神经营养性藤霉素类似物的制作方法
专利名称：神经营养性藤霉素类似物的制作方法
发明
背景技术：
领域本发明涉及一种具有高水平神经营养活性和低水平免疫抑制活性的藤霉素衍生物。
背景讨论某些大环内酯类化合物，例如藤霉素及其相关的化合物，已知被用来帮助预防或治疗脑局部缺血(WO94/14443)。与FKBP-型免疫亲和蛋白具有亲和力的特定的哌啶酸衍生物，例如藤霉素，已知被用来刺激受损的外周神经生长或促进神经元的再生(WO96/40140)。某些非免疫抑制化合物，也就是格尔德霉素和它的类似物，显示有破裂类固醇受体复合物和促进神经生长的作用(WO99/21552)。
发明概述本发明的发明人发现特定的藤霉素类似物，也就是下面提及的化合物(I)，具有极好的神经营养活性，但是与藤霉素不同的是它没有或只有很低的免疫抑制活性。如下所示，与藤霉素相比较化合物(I)具有更强的神经营养活性，例如，这一点通过衡量它们增加神经突长度的能力即可知。相似的，化合物(I)的给药显示有诱导轴突再生和加速神经挤压或脊髓损伤的恢复。而且，与藤霉素相比，化合物(I)在发挥这些有利的神经营养作用时没有或只有很低的免疫抑制活性。
相应地，本发明提供了化合物(I)作为一种极好的神经营养剂，同时也是一种没有或只有很低的免疫抑制作用的神经营养剂的新用途。
进一步地，本发明提供了一种含有化合物(I)的神经营养剂或组合物。
更进一步地，本发明提供一种预防或治疗神经元损伤/功能障碍的方法，该方法包括向哺乳动物施用化合物(I)。
发明详述出乎意料的，本发明的发明人已经发现化合物(I)可以用来改善，预防或治疗由神经系统损害或损伤、退化或疾病引起的神经学上的损伤或功能障碍，然而，有利的是其没有或只有很低的免疫抑制作用。
化合物(I)用于治疗由于物理损伤、营养紊乱、局部缺血、变性疾病、恶性病、感染性疾病引起的和由药物相互作用、毒素或毒物引起的损害，退化或功能障碍。例如，化合物(I)用来治疗由神经外科、外周神经损伤、烧伤、脑脊髓炎、HIV、疱疹、癌症、放射治疗、药物相互作用、叶酸或维生素B-12缺乏和通过暴露在神经毒素或化学物质如铅所引起的神经学上的损害或功能障碍。
相应地，化合物(I)用于预防或治疗神经元损伤和功能障碍，例如多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，神经病(例如糖尿病性神经变，化疗导致的神经病等等)，脊髓损伤，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪等等。
化合物(I)，即本发明中使用的藤霉素类似物，具有如下化学结构式 这一化合物可以按照美国专利5376663，实施例29描述的方法来制备。关于本发明中使用的化合物(I)，应该理解其也会有构象异构体和一种或多种立体异构体，例如由于不对称的碳原子或双键导致的光学的或几何学的异构体，这些构象异构体和立体异构体也包括在本发明要求保护的化合物的范围内。
化合物(I)也可以以药学上可接受的盐、衍生物、溶剂化物或前药的形式存在，所有这些都包括在本发明要求保护的范围内。溶剂化物优选的包括一种水合物和一种乙醇盐。
化合物(I)的一种优选形式如下 本发明中的化合物(I)可以以纯的化合物的形式或以与另一化合物或其它成分(优选的是一种药学介质或载体)形成的混合物的形式给药。当化合物(I)以一种药物制剂或组合物的形式使用时，它可以与一种适于外部的(局部的)、口服的、肠的、皮下的、静脉内的、肌肉的或肠胃外应用的有机或无机载体、介质或附形剂混合。例如，它可以以固体、半固体或液体组合物的形式存在，这些组合物包括作为活性成分的化合物(I)和一种或多种载体、介质或赋形剂。典型的载体、介质或赋形剂包括，但不限于常规药物载体，医学的或制药学上的试剂，缓冲剂，分散剂，乳化剂和佐剂。
化合物(I)也可以和常见的无毒的用于片剂、丸剂、胶囊、滴眼液、栓剂、溶液(例如盐水)、乳剂、混悬剂(例如橄榄油)、软膏、气溶胶、喷雾剂、乳膏、皮肤膏药、贴片和其它适于使用的这些药学上可接受的载体混合。
合适的载体包括水，盐水，右旋糖溶液和油。油包括动物油，植物油，合成油和石油产品。其它有用的载体包括葡萄糖，乳糖，阿拉伯树胶，明胶，甘露醇，淀粉糊，三硅酸镁，滑石粉，玉米淀粉，角蛋白，硅胶，马铃薯淀粉，尿素和其它适用于生产固体、半固体或液体形式的制剂的载体。另外，辅料，稳定剂，乳化剂，增稠剂，着色剂，调味剂也可以使用。
化合物(I)以有效量包含在药物组合物中，此剂量对特定的疾病过程或状况能产生想要的效果。优选的，化合物以足够提供一种神经营养作用或刺激神经细胞增长的量包含在药物组合物中。
可以利用本发明的方法来治疗的哺乳动物包括畜牧哺乳动物例如母牛，马，猪等；家养动物例如狗，猫，大鼠，小鼠，兔，仓鼠等，灵长类动物和人类。
包含化合物1的产品或组合物向人类给药时优选的给药或应用方式包括注射或口服给药。
尽管化合物(I)的治疗有效量或剂量会在各人病人之间不同，并且治疗有效量和剂量也依赖于每个被治疗的个体病人的年龄和状况，通常用来给予治疗疾病的活性成分日剂量范围为约0.0001-1000mg，优选为0.001-500mg，更优选为0.01-100mg，通常给药的平均单剂量是约0.001-0.01mg，0.2-0.5mg，1mg，5mg，10mg，50mg，100mg，250mg和500mg。人类长期用药的日剂量为约0.1-30mg/kg/日。化合物(I)也可以同时地、独立地或序贯地和其它具有神经营养的或神经细胞生长刺激活性的试剂一起使用。
本发明中的药物组合物可以周期性地给予需要这种治疗的哺乳动物的受试者(例如，人类患者)，来促进神经元再生、功能恢复和刺激神经突长出，因此，来治疗各种的神经病理学的状态，这些神经病理学状态包括外周神经损伤和由于物理损伤(例如脊髓损伤和创伤，坐骨神经或面神经病变或损伤，截断后的肢移植)所致的中枢神经系统损伤；疾病(例如糖尿病性神经变)；癌症化疗(例如丙烯酰胺，紫杉醇，长春碱和阿霉素引起的神经病)；与脑梗塞、出血梗塞等相关的后遗症如语无伦次(例如发音异常)，意识模糊，运动功能障碍等；和神经障碍，包括但不限于，各种的外周神经病性的和神经学上的障碍，包括但不限于三叉神经痛，舌咽神经痛，贝耳氏麻痹，重症肌无力，肌肉萎缩，肌萎缩性侧索硬化，进行性肌萎缩，进行性延髓性遗传的肌萎缩，疝气，破裂的或下垂的椎间盘综合症，颈椎强直，神经丛疾病，胸廓出口破坏综合症，外周神经病例如那些由铅，丙烯酰胺，γ-二酮(glue-sniffer’s神经病)，二硫化碳，氨苯砜，蜱引起的外周神经病，卟啉症，急性感染性多神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病和亨廷顿氏舞蹈病。
外周神经或脊髓损伤的横断可以通过给予哺乳动物一种神经生长刺激量的试剂和给外周神经或脊髓移植一种神经移植物例如一种同种异体移植物(Osawa等，J.Neurocytol.19833-849，1990；Buttemeyer等，Ann.Plastic Surgery 35396-401，1995)或一种人工神经移植物(Madison and Archibald，Exp.Neurol.128266-275，1994；Wells等，Exp.Neurol.146395-402，1997)而进行治疗。外周神经或脊髓的横断末端之间的空间优选用一种非细胞的间隙填充材料，如胶原、甲基纤维素等来填充，或用促进神经细胞生长的细胞如施旺氏细胞(Xu等.，J.Neurocytol.261-16，1997)，嗅觉细胞和外鞘(sheathing)细胞的混悬液来填充。神经生长促进剂可以和这些细胞或非细胞间隙填充物质包含在一起，或在神经移植过程之前、之中或之后全身给药。
