使用哺乳动物β防御素的类风湿性关节炎的治疗的制作方法
专利名称：使用哺乳动物β防御素的类风湿性关节炎的治疗的制作方法
使用哺乳动物β防御素的类风湿性关节炎的治疗涉及序列表本申请含有呈计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文中。发明背景发明领域本发明涉及通过施用人β防御素而预防与治疗类风湿性关节炎。背景在许多其它元件中，先天免疫的关键组分为个别显示相当大选择性但集体能够快速杀死广谱的细菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更为突出，且其有可能由所有多细胞生物体产生。在人类中，优势AMP为防御素。人防御素为阳离子小肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键之拓扑学可分为α-防御素及β-防御素。α-防御素可进一步细分为首先自嗜中性粒细胞颗粒分离的α-防御素 (ΗΝΡ1-4)及由Paneth细胞在小肠隐窝中表达的α -防御素(HD5及HD6)。β -防御素主要由多种组织及器官中的上皮细胞产生，所述组织及器官包括皮肤、气管、胃肠道、泌尿生殖系统、肾、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成员为hBDl_3。 然而，使用多种生物信息学工具，已在人基因组中注释了几乎40个编码推定β -防御素同源物的开放阅读框。一些人防御素是组成型产生的，而其它是由促炎性细胞因子或外源微生物产物诱导的。已经越来越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有宽范围的免疫调节/替代性质。所述性质包括诱导多种趋化因子及细胞因子、趋化活性及细胞凋亡活性，诱导前列腺素、组胺及白细胞三烯释放，抑制补体，通过铎样受体(toll-like receptor)信号传导刺激树突细胞成熟，以及刺激由嗜中性粒细胞的病原体清除。此外，人防御素也在伤口愈合、上皮及成纤维细胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管发生(vasculogenesis) 中起作用。有越来越多的人防御素在许多感染性及炎性疾病中发挥重要作用的证据。发炎和 /或感染皮肤中通常观察到人防御素之过表达，很可能是因为由微生物组分或内源性促炎性细胞因子局部诱导。在牛皮癣(psoriasis)中，hBD2及hBD3过于充足，且在患有寻常痤疮(acne vulgaris)或浅表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受损上皮中观察到hBD2的显著上调。另一方面，异位性/特应性皮炎(topic dermatitis)与hBD2及 hBD3的下调相关。类风湿性关节炎为一种慢性、全身性发炎病症，其可影响许 多组织与器官，但主要侵袭关节，产生常常发展成关节软骨之破坏与关节之僵硬的炎性滑膜炎。类风湿性关节炎也可于肺、心包、胸膜、以及巩膜产生弥漫性发炎、以及结节状损害，其在皮肤下的皮下组织中最常见。虽然类风湿性关节炎之原因不明，自体免疫在其长期性与进展中扮演重要的角色。
发明详述定义防御素如本文所用之术语“防御素”系指本领域的技术人员公认属于抗微生物肽之防御素类之多肽。为确定多肽是否为根据本发明之防御素，可通过使用免费可用之 HMMER软件包将氨基酸序列与PFAM数据库之隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)比较。PFAM防 御素家族包括例如防御素-1或“哺乳动物防御素”(登录号PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登录号PF00711)。本发明之防御素属于β防御素类。β防御素类之防御素享有共同的结构特征，如半胱氨酸模式。根据本发明之防御素之实例包括人β防御素1 (hBDl ；参见SEQ ID NO :1)、人β 防御素2(hBD2 ；参见SEQ ID N0:2)、人β防御素3 (hBD3 ；参见SEQ ID N0:3)、人β防御素4_4 ；参见SEQ ID NO 4)及小鼠β防御素3(mBD3 ；参见SEQ ID NO 6)。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 276~277 ；http:// emboss, org)，优选3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口延伸罚分(0. 5)及EBL0SUM62 (BL0SUM62 之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同残基X100) / (比对长度_比对中之缺口总数)。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，同上；http://emboss, org)、优选 3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970， 同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口扩展罚分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4之EMBOSS版本)取代矩阵。使用 Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。如本文所用之术语“经分离变体”或“经分离多肽”系指自来源分离之变体或多肽。 在一方面中，如SDS-PAGE所测定的，变体或多肽为至少1 %纯，优选至少5%纯，更优选至少 10 %纯，更优选至少20 %纯，更优选至少40 %纯，更优选至少60 %纯，甚至更优选至少80 % 纯，且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文中表示含有按重量计至多10%、 优选至多8 %、更优选至多6 %、更优选至多5 %、更优选至多4 %、更优选至多3 %、甚至更优选至多2%、最优选至多且甚至最优选至多0. 5%与之天然或重组相关之其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽按制备物中所存在之总多肽物质之重量计为至少92 %纯，优选至少94 %纯，更优选至少95 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少97 %纯， 更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99. 5%纯且甚至最优选100%纯。 本发明之多肽优选呈实质上纯的形式。