一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法
专利名称：一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灭蚊剂，具体地说，涉及一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。
背景技术：
淀粉废水是一种在淀粉加工过程中产生的高浓度有机废水，这些废水中含有大量的残余淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖等碳水化合物、蛋白质与有机酸等，易腐败发臭，COD通常在2000-20000mg/L之间，是食品工业中污染最严重的废水之一。
淀粉加工的主要原料是玉米(约占80％)、薯类、小麦以及其它富含淀粉的植物块根，废水主要来源于浸泡与淀粉分离工段。我国现有淀粉生产企业近600多家，废水年排放量超过1亿吨。淀粉废水中所含的有机物大多是可以回收利用的宝贵资源。例如，玉米淀粉废水一般含有0.3-0.7％的总糖，约2.1％粗蛋白与0.1-0.3％的脂肪酸；目前，国内外常用的淀粉废水处理方法有生物处理法(包括活性污泥法、生物膜法、生物稳定塘与厌氧生物法等)、蛋白分离法(包括重力沉降法、化学絮凝法、气浮法与膜分离法等)以及微生物转化法。其中微生物转化法最受青睐，它是利用废水含有的丰富营养物质可支持菌体生长的特点，将之转化成附加值较高的产品。微生物转化法处理淀粉废水生产单细胞蛋白的技术早在上世纪70年代就被广泛应用，采用的菌种主要有白地霉、假丝酵母、光合细菌等，产品形式较为单一，主要为单细胞蛋白(SCP)饲料。这类SCP饲料存在一些缺陷如核酸含量高(食用过多可能会引起痛风等疾病)、无肉质、风味不佳而限制了其应用范围。因此，有必要寻找新型微生物转化技术，开发新型高附加值产品。
球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，简称Bs)与苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)是当前应用最广泛、杀灭蚊幼虫最有效的微生物灭蚊剂。它们对非靶生物与人畜无毒(可用于饮用积水)，同时也不破坏生态平衡和污染环境，已被世界卫生组织(WHO)推荐作为防蚊控病的重要手段之一。Bti与Bs主要杀蚊活性成分是代谢过程中产生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼虫吞食后在肠道碱性环境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻击蚊幼虫中肠刷状缘上皮细胞膜，杀伤这些细胞，最终导致蚊幼死亡。
Bs与Bti微生物灭蚊剂的主要生产工艺是液体深层发酵，以黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等为主要原料，原料成本约占总生产成本的20-35％。目前，制约Bti与Bs两种微生物灭蚊剂大规模应用的主要因素有二一是生产原料昂贵。造成产品价格较高，抵消了其作为生物灭蚊剂的优越性；二是发酵水平低。这两种芽孢杆菌，尤其是Bs在发酵中往往不能同步成熟，发育同步性能差(普遍报道抗热性芽孢的形成率只有48-72％)，导致产品的杀蚊活性不高。
近年来，有研究者尝试采用廉价的农副产品或有机物含量丰富的有机废弃物作为原料发酵生产微生物灭蚊剂。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工业产生的有机废液(经水解预处理)作为主要培养基发酵生产Bti灭蚊剂，发酵罐试验表明，经过24-48h的通气搅拌培养，发酵液中Bti菌数达2.5×109个细菌/mL，对埃及伊蚊幼虫(Aedes aegypti)的LC50为0.063ppm，显著高于常规的合成培养基。Obeta等(1983)利用猪血、豆科植物种籽和矿质盐制备的几种培养基，发现在这些培养基中Bs 1593菌株都能良好的生长与产孢产毒，从而制备Bs灭蚊剂。然而，这些原料比较分散，并且通常需要繁琐、昂贵的预处理(如水解、浸提与浓缩处理等)，因而并未得到大规模的实际应用。
淀粉废水含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养物质。2006年，发明专利(CN1799363A)公开了一种淀粉废水生产苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，该专利以苏云金杆菌为发酵菌种，所生产的苏云金杆菌微生物杀虫剂的防治对象是鳞翅目农业害虫。蚊类属于双翅目卫生害虫，它不仅吸血扰人，而且传播多种严重疾病。经文献与专利检索，尚未发现淀粉废水制备微生物灭蚊剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种灭蚊效果好，对环境安全无害的微生物灭蚊剂。
本发明的另一个目的是提供上述微生物灭蚊剂的制备方法。在灭蚊剂制备过程中同时处理淀粉废水。
为了实现上述目的，本发明采用液体深层发酵方法，包括如下步骤1)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氢二钾、0.2-1.0g/L硫酸镁和1.0-5.0g/L消泡剂，用碱调pH为7.5-10.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是NaOH。
2)摇瓶培养从保藏正常的Bs或Bti斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，三角瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用Bs与Bti菌株是WHO推荐或厂家普遍使用的高毒力菌株。具体来说，Bs包括2362、1593、2297、Bs-10等4种，Bti是指苏云金芽孢杆菌H14血清型，主要是187与1897菌株，上述菌株可在国内微生物保藏机构直接购得。
3)种子罐发酵将Bs或Bti摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1.0-3.0％，进行发酵培养。条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时。
