水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用的制作方法
专利名称：水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi36的分离克隆与应用。
背景技术：
植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，抗病基因产物结构的分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于植物病害的预防和控制也具有重要的指导意义。
迄今，已经从3种单子叶植物和5种双子叶植物中分离了40多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC)，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蝇Toll蛋白及哺乳动物白介素-1受体(Toll andinterleukin-1 receptor，TIR)等。根据它们所编码蛋白的结构特征，可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack & Jones，1997；Dangl & Jones 2001；Iyer & McCouch2004)。
第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1个被克隆的植物抗病基因，它负责对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hm1编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小种1产生的致病因子，它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。它们编码的蛋白近N端为NBS，而近C端则由LRR组成。如RPS2(Bent等，1994)、RPM1(Grant等，1995)、I2(Simon等，1998)、RPP5(Parker等，1997)、N(Dodd等，2001)、L6(Lawrence等，1995)、Mla1(Zhou等，2001)、Mla6(Halterman等，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura等，1998)、Pib(Wang等，1999)、Pita(Bryan等，2000)等。第三类，PK类抗病基因。如番茄Pto基因，其产物是一个位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martin等，1993)。第四类，LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2(Dixon等，1996)、Cf-4(Thomas等，1997)、Cf-5(Dixon等，1998)、Cf-9(Jones等，1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基因Hs1ppro-1(Cai等，1997)等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song等，1995)为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域(Xiao等，2001)。第七类，以水稻的xa5基因为代表，其编码的蛋白为一个转录因子(TFIIAγ)(Iyer &McCouch，2004)。
编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers等，1999；Pan等，2000；Cannon等，2002；Richly等，2002)。TNL类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没在单子叶植物基因组中发现(Bai等，2002；Meyers等，2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的抗病基因主要编码CNL类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CNL类抗病基因，相对而言，单子叶植物中的CNL类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样(Cannon等，2002)。
研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack &Jones 1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反应下游的信号传导(Jones，1994)。最近的证据表明，亚麻的L族多样性选择也发生在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck等，2000)。LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones & Jones，1996；Kajava，1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent，1996；Baker等，1997)。Jia等(2000)通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小种特异性的激发子，传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita176不能与LRD结合，因而表现感病。这一结果直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(无性态Pyricularia grisea Sacc.)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的了解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应用于抗病育种计划已成为农业科研中优先解决的重要问题。
随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。值得指出的是，在众多被成功定位的抗性基因中，只有抗性基因Pib和Pita两个抗性基因被成功地克隆，它们分别位于水稻的第2染色体和第12染色体上。本发明申请提出之前还没有水稻第8染色体上稻瘟病抗性基因被克隆的报道。
克隆抗病基因是对水稻抗性机理研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻品种Q61中携带的一个稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植物。
本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
本发明涉及分离和应用一种包含Pi36基因的DNA片段，该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害产生特异性(专化性)的抗病反应。这一发明适用于对所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所列，结构如图6所示。本发明所示的DNA片段在水稻的叶片组织呈组成型表达。
所分离、克隆的Pi36抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域，其中NBS结构域含有保守的kinase 1aGMGGLGKTT，kinase 2aIVIDDIWDKP和kinase 3aGSKILVTTRK。而该蛋白的C-末端为13个LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％。Pi36基因中编码NBS或LRR的核苷酸片段可能具有独立的功能。将Pi36基因中编码不同结构域的片段与其他核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。对Pi36基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。例如，将该基因的LRR区域替换为其他抗性基因的结构域，或将该基因的NBS结构域进行定点突变，可能会导致基因抗性的丧失或基因的抗谱的改变。
本发明同样包括将Pi36抗性基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
根据本发明提供的Pi36基因序列信息(SEQ ID NO1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pi36等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)以Pi36基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pi36基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在Pi36基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明提供的稻瘟病抗性基因Pi36具有重要的应用价值。应用之一是将所述的Pi36基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将Pi36抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。
本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
本发明具有如下有益效果将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。
图1为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的图位克隆示意图；图2.为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的高解析度遗传图谱和电子物理图谱；图3为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的部分抗性转化体的选择标记潮霉素基因的PCR(3a)和Southern(3b)检测结果图；图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi36转化植株的抗性鉴定图；图5为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的基因结构图；图6为水稻稻瘟病抗性基因Pi36编码的氨基酸多肽序列结构图；图7为水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其等位基因pi36表达特性的RT-PCR检测图；图8为分子标记CRG3鉴定亲本和感病植株的Pi36位点基因型结果图；其中，图2中A为Pi36位点的高解析度遗传图谱，水平线表示染色体区域，上方为标记/抗性基因，下方数字为标记间的遗传距离(cM)；B为Pi36位点区域的BAC/PAC克隆电子重叠群，水平线表示BAC/PAC克隆，垂直线表示连锁标记的着陆位置；C为Pi36位点的电子物理图谱，括号内数字为各标记位点的重组体数，水平线表示基因组区域，下方数字为标记间的物理距离(kb)。
图3中泳道1-8为抗性基因Pi36的转化苗的潮霉素抗性基因的PCR扩增产物；泳道9为载体pCAMBIA1300质粒的潮霉素抗性基因的PCR产物；泳道10为受体Q1063的非转化体；M为分子量标记DL2000；箭头所指为Hpt基因的部分片段760bp。
图5中绿色方盒表示抗性基因Pi36的外显子，带斜线的方盒分别为5’和3’非翻译区，直线则表示内含子。
图6中带下划线字母为组成推定NBS的6个区域；第590个氨基酸残基反映了Pi36抗感等位基因间蛋白序列的差别，在感病等位基因pi36中均为天冬氨酸；下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域。
图7中A为抗病品种Q61在接种前以及接种后6、12、24、48、72h的基因表达情况；actin为内参照；B为感病品种Q13，即LTH，在接种前以及接种后6、12、24、48、72h的基因表达情况；actin为内参照。
图8中P1为抗病亲本Q61；P2为感病亲本爱知旭；S1-S5、S6和S7为F2感病植株，基因pi36pi36；R1为F2抗病植株，基因型为Pi36pi36；undigest2个亲本酶切前的带型；M分子量标记DL2000；箭头所指为标记CRG3。
具体实施例方式
实施例1水稻稻瘟病抗性基因Pi36的遗传分析及初步定位如图1，本发明利用图位克隆法克隆了抗性基因Pi36。首先，为了发掘和鉴定稻瘟病新抗性基因，对籼稻抗病品种Q61与粳稻感病品种爱知旭以及丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu，LTH)2个杂交组合由来的F2群体(F2-1和F2-2)，接种对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株CHL39。结果表明，这2个F2群体中抗病植株与感病植株的分离比符合3∶1。由此推断，Q61所表现的对接种菌株CHL39的抗性是由一对显性基因控制的。
为了快速地确定主效抗性基因的染色体位置，构建了由40个抗病个体和580个感病个体组成的F2代作图群体，并利用随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)标记技术，结合基于混合群体分离分析法(bulked-segregant analysis，BSA)的隐性群体分析法(recessive-class analysis，RCA)，共筛选了1200个随机引物，得到了3个多态性好的标记，BA1126550，BA253450和OPP091800。由于这3个标记均位于该位点的一侧，并且BA1126550的重复性最好，所以，对该标记进行了克隆和测序。通过标记序列与测序品种日本晴的参考序列进行同源性比较，该标记被着陆到水稻第8染色体上。为了证实RAPD分析的结果，我们从公共数据库中引用了4个序列标签位点(sequencetagged site，STS)标记，S5014、C30376、E60275和C61344，以及3个微卫星(simple sequence repeats，SSR)标记，RM8018，RM1374和RM5647，利用580株高度感病的F2个体进行了连锁分析。结果表明，该抗性基因位点被定位在第8染色体的短臂上，标记RM8018-RM5647之间5.8cM的区域。由于该区域与第8染色体上已定位的4个稻瘟病抗性基因的位置不同，因此，将这个新基因命名为Pi36。
实施例2稻瘟病新抗性基因Pi36的精细定位及电子物理作图为了精细地确定Pi36位点的位置，我们利用公共数据库中的参考序列，开发了5个多态性的标记，1个STS标记R36STS2和4个候选抗性基因(candidateresistance gene，CRG)标记，CRG1、CRG2、CRG3和CRG4，并对580株高度感病的F2个体进行了连锁分析。结果表明，Pi36位点被精细定位在CRG2-RM5647之间0.6cM的区域，并且与标记CRG3和CRG4完全共分离。为了构建该位点的物理图谱，我们利用参考品种日本晴的细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome，BAC)和P1介导的人工染色体(P1-derived artificialchromosome，PAC)克隆，通过生物信息学分析(bioinformatics analysis，BIA)，构建了该位点的电子物理图谱。结果表明，Pi36位点被物理定位在大约17kb的区域内。
实施例3稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因的预测注释及序列分析为了确定Pi36的候选基因，我们利用日本晴的参考序列，通过3种基因预测软件RiceGAAS(http//ricegaas.dna.affrc.go.jp)、Gramene(http//143.48.220.116/resources/)和Softberry的FGENESH(http//www.softberry.com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了Pi36的候选抗性基因为Pi36-1、Pi36-2和Pi36-3，其中Pi36-3包括了Pi36-1和Pi36-2。因此，将Pi36-3通过以下的基因功能互补实验确认其功能。
实施例4稻瘟病新抗性基因Pi36的转化与转化体的抗性鉴定利用长片段PCR(long-range PCR，LR-PCR)技术扩增了一个含Pi36的16.0kb的片段并将其克隆至双元载体转化体系pCAMBIA1300，导入了农杆菌菌株EHA105。将高度感病品种Q1063成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28℃培养1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代1次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗，获得了274株转化体。
用CRG标记CRG3对转化体进行了PCR-CAPS检测。本实验使用了2个引物，其中，引物CRG3F为gctagcaagcatggagttcgt-3’，引物CRG3R为3’-agcgggtaaggtagcataggt。PCR扩增的步骤为94℃预变性4min；接下来是30个循环，循环程序如下94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min；最后72℃延伸7min，温度降到4℃即完成扩增。扩增产物用限制性内切酶HigfI进行酶切，体系为10×酶切缓冲液2μl，PCR产物8μl，限制性内切酶HinfI10U，补加双蒸灭菌水至20μl。
同时，对转化植株进行了潮霉素基因的PCR和Southern blot鉴定(图3)。检测结果证明目基因片段已经导入这些转化体。抗性鉴定结果显示抗性基因Pi36在感病品种Q1063遗传背景下表现了与抗性基因供体Q61相同的抗性，表明抗性基因Pi36已经被成功地克隆了(图4)。
实施例5Pi36基因的结构采用移步法对Pi36的DNA序列进行了测定。利用5’和3’RACE反应，获得了Pi36的全长cDNA并对其进行了测序。序列表中的序列1和2分别是Pi36的DNA和cDNA序列。Pi36基因DNA长度为16.0kb，其全长cDNA为3963bp，含有一个3171bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为65bp和726bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放读码框含有4个内含子和5个外显子，而3’非翻译区含有1个内含子(图5)。
实施例6Pi36抗性蛋白的结构Pi36基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。抗性基因Pi36编码1个由1056个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为120KD，等电点为6.61。利用COIL分析表明该蛋白多肽的第14-45个氨基酸残基有95％的可能性为CC(coil-coil)结构域。Pi36蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GMGGLGKTT)位于该多肽的第206个氨基酸残基；kinase2(IVIDDIWDKP)位于该多肽的第286个氨基酸残基；kinase 3a(GSKILVTTRK)位于该多肽的第310个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的581-921个氨基酸残基为13个LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％。
数据库比较分析发现编码Pi36蛋白的核苷酸序列与大麦白粉病抗性基因Mla1和Mla6分别有40％和37％的同源性，与水稻稻瘟病抗性基因Pib、Pita和水稻白叶枯抗性基因Xa1分别具有30％、27％和24％的同源性。
实施例7Pi36基因的表达特性分析用RT-PCR对Pi36基因的表达模式进行了分析。从抗病品种Q61和感病品种LTH的叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒SuperScriptTMReverseTranscriptase II进行反转录cDNA第一条链的合成。RT-PCR引物为R36RT FCGAGCTGCTGAAGGAGAAGT；R36RT RAGCTCATCCCTTGGCTCATC。PCR反应为94℃预变性4min；接下来是35个循环，循环程序如下94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸7min，温度降到4℃即完成扩增。
实验结果表明，抗性品种和感病品种的接种前后的叶片组织的RNA反转录模板均能扩增出特异的片段，说明Pi36及其等位基因pi36均能在叶片组织中表达，即属于组成型表达的基因(图7)。
实施例8转化Pi36基因产生的抗性品种的应用将Pi36基因克隆到植物转化载体pCAMBIA1300，导入农杆菌菌株EHA105，用于转化感病的水稻品种，获得了274株转化植株。将转化体产生的T1种子进行播种、萌发和接种鉴定，发现其中有35个转化系(T1)表现抗性分离，而且转化植株的抗性与Pi36基因共分离。这说明可以用Pi36基因转化水稻感病品种，用于生产。