此可例如通过由众所周知之重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。哺乳动物β防御素本发明涉及哺乳动物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治疗类风湿性关节炎中的医药用途。治疗优选与降低所治疗组织中之TNF-α活性相关。在一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6中之任一氨基酸序列具有至少 80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO 4中之任一氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 1(SEQ ID NO :1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID NO :2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)、人 β 防御素4(SEQ ID N0:4)、人β防御素4之变体(SEQ ID NO 5)和/或小鼠β防御素3(SEQ ID NO 6)组成。在一甚至更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 KSEQ ID Ν0:1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID N0:2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO 3)和 / 或人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)组成。在另一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO :2之氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO 2)组成。在又一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效变体组成。优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β 防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效变体组成。更优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能等效变体组成。本发明之哺乳动物β防御素也称为优选实施方案之化合物。在本发明之上下文中，哺乳动物(例如人)β防御素之“功能等效变体 (functionally equivalent variant) ”为对类风湿性关节炎展现与亲本哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之功效的经修饰哺乳动物(例如人)β防御素。优选，其也展现与哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之对TNF-α活性之功效。根据本发明，哺乳动物(例如人)β防御素之功能等效变体与哺乳动物(例如人)β防御素氨基酸序列相比可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰且尤其1个氨基酸修饰。术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如人)β防御素之任何化学修饰。修饰可为氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链之置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特性之非天然氨基酸。详言之，修饰可为酰胺化，如C-末端酰胺化。优选地，氨基酸修饰是性质上较不重要的，其为不显著影响多肽之折迭和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；单缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多约20-25个残基之小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而有利于纯化之小延伸，如多聚组氨酸标记、抗原表位或结合域。保守取代的实例为在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸和甲硫氨酸)组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常发生的交换为 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)来鉴定哺乳动物β防御素中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，对抗类风湿性关节炎的活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见 Hilton 等，1996，J. Biol. Chem. 271 4699-4708 必需氨基酸的身份(identity)也可由分析与相关于哺乳动物β防御素之多肽的同一性来推断。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer，1988，Science 241 :53_57 ；Bowie 和 Sauer， 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152_2156 ；W095/17413 ；或 W 95/22625 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示 (例如，Lowman 等，1991 ,Biochem. 30 10832-10837 ；美国专利 5，223，409 号；WO 92/06204) 和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。本发明之多肽之N-末端延伸可合适地由1至50个氨基酸、优选2-20个氨基酸、 尤其3-15个氨基酸组成。在一实施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一实施方案中，N-末端延伸包含如下文进一步定义之kex2或kex2_样切割位点。