4)发酵罐发酵按1-10％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的适宜发酵时间为30-36小时，Bti菌株的适宜发酵时间为36-42小时。
5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为2-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。所述的无机酸是指硫酸、盐酸与硝酸，其中最好是盐酸；所述的防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸钾。
6)产品质量检验产品中抗热性芽孢的测定方法采用无菌操作，将液体产品进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min，然后进行涂布培养计数，每平板菌落数30-300个有效。产品生物毒力效价测定方法按照WHO标准程序进行，试虫为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedesalbopictus)二龄末至三龄初的健康幼虫。合格产品中抗热芽孢数≥109个/毫升，生物测定毒力效价≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培养基液体中加入的同标物的克数；％是指每100份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数；V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数。
本发明的技术原理是以淀粉废水所含的糖分与蛋白质、磷以及微量元素为主要营养物质，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，Bs或Bti菌株得以生长与增殖，形成芽孢与毒素蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩、防腐制成微生物灭蚊剂产品。
本发明所制备的灭蚊剂产品为液体剂型，可有效杀灭双翅目库蚊与伊蚊的幼虫，并且对环境安全无害。所述液体剂型中抗热性芽孢含量不低于109个/毫升，对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedes albopictus)2-3龄幼虫的生物毒效不低于100ITU/mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)为淀粉废水提供了一条崭新的资源化处置途径，同时降低了微生物灭蚊剂的生产成本。
(2)与现有技术中的淀粉废水生物处理法相比，本发明不仅处理了淀粉废水，而且可获得灭蚊剂产品，从而降低了废水处理成本。
(3)与现有技术中的蛋白分离法从淀粉废水中提取饲料蛋白相比，本方法获得的产品附加值较高。
(4)与现有技术中的微生物转化法生产单细胞蛋白饲料相比，本方法突破了现有技术中以蛋白饲料为最终发酵产品的局限性，扩大了淀粉废水的资源化利用途径。
(5)现有微生物灭蚊剂的生产原料主要是黄豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中Bs或Bti菌株主要依靠淀粉废水自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，大大降低了微生物灭蚊剂的生产成本，从而促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
(6)现有微生物灭蚊剂发酵生产中一个技术瓶颈是抗热性芽孢形成率低(48-72％)，也就是说细菌发育同步性能差，从而导致产品的杀蚊活性不高。以淀粉废水替代黄豆饼粉等常规原料，可以提高Bs与Bti的发育同步性，倒罐时(30-42小时)抗热芽孢形成率可达到85％以上。
图1为Bs 2362菌株在淀粉废水中培养36小时的电镜照片；图2为Bti 187菌株在淀粉废水中培养42小时的电镜照片。
具体实施例方式
实施例1生产Bs灭蚊剂(1)淀粉废水样品取北京市某淀粉厂的淀粉废水，该厂采用玉米为原料生产淀粉，加工工艺流程为玉米→过筛→浸泡→粉碎→胚芽分离→磨细→筛分→沉淀分离→淀粉洗涤→脱水→干燥→淀粉。废水主要来源为浸泡水与黄浆水。经分析，该淀粉废水中碳水化合物含量为6.8g/L、粗蛋白含量为19.0g/L、含固率8.61％，pH＝4.80。
(2)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为5.0％，加入0.75g/L的磷酸氢二钾、0.30g/L的硫酸镁和2.5g/L的泡敌。用NaOH调pH至9.5，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.3。
(其它消泡剂，如聚丙二醇、豆油、花生油等，分别代替泡敌，其效果相同。)(3)摇瓶培养从Bs 1593菌株斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速200转/分，500mL三角瓶装液250mL培养基，培养时间8小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种3.0％的Bs 1593摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温32℃、罐压0.06MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度260转/分、发酵时间8小时。
(5)发酵罐发酵接种8％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温32℃、罐压0.06MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间30小时。放罐时发酵液中Bs1593菌株的活菌数为6.7×108个/mL，抗热性芽孢数6.0×108个/mL，芽孢形成率89.6％，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表2)。