实施例9Pi36基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用利用本发明提供的Pi36基因序列信息可以产生分子标记，用于鉴定Pi36位点上具有的各种基因型即Pi36Pi36、Pi36pi36和pi36pi36的植株，可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用。
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>14450<212>DNA<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<220>
<221>5’UTR<222>(2489)..(2553)<220>
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<221>Intron<222>(11781)..(11903)<220>
<221>3’UTR<222>(11904)..(12459)<400>1
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表cttcgacacg caaacgtgca cacagccacc tatcgtgacc tcctcagcct ccacgcatcc 60gtacgtcctc tagtgcagcc actaaactgt aagtccaagt tctaaattgt aaccgacttt120gtacatatat tcgatacaaa ctctaacaat atcttcacta accctatctt agccgaataa180caactaaaat tttttctatt caaacatagc taaaccatgg ttaacaaata caacaatcct240aacaaccaca taaggtaaca gttggaatcg aacgctatat tgttacaaca ctgatacatt300tgtcgtgcac aggtagcttg aaatttgcac aagtcacgaa tattgtcgtc aaacggagat360agaacaaatc ctgcaagaag ctctggtaca ctttaaaatg accgctctag tcctcaaaat420ccagagatct cctacaaagc aattttagga tacggctcgt ttaaattgta aaagatgtat480tgtgtaattt caacagactt gacgatgcac atgctgattt ttaagagctt accattgtcc540actttaatgc acctggacca cggtcggttt cacagttcgc cgcaccaacc ggttccggaa600ggtgagcgtg ctggctgctg agaagaaaaa tagcttccca acgtggcttc aattaggggg660tgtttaggag agagggactt accaaacacc cccttaatca acgtgtggct gtcttttcag720atgacccttt tcctaagccc tctctctcat ttttcacaag cacatttttc aaattgttaa780acggtgtatt tttttaaaaa aaaagtttat atactaaagt tgcttaaaaa attaaattaa840ttatttttta aaaaaatagc aaatgtttaa ttaattacgt tctattggac cgtttcggtt900ttcgtaggta ccatgcacct ccccatccga ctgtagcgaa catcttccca tccggctgta960gcgatcacac ccagagggtc tcatgtgacg cgttcgaggt ggagccaacg gcgtcttaca 1020agttgagtaa cttgagtgat aaacacagta ttgcctacca cgcgttttga aacttaatta 1080cacgtgtttt cgccctcttg ttatgttcat gctccaatgg aaacaaacaa atcggatata 1140acacttcaat cctgaggcag gattttgtat gcaaaatggt actatactca gataaatggc 1200tcatcaatta taatgatggg tttacaatta caaatgaaga tatttaagca acttaattta 1260ttcattctag ttgcataggt ctagaactcg ttgcatttgg agtgagatgg agtaaatatt 1320atttcacatt ttgtcaattc aaacatttac acgttttaat gttttttcga gaatggatgg 1380cgtgagctcc gataagagta ctataagatt ataaaccagc tataaacata ttttaagaaa 1440ataaaagagg agagataaga gcaacggatt ataaatttat agccagctgc agcatagact 1500ccaagataca tgtgtgtatg ataggtgaga tcaaacatta atcatatagt acatgtttat 1560agataactat tgtatgaatt gactttagaa gatttggagc caatagttga atatactact 1620cccttctttc caaattaatc atcatgtaag aataggtaca acagcagatt attagccagc 1680tataaacata ttttaatgag ataaaagatg agagagaaga gcagcaggct atagatctgt 1740agccagctat aacacggact ccaagacgca atgggtgtat gacatgtggg accatatatt 1800aatagtataa taagcaacta ttgtatgaat tggctattag atcggctata gatgaattgg 1860agctagtagt gggctatact agtaaacttg ctctaataga atttaaaatt tttcaaattg 1920gtcattatat aactgcatgg acacggattt catcggaata caattaatac agtatgagag 1980aatatgtgta tgctagggtg taattgacat gaggttttaa ttgagtatag gagaatgtgt 2040gtatgttgtc ttgattgatg tgatttaaat tgtcattggt cttggtgcat aaaattatac 2100tccctccgtt ccataatata aggcacaact atttttttta tgttccataa tataaggcat 2160acatgcatgt atacaattaa ttaggacatc ttctccatta aattattatt tttttaaatc 2220attcactctc aagatctcta aatttattgg atgcatgcat gtattatatt tattaggatg 2280
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表atccaaatta gaaaataata ataattgttt cttgaaaaag tggttgtacc ttatattttg 2340gaacatatgg agtatgatga ttaatttggg aaggagggag tattaaactt gctctaaccc 2400aattgtgaca agtccattaa ttaacctatc agctagtagg ctagtagttg cacatatata 2460caggagtgca atgtatctgc tcctacccag ctaccaaccc agcaatacca tccactcaac 2520tcaagtcaag tcaaccacag ctagctagca agc atg gag ttc gtc act ggg gcg 2574Met Glu Phe Val Thr Gly Ala1 5atg agt agc ctg atc ccc aag ctg ggc gag ctg ctg aag gag aag tac2622Met Ser Ser Leu Ile Pro Lys Leu Gly Glu Leu Leu Lys Glu Lys Tyr10 15 20aat ctg cag aag aac ata agg ggg aag atc gag tct ctc tcg gcg gag2670Asn Leu Gln Lys Asn Ile Arg Gly Lys Ile Glu Ser Leu Ser Ala Glu25 30 35ctc cgg cga gcg caa gcc gtc ctc cgc atg gtc ggc gag gtg cca caa2718Leu Arg Arg Ala Gln Ala Val Leu Arg Met Val Gly Glu Val Pro Gln40 45 50 55gac cag cag aac gag ctg gtg aag ctc tgg gcg agc gac ctc agg gag2766Asp Gln Gln Ash Glu Leu Val Lys Leu Trp Ala Ser Asp Leu Arg Glu60 65 70gcg tcc tac gac atg gag gat atc atc gac gcc ttc ttg gtt cat gtc2814Ala Ser Tyr Asp Met Glu Asp Ile Ile Asp Ala Phe Leu Val His Val75 80 85gac gac gat ggc ccc aag cca gcc gac cca cat gtg ctc agg cgc ctc2862Asp Asp Asp Gly Pro Lys Pro Ala Asp Pro His Val Leu Arg Arg Leu90 95 100ggc aag cag gtg aag aaa ctg ttc aag aag acc aag cat cgc gtc acc2910Gly Lys Gln Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Thr Lys His Arg Val Thr105 110 115atc gcg gac gca atc caa gaa atg gaa aag aag ctc ctg gag att gat2958Ile Ala Asp Ala Ile Gln Glu Met Glu Lys Lys Leu Leu Glu Ile Asp120 125 130 135gca agg cat ggc ag gtatggaaaa tatttactcc ctccgtccca aaaaaaattc3012Ala Arg His Gly Argaatttctaag tttccgtatc caacatttga ttgtccgtct tatatgaaat ttttctatga 3072ttagtatttt tattgttgtt agatgataaa acataaataa tactttatgc gtgcgtgatt 3132tatcttttta ttttttttat aattttttca aataagacgg acggtcaaac gttgaacacg 3192gaaacccaaa aattgagtta ttttaagacg aagggagtaa tatggaagaa atcttaataa 3252tatgttgtat tatattgcat tatattgatc tgtcatgagg tacatacata tatagtacga 3312gttatagctg atttatctca agaattctat ttcttgtagt cttacattcg tcatctcttg 3372atgttgtctc ttgactctca tctattacta cag a tac cca gtt gat aac ata 3424Tyr Pro Val Asp Asn Ile145gtt atc cct gca cgt ccg acg cct att gat cct cgc atc cta aat att3472Val Ile Pro Ala Arg Pro Thr Pro Ile Asp Pro Arg Ile Leu Ash Ile150 155 160gag aaa atg gca aac aat ctt gtt ggc att gat gag cca agg gat gag3520Glu Lys Met Ala Asn Asn Leu Val Gly Ile Asp Glu Pro Arg Asp Glu165 170 175ctt att aag atg ttg tca caa cat gag cgt gac aac aat ctt aat acg3568Leu Ile Lys Met Leu Ser Gln His Glu Arg Asp Asn Asn Leu Asn Thr
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表180 185 190tcc aat agg aag aca aag ata gta tac gtc gtt gga atg ggt ggt ctg3616Ser Asn Arg Lys Thr Lys Ile Val Tyr Val Val Gly Met Gly Gly Leu195 200 205 210ggc aaa acc acc ctt gcc aca gca gta tat gag aag att aaa gtg ggt3664Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Val Gly215 220 225ttt cct ttg aat gct ttt gtt cca atc ggt caa aat cct aat atg aag3712Phe Pro Leu Asn Ala Phe Val Pro Ile Gly Gln Asn Pro Asn Met Lys230 235 240gca atc ttg tgg aac att ctt cat cgc ctt ggc tcg gag aag tac ctg3760Ala Ile Leu Trp Asn Ile Leu His Arg Leu Gly Ser Glu Lys Tyr Leu245 250 255aat tgt cca aat att gag atg ttg act gta cag gag ctc atc ggt gaa3808Asn Cys Pro Asn Ile Glu Met Leu Thr Val Gln Glu Leu Ile Gly Glu260 265 270ctc aag caa ttc atc aag gga aag ag gtatgaatat gacgacccac 3854Leu Lys Gln Phe Ile Lys Gly Lys Ser275 280caaatttgtt tttatatact acctcttttt cttaataaat cacgccattg acttttgaaa 3914taacgtttga ccttcaaaaa tttagtgtaa atatgctcaa gtataagtca taccttaaag 3974tttctttaat aataaaacaa gtcacaacaa aataaatagc atttatataa tttgtttgaa 4034tatgactaat ggttaaacgt catatcaaaa gtcaacatct tctgttagaa tacagaggga 4094gtatatgtcc ataacctatg ctaccttacc cgcttatgaa tgaatatttg cgctacacac 4154aatcatagtc ttaaagctat ttaatttgtc tttgcgcttg ctatttgaaa aaaaaatgat 4214gtacctcttt ttaatcgatc acagtaatag tccgggttta cccgttcttt aggctccact 4274tacatcatga gcaagctaaa aatcgtgatc aagatattaa acctaaaatg accttgatgt 4334cacctagagg ggtgtccatg gagcgactcc tcggacagcg aggagtggag acccctcccc 4394gagtttgaag attcagccag ggggttagca gtgcaagacg atagaaaaag ccaaacagag 4454aaaagatttg tggggcctga tctccccgcc aagcaaaagt caccagagtt tatacaggtt 4514caagccaccc ggaggtgtaa caccctactc ccgtgttggt tttgttgttt ttcttatatc 4574agcttagaac aagggatgcc tttttgggct acagacaaga agttctgatc caaaaaatcc 4634aactcttcat ccgtagcttg tccccttcct tttatagatc aaggatgggc tcacaattct 4694acaaatctac ttccttgtct tgtctatcag ctgtcttgtc aatgcctgtt ggttccctca 4754cacagtcttc gagtaaccca ctgacatttg aagcttgcat tgcccccaag cacccgggct 4814tctgtccgag acagctgggt cgtgccagca tgttcaccat gtggcgagtg gtgggcctgg 4874tgagacccga cctgcctgaa acagcaccac ggtttcgttt ctacccgttt ggctaaatca 4934ggcagcatgg ggcatgtgcg acacgtgtcc aagatgccac tggttctaat gactcagtga 4994tggtgccttg tccacatcct ttcagctcca gactagctgg ggctccccca taaacctgtt 5054taatttatgg cggagaggac tacttcacaa cagcccgtgg agcacgccca acaccccagc 5114tggtcctgag gtcgcgccct tgcacattta tggagatagt ttagctattc ttacacaagc 5174ttcttgaaga tatcttagat aatatctaat gtttcgacag agacattcct ccttaatcaa 5234gggacgtaac ctacatgcag acaaaggtga gcaagctaac aaggcaagca aaaggggata 5294tcggcaaaag tagttaatgg gttttcacaa acaacaacta aactactagt tgcaccaaat 5354
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表agcaaaactg gaggagtgag agagagagat accaccggga ttcttgcaaa ctgatatgtt 5414actgaatcta ctctccgttg aggagctcac aatgatatat atatatacat atatatatat 5474atatatacat atatatacat atacatatat atatacatac atatacatac atacatacat 5534acatacatac atacatacat atatacatac atacatacat acatacatac atacatacat 5594acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat 5654acatacacac acacatacat acatacatac atacatacat acatacatat atatatacat 5714acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac atatatatac 5774atacatacat acatatatat atatacatac atacatatat gtatacatac atatatatat 5834aatgtttcga cactcttcgt tgtagaggaa tgtaaaactc acaaggagta aggtgtgccc 5894gggtcctagg acgaggccgg acataggcat acctcagttt atctcttaat catatgtctc 5954caccctccac cccttgtaga aagtgtgacc tatgaagatt aaggtaagcc caggacccag 6014gtcaaggccg tgtctgaggc aaaccttagc ttattcttct taagatgtat atcttgtagg 6074tctctacgct cgtctacgta ggacttacaa ggactaaggt gagcccgaga cccaggacaa 6134gacagggtcc gaggcatacc ttaggctaca ttcttaagat gtagatttta tacgtctcca 6194cactcctctt ctcagagcaa tgtgtgactt gtgcggacta aggtgagccc gagacccagg 6254ataaggccga gtctgaggca taccttagtt tattcccttt aagatgtaga tcttgtaggt 6314ctctacgctc ctctcaccga gtctgaggca cacgttacat tettaagatg tacttcagtg 6374gacctgggtc ccgaagcgga actaggccta ggaccaacct tattactcag agttttaagt 6434cgttgtactt ttgacatgca tcattccccc ttaatcaagg ggagtaacct acatgcagac 6494aaaggtgggc ccgggaccaa ccaaggtggg tccctagtga cataacccta tttttaagga 6554tggtttaagc atgccattta tcttatttat aattgttttg ctgggggaaa tgggtagcct 6614aattcccatt tcaccgacaa ggggggtaaa taagcgttta taacttttat gtaaatgtgg 6674aggctaaaca tttcagatat tccaaaatat ttttggatat tctaggatat tttcagatat 6734tccgaaaatc tcaggttttc gagcaagcta acaaggcaag caaaggggat atcggcaaaa 6794gtagttaatg ggtttgcaca aacaacgact aaactactag ctgcaccaaa tagcaaaact 6854agaggagtga gagagagaga taccaccgag attgttgcaa actgatatgt tactgaatct 6914acactccgtt gaggagttca caatgagcca agtcttttcc aaccctatcc tcgtgaagtt 6974gcataaatgc actcatcttt tcattaaggg tatctcttcc ctttcagagg tgagatctga 7034ccttcacaaa ctccctcggc acaccaccta caaatcgatg tctcgaggtc aactcctagc 7094cgtccaggta tcctcaacca ccaagagtta caaatgcaac aaagatttct tggggatgaa 7154tcgactgctc gacaaatctt cacgaaatca acaccaagca ctcaaataaa ctcaaatcaa 7214ccactcacac atacacgaaa tccgagatgg aagatcggtg gagagtaggg atggcaattt 7274gacccgattg tccgtttacc catgggtaaa aaccctaata gagttgggtt tgttctacat 7334ttagtatcca tgggtttctt attgggtcaa aacctgtacc caatgggcaa gcgggcatgg 7394gcatgggtac ccatgcccgc ttcgcccatt tacccgcgaa aaacaactga catgtgggcc 7454ctcaatcaac ttaatataaa aagcaccatc taattctagg gttttcttcc tttcctccac 7514agccgctact ccttctcttc ccctttcctc tacagctacc actcctcttc ctccacagac 7574
