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水稻稻瘟病抗性基因Pi37及其应用的制作方法

xiaoxiao2020-06-24  2

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专利名称:水稻稻瘟病抗性基因Pi37及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi37的克隆及其应用。
背景技术
植物在生长的过程中,常常受到多种病原物的侵害,而植物则采取多种防御策略以保护自身,避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此,抗病基因产物结构的分析与研究,是了解植物抗病机制的基础,对于植物病害的预防和控制也具有重要的指导意义。
迄今,已经从3种单子叶植物和5种双子叶植物中分离了40多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和产物的研究发现,虽然寄主植物不同,所拮抗的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差异,但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征,如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR),N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS),亮氨酸拉链(leucine zipper,LZ),卷曲螺旋结构域(coiled-coil,CC),跨膜结构域(transmembrane domain,TM),蛋白激酶(protein kinase,PK),以及果蝇Toll蛋白及哺乳动物白介素-1受体(Toll andinterleukin-1 receptor,TIR)等。根据它们所编码蛋白的结构特征,可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack & Jones,1997;Dangl & Jones 2001;Iyer & McCouch2004)。
第一类,毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hm1,它是第1个被克隆的植物抗病基因,它负责对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hm1编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC毒素,而HC毒素是真菌C.carbonum小种1产生的致病因子,它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等,1992)。第二类,NBS-LRR类抗病基因。它们编码的蛋白近N端为NBS,而近C端则由LRR组成。如RPS2(Bent等,1994)、RPM1(Grant等,1995)、I2(Simon等,1998);RPP5(Parker等,1997)、N(Dodd等,2001)、L6(Lawrence等,1995)、Mla1(Zhou等,2001)、Mla6(Halterman等,2001);水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura等,1998)、Pib(Wang等,1999)、Pita(Bryan等,2000)等。第三类,PK类抗病基因。如番茄Pto基因,其产物是一个位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,没有LRR结构域(Martin等,1993)。第四类,LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2(Dixon等,1996)、Cf-4(Thomas等,1997)、Cf-5(Dixon等,1998)、Cf-9(Jones等,1994),以及甜菜抗胞囊线虫的基因Hs1pro-I(Cai等,1997)等。第五类,LRR-TM-PK类抗病基因,以水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song等,1995)为代表。第六类,以拟南芥的RPW8为代表,其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域(Xiao等,2001)。第七类,以水稻的xa5基因为代表,其编码的蛋白为一个转录因子(TFIIAγ)(Iyer &McCouch,2004)。
编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因,根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点,又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers等,Pan等,2000;Cannon等,2002;Richly等,2002)。TNL类抗病基因主要发现在双子叶植物,至今还没在单子叶植物基因组中发现(Bai等,2002;Meyers等,2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的抗病基因主要编码CNL类抗病蛋白,双子叶植物中也存在大量的CNL类抗病基因,相对而言,单子叶植物中的CNL类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样(Cannon等,2002)。
研究表明,NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack &Jones 1997),尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性,但NBS可以激活激酶或G蛋白,NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut,1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反应下游的信号传导(Jones,1994)。最近的证据表明,亚麻的L族多样性选择也发生在TIR区域,这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck等,2000)。LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones & Jones,1996;Kajava,1998),据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent,1996;Baker等,1997)。Jia等(2000)通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小种特异性的激发子,传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合,从而激活细胞内Pita介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita176不能与LRD结合,因而表现感病。