表2.Bs 1593菌株在淀粉废水培养30小时的发酵性状及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.0，经高速离心浓缩5倍，加入0.3g/L的防腐剂山梨酸钾，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，代替山梨酸钾，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.25×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为120ITU/mg实施例2生产Bs灭蚊剂(1)淀粉废水样品淀粉废水样品同实施例1。
(2)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为3.0％，加入0.50g/L的磷酸氢二钾、0.20g/L的硫酸镁和5.0g/L的花生油。用Ca(OH)2调pH至9.0，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.5。
(其它消泡剂，如泡敌、豆油、聚丙二醇等，分别代替花生油，其效果相同。)
(3)摇瓶培养发酵菌种由Bs 1593换成Bs 2362菌株，其余同实施例1。
(4)种子罐发酵接种1.0％的Bs 2362摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间10小时。
(5)发酵罐发酵接种2.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间36小时。图1是放罐时发酵液中Bs 2362菌株的芽孢形态(毒素蛋白包裹在芽孢之中)，可以看出基本没有营养体存在，发酵同步性好。此时发酵液中Bs 2362菌株的活菌数为6.6×108个/mL，抗热性芽孢数6.4×108个/mL，芽孢形成率97.0％。
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.0，经高速离心浓缩4倍，加入0.2g/L的防腐剂苯甲酸钠，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸钠，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.19×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为195ITU/mg。
实施例3生产Bti灭蚊剂(1)淀粉废水样品取河北省石家庄市某淀粉厂的淀粉废水，该厂采用红薯为原料生产淀粉，加工工艺流程为红薯→洗涤→磨碎→过筛→浆液→离心分离→淀粉洗涤→脱水→干燥→淀粉。废水主要来源为洗涤水与分离废水(薯浆废水及蛋白质水)。经分析废水中碳水化合物含量为13.2g/L、粗蛋白含量为6.1g/L、含固率7.10％、pH＝4.45。
(2)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为2.5％，加入矿质盐0.4g/L的磷酸氢二钾、0.35g/L的硫酸镁、2.0g/L的消泡剂聚丙二醇。用Ca(OH)2调pH至9.7，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.5。
(3)摇瓶培养从Bti 1897菌株斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速250转/分，500mL三角瓶装液150mL培养基，培养时间12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种2.0％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.04MPa、通气量1∶1.4(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间12小时。
(5)发酵罐发酵接种2.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.04MPa、通气量1∶1.4(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间38小时。放罐时发酵液中活菌数为5.5×108个/mL，抗热性芽孢数4.9×108个/mL，芽孢形成率89％。，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表3)。
表3.Bti 1897菌株在淀粉废水培养38小时的发酵参数及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀盐酸将发酵液pH调为4.5，经高速离心浓缩5倍，加入0.2g/L的防腐剂苯甲酸钠，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸钠，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bti生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.24×109个/毫升，生物测定表明产品对白纹伊蚊2-3龄幼虫的毒力效价为108ITU/mg。
实施例4生产Bti灭蚊剂(1)淀粉废水样品淀粉废水样品同实施例3。
(2)废水培养基调理同实施例3。
(3)摇瓶培养菌株由Bti 1897菌株换成Bti 187菌株，其余同实施例3。
(4)种子罐发酵接种1.0％的Bti 187摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度250转/分、发酵时间12小时。
(5)发酵罐发酵接种1.5％的Bti 187种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间42小时。图2是放罐时发酵液中Bti 187菌株的芽孢与毒素蛋白的形态，图中显示只有极少数营养体存在，发酵同步性较好。42小时放罐时发酵液中Bti187菌株的活菌数为7.5×108个/mL，抗热性芽孢数6.7×108个/mL，芽孢形成率89.3％。
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.2，经高速离心浓缩4倍，加入0.4g/L的防腐剂二甲苯，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯，代替二甲苯，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.19×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为205ITU/mg。
