方案之药物组合物可包括哺乳动物β防御素(如人β防御素)，其量取决于施用途径为每单位剂型约0. 5mg或更少至约1500mg 或更多，优选约 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8 或 0. 9mg 至约 150、200、250、300、350、400、450、500、600、 700、800、900 或 lOOOmg，且更优选约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25mg 至约 30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些实施方案中，比以上所提及之更低或更高的剂量可为优选的。本领域的技术人员可容易地确定适当的浓度及剂量。本领域的技术人员熟知药学上可接受之载剂和/或稀释剂。对于配制成液体溶液之组合物，可接受之载剂和/或稀释剂包括盐水及无菌水，且可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及其它常见添加剂。组合物也可配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固体溶液、悬浮液、分散液、固态分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、 凝胶、糊状物、吸入剂粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式)。配制物可含有 (除哺乳动物β防御素及其它任选之活性成分外)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖及甜味剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压之盐、缓冲剂、稀释剂、分散剂及表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或如本领域已知之其它药物赋形剂。本领域的技术人员可进一步以适当方式且根据公认操作法(如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro 编，Mack Publishing 公司，Easton，PA 1990 中描述之操作法)配制哺乳动物β防御素。哺乳动物β防御素(如人β防御素)可单独使用或与一种、两种或更多其它药物化合物或药物物质和/或一或多种药学上可接受之赋形剂之组合疗法使用。体外合成哺乳动物β防御素可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成装置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自动合成仪。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸、尤其D-异构物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-异亮氨酸)、非对映异构物、具有不同长度或官能团之侧链等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制备方式将由适宜性、经济性、所需纯度等确定。可提供与包含便于键联的官能团之多种肽或蛋白质之化学连接，所述官能团对于酰胺或经取代胺形成(例如还原胺基化)而言为胺基，对于硫醚或二硫化物形成而言为硫醇基，对于酰胺形成而言为羧基等。如果需要，在合成期间或表达期间可向肽中引入多个允许与其它分子或表面连接之基团。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，组氨酸用于连接于金属离子复合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其类似物。也可根据重组合成之常规方法分离且纯化哺乳动物β防御素或其功能等效物。 裂解物可由表达宿主制备，且裂解物可使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化。本发明由下列实施例进一步描述，所述实施例不应理解为限制本发明之范围。实施例在测试hBD2之免疫调节功效的期间，意外地观察到hBD2具有巨大的抗炎潜力。此处，我们已显示hBD2在小鼠中于治疗由口服施用右旋糖酐硫酸钠(DSS)所诱导的炎性肠病(结肠炎)具有显著的功效。我们也已显示hBD2具有下调TNF-α的潜力。实施例1 人β防御素2之产生重组产生hBD2。将编码hBD2之合成DNA片段(DNA 2. 0)克隆入pET_32(+)表达载体(Novagen)中。所得质粒编码翻译融合肽，该翻译融合肽含有N-末端硫氧还蛋白部分，继之以his-标记、肠激酶裂解位点且最后为hBD2肽。将表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli) 菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨苄青霉素之TB-甘油中将该菌株之过夜培养物稀释100 倍且在37°C生长至0D600为约8且用0. 5mM IPTG诱导3小时，此后通过离心收集细胞。使用标准方案在Ni-NTA珠(QIAGEN)上纯化his标记之trx_hBD2融合肽。随后将his-标记纯化融合肽过夜透析于肠激酶缓冲剂(50mM tris-HCKpH 7. 5) UmM CaCl2)中，且用肠激酶裂解以释放成熟hBD2。使用Source 15S基质(Amersham Biosciences)由阳离子交换层析进一步纯化hBD2肽。使用MALDI-T0F质谱验证hBD2之修正分子量。使用相同方案产生mBD3 (参见实施例7)。随后使用与LC-MS及NMR光谱学偶联之胰蛋白酶消化验证hBD2分子之适当折叠及二硫桥拓扑学。由制备型RP-HPLC在低pH值移除内毒素，且由LAL测定(Endosafe KTA2)测定内毒素含量且发现该水平低于测定之检测限(0.05EU/mg)。为确定低于内毒素测定之检测限之水平不能刺激PBMC，作以极有效脂多糖(大肠杆菌，0111 :B4, Sigma L4391)刺激之滴定曲线。极低水平之该LPS(0.06ng/ml)能够刺激PBMC产生可检测之细胞因子。实施例210天右旋糖酐硫酸钠(dextran sodium sulphate, DSS)诱导之结肠炎小鼠模型以下研究之目的在于确定人β防御素2在经口施用右旋糖酐硫酸钠(DSS)而诱导之急性(10天)炎性肠病(结肠炎)小鼠模型中的抗炎活性。DSS结肠炎小鼠模型为研究炎性肠病之公认模型，如在Kawada等，“ Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease，，,World J. Gastroenterol.,第 13 卷(42),第 5581-5593 页 (2007)；禾口Wirtz及Neurath,"Mouse models of inflammatory bowel disease，，,Advanced Drug Delivery Reviews，第 59 卷(11)，1073-1083 (2007)中所述。材料测试项目人β防御素2(hBD2)；参见以上实施例1。甲泼尼龙21-半琥珀酸盐(“泼尼松龙”)PBS 缓冲剂(GIBCO)实验动物