尤其，化合物(I)用来治疗或预防神经元的损伤/功能障碍，多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪或脊髓损伤。
接下来的实施例更详细地说明了本发明。应该认为这些实施例描述了本发明的某些方面或具体情况，但是无意于限制本发明的范围。
实施例1利用化合物(I)的处理显著地增加了海马神经元的神经突长度细胞培养物的制备按照Banker and Cowan(Brain Research，1977，126397-425)，胚胎的海马神经元得自在胚胎第18.5天(＂E18.5＂)的幼鼠。简单而言，取出海马区域，切碎，并在37℃在100I.U.木瓜蛋白酶中孵育45分钟，细胞被混悬在完全神经元培养基中不含L-谷氨酰胺的基本必需培养基(GIBCO，Grand Island，NY)，高葡萄糖基本必需培养基的1.5ml/100ml培养基(GIBCO)，血清增容剂(extender)的0.1ml/100ml培养基(Hito+Tm；Collaborative Research Inc，Lexington，MA)，谷氨酰胺(GIBCO)，5％胎牛血清(GIBCO)。
细胞被接种在聚L-赖氨酸包被的盖玻片上(500细胞/盖玻片)。盖玻片被倒置在预先包被了单层皮质的星形细胞的器皿上。
海马神经元的轴突长度的分析对海马神经元(通过它们特定的极性和树突来鉴定)每天进行检查和在72小时内随机照相(9-12帧/盖玻片)，轴突(定义为最长的突起)长度通过照相的印迹来测量，这一照相的印迹是利用与具有一个合适的软件(Bioquant IV，R & M Biometrics，Nashville，TN)的一台IBM XT计算机相连的Houston Instrument HI-PAD数字化图像输入板得到的。只测量到了细胞体长度的三倍以上。从同等处理过的盖玻片(每组三或四个)获得的数据之间没有差异，因此将它们结合起来。计算平均值并利用单向(化合物(Ia)或藤霉素处理组对一未处理对照组)方差分析来比较，然后进行Newman-Kuels多组比较检验(WINKS4.62专业版)。
结果在72小时时，未处理对照组和10nM藤霉素处理组之间没有显著性差异。然而，10nM浓度的化合物(Ia)治疗组在神经突长度方面表现出了一个统计学上的显著的增长。见下面表I中的结果表172小时时化合物(Ia)和藤霉素对大鼠原代海马细胞培养物平均神经突长度的影响
*与未处理组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例2利用化合物(I)的处理增加了SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞的平均神经突长度SH-SYSY成神经细胞瘤细胞培养物的制备
SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞在37℃，7％CO2条件下维持在添加有10％胎牛血清(SIGMA)，50I.U./ml青霉素和50μg/ml链霉素(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)中。将细胞以15000细胞/孔铺于六孔平板中并用0.4μM阿非笛霉素(SIGMA)处理。第五天，冲洗细胞并用存在或不存在藤霉素(10nM)或化合物(Ia)(1nM)的10ng/ml神经生长因子(NGF)处理(来诱导突起长出)。培养基在96小时后更换，用新的培养基来替代再放置72小时(总时间，168小时)。在所有的试验中使用双份的孔，数据是每一处理组的平均数据。
SH-SYSY成神经细胞瘤细胞神经突长度分析为了分析突起的长度，在168小时时随机给细胞(20个视野/孔)照相。神经突长度通过一个照相的印迹来衡量，这一照相的印迹是利用与具有一个合适的软件(Bioquant IV，R & M Biometrics，Nashville，TN)的一台IBM XT计算机相连的Houston InstrumentHI-PAD数字化图像输入板得到的。只测量到了那些细胞体长度两倍以上的突起。从同等处理过的孔中得到的数据之间没有差异，因此将它们结合起来。计算平均值并利用单向的(化合物(Ia)或藤霉素处理的样品对只用NGF处理过的样品)方差分析来比较平均值，然后进行Newman-Kuels多组比较检验(WINKS4.62专业版)。
结果神经突突起长度的测量值显示，与单独用NGF(10ng/ml)相比在168小时时化合物(Ia)(1nM)和藤霉素(10nM)都显著地增加了轴突突起的长度。然而，与NGF联合的1nM化合物(Ia)的作用高于与NGF联合的10nM藤霉素的作用。
表2在168小时时化合物(Ia)和藤霉素对SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞平均神经突长度的影响
*与NGF组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例3利用化合物(I)的处理促进了大鼠坐骨神经挤压模型的功能恢复动物和手术程序用2％的卤烷麻醉9只6周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠，暴露右侧的坐骨神经，在臀部水平的位置将神经挤压两次(总共60s利用一个7号Dumont jeweler′s钳)。挤压部位通过将一根无菌的9-O缝合线穿过神经外膜的鞘来标记。
化合物(Ia)的制备和给药将化合物(Ia)溶解在包含30％二甲亚砜(DMSO)70％盐水的介质中。给三只接受过轴突显微外科术的大鼠每天皮下注射化合物(Ia)(1或5mg/kg)或相等量的介质(包含30％DMSO的盐水)(5ml/kg)。
行为的评定每天检验动物直到灌注日(第18天)。下面的半定量等级通常用来评价动物的功能恢复。
0当走路时瘫痪并有脚翻转和脚趾弯曲；1正确控制脚并移动脚趾的能力；2能够持续地用脚走路；3在走路时证明脚趾能伸展；4抬起脚后跟走路并显示接近正常的脚趾伸展。
证明中间能力的动物给予部分分数+，0.25；++，0.5；+++，0.75。
组织固定和制备神经挤压18天后，用4％的卤烷深度麻醉大鼠，肝素化并用在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的4％的多聚甲醛灌注10s，接下来用在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的5％的戊二醛(1L)灌注，然后在4℃固定24小时。在坐骨神经上距粉碎位置已知距离(5mm)处取组织样品。在目前的研究中，只报导了从供给比目鱼肌的后胫神经分枝中得到的数据。组织被放置在0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.4)中，用1％四氧化锇(在0.1M磷酸缓冲液中)后固定2.5小时，用乙醇脱水并包埋在塑料中。半薄切片用乙酸铀酯和柠檬酸铅染色，安装在薄膜支持的75目格，并用JEOL 100 CX电子显微镜检查。
形态分析轴突管径的分析在比目鱼肌神经上进行。再生的有髓鞘的轴突的数目用电子显微镜来计算。计算介质处理组，化合物(Ia)(1mg/kg)处理组和化合物(Ia)(5mg/kg)处理组的平均值和标准差。