权利要求
1.一种利用淀粉废水制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤(1)废水培养基调理调节淀粉废水的含固率为2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氢二钾、0.2-1.0g/L硫酸镁和1.0-5.0g/L消泡剂，用碱调pH为7.5-10.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却至30-35℃备用；(2)摇瓶培养将Bs或Bti接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时；(3)种子罐发酵将Bs或Bti摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时；(4)发酵罐发酵按1-10％的接种量将Bs或Bti种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的1.0-1.5、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的发酵时间为30-36小时，Bti菌株的发酵时间为36-42小时；(5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为2-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消泡剂为泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱是指KOH、NaOH或Ca(OH)2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的灭菌是指在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述的无机酸是硫酸、盐酸或硝酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述防腐剂是山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯。
8.利用权利要求1～7任一项所述方法得到的微生物灭蚊剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。本发明的制备方法包括废水培养基调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验。本发明是一条减轻淀粉废水对环境污染、变废为宝的有效途径，同时可大大降低微生物灭蚊剂的生产成本。本发明所制备的灭蚊剂产品对环境安全无害，对淡色库蚊或白纹伊蚊2－3龄幼虫的生物毒效不低于100ITU/mg。
文档编号A01P7/04GK1915030SQ20061003755
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者周顺桂, 雷发懋, 王跃强 申请人:广东省生态环境与土壤研究所
技术领域：
本发明涉及一种灭蚊剂，具体地说，涉及一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。
背景技术：
淀粉废水是一种在淀粉加工过程中产生的高浓度有机废水，这些废水中含有大量的残余淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖等碳水化合物、蛋白质与有机酸等，易腐败发臭，COD通常在2000-20000mg/L之间，是食品工业中污染最严重的废水之一。
淀粉加工的主要原料是玉米(约占80％)、薯类、小麦以及其它富含淀粉的植物块根，废水主要来源于浸泡与淀粉分离工段。我国现有淀粉生产企业近600多家，废水年排放量超过1亿吨。淀粉废水中所含的有机物大多是可以回收利用的宝贵资源。例如，玉米淀粉废水一般含有0.3-0.7％的总糖，约2.1％粗蛋白与0.1-0.3％的脂肪酸；目前，国内外常用的淀粉废水处理方法有生物处理法(包括活性污泥法、生物膜法、生物稳定塘与厌氧生物法等)、蛋白分离法(包括重力沉降法、化学絮凝法、气浮法与膜分离法等)以及微生物转化法。其中微生物转化法最受青睐，它是利用废水含有的丰富营养物质可支持菌体生长的特点，将之转化成附加值较高的产品。微生物转化法处理淀粉废水生产单细胞蛋白的技术早在上世纪70年代就被广泛应用，采用的菌种主要有白地霉、假丝酵母、光合细菌等，产品形式较为单一，主要为单细胞蛋白(SCP)饲料。这类SCP饲料存在一些缺陷如核酸含量高(食用过多可能会引起痛风等疾病)、无肉质、风味不佳而限制了其应用范围。因此，有必要寻找新型微生物转化技术，开发新型高附加值产品。
球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，简称Bs)与苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)是当前应用最广泛、杀灭蚊幼虫最有效的微生物灭蚊剂。它们对非靶生物与人畜无毒(可用于饮用积水)，同时也不破坏生态平衡和污染环境，已被世界卫生组织(WHO)推荐作为防蚊控病的重要手段之一。Bti与Bs主要杀蚊活性成分是代谢过程中产生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼虫吞食后在肠道碱性环境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻击蚊幼虫中肠刷状缘上皮细胞膜，杀伤这些细胞，最终导致蚊幼死亡。
Bs与Bti微生物灭蚊剂的主要生产工艺是液体深层发酵，以黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等为主要原料，原料成本约占总生产成本的20-35％。目前，制约Bti与Bs两种微生物灭蚊剂大规模应用的主要因素有二一是生产原料昂贵。造成产品价格较高，抵消了其作为生物灭蚊剂的优越性；二是发酵水平低。这两种芽孢杆菌，尤其是Bs在发酵中往往不能同步成熟，发育同步性能差(普遍报道抗热性芽孢的形成率只有48-72％)，导致产品的杀蚊活性不高。
