一种获得转基因鸡的方法

专利名称：：一种获得转基因鸡的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程
技术领域：
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背景技术：
：现在较常见的制备转基因鸡的方法主要为反转录病毒感染法、原始生殖细胞(PGCs)转染法、胚盘显微注射法、精子介导法。但是这些方法都存在各自的不足之处。(1)反转录病毒感染法由于部分病毒载体具有致瘤和引起病毒血症的致病性危险，外源DNA在各组织中分布不均匀，不易整合至生殖细胞，而且整合往往在多位点发生，故其后代会出现遗传变异。(2)原始生殖细胞(PGCs)转染法可获得的PGCs细胞数量少，培养条件还不成熟，PGCs转基因操作比较困难，限制了该技术的发展。(3)胚盘显微注射法该法需要特殊的仪器设备，而且操作时难度较大，在进行显微注射时对鸡胚盘造成损伤，破坏了蛋的结构，因此在孵化过程中出现大量鸡胚死亡。(4)精子介导法精子介导外源基因转移法操作简单、易行，对卵原核无损伤，符合生理受精过程，易于大量制备，但是精子已经分化，只能代表单个雄性个体某一阶段的遗传信息。
发明内容本发明的目的是发明一种遗传信息全面、不会出现变异、不造成胚盘损伤、易于操作的获得转基因鸡的方法。本发明用外源基因pEGFP-N1质粒转染精原干细胞，然后，在体内继续分化，得到携带有外源基因的精子。利用这些携带有外源基因的精子，可获得大量转基因后代，应用于鸡的生产性能的改良，种质资源的保存，进行抗病育种，建立疾病模型，基因治疗和发育调控，制造生物反应器，生产各种稀有的用其他方法不易得到的有生物活性的各种医用蛋白。本发明的优点1、本发明避免了反转录病毒感染法对机体造成致命的危险，是一种比较安全的方法；2、本发明无需特殊的仪器要求，只需要进行一般的外科手术，即可完成转染外源基因的过程，简便易行；3、转染后的精子可直接用于人工受精，产生受精卵，即可孵化，不需要破坏蛋的结构，从而大大提高了存活率和出雏率，可获得大量的转基因后代；4、因为精原干细胞能代表该雄性个体在整个生精过程的遗传信息，所以在转基因后代中可获得比较完全的遗传素材。本发明所采用的方法同样适用于其他禽类及哺乳动物，可简化或取代一些较为繁琐的转基因操作。本发明包括以下具体步骤1)制备pEGFP-N1质粒pEGFP-N1转化大肠杆菌DH5α，50μg/ml卡那霉素筛选阳性菌落，LB培养基扩大培养，按碱裂解法提取质粒，取1μl质粒溶液进行琼脂糖凝胶电泳，定量，计算提取液中质粒的浓度及总含量，并用试剂盒进行纯化，沉淀用70％酒精洗涤后烘干，以无菌双蒸水溶解后，终浓度为1mg/ml，再用ApalI限制性内切酶37℃进行单酶切，电泳回收纯化大小为4700bp的pEGFP-N1质粒DNA片段；2)睾丸内注射pEGFP-N1质粒DNA片段取50μg、100μg、150μg、200μg质粒DNA，制备阳离子质粒/聚合物，室温孵育15～20min；然后在19周龄公鸡的双侧睾丸注射50～200μg质粒DNA，缝合伤口，消炎处理。图1为转染后曲精细管图片。图2为转染后睾丸细胞图片。图3为转染后精子图片。图4为PCR产物琼脂糖检测结果图片。具体实施例方式步骤1、pEGFP-N1质粒制备pEGFP-N1转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素(50μg/ml)筛选阳性菌落，LB培养基扩大培养，按照标准碱裂解法提取质粒，取1μl质粒溶液进行琼脂糖凝胶电泳，定量，计算提取液中质粒的浓度及总含量，并用试剂盒进行纯化，沉淀用70％酒精洗涤后烘干，以无菌双蒸水溶解，终浓度为1mg/ml。用ApalI限制性内切酶37℃进行单酶切，电泳回收纯化大小为4700bp的片段。步骤2、睾丸内注射质粒DNA取50μg、100μg、150μg、200μg质粒DNA，按照梭华-sofastTM说明书(vivo)制备阳离子质粒/聚合物，室温孵育15～20min。选择健康19周龄青年公鸡，以速眠新按1ml/Kg体重剂量麻醉，在右侧肋骨下两指处切开2～3cm的切口，以注射器随机打点注射入双侧睾丸，每个睾丸选5个注射点，缝合伤口。注射苏醒灵，破伤风疫苗及青、链霉素。步骤3、检测精子中pEGFP-N1的表达于术后48hr取注射转染液的睾丸，剥去白膜，在PBS中洗涤4～5次，经二酶三步法消化取细胞及组织进行涂片，结果见图1，图2。于术后20d开始采集精液，制成细胞涂片，于荧光显微镜下观测是否有绿荧光表达，并计算表达率。提取精子DNA，进行琼脂糖电泳检测及PCR检测。(1)各个时期精子中绿色荧光蛋白的表达率见表1表1术后不同时期精子中pEGFP-N1表达率table.5Transfectionrateofspermsatdifferenttimeafteroperation(2)转染后曲精细管、睾丸细胞及精子涂片分别见图1、图2、图3(3)PCR产物琼脂糖检测结果见图4图4中，3为DL2000Marker；1、2、5为精子中DNA的PCR产物电泳条带，4为质粒PCR产物。权利要求1.一种获得转基因鸡的方法，其特征在于用外源基因pEGFP-N1质粒转染精原干细胞，然后，在体内继续分化，得到携带有外源基因的精子。2.根据权利要求1所述获得转基因鸡的方法，其特征在于其步骤包括1)制备pEGFP-N1质粒pEGFP-N1转化DH5α大肠杆菌，50μg/ml卡那霉素筛选阳性菌落，LB培养基扩大培养，按碱裂解法提取质粒，取1μl质粒溶液进行琼脂糖凝胶电泳，定量，计算提取液中质粒的浓度及总含量，并用试剂盒进行纯化，沉淀用70％酒精洗涤后烘干，以无菌双蒸水溶解后，终浓度为1mg/ml，再用ApalI限制性内切酶37℃进行单酶切，电泳回收纯化大小为4700bp的pEGFP-N1质粒DNA片段；2)睾丸内注射pEGFP-N1质粒DNA片段取50μg、100μg、150μg、200μg质粒DNA，制备质粒/阳离子聚合物，室温孵育15～20min；然后在19周龄公鸡的双侧睾丸注射50～200μg质粒DNA，缝合伤口，消炎处理。全文摘要一种获得转基因鸡的方法，涉及基因工程
技术领域：
。本发明用外源基因pEGFP－N1质粒转染精原干细胞，然后，在体内继续分化，得到携带有外源基因的精子。利用这些携带有外源基因的精子，可获得大量转基因后代，应用于鸡的生产性能的改良，种质资源的保存，进行抗病育种，建立疾病模型，基因治疗和发育调控，制造生物反应器，生产各种稀有的用其他方法不易得到的有生物活性的各种医用蛋白。文档编号A01K67/027GK1821416SQ200610038609公开日2006年8月23日申请日期2006年3月2日优先权日2006年3月2日发明者李碧春,周冠月申请人:扬州大学