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表catagccacc actccaggct gccaaggcgc caggctgaca cgggacagcc ggacgagagg 7634ggcgcgcaat tcgccaccac ctcccacctc cgctcgtcgc tggcggcccc accctccagc 7694cgacgacttt catagcggcc acgggggagg gggggcaacc aaggaagctg cgaccgccgt 7754cgccttctac cccgtctgcg ccgagctcct ctccaaccag tcgtcgatgt cctctagcca 7814tcggccgcca gcccgccaca ccttcctcca gtcgcgcctc ccacctccgg tcgccgccgc 7874ttcctccaga cgcgcctccc acctctggtt cccagatgtg acgggtaaac gggcatgcct 7934gcgggcacat ggcgcctacg ggggacgggc attggaagtg ctccttgccc atcatgtagt 7994aacgggcatg cccgcggaca tgaattacct cgcggacacg ggatgggtag tcactacccg 8054tgcccgttgt gcccgactgc catccctagt ggaaagtaag aagtgagagg gcaaggctca 8114aagtgaatct caaatcaaca caagcaaggg gcacaagaaa gcaatggagc gagcaatctt 8174gacttggggt ggagggggtt atttataacc acaacctcaa atctgattgt tggaggcaaa 8234tcaagattca actttttgaa aaattttgaa aaccattttt ggacaagtct gaaaaacaca 8294agaaagcaat ttcatttgag caaccatttt ccgaatttcc aaaaaaattt cggaattatt 8354ttcggaagtt gctacaatac ttttggaaat tccaaaaagt ataaattaca gcacaaactc 8414agcaaaaaaa aggaaaaata acatttcaga aattctgaaa atatttcgaa aaaatctgaa 8474atcaccagag agctttttca caaattttat cattttggaa attccaaaaa ccattttcgg 8534aaaattctag aaaacaccaa aagatgtgtt ggccaccgcc gtcacgtgag catgtcacat 8594ttgaactcat gacggaggag cacactgccc acttgtcagc gttatccctg tcactattct 8654agtgcaccac tggttcctag ctacaagacc gtcgtgccca cacattatcc aaaagcacat 8714gccaatgcat aggctaatga ataattaatt gcaatatctc acttttaatg catgtttatc 8774tctcttatct agattttctt cggcactaaa aattattgct ccttcacata taaaaagaaa 8834accacatctt attgatgact cgtaattttc agtgattggg gtgcttatac agttcttcta 8894ctattctagg t ttt tta tcg tta tag atg aca tat ggg ata agc cat cat 8944Phe Leu Ser Leu Met Thr Tyr Gly Ile Ser His His285 290 295ggc aaa tac tcg aaa gtg gtt tac aag ata atg att acg gaa gta aaa8992Gly Lys Tyr Ser Lys Val Val Tyr Lys Ile Met Ile Thr Glu Val Lys300 305 310tac ttg taa cta ctc gta aat ctg agg ttg caa caa tta tca gcg atg9040Tyr Leu Leu Leu Val Asn Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ser Ala Met315 320 325tgt aca ata tga aac cac ttt ctc atg ata act cta aag aat tat tgt9088Cys Thr Ile Asn His Phe Leu Met Ile Thr Leu Lys Asn Tyr Cys330 335 340ata caa gaa ctg gta gtg aag gca aat ctc ttg aca gtt cat caa ctg9136Ile Gln Glu Leu Val Val Lys Ala Asn Leu Leu Thr Val His Gln Leu345 350 355agg cat gtg aca aga ttt tga aga aat gtg ctg gtg tgc cat tag cta9184Arg His Val Thr Arg Phe Arg Asn Val Leu Val Cys His Leu360 365 370tca tta cga tag cta gct tgt tgg cta gta gat cag gtc tgg act ggt9232Ser Leu Arg Leu Ala Cys Trp Leu Val Asp Gln Val Trp Thr Gly375 380 385ctg agg tgt aca gag cta ttg att ttg gag aag aag aca act atg aaa9280Leu Arg Cys Thr Glu Leu Leu Ile Leu Glu Lys Lys Thr Thr Met Lys390 395 400
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表tgg caa ata cta aaa gga tat tgt ctt tta gct act acg atc tgc ctt9328Trp Gln Ile Leu Lys Gly Tyr Cys Leu Leu Ala Thr Thr Ile Cys Leu405 410 415cac att taa aga att gtt tgc tct atc taa gca tgt ttc cag aag att9376His Ile Arg Ile Val Cys Set Ile Ala Cys Phe Gln Lys Ile420 425 430ata aaa ttg aca aaa atc att tga tat gga tgt gga tag ctg aag gtt9424Ile Lys Leu Thr Lys Ile Ile Tyr Gly Cys Gly Leu Lys Val435 440 445ttg tcc ctg aga aac aaa aca caa att tag gat tat atg agc ttg ggg9472Leu Ser Leu Arg Asn Lys Thr Gln Ile Asp Tyr Met Ser Leu Gly450 455 460aga gtt act tca atg agc tga taa ata gaa gca tga tcc agc caa ttg9520Arg Val Thr Ser Met Ser Ile Glu Ala Ser Ser Gln Leu465 470aga atg aat ttt ttg ggt gta tag aag gtt tgt cgt gtt cca tga tat9568Arg Met Asn Phe Leu Gly Val Lys Val Cys Arg Val Pro Tyr475 480485ggt gct cga tct agc tcg ttc att gac aag tga aca aaa ctt tgt cac9616Gly Ala Arg Ser Ser Ser Phe Ile Asp Lys Thr Lys Leu Cys His490 495 500tgt att gga taa cga tga gca acg gaa acc tga aag cac caa tgc tcg9664Cys Ile Gly Arg Ala Thr Glu Thr Lys His Gln Cys Ser505 510 515tag gtt ggc cct gca ccg tac gag tat cac gag cta tcg att tgt taa9712Val Gly Pro Ala Pro Tyr Glu Tyr His Glu Leu Ser Ile Cys520 525 530tat gga tat gaa gaa agt gag gtc att tgt tgc cac tga gtg caa taa9760Tyr Gly Tyr Glu Glu Ser Glu Val Ile Cys Cys His Val Gln535 540tgg caa taa tag tgt ggc acc acc aag gtt cca agt ttt acg tgt gtt9808Trp Gln Cys Gly Thr Thr Lys Val Pro Ser Phe Thr Cys Val545 550 555gtc ctt gga caa atg taa tgg tat gga gga tta tta cat aga aag tat9856Val Leu Gly Gln Met Trp Tyr Gly Gly Leu Leu His Arg Lys Tyr560 565 570ttt gca gta tgc tgg aag gct ggg tca cct gag gtg cct cca gct ttc9904Phe Ala Val Cys Trp Lys Ala Gly Ser Pro Glu Val Pro Pro Ala Phe575 580 585ctc aca cac aga gtt tca tag gct ccc taa aga att agg aga tct caa9952Leu Thr His Arg Val Ser Ala Pro Arg Ile Arg Arg Ser Gln590 595 600gtt tct aa aaat act gga ctt ggg tga ttg tgg cgg tac aat aga aga10000Val Ser Lys Asn Thr Gly Leu Gly Leu Trp Arg Tyr Asn Arg Arg605 610 615gct gcc gga gga gtt ggg tct cct gac aca ttt gtt gtg tct acg tat10048Ala Ala Gly Gly Val Gly Ser Pro Asp Thr Phe Val Val Ser Thr Tyr620 625 630tcc tcg cag att gga gat gtt gcc agc tgg ttt gat cgg aaa act gac10096Ser Ser Gln Ile Gly Asp Val Ala Ser Trp Phe Asp Arg Lys Thr Asp635 640 645 650atc gct gca aga gct atg cat aag tct tat cga aga ggt cgc tgt aag10144Ile Ala Ala Arg Ala Met His Lys Ser Tyr Arg Arg Gly Arg Cys Lys655 660 665gca ctt tgt gca gga gtt ggg caa cct cag aga act gag ggt gct cta10192Ala Leu Cys Ala Gly Val Gly Gln Pro Gln Arg Thr Glu Gly Ala Leu
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表670 675 680tgc caa aat tta tat agg gct gaa aga tga gag cat gca gag aga ttt10240Cys Gln Asn Leu Tyr Arg Ala Glu Arg Glu His Ala Glu Arg Phe685 690 695tct aca gtc ctt agg ctg tct aca taa ggt cca cac tat gaa tat ata10288Ser Thr Val Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro His Tyr Glu Tyr Ile700 705 710tag cat tga agt aag gga atg cac cag acc aga tgc agc agg ttc tgt10336His Ser Lys Gly Met His Gln Thr Arg Cys Ser Arg Phe Cys715 720 725gtc ctg tcc tcg gct ctg gca gct gtc att gcc atg cat caa gtt ttt10384Val Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ala Val Ile Ala Met His Gln Val Phe730 735 740tag cct acc tgt gtg gat taa ctc atc aac tct tgg ttg cct ctc gca10432Pro Thr Cys Val Asp Leu Ile Asn Ser Trp Leu Pro Leu Ala745 750 755tct aga cgt gaa agt aca ggt tgt gag aga gca gga cat gga aac cct10480Ser Arg Arg Glu Ser Thr Gly Cys Glu Arg Ala Gly His Gly Asn Pro760 765 770tgg aag gct ccc aat gct ctg tta cct caa att gga ttc cca ata tac10528Trp Lys Ala Pro Asn Ala Leu Leu Pro Gln Ile Gly Phe Pro Ile Tyr775 780 785cag gct aat aag cat taa gaa gcc tgc tga tga tgg cta ctt cca aaa10576Gln Ala Asn Lys His Glu Ala Cys Trp Leu Leu Pro Lys790 795 800att gag att ctt taa aac tcc tca ttc att tgt ccg gtt tga tct tca10624Ile Glu Ile Leu Asn Ser Ser Phe Ile Cys Pro Val Ser Ser805 810 815tgg ttg cga gtc cag cag tgg agc atc tag ctt cat gcc aag act tga10672Trp Leu Arg Val Gln Gln Trp Ser Ile Leu His Ala Lys Thr820 825aca cat tga att cag tgt cga tgt tcg gtt cct aaa aga tgc agc aga10720Thr His Ile Gln Cys Arg Cys Ser Val Pro Lys Arg Cys Ser Arg830 835 840cct gca tgc tgg tct taa caa cct gct tgc agg ctt caa tga ctt tgg10768Pro Ala Cys Trp Ser Gln Pro Ala Cys Arg Leu Gln Leu Trp845 850 855aag aac ttc gct caa gag tgt cga cgc tag gat cca ctg caa gga tgc10816Lys Asn Phe Ala Gln Glu Cys Arg Arg Asp Pro Leu Gln Gly Cys860 865 870cct tgc tgc gga ggt gca gga agc cga ggt ggc att ggc aaa tgc agc10864Pro Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ser Arg Gly Gly Ile Gly Lys Cys Ser875 880 885aca cgg cca tcc caa ccg tcc agt cct tcg aac tga tat ggc ata tga10912Thr Arg Pro Ser Gln Pro Ser Ser Pro Ser Asn Tyr Gly Ile890 895 900gag gat gat gcg ctc acc tga tga cga taa g gtacgtgtat gcacagtacg10963Glu Asp Asp Ala Leu Thr Arg905 910taatgtactt agatcatttc aatcgatttt ccttatgctg gttttctgcc tacatatata 11023aaatctgatc ttaattattt cttgtgctta tatatatttt tcag cc aac aag ctg 11078Ala Asn Lys Leugtc cga tca aaa att ttt tga gat aca tgt cta tcc gtc gtc gaa tga11126Val Arg Ser Lys Ile Phe Asp Thr Cys Leu Ser Val Val Glu915 920 925
