菊苣试管苗的高效快繁方法
专利名称：菊苣试管苗的高效快繁方法
技术领域：
本发明涉及一种菊苣组培苗的快繁方法，特别是一种通过离体叶片不定芽的直接发生方法得到菊苣组培苗的快繁方法，属生物组培育苗领域。
背景技术：
菊苣Chicory(Cichorium intybus.L)为菊科菊苣属多年生草本，既是高产优质的牧草，更是新兴的高档特色蔬菜，此外菊苣含有菊糖及马栗树皮素、马栗树皮甙、野莴苣甙、山莴苣素、山莴苣苦素等特殊成分，为咖啡代用品，并有防治黄胆性肝炎、心血管疾病、骨质疏松症等功效，具有饲用、食用和药用等方面的开发潜力。近年来有关菊苣组织培养已有一些报道[(1)Varotts，lucchin M，Parrinip.Immature embryos culture in Italian red chicory.Plan Cell Tissue andOrgan Culture，2000，62(1)75～79；(2)王绍明，张霞，刘彤.菊苣花瓣的组织培养.植物生理学通讯，2001，37(3)230；(3)程林梅，高洪文，赵茂林.菊苣组织培养与植株再生的研究.草业学报，2002，11(4)105～107.]，但都是通过间接的器官发生途径再生植株的，即外植体脱分化产生愈伤组织，愈伤组织再分化成不定芽，最后不定芽生根成苗。培养周期长，成本高，程序复杂，植株再生频率低，易发生变异。
发明内容
本发明的目的是提供一种菊苣组培高效快繁方法，以菊苣叶片为外植体，经无菌实生苗的产生、不定芽的直接诱导以及芽苗生根、练苗、移栽等环节，获得组培苗。
本发明内容如下一种菊苣组培高效快繁方法，以菊苣叶片为外植体，包括如下步骤(1)无菌实生苗的产生菊苣种子经灭菌接种于无激素的1/2MS基本培养基MS1上萌发成无菌实生苗；(2)离体叶片不定芽的直接发生将20～50d龄的无菌实生苗叶片切块，接种在不定芽直接诱导培养基MS2上产生绿色的不定芽芽点，继续培养15～20d，芽点可发育成单生和/或簇生的不定芽；(3)不定芽的生根、练苗与移栽切取不定芽转入MS或1/2MS生根培养基上诱导生根；上述步骤中培养基组分及含量配比如下无菌实生苗培养基MS11/2MS培养基
蔗糖30g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2不定芽直接诱导诱导培养基MS2MS培养基6-BA0.5～2.0mg/LNAA 0.2～1.0mg/LAgNO32～10mg/LVB150～100mg/L脯氨酸 200～300mg/L蔗糖30～60g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2生根培养基MS3MS或1/2MS培养基IBA 0.2～1.0mg/L蔗糖20g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2。
本发明的方法中无菌实生苗产生是将种子用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒10～15min，无菌水冲洗6次，接种于MS1基本培养基上，每日光照16h，光照强度2000lux，培养温度25±2℃。
本发明的方法中离体叶片不定芽的直接发生是将20～50d龄的菊苣无菌苗叶片沿主脉横切成叶片基部、中部和顶部三块，接种在不定芽直接诱导诱导培养基MS2上，25±2℃，2500lux光照培养5～7d，在外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，15～20d，芽点可发育成单生和/或簇生的不定芽，每块叶片形成的不定芽数量20～40个，继续培养不定芽逐渐长高，而且又有新的不定芽不断产生。
本发明的方法中不定芽的生根具体为切取2cm以上的不定芽，转入生根培养基MS3上诱导生根15d左右长出健壮根系。
本发明的方法中根系发达，生根健壮的小苗进一步练苗与移栽，具体为敞开瓶盖练苗5～7d，移栽于盆土(田园土∶腐叶土＝1∶1)中，其上覆盖塑料膜保湿培养4～7d后，自然光照培养，再生植株成活率为96.7～1 00％。