这一结果直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域;Pita与AvrPita的互作第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(无性态Pyricularia grisea Sacc.)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一,每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看,抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是,由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性,加之人们缺乏对抗性基因的有效利用,以及对抗性机理缺乏充分的了解,以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决,反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此,发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应用于抗病育种计划已成为农业科研中优先解决的重要问题。
随着分子生物学的快速发展,迄今,至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经被报道,其中60个已经被分子定位。目前,除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟病主效抗性基因之外,其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点,并且有的染色体上含有多个稻瘟病抗性位点,而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。值得指出的是,在众多被成功定位的抗性基因中,只有抗性基因Pib和Pita两个抗性基因被成功地克隆,它们分别位于水稻的第2染色体和第12染色体上。本发明申请提出之前还没有在水稻第1染色体上克隆稻瘟病抗性基因的报道。
克隆抗病基因是对水稻抗性机理研究的前提,揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时,对克隆的抗病基因的修饰和改造,可以人为地控制和增加植物的抗病性,拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻品种Q1333中携带的一个稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植物。
本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
本发明涉及分离和应用一种包含Pi37基因的DNA片段,该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于对所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中,所述片段如序列表SEQ ID NO1所示,或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列,或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO2所列,结构如图6所示。本发明所示的DNA片段在水稻的叶片组织呈组成型表达。
所分离、克隆的Pi37抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域,其中NBS结构域含有保守的kinase 1aGGAGKS,位于该多肽的第222-227个氨基酸残基;kinase 2aLLVLDDV位于该多肽的第297-303个氨基酸残基;kinase 3aGSRVLVTSRR位于该多肽的第327-336个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的589-1290个氨基酸残基为25个LRR重复,其亮氨酸含量为17.0%。
Pi37基因中编码NBS或LRR的核苷酸片段可能具有独立的功能。将Pi37基因中编码不同结构域的片段与其他核酸片段重组,可构成嵌合基因或蛋白质,使之具有新的功能。对Pi37基因进行修饰或改造,可改变或增加基因的某种功能。例如,将该基因的LRR区域替换为其他抗性基因的结构域,或将该基因的NBS结构域进行定点突变,可能会导致基因抗性的丧失或基因的抗谱的改变。
本发明同样包括将Pi37抗性基因的主要结构部分有效连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因,以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如,将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接,该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面,也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接,这些启动子称之为诱导型启动子。这样,环境的改变,发育时期的不同都可以改变该基因的表达,同样,也可以将该基因的表达限定在某一个组织内,使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等,组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
根据本发明提供的Pi37基因序列信息(SEQ ID NO1),本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pi36等同的基因(1)通过数据库检索获得;(2)以Pi37基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得;(3)根据Pi37基因序列信息设计寡核苷酸引物,用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取;(4)在Pi37基因序列的基础上用基因工程方法改造获得;(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明提供的稻瘟病抗性基因Pi37具有重要的应用价值。应用之一是将所述的Pi37基因序列连接到任何一种植物转化载体,用任何一种转化方法将Pi37抗病基因导入水稻或其他植物细胞,可获得表达所述基因的转基因抗病品种,从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中,可以对所述基因或其调控序列适当修饰,也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子,从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。
