从种植于铜污染土壤的海州香薷中提取杀菌活性剂的方法

专利名称：：从种植于铜污染土壤的海州香薷中提取杀菌活性剂的方法
技术领域：
：本发明涉及从种植于铜污染土壤的海州香薷中提取杀菌活性剂的方法。
背景技术：
：海州香薷，唇形科香薷属植物，在东南亚地区多作为民间药草使用。有发汗解暑，和中祠湿之功效，主治胸痞腹痛，呕吐腹泻，水肿脚气等。海州香薷花枝和叶片中含有精油、氨基酸、蛋白质、色素、黄酮苷、生物碱、有机酸、酚类和多糖等天然有机成分，其中精油主成分为脱氢香薷酮和香薷酮，有很强的杀菌活性。胡珊梅等在江苏连云港海州山的海州香薷精油中，鉴定出精油成分37种，主成分为香薷酮(85.27％)和脱氢香薷酮(2.00％)。脱氢香薷酮是铜污染土壤中海州香薷花枝或叶片精油的特征成分，花枝精油中脱氢香薷酮相对含量为56.8％～80.6％，香薷酮相对含量为9.1％～19.6％；叶片精油中脱氢香薷酮相对含量为46.6％～71.5％，香薷酮相对含量为和8.3％～15.6％。天然植物药剂具有无公害、不易产生抗药性、价格低廉、对光照温度性能稳定、货柜寿命长、在空气和土壤中易分解、无残毒积累等特性，且使用的药剂一般不提纯，多为几种有效植物成分按一定比例混合的提取液或浸提液。因此，海州香薷植物可作为化学合成杀菌活性剂替代品的开发资源。海州香薷植物资源丰富，近年来，铜耐性/富集植物海州香薷广泛用于铜污染土壤的植物修复。这是因为农产品质量安全已经成为人们关注的焦点之一，农产品质量与土壤环境质量密切相关，而重金属污染是影响土壤环境质量的主要因素之一。在不破坏农田生态环境和种植功能的前提下，降低污染土壤中有效态铜含量，恢复土壤农耕的目的，已经开发出适合我国且具有我国独立知识产权的、利用我国原生铜耐性/富集植物海州香薷，修复利用铜污染土壤的技术(中国专利，ZL200310108946.1，铜污染土壤的生物原位修复方法)。随着海州香薷植物修复铜污染土壤的大规模田间示范和应用推广，植物修复材料的产后处置和资源化是个急需解决的环境问题。如何合理开发和高效利用修复材料，获得典型铜污染土壤植物修复—修复材料产后资源化的成套技术体系，对降低污染土壤植物修复成本，加快植物修复进程，有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供从种植在铜污染土壤的海州香薷中提取植物源杀菌活性剂的方法，该方法以修复铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷花枝或/和叶片为原料提取植物源杀菌活性剂，既可在食品防腐和绿色农药的开发利用方面应用，同时可实现植物修复材料的产后资源化，提高其经济价值。本发明所提供的方法包括以下步骤1)盛花期收获种植在铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷花枝或/和叶片，洗净、干燥、粉碎，将粉碎后的花枝或/和叶片用浓度为75％～100％乙醇进行索氏提取，获取提取液；或者将粉碎后的花枝或/和叶片用浓度为75％～100％乙醇室温浸提，获取提取液；2)于18～25℃，0.08～0.20Mpa下，真空浓缩提取液，然后用石油醚萃取，得到石油醚萃取液，石油醚的用量为提取液的0.1～0.3倍；3)于18～25℃，0.08～0.20MPa下，浓缩石油醚萃取液，干燥，然后用水蒸汽蒸馏或超临界CO2萃取，得到黄色透明的精油；4)精油用乙醇、乙酸乙酯或石油醚配制成浓度为10～25mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。本发明中，步骤1)海州香薷花枝或/和叶片粉碎料与乙醇的重量体积比一般为1∶20～1∶30；铜耐性/富集植物海州香薷的特征精油组分是具有抑菌性能的脱氢香薷酮和香薷酮，这是由于种植在铜污染土壤的海州香薷花枝和叶片中铜含量及其精油中脱氢香薷酮含量远高于非铜污染土壤生长的海州香薷。本发明中，精油得率为石油醚萃取液干燥物的31.5％～43.5％，精油中GC/MS测出脱氢香薷酮相对含量为73.3％～74.2％，香薷酮相对含量为18.4％～18.6％。本发明制得的杀菌活性剂的抗菌活性测定，所选用的菌种可以是细菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，或者是植物病菌番茄枯萎病、芒果蒂腐病菌、茄腐镰刀病和水稻纹枯病菌。抗菌活性测定方法采用滤纸片平板抑菌圈直径测定法，方法是琼脂培养基高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后，冷却至50～60℃，无菌操作倾注于干热灭菌的直径9cm的培养皿内，厚度约0.5cm。待培养基冷却后，倒入1ml不同稀释度的菌悬液分别均匀涂布平板，在恒温生化培养箱内经35～37℃恒温培养24h。观察培养结果，找出长满整个培养皿且分布均匀的菌悬液浓度。用大号打孔器将普通分析滤纸制成直径为5mm的圆片，放入干燥洁净的试管内，经120℃干热灭菌4h，浸入本发明的杀菌活性剂溶液中。