本发明的优点与积极效果本发明以菊苣无菌苗叶片切块为外植体，培养15～20d，每个外植体上可直接形成20～40个不定芽，35～40d内可再生30多个健壮的组培苗，一棵具5片叶的无菌实生苗，离体培养30天后可产生500棵左右的优质组培苗。与常规的离体植株再生体系相比，培养周期至少缩短25～30d，培养成本减少一半以上，繁殖系数增加3～5倍，从而建立了高效快速低成本的菊苣组培苗工厂化生产体系，为常年供应优质特色菊苣芽苗蔬菜以及优良的菊苣牧草提供了可能及保证，同时为利用细胞工程和基因工程技术对菊苣性状进行遗传改良奠定了良好的技术平台。
图1为本发明的菊苣无菌苗20d龄叶片基部直接诱导不定芽。
图2为本发明的菊苣无菌苗30d龄叶片中上部直接诱导不定芽。
图3为本发明的菊苣不定芽在生根培养基上生根。
具体实施例方式
本发明使用的缩略语对应的中文名称如下VB1(维生素B1)CH(水解乳蛋白)6-BA(6-苄基嘌呤)IBA(吲哚丁酸)NAA(α-奈乙酸)MS培养基按照手册通用方法配制，组成与含量如下MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，KI0.83mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，H3BO36.2mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，肌醇100mg/L，维生素B10.1mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。
以下通过实施例进一步描述本发明。
实施例1挑选子粒饱满的菊苣种子，用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒12min，无菌水冲洗6次，接种于1/2MS基本培养基上，每日光照16h，光照强度20001x，培养温度25±2℃.
切取培养20d的菊苣无菌苗叶片的基部，接种在附加2.0mg/L6-BA，0.5mg/LNAA，10mg/L AgNO3，100mg/LVB1，300mg/L脯氨酸和4％蔗糖的MS培养基上，25±2℃，2500lux光照培养7d，外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，15d后，芽点发育成簇生的不定芽，每块叶片形成的不定芽数最多为44个，平均为36.08个(如图1所示)。切取2cm以上的不定芽，转入附加0.5mg/L IBA的MS培养基上，7d后产生不定根，15d后可形成3条健壮的不定根系(如图3所示)。将生根的健壮再生植株，敞开瓶盖练苗5d，移栽于营养盆土(田园土∶腐叶＝1∶1)中，覆盖PVC薄膜保湿培养5d后，自然光下生长健壮，成活率100％。
经过上述培养，在30～40d内，一块菊苣离体叶片切块可形成30多棵组培苗，而一棵带有5片叶的菊苣无菌苗可生产出500多棵优质组培苗。
实施例2挑选子粒饱满的菊苣种子，用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒12min，无菌水冲洗6次，接种于1/2MS基本培养基上，每日光照16h，光照强度20001x，培养温度25±2℃。
切取培养30d的菊苣无菌苗叶片的中上部，接种在附加1.5mg/L6-BA，0.5mg/L NAA，5mg/L AgNO3，50mg/L VB1，300mg/L脯氨酸和4％蔗糖的MS培养基上，25±2℃，2500lux光照培养7d，外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，15d左右，芽点发育成簇生的不定芽，每块叶片形成的不定芽数最多为35个，平均为29.06个(如图2所示)。切取2cm以上的不定芽，转入附加0.5mg/L IBA的1/2MS培养基上，5～7d产生不定根，15d后可形成3条以上健壮的不定根系。将健壮的再生植株，敞开瓶盖练苗5d，移栽于营养盆土(田园土∶腐叶土＝1∶1)中，覆盖PVC薄膜保湿培养5d后，自然光下生长健壮，成活率96.78％。
经过上述培养，在30～40d内，一块菊苣离体叶片切块能生产出近30棵组培快繁苗，而一棵带有5片叶的菊苣无菌苗可生产出近500棵优质组培苗。
权利要求