统计学分析对于行为的分析，用单向的方差分析来比较功能恢复的平均值，然后进行Newman-Kuels多组比较检验来比较各个值。至于形态分析，用单向的方差分析来比较轴突数目的平均值，然后进行Newman-Kuels多组检验来比较各个值。
结果功能恢复在15-17天观察到了功能恢复，并且1mg/kg处理组大鼠和5mg/kg处理组大鼠的功能恢复都比介质处理组大鼠的功能恢复出现的早。见下面的表3。
表3化合物(Ia)在大鼠坐骨神经损伤功能恢复中的作用
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)电子显微镜检查动物的形态学检查在轴突显微外科术后第18天进行。
每神经面积(5,000μm2)中再生的有髓鞘的轴突的数目产生显著增长，从介质处理组大鼠的5.5±2.7(平均值±SEM)到1和5mg/kg处理组大鼠的19±2.4和20±2.9，各自(P＜0.05)。见下面表4。
表4化合物(Ia)在大鼠坐骨神经粉碎后18天时对比目鱼肌神经每神经面积(5,000μm2)的再生的有髓鞘轴突数目的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例4用化合物(I)的处理促进了大鼠脊髓损伤模型中的功能恢复(1)方法动物和外科程序用2％的卤烷麻醉28只六星期大的雄性Sprague-Dawley大鼠，在T10/T11进行椎板切除术并在脊髓T10/T11水平进行脊髓半切损害。
化合物(Ia)的制备和给药将化合物(Ia)溶解在包含30％二甲亚砜(DMSO)70％盐水的介质中。在手术后7个星期内脊髓损伤的大鼠每天接受皮下注射化合物(Ia)(2mg/kg)或相等体积的介质(含30％DMSO的盐水)(5ml/kg)。
功能恢复的评价利用一个改进的Tarlov/Klinger等级、狭窄横梁试验和脚印试验在损害后2周来评价功能恢复。
A.改进的Tarlov/Klinge等级让大鼠在一片开放的场地中自由活动1分钟并用下面提供的等级0-6来评定。
0受损的后肢没有运动；1受损的后肢几乎没有可察觉的运动；2受损的后肢关节(臀，膝或踝)有活跃的运动但是不协调，不能支撑重量；
3受损的后肢有交替的行走并有推进的运动，不能支撑重量；4受损的后肢可支撑重量；5只有微小的不足的行走；6正常行走B.狭窄横梁试验大鼠在宽度递减的木制横梁(1.5m长)上测试，宽度分别为7.7cm，4.7cm，2.7cm和1.7cm。让大鼠在木条上行走，记录它们可以不滑倒地以至少两个轨道行走的最窄木条。
0不能在任何一个横梁上行走；1可以在7.7cm宽的横梁上行走；2可以在4.7cm宽的横梁上行走；3可以在2.7cm宽的横梁上行走；4可以在1.7cm宽的横梁上行走；C.脚印试验将大鼠的后肢沾上墨水并将脚印印在一张覆盖在60cm长和7.5cm宽的狭窄跑道上的纸上。一系列至少6个连续等级通常被用来确定5-点脚印分值。
0持续的背侧的走步或后肢拖动，例如，不可见脚印1有可见的至少3个脚印中至少3个脚趾的脚趾印2与它自己的基线值相比显示多于两倍值的脚的外或内旋转3除了脚旋转外没有脚趾拖动的印记4未显示内或外旋转印记(小于两倍的基线值角)，但可见多于一个的脚后跟印5未见脚后跟印统计分析对于行为的分析，用单向的方差分析来比较每一功能试验分值的平均值，然后进行Newman-Kuels多组比较检验来比较各个值。
结果功能恢复利用改进的Tarlov/Klinger等级(表5)，横梁行走试验(表6)和脚印试验(表7)来进行所有三项功能恢复测量。在改进的Tarlov/Klinger等级(表5)，横梁行走试验(表6)和脚印试验(表7)中化合物(Ia)改善了运动功能损伤。
表5化合物(Ia)对大鼠脊髓损伤的改进的Tarlov/Klinger分数的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)表6化合物(Ia)对大鼠脊髓损伤的横梁行走分数的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)表7化合物(Ia)对大鼠脊髓损伤的脚印分数的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例5化合物(Ia)与FKBP12结合，但是与藤霉素不同的是它不发挥或只发挥很少的免疫抑制作用(1)与FKBP12的结合试验结合试验按照Tamura，K.等(Biochemical arid BiophysicalResearch Communications，Vol.202，No.1，437-499，1994)的相似方式进行。结果在表8中列出。
(2)混合的淋巴细胞反应(MLR)MLR试验按照美国专利US4929611的相似方式进行。
结果在表8中列出。
表8化合物(Ia)和藤霉素体外实验的药理学特性
上面的结论显示化合物(Ia)没有免疫抑制活性，但是它可以和FKBP12结合。
上面显示的结果说明化合物(I)在体外和体内模型中都有有效的神经营养作用。在两个细胞培养模型中，化合物(I)甚至在低浓度也增加了神经突的生长。而且，在低剂量将化合物(I)全身给药通过增加坐骨神经的神经突再生速率和促进脊髓损伤的功能恢复加速了神经挤压损害后的功能恢复。
此外，如上所示，化合物(I)提供了一种有效的神经营养的或刺激神经细胞生长的活性，但是，它没有免疫抑制活性。相应的，本发明提供一种有用的神经营养剂用来刺激或促进神经元生长或再生，特别是当一种免疫抑制作用是不利的或不需要的时候。
本发明的其它方面包括一件制品，包括包装材料和包含在所述包装材料中的上面确定的化合物(I)，其中所述的化合物(I)是预防或治疗神经元功能障碍的治疗有效量的，并且其中的包装材料包括一个标签或书面材料，此材料指出化合物(I)能或应当用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
一种商业药包，包含含有上面确定的化合物(I)的药物组合物和一个所附带的书面材料，其中书面材料表明化合物(I)可以或应该用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
一种组合物，例如包含用化合物(I)处理过的细胞的一种细胞混悬液，组织或移植物。这些组合物用来修复神经系统损伤。这些组合物也可以包括其他对神经细胞生长刺激剂，例如促进或辅助神经细胞生长的其它类型的细胞混悬液，例如产生髓磷脂的细胞如施旺氏细胞或少突细胞，神经胶质细胞和鞘细胞；细胞外的基质物质，如胶原；或其它特异性的神经调节剂如细胞因子，促有丝分裂因子，免疫亲和蛋白和神经营养物质如NGF-1，BDNF，CNTF，NT-3，NT-4和NT-5。
移植物例如自体移植物，同种异体移植物或异种移植物也可以用化合物(I)来处理以促进神经元生长，用作移植物和用作其它应用。
引入的参考此处公开所引用或提及的每篇文献，专利申请或专利公开的内容都是将它们的全文引入作为参考。此申请要求优先权的任何专利文献的内容也是将它们的全文引入作为参考。特别的，美国临时申请No.60/258,500的内容引入作为参考。
修改和其它实施方案显然，根据上述的教导本发明的大量的修改和变化都是可能的。因此应该理解在所附的权利要求的范围内，除了此处明确描述过的其它的内容本发明也可以实施。所述的组合物和方法及本发明的概念的各种的修改和变化在不偏离本发明的范围和精神的条件下对本领域技术人员来说是显而易见的。虽然上面已经用特别优选的实施方案描述了发明，应该理解所要求保护的发明不是有意限于这些特定的实施方案。用来实施本发明的所述模式的各种修改对于医学，生物学，化学或药理学科或相关领域的技术人员来说是显而易见的，也包括在本发明的范围内。