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表cca tca tcg tta cct tag cta cct ccg gtt gtt gaa gaa gcc acg cct11174Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Pro Val Val Glu Glu Ala Thr Pro930 935 940gga gaa gct tat agt caa cat ata tgt gtc caa gga tgg tat ggt tgg11222Gly Glu Ala Tyr Ser Gln His Ile Cys Val Gln Gly Trp Tyr Gly Trp945 950 955gga tgt gga tga agc tgt ggc agc tgc gag gaa cgt agt cga cca tca11270Gly Cys Gly Ser Cys Gly Ser Cys Glu Glu Arg Ser Arg Pro Ser960 965 970tat caa cca tcc aac act tga gat aaa tag aat gga aga aag tat ttc11318Tyr Gln Pro Ser Asn Thr Asp Lys Asn Gly Arg Lys Tyr Phe975 980 985tga cca aca tca aca g gcaagatata tctctcttct tgagctcgtc cccaatattg 11374Pro Thr Ser Thr990tactacagag aaacccagtt aatttgtaac accaaccatc acattctgaa tcatgtttgc 11434cttttaattg tttttatgca tactctacat gagagtgcta tatatatttt gtttcacttg 11494cagttgctca tagtcatttc acaagataca tatgcatggt ggtagactgc taaaactata 11554gttcatccta acatagcatt attttttgac tgtttctag gt ccc tga aaa taa 11607Gly Pro Lys995ttg a gtggcaagct gttcatttga aggttaagat tggcacagtg atggcacaat 11661Leuattaatgaat ccgagccaga ctagacggga agctgtcata gcattgacta atctgtaatc 11721cgatttcaaa atgcaggata ttcggatcaa tttcctcata tgtcgtctac tcttttactg 11781taagtatgac actttatctt ttatctcatt tatgtatctt tcgtaagtgg cacagtaata 11841aggtgacatc ccattgttat tcccacacgt ttgtaaccaa attctttaat aattgagtgc 11901agttctggtg catgtttgat tctctgcatt tggtccaagc agaggttaca gcacattatc 11961aacggagaaa ataactgaaa aaaggtgatg ataaacagaa tattatgggt gctgtagcat 12021aattgactct gcacctgatc accctcctca tgggttggta agcacaacag cttgccatct 12081tattgctgta caatcttttg tgaatgatga taggtgtaat tggatatgtg tgctggagaa 12141aaaatgctca atccaagtga caaattgcgc acttgttttg atctttaatt ccctttcaga 12201gtgatctact ctaaggacaa tcttggatca cccttggatg aaaaacttaa ggattggatg 12261ttggacattt tacctttgat aggcctaaaa acttcatgta tatattatat ccaaactaga 12321ggttataagt gtgttttggc tatgtgcatc atagctatgc aaatgccggg agtatgctca 12381acatagttgt atcgcctcat tgtaattgac tgcgttcaat aaaatcttcc attatctaaa 12441aaatggaaag cttcaatcca ccaacagagt catggccaca tgattccctc attggacacc 12501gaaagattca aagaaagcag acttcaggct gtaaaattgt ttgtgaaaac cttcatgttg 12561catgaatgca agagtgacct tgaatatgtt gcttaatttt tcagattatg tgtttcacat 12621tttctaattt agtatactgt gaagtttgcg ggggaatgta tagatttagt tgatgaattc 12681agtagagcaa acacaaagta caggtacaaa acaataacat gatgggattc agatctcaga 12741aggtgcacag attcgtaact gtgaacctac agaggcacaa tgcaacaaca ggtcaccaaa 12801taatatctca actgagtaac aactaaaaat cattttactt gaacaacttg cccaaataga 12861
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表gtcatcaaaa ggagaaataa caacttgccc aagaataaga aaatctgatc caccttaaga 12921tgaccaccct agtcatcaaa atccacatca cttacaaaac agatttagga tcataaccat 12981caacaacttc aataacgtaa ctggtggcct aggttgtaaa agaaaacatt gaaatatgag 13041tcatggaatt ccaattcaaa agacttgagt gtgcaaatgc tgaaattaag atgctcaaca 13101ttctcagcca ttttggggat ggattttgat ttgagggaga ggattaataa tggaaaataa 13161gatcttcaca atgatgtgga ctcttctatc gccttgtggg caaatgattt tgattttcct 13221atgcttttca cagttaactg ctgccctgtt ccttcgcatg tgggatctaa atctgcagta 13281gcatttgcag aattggtgtc gtgatcatag gcataagctc catgctggta aaatgaacaa 13341ggaaacagtt aaactcaatt catgagaaga aaagaaacag caatgtggag agggggagat 13401ataccgaacc ttgacaagat gcagggaaag tttctctatg ttaggtgagt gccgaagcaa 13461gtacagtagt ggatagcagc catcactaaa aaaccactca ccaagtgcca aactcgttag 13521attgctgaat atcccacacc ttggaagatc acgtagtaat accttttgga ccacctgccc 13581acaagtttta aactccaaag atgttaaaga taggaatata taaacaacaa ataagagcaa 13641ttgtaattta aagcatttag cttacatctt cgtagataga tgaagacatc aagtgcaatc 13701ttgcagcgtt tgaaagagca ctgagaatag tgcagtcaac atcagaatgt ccaaaagaga 13761acctattaag ggtaaactga agctgattcc actgatgata tgtctaggag ccgaagattt 13821ctgtttgcaa tctcctctac atgcaggcag ataaggtttg gcatatttat cacaagatgc 13881tgaaaacctt ctgggtcatc ttgagttcta tctgcagctg taatggtcag aatcttcaat 13941gtagcagagc aaaacatggt ggccttgatg gcacaatgtc tcaactccag atgcagtagc 14001tccgggcaac cagaaaagag tttctcgaca aaacggttat caatagaaaa tttgcaaagg 14061tatacactct tcaagtgcaa ggaagtgaag gggacaggat atccatctac agaaaggagc 14121ttgccatcac aataattgag tatgccgaga gttttaacgt tgcacctaag ggcatggcag 14181acccatggat ggatgtcaga ataatcaagg gaatcatcag agctgtcata ggaggtatgg 14241atacagaaca tatccaacag ggcacagctg cgctgcagga gcaaattgtc aacaaacttc 14301ttaaaatgtt tcactgtaat gaagttgcac gaatcaacat tgaggtatcc cacagatgcc 14361cagacgttct gccacctccg agatagcaca caagtctgca cagcctcctt cgctgttagg 14421aatgtcatga catggtgcaa aagttcgtc14450<210>2<211>1056<212>NBS-LRR<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<400>2Met Glu Phe Val Thr Gly Ala Met Ser Ser Leu Ile Pro Lys Leu5 10 15Gly Glu Leu Leu Lys Glu Lys Tyr Asn Leu Gln Lys Asn Ile Arg20 25 30Gly Lys Ile Glu Ser Leu Ser Ala Glu Leu Arg Arg Ala Gln Ala35 40 45Val Leu Arg Met Val Gly Glu Val Pro Gln Asp Gln Gln Asn Glu50 55 60Leu Val Lys Leu Trp Ala Ser Asp Leu Arg Glu Ala Ser Tyr Asp
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表65 70 75Met Glu Asp Ile Ile Asp Ala Phe Leu Val His Val Asp Asp Asp80 85 90Gly Pro Lys Pro Ala Asp Pro His Val Leu Arg Arg Leu Gly Lys95 100 105Gln Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Thr Lys His Arg Val Thr Ile110 115 120Ala Asp Ala Ile Gln 6lu Met Glu Lys Lys Leu Leu Glu Ile Asp125 130 135Ala Arg His Gly Arg Tyr Pro Val Asp Asn Ile Val Ile Pro Ala140 145 150Arg Pro Thr Pro Ile Asp Pro Arg Ile Leu Asn Ile Glu Lys Met155 160 165Ala Asn Asn Leu Val Gly Ile Asp Glu Pro Arg Asp Glu Leu Ile170 175 180Lys Met Leu Ser Gln His Glu Arg Asp Asn Asn Leu Asn Thr Ser185 190 195Asn Arg Lys Thr Lys Ile Val Tyr Val Val Gly Met Gly Gly Leu200 205 210Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Val215 220 225Gly Phe Pro Leu Asn Ala Phe Val Pro Ile Gly Gln Asn Pro Asn230 235 240Met Lys Ala Ile Leu Trp Asn Ile Leu His Arg Leu Gly Ser Glu245 250 255Lys Tyr Leu Asn Cys Pro Asn Ile Glu Met Leu Thr Val Gln Glu260 265 270Leu Ile Gly Glu Leu Lys Gln Phe Ile Lys Gly Lys Arg Phe Phe275 280 285Ile Val Ile Asp Asp Ile Trp Asp Lys Pro Ser Trp Gln Ile Leu290 295 300Glu Ser Gly Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Gly Ser Lys Ile Leu Val305 310 315Thr Thr Arg Lys Ser Glu Val Ala Thr Ile Ile Ser Asp Val Tyr320 325 330Asn Met Lys Pro Leu Ser His Asp Asn Ser Lys Glu Leu Leu Tyr335 340 345Thr Arg Thr Gly Ser Glu Gly Lys Ser Leu Asp Ser Ser Ser Thr350 355 360Glu Ala Cys Asp Lys Ile Leu Lys Lys Cys Ala Gly Val Pro Leu365 370 375Ala Ile Ile Thr Ile Ala Ser Leu Leu Ala Ser Arg Ser Gly Leu380 385 390Asp Trp Ser Glu Val Tyr Arg Ala Ile Asp Phe Gly Glu Glu Asp395 400 405Asn Tyr Glu Met Ala Asn Thr Lys Arg Ile Leu Ser Phe Ser Tyr410 415 420Tyr Asp Leu Pro Ser His Leu Lys Asn Cys Leu Leu Tyr Leu Ser425 430 435Met Phe Pro Glu Asp Tyr Lys Ile Asp Lys Asn His Leu Ile Trp440 445 450Met Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Pro Glu Lys Gln Asn Thr Asn455 460 465Leu Gly Leu Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Tyr Phe Asn Glu Leu IIe470 475 480Asn Arg Ser Met Ile Gln Pro Ile Glu Asn Glu Phe Phe Gly Cys485 490 495Ile Glu Gly Cys Arg Val His Asp Met Val Leu Asp Leu Ala Arg500 505 510Ser Leu Thr Ser Glu Gln Asn Phe Val Thr Val Leu Asp Asn Asp515 520 525Glu Gln Arg Lys Pro Glu Ser Thr Asn Ala Arg Arg Leu Ala Leu530 535 540His Arg Thr Ser Ile Thr Ser Tyr Arg Phe Val Asn Met Asp Met545 550 555Lys Lys Val Arg Ser Phe Val Ala Thr Glu Cys Asn Asn Gly Asn560 565 570Asn Ser Val Ala Pro Pro Arg Phe Gln Val Leu Arg Val Leu Ser575 580 585Leu Asp Lys Cys Ser Gly Met Glu Asp Tyr Tyr Ile Glu Ser Ile590 595 600Leu Gln Tyr Ala Gly Arg Leu Gly His Leu Arg Cys Leu Gln Leu605 610 615Ser Ser His Thr Glu Phe His Arg Leu Pro Lys Glu Leu Gly Asp620 625 630
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表Leu Lys Phe Leu Lys Ile Leu Asp Leu Gly Asp Cys Gly Gly Thr635 640 645Ile Glu Glu Leu Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Thr His Leu Leu650 655 660Cys Leu Arg Ile Pro Arg Arg Leu Glu Met Leu Pro Ala Gly Leu665 670 675Ile Gly Lys Leu Thr Ser Leu Gln Glu Leu Cys Ile Ser Leu Ile680 685 690Glu Glu Val Ala Val Arg His Phe Val Gln Glu Leu Gly Asn Leu695 700 705Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Ala Lys Ile Tyr Ile Gly Leu Lys710 715 720Asp Glu Ser Met Gln Arg Asp Phe Leu Gln Ser Leu Gly Cys Leu725 730 735His Lys Val His Thr Met Asn Ile Tyr Ser Ile Glu Val Arg Glu740 745 750Cys Thr Arg Pro Asp Ala Ala Gly Ser Val Ser Cys Pro Arg Leu755 760 765Trp Gln Leu Ser Leu Pro Cys Ile Lys Phe Phe Ser Leu Pro Val770 775 780Trp Ile Asn Ser Ser Thr Leu Gly Cys Leu Ser His Leu Asp Val785 790 795Lys Val Gln Val Val Arg Glu Gln Asp Met Glu Thr Leu Gly Arg800 805 810Leu Pro Met Leu Cys Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Gln Tyr Thr Arg815 820 825Leu Ile Ser Ile Lys Lys Pro Ala Asp Asp Gly Tyr Phe Gln Lys830 835 840Leu Arg Phe Phe Lys Thr Pro His Ser Phe Val Arg Phe Asp Leu845 850 855His Gly Cys Glu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Phe Met Pro Arg860 865 870Leu Glu His Ile Glu Phe Ser Val Asp Val Arg Phe Leu Lys Asp875 880 885Ala Ala Asp Leu His Ala Gly Leu Asn Asn Leu Leu Ala Gly Phe890 895 900Asn Asp Phe Gly Arg Thr Ser Leu Lys Ser Val Asp Ala Arg Ile905 910 915His Cys Lys Asp Ala Leu Ala Ala Glu Val Gln Glu Ala Glu Val920 925 930Ala Leu Ala Asn Ala Ala His Gly His Pro Asn Arg Pro Val Leu935 940 945Arg Thr Asp Met Ala Tyr Glu Arg Met Met Arg Ser Pro Asp Asp950 955 960Asp Lys Pro Thr Ser Trp Ser Asp Gln Lys Phe Phe Glu Val His965 970 975Val Tyr Pro Ser Ser Asn Asp His His Arg Tyr Leu Ser Tyr Leu980 985 990Arg Leu Leu Lys Lys Pro Arg Leu Glu Lys Leu Ile Val Asn Ile99510001005Tyr Val Ser Lys Asp Gly Met Val Gly Asp Val Asp Glu Ala Val101010151020Ala Ala Ala Arg Asn Val Val Asp His His Ile Asn His Pro Thr102510301035Leu Glu Ile Asn Arg Met Glu Glu Ser Ile Ser Asp Gln His Gln104010451050Gln Val Pro Glu Asn Asn105权利要求
1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi36编码的蛋白质，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.编码权利要求1所述蛋白质的水稻稻瘟病抗性基因Pi36的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi36，其核苷酸序列如SEQID NO1所示。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.权利要求5所述载体转化的转基因植物。
7.权利要求3或4所述基因产生的分子标记。
8.权利要求1或2所述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
9.权利要求7所述分子标记在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个水稻新抗性基因Pi36的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列与应用。该基因属于nonTIR－NBS－LRR抗性基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。本发明还涉及了用该基因转化水稻或其它植物培育抗病品种以及根据该基因序列产生的分子标记在育种中的应用。
文档编号A01N65/00GK1821406SQ200610034048