本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记,包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型,用于分子标记辅助选择育种,从而提高育种的选择效率。
本发明具有如下有益效果将克隆的抗病基因转入感病的植物,有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因,而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题,并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆可以克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题。另外,本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子,以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。


图1为水稻稻瘟病抗性基因Pi37的图位克隆示意图;图2为水稻稻瘟病抗性基因Pi37的高解析度遗传图谱和电子物理图谱;图3a为水稻稻瘟病抗性基因Pi37的抗性转化体的潮霉素基因的PCR检测结果图;图3b为水稻稻瘟病抗性基因Pi37的抗性转化体的潮霉素基因的Southern杂交图;图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi37转化植株的抗性鉴定图;图5为水稻稻瘟病抗性基因Pi37的基因结构图;图6为水稻稻瘟病抗性基因Pi37编码的氨基酸多肽序列结构图;图7为水稻稻瘟病抗性基因Pi37及其等位基因pi37表达特性的RT-PCR检测图;图8为分子标记FSTS1鉴定亲本和感病植株的Pi37位点基因型结果图。
其中,图2中A表示Pi37基因的遗传图,图距为厘摩(cM);B表示Pi37基因的物理图谱,标记下面括号内的数字表示重组事件,标记之间的数字表示物理距离(kb);C表示构建Pi37基因物理图的重叠群,短水平线表示IRGSP公布的粳稻品种日本晴的BAC/PAC克隆,垂直线代表标记所在克隆的相对位置。图3a中泳道1为分子量标记DL2000;泳道2、3和4分别为抗性基因Pi37的转化苗T0-1、T0-2和T0-3的潮霉素抗性基因的PCR扩增产物;泳道5为受体Q1063的非转化体;泳道6为载体pCAMBIA1300质粒的潮霉素抗性基因的PCR产物;泳道7为清水对照。
图3b中泳道1为供体Q1333的非转化体;泳道2为受体Q1063的非转化体;泳道3、4和5分别为抗性基因Pi37的转化苗T0-1、T0-2和T0-3的潮霉素抗性基因的PCR扩增产物;泳道6为分子量标记DL2000。
图5中绿色方盒表示抗性基因Pi37的外显子,带斜线的方盒分别为5’和3’非翻译区。
图6中带下划线字母为组成推定NBS的3个区域;下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域。
图7中a为抗病品种Q1333在接种前以及接种后24h和48h的基因表达情况;b为感病品种Q13,即LTH,在接种前以及接种后24h和48h的基因表达情况;Actin为内参照。
图8中M为DL2000DNA标准分子量;1为抗病亲本Q1333;2-4分别为感病亲本C101PKT、CO39和AS20-1;5-7和9-11为感病个体;8为抗病个体;箭头所指为标记FSTS1。
具体实施例方式
实施例1水稻稻瘟病抗性基因Pi37的遗传分析及初步定位本发明对由粳稻抗病品种Q1333和3个籼稻感病品种AS20-1、C101PKT和CO39的杂交组合由来的3个F2群体,分别接种对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株CHL1159、CHL1340和CHL1405,结果表明这3个F2群体中抗病植株与感病植株的分离比都符合3R∶1S,由此推断Q1333所表现的对上述3个接种菌株的抗性都是由一对显性基因控制的。对这3个F2群体对应的抗性基因进行连锁分析,结果表明它们受同一显性基因控制,因此构建了从这3个F2群体由来的,共85个抗病个体和701个感病个体组成的一个大作图群体。
利用微卫星(simple sequence repeat,SSR)分子标记技术,结合基于分离群体分析法(bulked-sgregant analysis,BSA)的隐性群体分析法(recessive-classanalysis,RCA),对该目的基因进行了连锁分析。利用从水稻12条染色体上等距离(约间隔10cM)选出的180个微卫星标记对抗感亲本和抗感基因池进行了筛选,获得了2个位于第1染色体上的候选连锁标记RM128和RM486。这个结果说明这3个群体鉴定的抗性基因和Pif基因是不同的。为了确认这个结果,又在RM128和RM486之间选取了4个在抗感亲本间有多态性的微卫星标记RM543、RM302、RM212和RM319进行了连锁分析,结果表明SSR标记RM543和RM319更靠近目的抗性位点,与目的基因的遗传距离分别为0.7cM和1.6cM;另外两个SSR标记RM302和RM212则与目的基因完全共分离。这个结果进一步说明了本研究鉴定的抗性基因可能是Q1333上的另外一个新抗性基因,把它命名为Pi37。
实施例2水稻稻瘟病抗性基因Pi37的精细定位为了把Pi37位点缩小到更小的基因组区域内,利用公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)的参考序列,通过生物信息学分析(bioinformatics analysis,BIA)方法在目标基因组区域开发了新的分子标记,即新SSR和STS标记。在开发的8个标记FPSM1、FPSM2、FPSM3、FPSM4、FSTS1、FSTS2、FSTS3和FSTS4中,只有标记FPSM3没有表现多态性;进一步的重组事件分析表明,FPSM1检测到1个重组体,FPSM2和FSTS2都检测到2个重组体,其它4个标记FPSM4、FSTS1、FSTS3和FSTS4则与目的基因完全共分离。综合上述连锁分析的结果说明,Pi37(t)位点被界定在侧翼标记RM543和FPSM1之间0.77cM的遗传区域,在这个区域内有7个分子标记RM302、FPSM4、RM212、FSTS4、S15628、FSTS1和FSTS3都与之完全共分离。
为了构建Pi37位点的物理图,把与Pi37基因连锁的标记都通过BIA方法着陆于上述参考序列上,并由此构建了该目的基因位点的重叠群。由参考序列可以推测Pi37位点被界定于侧翼标记RM543和FPSM1之间374kb的范围内。进一步通过BIA分析,确认了在该区域内只有4个具有抗性基因保守结构,核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(nucleotide binding site-leucine-rich repeat,NBS-LRR)的候选基因。由此则进一步把该目的基因位点界定于约60kb的DNA片段上(图2)。