权利要求
1.下式化合物在制备神经营养剂中的应用
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经营养剂用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经营养剂用来刺激或促进神经细胞生长或再生。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经营养剂用来促进神经损伤的功能恢复。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经元损伤/功能障碍是多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪或脊髓损伤。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经元损伤/功能障碍是阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病或脊髓损伤。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于化合物(I)以它的药学可接受的盐，衍生物，前药或溶剂化物的形式存在。
8.一种组合物，包括具有下面结构式的化合物(I)
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于化合物(I)以它的药学可接受的盐，衍生物，前药或溶剂化物的形式存在。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于化合物(I)以化合物(Ia)的形式存在。
11.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于其进一步包含至少一种其它的神经营养剂。
12.一种制品或试剂盒，包括包装材料和包含在所述包装材料中的化合物(I)，其中所述的包装材料包括一个标签或一个书面材料，它指出所述化合物(I)可以或应当用来预防，改善或治疗神经元损伤/功能障碍。
13.一个商业药包或试剂盒，包括含有化合物(I)的药物组合物和所附带的书面材料，其中该书面材料指出化合物(I)可以或应当用来预防，改善或治疗神经元损伤/功能障碍。
14.一种制备或制造神经营养剂的方法，包括将化合物(I)与一种药学上可接受的载体、介质或赋形剂混合。
15.一种预防，改善或治疗神经元损伤/功能障碍的方法，包括给需要的受试者施用有效量的化合物(I)。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述的受试者为哺乳动物。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述的受试者为人。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述的神经元损伤/功能障碍是多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪或脊髓损伤。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于神经元损伤/功能障碍是阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病或脊髓损伤。
20.一种刺激或促进神经细胞生长或再生的方法，包括将神经细胞与化合物(I)相接触。
21.一种增加轴突生长或再生速度或神经细胞长度的方法，包括将神经细胞与化合物(I)相接触。
22.一种在需要其的组织中增加神经细胞生长的方法，包括将化合物(I)施用于所述组织。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述组织选自脑组织，脊髓组织或外周神经组织。
24.一种促进神经损伤功能恢复的方法，包括给需要的对象施用有效量的化合物(I)。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于神经损伤选自烧伤，创伤，机械损伤，手术损伤，生理学损伤，病理学损伤和免疫学损伤。
26.一种修补横切的外周神经或脊髓的方法，包括将所述外周神经或脊髓的横切的末端与有效量的化合物(I)相接触。
27.一种修复受试者中横切的外周神经或脊髓的方法，包括给所述受试者施用神经生长刺激量的化合物(I)和移植给外周神经或脊髓。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述移植物为一种同种异体移植物。
29.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述移植物为一种人工神经移植物。
30.根据权利要求27所述的方法，其特征在于进一步包含用一种非细胞的间隙填充材料来填充外周神经或脊髓的横切的末端间的空间。
31.根据权利要求27所述的方法，其特征在于进一步包含用一种细胞混悬液来填充外周神经或脊髓的横切的末端间的空间。
32.一种组合物，包含用化合物(I)处理的一种神经细胞。
33.一种组织，包含用化合物(I)处理的一种神经细胞。
34.一种移植物，包含用化合物(I)处理的一种神经细胞。
35.根据权利要求34所述的移植物，其特征在于所述的移植物是一种自体移植物，同种异体移植物或异种移植物。
36.一种促进神经损伤功能恢复的方法，包括向需要的受试者施用有效量的包含用化合物(I)处理过的细胞的一种组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于神经损伤选自烧伤，外伤，机械损伤，外科手术损伤，生理学损伤，病理学损伤和免疫学损伤。
38.一种修补横切的外科神经或脊髓的方法，包括将所述外周神经或脊髓的横切的末端与有效量的包含用化合物(I)处理过的细胞的一种组合物相接触。
39.一种组合物，包含一种用化合物(I)处理过的细胞、组织或移植物和至少一种神经细胞生长促进剂。
40.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于所述的神经生长促进剂选自一种促进神经的生长的细胞混悬液、一种非细胞的间隙填充材料或一种神经生长因子。
41.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于其包含作为神经生长促进剂的胶原或甲基纤维素。
42.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于其包含作为神经生长促进剂的一种细胞混悬液。
全文摘要
具有高水平的神经营养活性和低水平的免疫抑制活性的藤霉素衍生物。这些化合物用作神经营养剂，特别是用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
文档编号A61P21/00GK1538843SQ01822886
公开日2004年10月20日 申请日期2001年12月31日 优先权日2000年12月29日
发明者松冈信也, 山路隆之, 布鲁斯·戈尔德, 戈尔德, 之 申请人:藤泽药品工业株式会社
发明
背景技术：
领域本发明涉及一种具有高水平神经营养活性和低水平免疫抑制活性的藤霉素衍生物。