在一优选实施方案中，N-末端延伸为包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途已发现人β防御素2在小鼠中于41天胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型显著地减轻疾病参数之严重性；因此显示作为用于治疗类风湿性关节炎的药物的潜在活性。本发明因此提供治疗类风湿性关节炎的方法，该治疗包括向需要该治疗之受试者施用有效量之例如药物组合物形式之哺乳动物β防御素，优选为人β防御素，更优选为人 β防御素2。也提供者为哺乳动物β防御素(优选为人β防御素，更优选为人β防御素 2)，其用于制造药物；及哺乳动物β防御素(优选为人β防御素，更优选为人β防御素2)用于制造治疗类风湿性关节炎的药物之用途。治疗包括治疗已有疾病或病症以及预防 (prophylaxis 或 prevention)疾病或病症。哺乳动物β防御素可治疗性用于组合物中，所述组合物经配制用于经由任何常规途径施用，常规途径包括肠内(例如经颊、经口、经鼻、经直肠)、胃肠外(例如，静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内)或局部(例如，表皮、鼻内或气管内)。在其它实施方案中，本文中描述之组合物可作为持续释放植入物之一部分施用。
在另外的其它实施方案中，可利用提供冷冻干燥物稳定性之适当赋形剂将优选实施方案之组合物配制为冷冻干燥物，且接着复水。含有哺乳动物β防御素之药物组合物可根据常规方法，例如通过混合、造粒、包覆、溶解或冻干过程制造。优选实施方案之药物组合物包含哺乳动物β防御素及药学上可接受之载剂和/ 或稀释剂。哺乳动物β防御素优选在药物组合物中以有效治疗类风湿性关节炎之量，优选具有对患者可接受之毒性之量使用。对于该治疗，适当剂量当然依赖于例如所使用之本发明化合物之化学性质及药物动力学数据、个体宿主、施用模式及接受治疗之病状之性质及严重性而变化。然而，一般而言，为在较大哺乳动物，例如人中获得令人满意的结果，指示每日剂量优选为约0. 001mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至50mg/kg体重，更优选约0. 05mg/kg体重至20mg/kg体重，且最优选约0. lmg/kg体重至约10mg/kg体重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分开的剂量施用。优选实施方案之化合物可以通常使用之类似施用模式及类似剂量向较大哺乳动物，例如人施用。在某些实施方案中，优选实施方案之药物组合物可包括哺乳动物β防御素(如人 β防御素)，其量取决于施用途径为每单位剂型约0.5mg或更少至约1500mg或更多，优选约 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8 或 0. 9mg 至约 150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 IOOOmg,且更优选约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25mg 至约 30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些实施方案中，比以上所提及之更低或更高的剂量可为优选的。本领域的技术人员可容易地确定适当的浓度及剂量。本领域的技术人员熟知药学上可接受之载剂和/或稀释剂。对于配制成液体溶液之组合物，可接受之载剂和/或稀释剂包括盐水及无菌水，且可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及其它常见添加剂。组合物也可配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固体溶液、悬浮液、分散液、固态分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、 凝胶、糊状物、吸入剂粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式)。配制物可含有 (除哺乳动物β防御素及其它任选之活性成分外)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖及甜味剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压之盐、缓冲剂、稀释齐U、分散剂及表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或如本领域已知之其它药物赋形剂。本领域的技术人员可进一步以适当方式且根据公认操作法(如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro 编，Mack Publishing 公司，Easton，PA 1990 中描述之操作法)配制哺乳动物β防御素。哺乳动物β防御素可单独使用或与一种、两种或更多其它药物化合物或药物物质和/或一或多种药学上可接受之赋形剂之组合疗法使用。
体外合成哺乳动物β防御素可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成装置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自动合成仪。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸、尤其D-异构物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-异亮氨酸)、非对映异构物、具有不同长度或官能团之侧链等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制备方式将由适宜性、经济性、所需纯度等确定。可提供与包含便于键联的官能团之多种肽或蛋白质之化学连接， 所述官能团对于酰胺或经取代胺形成(例如还原胺基化)而言为胺基，对于硫醚或二硫化物形成而言为硫醇基，对于酰胺形成而言为羧基等。如果需要，在合成期间或表达期间可向肽中引入多个允许与其它分子或表面连接之基团。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，组氨酸用于连接于金属离子复合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其类似物。也可根据重组合成之常规方法分离且纯化哺乳动物β防御素。裂解物可由表达宿主制备，且裂解物可使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化。本发明由下列实施例进一步描述，所述实施例不应理解为限制本发明之范围。