在烘箱上保持35～37℃烘干，并装入大烧杯，包上牛皮纸，在高压蒸汽灭菌锅内灭菌0.5h。用无菌吸管吸取已选定的适宜浓度的菌悬液1ml，加在已倒好且灭菌的平板皿培养基表面，涂抹均匀，用无菌镊子夹取已制备好的滤纸片，放在上述的含菌培养皿内，在恒温生物培养箱内经35～37℃恒温培养24h，取出，量取抑菌直径。本发明的杀菌活性剂对所测菌株，无论是大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，还是芒果蒂腐病菌或水稻纹枯病菌的生长都有抑制作用。本发明提取方法简单，制得的杀菌活性剂绿色环保，为纯天然植物源抗菌剂。不仅可以用于食品行业作为食品加工的防腐剂，抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长；而且可以服务于农业生产，防治芒果蒂腐病和水稻纹枯病的孳生。同时可实现种植在铜污染土壤的海州香薷植物的产后资源化利用，提高其经济价值。图1为实施例1水醇索氏提取后石油醚萃取液的精油总离子流图；图2为精油中脱氢香薷酮和香薷酮结构式及质谱图；图3为实施例4水醇室温浸提后石油醚萃取液的精油总离子流图。具体实施例方式以下结合实施例进一步说明本发明。实施例11)盛花期收获种植在铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷花枝和叶片，洗净、干燥、粉碎。称取160g花枝和叶片干粉原料置于3200mL浓度为95％乙醇溶液的索氏提取器中，回流提取至少9小时，至索氏提取器内的溶液澄清无色为止，得到的提取液；2)于20℃，0.08MPa下，真空浓缩提取液，然后用500mL石油醚萃取，至石油醚层澄清无色为止，得到石油醚萃取液，乙醇回收；3)于20℃，0.08MPa下，浓缩石油醚萃取液，干燥，石油醚回收。超临界CO2萃取石油醚萃取液的干燥物，得到精油，精油为黄色透明液体，干燥后，得率为石油醚萃取液干燥物的43.5％。超临界CO2萃取精油的条件为萃取温度45℃，萃取压力15MPa，CO2流量为27.9～28.6L/h，原料干粉投入量为200g/L。分离釜I压力8MPa、温度45℃；分离釜II压力5.5MPa、温度50.5℃。精油的总离子流图如图1所示，由图可见，精油中含有脱氢香薷酮和香薷酮，经GC/MS谱库检索得到脱氢香薷酮和香薷酮的相对含量分别为74.2％，18.6％；脱氢香薷酮和香薷酮的结构式和质谱图如图2所示。4)精油用乙醇配制成浓度为20mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。实施例2步骤1)、2)、3)同实施例1，精油用乙酸乙酯配制成浓度为20mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。实施例3步骤1)、2)、3)同实施例1，精油用石油醚配制成浓度为20mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。抗菌活性测定琼脂培养基高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后，冷却至50～60℃，无菌操作倾注于干热灭菌的直径9cm的培养皿内，厚度约0.5cm。待培养基冷却后，倒入1ml不同稀释度的菌悬液(菌株为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)，分别均匀涂布平板，在恒温生化培养箱内经35～37℃恒温培养24h。观察培养结果，找出长满整个培养皿且分布均匀的菌悬液浓度。用大号打孔器将普通分析滤纸制成直径为5mm的圆片，放入干燥洁净的试管内，经120℃干热灭菌4h，浸入本发明的杀菌活性剂溶液中。在烘箱上保持35～37℃烘干，并装入大烧杯，包上牛皮纸，在高压蒸汽灭菌锅内灭菌0.5h。用无菌吸管吸取已选定的适宜浓度的菌悬液1ml，加在已倒好且灭菌的平板皿培养基表面，涂抹均匀，用无菌镊子夹取已制备好的滤纸片，放在上述的含菌培养皿内，在恒温生物培养箱内经35～37℃恒温培养24h，取出，量取抑菌直径。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="784">试验菌株抑菌圈孔外毫米数a实施例1实施例2实施例3大肠杆菌12.511.211.6金黄色葡萄球菌5.65.25.0</table></tables>a为抑菌圈孔外毫米数，不包括滤纸片的直径(5mm)，每组试验重复三次。溶剂作为对照，其抑菌圈孔外毫米数为0.8～1.1。表1为实施例1-3的杀菌活性剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。对大肠杆菌而言，其抑菌圈孔外毫米数分别为11.2～12.5，对金黄色葡萄球菌而言，其抑菌圈孔外毫米数分别为5.0～5.6。