一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法
专利名称：一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灭蚊剂，具体地说，涉及一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。
背景技术：
城市污泥是污水处理过程中必然产生的沉淀物。目前，我国城市污泥年产生量约700万吨干重，根据我国城市污水处理目标，预计到2010年污泥产生量将超过800万吨干重。如何妥善处置这些数量日益庞大、高度集中的有机固体废弃物，是城市污水处理厂最头痛的问题之一。
在国际上，现行污泥的处置方式主要有填埋、土地利用、焚烧等，但它们都存在各自难以克服的缺陷，并且也不能满足当前的实际需要。例如，污泥填埋占地面积大，合适的填埋场地正急剧减少，并且污泥中有害成分的渗漏会对地下水造成污染；污泥土地利用存在因污泥大量施用造成的重金属、有机污染物与病原体等物质污染食物链与威胁人类健康的问题；而污泥焚烧的投资成本和操作费用高，处理成本是填埋法、土地利用的好几倍，并且技术要求高，容易产生二噁英等二次污染物。
在我国，目前城市污泥的主要处置方式是随意弃置与简单填埋，这不仅极大地浪费了污泥中大量的有机质和氮、磷等植物养分，而且已成为水土环境的新隐患，严重干扰了污水处理厂的正常运行。缺乏稳定、环境安全与经济有效的资源化技术是当前我国城市污泥所面临的实际现状。
蚊虫是人类最主要的卫生害虫之一，不仅吸血扰人，而且是多种严重疾病的传播媒介。在世界范围内，每年因蚊虫的传播致使24亿人(约占全球总人口的40％)遭受疟疾、丝虫病、登革热、黄热病、乙型脑炎的威胁，每年由于感染上述五种蚊媒疾病而发病死亡的人数超过200万。我国是蚊媒疾病流行国家之一，灭蚊控病任务十分紧迫，特别是近年来登革热等蚊媒疾病在沿海等城市发病明显上升。控制蚊虫被认为是消除蚊虫蚊媒疾病的有效途径。20世纪50年代在世界卫生组织(WHO)的倡导下，人们开始采用六六六、DDT等化学灭蚊剂来控制成蚊密度。但是，随着化学灭蚊剂长期大量使用所导致的蚊虫抗药性，以及环境污染和生态平衡破坏等问题的日益严重，迫切需要新的安全有效的蚊虫综合防治方法。微生物灭蚊策略越来越受重视。
目前，已相继发现球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，简称Bs)、苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)、厌氧双酶梭菌马来西亚亚种(Clostridium bifermentans subsp.malaysia)与大链壶菌(Lagenidium giganteum)等对蚊幼虫有特异性毒杀作用，它们对非靶生物包括人畜安全(可用于饮用积水)，同时也不破坏生态平衡和污染环境。在这些杀蚊微生物中，Bs与Bti两种芽孢杆菌的杀蚊幼效果最好，应用最为广泛。它们杀蚊的主要活性成分是代谢过程中产生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼虫吞食后在肠道碱性环境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻击蚊幼虫中肠刷状缘上皮细胞膜，杀伤这些细胞，最终导致幼虫死亡。
Bti与Bs微生物灭蚊剂的主要生产工艺是液体深层发酵，以黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等为主要原料，原料成本约占总生产成本的20-35％。目前，制约它们大规模应用的主要因素有两个一是生产原料昂贵，造成产品使用价格较高，抵消了其作为生物灭蚊剂的优越性；二是发酵水平低。这两种芽孢杆菌，尤其是Bs在发酵中往往不能同步成熟，发育同步性能差(普遍报道抗热芽孢的形成率只有48-72％)，导致产品的杀蚊活性不高。
近20年来，有研究者尝试采用廉价的农副产品或有机物含量丰富的有机废弃物作为原料发酵生产微生物灭蚊剂。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工业产生的有机废液(经水解预处理)作为主要培养基发酵生产Bti灭蚊剂，发酵罐试验表明，经过24-48h的通气搅拌培养，发酵液中Bti菌数达2.5×109个细菌/mL，对埃及伊蚊幼虫(Aedes aegypti)的LC50为0.063mg/L，显著高于常规的合成培养基。Obeta等(1983)利用猪血、豆科植物种籽和矿质盐制备的几种培养基，发现在这些培养基中Bs 1593菌株都能良好的生长与产孢产毒，从而制备Bs灭蚊剂。然而，这些原料具有季节性和分散性，往往不能及时供给，并且通常需要繁琐、昂贵的预处理(如水解、浸提与浓缩处理等)，因而并未得到大规模的实际应用。
城市污泥的产生具有日常性与集中性，并且含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养物质。W095/35365(1995)与CN 1772879A(2006)公开了以污泥作为发酵原料、以苏云金杆菌作为发酵菌种生产苏云金杆菌生物杀虫剂。但它们所生产的生物杀虫剂的防治对象是农作物害虫，没有涉及到卫生害虫蚊类。经文献与专利检索，在现有技术中还未发现利用城市污泥制备生物灭蚊剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种杀蚊效果好，对环境安全无害的微生物灭蚊剂。
本发明的另一个目的是提供上述微生物灭蚊剂的制备方法，在灭蚊剂制备过程中实现污泥的资源化处置。
为了实现上述目的，本发明采用液体深层发酵方法，包括如下步骤1)培养基调理调节城市污泥的含固率为2-5％，加入1-5g/L消泡剂，用酸或碱调pH为6.5-8.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的酸是指磷酸、硫酸或盐酸，其中最好是磷酸；所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是KOH。
2)摇瓶培养从保藏正常的Bti或Bs斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，三角瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用Bti与Bs菌株是WHO推荐或厂家普遍使用的高毒力菌株，具体来说，Bti是指苏云金芽孢杆菌H14血清型，主要是187与1897菌株；Bs包括2362、1593、2297等3种，上述菌株可在国内微生物保藏机构通过直接购得。