实施例实施例1评估胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型中之人β防御素2在测试hBD2之免疫调节效应期间，出乎意料地观察到hBD2具有巨大的抗炎潜力。此处，我们已展示hBD2于小鼠中于胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型中在治疗类风湿性关节炎中有显著的效果。人β 防御素 2 (hBD2)重组产生hBD2。将编码hBD2之合成DNA片段(DNA 2. 0)克隆入pET_32(+)表达载体(Novagen)中。所得质粒编码翻译融合肽，该翻译融合肽含有N-末端硫氧还蛋白部分，继之以his-标记、肠激酶裂解位点且最后为hBD2肽。将表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli) 菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨苄青霉素之TB-甘油中将该菌株之过夜培养物稀释100 倍且在37°C生长至0D600为约8且用0. 5mM IPTG诱导3小时，此后通过离心收集细胞。使用标准方案在Ni-NTA珠(QIAGEN)上纯化his标记之trx_hBD2融合肽。随后将his-标记纯化融合肽过夜透析于肠激酶缓冲剂(50mM tris-HCKpH 7. 5) UmM CaCl2)中，且用肠激酶裂解以释放成熟hBD2。使用Source 15S基质(Amersham Biosciences)由阳离子交换层析进一步纯化hBD2肽。使用MALDI-T0F质谱验证hBD2之修正分子量。使用相同方案产生mBD3 (参见实施例5)。随后使用与LC-MS及NMR光谱学偶联之胰蛋白酶消化验证hBD2分子之适当折叠及二硫桥拓扑学。由制备型RP-HPLC在低pH值移除内毒素，且由LAL测定(Endosafe KTA2)测定内毒素含量且发现该水平低于测定之检测限(0.05EU/mg)。为确定低于内毒素测定之检测限之水平不能刺激PBMC，作以极有效脂多糖(大肠杆菌，0111 :B4，Sigma L4391)刺激之滴定曲线。极低水平之该LPS(0.06ng/ml)能够刺激PBMC产生可检测之细胞因子。以下研究之目的在于确定人β防御素2在类风湿性关节炎之抗炎活性。测试系统物种/株小鼠/DBA/1来源Harlan，UK 性别雄性动物数目η = 50年龄年轻成鼠，研究起始时为6-8周龄。体重胶原蛋白诱导时研究动物之重量差异不超过平均体重之士20%。动物健康状况到达时检查该研究中所使用之动物之健康状态。仅使健康的动物适应实验室条件且用于研究中。适应至少7天。安置适应期间及给药后，将动物安置于入口受限之啮齿动物设施中且分组饲养于配备有硬底且填充刨花作为铺垫材料之聚丙烯笼(45CmX25CmX13Cm)中，每组最多10 只小鼠。每周更换笼一次。食物及水向动物提供可自由取得的商业啮齿动物膳食且动物可自由获取经由具有不锈钢吸管(sipper tube)之聚乙烯瓶供应至各笼之饮用水。至少每3周更换水瓶。每周更换水3次。环境设定自动控制之环境条件维持在20-24°C，相对湿度(RH)为30-70 %，12/12 小时光照/黑暗循环，且研究房内每小时换气10-30次。由人工测量与控制计算机每天监测温度及RH。由控制计算机监测光照循环。鉴定给予动物唯一的动物鉴定耳编号。该编号也呈现在各笼前端可见之笼卡上。 笼卡也含有研究编号。随机性将动物随机分配至实验组中。终止研究结束时，通过吸入02/C02使存活动物安乐死，接着放血。理由选择小鼠，因为其代表该实验动物模型之精选物种。小鼠之DBA/1品系高度易罹患胶原蛋白诱导之关节炎(CIA)。材料人β防御素2(hBD2)；参见以上地塞米松(Sigma，目录号D1756)第II 型牛胶原蛋白(MD Biosciences,目录号 804001314)完全弗氏佐剂(CFA)(MD Biosciences,目录号 5OlOO97O3)PBS (PAA,目录号 H15-002)测试组之构成表1 测试组及处理
权利要求
1.一种哺乳动物β防御素在制造用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中该哺乳动物β防御素系胃肠外施用，优选系皮下或静脉内施用。
3.根据权利要求1-2中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素系以约0.lmg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，优选约0. lmg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天之剂量施用。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDΝ0:2之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素2。
9.一种治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向需要所述治疗之受试者施用有效量之哺乳动物β防御素。
10.权利要求9的方法，其中该人β防御素系胃肠外施用，优选系皮下或静脉内施用。
11.权利要求9的方法，其中该人β防御素或其功能等效变体系以约0.lmg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0. lmg/kg体重至约10mg/kg体重之剂量施用。
12.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
13.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
14.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO :2之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
15.权利要求9的方法，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
全文摘要
本发明系关于使用哺乳动物β防御素治疗类风湿性关节炎。
文档编号A61K38/17GK102159234SQ200980136396
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月18日
发明者伯吉特·安德森, 卡罗琳·S·布林奇, 坦贾·M·R·凯尔, 托马斯·克鲁泽, 泽伦·凯拉尔夫, 珀尔·H·迈金德 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