研究中使用雄性C57BL/6小鼠(Harlan Interfauna Iberica, Barcelona, Spain), 因为其为已证明当经10天施用2% DSS于饮用水中的溶液时产生显著结肠发炎的物种及性别。魅由尾巴上的数字及字母代码鉴定动物。另外，由指示动物数目及性别、测试项目代码或名称、剂量水平、施用途径、处理时间、组编号、研究代码及研究指导者之名字的颜色编码卡鉴定各笼。体重研究起始当天，动物之平均体重为22. 4士0. 16g。适应(检疫)研究起始之前最少7天，在与主要研究相同之条件下。^到达时，将动物随机分开且安置于具有不锈钢盖之聚碳酸酯笼(E型，Charles River, 255 X 405 X 197mm)中。根据性别以每笼5只动物将动物分组安置于具有控制之温度(22士2°C )、光照 (12/12小时光照/黑暗)、空气压力、空气更新次数及相对湿度(30-70% )之动物房中。所有笼底面上均具有Ig屑(Lignocel 3-4 ；HarIan Interfauna Iberica, Spain) 作为褥草(litter)。食物及水让所有小鼠自由取食干燥粒状标准啮齿动物膳食(Teklad Global 2014 ；Harlan Interfauna Iberica, Spain)。于瓶中提供可自由取得的水。周期性分析供应至动物房内之自来水以检查其组成且检测可能的污染物(化学物质及微生物)。设备及材料设备· Sartorius BP 2100 型动物天平 手术解剖设备· Eppendorf 5415C 离心机·尼康(Nikon)Eclipse E600FN 显微镜· Hook & !\icker仪器旋转混合器· IKA UltraiTurrax 均质机· Sartorius BP 221S 型分析天平.ELISA 微板读取器(Labsystems Multiskan EX)材料及试剂·无菌抛弃式注射器(Iml) 无菌蝴蝶型25G输液器·麻醉剂(开他敏(Ketamine)/甲苯噻嗪(Xylazine))·局部麻醉乳膏(EMLA, Astra Zeneca)·右旋糖酐硫酸钠 30，000-50，OOODa(MP Biomedicals)
·磷酸盐缓冲盐水(PBS ；Sigma)·中性缓冲福尔马林(VWR) 牛血清白蛋白(Sigma)·蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)·小鼠 TNF- α ELISA 套组(GE Healthcare)实验方案研究设计将动物分成5个实验组。各组由10只雄性动物组成A组用对照媒剂(PBQ (静脉内)处理B 组用 hBD2 (0. lmg/kg，静脉内)处理C组用hBD2(lmg/kg，静脉内)处理D 组用 hBD2(10mg/kg，静脉内)处理E组用甲泼尼龙(lmg/kg，口服)处理以随机方式将动物分配至所有实验组中。各笼中最多安置5只小鼠(根据指令 86/609/EEC)。在到达实验室时及施用测试项目之前称重所有动物。测试物质之施用通过使用无菌针Q5G)以5ml/kg体重之给药体积以缓慢推注形式经由尾部静脉静脉内施用对照媒剂及hBD2。动物连续10天每天(每M小时)接受一次剂量之相应测试项目(hBD2、泼尼松龙或对照媒剂)。以5ml/kg体重之给药体积以lmg/kg之剂量经口给予泼尼松龙，给药方案与hBD2 相同。实验程序诱导结肠炎通过用2% DSS补充饮用水7天在小鼠中诱导结肠炎。第1天，称重所有小鼠且根据其实验组加以标记。使各笼之饮用瓶装满DSS溶液， 确保所有瓶盖适当安装且没有一个堵塞。第3天，排空瓶中之任何剩余溶液且再用新鲜DSS溶液装满。第5天，再次重复该程序。第8天，舍弃任何剩余溶液且用高压灭菌水更换。2天后，即第10天，处死动物。临床评定(疾病活性指数)每日临床评定DSS-处理的动物，根据以下参数计算验证临床疾病活性指数 (DAI)粪便稠度、直肠出血存在与否及体重减轻，该指数在0至4范围内
权利要求
1.一种哺乳动物β防御素在制造用于胃肠外施用治疗炎性肠病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中该哺乳动物β防御素是皮下或静脉内施用的。
3.根据权利要求1-2中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素以约0.001mg/kg体重至约10mg/kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至约10mg/kg体重的每日剂量施用。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDΝ0:2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素2。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中在所治疗之组织中TNF-α活性降低。
10.一种治疗炎性肠病的方法，该方法包括向需要所述治疗的受试者胃肠外施用有效量的哺乳动物β防御素。
11.权利要求10的方法，其中该有效量有效降低所治疗组织中的TNF-α活性。
12.权利要求10的方法，其中该人β防御素是皮下或静脉内施用的。
13.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素以约0.001mg/kg体重至约IOmg/ kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至约10mg/kg体重之每日剂量施用。
14.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
15.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
16.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO :2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