近年来，有研究者尝试采用廉价的农副产品或有机物含量丰富的有机废弃物作为原料发酵生产微生物灭蚊剂。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工业产生的有机废液(经水解预处理)作为主要培养基发酵生产Bti灭蚊剂，发酵罐试验表明，经过24-48h的通气搅拌培养，发酵液中Bti菌数达2.5×109个细菌/mL，对埃及伊蚊幼虫(Aedes aegypti)的LC50为0.063ppm，显著高于常规的合成培养基。Obeta等(1983)利用猪血、豆科植物种籽和矿质盐制备的几种培养基，发现在这些培养基中Bs 1593菌株都能良好的生长与产孢产毒，从而制备Bs灭蚊剂。然而，这些原料比较分散，并且通常需要繁琐、昂贵的预处理(如水解、浸提与浓缩处理等)，因而并未得到大规模的实际应用。
淀粉废水含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养物质。2006年，发明专利(CN1799363A)公开了一种淀粉废水生产苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，该专利以苏云金杆菌为发酵菌种，所生产的苏云金杆菌微生物杀虫剂的防治对象是鳞翅目农业害虫。蚊类属于双翅目卫生害虫，它不仅吸血扰人，而且传播多种严重疾病。经文献与专利检索，尚未发现淀粉废水制备微生物灭蚊剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种灭蚊效果好，对环境安全无害的微生物灭蚊剂。
本发明的另一个目的是提供上述微生物灭蚊剂的制备方法。在灭蚊剂制备过程中同时处理淀粉废水。
为了实现上述目的，本发明采用液体深层发酵方法，包括如下步骤1)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氢二钾、0.2-1.0g/L硫酸镁和1.0-5.0g/L消泡剂，用碱调pH为7.5-10.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是NaOH。
2)摇瓶培养从保藏正常的Bs或Bti斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，三角瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用Bs与Bti菌株是WHO推荐或厂家普遍使用的高毒力菌株。具体来说，Bs包括2362、1593、2297、Bs-10等4种，Bti是指苏云金芽孢杆菌H14血清型，主要是187与1897菌株，上述菌株可在国内微生物保藏机构直接购得。
3)种子罐发酵将Bs或Bti摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1.0-3.0％，进行发酵培养。条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时。
4)发酵罐发酵按1-10％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的适宜发酵时间为30-36小时，Bti菌株的适宜发酵时间为36-42小时。
5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为2-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。所述的无机酸是指硫酸、盐酸与硝酸，其中最好是盐酸；所述的防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸钾。
6)产品质量检验产品中抗热性芽孢的测定方法采用无菌操作，将液体产品进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min，然后进行涂布培养计数，每平板菌落数30-300个有效。产品生物毒力效价测定方法按照WHO标准程序进行，试虫为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedesalbopictus)二龄末至三龄初的健康幼虫。合格产品中抗热芽孢数≥109个/毫升，生物测定毒力效价≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培养基液体中加入的同标物的克数；％是指每100份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数；V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数。
本发明的技术原理是以淀粉废水所含的糖分与蛋白质、磷以及微量元素为主要营养物质，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，Bs或Bti菌株得以生长与增殖，形成芽孢与毒素蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩、防腐制成微生物灭蚊剂产品。
本发明所制备的灭蚊剂产品为液体剂型，可有效杀灭双翅目库蚊与伊蚊的幼虫，并且对环境安全无害。所述液体剂型中抗热性芽孢含量不低于109个/毫升，对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedes albopictus)2-3龄幼虫的生物毒效不低于100ITU/mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)为淀粉废水提供了一条崭新的资源化处置途径，同时降低了微生物灭蚊剂的生产成本。
(2)与现有技术中的淀粉废水生物处理法相比，本发明不仅处理了淀粉废水，而且可获得灭蚊剂产品，从而降低了废水处理成本。
(3)与现有技术中的蛋白分离法从淀粉废水中提取饲料蛋白相比，本方法获得的产品附加值较高。
(4)与现有技术中的微生物转化法生产单细胞蛋白饲料相比，本方法突破了现有技术中以蛋白饲料为最终发酵产品的局限性，扩大了淀粉废水的资源化利用途径。
(5)现有微生物灭蚊剂的生产原料主要是黄豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中Bs或Bti菌株主要依靠淀粉废水自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，大大降低了微生物灭蚊剂的生产成本，从而促进环境友好型生物灭蚊剂的推广应用。