使用哺乳动物β防御素的类风湿性关节炎的治疗涉及序列表本申请含有呈计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文中。发明背景发明领域本发明涉及通过施用人β防御素而预防与治疗类风湿性关节炎。背景在许多其它元件中，先天免疫的关键组分为个别显示相当大选择性但集体能够快速杀死广谱的细菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更为突出，且其有可能由所有多细胞生物体产生。在人类中，优势AMP为防御素。人防御素为阳离子小肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键之拓扑学可分为α-防御素及β-防御素。α-防御素可进一步细分为首先自嗜中性粒细胞颗粒分离的α-防御素 (ΗΝΡ1-4)及由Paneth细胞在小肠隐窝中表达的α -防御素(HD5及HD6)。β -防御素主要由多种组织及器官中的上皮细胞产生，所述组织及器官包括皮肤、气管、胃肠道、泌尿生殖系统、肾、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成员为hBDl_3。 然而，使用多种生物信息学工具，已在人基因组中注释了几乎40个编码推定β -防御素同源物的开放阅读框。一些人防御素是组成型产生的，而其它是由促炎性细胞因子或外源微生物产物诱导的。已经越来越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有宽范围的免疫调节/替代性质。所述性质包括诱导多种趋化因子及细胞因子、趋化活性及细胞凋亡活性，诱导前列腺素、组胺及白细胞三烯释放，抑制补体，通过铎样受体(toll-like receptor)信号传导刺激树突细胞成熟，以及刺激由嗜中性粒细胞的病原体清除。此外，人防御素也在伤口愈合、上皮及成纤维细胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管发生(vasculogenesis) 中起作用。有越来越多的人防御素在许多感染性及炎性疾病中发挥重要作用的证据。发炎和 /或感染皮肤中通常观察到人防御素之过表达，很可能是因为由微生物组分或内源性促炎性细胞因子局部诱导。在牛皮癣(psoriasis)中，hBD2及hBD3过于充足，且在患有寻常痤疮(acne vulgaris)或浅表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受损上皮中观察到hBD2的显著上调。另一方面，异位性/特应性皮炎(topic dermatitis)与hBD2及 hBD3的下调相关。类风湿性关节炎为一种慢性、全身性发炎病症，其可影响许 多组织与器官，但主要侵袭关节，产生常常发展成关节软骨之破坏与关节之僵硬的炎性滑膜炎。类风湿性关节炎也可于肺、心包、胸膜、以及巩膜产生弥漫性发炎、以及结节状损害，其在皮肤下的皮下组织中最常见。虽然类风湿性关节炎之原因不明，自体免疫在其长期性与进展中扮演重要的角色。
发明详述定义防御素如本文所用之术语“防御素”系指本领域的技术人员公认属于抗微生物肽之防御素类之多肽。为确定多肽是否为根据本发明之防御素，可通过使用免费可用之 HMMER软件包将氨基酸序列与PFAM数据库之隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)比较。PFAM防 御素家族包括例如防御素-1或“哺乳动物防御素”(登录号PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登录号PF00711)。本发明之防御素属于β防御素类。β防御素类之防御素享有共同的结构特征，如半胱氨酸模式。根据本发明之防御素之实例包括人β防御素1 (hBDl ；参见SEQ ID NO :1)、人β 防御素2(hBD2 ；参见SEQ ID N0:2)、人β防御素3 (hBD3 ；参见SEQ ID N0:3)、人β防御素4_4 ；参见SEQ ID NO 4)及小鼠β防御素3(mBD3 ；参见SEQ ID NO 6)。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,Trends in Genetics 16 276~277 ；http:// emboss, org)，优选3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman及Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口延伸罚分(0. 5)及EBL0SUM62 (BL0SUM62 之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同残基X100) / (比对长度_比对中之缺口总数)。就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，同上；http://emboss, org)、优选 3. 0. 0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970， 同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口扩展罚分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4之EMBOSS版本)取代矩阵。使用 Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算(相同脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。如本文所用之术语“经分离变体”或“经分离多肽”系指自来源分离之变体或多肽。 在一方面中，如SDS-PAGE所测定的，变体或多肽为至少1 %纯，优选至少5%纯，更优选至少 10 %纯，更优选至少20 %纯，更优选至少40 %纯，更优选至少60 %纯，甚至更优选至少80 % 纯，且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文中表示含有按重量计至多10%、 优选至多8 %、更优选至多6 %、更优选至多5 %、更优选至多4 %、更优选至多3 %、甚至更优选至多2%、最优选至多且甚至最优选至多0. 5%与之天然或重组相关之其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽按制备物中所存在之总多肽物质之重量计为至少92 %纯，优选至少94 %纯，更优选至少95 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少97 %纯， 更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99. 5%纯且甚至最优选100%纯。 本发明之多肽优选呈实质上纯的形式。此可例如通过由众所周知之重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。