17.权利要求10的方法，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
全文摘要
本发明系关于使用哺乳动物β防御素治疗炎性肠病。
文档编号A61P1/04GK102159233SQ200980136343
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月18日
发明者伯吉特·安德森, 卡罗琳·S·布林奇, 坦贾·M·R·凯尔, 托马斯·克鲁泽, 泽伦·凯拉尔夫, 珀尔·H·迈金德 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
使用哺乳动物β防御素的炎性肠病的治疗涉及序列表本申请含有呈计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文中。发明背景发明领域本发明涉及通过施用哺乳动物β防御素而预防与治疗炎性肠病。背景人防御素在许多其它元件中，先天免疫的关键组分为个别显示相当大选择性但集体能够快速杀死广谱的细菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更为突出，且其有可能由所有多细胞生物体产生。在人类中，优势AMP为防御素。人防御素为阳离子小肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键之拓扑学可分为α-防御素及β-防御素。α-防御素可进一步细分为首先自嗜中性粒细胞颗粒分离的α-防御素 (ΗΝΡ1-4)及由Paneth细胞在小肠隐窝中表达的α -防御素(HD5及HD6)。β -防御素主要由多种组织及器官中的上皮细胞产生，所述组织及器官包括皮肤、气管、胃肠道、泌尿生殖系统、肾、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成员为hBDl_3。 然而，使用多种生物信息学工具，已在人基因组中注释了几乎40个编码推定β -防御素同源物的开放阅读框。一些人防御素是组成型产生的，而其它是由促炎性细胞因子或外源微生物产物诱导的。已经越来越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有宽范围的免疫调节/替代性质。所述性质包括诱导多种趋化因子及细胞因子、趋化活性及细胞凋亡活性，诱导前列腺素、组胺及白细胞三烯释放，抑制补体，通过铎样受体(toll-like receptor)信号传导刺激树突细胞成熟，以及刺激由嗜中性粒细胞的病原体清除。此外，人防御素也在伤口愈合、上皮及成纤维细胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管发生(vasculogenesis) 中起作用。有越来越多的人防御素在许多感染性及炎性疾病中发挥重要作用的证据。发炎和 /或感染皮肤中通常观察到人防御素之过表达，很可能是因为由微生物组分或内源性促炎性细胞因子局部诱导。在牛皮癣(psoriasis)中，hBD2及hBD3过于充足，且在患有寻常痤疮(acne vulgaris)或浅表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受损上皮中观察到hBD2的显著上调。另一方面，异位性/特应性皮炎(topic dermatitis)与hBD2及 hBD3的下调相关。回肠克罗恩氏病(Crohn' s disease)与HD5及HD6的缺陷表达相关， 且在结肠中的克罗恩氏病中，hBD2-4的表达下调。细胞因子细胞因子为来自高级真核生物的小的分泌多肽，其负责细胞间信号转导且影响其它细胞之生长、分裂和功能。它们是有效的多效性多肽，其例如经由相应受体充当局部或全身性细胞间调控因子，且因此在许多生物过程(如免疫、发炎及造血)中起关键作用。细胞因子由多样细胞类型产生，所述细胞类型包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞/ 单核细胞及淋巴细胞。 TNF-α涉及多种生理病原性过程且可如在宿主防御中具有保护性或如在自体免疫中具有有害性。TNF-α为关键细胞因子之一，其引发且维持发炎反应，且已证明TNF-a 失活在下调与自体免疫疾病相关之炎性反应中是重要的。感染后，巨噬细胞大量分泌 TNF-α且TNF-α通过刺激内皮细胞产生粘附分子及通过产生作为趋化细胞因子之趋化因子来介导嗜中性粒细胞及巨噬细胞募集(recruitment)至感染部位。TNF-α有助于活化白血球及其它炎性细胞且增加损伤组织内之血管渗透性。TNF-α主要由巨噬细胞、单核细胞及树突细胞产生，但也可由多种其它细胞类型产生，所述细胞类型包括淋巴样细胞、肥大细胞、内皮细胞、心肌细胞、脂肪组织、成纤维细胞及神经元组织。当前的抗炎药通过与TNF-α结合且因此阻止TNF_a向细胞表面上TNF_a之受体传导信号来阻断TNF-a之作用。该类型之阻断具有某些严重的副作用，其中一些为感染，如肺结核、败血症及真菌感染且可能使癌症发病率增加。IL-10,也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，也作为抗炎细胞因子是免疫调控的关键参与者。该细胞因子由数种细胞类型产生，所述细胞类型包括单核细胞、巨噬细胞、 T细胞、B细胞、树突细胞及肥大细胞。该细胞因子在免疫调控及发炎作用中具有多效性效应。其下调促炎性细胞因子、由Thl/Thl7细胞分泌之细胞因子、MHC第II类Ag及共刺激分子于抗原呈递细胞上的表达。IL-10也由称为调控T细胞(Tregs)之T细胞群体分泌。 所述细胞不阻止最初T细胞活化；相反，其抑制持续反应且阻止慢性和潜在破坏性的反应。 在周边中，一些T细胞被抗原及IL-10或TGF-β诱导成为Tregs。IL-10诱导之Tregs为 ⑶4+/⑶25+/Foxp3-且称为Trl细胞。所述细胞通过分泌IL-10抑制免疫反应。最近研究已公开在鉴定Thl7细胞时T细胞效应子谱系之多样化大于Thl/Th2/Treg。已显示该亚群在先前归因于Thl系之数种自体免疫疾病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣及多发性硬化)中呈病原性。由Thl7分泌之细胞因子也被IL-10下调，且阻断TNF通过使Thl7细胞失活而预防牛皮癣。IL-10之总体活性为抗炎性，且已在数个动物研究中显示预防发炎及损伤，然而因为IL-10施用途径及其生物半衰期方面的困难，所以临床IL-10治疗仍然不足。炎性肠病炎性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)定义为来源模糊的慢性、复发性肠发炎。