背景讨论某些大环内酯类化合物，例如藤霉素及其相关的化合物，已知被用来帮助预防或治疗脑局部缺血(WO94/14443)。与FKBP-型免疫亲和蛋白具有亲和力的特定的哌啶酸衍生物，例如藤霉素，已知被用来刺激受损的外周神经生长或促进神经元的再生(WO96/40140)。某些非免疫抑制化合物，也就是格尔德霉素和它的类似物，显示有破裂类固醇受体复合物和促进神经生长的作用(WO99/21552)。
发明概述本发明的发明人发现特定的藤霉素类似物，也就是下面提及的化合物(I)，具有极好的神经营养活性，但是与藤霉素不同的是它没有或只有很低的免疫抑制活性。如下所示，与藤霉素相比较化合物(I)具有更强的神经营养活性，例如，这一点通过衡量它们增加神经突长度的能力即可知。相似的，化合物(I)的给药显示有诱导轴突再生和加速神经挤压或脊髓损伤的恢复。而且，与藤霉素相比，化合物(I)在发挥这些有利的神经营养作用时没有或只有很低的免疫抑制活性。
相应地，本发明提供了化合物(I)作为一种极好的神经营养剂，同时也是一种没有或只有很低的免疫抑制作用的神经营养剂的新用途。
进一步地，本发明提供了一种含有化合物(I)的神经营养剂或组合物。
更进一步地，本发明提供一种预防或治疗神经元损伤/功能障碍的方法，该方法包括向哺乳动物施用化合物(I)。
发明详述出乎意料的，本发明的发明人已经发现化合物(I)可以用来改善，预防或治疗由神经系统损害或损伤、退化或疾病引起的神经学上的损伤或功能障碍，然而，有利的是其没有或只有很低的免疫抑制作用。
化合物(I)用于治疗由于物理损伤、营养紊乱、局部缺血、变性疾病、恶性病、感染性疾病引起的和由药物相互作用、毒素或毒物引起的损害，退化或功能障碍。例如，化合物(I)用来治疗由神经外科、外周神经损伤、烧伤、脑脊髓炎、HIV、疱疹、癌症、放射治疗、药物相互作用、叶酸或维生素B-12缺乏和通过暴露在神经毒素或化学物质如铅所引起的神经学上的损害或功能障碍。
相应地，化合物(I)用于预防或治疗神经元损伤和功能障碍，例如多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，神经病(例如糖尿病性神经变，化疗导致的神经病等等)，脊髓损伤，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪等等。
化合物(I)，即本发明中使用的藤霉素类似物，具有如下化学结构式 这一化合物可以按照美国专利5376663，实施例29描述的方法来制备。关于本发明中使用的化合物(I)，应该理解其也会有构象异构体和一种或多种立体异构体，例如由于不对称的碳原子或双键导致的光学的或几何学的异构体，这些构象异构体和立体异构体也包括在本发明要求保护的化合物的范围内。
化合物(I)也可以以药学上可接受的盐、衍生物、溶剂化物或前药的形式存在，所有这些都包括在本发明要求保护的范围内。溶剂化物优选的包括一种水合物和一种乙醇盐。
化合物(I)的一种优选形式如下 本发明中的化合物(I)可以以纯的化合物的形式或以与另一化合物或其它成分(优选的是一种药学介质或载体)形成的混合物的形式给药。当化合物(I)以一种药物制剂或组合物的形式使用时，它可以与一种适于外部的(局部的)、口服的、肠的、皮下的、静脉内的、肌肉的或肠胃外应用的有机或无机载体、介质或附形剂混合。例如，它可以以固体、半固体或液体组合物的形式存在，这些组合物包括作为活性成分的化合物(I)和一种或多种载体、介质或赋形剂。典型的载体、介质或赋形剂包括，但不限于常规药物载体，医学的或制药学上的试剂，缓冲剂，分散剂，乳化剂和佐剂。
化合物(I)也可以和常见的无毒的用于片剂、丸剂、胶囊、滴眼液、栓剂、溶液(例如盐水)、乳剂、混悬剂(例如橄榄油)、软膏、气溶胶、喷雾剂、乳膏、皮肤膏药、贴片和其它适于使用的这些药学上可接受的载体混合。
合适的载体包括水，盐水，右旋糖溶液和油。油包括动物油，植物油，合成油和石油产品。其它有用的载体包括葡萄糖，乳糖，阿拉伯树胶，明胶，甘露醇，淀粉糊，三硅酸镁，滑石粉，玉米淀粉，角蛋白，硅胶，马铃薯淀粉，尿素和其它适用于生产固体、半固体或液体形式的制剂的载体。另外，辅料，稳定剂，乳化剂，增稠剂，着色剂，调味剂也可以使用。
化合物(I)以有效量包含在药物组合物中，此剂量对特定的疾病过程或状况能产生想要的效果。优选的，化合物以足够提供一种神经营养作用或刺激神经细胞增长的量包含在药物组合物中。
可以利用本发明的方法来治疗的哺乳动物包括畜牧哺乳动物例如母牛，马，猪等；家养动物例如狗，猫，大鼠，小鼠，兔，仓鼠等，灵长类动物和人类。
包含化合物1的产品或组合物向人类给药时优选的给药或应用方式包括注射或口服给药。
尽管化合物(I)的治疗有效量或剂量会在各人病人之间不同，并且治疗有效量和剂量也依赖于每个被治疗的个体病人的年龄和状况，通常用来给予治疗疾病的活性成分日剂量范围为约0.0001-1000mg，优选为0.001-500mg，更优选为0.01-100mg，通常给药的平均单剂量是约0.001-0.01mg，0.2-0.5mg，1mg，5mg，10mg，50mg，100mg，250mg和500mg。人类长期用药的日剂量为约0.1-30mg/kg/日。化合物(I)也可以同时地、独立地或序贯地和其它具有神经营养的或神经细胞生长刺激活性的试剂一起使用。
本发明中的药物组合物可以周期性地给予需要这种治疗的哺乳动物的受试者(例如，人类患者)，来促进神经元再生、功能恢复和刺激神经突长出，因此，来治疗各种的神经病理学的状态，这些神经病理学状态包括外周神经损伤和由于物理损伤(例如脊髓损伤和创伤，坐骨神经或面神经病变或损伤，截断后的肢移植)所致的中枢神经系统损伤；疾病(例如糖尿病性神经变)；癌症化疗(例如丙烯酰胺，紫杉醇，长春碱和阿霉素引起的神经病)；与脑梗塞、出血梗塞等相关的后遗症如语无伦次(例如发音异常)，意识模糊，运动功能障碍等；和神经障碍，包括但不限于，各种的外周神经病性的和神经学上的障碍，包括但不限于三叉神经痛，舌咽神经痛，贝耳氏麻痹，重症肌无力，肌肉萎缩，肌萎缩性侧索硬化，进行性肌萎缩，进行性延髓性遗传的肌萎缩，疝气，破裂的或下垂的椎间盘综合症，颈椎强直，神经丛疾病，胸廓出口破坏综合症，外周神经病例如那些由铅，丙烯酰胺，γ-二酮(glue-sniffer’s神经病)，二硫化碳，氨苯砜，蜱引起的外周神经病，卟啉症，急性感染性多神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病和亨廷顿氏舞蹈病。
外周神经或脊髓损伤的横断可以通过给予哺乳动物一种神经生长刺激量的试剂和给外周神经或脊髓移植一种神经移植物例如一种同种异体移植物(Osawa等，J.Neurocytol.19833-849，1990；Buttemeyer等，Ann.Plastic Surgery 35396-401，1995)或一种人工神经移植物(Madison and Archibald，Exp.Neurol.128266-275，1994；Wells等，Exp.Neurol.146395-402，1997)而进行治疗。外周神经或脊髓的横断末端之间的空间优选用一种非细胞的间隙填充材料，如胶原、甲基纤维素等来填充，或用促进神经细胞生长的细胞如施旺氏细胞(Xu等.，J.Neurocytol.261-16，1997)，嗅觉细胞和外鞘(sheathing)细胞的混悬液来填充。神经生长促进剂可以和这些细胞或非细胞间隙填充物质包含在一起，或在神经移植过程之前、之中或之后全身给药。