1.一种菊苣组培高效快繁方法，以菊苣叶片为外植体，包括如下步骤(1)无菌实生苗的产生菊苣种子经灭菌接种于无激素的1/2MS基本培养基MS1上萌发成无菌实生苗；(2)离体叶片不定芽的直接发生将20～50d龄的无菌实生苗叶片切块，接种在不定芽直接诱导培养基MS2上产生绿色的不定芽芽点，继续培养15～20d，芽点可发育成单生和/或簇生的不定芽；(3)不定芽的生根切取不定芽转入MS或1/2MS生根培养基上诱导生根；上述步骤中培养基组分及含量配比如下无菌实生苗培养基MS11/2MS培养基蔗糖30g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2不定芽直接诱导诱导培养基MS2MS培养基6-BA0.5～2.0mg/LNAA 0.2～1.0mg/LAgNO32～10mg/LVB150～100mg/L脯氨酸 200～300mg/L蔗糖30～60g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2生根培养基MS3MS或1/2MS培养基IBA 0.2～1.0mg/L蔗糖20g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2。
2.根据权利要求1所述的一种菊苣组培高效快繁方法，其特征在于无菌实生苗产生是将种子用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒10～15min，无菌水冲洗6次，接种于MS1基本培养基上，每日光照16h，光照强度2000lux，培养温度25±2℃。
3.根据权利要求1所述的一种菊苣组培高效快繁方法，其特征在于离体叶片不定芽的直接发生是将20～50d龄的菊苣无菌苗叶片沿主脉横切成叶片基部、中部和顶部三块，接种在不定芽直接诱导诱导培养基MS2上，25±2℃，2500lux光照培养发育成单生和/或簇生的不定芽。
4.根据权利要求1所述的一种菊苣组培高效快繁方法，其特征在于生根健壮的小苗进一步练苗与移栽，具体为敞开瓶盖练苗5～7d，移栽于盆土中，其上覆盖塑料膜保湿培养4～7d后，自然光照培养。
全文摘要
本发明公开了一种菊苣组培苗的快繁方法。其技术特征是以菊苣叶片为外植体，包括如下步骤(1)无菌实生苗的产生；(2)离体叶片不定芽的直接发生；(3)不定芽的生根、练苗与移栽。本发明以菊苣无菌苗叶片切块为外植体，培养15～20d，每个外植体上可直接形成20～40个不定芽，35～40d内可再生30多个健壮的组培苗，一棵具5片叶的无菌实生苗，离体培养30天后可产生500棵左右的优质组培苗。与常规的离体植株再生体系相比，培养周期至少缩短25～30d，培养成本减少一半以上，繁殖系数增加3～5倍。
文档编号A01H3/00GK1820584SQ20061004191
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者韩晓玲, 贾敬芬 申请人:西北大学
技术领域：
本发明涉及一种菊苣组培苗的快繁方法，特别是一种通过离体叶片不定芽的直接发生方法得到菊苣组培苗的快繁方法，属生物组培育苗领域。
背景技术：
菊苣Chicory(Cichorium intybus.L)为菊科菊苣属多年生草本，既是高产优质的牧草，更是新兴的高档特色蔬菜，此外菊苣含有菊糖及马栗树皮素、马栗树皮甙、野莴苣甙、山莴苣素、山莴苣苦素等特殊成分，为咖啡代用品，并有防治黄胆性肝炎、心血管疾病、骨质疏松症等功效，具有饲用、食用和药用等方面的开发潜力。近年来有关菊苣组织培养已有一些报道[(1)Varotts，lucchin M，Parrinip.Immature embryos culture in Italian red chicory.Plan Cell Tissue andOrgan Culture，2000，62(1)75～79；(2)王绍明，张霞，刘彤.菊苣花瓣的组织培养.植物生理学通讯，2001，37(3)230；(3)程林梅，高洪文，赵茂林.菊苣组织培养与植株再生的研究.草业学报，2002，11(4)105～107.]，但都是通过间接的器官发生途径再生植株的，即外植体脱分化产生愈伤组织，愈伤组织再分化成不定芽，最后不定芽生根成苗。培养周期长，成本高，程序复杂，植株再生频率低，易发生变异。
发明内容
本发明的目的是提供一种菊苣组培高效快繁方法，以菊苣叶片为外植体，经无菌实生苗的产生、不定芽的直接诱导以及芽苗生根、练苗、移栽等环节，获得组培苗。