IBD指两种不同的病症克罗恩氏病与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)。两种疾病似乎皆由于在肠中的炎性反应之过度活化。此炎性级联(cascade)被认为通过促炎性细胞因子之作用与淋巴细胞亚组之选择性活化而永存。在患有IBD的患者中，肠之内衬之溃疡与发炎导致腹痛、腹泻、和直肠出血之症状。溃疡性结肠炎在大肠中发生，而在克罗恩氏病中，疾病可涉及整个GI道以及小肠与大肠。对于大多数的患者而言，IBD为慢性病况，其症状持续数月至数年。其在年轻成人最常见，但可于任何年龄发生。其在世界各地发现，但于工业化国家(例如美国、英国、与北欧)最常见。其在犹太裔人口中特别常见且在发生率也有种族差异。IBD之临床症状为间歇性直肠出血、狭窄性腹痛、体重丧失与腹泻。 IBD之诊断基于临床症状，使用钡灌肠，但直接可视化(乙状结肠镜或结肠镜)为最精确的测试。长期IBD为结肠癌之风险因子，且治疗IBD可涉及药物治疗与手术。有些患UC的患者仅在直肠具有疾病(直肠炎)。其它患UC的患者具有限于直肠与邻近的左结肠的疾病(直肠乙状结肠炎)。又其它者具有整个结肠之UC(普遍性IBD)。 UC之症状一般在患有更广泛疾病(较大部分的结肠牵涉疾病)者更严重。对于具有限于直肠的疾病(直肠炎)或限于左结肠之末端的UC(直肠乙状结肠炎)的患者，预后比具有全结肠UC者佳。使用口服药物治疗或灌肠的短暂周期性治疗可能已足够。在所述具有更广泛疾病者，来自发炎肠的血液丧失可导致贫血，且可能需要以铁补给或甚至输血治疗。罕见地，当发炎变得非常严重时，结肠可剧烈地膨胀成大尺寸。此病况称为毒性巨结肠。患有毒性巨结肠的患者有发烧、腹痛与膨胀、脱水与营养失调而极端不健康。除非患者因药物治疗而快速改善，通常需要手术以预防结肠破裂。克罗恩氏病可于胃肠道之所有区域发生。在此疾病中，胃肠道由于发炎阻塞且纤维化在大多数患者中发生。肉芽肿与瘘管形成为克罗恩氏病之常见并发症。疾病进展结果包括静脉内出血、手术与结肠造口术。IBD可通过药物而治疗。最常用以治疗IBD的药物为抗发炎药物，如水杨酸盐。水杨酸盐制备物已有效治疗轻度至中度疾病。当药物长期使用时，其等也可减少疾病爆发之频率。水杨酸盐之实例包括柳氮磺吡啶、奥沙拉秦、和美沙拉秦。所有此等药物皆以口服以高剂量给予以实现最大治疗利益。此等药物并非没有副作用。当以高剂量服用时，柳氮磺吡啶可造成胃不适，且一些水杨酸盐制备物已被报导会罕见地造成轻度肾脏发炎。皮质类固醇在治疗IBD中比水杨酸盐更有潜力且更快速起作用，但潜在地副作用对将皮质类固醇用于具有更严重疾病的患者造成限制。皮质类固醇之副作用通常于长期使用发生。其等包括使骨骼变细且使皮肤变薄、感染、糖尿病、肌肉消耗、使脸变圆、精神病混乱、与(罕见发生)髋关节破坏。在不对水杨酸盐或皮质类固醇反应的IBD患者中，则使用抑制免疫系统的药物。 免疫抑制剂之实例包括硫唑嘌呤与6-巯嘌呤。用于此情况的免疫抑制剂帮助控制IBD且允许逐渐减少或排除皮质类固醇。然而，免疫抑制剂使患者免疫缺损且易受许多其它疾病影响。用于研究IBD的广为认可的模型之一为DSS结肠炎小鼠模型，如于Kawada等 “Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease", World J.Gastroenterol. , Vol. 13 (42), pp. 5581-5593 (2007)；以及 Wirtz 与 Neurath "Mouse models of inflammatory bowel disease”，Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 59 (11), 1073-1083 (2007)中所述。明显地，有对于能够预防与治疗IBD的药剂之巨大需要。使用人防御素治疗炎性肠病引人关注的是，小肠中的克罗恩氏病与潘纳斯细胞(Paneth cell) α -防御素HD5 及HD6之水平降低相关，而结肠中的克罗恩氏病与β -防御素hBD2及hBD3之产生减少相关(Gersemarm等，2008 ；Wehkamp等，2005)。此外，已有力地证明克罗恩氏病之发病机制中涉及肠微生物区(Swidsinski等，200 。所述研究人员通过使用荧光原位杂交显示在活性克罗恩氏病中，观察到粘膜相关且具侵袭性之细菌之急剧增加，而正常小肠上皮及大肠上皮中无所述细菌。这些观察结果一起合并成一个假设，该假设表明在健康人中，沿肠上皮屏障之适当水平之防御素起作用以控制腔内(luminal)细菌之组成及数目且使其不粘附及入侵粘膜而触发发炎(Wang等，2007)。另一方面，在能力不足以产生保护性水平之分泌防御素的人中，抗微生物防御与腔内细菌之间的平衡会改变。结果，这使得细菌入侵基础 (underlying)肠组织，从而诱导炎性状态，而这又可能发展成克罗恩氏病。 基于该假设，WO 2007/081486公开了数种人防御素在炎性肠病之治疗中之用途。 发明者提出以使防御素在肠腔中之适当位置释放之配制物形式经口向克罗恩氏病患者施用的防御素将减少入侵细菌之数目，重建正常上皮屏障功能且因此降低炎性疾病之严重性。根据WO 2007/081486，防御素之功能在于直接靶向且杀死腔中之细菌，从而阻止其入侵上皮组织。即，防御素完全起抗感染化合物作用。关于W0/2007/081486，令人惊讶的是胃肠外施用之hBD2能够降低小鼠中DSS诱导之结肠炎的严重性，因为通过使用该施用途径，肽从未遇到腔内细菌。另外，我们此处显示hBD2之作用为减小由PBMC分泌之促炎性细胞因子TNFa、IL-I β及IL-23之水平。已知这些细胞因子是许多炎性疾病包括炎性肠病中的关键参与者。多于十年已知的是，除抗微生物功能外，防御素也具有多种免疫调节功能。然而，大部分关于人防御素之免疫调节性质之著作描述其主要具有促炎性或免疫增强功能(参见例如，Niyonsaba 等，2007 ；Bowdish 等，2006 ；Lehrer, 2004)。因此，确实出乎意料的是胃肠外施用之hBD2能够降低炎性肠病中的疾病严重性。 首先，当胃肠外施用时，hBD2决不会到达肠腔从而遇到参与诱导疾病之有害细菌。此外，基于大部分公开之文献，如此处所提供之著作中所观察到的，将预期进入血流之防御素将诱导促炎性而非抗炎性反应。发明详述定义EM:如本文所用之术语“防御素”系指本领域的技术人员公认属于抗微生物肽之防御素类别之多肽。为确定多肽是否为根据本发明之防御素，可通过使用免费可用之 HMMER软件包将氨基酸序列与PFAM数据库之隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)比较。PFAM防御素家族包括例如防御素-1或“哺乳动物防御素”(登录号PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登录号PF00711)。