3)种子罐发酵将Bti或Bs摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养。条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时。
4)发酵罐发酵按2-8％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的适宜发酵时间为30-36小时，Bti菌株的适宜发酵时间为36-42小时。
5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品；所述的无机酸是指硫酸、盐酸或硝酸，其中最好是盐酸所述的防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸钾。
6)产品质量检验产品中抗热性芽孢的测定方法采用无菌操作，将液体产品进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min，然后进行涂布培养计数，每平板菌落数30-300个有效。产品生物毒力效价测定方法按照WHO标准程序进行，试虫为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedesalbopictus)二龄末至三龄初的健康幼虫。合格产品中抗热芽孢数≥109个/毫升，生物测定毒力效价≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培养基液体中加入目标物的克数；％是指每百份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数；V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数。
本发明的技术原理是以城市污泥所含的碳水化合物与蛋白质、磷以及微量元素为主要营养物质，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，Bti或Bs菌株得以生长与增殖，形成抗热性芽孢与毒素蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩制成微生物灭蚊剂产品。所制备的灭蚊制剂为液体剂型，可有效杀灭库蚊与伊蚊的幼虫，并且对环境安全无害。所述液体剂型中抗热性芽孢含量不低于109个/毫升，对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedes albopictus)2-3龄幼虫的生物毒效不低于100ITU/mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)为城市污泥提供了一条崭新资源化处置途径，同时降低了微生物灭蚊剂的生产成本。
(2)与现有污泥处置技术相比，本方法不仅处置了污泥，而且可获得附加值较高的灭蚊剂产品，从而降低了污泥处理处置成本。
(3)现有微生物灭蚊剂的生产原料主要是黄豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中Bti或Bs菌株主要依靠城市污泥中自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，大大降低了微生物灭蚊剂的生产成本，从而促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
(4)现有微生物灭蚊剂发酵生产中一个技术瓶颈是抗热芽孢形成率低(48-72％)。也就是说细菌发育同步性能差，从而导致产品的杀蚊活性不高。以城市污泥替代黄豆饼粉等常规原料，可以提高Bti与Bs的发育同步性，倒罐时(30-42小时)抗热芽孢形成率可达到85％以上。
图1为本发明的制备流程图。
具体实施例方式
实施例1 生产Bti生物灭蚊剂(1)城市污泥样品取广东省广州市某污水处理厂的浓缩污泥，该污泥的基本性质见表1。
表1.供试污泥基本性质
(2)污泥调理用自来水调节污泥含固率为4.0％，加入2.0g/L的消泡剂泡敌。用磷酸调pH至6.80，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.19。
(其它消泡剂，如聚丙二醇、豆油、花生油等，分别代替泡敌，其效果相同。)(3)摇瓶培养从Bti 187菌株斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速200转/分，500mL三角瓶装液200mL培养基，培养时间10小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种2.0％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间8小时。
(5)发酵罐发酵接种2.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间40小时。放罐时发酵液中Bti 187菌株的活菌数为4.6×108个/mL，抗热性芽孢数4.1×108个/mL，芽孢形成率91％，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表2)。
表2.Bti 187菌株在污泥培养40小时的发酵参数及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.0，经高速离心浓缩5倍，加入0.3g/L的防腐剂山梨酸钾，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，代替山梨酸钾，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bti生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为1.89×109个/毫升，生物测定表明产品对白纹伊蚊2-3龄幼虫的毒力效价为120ITU/mg。
制备流程图见图1。
实施例2 生产Bti生物灭蚊剂(1)城市污泥样品城市污泥样品性质与表1相同。
(2)污泥调理用自来水调节污泥含固率为3.0％，加入1.5g/L的消泡剂聚丙二醇。用磷酸调pH至6.92，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.55。
(3)摇瓶培养菌株由Bti 187菌株换成Bti 1897菌株，其余同实施例1。