哺乳动物β防御素本发明涉及哺乳动物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治疗类风湿性关节炎中的医药用途。治疗优选与降低所治疗组织中之TNF-α活性相关。在一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 6中之任一氨基酸序列具有至少 80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO 4中之任一氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 1(SEQ ID NO :1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID NO :2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO :3)、人 β 防御素4(SEQ ID N0:4)、人β防御素4之变体(SEQ ID NO 5)和/或小鼠β防御素3(SEQ ID NO 6)组成。在一甚至更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素 KSEQ ID Ν0:1)、人 β 防御素 2 (SEQ ID N0:2)、人 β 防御素 3 (SEQ ID NO 3)和 / 或人 β 防御素4 (SEQ ID NO 4)组成。在另一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO :2之氨基酸序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%且最优选至少95%的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO 2)组成。在又一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效变体组成。优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β 防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效变体组成。更优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能等效变体组成。本发明之哺乳动物β防御素也称为优选实施方案之化合物。在本发明之上下文中，哺乳动物(例如人)β防御素之“功能等效变体 (functionally equivalent variant) ”为对类风湿性关节炎展现与亲本哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之功效的经修饰哺乳动物(例如人)β防御素。优选，其也展现与哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之对TNF-α活性之功效。根据本发明，哺乳动物(例如人)β防御素之功能等效变体与哺乳动物(例如人)β防御素氨基酸序列相比可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰且尤其1个氨基酸修饰。术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如人)β防御素之任何化学修饰。修饰可为氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链之置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特性之非天然氨基酸。详言之，修饰可为酰胺化，如C-末端酰胺化。优选地，氨基酸修饰是性质上较不重要的，其为不显著影响多肽之折迭和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；单缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多约20-25个残基之小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而有利于纯化之小延伸，如多聚组氨酸标记、抗原表位或结合域。保守取代的实例为在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸和甲硫氨酸)组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并由， 例如，Neurath 和 Hill，1979 在 The Proteins,Academic Press,New York 中描述。最通常发生的交换为 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)来鉴定哺乳动物β防御素中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，对抗类风湿性关节炎的活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见 Hilton 等，1996，J. Biol. Chem. 271 4699-4708 必需氨基酸的身份(identity)也可由分析与相关于哺乳动物β防御素之多肽的同一性来推断。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer，1988，Science 241 :53_57 ；Bowie 和 Sauer， 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152_2156 ；W095/17413 ；或 W 95/22625 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示 (例如，Lowman 等，1991 ,Biochem. 30 10832-10837 ；美国专利 5，223，409 号；WO 92/06204) 和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。本发明之多肽之N-末端延伸可合适地由1至50个氨基酸、优选2-20个氨基酸、 尤其3-15个氨基酸组成。在一实施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一实施方案中，N-末端延伸包含如下文进一步定义之kex2或kex2_样切割位点。