本发明之防御素属于β防御素类。β防御素类之防御素享有共同的结构特征，如半胱氨酸模式。根据本发明之防御素之实例包括人β防御素1 (hBDl ；参见SEQ ID NO :1)、人β 防御素2(hBD2 ；参见SEQ ID N0:2)、人β防御素3 (hBD3 ；参见SEQ ID N0:3)、人β防御素4_4 ；参见SEQ ID NO 4)及小鼠β防御素3(mBD3 ；参见SEQ ID NO 6)。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 276~277 ；http:// emboss, org)，优选3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口延伸罚分(0. 5)及EBL0SUM62 (BL0SUM62 之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同残基X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，同上；http://emboss, org)、优选 3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970， 同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口扩展罚分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4之EMBOSS版本)取代矩阵。使用 Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。经分离多肽如本文所用之术语“经分离变体”或“经分离多肽”系指自来源分离之变体或多肽。在一方面中，如SDS-PAGE所测定的，变体或多肽为至少纯，优选至少5% 纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文中表示含有按重量计至多10%、 优选至多8 %、更优选至多6 %、更优选至多5 %、更优选至多4 %、更优选至多3 %、甚至更优选至多2%、最优选至多且甚至最优选至多0. 5%与之天然或重组相关之其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽按制备物中所存在之总多肽物质之重量计为至少92 %纯，优选至少94 %纯，更优选至少95 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少97 %纯， 更优选至少98 %纯，甚至更优选至少99 %纯，最优选至少99. 5 %纯且甚至最优选100 %纯。 本发明之多肽优选呈实质上纯的形式。此可例如通过由众所周知之重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。哺乳动物β防御素本发明涉及哺乳动物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治疗炎性肠病(如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)中的医药用途。治疗优选与降低所治疗组织中之TNF-α活性相关。在一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6中之任一氨基酸序列具有至少 80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO 4中之任一氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 1(SEQ ID NO :1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID NO :2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)、人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)、人β防御素4之变体(SEQ ID NO 5)和/或小鼠β防御素3 (SEQ ID NO 6)组成。在一甚至更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 KSEQ ID Ν0:1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID N0:2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)和 / 或人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)组成。
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在另一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO :2之氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO 2)组成。在又一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效变体组成。优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β 防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效变体组成。更优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能等效变体组成。本发 明之哺乳动物β防御素也称为优选实施方案之化合物。在本发明之上下文中，哺乳动物(例如人)β防御素之“功能等效变体 (functionally equivalent variant) ”为对炎性肠病展现与亲本哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之功效的经修饰哺乳动物(例如人)β防御素。优选地，其也展现与哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之对TNF-α活性之功效。根据本发明，哺乳动物(例如人)β防御素之功能等效变体与哺乳动物(例如人) β防御素氨基酸序列相比可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰且尤其1个氨基酸修饰。