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叶下珠茎节和枝节腋芽组培苗的高效快繁的制作方法

xiaoxiao2020-06-24  2

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专利名称:叶下珠茎节和枝节腋芽组培苗的高效快繁的制作方法
技术领域
本发明涉及一种叶下珠组培快繁方法,属于生物组培育苗技术领域。
背景技术
目前,乙肝病毒携带者数量十分惊人。椐世界卫生组织调查统计,全世界达4~5亿人,每年约有100万人死于乙肝病毒感染。我国约有10%人口患此病,至今尚未有十分有效的药物,且疗程较长。大戟科(Euphorbiaceae)植物叶下珠(Phyllanthus urinaria L)作为中药抗乙肝病毒药物之一近年来从实验到临床均进行了深入研究[仲英,左春旭,李风琴,等。叶下珠化学成份及其抗乙型肝炎病毒活性的研究。中国中药杂志,1998,23(6)363.]。研究发现除具有抗病毒作用外,还可提高免疫力、保护肝细胞损伤、抗肝纤维化、抗癌变等作用,有望成为制药业的一个新的利润增长点,需求量将不断增加。
目前我国叶下珠仍处于野生状态,很少进行人工栽培[赵永华 丁赢 杨春清我国叶下珠属药用植物资源的开发利用。生物学通报2000,35(12)39-40.],且种子发芽率不高,植株生长较慢[Unander DW,Bryan HH,Lance CJ & McMillan RT Factors affecting germination and standestablishment of Phyllanthus amarus(Euphorbiaceae).Econ.Bot.1995,4949-55.]。为更好地满足植物化学和药理学进一步研究及制药业日益增长之需,克服人工过度采收导致的资源匮乏,应采用积极有效措施,使之能够可持续利用发展。
采用离体组织培养快繁技术,可以在短期内获得大量优质试管苗,不受时间季节限制,全年生产,节约土地,保护叶下珠自然资源,更好地满足植物化学和药理学进一步研究及制药业日益增长之需。
有关叶下珠组织培养快繁的研究相对较少。Elizabete Catapan等人[Elizabete Catapan,M′arcio Lu′is,Busi da Silva,F′abio Netto Moreno & Ana Maria Vianal Micropropagation,callusand root culture of Phyllanthus urinaria(Euphorbiaceae)Plant Cell,Tissue and Organ Culture2002,70301-309.]以叶下珠节点(node)为外植体,采用离体快繁方法,在附加5.0微摩尔激动素KT的MS培养基上获得了试管苗。显然,如果能够利用茎节和枝节为外植体,可以扩大外植体的使用范围和种类,大大提高繁殖基数。

发明内容
本发明的目的是提供一种叶下珠组培快繁方法,以叶下珠40~70d龄植株的茎节和/或枝节为外植体,经芽苗诱导、增殖和组培苗生根、练苗与移栽等环节,快速获得大量的组培苗,以克服人工过度采收导致的资源匮乏。
本发明提出的叶下珠组培快繁方法,以叶下珠的茎节和枝节为外植体,经芽苗诱导、芽苗增殖、组培苗生根、炼苗与移栽,具体步骤如下(1)芽苗诱导将叶下珠茎节和枝节的切段接种于芽苗诱导培养基MSP1上分化无菌芽苗;(2)芽苗增殖无菌芽苗茎节和枝节切段培养于芽苗增殖培养基MSP2上,萌发丛生苗,丛生苗可用于下一轮的繁殖;(3)组培苗生根单株组培芽苗接种于生根培养基MSP3上生根。
上述步骤中培养基组分及含量配比如下芽苗诱导培养基MSP1MS培养基无机盐B5培养基的有机物Vc 50~150mg/LCH 200~400mg/L6-BA 0.5~3.0mg/LIBA0.2~0.8mg/LAgNO32~10mg/L蔗糖 30~50g/L琼脂 6.5g/LpH值 5.8~6.2芽苗增殖培养基MSP2MS培养基无机盐B5培养基有机物Vc 100mg/LCH 300mg/L6-BA 0.5~2.0mg/LIBA0.2~1.0mg/L蔗糖 30g/L琼脂 6.5g/LpH值 5.8~6.2生根培养基MSP3MS或1/2MS培养基IBA0.2~0.5mg/L蔗糖 20~30g/L
琼脂 6.5g/LpH值 5.8~6.2芽苗诱导是将叶下珠茎节和枝节流水冲洗,70%乙醇浸30s,0.1%HgCl2表面消毒7~10min,无菌水冲洗数次,然后在含有50~150mg/L Vc的无菌水中剪切成2~3cm长的切段,接种于芽苗诱导培养基MSP1上,10d后陆续分化出无菌芽苗。
芽苗增殖是将芽苗诱导培养基上生长的无菌芽苗茎节和枝节切成带1-2片叶的切段,接种于芽苗增殖培养基MSP2上培养20~30d。
组培苗接种于生根培养基MSP3上生根,挑选生长健壮的完整植株,敞开瓶盖炼苗5d,移栽于含蛭石∶腐殖土∶田园土=2∶1∶1的盆钵中,覆膜保湿培养5~7d,自然光照生长。
芽苗诱导、增殖和组培苗生根培养的温度25℃,每日光照12h,光照强度2000Lux。
本发明的优点与积极效果本发明以茎节和枝节为外植体,不仅创新了外植体的使用范围和种类,大大提高了繁殖基数,而且通过改良培养基成分及其激素种类与配比含量,缩短了腋芽发生时间,抑制了外植体和芽苗的褐变现象,提高了芽苗质量,从而使每株外植体的繁殖系数大幅度提高。以此方法可快速高效地繁殖出大量的组培试管苗,每25d为一个周期,每个节段的繁殖系数为9~15,每棵叶下珠的繁殖系数可达130~200。该高效快繁体系为叶下珠的进一步开发利用提供了源源不断、四季可用的原料基础。