本发明内容如下一种菊苣组培高效快繁方法，以菊苣叶片为外植体，包括如下步骤(1)无菌实生苗的产生菊苣种子经灭菌接种于无激素的1/2MS基本培养基MS1上萌发成无菌实生苗；(2)离体叶片不定芽的直接发生将20～50d龄的无菌实生苗叶片切块，接种在不定芽直接诱导培养基MS2上产生绿色的不定芽芽点，继续培养15～20d，芽点可发育成单生和/或簇生的不定芽；(3)不定芽的生根、练苗与移栽切取不定芽转入MS或1/2MS生根培养基上诱导生根；上述步骤中培养基组分及含量配比如下无菌实生苗培养基MS11/2MS培养基
蔗糖30g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2不定芽直接诱导诱导培养基MS2MS培养基6-BA0.5～2.0mg/LNAA 0.2～1.0mg/LAgNO32～10mg/LVB150～100mg/L脯氨酸 200～300mg/L蔗糖30～60g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2生根培养基MS3MS或1/2MS培养基IBA 0.2～1.0mg/L蔗糖20g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2。
本发明的方法中无菌实生苗产生是将种子用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒10～15min，无菌水冲洗6次，接种于MS1基本培养基上，每日光照16h，光照强度2000lux，培养温度25±2℃。
本发明的方法中离体叶片不定芽的直接发生是将20～50d龄的菊苣无菌苗叶片沿主脉横切成叶片基部、中部和顶部三块，接种在不定芽直接诱导诱导培养基MS2上，25±2℃，2500lux光照培养5～7d，在外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，15～20d，芽点可发育成单生和/或簇生的不定芽，每块叶片形成的不定芽数量20～40个，继续培养不定芽逐渐长高，而且又有新的不定芽不断产生。
本发明的方法中不定芽的生根具体为切取2cm以上的不定芽，转入生根培养基MS3上诱导生根15d左右长出健壮根系。
本发明的方法中根系发达，生根健壮的小苗进一步练苗与移栽，具体为敞开瓶盖练苗5～7d，移栽于盆土(田园土∶腐叶土＝1∶1)中，其上覆盖塑料膜保湿培养4～7d后，自然光照培养，再生植株成活率为96.7～1 00％。
本发明的优点与积极效果本发明以菊苣无菌苗叶片切块为外植体，培养15～20d，每个外植体上可直接形成20～40个不定芽，35～40d内可再生30多个健壮的组培苗，一棵具5片叶的无菌实生苗，离体培养30天后可产生500棵左右的优质组培苗。与常规的离体植株再生体系相比，培养周期至少缩短25～30d，培养成本减少一半以上，繁殖系数增加3～5倍，从而建立了高效快速低成本的菊苣组培苗工厂化生产体系，为常年供应优质特色菊苣芽苗蔬菜以及优良的菊苣牧草提供了可能及保证，同时为利用细胞工程和基因工程技术对菊苣性状进行遗传改良奠定了良好的技术平台。
图1为本发明的菊苣无菌苗20d龄叶片基部直接诱导不定芽。
图2为本发明的菊苣无菌苗30d龄叶片中上部直接诱导不定芽。
图3为本发明的菊苣不定芽在生根培养基上生根。
具体实施例方式
本发明使用的缩略语对应的中文名称如下VB1(维生素B1)CH(水解乳蛋白)6-BA(6-苄基嘌呤)IBA(吲哚丁酸)NAA(α-奈乙酸)MS培养基按照手册通用方法配制，组成与含量如下MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，KI0.83mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，H3BO36.2mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，肌醇100mg/L，维生素B10.1mg/L，维生素B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。
以下通过实施例进一步描述本发明。
实施例1挑选子粒饱满的菊苣种子，用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒12min，无菌水冲洗6次，接种于1/2MS基本培养基上，每日光照16h，光照强度20001x，培养温度25±2℃.
