稳定的含有类维生素a和类维生素a增强剂系统的护肤组合物的制作方法
专利名称：稳定的含有类维生素a和类维生素a增强剂系统的护肤组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定的护肤组合物，它含有类维生素A和类维生素A增强剂系统(booster system)，被装在包装中，以便使得所述组合物不与氧接触。
类维生素A(例如视黄醇和视黄醇酯)是化妆品中常用的组分。视黄醇(维生素A)是内源性化合物，它天然地存在于人体中并且是正常上皮细胞分化必需的。天然的和合成的维生素A衍生物已广泛地用于治疗各种皮肤病并且已用作皮肤修复剂和再生剂。视黄酸已用于治疗各种皮肤病，例如痤疮、皱纹、银屑病、老年斑和脱色。例如参见Vahlquist，A.等人，J.Invest.Dermatol.，94卷，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，496-498页；Ellis，C.N.等人，“Pharmacology of Retinols inSkin，”Basel，Karger，3卷，(1989)，249-252页；和PCT专利申请WO93/19743。
然而，在化妆品制剂中，视黄醇特别不稳定，因为视黄醇受多种因素的影响而发生化学降解，包括氧化、热不稳定性和UV诱导降解。视黄酯也具有这些不稳定性，尽管其程度比视黄醇小。类维生素A对皮肤的好处可通过合用类维生素A增强剂分子得以提高。然而，虽然不是全部，但很多类维生素A增强剂分子也增加视黄醇的不稳定性。因此，与只含有视黄醇的制剂需求相比，更需要保护含有类维生素A增强剂的视黄醇制剂。
在某些参考文献中试图创造稳定的含有视黄醇的组合物。例如，Johnson&Johnson受让的美国专利5,976,555中公开了护肤组合物，它们包括其中含有类维生素A、乳化剂系统和助乳化剂的水包油乳剂。该专利描述了一种用于保存组合物的容器的使用以便组合物不与氧接触。该容器被描述为用于只含有乳化剂系统和助乳化剂的类维生素A组合物而不能防止由于与类维生素A增强剂接触所引起的类维生素A降解。
L’Oreal受让的美国专利5,800,596中公开了一种在分配装置中含有视黄醇的油包水乳剂，所述分配装置具有不透氧和UV光的壁和捕氧装置。该专利中没有教导和建议增强剂的使用和在增强剂存在下与类维生素A稳定性有关的问题。
以上所引用的参考文献中无一教导和建议在类维生素A增强剂存在下稳定类维生素A组合物的系统。因此，仍然需要这样的稳定的含有类维生素A和类维生素A增强剂的化妆品组合物。
本发明提供了一种稳定的护肤组合物，它含有大约0.0001％-大约50％的至少一种类维生素A增强剂；大约0.001％-大约10％的类维生素A；和可化妆用载体，其中将稳定的护肤组合物装在一个包装中以便使所述组合物不与氧接触。
作为优选的组分，本发明组合物包含类维生素A，它选自视黄酯、视黄醇、视黄醛和视黄酸，优选视黄醇和视黄酯。术语“视黄醇”包括下列的视黄醇异构体全反式-视黄醇、13-顺式-视黄醇、11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇、3，4-二脱氢-13-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-11-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-9-顺式-视黄醇。优选的异构体是全反式-视黄醇、13-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇、9-顺式-视黄醇。由于具有广泛的商业可获得性，最优选的是全反式-视黄醇。
视黄酯是视黄醇的酯。术语“视黄醇” 定义同上。适用于本发明的视黄酯是视黄醇的C1-C30酯，优选C2-C20酯，并且最优选C2、C3和C16酯，因为它们更容易通过商业渠道获得。视黄酯的实例包括但不限制于棕榈酸视黄酯、甲酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、丁酸视黄酯、戊酸视黄酯、异戊酸视黄酯、己酸视黄酯、庚酸视黄酯、辛酸视黄酯、壬酸视黄酯、癸酸视黄酯、十一烷酸视黄酯、月桂酸视黄酯、十三烷酸视黄酯、十四烷酸视黄酯、十五烷酸视黄酯、十七烷酸视黄酯、硬脂酸视黄酯、异硬脂酸视黄酯、十九烷酸视黄酯、花生四烯酸视黄酯、山萮酸视黄酯、亚油酸视黄酯、油酸视黄酯。
优选的用于本发明的酯选自棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯和丙酸视黄酯，因为这些酯最容易通过商业渠道获得并因此是最便宜的。亚油酸视黄酯和油酸视黄酯因其功效也是优选的。
在本发明组合物中所使用的视黄醇和视黄酯的量大约为0.001％-大约10％，优选的量大约为0.01％-大约1％，最优选的量大约为0.01％-大约0.5％。
已确信，类维生素A在皮肤中按照流程1的机理通过酶转化为视黄酸。
视黄醇在表皮中的代谢酶的名称 ARAT/LRAT＝乙酰辅酶A(CoA)视黄醇乙酰基转移酶/卵磷脂视黄醇乙酰基转移酶CRABPII＝细胞视黄酸结合蛋白II意外地发现，某些化合物抑制ARAT/LRAT、视黄醛还原酶、CRABPII和视黄酸氧化(后者通过细胞色素(cytochrome)P450系统催化)，而某些其他化合物增强视黄醇脱氢酶的作用。所述化合物在本文统称为“增强剂”并且编码为B1-B5组，如上文流程1所示。增强剂单独或彼此联合应用通过增加可转化成视黄酸的视黄醇的量和抑制视黄酸的降解来增强类维生素A的作用。增强剂与类维生素A(例如视黄醇、视黄酯、视黄醛、视黄酸)联合起作用，后者是皮肤中内源性存在的。然而，为了达到最佳性能，优选的组分包括在所述组合物中的类维生素A和共同存在的增强剂。