图1为叶下珠外植体诱导的芽苗。
图2为组培苗再生完整植株。
具体实施例方式
本发明使用的缩略语对应的中文名称如下Vc(维生素C)CH(水解乳蛋白)6-BA(6-苄基嘌呤)IBA(吲哚丁酸)本发明使用的MS培养基无机盐按照手册通用方法配制,组成与含量如下MgSO4·7H2O370mg/L,CaCl2·2H2O440mg/L,KNO31900mg/L,NH4NO31650mg/L,KH2PO4170mg/L,MnSO4·4H2O22.3mg/L,KI0.83mg/L,ZnSO4·7H2O8.6mg/L,CoCl2·6H2O0.025mg/L,CuSO4·5H2O0.025mg/L,H3BO36.2mg/L,Na2MoO4·2H2O0.25mg/L,FeSO4·7H2O27.8mg/L,Na2-EDTA37.3mg/L。
B5培养基有机物即肌醇100mg/L,维生素B110mg/L,维生素B61mg/L,烟酸1mg/L。
以下通过实施例进一步描述本发明。
实施例1以西安市植物园中药园区试种的60d龄的健壮植株顶部倒数4~5个茎节和枝节为外植体,去掉叶片,流水冲洗,70%乙醇浸摇30s,0.1%HgCl2表面消毒9min,无菌水冲洗6次,然后在含有50mg/L Vc的无菌水中剪切成具2片叶的切段,水平或垂直放置于MS培养基无机盐+B5培养基的有机物+Vc100mg/L+CH300mg/L+6-BA 1.5mg/L+IBA0.2mg/L+AgNO310mg/L+40g/L蔗糖的培养基上,5d后腋芽开始萌发生长,25d后可长成高6cm、含6~8片叶、具2~4个侧芽的无菌苗(图1所示)。
将无菌试管苗的茎节和枝节切成带2片叶的切段,接种于MS培养基无机盐+B5培养基有机物+Vc100mg/L+CH300mg/L+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+30g/L蔗糖的培养基上,进行芽苗的进一步增殖培养,25d后,每个茎段的腋芽又可萌发长成主茎高5~7cm、带5~8片叶,2~4个侧芽的丛生苗。这些增殖的小苗又可用于下一轮的繁殖。以此方法可快速高效地繁殖出大量的组培苗,每25d为一个周期,每个切段能诱导产生10~15棵芽苗,每棵叶下株植株可繁殖出138~160棵无菌试管芽苗。
如果需要生根移栽,切取高约2cm以上的组培苗,接种于1/2MS+IBA0.5+20g/L蔗糖的生根培养基上,25℃、2000Lx光下壮苗生根,5~7d后根开始形成,生根率达100%(图2所示)。培养15d后,挑选生长健壮,带3条以上根的植株,敞开瓶盖炼苗5d,移栽于盆钵(盆钵的营养土组成为蛭石∶腐殖土∶田园土=2∶1;1)中,其上覆盖塑料膜,保湿培养7d后,移去薄膜,自然光下生长良好。移栽成活率为90.43%。
实施例2以西安市植物园中药园区试种的40d龄的健壮植株茎节和枝节为外植体,去掉叶片,流水冲洗,70%乙醇浸摇30s,0.1%HgCl2表面消毒8min,无菌水冲洗6次,然后在含有150mg/L Vc的无菌水中剪切成具2片叶的切段,水平或垂直放置于MS培养基无机盐+B5培养基的有机物+Vc100mg/L+CH300mg/L+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+AgNO310mg/L+40g/L蔗糖的培养基上,5d后腋芽开始萌发生长,30d左右可长成高4~6cm、含5~7片叶、具2个侧芽的无菌苗。
将无菌试管苗的茎节和枝节切成带2片叶的且段,接种于MS培养基无机盐+B5培养基的有机物+Vc100mg/L+CH300mg/L+6-BA1.5mg/L+IBA0.5mg/L+30g/L蔗糖的培养基上,进行芽苗的进一步增殖培养,25d后,每个茎段的腋芽又可萌发长成主茎高5cm左右、带5~8片叶,2~4个侧芽的丛生苗。这些增殖的小苗又可用于下一轮的繁殖。以此方法可快速高效地繁殖出大量的组培苗,每25d为一个周期,每个切段可诱导形成9~11棵芽苗,每棵叶下株植株可生产出150~180棵无菌试管芽苗。