(6)现有微生物灭蚊剂发酵生产中一个技术瓶颈是抗热性芽孢形成率低(48-72％)，也就是说细菌发育同步性能差，从而导致产品的杀蚊活性不高。以淀粉废水替代黄豆饼粉等常规原料，可以提高Bs与Bti的发育同步性，倒罐时(30-42小时)抗热芽孢形成率可达到85％以上。
图1为Bs 2362菌株在淀粉废水中培养36小时的电镜照片；图2为Bti 187菌株在淀粉废水中培养42小时的电镜照片。
具体实施例方式
实施例1生产Bs灭蚊剂(1)淀粉废水样品取北京市某淀粉厂的淀粉废水，该厂采用玉米为原料生产淀粉，加工工艺流程为玉米→过筛→浸泡→粉碎→胚芽分离→磨细→筛分→沉淀分离→淀粉洗涤→脱水→干燥→淀粉。废水主要来源为浸泡水与黄浆水。经分析，该淀粉废水中碳水化合物含量为6.8g/L、粗蛋白含量为19.0g/L、含固率8.61％，pH＝4.80。
(2)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为5.0％，加入0.75g/L的磷酸氢二钾、0.30g/L的硫酸镁和2.5g/L的泡敌。用NaOH调pH至9.5，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.3。
(其它消泡剂，如聚丙二醇、豆油、花生油等，分别代替泡敌，其效果相同。)(3)摇瓶培养从Bs 1593菌株斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速200转/分，500mL三角瓶装液250mL培养基，培养时间8小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种3.0％的Bs 1593摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温32℃、罐压0.06MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度260转/分、发酵时间8小时。
(5)发酵罐发酵接种8％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温32℃、罐压0.06MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间30小时。放罐时发酵液中Bs1593菌株的活菌数为6.7×108个/mL，抗热性芽孢数6.0×108个/mL，芽孢形成率89.6％，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表2)。
表2.Bs 1593菌株在淀粉废水培养30小时的发酵性状及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.0，经高速离心浓缩5倍，加入0.3g/L的防腐剂山梨酸钾，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，代替山梨酸钾，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.25×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为120ITU/mg实施例2生产Bs灭蚊剂(1)淀粉废水样品淀粉废水样品同实施例1。
(2)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为3.0％，加入0.50g/L的磷酸氢二钾、0.20g/L的硫酸镁和5.0g/L的花生油。用Ca(OH)2调pH至9.0，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.5。
(其它消泡剂，如泡敌、豆油、聚丙二醇等，分别代替花生油，其效果相同。)
(3)摇瓶培养发酵菌种由Bs 1593换成Bs 2362菌株，其余同实施例1。
(4)种子罐发酵接种1.0％的Bs 2362摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间10小时。
(5)发酵罐发酵接种2.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间36小时。图1是放罐时发酵液中Bs 2362菌株的芽孢形态(毒素蛋白包裹在芽孢之中)，可以看出基本没有营养体存在，发酵同步性好。此时发酵液中Bs 2362菌株的活菌数为6.6×108个/mL，抗热性芽孢数6.4×108个/mL，芽孢形成率97.0％。
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.0，经高速离心浓缩4倍，加入0.2g/L的防腐剂苯甲酸钠，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸钠，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.19×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为195ITU/mg。
实施例3生产Bti灭蚊剂(1)淀粉废水样品取河北省石家庄市某淀粉厂的淀粉废水，该厂采用红薯为原料生产淀粉，加工工艺流程为红薯→洗涤→磨碎→过筛→浆液→离心分离→淀粉洗涤→脱水→干燥→淀粉。废水主要来源为洗涤水与分离废水(薯浆废水及蛋白质水)。经分析废水中碳水化合物含量为13.2g/L、粗蛋白含量为6.1g/L、含固率7.10％、pH＝4.45。
(2)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为2.5％，加入矿质盐0.4g/L的磷酸氢二钾、0.35g/L的硫酸镁、2.0g/L的消泡剂聚丙二醇。用Ca(OH)2调pH至9.7，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用，灭后pH约为7.5。
(3)摇瓶培养从Bti 1897菌株斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。培养条件为温度30℃、转速250转/分，500mL三角瓶装液150mL培养基，培养时间12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