实施例41)盛花期收获种植在铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷花枝和叶片，洗净、干燥、粉碎。称取500g花枝和叶片干粉原料置于5000mL浓度为75％乙醇中浸提至少7天，滤出提取液。残渣用回收的乙醇溶剂重提两次，滤出提取液。合并三次的提取液。2)于25℃，0.20MPa下，真空浓缩提取液，然后用500mL石油醚萃取，至石油醚层澄清无色为止，得到石油醚萃取液，乙醇回收；3)于25℃，0.20MPa下，浓缩石油醚萃取液，干燥，水蒸汽蒸馏石油醚萃取液的干燥物，得到精油。精油为黄色透明液体，干燥后，得率为石油醚萃取液干燥物的31.5％。精油的总离子流图如图3所示，由图可见，精油中含有脱氢香薷酮和香薷酮，经GC/MS谱库检索得到脱氢香薷酮和香薷酮的相对含量分别为73.3％，18.4％；脱氢香薷酮和香薷酮的结构式和质谱图如图2所示。4)精油用乙醇配制成浓度为10mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。实施例5步骤1)、2)、3)同实施例4，精油用乙酸乙酯配制成浓度为10mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。实施例6步骤1)、2)、3)同实施例4，精油用石油醚配制成浓度为10mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。抗菌活性测定琼脂培养基高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后，冷却至50～60℃，无菌操作倾注于干热灭菌的直径9cm的培养皿内，厚度约0.5cm。待培养基冷却后，倒入1ml不同稀释度的菌悬液(菌株为番茄枯萎病、芒果蒂腐病、茄腐镰刀病、水稻纹枯病)，分别均匀涂布平板，在恒温生化培养箱内经35～37℃恒温培养24h。观察培养结果，找出长满整个培养皿且分布均匀的菌悬液浓度。用大号打孔器将普通分析滤纸制成直径为5mm的圆片，放入干燥洁净的试管内，经120℃干热灭菌4h，浸入本发明的杀菌活性剂溶液中。在烘箱上保持35～37℃烘干，并装入大烧杯，包上牛皮纸，在高压蒸汽灭菌锅内灭菌0.5h。用无菌吸管吸取已选定的适宜浓度的菌悬液1ml，加在已倒好且灭菌的平板皿培养基表面，涂抹均匀，用无菌镊子夹取已制备好的滤纸片，放在上述的含菌培养皿内，在恒温生物培养箱内经35～37℃恒温培养24h，取出，量取抑菌直径。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="784">试验菌株抑菌圈孔外毫米数a实施例4实施例5实施例6番茄枯萎病1.51.41.2芒果蒂腐病6.36.26.0茄腐镰刀病2.22.02.0水稻纹枯病5.95.85.6</table></tables>a为抑菌圈孔外毫米数，不包括滤纸片的直径(5mm)，每组试验重复三次。溶剂作为对照，其抑菌圈孔外毫米数为0.8～1.1。表2为实施例4-6的杀菌活性剂对番茄枯萎病、芒果蒂腐病、茄腐镰刀病、水稻纹枯病的抑菌效果。对芒果蒂腐病而言，其抑菌圈孔外毫米数分别为6.0～6.3，对水稻纹枯病而言，其抑菌圈孔外毫米数分别为5.6～5.9。权利要求1.从种植于铜污染土壤的海州香薷中提取杀菌活性剂的方法，其特征是包括以下步骤1)盛花期收获种植在铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷花枝或/和叶片，洗净、干燥、粉碎，将粉碎后的花枝或/和叶片用浓度为75％～100％乙醇进行索氏提取，获取提取液；或者将粉碎后的花枝或/和叶片用浓度为75％～100％乙醇室温浸提，获取提取液；2)于18～25℃，0.08～0.20MPa下，真空浓缩提取液，然后用石油醚萃取，得到石油醚萃取液，石油醚的用量为提取液的0.1～0.3倍；3)于18～25℃，0.08～0.20MPa下，浓缩石油醚萃取液，干燥，然后用水蒸汽蒸馏或超临界CO2萃取，得到黄色透明的精油；4)精油用乙醇、乙酸乙酯或石油醚配制成浓度为10～25mg/mL的溶液，得到杀菌活性剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤1)中海州香薷花枝或/和叶片粉碎料与乙醇的重量体积比为1∶20～1∶30。全文摘要本发明涉及从种植于铜污染土壤的海州香薷中提取杀菌活性剂的方法。步骤如下盛花期收获种植在铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷花枝或/和叶片，洗净、干燥、粉碎后，用乙醇进行索氏提取或室温浸提，获取提取液；浓缩提取液，用石油醚萃取，再浓缩、干燥、水蒸汽蒸馏或超临界CO文档编号A01P3/00GK1813544SQ20061004961公开日2006年8月9日申请日期2006年2月27日优先权日2006年2月27日发明者彭红云,石伟勇,杨肖娥,吴龙华申请人:浙江大学