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者潘庆华, 王玲, 林菲, 刘新琼 申请人:华南农业大学
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi36的分离克隆与应用。
背景技术：
植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，抗病基因产物结构的分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于植物病害的预防和控制也具有重要的指导意义。
迄今，已经从3种单子叶植物和5种双子叶植物中分离了40多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC)，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蝇Toll蛋白及哺乳动物白介素-1受体(Toll andinterleukin-1 receptor，TIR)等。根据它们所编码蛋白的结构特征，可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack & Jones，1997；Dangl & Jones 2001；Iyer & McCouch2004)。
第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1个被克隆的植物抗病基因，它负责对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hm1编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小种1产生的致病因子，它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。它们编码的蛋白近N端为NBS，而近C端则由LRR组成。如RPS2(Bent等，1994)、RPM1(Grant等，1995)、I2(Simon等，1998)、RPP5(Parker等，1997)、N(Dodd等，2001)、L6(Lawrence等，1995)、Mla1(Zhou等，2001)、Mla6(Halterman等，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura等，1998)、Pib(Wang等，1999)、Pita(Bryan等，2000)等。第三类，PK类抗病基因。如番茄Pto基因，其产物是一个位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martin等，1993)。第四类，LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2(Dixon等，1996)、Cf-4(Thomas等，1997)、Cf-5(Dixon等，1998)、Cf-9(Jones等，1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基因Hs1ppro-1(Cai等，1997)等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song等，1995)为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域(Xiao等，2001)。第七类，以水稻的xa5基因为代表，其编码的蛋白为一个转录因子(TFIIAγ)(Iyer &McCouch，2004)。
编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers等，1999；Pan等，2000；Cannon等，2002；Richly等，2002)。TNL类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没在单子叶植物基因组中发现(Bai等，2002；Meyers等，2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的抗病基因主要编码CNL类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CNL类抗病基因，相对而言，单子叶植物中的CNL类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样(Cannon等，2002)。
研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack &Jones 1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反应下游的信号传导(Jones，1994)。最近的证据表明，亚麻的L族多样性选择也发生在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck等，2000)。LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones & Jones，1996；Kajava，1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent，1996；Baker等，1997)。Jia等(2000)通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小种特异性的激发子，传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita176不能与LRD结合，因而表现感病。这一结果直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(无性态Pyricularia grisea Sacc.)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的了解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应用于抗病育种计划已成为农业科研中优先解决的重要问题。
随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。值得指出的是，在众多被成功定位的抗性基因中，只有抗性基因Pib和Pita两个抗性基因被成功地克隆，它们分别位于水稻的第2染色体和第12染色体上。本发明申请提出之前还没有水稻第8染色体上稻瘟病抗性基因被克隆的报道。
克隆抗病基因是对水稻抗性机理研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻品种Q61中携带的一个稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植物。
本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
本发明涉及分离和应用一种包含Pi36基因的DNA片段，该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害产生特异性(专化性)的抗病反应。这一发明适用于对所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所列，结构如图6所示。本发明所示的DNA片段在水稻的叶片组织呈组成型表达。
所分离、克隆的Pi36抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域，其中NBS结构域含有保守的kinase 1aGMGGLGKTT，kinase 2aIVIDDIWDKP和kinase 3aGSKILVTTRK。而该蛋白的C-末端为13个LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％。Pi36基因中编码NBS或LRR的核苷酸片段可能具有独立的功能。将Pi36基因中编码不同结构域的片段与其他核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。对Pi36基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。例如，将该基因的LRR区域替换为其他抗性基因的结构域，或将该基因的NBS结构域进行定点突变，可能会导致基因抗性的丧失或基因的抗谱的改变。
本发明同样包括将Pi36抗性基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
根据本发明提供的Pi36基因序列信息(SEQ ID NO1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pi36等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)以Pi36基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pi36基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在Pi36基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明提供的稻瘟病抗性基因Pi36具有重要的应用价值。应用之一是将所述的Pi36基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将Pi36抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。
本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
本发明具有如下有益效果将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。
图1为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的图位克隆示意图；图2.为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的高解析度遗传图谱和电子物理图谱；图3为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的部分抗性转化体的选择标记潮霉素基因的PCR(3a)和Southern(3b)检测结果图；图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi36转化植株的抗性鉴定图；图5为水稻稻瘟病抗性基因Pi36的基因结构图；图6为水稻稻瘟病抗性基因Pi36编码的氨基酸多肽序列结构图；图7为水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其等位基因pi36表达特性的RT-PCR检测图；图8为分子标记CRG3鉴定亲本和感病植株的Pi36位点基因型结果图；其中，图2中A为Pi36位点的高解析度遗传图谱，水平线表示染色体区域，上方为标记/抗性基因，下方数字为标记间的遗传距离(cM)；B为Pi36位点区域的BAC/PAC克隆电子重叠群，水平线表示BAC/PAC克隆，垂直线表示连锁标记的着陆位置；C为Pi36位点的电子物理图谱，括号内数字为各标记位点的重组体数，水平线表示基因组区域，下方数字为标记间的物理距离(kb)。
图3中泳道1-8为抗性基因Pi36的转化苗的潮霉素抗性基因的PCR扩增产物；泳道9为载体pCAMBIA1300质粒的潮霉素抗性基因的PCR产物；泳道10为受体Q1063的非转化体；M为分子量标记DL2000；箭头所指为Hpt基因的部分片段760bp。
图5中绿色方盒表示抗性基因Pi36的外显子，带斜线的方盒分别为5’和3’非翻译区，直线则表示内含子。
图6中带下划线字母为组成推定NBS的6个区域；第590个氨基酸残基反映了Pi36抗感等位基因间蛋白序列的差别，在感病等位基因pi36中均为天冬氨酸；下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域。
图7中A为抗病品种Q61在接种前以及接种后6、12、24、48、72h的基因表达情况；actin为内参照；B为感病品种Q13，即LTH，在接种前以及接种后6、12、24、48、72h的基因表达情况；actin为内参照。
图8中P1为抗病亲本Q61；P2为感病亲本爱知旭；S1-S5、S6和S7为F2感病植株，基因pi36pi36；R1为F2抗病植株，基因型为Pi36pi36；undigest2个亲本酶切前的带型；M分子量标记DL2000；箭头所指为标记CRG3。
具体实施例方式
实施例1水稻稻瘟病抗性基因Pi36的遗传分析及初步定位如图1，本发明利用图位克隆法克隆了抗性基因Pi36。首先，为了发掘和鉴定稻瘟病新抗性基因，对籼稻抗病品种Q61与粳稻感病品种爱知旭以及丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu，LTH)2个杂交组合由来的F2群体(F2-1和F2-2)，接种对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株CHL39。结果表明，这2个F2群体中抗病植株与感病植株的分离比符合3∶1。由此推断，Q61所表现的对接种菌株CHL39的抗性是由一对显性基因控制的。
为了快速地确定主效抗性基因的染色体位置，构建了由40个抗病个体和580个感病个体组成的F2代作图群体，并利用随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)标记技术，结合基于混合群体分离分析法(bulked-segregant analysis，BSA)的隐性群体分析法(recessive-class analysis，RCA)，共筛选了1200个随机引物，得到了3个多态性好的标记，BA1126550，BA253450和OPP091800。由于这3个标记均位于该位点的一侧，并且BA1126550的重复性最好，所以，对该标记进行了克隆和测序。通过标记序列与测序品种日本晴的参考序列进行同源性比较，该标记被着陆到水稻第8染色体上。为了证实RAPD分析的结果，我们从公共数据库中引用了4个序列标签位点(sequencetagged site，STS)标记，S5014、C30376、E60275和C61344，以及3个微卫星(simple sequence repeats，SSR)标记，RM8018，RM1374和RM5647，利用580株高度感病的F2个体进行了连锁分析。结果表明，该抗性基因位点被定位在第8染色体的短臂上，标记RM8018-RM5647之间5.8cM的区域。由于该区域与第8染色体上已定位的4个稻瘟病抗性基因的位置不同，因此，将这个新基因命名为Pi36。
实施例2稻瘟病新抗性基因Pi36的精细定位及电子物理作图为了精细地确定Pi36位点的位置，我们利用公共数据库中的参考序列，开发了5个多态性的标记，1个STS标记R36STS2和4个候选抗性基因(candidateresistance gene，CRG)标记，CRG1、CRG2、CRG3和CRG4，并对580株高度感病的F2个体进行了连锁分析。结果表明，Pi36位点被精细定位在CRG2-RM5647之间0.6cM的区域，并且与标记CRG3和CRG4完全共分离。为了构建该位点的物理图谱，我们利用参考品种日本晴的细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome，BAC)和P1介导的人工染色体(P1-derived artificialchromosome，PAC)克隆，通过生物信息学分析(bioinformatics analysis，BIA)，构建了该位点的电子物理图谱。结果表明，Pi36位点被物理定位在大约17kb的区域内。
实施例3稻瘟病新抗性基因Pi36候选基因的预测注释及序列分析为了确定Pi36的候选基因，我们利用日本晴的参考序列，通过3种基因预测软件RiceGAAS(http//ricegaas.dna.affrc.go.jp)、Gramene(http//143.48.220.116/resources/)和Softberry的FGENESH(http//www.softberry.com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了Pi36的候选抗性基因为Pi36-1、Pi36-2和Pi36-3，其中Pi36-3包括了Pi36-1和Pi36-2。因此，将Pi36-3通过以下的基因功能互补实验确认其功能。
实施例4稻瘟病新抗性基因Pi36的转化与转化体的抗性鉴定利用长片段PCR(long-range PCR，LR-PCR)技术扩增了一个含Pi36的16.0kb的片段并将其克隆至双元载体转化体系pCAMBIA1300，导入了农杆菌菌株EHA105。将高度感病品种Q1063成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28℃培养1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基。将水稻愈伤组织浸入菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代1次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗，获得了274株转化体。
用CRG标记CRG3对转化体进行了PCR-CAPS检测。本实验使用了2个引物，其中，引物CRG3F为gctagcaagcatggagttcgt-3’，引物CRG3R为3’-agcgggtaaggtagcataggt。PCR扩增的步骤为94℃预变性4min；接下来是30个循环，循环程序如下94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min；最后72℃延伸7min，温度降到4℃即完成扩增。扩增产物用限制性内切酶HigfI进行酶切，体系为10×酶切缓冲液2μl，PCR产物8μl，限制性内切酶HinfI10U，补加双蒸灭菌水至20μl。
同时，对转化植株进行了潮霉素基因的PCR和Southern blot鉴定(图3)。检测结果证明目基因片段已经导入这些转化体。抗性鉴定结果显示抗性基因Pi36在感病品种Q1063遗传背景下表现了与抗性基因供体Q61相同的抗性，表明抗性基因Pi36已经被成功地克隆了(图4)。
实施例5Pi36基因的结构采用移步法对Pi36的DNA序列进行了测定。利用5’和3’RACE反应，获得了Pi36的全长cDNA并对其进行了测序。序列表中的序列1和2分别是Pi36的DNA和cDNA序列。Pi36基因DNA长度为16.0kb，其全长cDNA为3963bp，含有一个3171bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为65bp和726bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放读码框含有4个内含子和5个外显子，而3’非翻译区含有1个内含子(图5)。
实施例6Pi36抗性蛋白的结构Pi36基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。抗性基因Pi36编码1个由1056个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为120KD，等电点为6.61。利用COIL分析表明该蛋白多肽的第14-45个氨基酸残基有95％的可能性为CC(coil-coil)结构域。Pi36蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GMGGLGKTT)位于该多肽的第206个氨基酸残基；kinase2(IVIDDIWDKP)位于该多肽的第286个氨基酸残基；kinase 3a(GSKILVTTRK)位于该多肽的第310个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的581-921个氨基酸残基为13个LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％。
数据库比较分析发现编码Pi36蛋白的核苷酸序列与大麦白粉病抗性基因Mla1和Mla6分别有40％和37％的同源性，与水稻稻瘟病抗性基因Pib、Pita和水稻白叶枯抗性基因Xa1分别具有30％、27％和24％的同源性。
实施例7Pi36基因的表达特性分析用RT-PCR对Pi36基因的表达模式进行了分析。从抗病品种Q61和感病品种LTH的叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒SuperScriptTMReverseTranscriptase II进行反转录cDNA第一条链的合成。RT-PCR引物为R36RT FCGAGCTGCTGAAGGAGAAGT；R36RT RAGCTCATCCCTTGGCTCATC。PCR反应为94℃预变性4min；接下来是35个循环，循环程序如下94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸7min，温度降到4℃即完成扩增。
实验结果表明，抗性品种和感病品种的接种前后的叶片组织的RNA反转录模板均能扩增出特异的片段，说明Pi36及其等位基因pi36均能在叶片组织中表达，即属于组成型表达的基因(图7)。
实施例8转化Pi36基因产生的抗性品种的应用将Pi36基因克隆到植物转化载体pCAMBIA1300，导入农杆菌菌株EHA105，用于转化感病的水稻品种，获得了274株转化植株。将转化体产生的T1种子进行播种、萌发和接种鉴定，发现其中有35个转化系(T1)表现抗性分离，而且转化植株的抗性与Pi36基因共分离。这说明可以用Pi36基因转化水稻感病品种，用于生产。
实施例9Pi36基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用利用本发明提供的Pi36基因序列信息可以产生分子标记，用于鉴定Pi36位点上具有的各种基因型即Pi36Pi36、Pi36pi36和pi36pi36的植株，可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用。