切取高约2cm以上的组培苗,接种于MS+IBA0.2+30g/L蔗糖的生根培养基上,25℃、2000Lx光下壮苗生根,7d后开始生根,生根率达100%。培养15d后,挑选生长健壮,根系发达的再生植株,敞开瓶盖炼苗7d,移栽于盆土(蛭石∶腐殖土∶田园土=2∶1;1)中,其上覆膜保湿培养4~5d,移去薄膜,自然光下生长,移栽成活率为100%。
以上述方法可快速高效地繁殖出大量的叶下珠组培试管苗,每25d为一个周期,每个节段的繁殖系数为9~15,每棵叶下珠的繁殖系数可达130~200,该高效快繁体系为叶下珠的进一步开发利用提供了源源不断、四季可用的原料基础。
权利要求
1.叶下珠组培快繁方法,以叶下珠的茎节和枝节为外植体,经芽苗诱导、芽苗增殖、组培苗生根、炼苗与移栽,具体步骤如下(1)芽苗诱导将叶下珠茎节和枝节的切段接种于芽苗诱导培养基MSP1上分化无菌芽苗;(2)芽苗增殖无菌芽苗茎节和枝节切段培养于芽苗增殖培养基MSP2上,萌发丛生苗,丛生苗可用于下一轮的繁殖;(3)组培苗生根单株组培芽苗接种于生根培养基MSP3上生根;上述步骤中培养基组分及含量配比如下芽苗诱导培养基MSP1MS培养基无机盐B5培养基的有机物Vc 50~150mg/LCH 200~400mg/L6-BA0.5~3.0mg/LIBA 0.2~0.8mg/LAgNO32~10mg/L蔗糖30~50g/L琼脂6.5g/LpH值5.8~6.2芽苗增殖培养基MSP2MS培养基无机盐B5培养基有机物Vc 100mg/LCH 300mg/L6-BA0.5~2.0mG/LIBA 0.2~1.0 mg/L蔗糖30G/L琼脂6.5g/LpH值5.8~6.2生根培养基MSP3MS或1/2MS培养基IBA 0.2~0.5mg/L蔗糖20~30g/L琼脂6.5g/LpH值5.8~6.2。
2.根据权利要求1所述的叶下珠组培快繁方法,其特征在于芽苗诱导是将叶下珠茎节和枝节流水冲洗,70%乙醇浸30s,0.1%HgCl2表面消毒7~10min,无菌水冲洗数次,然后在含有50~150mg/L Vc的无菌水中剪切成2~3cm长的切段,接种于芽苗诱导培养基MSP1上,10d后陆续分化出无菌芽苗。
3.根据权利要求1所述的叶下珠组培快繁方法,其特征在于芽苗增殖是将芽苗诱导培养基上生长的无菌芽苗茎节和枝节切成带1-2片叶的切段,接种于芽苗增殖培养基MSP2上培养20~30d。
4.根据权利要求1所述的叶下珠组培快繁方法,其特征在于炼苗与移栽步骤中,挑选生长健壮的完整植株,敞开瓶盖炼苗5d,移栽于含蛭石∶腐殖土∶田园土=2∶1∶1的盆钵中,覆膜保湿培养5~7d,自然光照生长。
5.根据权利要求1-3任意之一所述的叶下珠组培快繁方法,其特征在于芽苗诱导、增殖和组培苗生根培养的温度25℃,每日光照12h,光照强度2000Lux。
全文摘要
本发明公开了一种叶下珠组培快繁方法。其技术特征是以叶下珠的茎节和枝节为外植体,具体步骤如下(1)芽苗诱导将叶下珠茎节和枝节的切段接种于芽苗诱导培养基MSP1上分化无菌芽苗;(2)芽苗增殖无菌芽苗茎节和枝节切段培养于芽苗增殖培养基MSP2上,萌发丛生苗,丛生苗可用于下一轮的繁殖;(3)组培苗生根单株组培芽苗接种于生根培养基MSP3上生根。本发明以茎节和枝节为外植体,不仅创新了外植体的使用范围和种类,大大提高了繁殖基数,而且通过改良培养基成分及其激素种类与配比含量,缩短了腋芽发生时间,抑制了外植体和芽苗的褐变现象,提高了芽苗质量,从而使每株外植体的繁殖系数大幅度提高。
文档编号A01G7/00GK1843097SQ200610041910
公开日2006年10月11日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者贾敬芬, 韩晓玲 申请人:西北大学

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