实施例3稻瘟病新抗性基因Pi37的转化与转化体的抗性鉴定为了确定候选抗性基因的功能,对以上预测的4个候选基因R37-L1、R37-L2、R37-L3和R37-L4分别进行了功能互补实验。利用长片段PCR(long-range PCR,LR-PCR)技术分别扩增了4个候选抗性基因并将其克隆至双元载体转化体系pCAMBIA1300,导入了农杆菌菌株EHA105。将高度感病品种Q1063成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28℃培养1天,收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟,吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养,每14天继代1次,继代2次。抗性筛选后,转入再生培养基分化出转化苗,分别获得了R37-L1、R37-L2、R37-L3和R37-L4的转化苗6株、68株、92株和79株。
对转化植株进行了潮霉素基因的PCR鉴定(图3)。检测结果证明目基因片段已经导入这些转化体。抗性鉴定结果显示只有候选基因R37-L3在感病品种Q1063遗传背景下表现了与抗性基因供体Q1333相同的抗性,表明抗性基因Pi37已经被成功地克隆了(图4)。
实施例4Pi37基因的结构采用移步法对Pi37的DNA序列进行了测定。利用5’和3’RACE反应,获得了Pi37的全长cDNA并对其进行了测序。Pi37基因DNA长度为7486bp,其全长cDNA为4691bp,含有一个3873bp的开放读码框,5’和3’非翻译区分别为192bp和626bp(图5)。
实施例5Pi37抗性蛋白的结构Pi37基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。抗性基因Pi37编码1个由1290个氨基酸残基组成的蛋白多肽,分子量为120KD,等电点为6.61。Pi37蛋白属于NBS-LRR蛋白,NBS结构域中保守的kinase 1a(GGAGKS),位于该多肽的第222-227个氨基酸残基;kinase 2a(LLVLDDV)位于该多肽的第297-303个氨基酸残基;kinase 3a(GSRVLVTSRR)位于该多肽的第327-336个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的590-1290个氨基酸残基为25个LRR重复,其亮氨酸含量为17.0%。
实施例6Pi37基因的表达特性分析用RT-PCR对Pi37基因的表达模式进行了分析。从抗病品种St.No.1和感病品种LHT的叶片中提取总RNA,利用反转录试剂盒SuperScriptTMReverseTranscriptase II进行反转录cDNA第一条链的合成。RT-PCR引物为R37RT FCCTTGGTGGGCTTACTTCACTTAG;R36RT RTCCGTCAAGTGCCTGAGGTTATG。PCR反应为94℃预变性4min;接下来是35个循环,循环程序如下94℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸1min;最后72℃延伸7min,温度降到4℃即完成扩增。实验结果表明,抗性品种和感病品种的接种前后的叶片组织的RNA反转录模板均能扩增出特异的片段,说明Pi37及其等位基因pi37均能在叶片组织中表达,即属于组成型表达的基因(图7)。
实施例7转化Pi37基因产生的抗性品种的应用将Pi37基因克隆到植物转化载体pCAMBIA1300,导入农杆菌菌株EHA105,用与转化感病的水稻品种,获得了92株转化植株。将转化体产生的转化系(T1)进行接种鉴定,发现其中有20个转化系表现抗性分离,而且转化植株的抗性与Pi37基因共分离。说明可以用Pi37基因转化水稻感病品种,用于生产。
实施例8Pi37基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用利用本发明提供的Pi37基因序列信息可以产生分子标记,用于鉴定Pi37位点上具有的各种基因型即Pi37Pi37、Pi37pi37和pi37pi37的植株,可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用。
实施例9抗性基因Pi37的抗性特征首先用亲本菌株CHL42和CHL43及其78个后代菌株,对由15个品种组成的3套品种组合进行了抗谱比较分析。结果表明Pi37基因与其他水稻品种所携带的14个抗性基因所表现的抗性反应明显不同,特别是与第1染色体上的其它抗性基因的抗谱相比,差异更明显。其次用从中国广东、福建、湖南、云南和江苏5个省份收集的5个群体共537个菌株进行了致病性测定,结果表明Pi37基因除了江苏以外,对其它大部分采自中国的菌株都具有广谱的高度抗性。
水稻稻瘟病抗性基因Pi37及其应用序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>水稻稻瘟病抗性基因Pi37及其应用<130>
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aaaaaaccag acagagagaa aaaaacttgt tttgggagtt ctgttgttat cttcctcaca 1260gaagaaaaat ctctccatca ccatctgttc ttatgccctg cttctattca ttcacttgtt 1320cacagctgca gtagtgctgt tcc atg gcg gag gtg gtg ttg gct ggc tta cgt 1373Met Ala Glu Val Val Leu Ala Gly Leu Arg1 5 10ttg gca gca aca cca acc tgt gtg aag ctc ctc tgt aat gct tcg acg1421Leu Ala Ala Thr Pro Thr Cys Val Lys Leu Leu Cys Asn Ala Ser Thr15 20 25tgc ctt ggc gtg gac atg acg cgt gag ctc cat gaa ctg gag acc atc 1469Cys Leu Gly Val Asp Met Thr Arg Glu Leu His Glu Leu Glu Thr Ile30 35 40atc ata cca cag ttc gag ctg gtg att gaa gca gct gag aaa gga aac1517Ile Ile Pro Gln Phe Glu Leu Val Ile Glu Ala Ala Glu Lys Gly Asn45 50 55cac aga gcc aag ctg gac aga tgg ctc cgg gag ctc aaa caa gcc ttc1565His Arg Ala Lys Leu Asp Arg Trp Leu Arg Glu Leu Lys Gln Ala Phe60 65 70tac aat gct gag gac ctt ctg gac gag cat gag tac aac atc ctt aag1613Tyr Asn Ala Glu Asp Leu Leu Asp Glu His Glu Tyr Asn Ile Leu Lys75 80 85 90cgc aaa gcg aaa cac aag gat tct cta gtg aaa gat tcc acc cag gtt1661Arg Lys Ala Lys His Lys Asp Ser Leu Val Lys Asp Ser Thr Gln Val95 100 105cat gac tct tcc atc agc aat att ttg aag cag cct atg cgt gct gtg1709His Asp Ser Ser Ile Ser Asn Ile Leu Lys Gln Pro Met