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>14450<212>DNA<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<220>
<221>5’UTR<222>(2489)..(2553)<220>
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<221>3’UTR<222>(11904)..(12459)<400>1
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表cttcgacacg caaacgtgca cacagccacc tatcgtgacc tcctcagcct ccacgcatcc 60gtacgtcctc tagtgcagcc actaaactgt aagtccaagt tctaaattgt aaccgacttt120gtacatatat tcgatacaaa ctctaacaat atcttcacta accctatctt agccgaataa180caactaaaat tttttctatt caaacatagc taaaccatgg ttaacaaata caacaatcct240aacaaccaca taaggtaaca gttggaatcg aacgctatat tgttacaaca ctgatacatt300tgtcgtgcac aggtagcttg aaatttgcac aagtcacgaa tattgtcgtc aaacggagat360agaacaaatc ctgcaagaag ctctggtaca ctttaaaatg accgctctag tcctcaaaat420ccagagatct cctacaaagc aattttagga tacggctcgt ttaaattgta aaagatgtat480tgtgtaattt caacagactt gacgatgcac atgctgattt ttaagagctt accattgtcc540actttaatgc acctggacca cggtcggttt cacagttcgc cgcaccaacc ggttccggaa600ggtgagcgtg ctggctgctg agaagaaaaa tagcttccca acgtggcttc aattaggggg660tgtttaggag agagggactt accaaacacc cccttaatca acgtgtggct gtcttttcag720atgacccttt tcctaagccc tctctctcat ttttcacaag cacatttttc aaattgttaa780acggtgtatt tttttaaaaa aaaagtttat atactaaagt tgcttaaaaa attaaattaa840ttatttttta aaaaaatagc aaatgtttaa ttaattacgt tctattggac cgtttcggtt900ttcgtaggta ccatgcacct ccccatccga ctgtagcgaa catcttccca tccggctgta960gcgatcacac ccagagggtc tcatgtgacg cgttcgaggt ggagccaacg gcgtcttaca 1020agttgagtaa cttgagtgat aaacacagta ttgcctacca cgcgttttga aacttaatta 1080cacgtgtttt cgccctcttg ttatgttcat gctccaatgg aaacaaacaa atcggatata 1140acacttcaat cctgaggcag gattttgtat gcaaaatggt actatactca gataaatggc 1200tcatcaatta taatgatggg tttacaatta caaatgaaga tatttaagca acttaattta 1260ttcattctag ttgcataggt ctagaactcg ttgcatttgg agtgagatgg agtaaatatt 1320atttcacatt ttgtcaattc aaacatttac acgttttaat gttttttcga gaatggatgg 1380cgtgagctcc gataagagta ctataagatt ataaaccagc tataaacata ttttaagaaa 1440ataaaagagg agagataaga gcaacggatt ataaatttat agccagctgc agcatagact 1500ccaagataca tgtgtgtatg ataggtgaga tcaaacatta atcatatagt acatgtttat 1560agataactat tgtatgaatt gactttagaa gatttggagc caatagttga atatactact 1620cccttctttc caaattaatc atcatgtaag aataggtaca acagcagatt attagccagc 1680tataaacata ttttaatgag ataaaagatg agagagaaga gcagcaggct atagatctgt 1740agccagctat aacacggact ccaagacgca atgggtgtat gacatgtggg accatatatt 1800aatagtataa taagcaacta ttgtatgaat tggctattag atcggctata gatgaattgg 1860agctagtagt gggctatact agtaaacttg ctctaataga atttaaaatt tttcaaattg 1920gtcattatat aactgcatgg acacggattt catcggaata caattaatac agtatgagag 1980aatatgtgta tgctagggtg taattgacat gaggttttaa ttgagtatag gagaatgtgt 2040gtatgttgtc ttgattgatg tgatttaaat tgtcattggt cttggtgcat aaaattatac 2100tccctccgtt ccataatata aggcacaact atttttttta tgttccataa tataaggcat 2160acatgcatgt atacaattaa ttaggacatc ttctccatta aattattatt tttttaaatc 2220attcactctc aagatctcta aatttattgg atgcatgcat gtattatatt tattaggatg 2280
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表atccaaatta gaaaataata ataattgttt cttgaaaaag tggttgtacc ttatattttg 2340gaacatatgg agtatgatga ttaatttggg aaggagggag tattaaactt gctctaaccc 2400aattgtgaca agtccattaa ttaacctatc agctagtagg ctagtagttg cacatatata 2460caggagtgca atgtatctgc tcctacccag ctaccaaccc agcaatacca tccactcaac 2520tcaagtcaag tcaaccacag ctagctagca agc atg gag ttc gtc act ggg gcg 2574Met Glu Phe Val Thr Gly Ala1 5atg agt agc ctg atc ccc aag ctg ggc gag ctg ctg aag gag aag tac2622Met Ser Ser Leu Ile Pro Lys Leu Gly Glu Leu Leu Lys Glu Lys Tyr10 15 20aat ctg cag aag aac ata agg ggg aag atc gag tct ctc tcg gcg gag2670Asn Leu Gln Lys Asn Ile Arg Gly Lys Ile Glu Ser Leu Ser Ala Glu25 30 35ctc cgg cga gcg caa gcc gtc ctc cgc atg gtc ggc gag gtg cca caa2718Leu Arg Arg Ala Gln Ala Val Leu Arg Met Val Gly Glu Val Pro Gln40 45 50 55gac cag cag aac gag ctg gtg aag ctc tgg gcg agc gac ctc agg gag2766Asp Gln Gln Ash Glu Leu Val Lys Leu Trp Ala Ser Asp Leu Arg Glu60 65 70gcg tcc tac gac atg gag gat atc atc gac gcc ttc ttg gtt cat gtc2814Ala Ser Tyr Asp Met Glu Asp Ile Ile Asp Ala Phe Leu Val His Val75 80 85gac gac gat ggc ccc aag cca gcc gac cca cat gtg ctc agg cgc ctc2862Asp Asp Asp Gly Pro Lys Pro Ala Asp Pro His Val Leu Arg Arg Leu90 95 100ggc aag cag gtg aag aaa ctg ttc aag aag acc aag cat cgc gtc acc2910Gly Lys Gln Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Thr Lys His Arg Val Thr105 110 115atc gcg gac gca atc caa gaa atg gaa aag aag ctc ctg gag att gat2958Ile Ala Asp Ala Ile Gln Glu Met Glu Lys Lys Leu Leu Glu Ile Asp120 125 130 135gca agg cat ggc ag gtatggaaaa tatttactcc ctccgtccca aaaaaaattc3012Ala Arg His Gly Argaatttctaag tttccgtatc caacatttga ttgtccgtct tatatgaaat ttttctatga 3072ttagtatttt tattgttgtt agatgataaa acataaataa tactttatgc gtgcgtgatt 3132tatcttttta ttttttttat aattttttca aataagacgg acggtcaaac gttgaacacg 3192gaaacccaaa aattgagtta ttttaagacg aagggagtaa tatggaagaa atcttaataa 3252tatgttgtat tatattgcat tatattgatc tgtcatgagg tacatacata tatagtacga 3312gttatagctg atttatctca agaattctat ttcttgtagt cttacattcg tcatctcttg 3372atgttgtctc ttgactctca tctattacta cag a tac cca gtt gat aac ata 3424Tyr Pro Val Asp Asn Ile145gtt atc cct gca cgt ccg acg cct att gat cct cgc atc cta aat att3472Val Ile Pro Ala Arg Pro Thr Pro Ile Asp Pro Arg Ile Leu Ash Ile150 155 160gag aaa atg gca aac aat ctt gtt ggc att gat gag cca agg gat gag3520Glu Lys Met Ala Asn Asn Leu Val Gly Ile Asp Glu Pro Arg Asp Glu165 170 175ctt att aag atg ttg tca caa cat gag cgt gac aac aat ctt aat acg3568Leu Ile Lys Met Leu Ser Gln His Glu Arg Asp Asn Asn Leu Asn Thr
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表180 185 190tcc aat agg aag aca aag ata gta tac gtc gtt gga atg ggt ggt ctg3616Ser Asn Arg Lys Thr Lys Ile Val Tyr Val Val Gly Met Gly Gly Leu195 200 205 210ggc aaa acc acc ctt gcc aca gca gta tat gag aag att aaa gtg ggt3664Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Val Gly215 220 225ttt cct ttg aat gct ttt gtt cca atc ggt caa aat cct aat atg aag3712Phe Pro Leu Asn Ala Phe Val Pro Ile Gly Gln Asn Pro Asn Met Lys230 235 240gca atc ttg tgg aac att ctt cat cgc ctt ggc tcg gag aag tac ctg3760Ala Ile Leu Trp Asn Ile Leu His Arg Leu Gly Ser Glu Lys Tyr Leu245 250 255aat tgt cca aat att gag atg ttg act gta cag gag ctc atc ggt gaa3808Asn Cys Pro Asn Ile Glu Met Leu Thr Val Gln Glu Leu Ile Gly Glu260 265 270ctc aag caa ttc atc aag gga aag ag gtatgaatat gacgacccac 3854Leu Lys Gln Phe Ile Lys Gly Lys Ser275 280caaatttgtt tttatatact acctcttttt cttaataaat cacgccattg acttttgaaa 3914taacgtttga ccttcaaaaa tttagtgtaa atatgctcaa gtataagtca taccttaaag 3974tttctttaat aataaaacaa gtcacaacaa aataaatagc atttatataa tttgtttgaa 4034tatgactaat ggttaaacgt catatcaaaa gtcaacatct tctgttagaa tacagaggga 4094gtatatgtcc ataacctatg ctaccttacc cgcttatgaa tgaatatttg cgctacacac 4154aatcatagtc ttaaagctat ttaatttgtc tttgcgcttg ctatttgaaa aaaaaatgat 4214gtacctcttt ttaatcgatc acagtaatag tccgggttta cccgttcttt aggctccact 4274tacatcatga gcaagctaaa aatcgtgatc aagatattaa acctaaaatg accttgatgt 4334cacctagagg ggtgtccatg gagcgactcc tcggacagcg aggagtggag acccctcccc 4394gagtttgaag attcagccag ggggttagca gtgcaagacg atagaaaaag ccaaacagag 4454aaaagatttg tggggcctga tctccccgcc aagcaaaagt caccagagtt tatacaggtt 4514caagccaccc ggaggtgtaa caccctactc ccgtgttggt tttgttgttt ttcttatatc 4574agcttagaac aagggatgcc tttttgggct acagacaaga agttctgatc caaaaaatcc 4634aactcttcat ccgtagcttg tccccttcct tttatagatc aaggatgggc tcacaattct 4694acaaatctac ttccttgtct tgtctatcag ctgtcttgtc aatgcctgtt ggttccctca 4754cacagtcttc gagtaaccca ctgacatttg aagcttgcat tgcccccaag cacccgggct 4814tctgtccgag acagctgggt cgtgccagca tgttcaccat gtggcgagtg gtgggcctgg 4874tgagacccga cctgcctgaa acagcaccac ggtttcgttt ctacccgttt ggctaaatca 4934ggcagcatgg ggcatgtgcg acacgtgtcc aagatgccac tggttctaat gactcagtga 4994tggtgccttg tccacatcct ttcagctcca gactagctgg ggctccccca taaacctgtt 5054taatttatgg cggagaggac tacttcacaa cagcccgtgg agcacgccca acaccccagc 5114tggtcctgag gtcgcgccct tgcacattta tggagatagt ttagctattc ttacacaagc 5174ttcttgaaga tatcttagat aatatctaat gtttcgacag agacattcct ccttaatcaa 5234gggacgtaac ctacatgcag acaaaggtga gcaagctaac aaggcaagca aaaggggata 5294tcggcaaaag tagttaatgg gttttcacaa acaacaacta aactactagt tgcaccaaat 5354
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表agcaaaactg gaggagtgag agagagagat accaccggga ttcttgcaaa ctgatatgtt 5414actgaatcta ctctccgttg aggagctcac aatgatatat atatatacat atatatatat 5474atatatacat atatatacat atacatatat atatacatac atatacatac atacatacat 5534acatacatac atacatacat atatacatac atacatacat acatacatac atacatacat 5594acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat 5654acatacacac acacatacat acatacatac atacatacat acatacatat atatatacat 5714acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac atatatatac 5774atacatacat acatatatat atatacatac atacatatat gtatacatac atatatatat 5834aatgtttcga cactcttcgt tgtagaggaa tgtaaaactc acaaggagta aggtgtgccc 5894gggtcctagg acgaggccgg acataggcat acctcagttt atctcttaat catatgtctc 5954caccctccac cccttgtaga aagtgtgacc tatgaagatt aaggtaagcc caggacccag 6014gtcaaggccg tgtctgaggc aaaccttagc ttattcttct taagatgtat atcttgtagg 6074tctctacgct cgtctacgta ggacttacaa ggactaaggt gagcccgaga cccaggacaa 6134gacagggtcc gaggcatacc ttaggctaca ttcttaagat gtagatttta tacgtctcca 6194cactcctctt ctcagagcaa tgtgtgactt gtgcggacta aggtgagccc gagacccagg 6254ataaggccga gtctgaggca taccttagtt tattcccttt aagatgtaga tcttgtaggt 6314ctctacgctc ctctcaccga gtctgaggca cacgttacat tettaagatg tacttcagtg 6374gacctgggtc ccgaagcgga actaggccta ggaccaacct tattactcag agttttaagt 6434cgttgtactt ttgacatgca tcattccccc ttaatcaagg ggagtaacct acatgcagac 6494aaaggtgggc ccgggaccaa ccaaggtggg tccctagtga cataacccta tttttaagga 6554tggtttaagc atgccattta tcttatttat aattgttttg ctgggggaaa tgggtagcct 6614aattcccatt tcaccgacaa ggggggtaaa taagcgttta taacttttat gtaaatgtgg 6674aggctaaaca tttcagatat tccaaaatat ttttggatat tctaggatat tttcagatat 6734tccgaaaatc tcaggttttc gagcaagcta acaaggcaag caaaggggat atcggcaaaa 6794gtagttaatg ggtttgcaca aacaacgact aaactactag ctgcaccaaa tagcaaaact 6854agaggagtga gagagagaga taccaccgag attgttgcaa actgatatgt tactgaatct 6914acactccgtt gaggagttca caatgagcca agtcttttcc aaccctatcc tcgtgaagtt 6974gcataaatgc actcatcttt tcattaaggg tatctcttcc ctttcagagg tgagatctga 7034ccttcacaaa ctccctcggc acaccaccta caaatcgatg tctcgaggtc aactcctagc 7094cgtccaggta tcctcaacca ccaagagtta caaatgcaac aaagatttct tggggatgaa 7154tcgactgctc gacaaatctt cacgaaatca acaccaagca ctcaaataaa ctcaaatcaa 7214ccactcacac atacacgaaa tccgagatgg aagatcggtg gagagtaggg atggcaattt 7274gacccgattg tccgtttacc catgggtaaa aaccctaata gagttgggtt tgttctacat 7334ttagtatcca tgggtttctt attgggtcaa aacctgtacc caatgggcaa gcgggcatgg 7394gcatgggtac ccatgcccgc ttcgcccatt tacccgcgaa aaacaactga catgtgggcc 7454ctcaatcaac ttaatataaa aagcaccatc taattctagg gttttcttcc tttcctccac 7514agccgctact ccttctcttc ccctttcctc tacagctacc actcctcttc ctccacagac 7574