切取培养20d的菊苣无菌苗叶片的基部，接种在附加2.0mg/L6-BA，0.5mg/LNAA，10mg/L AgNO3，100mg/LVB1，300mg/L脯氨酸和4％蔗糖的MS培养基上，25±2℃，2500lux光照培养7d，外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，15d后，芽点发育成簇生的不定芽，每块叶片形成的不定芽数最多为44个，平均为36.08个(如图1所示)。切取2cm以上的不定芽，转入附加0.5mg/L IBA的MS培养基上，7d后产生不定根，15d后可形成3条健壮的不定根系(如图3所示)。将生根的健壮再生植株，敞开瓶盖练苗5d，移栽于营养盆土(田园土∶腐叶＝1∶1)中，覆盖PVC薄膜保湿培养5d后，自然光下生长健壮，成活率100％。
经过上述培养，在30～40d内，一块菊苣离体叶片切块可形成30多棵组培苗，而一棵带有5片叶的菊苣无菌苗可生产出500多棵优质组培苗。
实施例2挑选子粒饱满的菊苣种子，用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒12min，无菌水冲洗6次，接种于1/2MS基本培养基上，每日光照16h，光照强度20001x，培养温度25±2℃。
切取培养30d的菊苣无菌苗叶片的中上部，接种在附加1.5mg/L6-BA，0.5mg/L NAA，5mg/L AgNO3，50mg/L VB1，300mg/L脯氨酸和4％蔗糖的MS培养基上，25±2℃，2500lux光照培养7d，外植体的表面和切口处陆续产生绿色的不定芽芽点，15d左右，芽点发育成簇生的不定芽，每块叶片形成的不定芽数最多为35个，平均为29.06个(如图2所示)。切取2cm以上的不定芽，转入附加0.5mg/L IBA的1/2MS培养基上，5～7d产生不定根，15d后可形成3条以上健壮的不定根系。将健壮的再生植株，敞开瓶盖练苗5d，移栽于营养盆土(田园土∶腐叶土＝1∶1)中，覆盖PVC薄膜保湿培养5d后，自然光下生长健壮，成活率96.78％。
经过上述培养，在30～40d内，一块菊苣离体叶片切块能生产出近30棵组培快繁苗，而一棵带有5片叶的菊苣无菌苗可生产出近500棵优质组培苗。
权利要求
1.一种菊苣组培高效快繁方法，以菊苣叶片为外植体，包括如下步骤(1)无菌实生苗的产生菊苣种子经灭菌接种于无激素的1/2MS基本培养基MS1上萌发成无菌实生苗；(2)离体叶片不定芽的直接发生将20～50d龄的无菌实生苗叶片切块，接种在不定芽直接诱导培养基MS2上产生绿色的不定芽芽点，继续培养15～20d，芽点可发育成单生和/或簇生的不定芽；(3)不定芽的生根切取不定芽转入MS或1/2MS生根培养基上诱导生根；上述步骤中培养基组分及含量配比如下无菌实生苗培养基MS11/2MS培养基蔗糖30g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2不定芽直接诱导诱导培养基MS2MS培养基6-BA0.5～2.0mg/LNAA 0.2～1.0mg/LAgNO32～10mg/LVB150～100mg/L脯氨酸 200～300mg/L蔗糖30～60g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2生根培养基MS3MS或1/2MS培养基IBA 0.2～1.0mg/L蔗糖20g/L琼脂6.5g/LpH值5.8～6.2。
2.根据权利要求1所述的一种菊苣组培高效快繁方法，其特征在于无菌实生苗产生是将种子用自来水冲洗，70％乙醇浸摇30s，0.1％HgCl2表面消毒10～15min，无菌水冲洗6次，接种于MS1基本培养基上，每日光照16h，光照强度2000lux，培养温度25±2℃。
3.根据权利要求1所述的一种菊苣组培高效快繁方法，其特征在于离体叶片不定芽的直接发生是将20～50d龄的菊苣无菌苗叶片沿主脉横切成叶片基部、中部和顶部三块，接种在不定芽直接诱导诱导培养基MS2上，25±2℃，2500lux光照培养发育成单生和/或簇生的不定芽。
4.根据权利要求1所述的一种菊苣组培高效快繁方法，其特征在于生根健壮的小苗进一步练苗与移栽，具体为敞开瓶盖练苗5～7d，移栽于盆土中，其上覆盖塑料膜保湿培养4～7d后，自然光照培养。
全文摘要
本发明公开了一种菊苣组培苗的快繁方法。其技术特征是以菊苣叶片为外植体，包括如下步骤(1)无菌实生苗的产生；(2)离体叶片不定芽的直接发生；(3)不定芽的生根、练苗与移栽。本发明以菊苣无菌苗叶片切块为外植体，培养15～20d，每个外植体上可直接形成20～40个不定芽，35～40d内可再生30多个健壮的组培苗，一棵具5片叶的无菌实生苗，离体培养30天后可产生500棵左右的优质组培苗。与常规的离体植株再生体系相比，培养周期至少缩短25～30d，培养成本减少一半以上，繁殖系数增加3～5倍。
文档编号A01H3/00GK1820584SQ20061004191
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者韩晓玲, 贾敬芬 申请人:西北大学
最新回复(0)