尤其，化合物(I)用来治疗或预防神经元的损伤/功能障碍，多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪或脊髓损伤。
接下来的实施例更详细地说明了本发明。应该认为这些实施例描述了本发明的某些方面或具体情况，但是无意于限制本发明的范围。
实施例1利用化合物(I)的处理显著地增加了海马神经元的神经突长度细胞培养物的制备按照Banker and Cowan(Brain Research，1977，126397-425)，胚胎的海马神经元得自在胚胎第18.5天(＂E18.5＂)的幼鼠。简单而言，取出海马区域，切碎，并在37℃在100I.U.木瓜蛋白酶中孵育45分钟，细胞被混悬在完全神经元培养基中不含L-谷氨酰胺的基本必需培养基(GIBCO，Grand Island，NY)，高葡萄糖基本必需培养基的1.5ml/100ml培养基(GIBCO)，血清增容剂(extender)的0.1ml/100ml培养基(Hito+Tm；Collaborative Research Inc，Lexington，MA)，谷氨酰胺(GIBCO)，5％胎牛血清(GIBCO)。
细胞被接种在聚L-赖氨酸包被的盖玻片上(500细胞/盖玻片)。盖玻片被倒置在预先包被了单层皮质的星形细胞的器皿上。
海马神经元的轴突长度的分析对海马神经元(通过它们特定的极性和树突来鉴定)每天进行检查和在72小时内随机照相(9-12帧/盖玻片)，轴突(定义为最长的突起)长度通过照相的印迹来测量，这一照相的印迹是利用与具有一个合适的软件(Bioquant IV，R & M Biometrics，Nashville，TN)的一台IBM XT计算机相连的Houston Instrument HI-PAD数字化图像输入板得到的。只测量到了细胞体长度的三倍以上。从同等处理过的盖玻片(每组三或四个)获得的数据之间没有差异，因此将它们结合起来。计算平均值并利用单向(化合物(Ia)或藤霉素处理组对一未处理对照组)方差分析来比较，然后进行Newman-Kuels多组比较检验(WINKS4.62专业版)。
结果在72小时时，未处理对照组和10nM藤霉素处理组之间没有显著性差异。然而，10nM浓度的化合物(Ia)治疗组在神经突长度方面表现出了一个统计学上的显著的增长。见下面表I中的结果表172小时时化合物(Ia)和藤霉素对大鼠原代海马细胞培养物平均神经突长度的影响
*与未处理组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例2利用化合物(I)的处理增加了SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞的平均神经突长度SH-SYSY成神经细胞瘤细胞培养物的制备
SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞在37℃，7％CO2条件下维持在添加有10％胎牛血清(SIGMA)，50I.U./ml青霉素和50μg/ml链霉素(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)中。将细胞以15000细胞/孔铺于六孔平板中并用0.4μM阿非笛霉素(SIGMA)处理。第五天，冲洗细胞并用存在或不存在藤霉素(10nM)或化合物(Ia)(1nM)的10ng/ml神经生长因子(NGF)处理(来诱导突起长出)。培养基在96小时后更换，用新的培养基来替代再放置72小时(总时间，168小时)。在所有的试验中使用双份的孔，数据是每一处理组的平均数据。
SH-SYSY成神经细胞瘤细胞神经突长度分析为了分析突起的长度，在168小时时随机给细胞(20个视野/孔)照相。神经突长度通过一个照相的印迹来衡量，这一照相的印迹是利用与具有一个合适的软件(Bioquant IV，R & M Biometrics，Nashville，TN)的一台IBM XT计算机相连的Houston InstrumentHI-PAD数字化图像输入板得到的。只测量到了那些细胞体长度两倍以上的突起。从同等处理过的孔中得到的数据之间没有差异，因此将它们结合起来。计算平均值并利用单向的(化合物(Ia)或藤霉素处理的样品对只用NGF处理过的样品)方差分析来比较平均值，然后进行Newman-Kuels多组比较检验(WINKS4.62专业版)。
结果神经突突起长度的测量值显示，与单独用NGF(10ng/ml)相比在168小时时化合物(Ia)(1nM)和藤霉素(10nM)都显著地增加了轴突突起的长度。然而，与NGF联合的1nM化合物(Ia)的作用高于与NGF联合的10nM藤霉素的作用。
表2在168小时时化合物(Ia)和藤霉素对SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞平均神经突长度的影响
*与NGF组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例3利用化合物(I)的处理促进了大鼠坐骨神经挤压模型的功能恢复动物和手术程序用2％的卤烷麻醉9只6周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠，暴露右侧的坐骨神经，在臀部水平的位置将神经挤压两次(总共60s利用一个7号Dumont jeweler′s钳)。挤压部位通过将一根无菌的9-O缝合线穿过神经外膜的鞘来标记。
化合物(Ia)的制备和给药将化合物(Ia)溶解在包含30％二甲亚砜(DMSO)70％盐水的介质中。给三只接受过轴突显微外科术的大鼠每天皮下注射化合物(Ia)(1或5mg/kg)或相等量的介质(包含30％DMSO的盐水)(5ml/kg)。
行为的评定每天检验动物直到灌注日(第18天)。下面的半定量等级通常用来评价动物的功能恢复。
0当走路时瘫痪并有脚翻转和脚趾弯曲；1正确控制脚并移动脚趾的能力；2能够持续地用脚走路；3在走路时证明脚趾能伸展；4抬起脚后跟走路并显示接近正常的脚趾伸展。
证明中间能力的动物给予部分分数+，0.25；++，0.5；+++，0.75。
组织固定和制备神经挤压18天后，用4％的卤烷深度麻醉大鼠，肝素化并用在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的4％的多聚甲醛灌注10s，接下来用在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)中的5％的戊二醛(1L)灌注，然后在4℃固定24小时。在坐骨神经上距粉碎位置已知距离(5mm)处取组织样品。在目前的研究中，只报导了从供给比目鱼肌的后胫神经分枝中得到的数据。组织被放置在0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.4)中，用1％四氧化锇(在0.1M磷酸缓冲液中)后固定2.5小时，用乙醇脱水并包埋在塑料中。半薄切片用乙酸铀酯和柠檬酸铅染色，安装在薄膜支持的75目格，并用JEOL 100 CX电子显微镜检查。
形态分析轴突管径的分析在比目鱼肌神经上进行。再生的有髓鞘的轴突的数目用电子显微镜来计算。计算介质处理组，化合物(Ia)(1mg/kg)处理组和化合物(Ia)(5mg/kg)处理组的平均值和标准差。
统计学分析对于行为的分析，用单向的方差分析来比较功能恢复的平均值，然后进行Newman-Kuels多组比较检验来比较各个值。至于形态分析，用单向的方差分析来比较轴突数目的平均值，然后进行Newman-Kuels多组检验来比较各个值。