Arg Ala Val110 115 120tcc agt agg atg tcc aat ctg cgc cca gag aac aga aag ata ctt tgc1757Ser Ser Arg Met Ser Asn Leu Arg Pro Glu Asn Arg Lys Ile Leu Cys125 130 135cag ttg aat gaa ctg aag acc atg ctg gag aaa gcc aag gag ttc cgt1805Gln Leu Asn Glu Leu Lys Thr Met Leu Glu Lys Ala Lys Glu Phe Arg140 145 150gag ctg att cac tta cct gct ggt aat agt ctt gag ggt ccc agt gta1853Glu Leu Ile His Leu Pro Ala Gly Asn Ser Leu Glu Gly Pro Ser Val155 160 165 170cca aca att gtt gtt cct gta gtg aca tcg cta ttg ccg cca aga gta1901Pro Thr Ile Val Val Pro Val Val Thr Ser Leu Leu Pro Pro Arg Val175 180 185ttt ggt cgc aac atg gat cgc gat cgc ata ata cat ctt ctt act aag1949Phe Gly Arg Asn Met Asp Arg Asp Arg Ile Ile His Leu Leu Thr Lys190 195 200cca atg gct act gtt tct agc tca gtc ggc tac tct ggt ttg gcc att1997Pro Met Ala Thr Val Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ser Gly Leu Ala Ile205210 215gtt gcg cat gga gga gca gga aaa tcc acc tta gca caa tgt gtt tac2045Val Ala His Gly Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ala Gln Cys Val Tyr220 225 230aat gac aag agg gta caa gaa cat ttt gac gtc agg ata tgg gtc tgc2093Asn Asp Lys Arg Val Gln Glu His Phe Asp Val Arg Ile Trp Val Cys235 240 245 250atc tca cgc aaa ctt gat gtt cat cgc cat aca cgt gag att atc gag2141Ile Ser Arg Lys Leu Asp Val His Arg His Thr Arg Glu Ile Ile Glu255 260 265tca gca aca aat gga gag tgc cct cgt gtg gac aat ctt gat act ctc2189Ser Ala Thr Asn Gly Glu Cys Pro Arg Val Asp Asn Leu Asp Thr Leu270 275 280
cag tgc aga ttg aag gac ata atg caa aaa tca gag aaa ttc ctg ctt2237Gln Cys Arg Leu Lys Asp Ile Met Gln Lys Ser Glu Lys Phe Leu Leu285 290 295gtg ttg gat gac gtc tgg ttt gat gaa tcc gtc aat gag agg gaa tgg2285Val Leu Asp Asp Val Trp Phe Asp Glu Ser Val Asn Glu Arg Glu Trp300 305 310gac cag ttg ctt gat cct ctt gtt tct cag cag gag ggg agc aga gtt2333Asp Gln Leu Leu Asp Pro Leu Val Ser Gln Gln Glu Gly Ser Arg Val315 320 325 330ttg gtg act tct aga cga gat gta ctt cca gct gct ctt cac tgt aag2381Leu Val Thr Ser Arg Arg Asp Val Leu Pro Ala Ala Leu His Cys Lys335 340 345ggt gtt gtt cat ttg gaa aac atg gaa gat gcc gag ttc ttg gct cta2429Gly Val Val His Leu Glu Asn Met Glu Asp Ala Glu Phe Leu Ala Leu350 355 360ttc aaa tac cat gct ttc tct gga aca gaa atc aga aat cca cag ttg2477Phe Lys Tyr His Ala Phe Ser Gly Thr Glu Ile Arg Asn Pro Gln Leu365 370 375cat gca cgg cta gaa gag gtc gca gag aag att gct aaa agg tta gga2525His Ala Arg Leu Glu Glu Val Ala Glu Lys Ile Ala Lys Arg Leu Gly380 385 390caa tcg cct tta gca gca agg aca gta ggc tcc cag ctg agc agg aat2573Gln Ser Pro Leu Ala Ala Arg Thr Val Gly Ser Gln Leu Ser Arg Asn395 400 405 410aag gat att gcc ata tgg aaa agt gct cta aat att gaa aac tta agt2621Lys Asp Ile Ala Ile Trp Lys Ser Ala Leu Asn Ile Glu Asn Leu Ser415 420 425gag ccc atg aaa gct ctg ttg tgg agt tat aat aaa tta gat tca cgt2669Glu Pro Met Lys Ala Leu Leu Trp Ser Tyr Asn Lys Leu Asp Ser Arg430 435 440ctg cag aga tgt ttt ctg tac tgc agc tta ttt cca aaa ggt cac aag2717Leu Gln Arg Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Leu Phe Pro Lys Gly His Lys445 450 455tat aaa att gat gag atg gtt gac ctt tgg gtg gca gag ggg cta gtt2765Tyr Lys Ile Asp Glu Met Val Asp Leu Trp Val Ala Glu Gly Leu Val460 465 470gat tca cgc aac cag ggg gat