(4)种子罐发酵接种1.0％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温28℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度240转份、发酵时间12小时。
(5)发酵罐发酵接种5.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温28℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间36小时。放罐时发酵液中活菌数为5.5×108个/mL，抗热性芽孢数4.9×108个/mL，芽孢形成率89％。
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀盐酸将发酵液pH调为4.5，经高速离心浓缩5倍，加入0.2g/L的防腐剂苯甲酸钠，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸钠，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bti生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.24×109个/毫升，生物测定表明产品对白纹伊蚊2-3龄幼虫的毒力效价为102ITU/mg。
实施例3 生产Bs生物灭蚊剂(1)城市污泥样品取广东省深圳市某污水处理厂的浓缩污泥，该污泥的基本性质见表3。
表3.供试污泥基本性质
(2)污泥调理用自来水调节城市污泥含固率为2.0％，加入5g/L的花生油。用KOH调pH至7.0，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.61。
(3)摇瓶培养从Bs 2362菌株斜面培养基上挑取-环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速200转/分，500ml三角瓶装液150mL培养基，培养时间8小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种1.5％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度250转/分、发酵时间8小时。
(5)发酵罐发酵接种3.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间32小时。放罐时发酵液中Bs 2362菌株的活菌数为5.1×108个/mL，抗热性芽孢数5.0×108个/mL，芽孢形成率98％，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表4)。
表4.Bs 2362菌株在污泥培养40小时的发酵参数及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.3，经高速离心浓缩4倍，加入0.4g/L的防腐剂二甲苯，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯，代替二甲苯，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为1.67×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为180ITU/mg。
权利要求
1.一种利用城市污泥制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤(1)污泥调理将城市污泥的含固率调至2-5％，加入1-5g/L消泡剂，用酸或碱调pH为6.5-8.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却至30-35℃备用；(2)摇瓶培养将Bti或Bs接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时；(3)种子罐发酵将Bti或Bs摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气体积量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时；(4)发酵罐发酵按2-8％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气体积量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的发酵时间为30-36小时，Bti菌株的发酵时间为36-42小时；(5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消泡剂为泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酸是指磷酸、硫酸或盐酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱是指KOH、NaOH或Ca(OH)2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述灭菌是指在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的无机酸是指硫酸、盐酸或硝酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的防腐剂是山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯。
8.利用权利要求1～7任一项所述方法得到的微生物灭蚊剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。本发明的制备方法包括污泥调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验。本发明为污泥提供一条新型高附加值的资源化处置途径，具有处置污泥与生产微生物灭蚊剂的双重功效。同时本发明可以降低微生物灭蚊剂的生产成本，有利于促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
文档编号A01P7/04GK1919002SQ200610037548
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者周顺桂, 雷发懋, 王跃强 申请人:广东省生态环境与土壤研究所
技术领域：