术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如人)β防御素之任何化学修饰。修饰可为氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链之置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特性之非天然氨基酸。详言之，修饰可为酰胺化，如C-末端酰胺化。优选地，氨基酸修饰是性质上较不重要的，其为不显著影响多肽之折叠和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；单缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多约20-25个残基之小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而有利于纯化之小延伸，如多聚组氨酸标记、抗原表位或结合域。保守取代的实例为在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸和甲硫氨酸)组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常发生的交换为 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)来鉴定哺乳动物β防御素中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(g卩，TNF-α活性之抑制)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见 Hilton 等，1996，J. Biol. Chem. 271 4699-4708 必需氨基酸的身份(identity)也可由分析与相关于哺乳动物β防御素之多肽的同一性来推断。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413 ；或 W095/2^25 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示 (例如，Lowman 等，1991 ,Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利 5，223，409 号；WO 92/06204) 和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 :127)。本发明之多肽之N-末端延伸可合适地由1至50个氨基酸、优选2-20个氨基酸、 尤其3-15个氨基酸组成。在一实施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一实施方案中，N-末端延伸包含如下文进一步定义之kex2或kex2_样切割位点。在一优选实施方案中，N-末端延伸为包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途已发现人β防御素2在小鼠中于10-天右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导性结肠炎模型中显著地减轻疾病参数之严重性；因此显示作为用于治疗炎性肠病(如溃疡性结肠炎与克罗恩氏病)的药物的强活性。本发明因此提供治疗炎性肠病的方法，该治疗包含向需要该治疗之受试者胃肠外施用有效量之例如药物组合物形式之哺乳动物β防御素，如人β防御素2。也提供的是哺乳动物β防御素(如人β防御素2)，其用于制造胃肠外施用的药物；及哺乳动物β防御素(如人β防御素2)之用途，其用于制造胃肠外施用的药物，例如药物组合物。治疗包括治疗已有疾病或病症以及预防(prophylaxis (prevention))疾病或病症。在一具体实施方案中，治疗使得所治疗组织中诱导之TNF-α活性降低，优选 TNF-α活性降低且IL-10活性增加。哺乳动物β防御素可治疗性用于组合物中，所述组合物经配制用于经由任何常规途径施用，常规途径包括肠内(例如经颊、经口、经鼻、经直肠)、胃肠外(例如，静脉内、 颅内、腹膜内、皮下或肌肉内)或局部(例如，表皮、鼻内或气管内)。在其它具体实施方案中，本文中描述之组合物可作为持续释放植入物之一部分施用。在另外的其它实施方案中，可利用提供冷冻干燥物稳定性之适当赋形剂将优选实施方案之组合物配制为冷冻干燥物，且接着复水。含有哺乳动物β防御素(如人β防御素)之药物组合物可根据常规方法，例如由混合、造粒、包覆、溶解或冻干过程制造。优选具体实施方案之药物组合物包含哺乳动物β防御素(如人β防御素)及药学上可接受之载剂和/或稀释剂。哺乳动物β防御素(如人β防御素)优选在药物组合物中以有效治疗炎性肠病，优选具有对患者可接受之毒性之量使用。对于该治疗，适当剂量当然依赖于例如所使用之本发明化合物之化学性质及药物动力学数据、个体宿主、施用模式及接受治疗之病状之性质及严重性而变化。然而，一般而言，为在较大哺乳动物，例如人中获得令人满意的结果，指示每日剂量优选为约0. OOlg至约1. 5g、更优选约0. Olg至1. Og ；或约0. OOlmg/kg体重至约20mg/kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至20mg/kg体重，更优选约0. lmg/kg体重至约 10mg/kg体重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分开的剂量施用。优选具体实施方案之化合物可以通常使用之类似施用模式及类似剂量向较大哺乳动物，例如人施用。在某些具体实施方案中，优选具体实施方案之药物组合物可包括哺乳动物β防御素(如人β防御素)，其量取决于施用途径为每单位剂型约0. 5mg或更少至约1500mg 或更多，优选约 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8 或 0. 9mg 至约 150、200、250、300、350、400、450、500、600、 700、800、900 或 lOOOmg，且更优选约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25mg 至约 30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些实施方案中，比以上所提及之更低或更高的剂量可为优选的。本领域的技术人员可容易地确定适当的浓度及剂量。本领域的技术人员熟知药学上可接受之载剂和/或稀释剂。