aag aga att gaa gat att ggc agg gat2813Asp Ser Arg Asn Gln Gly Asp Lys Arg Ile Glu Asp Ile Gly Arg Asp475 480 485 490tac ttc aat gag atg gtg tca gga tct ttc ttt caa cca gtt tct gaa2861Tyr Phe Asn Glu Met Val Ser Gly Ser Phe Phe Gln Pro Val Ser Glu495 500 505aga tat atg ggt aca tgg tac att atg cat gat ctg ctt cat gat ttg2909Arg Tyr Met Gly Thr Trp Tyr Ile Met His Asp Leu Leu His Asp Leu510 515 520gca gag tca ctg act aaa gaa gac tgc ttc aga tta gaa gat gat ggg2957Ala Glu Ser Leu Thr Lys Glu Asp Cys Phe Arg Leu Glu Asp Asp Gly525 530 535gtg aaa gag ata cca gcc act gtt cga cat cta tct att tgt gtt gac3005Val Lys Glu Ile Pro Ala Thr Val Arg His Leu Ser Ile Cys Val Asp540 545 550agt atg aaa ttc cat aag caa aag atc tgc aag cta cgt tat tta cgc3053Ser Met Lys Phe His Lys Gln Lys Ile Cys Lys Leu Arg Tyr Leu Arg555 560 565 570act gtt atc tgc att gac cct ctc atg gat gac gga gat gat att ttt3101Thr Val Ile Cys Ile Asp Pro Leu Met Asp Asp Gly Asp Asp Ile Phe
575 580 585aat cag cta ttg aag aat ctg aag aag cta cgt gta cta cat ttg tcg3149Asn Gln Leu Leu Lys Asn Leu Lys Lys Leu Arg Val Leu His Leu Ser590 595 600ttt tac aac agt agc agc ttg cct gaa tgt att ggt gag ctg aag cac3197Phe Tyr Asn Ser Ser Ser Leu Pro Glu Cys Ile Gly Glu Leu Lys His605 610 615ctt cga tat ttg agt atc atc agc aca ttg att tct gaa ctg cca aga3245Leu Arg Tyr Leu Ser Ile Ile Ser Thr Leu Ile Ser Glu Leu Pro Arg620 625 630tca ttg tgt act ctt ttc cac ttg gag cta ctt cat ttg aat gac aag3293Ser Leu Cys Thr Leu Phe His Leu Glu Leu Leu His Leu Asn Asp Lys635 640 645 650gtc aag aat ttg ccg gac aga ctc tgt aat tta aga aag tta cga cgt3341Val Lys Asn Leu Pro Asp Arg Leu Cys Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg655 660 665ctt gaa gca tat gat gac aga aac aga gtg tat aaa ttg tat aga gca3389Leu Glu Ala Tyr Asp Asp Arg Asn Arg Val Tyr Lys Leu Tyr Arg Ala670 675 680gct ctc cct caa att cct tac ata ggc aag cta tct ttg ctg caa gat3437Ala Leu Pro Gln Ile Pro Tyr Ile Gly Lys Leu Ser Leu Leu Gln Asp685 690 695att gat gga ttt tgc gtg caa aag cag aag gga tat gag ttg cga caa3485Ile Asp Gly Phe Cys Val Gln Lys Gln Lys Gly Tyr Glu Leu Arg Gln700 705 710ctg agg gac atg aac aag ctc ggt ggt aat ttg cgt gtc gtt aat ctt3533Leu Arg Asp Met Asn Lys Leu Gly Gly Asn Leu Arg Val Val Asn Leu715 720 725 730gaa aat gta act gga aag gat gaa gcc tca gag tcg aag ttg cat cag3581Glu Asn Val Thr Gly Lys Asp Glu Ala Ser Glu Ser Lys Leu His Gln735 740 745aaa act cat ctt aga ggt ttg cat ctc tcc tgg aat gat gtg gat gac3629Lys Thr His Leu Arg Gly Leu His Leu Ser Trp Asn Asp Val Asp Asp750 755 760atg gat gtt tca cat ttg gag att cta gaa ggt ttg agg ccg cca tct3677Met Asp Val Ser His Leu Glu Ile Leu Glu Gly Leu Arg Pro Pro Ser765 770 775caa ttg gag gac ctt aca atc gaa ggt tac aaa tcc acc atg tac cca3725Gln Leu Glu Asp Leu Thr Ile Glu Gly Tyr Lys Ser Thr Met Tyr Pro780 785 790agc tgg tta ctt gat gga tcc tat ttt gag aat cta gag tct ttt acg3773Ser Trp Leu Leu Asp Gly Ser Tyr Phe Glu Asn Leu Glu Ser Phe Thr795 800 805 810ctt gct aat tgc tgt gtg ata gga agc cta cca ccc aat acc gag atc3821Leu Ala Asn Cys Cys Val Ile Gly Ser Leu Pro Pro Asn Thr Glu Ile815 820 825ttt agg cac tgt atg aca ctt acc ctt gag aat gtc ccg aat atg aag3869Phe Arg His Cys Met Thr Leu Thr Leu Glu Asn Val Pro Asn Met Lys830 835 840aca cta cct ttt ctt cca gaa ggt ctc aca agc cta tca att gag ggg3917Thr Leu Pro Phe Leu Pro Glu Gly Leu Thr Ser Leu Ser Ile Glu Gly845 850 855tgc cca ctg ctt gtg ttc act act aat aac gat gaa ccg gaa cac cat3965Cys Pro Leu Leu Val Phe Thr Thr Asn Asn Asp Glu Pro Glu His His860 865 870gat tat agg gag agc atc acg agg gca aac aac ctg gaa aca caa ctt4013