在一优选实施方案中，N-末端延伸为包含至少两个Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸残基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途已发现人β防御素2在小鼠中于41天胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型显著地减轻疾病参数之严重性；因此显示作为用于治疗类风湿性关节炎的药物的潜在活性。本发明因此提供治疗类风湿性关节炎的方法，该治疗包括向需要该治疗之受试者施用有效量之例如药物组合物形式之哺乳动物β防御素，优选为人β防御素，更优选为人 β防御素2。也提供者为哺乳动物β防御素(优选为人β防御素，更优选为人β防御素 2)，其用于制造药物；及哺乳动物β防御素(优选为人β防御素，更优选为人β防御素2)用于制造治疗类风湿性关节炎的药物之用途。治疗包括治疗已有疾病或病症以及预防 (prophylaxis 或 prevention)疾病或病症。哺乳动物β防御素可治疗性用于组合物中，所述组合物经配制用于经由任何常规途径施用，常规途径包括肠内(例如经颊、经口、经鼻、经直肠)、胃肠外(例如，静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内)或局部(例如，表皮、鼻内或气管内)。在其它实施方案中，本文中描述之组合物可作为持续释放植入物之一部分施用。
在另外的其它实施方案中，可利用提供冷冻干燥物稳定性之适当赋形剂将优选实施方案之组合物配制为冷冻干燥物，且接着复水。含有哺乳动物β防御素之药物组合物可根据常规方法，例如通过混合、造粒、包覆、溶解或冻干过程制造。优选实施方案之药物组合物包含哺乳动物β防御素及药学上可接受之载剂和/ 或稀释剂。哺乳动物β防御素优选在药物组合物中以有效治疗类风湿性关节炎之量，优选具有对患者可接受之毒性之量使用。对于该治疗，适当剂量当然依赖于例如所使用之本发明化合物之化学性质及药物动力学数据、个体宿主、施用模式及接受治疗之病状之性质及严重性而变化。然而，一般而言，为在较大哺乳动物，例如人中获得令人满意的结果，指示每日剂量优选为约0. 001mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0. 01mg/kg体重至50mg/kg体重，更优选约0. 05mg/kg体重至20mg/kg体重，且最优选约0. lmg/kg体重至约10mg/kg体重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分开的剂量施用。优选实施方案之化合物可以通常使用之类似施用模式及类似剂量向较大哺乳动物，例如人施用。在某些实施方案中，优选实施方案之药物组合物可包括哺乳动物β防御素(如人 β防御素)，其量取决于施用途径为每单位剂型约0.5mg或更少至约1500mg或更多，优选约 0. 5,0. 6,0. 7,0. 8 或 0. 9mg 至约 150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 IOOOmg,且更优选约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25mg 至约 30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些实施方案中，比以上所提及之更低或更高的剂量可为优选的。本领域的技术人员可容易地确定适当的浓度及剂量。本领域的技术人员熟知药学上可接受之载剂和/或稀释剂。对于配制成液体溶液之组合物，可接受之载剂和/或稀释剂包括盐水及无菌水，且可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及其它常见添加剂。组合物也可配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固体溶液、悬浮液、分散液、固态分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、 凝胶、糊状物、吸入剂粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式)。配制物可含有 (除哺乳动物β防御素及其它任选之活性成分外)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖及甜味剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压之盐、缓冲剂、稀释齐U、分散剂及表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或如本领域已知之其它药物赋形剂。本领域的技术人员可进一步以适当方式且根据公认操作法(如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro 编，Mack Publishing 公司，Easton，PA 1990 中描述之操作法)配制哺乳动物β防御素。哺乳动物β防御素可单独使用或与一种、两种或更多其它药物化合物或药物物质和/或一或多种药学上可接受之赋形剂之组合疗法使用。
体外合成哺乳动物β防御素可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成装置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自动合成仪。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸、尤其D-异构物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-异亮氨酸)、非对映异构物、具有不同长度或官能团之侧链等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制备方式将由适宜性、经济性、所需纯度等确定。可提供与包含便于键联的官能团之多种肽或蛋白质之化学连接， 所述官能团对于酰胺或经取代胺形成(例如还原胺基化)而言为胺基，对于硫醚或二硫化物形成而言为硫醇基，对于酰胺形成而言为羧基等。如果需要，在合成期间或表达期间可向肽中引入多个允许与其它分子或表面连接之基团。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，组氨酸用于连接于金属离子复合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其类似物。也可根据重组合成之常规方法分离且纯化哺乳动物β防御素。裂解物可由表达宿主制备，且裂解物可使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化。本发明由下列实施例进一步描述，所述实施例不应理解为限制本发明之范围。