结果功能恢复在15-17天观察到了功能恢复，并且1mg/kg处理组大鼠和5mg/kg处理组大鼠的功能恢复都比介质处理组大鼠的功能恢复出现的早。见下面的表3。
表3化合物(Ia)在大鼠坐骨神经损伤功能恢复中的作用
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)电子显微镜检查动物的形态学检查在轴突显微外科术后第18天进行。
每神经面积(5,000μm2)中再生的有髓鞘的轴突的数目产生显著增长，从介质处理组大鼠的5.5±2.7(平均值±SEM)到1和5mg/kg处理组大鼠的19±2.4和20±2.9，各自(P＜0.05)。见下面表4。
表4化合物(Ia)在大鼠坐骨神经粉碎后18天时对比目鱼肌神经每神经面积(5,000μm2)的再生的有髓鞘轴突数目的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例4用化合物(I)的处理促进了大鼠脊髓损伤模型中的功能恢复(1)方法动物和外科程序用2％的卤烷麻醉28只六星期大的雄性Sprague-Dawley大鼠，在T10/T11进行椎板切除术并在脊髓T10/T11水平进行脊髓半切损害。
化合物(Ia)的制备和给药将化合物(Ia)溶解在包含30％二甲亚砜(DMSO)70％盐水的介质中。在手术后7个星期内脊髓损伤的大鼠每天接受皮下注射化合物(Ia)(2mg/kg)或相等体积的介质(含30％DMSO的盐水)(5ml/kg)。
功能恢复的评价利用一个改进的Tarlov/Klinger等级、狭窄横梁试验和脚印试验在损害后2周来评价功能恢复。
A.改进的Tarlov/Klinge等级让大鼠在一片开放的场地中自由活动1分钟并用下面提供的等级0-6来评定。
0受损的后肢没有运动；1受损的后肢几乎没有可察觉的运动；2受损的后肢关节(臀，膝或踝)有活跃的运动但是不协调，不能支撑重量；
3受损的后肢有交替的行走并有推进的运动，不能支撑重量；4受损的后肢可支撑重量；5只有微小的不足的行走；6正常行走B.狭窄横梁试验大鼠在宽度递减的木制横梁(1.5m长)上测试，宽度分别为7.7cm，4.7cm，2.7cm和1.7cm。让大鼠在木条上行走，记录它们可以不滑倒地以至少两个轨道行走的最窄木条。
0不能在任何一个横梁上行走；1可以在7.7cm宽的横梁上行走；2可以在4.7cm宽的横梁上行走；3可以在2.7cm宽的横梁上行走；4可以在1.7cm宽的横梁上行走；C.脚印试验将大鼠的后肢沾上墨水并将脚印印在一张覆盖在60cm长和7.5cm宽的狭窄跑道上的纸上。一系列至少6个连续等级通常被用来确定5-点脚印分值。
0持续的背侧的走步或后肢拖动，例如，不可见脚印1有可见的至少3个脚印中至少3个脚趾的脚趾印2与它自己的基线值相比显示多于两倍值的脚的外或内旋转3除了脚旋转外没有脚趾拖动的印记4未显示内或外旋转印记(小于两倍的基线值角)，但可见多于一个的脚后跟印5未见脚后跟印统计分析对于行为的分析，用单向的方差分析来比较每一功能试验分值的平均值，然后进行Newman-Kuels多组比较检验来比较各个值。
结果功能恢复利用改进的Tarlov/Klinger等级(表5)，横梁行走试验(表6)和脚印试验(表7)来进行所有三项功能恢复测量。在改进的Tarlov/Klinger等级(表5)，横梁行走试验(表6)和脚印试验(表7)中化合物(Ia)改善了运动功能损伤。
表5化合物(Ia)对大鼠脊髓损伤的改进的Tarlov/Klinger分数的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)表6化合物(Ia)对大鼠脊髓损伤的横梁行走分数的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)表7化合物(Ia)对大鼠脊髓损伤的脚印分数的影响
*与介质组相比P＜0.05(单向的方差分析，然后进行Newman-Kuels多组比较检验)实施例5化合物(Ia)与FKBP12结合，但是与藤霉素不同的是它不发挥或只发挥很少的免疫抑制作用(1)与FKBP12的结合试验结合试验按照Tamura，K.等(Biochemical arid BiophysicalResearch Communications，Vol.202，No.1，437-499，1994)的相似方式进行。结果在表8中列出。
(2)混合的淋巴细胞反应(MLR)MLR试验按照美国专利US4929611的相似方式进行。
结果在表8中列出。
表8化合物(Ia)和藤霉素体外实验的药理学特性
上面的结论显示化合物(Ia)没有免疫抑制活性，但是它可以和FKBP12结合。
上面显示的结果说明化合物(I)在体外和体内模型中都有有效的神经营养作用。在两个细胞培养模型中，化合物(I)甚至在低浓度也增加了神经突的生长。而且，在低剂量将化合物(I)全身给药通过增加坐骨神经的神经突再生速率和促进脊髓损伤的功能恢复加速了神经挤压损害后的功能恢复。
此外，如上所示，化合物(I)提供了一种有效的神经营养的或刺激神经细胞生长的活性，但是，它没有免疫抑制活性。相应的，本发明提供一种有用的神经营养剂用来刺激或促进神经元生长或再生，特别是当一种免疫抑制作用是不利的或不需要的时候。
本发明的其它方面包括一件制品，包括包装材料和包含在所述包装材料中的上面确定的化合物(I)，其中所述的化合物(I)是预防或治疗神经元功能障碍的治疗有效量的，并且其中的包装材料包括一个标签或书面材料，此材料指出化合物(I)能或应当用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
一种商业药包，包含含有上面确定的化合物(I)的药物组合物和一个所附带的书面材料，其中书面材料表明化合物(I)可以或应该用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
一种组合物，例如包含用化合物(I)处理过的细胞的一种细胞混悬液，组织或移植物。这些组合物用来修复神经系统损伤。这些组合物也可以包括其他对神经细胞生长刺激剂，例如促进或辅助神经细胞生长的其它类型的细胞混悬液，例如产生髓磷脂的细胞如施旺氏细胞或少突细胞，神经胶质细胞和鞘细胞；细胞外的基质物质，如胶原；或其它特异性的神经调节剂如细胞因子，促有丝分裂因子，免疫亲和蛋白和神经营养物质如NGF-1，BDNF，CNTF，NT-3，NT-4和NT-5。
移植物例如自体移植物，同种异体移植物或异种移植物也可以用化合物(I)来处理以促进神经元生长，用作移植物和用作其它应用。
引入的参考此处公开所引用或提及的每篇文献，专利申请或专利公开的内容都是将它们的全文引入作为参考。此申请要求优先权的任何专利文献的内容也是将它们的全文引入作为参考。特别的，美国临时申请No.60/258,500的内容引入作为参考。
修改和其它实施方案显然，根据上述的教导本发明的大量的修改和变化都是可能的。因此应该理解在所附的权利要求的范围内，除了此处明确描述过的其它的内容本发明也可以实施。所述的组合物和方法及本发明的概念的各种的修改和变化在不偏离本发明的范围和精神的条件下对本领域技术人员来说是显而易见的。虽然上面已经用特别优选的实施方案描述了发明，应该理解所要求保护的发明不是有意限于这些特定的实施方案。用来实施本发明的所述模式的各种修改对于医学，生物学，化学或药理学科或相关领域的技术人员来说是显而易见的，也包括在本发明的范围内。
权利要求
1.下式化合物在制备神经营养剂中的应用