Asp Tyr Arg Glu Ser Ile Thr Arg Ala Asn Asn Leu Glu Thr Gln Leu875 880 885 890gtt ttg ata tgg gaa gcg aat tcc gat tca gat att agg agc aca ttg4061Val Leu Ile Trp Glu Ala Asn Ser Asp Ser Asp Ile Arg Ser Thr Leu895 900 905tcg tcc gaa cac tca tcc atg aag aag ttg acg gaa ttg atg gat act4109Ser Ser Glu His Ser Ser Met Lys Lys Leu Thr Glu Leu Met Asp Thr910 915 920gat atg tcg gga aat ctt caa acc att gaa agc gct tta gaa ata gag4157Asp Met Ser Gly Asn Leu Gln Thr Ile Glu Ser Ala Leu Glu Ile Glu925 930 935aga gat gaa gcc ttg gtt aaa gaa gat atc atc aaa gta tgg ctc tgt4205Arg Asp Glu Ala Leu Val Lys Glu Asp Ile Ile Lys Val Trp Leu Cys940 945 950tgc cac gag gag agg atg aga ttc att tgt tca agg aag gct ggg ttg4253Cys His Glu Glu Arg Met Arg Phe Ile Cys Ser Arg Lys Ala Gly Leu955 960 965970ccg ttg gtt cta cca tct gga cta tgc gta ctc tct ctt tcc tcc tgt4301Pro Leu Val Leu Pro Ser Gly Leu Cys Val Leu Ser Leu Ser Ser Cys975 980 985agt att aca gat gga gct tta gct att tgc ctt ggt ggg ctt act tca4349Ser Ile Thr Asp Gly Ala Leu Ala Ile Cys Leu Gly Gly Leu Thr Ser990 995 1000ctt aga aat ttg ttc tta aca gag att atg act tta act acg ctt4394Leu Arg Asn Leu Phe Leu Thr Glu Ile Met Thr Leu Thr Thr Leu100510101015cca ccg gaa gag gtc ttc caa cat ttg ggc aat ctt aga tac ttg4439Pro Pro Glu Glu Val Phe Gln His Leu Gly Asn Leu Arg Tyr Leu102010251030gtc att cgt tcc tgc tgg tgt ttc aga tca ttc ggg ggc ttg cga4484Val Ile Arg Ser Cys Trp Cys Phe Arg Ser Phe Gly Gly Leu Arg103510401045tct gct acc tct ctt tca gaa ata aga tta ttt tcc tgt cct tct4529Ser Ala Thr Ser Leu Ser Glu Ile Arg Leu Phe Ser Cys Pro Ser105010551060tta cag ttg gca cgt ggc gca gaa ttt atg caa atg tcc ctt gag4574Leu Gln Leu Ala Arg Gly Ala Glu Phe Met Gln Met Ser Leu Glu106510701075aag cta tgt gta tac aac tgt gtg ctt tca gct gac ttc ttc tgt4619Lys Leu Cys Val Tyr Asn Cys Val Leu Ser Ala Asp Phe Phe Cys108010851090ggt gac tgg cca cat ctg gat gat att ctc tta tct ggg tgc aga4664Gly Asp Trp Pro His Leu Asp Asp Ile Leu Leu Ser Gly Cys Arg109511001105agc tcg tcg tcc ttg cat gtt ggt gat ctt acc tcc ctc gaa tca4709Ser Ser Ser Ser Leu His Val Gly Asp Leu Thr Ser Leu Glu Ser111011151120ttc tca cta tat cat ttt cca gat tta tgc acg ctg gaa ggt ttg4754Phe Ser Leu Tyr His Phe Pro Asp Leu Cys Thr Leu Glu Gly Leu112511301135tct tcc ctg cag ctt cac cac gtg cat ttg ata gat gtt cca aag4799Ser Ser Leu Gln Leu His His Val His Leu Ile Asp Val Pro Lys114011451150ctt act acc gag agc atc tca cag ttt cgc gtc cag cgt tcg ctc4844Leu Thr Thr Glu Ser Ile Ser Gln Phe Arg Val Gln Arg Ser Leu115511601165