本发明涉及一种灭蚊剂，具体地说，涉及一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。
背景技术：
城市污泥是污水处理过程中必然产生的沉淀物。目前，我国城市污泥年产生量约700万吨干重，根据我国城市污水处理目标，预计到2010年污泥产生量将超过800万吨干重。如何妥善处置这些数量日益庞大、高度集中的有机固体废弃物，是城市污水处理厂最头痛的问题之一。
在国际上，现行污泥的处置方式主要有填埋、土地利用、焚烧等，但它们都存在各自难以克服的缺陷，并且也不能满足当前的实际需要。例如，污泥填埋占地面积大，合适的填埋场地正急剧减少，并且污泥中有害成分的渗漏会对地下水造成污染；污泥土地利用存在因污泥大量施用造成的重金属、有机污染物与病原体等物质污染食物链与威胁人类健康的问题；而污泥焚烧的投资成本和操作费用高，处理成本是填埋法、土地利用的好几倍，并且技术要求高，容易产生二噁英等二次污染物。
在我国，目前城市污泥的主要处置方式是随意弃置与简单填埋，这不仅极大地浪费了污泥中大量的有机质和氮、磷等植物养分，而且已成为水土环境的新隐患，严重干扰了污水处理厂的正常运行。缺乏稳定、环境安全与经济有效的资源化技术是当前我国城市污泥所面临的实际现状。
蚊虫是人类最主要的卫生害虫之一，不仅吸血扰人，而且是多种严重疾病的传播媒介。在世界范围内，每年因蚊虫的传播致使24亿人(约占全球总人口的40％)遭受疟疾、丝虫病、登革热、黄热病、乙型脑炎的威胁，每年由于感染上述五种蚊媒疾病而发病死亡的人数超过200万。我国是蚊媒疾病流行国家之一，灭蚊控病任务十分紧迫，特别是近年来登革热等蚊媒疾病在沿海等城市发病明显上升。控制蚊虫被认为是消除蚊虫蚊媒疾病的有效途径。20世纪50年代在世界卫生组织(WHO)的倡导下，人们开始采用六六六、DDT等化学灭蚊剂来控制成蚊密度。但是，随着化学灭蚊剂长期大量使用所导致的蚊虫抗药性，以及环境污染和生态平衡破坏等问题的日益严重，迫切需要新的安全有效的蚊虫综合防治方法。微生物灭蚊策略越来越受重视。
目前，已相继发现球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，简称Bs)、苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)、厌氧双酶梭菌马来西亚亚种(Clostridium bifermentans subsp.malaysia)与大链壶菌(Lagenidium giganteum)等对蚊幼虫有特异性毒杀作用，它们对非靶生物包括人畜安全(可用于饮用积水)，同时也不破坏生态平衡和污染环境。在这些杀蚊微生物中，Bs与Bti两种芽孢杆菌的杀蚊幼效果最好，应用最为广泛。它们杀蚊的主要活性成分是代谢过程中产生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼虫吞食后在肠道碱性环境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻击蚊幼虫中肠刷状缘上皮细胞膜，杀伤这些细胞，最终导致幼虫死亡。
Bti与Bs微生物灭蚊剂的主要生产工艺是液体深层发酵，以黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等为主要原料，原料成本约占总生产成本的20-35％。目前，制约它们大规模应用的主要因素有两个一是生产原料昂贵，造成产品使用价格较高，抵消了其作为生物灭蚊剂的优越性；二是发酵水平低。这两种芽孢杆菌，尤其是Bs在发酵中往往不能同步成熟，发育同步性能差(普遍报道抗热芽孢的形成率只有48-72％)，导致产品的杀蚊活性不高。
近20年来，有研究者尝试采用廉价的农副产品或有机物含量丰富的有机废弃物作为原料发酵生产微生物灭蚊剂。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工业产生的有机废液(经水解预处理)作为主要培养基发酵生产Bti灭蚊剂，发酵罐试验表明，经过24-48h的通气搅拌培养，发酵液中Bti菌数达2.5×109个细菌/mL，对埃及伊蚊幼虫(Aedes aegypti)的LC50为0.063mg/L，显著高于常规的合成培养基。Obeta等(1983)利用猪血、豆科植物种籽和矿质盐制备的几种培养基，发现在这些培养基中Bs 1593菌株都能良好的生长与产孢产毒，从而制备Bs灭蚊剂。然而，这些原料具有季节性和分散性，往往不能及时供给，并且通常需要繁琐、昂贵的预处理(如水解、浸提与浓缩处理等)，因而并未得到大规模的实际应用。
城市污泥的产生具有日常性与集中性，并且含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养物质。W095/35365(1995)与CN 1772879A(2006)公开了以污泥作为发酵原料、以苏云金杆菌作为发酵菌种生产苏云金杆菌生物杀虫剂。但它们所生产的生物杀虫剂的防治对象是农作物害虫，没有涉及到卫生害虫蚊类。经文献与专利检索，在现有技术中还未发现利用城市污泥制备生物灭蚊剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种杀蚊效果好，对环境安全无害的微生物灭蚊剂。
本发明的另一个目的是提供上述微生物灭蚊剂的制备方法，在灭蚊剂制备过程中实现污泥的资源化处置。
为了实现上述目的，本发明采用液体深层发酵方法，包括如下步骤1)培养基调理调节城市污泥的含固率为2-5％，加入1-5g/L消泡剂，用酸或碱调pH为6.5-8.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的酸是指磷酸、硫酸或盐酸，其中最好是磷酸；所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是KOH。
2)摇瓶培养从保藏正常的Bti或Bs斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，三角瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用Bti与Bs菌株是WHO推荐或厂家普遍使用的高毒力菌株，具体来说，Bti是指苏云金芽孢杆菌H14血清型，主要是187与1897菌株；Bs包括2362、1593、2297等3种，上述菌株可在国内微生物保藏机构通过直接购得。
3)种子罐发酵将Bti或Bs摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养。条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时。