(4)种子罐发酵接种2.0％的上述摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.04MPa、通气量1∶1.4(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间12小时。
(5)发酵罐发酵接种2.0％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.04MPa、通气量1∶1.4(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间38小时。放罐时发酵液中活菌数为5.5×108个/mL，抗热性芽孢数4.9×108个/mL，芽孢形成率89％。，均显著高于常规牛肉膏蛋白胨液体培养基(表3)。
表3.Bti 1897菌株在淀粉废水培养38小时的发酵参数及其与常规培养基的比较
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀盐酸将发酵液pH调为4.5，经高速离心浓缩5倍，加入0.2g/L的防腐剂苯甲酸钠，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸钠，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bti生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.24×109个/毫升，生物测定表明产品对白纹伊蚊2-3龄幼虫的毒力效价为108ITU/mg。
实施例4生产Bti灭蚊剂(1)淀粉废水样品淀粉废水样品同实施例3。
(2)废水培养基调理同实施例3。
(3)摇瓶培养菌株由Bti 1897菌株换成Bti 187菌株，其余同实施例3。
(4)种子罐发酵接种1.0％的Bti 187摇瓶菌液，发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度250转/分、发酵时间12小时。
(5)发酵罐发酵接种1.5％的Bti 187种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间42小时。图2是放罐时发酵液中Bti 187菌株的芽孢与毒素蛋白的形态，图中显示只有极少数营养体存在，发酵同步性较好。42小时放罐时发酵液中Bti187菌株的活菌数为7.5×108个/mL，抗热性芽孢数6.7×108个/mL，芽孢形成率89.3％。
(6)发酵液后处理发酵结束后，用稀硫酸将发酵液pH调为4.2，经高速离心浓缩4倍，加入0.4g/L的防腐剂二甲苯，搅拌均匀，分装。
(其它防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯，代替二甲苯，效果相同。)(7)产品质量检验经检验所制备的Bs生物灭蚊剂液体剂型中抗热性芽孢数为2.19×109个/毫升，生物测定表明产品对淡色库蚊2-3龄幼虫的毒力效价为205ITU/mg。
权利要求
1.一种利用淀粉废水制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤(1)废水培养基调理调节淀粉废水的含固率为2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氢二钾、0.2-1.0g/L硫酸镁和1.0-5.0g/L消泡剂，用碱调pH为7.5-10.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却至30-35℃备用；(2)摇瓶培养将Bs或Bti接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时；(3)种子罐发酵将Bs或Bti摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时；(4)发酵罐发酵按1-10％的接种量将Bs或Bti种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的1.0-1.5、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的发酵时间为30-36小时，Bti菌株的发酵时间为36-42小时；(5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为2-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消泡剂为泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱是指KOH、NaOH或Ca(OH)2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的灭菌是指在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述的无机酸是硫酸、盐酸或硝酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述防腐剂是山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯或尼泊金甲酯。
8.利用权利要求1～7任一项所述方法得到的微生物灭蚊剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。本发明的制备方法包括废水培养基调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验。本发明是一条减轻淀粉废水对环境污染、变废为宝的有效途径，同时可大大降低微生物灭蚊剂的生产成本。本发明所制备的灭蚊剂产品对环境安全无害，对淡色库蚊或白纹伊蚊2－3龄幼虫的生物毒效不低于100ITU/mg。
文档编号A01P7/04GK1915030SQ20061003755
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者周顺桂, 雷发懋, 王跃强 申请人:广东省生态环境与土壤研究所
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