对于配制成液体溶液之组合物，可接受之载剂和/或稀释剂包括盐水及无菌水，且可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及其它常见添加剂。组合物也可配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固体溶液、悬浮液、分散液、固态分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、 凝胶、糊状物、吸入剂粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式)。配制物可含有 (除哺乳动物β防御素及其它任选之活性成分外)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖及甜味剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压之盐、缓冲剂、稀释剂、分散剂及表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或如本领域已知之其它药物赋形剂。本领域的技术人员可进一步以适当方式且根据公认操作法(如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro 编，Mack Publishing 公司，Easton，PA 1990 中描述之操作法)配制哺乳动物β防御素。哺乳动物β防御素(如人β防御素)可单独使用或与一种、两种或更多其它药物化合物或药物物质和/或一或多种药学上可接受之赋形剂之组合疗法使用。体外合成哺乳动物β防御素可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成装置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自动合成仪。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸、尤其D-异构物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-异亮氨酸)、非对映异构物、具有不同长度或官能团之侧链等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制备方式将由适宜性、经济性、所需纯度等确定。可提供与包含便于键联的官能团之多种肽或蛋白质之化学连接，所述官能团对于酰胺或经取代胺形成(例如还原胺基化)而言为胺基，对于硫醚或二硫化物形成而言为硫醇基，对于酰胺形成而言为羧基等。如果需要，在合成期间或表达期间可向肽中引入多个允许与其它分子或表面连接之基团。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，组氨酸用于连接于金属离子复合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其类似物。也可根据重组合成之常规方法分离且纯化哺乳动物β防御素或其功能等效物。 裂解物可由表达宿主制备，且裂解物可使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化。本发明由下列实施例进一步描述，所述实施例不应理解为限制本发明之范围。实施例在测试hBD2之免疫调节功效的期间，意外地观察到hBD2具有巨大的抗炎潜力。此处，我们已显示hBD2在小鼠中于治疗由口服施用右旋糖酐硫酸钠(DSS)所诱导的炎性肠病(结肠炎)具有显著的功效。我们也已显示hBD2具有下调TNF-α的潜力。实施例1 人β防御素2之产生重组产生hBD2。将编码hBD2之合成DNA片段(DNA 2. 0)克隆入pET_32(+)表达载体(Novagen)中。所得质粒编码翻译融合肽，该翻译融合肽含有N-末端硫氧还蛋白部分，继之以his-标记、肠激酶裂解位点且最后为hBD2肽。将表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli) 菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨苄青霉素之TB-甘油中将该菌株之过夜培养物稀释100 倍且在37°C生长至0D600为约8且用0. 5mM IPTG诱导3小时，此后通过离心收集细胞。使用标准方案在Ni-NTA珠(QIAGEN)上纯化his标记之trx_hBD2融合肽。随后将his-标记纯化融合肽过夜透析于肠激酶缓冲剂(50mM tris-HCKpH 7. 5) UmM CaCl2)中，且用肠激酶裂解以释放成熟hBD2。使用Source 15S基质(Amersham Biosciences)由阳离子交换层析进一步纯化hBD2肽。使用MALDI-T0F质谱验证hBD2之修正分子量。使用相同方案产生mBD3 (参见实施例7)。随后使用与LC-MS及NMR光谱学偶联之胰蛋白酶消化验证hBD2分子之适当折叠及二硫桥拓扑学。由制备型RP-HPLC在低pH值移除内毒素，且由LAL测定(Endosafe KTA2)测定内毒素含量且发现该水平低于测定之检测限(0.05EU/mg)。为确定低于内毒素测定之检测限之水平不能刺激PBMC，作以极有效脂多糖(大肠杆菌，0111 :B4, Sigma L4391)刺激之滴定曲线。极低水平之该LPS(0.06ng/ml)能够刺激PBMC产生可检测之细胞因子。实施例210天右旋糖酐硫酸钠(dextran sodium sulphate, DSS)诱导之结肠炎小鼠模型以下研究之目的在于确定人β防御素2在经口施用右旋糖酐硫酸钠(DSS)而诱导之急性(10天)炎性肠病(结肠炎)小鼠模型中的抗炎活性。DSS结肠炎小鼠模型为研究炎性肠病之公认模型，如在Kawada等，“ Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease，，,World J. Gastroenterol.,第 13 卷(42),第 5581-5593 页 (2007)；禾口Wirtz及Neurath,"Mouse models of inflammatory bowel disease，，,Advanced Drug Delivery Reviews，第 59 卷(11)，1073-1083 (2007)中所述。材料测试项目人β防御素2(hBD2)；参见以上实施例1。甲泼尼龙21-半琥珀酸盐(“泼尼松龙”)PBS 缓冲剂(GIBCO)实验动物