tat att agc agt tct gtt atg ctc aac cac atg ctc tct gct gaa4889Tyr Ile Ser Ser Ser Val Met Leu Asn His Met Leu Ser Ala Glu117011751180ggt ttc gtt gtt cca gag ttt ctc tct ctt gaa agc tgc aag gag4934Gly Phe Val Val Pro Glu Phe Leu Ser Leu Glu Ser Cys Lys Glu118511901195cca tcc gtt tca ttc gaa gaa tct gca aac ttc aca tcc gtc aag4979Pro Ser Val Ser Phe Glu Glu Ser Ala Asn Phe Thr Ser Val Lys120012051210tgc ctg agg tta tgt aat tgt gaa atg agg tca cca cca ggg aat5024Cys Leu Arg Leu Cys Asn Cys Glu Met Arg Ser Pro Pro Gly Asn121512201225atg aag tgc cta tcc agt cta acg aaa ctc gat atc tat gat tgc5069Met Lys Cys Leu Ser Ser Leu Thr Lys Leu Asp Ile Tyr Asp Cys123012351240ccc aac ata tca tct ata cca gat ctg ccg tcc tcc ctc cag cat5114Pro Asn Ile Ser Ser Ile Pro Asp Leu Pro Ser Ser Leu Gln His124512501255ata tgt ata tgg ggt tgt gag ctc ttg aag gag agc tgc aga gca5159Ile Cys Ile Trp Gly Cys Glu Leu Leu Lys Glu Ser Cys Arg Ala126012651270cct gaa gga gaa agc tgg cca aag att gcg cat atc cgc tgg aag5204Pro Glu Gly Glu Ser Trp Pro Lys Ile Ala His Ile Arg Trp Lys127512801285gaa ttc aga tga attgtgcttc agaatcacaa ctagagagaa acggaaaggt5256Glu Phe Arg1290gaaggttaca tcaatgcatt gtcagaagta ctttcttttc tgtattattt atttcgttaa 5316cccatgatca tgcaaacaca ttatttactt caatgtttcc ttgtttattt attttgaaca 5376gacaccccaa gattggcaca tatacgtttc cctgctgcca tccaccgact cgccgcctcc 5436ttttattcgg tttctctgcc actgacggcc catgatcgtg tcctgttgct taaatggagt 5496cttgttggct taagataatc tctgtgtctc ttgaagactc aactatcttg tatttgttag 5556gatacgatag gcaaccaaac cataaaaaac aatagatcaa tcataaaata tacgagattt 5616taacgtggaa aaccctacca aaacaggaga gaaaaaacca cgggcgtcag ccagcaaaat 5676atctttacta tatctggggt gaggttacaa cgccgcacgt cggcttacaa gaggtatata 5736tatggtggaa ccctagaagg aatgacgatc cggcccaagc ctcccggcga cgggcctccg 5796ctccactacg gcagaagctg gcctttatta agtgcagatg aatttggatc ataactcaac 5856agtattttat tatgtgatgt gatatactat tccagtactt ggattttaca cttcacacaa 5916atatacagtt tgcttcaaat gtttgtctat gtagtttgca taaagtttgt atggatatcg 5976attatttgtg taagtttctg atgcttttat cgcacgatag ttcttgatag ttctcacctc 6036acttcgaatg tgtccttgac tccttgttga gctgcccggc agtctgacaa aatttgatca 6096gtccccattg tttctgttgc actctggcgc ttggattgtt tgacttagtt ctctctctat 6156cctcccggtt gagtaagata taggtggtgt ttgaatctcc tgaagataaa aataaagata 6216aaaattaaat gtttcacaca aaacgaggtg gtaataacgt gtgagtaatt aagctttaat 6276cattacaaac ttgaaaaata gattaatatg atattttaga acaactttca tatagaaagt 6336tttcacacga aacgaaccgt ttagctgttt aaaaagcgtg ccacgagtat ccaaaagttt 6396atccaacgtt tgttagcaga ttaattttga taatagtagc agaatgtccg tccgttgcta 6456
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权利要求
1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi37编码的蛋白质,其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示,或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根据权利要求1所述的蛋白质,其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.编码权利要求1所述蛋白质的水稻稻瘟病抗性基因Pi37的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi376,其核苷酸序列如SEQID NO1所示。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.权利要求5所述载体转化的转基因植物。
7.权利要求3或4所述基因产生的分子标记。
8.权利要求1或2所述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
9.权利要求7所述分子标记在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个水稻稻瘟病新抗性基因Pi37的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列与应用。该基因属于nonTIR-NBS-LRR抗性基因家族的成员,为一个组成型表达的基因。本发明还涉及了用该基因转化水稻或其它植物培育抗病品种以及根据该基因序列产生的分子标记在育种中的应用。
文档编号A01H1/04GK1844393SQ20061003404
公开日2006年10月11日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者潘庆华, 王玲, 林菲, 陈深, 却志群 申请人:华南农业大学

【专利交易】【专利代理】【商标和版权申请】【高新技术企业认定】Tel:18215660330

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