4)发酵罐发酵按2-8％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的适宜发酵时间为30-36小时，Bti菌株的适宜发酵时间为36-42小时。
5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品；所述的无机酸是指硫酸、盐酸或硝酸，其中最好是盐酸所述的防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸钾。
6)产品质量检验产品中抗热性芽孢的测定方法采用无菌操作，将液体产品进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min，然后进行涂布培养计数，每平板菌落数30-300个有效。产品生物毒力效价测定方法按照WHO标准程序进行，试虫为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedesalbopictus)二龄末至三龄初的健康幼虫。合格产品中抗热芽孢数≥109个/毫升，生物测定毒力效价≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培养基液体中加入目标物的克数；％是指每百份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数；V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数。
本发明的技术原理是以城市污泥所含的碳水化合物与蛋白质、磷以及微量元素为主要营养物质，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，Bti或Bs菌株得以生长与增殖，形成抗热性芽孢与毒素蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩制成微生物灭蚊剂产品。所制备的灭蚊制剂为液体剂型，可有效杀灭库蚊与伊蚊的幼虫，并且对环境安全无害。所述液体剂型中抗热性芽孢含量不低于109个/毫升，对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedes albopictus)2-3龄幼虫的生物毒效不低于100ITU/mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)为城市污泥提供了一条崭新资源化处置途径，同时降低了微生物灭蚊剂的生产成本。
(2)与现有污泥处置技术相比，本方法不仅处置了污泥，而且可获得附加值较高的灭蚊剂产品，从而降低了污泥处理处置成本。
(3)现有微生物灭蚊剂的生产原料主要是黄豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中Bti或Bs菌株主要依靠城市污泥中自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，大大降低了微生物灭蚊剂的生产成本，从而促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
(4)现有微生物灭蚊剂发酵生产中一个技术瓶颈是抗热芽孢形成率低(48-72％)。也就是说细菌发育同步性能差，从而导致产品的杀蚊活性不高。以城市污泥替代黄豆饼粉等常规原料，可以提高Bti与Bs的发育同步性，倒罐时(30-42小时)抗热芽孢形成率可达到85％以上。
图1为本发明的制备流程图。
具体实施例方式
实施例1 生产Bti生物灭蚊剂(1)城市污泥样品取广东省广州市某污水处理厂的浓缩污泥，该污泥的基本性质见表1。
表1.供试污泥基本性质
(2)污泥调理用自来水调节污泥含固率为4.0％，加入2.0g/L的消泡剂泡敌。用磷酸调pH至6.80，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.19。
(其它消泡剂，如聚丙二醇、豆油、花生油等，分别代替泡敌，其效果相同。)(3)摇瓶培养从Bti 187菌株斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速200转/分，500mL三角瓶装液200mL培养基，培养时间10小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种2.0％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间8小时。
(5)发酵罐发酵接种2.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间40小时。放罐时发酵液中Bti 187菌株的活菌数为4.6×108个/mL，抗热性芽孢数4.1×108个/mL，芽孢形成率91％，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表2)。
表2.Bti 187菌株在污泥培养40小时的发酵参数及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.0，经高速离心浓缩5倍，加入0.3g/L的防腐剂山梨酸钾，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，代替山梨酸钾，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bti生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为1.89×109个/毫升，生物测定表明产品对白纹伊蚊2-3龄幼虫的毒力效价为120ITU/mg。
制备流程图见图1。
实施例2 生产Bti生物灭蚊剂(1)城市污泥样品城市污泥样品性质与表1相同。
(2)污泥调理用自来水调节污泥含固率为3.0％，加入1.5g/L的消泡剂聚丙二醇。用磷酸调pH至6.92，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.55。
(3)摇瓶培养菌株由Bti 187菌株换成Bti 1897菌株，其余同实施例1。
(4)种子罐发酵接种1.0％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温28℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度240转份、发酵时间12小时。