研究中使用雄性C57BL/6小鼠(Harlan Interfauna Iberica, Barcelona, Spain), 因为其为已证明当经10天施用2% DSS于饮用水中的溶液时产生显著结肠发炎的物种及性别。魅由尾巴上的数字及字母代码鉴定动物。另外，由指示动物数目及性别、测试项目代码或名称、剂量水平、施用途径、处理时间、组编号、研究代码及研究指导者之名字的颜色编码卡鉴定各笼。体重研究起始当天，动物之平均体重为22. 4士0. 16g。适应(检疫)研究起始之前最少7天，在与主要研究相同之条件下。^到达时，将动物随机分开且安置于具有不锈钢盖之聚碳酸酯笼(E型，Charles River, 255 X 405 X 197mm)中。根据性别以每笼5只动物将动物分组安置于具有控制之温度(22士2°C )、光照 (12/12小时光照/黑暗)、空气压力、空气更新次数及相对湿度(30-70% )之动物房中。所有笼底面上均具有Ig屑(Lignocel 3-4 ；HarIan Interfauna Iberica, Spain) 作为褥草(litter)。食物及水让所有小鼠自由取食干燥粒状标准啮齿动物膳食(Teklad Global 2014 ；Harlan Interfauna Iberica, Spain)。于瓶中提供可自由取得的水。周期性分析供应至动物房内之自来水以检查其组成且检测可能的污染物(化学物质及微生物)。设备及材料设备· Sartorius BP 2100 型动物天平 手术解剖设备· Eppendorf 5415C 离心机·尼康(Nikon)Eclipse E600FN 显微镜· Hook & !\icker仪器旋转混合器· IKA UltraiTurrax 均质机· Sartorius BP 221S 型分析天平.ELISA 微板读取器(Labsystems Multiskan EX)材料及试剂·无菌抛弃式注射器(Iml) 无菌蝴蝶型25G输液器·麻醉剂(开他敏(Ketamine)/甲苯噻嗪(Xylazine))·局部麻醉乳膏(EMLA, Astra Zeneca)·右旋糖酐硫酸钠 30，000-50，OOODa(MP Biomedicals)
·磷酸盐缓冲盐水(PBS ；Sigma)·中性缓冲福尔马林(VWR) 牛血清白蛋白(Sigma)·蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)·小鼠 TNF- α ELISA 套组(GE Healthcare)实验方案研究设计将动物分成5个实验组。各组由10只雄性动物组成A组用对照媒剂(PBQ (静脉内)处理B 组用 hBD2 (0. lmg/kg，静脉内)处理C组用hBD2(lmg/kg，静脉内)处理D 组用 hBD2(10mg/kg，静脉内)处理E组用甲泼尼龙(lmg/kg，口服)处理以随机方式将动物分配至所有实验组中。各笼中最多安置5只小鼠(根据指令 86/609/EEC)。在到达实验室时及施用测试项目之前称重所有动物。测试物质之施用通过使用无菌针Q5G)以5ml/kg体重之给药体积以缓慢推注形式经由尾部静脉静脉内施用对照媒剂及hBD2。动物连续10天每天(每M小时)接受一次剂量之相应测试项目(hBD2、泼尼松龙或对照媒剂)。以5ml/kg体重之给药体积以lmg/kg之剂量经口给予泼尼松龙，给药方案与hBD2 相同。实验程序诱导结肠炎通过用2% DSS补充饮用水7天在小鼠中诱导结肠炎。第1天，称重所有小鼠且根据其实验组加以标记。使各笼之饮用瓶装满DSS溶液， 确保所有瓶盖适当安装且没有一个堵塞。第3天，排空瓶中之任何剩余溶液且再用新鲜DSS溶液装满。第5天，再次重复该程序。第8天，舍弃任何剩余溶液且用高压灭菌水更换。2天后，即第10天，处死动物。临床评定(疾病活性指数)每日临床评定DSS-处理的动物，根据以下参数计算验证临床疾病活性指数 (DAI)粪便稠度、直肠出血存在与否及体重减轻，该指数在0至4范围内
权利要求
1.一种哺乳动物β防御素在制造用于胃肠外施用治疗炎性肠病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中该哺乳动物β防御素是皮下或静脉内施用的。
3.根据权利要求1-2中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素以约0.001mg/kg体重至约10mg/kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至约10mg/kg体重的每日剂量施用。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDΝ0:2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素2。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中在所治疗之组织中TNF-α活性降低。
10.一种治疗炎性肠病的方法，该方法包括向需要所述治疗的受试者胃肠外施用有效量的哺乳动物β防御素。
11.权利要求10的方法，其中该有效量有效降低所治疗组织中的TNF-α活性。
12.权利要求10的方法，其中该人β防御素是皮下或静脉内施用的。
13.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素以约0.001mg/kg体重至约IOmg/ kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至约10mg/kg体重之每日剂量施用。
14.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
15.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
16.权利要求10的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO :2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。
17.权利要求10的方法，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
全文摘要
本发明系关于使用哺乳动物β防御素治疗炎性肠病。
文档编号A61P1/04GK102159233SQ200980136343
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月18日
发明者伯吉特·安德森, 卡罗琳·S·布林奇, 坦贾·M·R·凯尔, 托马斯·克鲁泽, 泽伦·凯拉尔夫, 珀尔·H·迈金德 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
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