实施例实施例1评估胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型中之人β防御素2在测试hBD2之免疫调节效应期间，出乎意料地观察到hBD2具有巨大的抗炎潜力。此处，我们已展示hBD2于小鼠中于胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型中在治疗类风湿性关节炎中有显著的效果。人β 防御素 2 (hBD2)重组产生hBD2。将编码hBD2之合成DNA片段(DNA 2. 0)克隆入pET_32(+)表达载体(Novagen)中。所得质粒编码翻译融合肽，该翻译融合肽含有N-末端硫氧还蛋白部分，继之以his-标记、肠激酶裂解位点且最后为hBD2肽。将表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli) 菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨苄青霉素之TB-甘油中将该菌株之过夜培养物稀释100 倍且在37°C生长至0D600为约8且用0. 5mM IPTG诱导3小时，此后通过离心收集细胞。使用标准方案在Ni-NTA珠(QIAGEN)上纯化his标记之trx_hBD2融合肽。随后将his-标记纯化融合肽过夜透析于肠激酶缓冲剂(50mM tris-HCKpH 7. 5) UmM CaCl2)中，且用肠激酶裂解以释放成熟hBD2。使用Source 15S基质(Amersham Biosciences)由阳离子交换层析进一步纯化hBD2肽。使用MALDI-T0F质谱验证hBD2之修正分子量。使用相同方案产生mBD3 (参见实施例5)。随后使用与LC-MS及NMR光谱学偶联之胰蛋白酶消化验证hBD2分子之适当折叠及二硫桥拓扑学。由制备型RP-HPLC在低pH值移除内毒素，且由LAL测定(Endosafe KTA2)测定内毒素含量且发现该水平低于测定之检测限(0.05EU/mg)。为确定低于内毒素测定之检测限之水平不能刺激PBMC，作以极有效脂多糖(大肠杆菌，0111 :B4，Sigma L4391)刺激之滴定曲线。极低水平之该LPS(0.06ng/ml)能够刺激PBMC产生可检测之细胞因子。以下研究之目的在于确定人β防御素2在类风湿性关节炎之抗炎活性。测试系统物种/株小鼠/DBA/1来源Harlan，UK 性别雄性动物数目η = 50年龄年轻成鼠，研究起始时为6-8周龄。体重胶原蛋白诱导时研究动物之重量差异不超过平均体重之士20%。动物健康状况到达时检查该研究中所使用之动物之健康状态。仅使健康的动物适应实验室条件且用于研究中。适应至少7天。安置适应期间及给药后，将动物安置于入口受限之啮齿动物设施中且分组饲养于配备有硬底且填充刨花作为铺垫材料之聚丙烯笼(45CmX25CmX13Cm)中，每组最多10 只小鼠。每周更换笼一次。食物及水向动物提供可自由取得的商业啮齿动物膳食且动物可自由获取经由具有不锈钢吸管(sipper tube)之聚乙烯瓶供应至各笼之饮用水。至少每3周更换水瓶。每周更换水3次。环境设定自动控制之环境条件维持在20-24°C，相对湿度(RH)为30-70 %，12/12 小时光照/黑暗循环，且研究房内每小时换气10-30次。由人工测量与控制计算机每天监测温度及RH。由控制计算机监测光照循环。鉴定给予动物唯一的动物鉴定耳编号。该编号也呈现在各笼前端可见之笼卡上。 笼卡也含有研究编号。随机性将动物随机分配至实验组中。终止研究结束时，通过吸入02/C02使存活动物安乐死，接着放血。理由选择小鼠，因为其代表该实验动物模型之精选物种。小鼠之DBA/1品系高度易罹患胶原蛋白诱导之关节炎(CIA)。材料人β防御素2(hBD2)；参见以上地塞米松(Sigma，目录号D1756)第II 型牛胶原蛋白(MD Biosciences,目录号 804001314)完全弗氏佐剂(CFA)(MD Biosciences,目录号 5OlOO97O3)PBS (PAA,目录号 H15-002)测试组之构成表1 测试组及处理
权利要求
1.一种哺乳动物β防御素在制造用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中该哺乳动物β防御素系胃肠外施用，优选系皮下或静脉内施用。
3.根据权利要求1-2中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素系以约0.lmg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，优选约0. lmg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天之剂量施用。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDNO=USEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQIDΝ0:2之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素2。
9.一种治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向需要所述治疗之受试者施用有效量之哺乳动物β防御素。
10.权利要求9的方法，其中该人β防御素系胃肠外施用，优选系皮下或静脉内施用。
11.权利要求9的方法，其中该人β防御素或其功能等效变体系以约0.lmg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0. lmg/kg体重至约10mg/kg体重之剂量施用。
12.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。
13.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
14.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO :2之氨基酸序列具有至少80%之同一性。
15.权利要求9的方法，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。
全文摘要
本发明系关于使用哺乳动物β防御素治疗类风湿性关节炎。
文档编号A61K38/17GK102159234SQ200980136396
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月18日
发明者伯吉特·安德森, 卡罗琳·S·布林奇, 坦贾·M·R·凯尔, 托马斯·克鲁泽, 泽伦·凯拉尔夫, 珀尔·H·迈金德 申请人:诺维信阿德宁生物技术公司
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