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表catagccacc actccaggct gccaaggcgc caggctgaca cgggacagcc ggacgagagg 7634ggcgcgcaat tcgccaccac ctcccacctc cgctcgtcgc tggcggcccc accctccagc 7694cgacgacttt catagcggcc acgggggagg gggggcaacc aaggaagctg cgaccgccgt 7754cgccttctac cccgtctgcg ccgagctcct ctccaaccag tcgtcgatgt cctctagcca 7814tcggccgcca gcccgccaca ccttcctcca gtcgcgcctc ccacctccgg tcgccgccgc 7874ttcctccaga cgcgcctccc acctctggtt cccagatgtg acgggtaaac gggcatgcct 7934gcgggcacat ggcgcctacg ggggacgggc attggaagtg ctccttgccc atcatgtagt 7994aacgggcatg cccgcggaca tgaattacct cgcggacacg ggatgggtag tcactacccg 8054tgcccgttgt gcccgactgc catccctagt ggaaagtaag aagtgagagg gcaaggctca 8114aagtgaatct caaatcaaca caagcaaggg gcacaagaaa gcaatggagc gagcaatctt 8174gacttggggt ggagggggtt atttataacc acaacctcaa atctgattgt tggaggcaaa 8234tcaagattca actttttgaa aaattttgaa aaccattttt ggacaagtct gaaaaacaca 8294agaaagcaat ttcatttgag caaccatttt ccgaatttcc aaaaaaattt cggaattatt 8354ttcggaagtt gctacaatac ttttggaaat tccaaaaagt ataaattaca gcacaaactc 8414agcaaaaaaa aggaaaaata acatttcaga aattctgaaa atatttcgaa aaaatctgaa 8474atcaccagag agctttttca caaattttat cattttggaa attccaaaaa ccattttcgg 8534aaaattctag aaaacaccaa aagatgtgtt ggccaccgcc gtcacgtgag catgtcacat 8594ttgaactcat gacggaggag cacactgccc acttgtcagc gttatccctg tcactattct 8654agtgcaccac tggttcctag ctacaagacc gtcgtgccca cacattatcc aaaagcacat 8714gccaatgcat aggctaatga ataattaatt gcaatatctc acttttaatg catgtttatc 8774tctcttatct agattttctt cggcactaaa aattattgct ccttcacata taaaaagaaa 8834accacatctt attgatgact cgtaattttc agtgattggg gtgcttatac agttcttcta 8894ctattctagg t ttt tta tcg tta tag atg aca tat ggg ata agc cat cat 8944Phe Leu Ser Leu Met Thr Tyr Gly Ile Ser His His285 290 295ggc aaa tac tcg aaa gtg gtt tac aag ata atg att acg gaa gta aaa8992Gly Lys Tyr Ser Lys Val Val Tyr Lys Ile Met Ile Thr Glu Val Lys300 305 310tac ttg taa cta ctc gta aat ctg agg ttg caa caa tta tca gcg atg9040Tyr Leu Leu Leu Val Asn Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ser Ala Met315 320 325tgt aca ata tga aac cac ttt ctc atg ata act cta aag aat tat tgt9088Cys Thr Ile Asn His Phe Leu Met Ile Thr Leu Lys Asn Tyr Cys330 335 340ata caa gaa ctg gta gtg aag gca aat ctc ttg aca gtt cat caa ctg9136Ile Gln Glu Leu Val Val Lys Ala Asn Leu Leu Thr Val His Gln Leu345 350 355agg cat gtg aca aga ttt tga aga aat gtg ctg gtg tgc cat tag cta9184Arg His Val Thr Arg Phe Arg Asn Val Leu Val Cys His Leu360 365 370tca tta cga tag cta gct tgt tgg cta gta gat cag gtc tgg act ggt9232Ser Leu Arg Leu Ala Cys Trp Leu Val Asp Gln Val Trp Thr Gly375 380 385ctg agg tgt aca gag cta ttg att ttg gag aag aag aca act atg aaa9280Leu Arg Cys Thr Glu Leu Leu Ile Leu Glu Lys Lys Thr Thr Met Lys390 395 400
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表tgg caa ata cta aaa gga tat tgt ctt tta gct act acg atc tgc ctt9328Trp Gln Ile Leu Lys Gly Tyr Cys Leu Leu Ala Thr Thr Ile Cys Leu405 410 415cac att taa aga att gtt tgc tct atc taa gca tgt ttc cag aag att9376His Ile Arg Ile Val Cys Set Ile Ala Cys Phe Gln Lys Ile420 425 430ata aaa ttg aca aaa atc att tga tat gga tgt gga tag ctg aag gtt9424Ile Lys Leu Thr Lys Ile Ile Tyr Gly Cys Gly Leu Lys Val435 440 445ttg tcc ctg aga aac aaa aca caa att tag gat tat atg agc ttg ggg9472Leu Ser Leu Arg Asn Lys Thr Gln Ile Asp Tyr Met Ser Leu Gly450 455 460aga gtt act tca atg agc tga taa ata gaa gca tga tcc agc caa ttg9520Arg Val Thr Ser Met Ser Ile Glu Ala Ser Ser Gln Leu465 470aga atg aat ttt ttg ggt gta tag aag gtt tgt cgt gtt cca tga tat9568Arg Met Asn Phe Leu Gly Val Lys Val Cys Arg Val Pro Tyr475 480485ggt gct cga tct agc tcg ttc att gac aag tga aca aaa ctt tgt cac9616Gly Ala Arg Ser Ser Ser Phe Ile Asp Lys Thr Lys Leu Cys His490 495 500tgt att gga taa cga tga gca acg gaa acc tga aag cac caa tgc tcg9664Cys Ile Gly Arg Ala Thr Glu Thr Lys His Gln Cys Ser505 510 515tag gtt ggc cct gca ccg tac gag tat cac gag cta tcg att tgt taa9712Val Gly Pro Ala Pro Tyr Glu Tyr His Glu Leu Ser Ile Cys520 525 530tat gga tat gaa gaa agt gag gtc att tgt tgc cac tga gtg caa taa9760Tyr Gly Tyr Glu Glu Ser Glu Val Ile Cys Cys His Val Gln535 540tgg caa taa tag tgt ggc acc acc aag gtt cca agt ttt acg tgt gtt9808Trp Gln Cys Gly Thr Thr Lys Val Pro Ser Phe Thr Cys Val545 550 555gtc ctt gga caa atg taa tgg tat gga gga tta tta cat aga aag tat9856Val Leu Gly Gln Met Trp Tyr Gly Gly Leu Leu His Arg Lys Tyr560 565 570ttt gca gta tgc tgg aag gct ggg tca cct gag gtg cct cca gct ttc9904Phe Ala Val Cys Trp Lys Ala Gly Ser Pro Glu Val Pro Pro Ala Phe575 580 585ctc aca cac aga gtt tca tag gct ccc taa aga att agg aga tct caa9952Leu Thr His Arg Val Ser Ala Pro Arg Ile Arg Arg Ser Gln590 595 600gtt tct aa aaat act gga ctt ggg tga ttg tgg cgg tac aat aga aga10000Val Ser Lys Asn Thr Gly Leu Gly Leu Trp Arg Tyr Asn Arg Arg605 610 615gct gcc gga gga gtt ggg tct cct gac aca ttt gtt gtg tct acg tat10048Ala Ala Gly Gly Val Gly Ser Pro Asp Thr Phe Val Val Ser Thr Tyr620 625 630tcc tcg cag att gga gat gtt gcc agc tgg ttt gat cgg aaa act gac10096Ser Ser Gln Ile Gly Asp Val Ala Ser Trp Phe Asp Arg Lys Thr Asp635 640 645 650atc gct gca aga gct atg cat aag tct tat cga aga ggt cgc tgt aag10144Ile Ala Ala Arg Ala Met His Lys Ser Tyr Arg Arg Gly Arg Cys Lys655 660 665gca ctt tgt gca gga gtt ggg caa cct cag aga act gag ggt gct cta10192Ala Leu Cys Ala Gly Val Gly Gln Pro Gln Arg Thr Glu Gly Ala Leu
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表670 675 680tgc caa aat tta tat agg gct gaa aga tga gag cat gca gag aga ttt10240Cys Gln Asn Leu Tyr Arg Ala Glu Arg Glu His Ala Glu Arg Phe685 690 695tct aca gtc ctt agg ctg tct aca taa ggt cca cac tat gaa tat ata10288Ser Thr Val Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro His Tyr Glu Tyr Ile700 705 710tag cat tga agt aag gga atg cac cag acc aga tgc agc agg ttc tgt10336His Ser Lys Gly Met His Gln Thr Arg Cys Ser Arg Phe Cys715 720 725gtc ctg tcc tcg gct ctg gca gct gtc att gcc atg cat caa gtt ttt10384Val Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ala Val Ile Ala Met His Gln Val Phe730 735 740tag cct acc tgt gtg gat taa ctc atc aac tct tgg ttg cct ctc gca10432Pro Thr Cys Val Asp Leu Ile Asn Ser Trp Leu Pro Leu Ala745 750 755tct aga cgt gaa agt aca ggt tgt gag aga gca gga cat gga aac cct10480Ser Arg Arg Glu Ser Thr Gly Cys Glu Arg Ala Gly His Gly Asn Pro760 765 770tgg aag gct ccc aat gct ctg tta cct caa att gga ttc cca ata tac10528Trp Lys Ala Pro Asn Ala Leu Leu Pro Gln Ile Gly Phe Pro Ile Tyr775 780 785cag gct aat aag cat taa gaa gcc tgc tga tga tgg cta ctt cca aaa10576Gln Ala Asn Lys His Glu Ala Cys Trp Leu Leu Pro Lys790 795 800att gag att ctt taa aac tcc tca ttc att tgt ccg gtt tga tct tca10624Ile Glu Ile Leu Asn Ser Ser Phe Ile Cys Pro Val Ser Ser805 810 815tgg ttg cga gtc cag cag tgg agc atc tag ctt cat gcc aag act tga10672Trp Leu Arg Val Gln Gln Trp Ser Ile Leu His Ala Lys Thr820 825aca cat tga att cag tgt cga tgt tcg gtt cct aaa aga tgc agc aga10720Thr His Ile Gln Cys Arg Cys Ser Val Pro Lys Arg Cys Ser Arg830 835 840cct gca tgc tgg tct taa caa cct gct tgc agg ctt caa tga ctt tgg10768Pro Ala Cys Trp Ser Gln Pro Ala Cys Arg Leu Gln Leu Trp845 850 855aag aac ttc gct caa gag tgt cga cgc tag gat cca ctg caa gga tgc10816Lys Asn Phe Ala Gln Glu Cys Arg Arg Asp Pro Leu Gln Gly Cys860 865 870cct tgc tgc gga ggt gca gga agc cga ggt ggc att ggc aaa tgc agc10864Pro Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ser Arg Gly Gly Ile Gly Lys Cys Ser875 880 885aca cgg cca tcc caa ccg tcc agt cct tcg aac tga tat ggc ata tga10912Thr Arg Pro Ser Gln Pro Ser Ser Pro Ser Asn Tyr Gly Ile890 895 900gag gat gat gcg ctc acc tga tga cga taa g gtacgtgtat gcacagtacg10963Glu Asp Asp Ala Leu Thr Arg905 910taatgtactt agatcatttc aatcgatttt ccttatgctg gttttctgcc tacatatata 11023aaatctgatc ttaattattt cttgtgctta tatatatttt tcag cc aac aag ctg 11078Ala Asn Lys Leugtc cga tca aaa att ttt tga gat aca tgt cta tcc gtc gtc gaa tga11126Val Arg Ser Lys Ile Phe Asp Thr Cys Leu Ser Val Val Glu915 920 925