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经营养剂用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经营养剂用来刺激或促进神经细胞生长或再生。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经营养剂用来促进神经损伤的功能恢复。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经元损伤/功能障碍是多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪或脊髓损伤。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于神经元损伤/功能障碍是阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病或脊髓损伤。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于化合物(I)以它的药学可接受的盐，衍生物，前药或溶剂化物的形式存在。
8.一种组合物，包括具有下面结构式的化合物(I)
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于化合物(I)以它的药学可接受的盐，衍生物，前药或溶剂化物的形式存在。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于化合物(I)以化合物(Ia)的形式存在。
11.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于其进一步包含至少一种其它的神经营养剂。
12.一种制品或试剂盒，包括包装材料和包含在所述包装材料中的化合物(I)，其中所述的包装材料包括一个标签或一个书面材料，它指出所述化合物(I)可以或应当用来预防，改善或治疗神经元损伤/功能障碍。
13.一个商业药包或试剂盒，包括含有化合物(I)的药物组合物和所附带的书面材料，其中该书面材料指出化合物(I)可以或应当用来预防，改善或治疗神经元损伤/功能障碍。
14.一种制备或制造神经营养剂的方法，包括将化合物(I)与一种药学上可接受的载体、介质或赋形剂混合。
15.一种预防，改善或治疗神经元损伤/功能障碍的方法，包括给需要的受试者施用有效量的化合物(I)。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述的受试者为哺乳动物。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述的受试者为人。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述的神经元损伤/功能障碍是多发性肌炎，急性感染性多神经炎，梅尼埃尔氏病，多神经炎，单神经炎，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿氏舞蹈病，神经根病，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病，老年性痴呆，血管性痴呆，多发性硬化，身体瘫痪或脊髓损伤。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于神经元损伤/功能障碍是阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，糖尿病性神经病变，化疗导致的神经病或脊髓损伤。
20.一种刺激或促进神经细胞生长或再生的方法，包括将神经细胞与化合物(I)相接触。
21.一种增加轴突生长或再生速度或神经细胞长度的方法，包括将神经细胞与化合物(I)相接触。
22.一种在需要其的组织中增加神经细胞生长的方法，包括将化合物(I)施用于所述组织。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述组织选自脑组织，脊髓组织或外周神经组织。
24.一种促进神经损伤功能恢复的方法，包括给需要的对象施用有效量的化合物(I)。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于神经损伤选自烧伤，创伤，机械损伤，手术损伤，生理学损伤，病理学损伤和免疫学损伤。
26.一种修补横切的外周神经或脊髓的方法，包括将所述外周神经或脊髓的横切的末端与有效量的化合物(I)相接触。
27.一种修复受试者中横切的外周神经或脊髓的方法，包括给所述受试者施用神经生长刺激量的化合物(I)和移植给外周神经或脊髓。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述移植物为一种同种异体移植物。
29.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述移植物为一种人工神经移植物。
30.根据权利要求27所述的方法，其特征在于进一步包含用一种非细胞的间隙填充材料来填充外周神经或脊髓的横切的末端间的空间。
31.根据权利要求27所述的方法，其特征在于进一步包含用一种细胞混悬液来填充外周神经或脊髓的横切的末端间的空间。
32.一种组合物，包含用化合物(I)处理的一种神经细胞。
33.一种组织，包含用化合物(I)处理的一种神经细胞。
34.一种移植物，包含用化合物(I)处理的一种神经细胞。
35.根据权利要求34所述的移植物，其特征在于所述的移植物是一种自体移植物，同种异体移植物或异种移植物。
36.一种促进神经损伤功能恢复的方法，包括向需要的受试者施用有效量的包含用化合物(I)处理过的细胞的一种组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于神经损伤选自烧伤，外伤，机械损伤，外科手术损伤，生理学损伤，病理学损伤和免疫学损伤。
38.一种修补横切的外科神经或脊髓的方法，包括将所述外周神经或脊髓的横切的末端与有效量的包含用化合物(I)处理过的细胞的一种组合物相接触。
39.一种组合物，包含一种用化合物(I)处理过的细胞、组织或移植物和至少一种神经细胞生长促进剂。
40.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于所述的神经生长促进剂选自一种促进神经的生长的细胞混悬液、一种非细胞的间隙填充材料或一种神经生长因子。
41.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于其包含作为神经生长促进剂的胶原或甲基纤维素。
42.根据权利要求39所述的组合物，其特征在于其包含作为神经生长促进剂的一种细胞混悬液。
全文摘要
具有高水平的神经营养活性和低水平的免疫抑制活性的藤霉素衍生物。这些化合物用作神经营养剂，特别是用来预防或治疗神经元损伤/功能障碍。
文档编号A61P21/00GK1538843SQ01822886
公开日2004年10月20日 申请日期2001年12月31日 优先权日2000年12月29日
发明者松冈信也, 山路隆之, 布鲁斯·戈尔德, 戈尔德, 之 申请人:藤泽药品工业株式会社
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