(5)发酵罐发酵接种5.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温28℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间36小时。放罐时发酵液中活菌数为5.5×108个/mL，抗热性芽孢数4.9×108个/mL，芽孢形成率89％。
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀盐酸将发酵液pH调为4.5，经高速离心浓缩5倍，加入0.2g/L的防腐剂苯甲酸钠，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸钠，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bti生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.24×109个/毫升，生物测定表明产品对白纹伊蚊2-3龄幼虫的毒力效价为102ITU/mg。
实施例3 生产Bs生物灭蚊剂(1)城市污泥样品取广东省深圳市某污水处理厂的浓缩污泥，该污泥的基本性质见表3。
表3.供试污泥基本性质
(2)污泥调理用自来水调节城市污泥含固率为2.0％，加入5g/L的花生油。用KOH调pH至7.0，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.61。
(3)摇瓶培养从Bs 2362菌株斜面培养基上挑取-环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速200转/分，500ml三角瓶装液150mL培养基，培养时间8小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种1.5％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度250转/分、发酵时间8小时。
(5)发酵罐发酵接种3.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间32小时。放罐时发酵液中Bs 2362菌株的活菌数为5.1×108个/mL，抗热性芽孢数5.0×108个/mL，芽孢形成率98％，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表4)。
表4.Bs 2362菌株在污泥培养40小时的发酵参数及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.3，经高速离心浓缩4倍，加入0.4g/L的防腐剂二甲苯，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯，代替二甲苯，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为1.67×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为180ITU/mg。
权利要求
1.一种利用城市污泥制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤(1)污泥调理将城市污泥的含固率调至2-5％，加入1-5g/L消泡剂，用酸或碱调pH为6.5-8.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却至30-35℃备用；(2)摇瓶培养将Bti或Bs接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时；(3)种子罐发酵将Bti或Bs摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气体积量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时；(4)发酵罐发酵按2-8％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气体积量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的发酵时间为30-36小时，Bti菌株的发酵时间为36-42小时；(5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消泡剂为泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酸是指磷酸、硫酸或盐酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱是指KOH、NaOH或Ca(OH)2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述灭菌是指在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的无机酸是指硫酸、盐酸或硝酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的防腐剂是山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯。
8.利用权利要求1～7任一项所述方法得到的微生物灭蚊剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用城市污泥制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。本发明的制备方法包括污泥调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验。本发明为污泥提供一条新型高附加值的资源化处置途径，具有处置污泥与生产微生物灭蚊剂的双重功效。同时本发明可以降低微生物灭蚊剂的生产成本，有利于促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
文档编号A01P7/04GK1919002SQ200610037548
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者周顺桂, 雷发懋, 王跃强 申请人:广东省生态环境与土壤研究所
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