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表cca tca tcg tta cct tag cta cct ccg gtt gtt gaa gaa gcc acg cct11174Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Pro Val Val Glu Glu Ala Thr Pro930 935 940gga gaa gct tat agt caa cat ata tgt gtc caa gga tgg tat ggt tgg11222Gly Glu Ala Tyr Ser Gln His Ile Cys Val Gln Gly Trp Tyr Gly Trp945 950 955gga tgt gga tga agc tgt ggc agc tgc gag gaa cgt agt cga cca tca11270Gly Cys Gly Ser Cys Gly Ser Cys Glu Glu Arg Ser Arg Pro Ser960 965 970tat caa cca tcc aac act tga gat aaa tag aat gga aga aag tat ttc11318Tyr Gln Pro Ser Asn Thr Asp Lys Asn Gly Arg Lys Tyr Phe975 980 985tga cca aca tca aca g gcaagatata tctctcttct tgagctcgtc cccaatattg 11374Pro Thr Ser Thr990tactacagag aaacccagtt aatttgtaac accaaccatc acattctgaa tcatgtttgc 11434cttttaattg tttttatgca tactctacat gagagtgcta tatatatttt gtttcacttg 11494cagttgctca tagtcatttc acaagataca tatgcatggt ggtagactgc taaaactata 11554gttcatccta acatagcatt attttttgac tgtttctag gt ccc tga aaa taa 11607Gly Pro Lys995ttg a gtggcaagct gttcatttga aggttaagat tggcacagtg atggcacaat 11661Leuattaatgaat ccgagccaga ctagacggga agctgtcata gcattgacta atctgtaatc 11721cgatttcaaa atgcaggata ttcggatcaa tttcctcata tgtcgtctac tcttttactg 11781taagtatgac actttatctt ttatctcatt tatgtatctt tcgtaagtgg cacagtaata 11841aggtgacatc ccattgttat tcccacacgt ttgtaaccaa attctttaat aattgagtgc 11901agttctggtg catgtttgat tctctgcatt tggtccaagc agaggttaca gcacattatc 11961aacggagaaa ataactgaaa aaaggtgatg ataaacagaa tattatgggt gctgtagcat 12021aattgactct gcacctgatc accctcctca tgggttggta agcacaacag cttgccatct 12081tattgctgta caatcttttg tgaatgatga taggtgtaat tggatatgtg tgctggagaa 12141aaaatgctca atccaagtga caaattgcgc acttgttttg atctttaatt ccctttcaga 12201gtgatctact ctaaggacaa tcttggatca cccttggatg aaaaacttaa ggattggatg 12261ttggacattt tacctttgat aggcctaaaa acttcatgta tatattatat ccaaactaga 12321ggttataagt gtgttttggc tatgtgcatc atagctatgc aaatgccggg agtatgctca 12381acatagttgt atcgcctcat tgtaattgac tgcgttcaat aaaatcttcc attatctaaa 12441aaatggaaag cttcaatcca ccaacagagt catggccaca tgattccctc attggacacc 12501gaaagattca aagaaagcag acttcaggct gtaaaattgt ttgtgaaaac cttcatgttg 12561catgaatgca agagtgacct tgaatatgtt gcttaatttt tcagattatg tgtttcacat 12621tttctaattt agtatactgt gaagtttgcg ggggaatgta tagatttagt tgatgaattc 12681agtagagcaa acacaaagta caggtacaaa acaataacat gatgggattc agatctcaga 12741aggtgcacag attcgtaact gtgaacctac agaggcacaa tgcaacaaca ggtcaccaaa 12801taatatctca actgagtaac aactaaaaat cattttactt gaacaacttg cccaaataga 12861
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表gtcatcaaaa ggagaaataa caacttgccc aagaataaga aaatctgatc caccttaaga 12921tgaccaccct agtcatcaaa atccacatca cttacaaaac agatttagga tcataaccat 12981caacaacttc aataacgtaa ctggtggcct aggttgtaaa agaaaacatt gaaatatgag 13041tcatggaatt ccaattcaaa agacttgagt gtgcaaatgc tgaaattaag atgctcaaca 13101ttctcagcca ttttggggat ggattttgat ttgagggaga ggattaataa tggaaaataa 13161gatcttcaca atgatgtgga ctcttctatc gccttgtggg caaatgattt tgattttcct 13221atgcttttca cagttaactg ctgccctgtt ccttcgcatg tgggatctaa atctgcagta 13281gcatttgcag aattggtgtc gtgatcatag gcataagctc catgctggta aaatgaacaa 13341ggaaacagtt aaactcaatt catgagaaga aaagaaacag caatgtggag agggggagat 13401ataccgaacc ttgacaagat gcagggaaag tttctctatg ttaggtgagt gccgaagcaa 13461gtacagtagt ggatagcagc catcactaaa aaaccactca ccaagtgcca aactcgttag 13521attgctgaat atcccacacc ttggaagatc acgtagtaat accttttgga ccacctgccc 13581acaagtttta aactccaaag atgttaaaga taggaatata taaacaacaa ataagagcaa 13641ttgtaattta aagcatttag cttacatctt cgtagataga tgaagacatc aagtgcaatc 13701ttgcagcgtt tgaaagagca ctgagaatag tgcagtcaac atcagaatgt ccaaaagaga 13761acctattaag ggtaaactga agctgattcc actgatgata tgtctaggag ccgaagattt 13821ctgtttgcaa tctcctctac atgcaggcag ataaggtttg gcatatttat cacaagatgc 13881tgaaaacctt ctgggtcatc ttgagttcta tctgcagctg taatggtcag aatcttcaat 13941gtagcagagc aaaacatggt ggccttgatg gcacaatgtc tcaactccag atgcagtagc 14001tccgggcaac cagaaaagag tttctcgaca aaacggttat caatagaaaa tttgcaaagg 14061tatacactct tcaagtgcaa ggaagtgaag gggacaggat atccatctac agaaaggagc 14121ttgccatcac aataattgag tatgccgaga gttttaacgt tgcacctaag ggcatggcag 14181acccatggat ggatgtcaga ataatcaagg gaatcatcag agctgtcata ggaggtatgg 14241atacagaaca tatccaacag ggcacagctg cgctgcagga gcaaattgtc aacaaacttc 14301ttaaaatgtt tcactgtaat gaagttgcac gaatcaacat tgaggtatcc cacagatgcc 14361cagacgttct gccacctccg agatagcaca caagtctgca cagcctcctt cgctgttagg 14421aatgtcatga catggtgcaa aagttcgtc14450<210>2<211>1056<212>NBS-LRR<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<400>2Met Glu Phe Val Thr Gly Ala Met Ser Ser Leu Ile Pro Lys Leu5 10 15Gly Glu Leu Leu Lys Glu Lys Tyr Asn Leu Gln Lys Asn Ile Arg20 25 30Gly Lys Ile Glu Ser Leu Ser Ala Glu Leu Arg Arg Ala Gln Ala35 40 45Val Leu Arg Met Val Gly Glu Val Pro Gln Asp Gln Gln Asn Glu50 55 60Leu Val Lys Leu Trp Ala Ser Asp Leu Arg Glu Ala Ser Tyr Asp
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表65 70 75Met Glu Asp Ile Ile Asp Ala Phe Leu Val His Val Asp Asp Asp80 85 90Gly Pro Lys Pro Ala Asp Pro His Val Leu Arg Arg Leu Gly Lys95 100 105Gln Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Thr Lys His Arg Val Thr Ile110 115 120Ala Asp Ala Ile Gln 6lu Met Glu Lys Lys Leu Leu Glu Ile Asp125 130 135Ala Arg His Gly Arg Tyr Pro Val Asp Asn Ile Val Ile Pro Ala140 145 150Arg Pro Thr Pro Ile Asp Pro Arg Ile Leu Asn Ile Glu Lys Met155 160 165Ala Asn Asn Leu Val Gly Ile Asp Glu Pro Arg Asp Glu Leu Ile170 175 180Lys Met Leu Ser Gln His Glu Arg Asp Asn Asn Leu Asn Thr Ser185 190 195Asn Arg Lys Thr Lys Ile Val Tyr Val Val Gly Met Gly Gly Leu200 205 210Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Val215 220 225Gly Phe Pro Leu Asn Ala Phe Val Pro Ile Gly Gln Asn Pro Asn230 235 240Met Lys Ala Ile Leu Trp Asn Ile Leu His Arg Leu Gly Ser Glu245 250 255Lys Tyr Leu Asn Cys Pro Asn Ile Glu Met Leu Thr Val Gln Glu260 265 270Leu Ile Gly Glu Leu Lys Gln Phe Ile Lys Gly Lys Arg Phe Phe275 280 285Ile Val Ile Asp Asp Ile Trp Asp Lys Pro Ser Trp Gln Ile Leu290 295 300Glu Ser Gly Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Gly Ser Lys Ile Leu Val305 310 315Thr Thr Arg Lys Ser Glu Val Ala Thr Ile Ile Ser Asp Val Tyr320 325 330Asn Met Lys Pro Leu Ser His Asp Asn Ser Lys Glu Leu Leu Tyr335 340 345Thr Arg Thr Gly Ser Glu Gly Lys Ser Leu Asp Ser Ser Ser Thr350 355 360Glu Ala Cys Asp Lys Ile Leu Lys Lys Cys Ala Gly Val Pro Leu365 370 375Ala Ile Ile Thr Ile Ala Ser Leu Leu Ala Ser Arg Ser Gly Leu380 385 390Asp Trp Ser Glu Val Tyr Arg Ala Ile Asp Phe Gly Glu Glu Asp395 400 405Asn Tyr Glu Met Ala Asn Thr Lys Arg Ile Leu Ser Phe Ser Tyr410 415 420Tyr Asp Leu Pro Ser His Leu Lys Asn Cys Leu Leu Tyr Leu Ser425 430 435Met Phe Pro Glu Asp Tyr Lys Ile Asp Lys Asn His Leu Ile Trp440 445 450Met Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Pro Glu Lys Gln Asn Thr Asn455 460 465Leu Gly Leu Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Tyr Phe Asn Glu Leu IIe470 475 480Asn Arg Ser Met Ile Gln Pro Ile Glu Asn Glu Phe Phe Gly Cys485 490 495Ile Glu Gly Cys Arg Val His Asp Met Val Leu Asp Leu Ala Arg500 505 510Ser Leu Thr Ser Glu Gln Asn Phe Val Thr Val Leu Asp Asn Asp515 520 525Glu Gln Arg Lys Pro Glu Ser Thr Asn Ala Arg Arg Leu Ala Leu530 535 540His Arg Thr Ser Ile Thr Ser Tyr Arg Phe Val Asn Met Asp Met545 550 555Lys Lys Val Arg Ser Phe Val Ala Thr Glu Cys Asn Asn Gly Asn560 565 570Asn Ser Val Ala Pro Pro Arg Phe Gln Val Leu Arg Val Leu Ser575 580 585Leu Asp Lys Cys Ser Gly Met Glu Asp Tyr Tyr Ile Glu Ser Ile590 595 600Leu Gln Tyr Ala Gly Arg Leu Gly His Leu Arg Cys Leu Gln Leu605 610 615Ser Ser His Thr Glu Phe His Arg Leu Pro Lys Glu Leu Gly Asp620 625 630
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其应用序列表Leu Lys Phe Leu Lys Ile Leu Asp Leu Gly Asp Cys Gly Gly Thr635 640 645Ile Glu Glu Leu Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Thr His Leu Leu650 655 660Cys Leu Arg Ile Pro Arg Arg Leu Glu Met Leu Pro Ala Gly Leu665 670 675Ile Gly Lys Leu Thr Ser Leu Gln Glu Leu Cys Ile Ser Leu Ile680 685 690Glu Glu Val Ala Val Arg His Phe Val Gln Glu Leu Gly Asn Leu695 700 705Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Ala Lys Ile Tyr Ile Gly Leu Lys710 715 720Asp Glu Ser Met Gln Arg Asp Phe Leu Gln Ser Leu Gly Cys Leu725 730 735His Lys Val His Thr Met Asn Ile Tyr Ser Ile Glu Val Arg Glu740 745 750Cys Thr Arg Pro Asp Ala Ala Gly Ser Val Ser Cys Pro Arg Leu755 760 765Trp Gln Leu Ser Leu Pro Cys Ile Lys Phe Phe Ser Leu Pro Val770 775 780Trp Ile Asn Ser Ser Thr Leu Gly Cys Leu Ser His Leu Asp Val785 790 795Lys Val Gln Val Val Arg Glu Gln Asp Met Glu Thr Leu Gly Arg800 805 810Leu Pro Met Leu Cys Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Gln Tyr Thr Arg815 820 825Leu Ile Ser Ile Lys Lys Pro Ala Asp Asp Gly Tyr Phe Gln Lys830 835 840Leu Arg Phe Phe Lys Thr Pro His Ser Phe Val Arg Phe Asp Leu845 850 855His Gly Cys Glu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Phe Met Pro Arg860 865 870Leu Glu His Ile Glu Phe Ser Val Asp Val Arg Phe Leu Lys Asp875 880 885Ala Ala Asp Leu His Ala Gly Leu Asn Asn Leu Leu Ala Gly Phe890 895 900Asn Asp Phe Gly Arg Thr Ser Leu Lys Ser Val Asp Ala Arg Ile905 910 915His Cys Lys Asp Ala Leu Ala Ala Glu Val Gln Glu Ala Glu Val920 925 930Ala Leu Ala Asn Ala Ala His Gly His Pro Asn Arg Pro Val Leu935 940 945Arg Thr Asp Met Ala Tyr Glu Arg Met Met Arg Ser Pro Asp Asp950 955 960Asp Lys Pro Thr Ser Trp Ser Asp Gln Lys Phe Phe Glu Val His965 970 975Val Tyr Pro Ser Ser Asn Asp His His Arg Tyr Leu Ser Tyr Leu980 985 990Arg Leu Leu Lys Lys Pro Arg Leu Glu Lys Leu Ile Val Asn Ile99510001005Tyr Val Ser Lys Asp Gly Met Val Gly Asp Val Asp Glu Ala Val101010151020Ala Ala Ala Arg Asn Val Val Asp His His Ile Asn His Pro Thr102510301035Leu Glu Ile Asn Arg Met Glu Glu Ser Ile Ser Asp Gln His Gln104010451050Gln Val Pro Glu Asn Asn105权利要求
1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi36编码的蛋白质，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.编码权利要求1所述蛋白质的水稻稻瘟病抗性基因Pi36的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi36，其核苷酸序列如SEQID NO1所示。
5.一种含有权利要求3或4所述基因的载体。
6.权利要求5所述载体转化的转基因植物。
7.权利要求3或4所述基因产生的分子标记。
8.权利要求1或2所述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
9.权利要求7所述分子标记在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个水稻新抗性基因Pi36的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列与应用。该基因属于nonTIR－NBS－LRR抗性基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。本发明还涉及了用该基因转化水稻或其它植物培育抗病品种以及根据该基因序列产生的分子标记在育种中的应用。
文档编号A01N65/00GK1821406SQ200610034048
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者潘庆华, 王玲, 林菲, 刘新琼 申请人:华南农业大学
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