本发明部分包括第二种组合物，它包含占所述组合物重量的大约0.0001％-大约50％，优选大约0.001％-大约10％，最优选大约0.001％-大约5％的至少一种增强剂化合物和可化妆用载体，其中所述化合物单独或以10mM的组合浓度在体内谷氨酰胺转移酶测定中抑制谷氨酰胺转移酶至50％以上。
本发明组合物中所包含的增强剂选自(a)、两种增强剂，其中二者都选自由B2、B3和B4组成的相同组中；(b)、增强剂的二元组合，选自B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3；B2/B4；B2/B5；B3/B4；B3/B5；B4/B5(c)、增强剂的三元组合，选自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5(d)、增强剂的四元组合，选自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和(e)、五组增强剂的组合B1/B2/B3/B4/B5。
优选的组合物包括至少一种来自不同组(即上述(b)-(e)组)的增强剂。然而，在本发明组合物中，也可以使用选自不同组的增强剂的任何组合来提供所需要的激活作用。
如下2.1-2.7节所述，首先根据化合物以表A中所列出的某浓度通过特定酶体外微粒体测定的能力来选择在本发明中用作增强剂的该化合物。然后，如下所述，将化合物(单独或与另一增强剂一起)以10mM的单一或组合浓度进行体外谷氨酰胺转移酶测定。如果所述组合抑制谷氨酰胺转移酶至50％以上，那么它适用于本发明。如果对增强剂进行单独的测试并且该增强剂通过了谷氨酰胺转移酶测定，那么它可以与另一通过谷氨酰胺转移酶测定的增强剂或组合物联合使用。
优选的本发明组合物包括至少以10mM的各自浓度抑制谷氨酰胺转移酶至50％以上的增强剂的组合物。
本文所使用的术语“调理”是指预防和治疗干燥皮肤、痤疮、光损伤性皮肤、皱纹、老年斑、皮肤老化，增加角质层柔韧性、使皮肤的颜色变明亮、控制皮脂排泄和一般性地增加皮肤的质量。该组合物可用于改善皮肤脱屑和表皮分化。
增强剂是通过下文2.1-2.7节所描述的体外微粒体测定的化合物。适用于本发明的化合物在表A所列出的浓度下将酶至少抑制或增加到表A所列出的宽范围百分数。
表A增强剂试验浓度和抑制/增加百分数(％)ARAT/LRAT的测定 (用于识别B1增强剂)
视黄醇脱氢酶的测定 (用于识别B2增强剂)
视黄醛还原酶的测定 (用于识别B3增强剂)
CRABPII拮抗剂的测定 (用于识别B4增强剂)
视黄酸氧化的测定 (用于识别B5增强剂)
下面是用于确定本发明组合物中化合物包合(inclusion)的适应性的体外微粒体测定法1、材料全反式-视黄醇、全反式-视黄酸、棕榈酰基-CoA、二月桂酰基磷脂酰胆碱、NAD和NADPH购于Sigma化学公司。用HPLC级乙腈配制用于微粒体测定的类维生素A贮备液。所有用于HPLC分析的类维生素A的标准贮备液都用乙醇配制，在-70℃、N2环境下贮存并且当离开贮存条件时，在琥珀色光照下保存在冰上。其他化学品和抑制剂通过商业渠道购于化妆材料供应商或化学品公司如Aldrich或InternationalFlavors and Fragrances。
2、方法2.1、RPE微粒体的分离(改良的J.C.Saari & D.L.Bredberg，“CoAand Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal PigmentEpithelium”，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988))。
从W.L.Lawson Co.，Lincoln，NE，USA获得50个除去视网膜和水状液的冷冻对切牛眼杯。将眼解冻过夜并通过用镊子剥皮除去有色的彩虹膜。各眼用2×0.5ml冷缓冲液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)洗涤并用艺术家的刷子或橡胶膜擦去黑色素沉着的细胞。将细胞悬浮液加到彩虹膜中并将该悬浮液在烧杯中用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌几分钟。悬浮液通过粗滤器(Spectra/Por 925μ孔径聚乙烯筛)过滤以便除去大颗粒，所得到的深色悬浮液用Glas-Col和马达驱动的聚四氟乙烯均化器搅拌均匀，将细胞均化物在20,000g下(Sorvaal RC-5B型离心机，具有SS34马达，2.5×10cm离心管，14,000RPM转速)离心30分钟。所得到的上清液在150,000g下(Becman L80型超速离心机，具有SW50.1马达，13×51mm离心管，40,000RPM转速)进一步离心60分钟。将所得到的沉降物利用Heat Systems Ultrasonics，Inc.的W185D型Sonifier Cell Disruptor分散到～5ml 0.1M PO4/5mM DTT，pH7缓冲液中，并将所得到的微粒体分散液等分到小管子中并在-70℃下贮存。利用BioRad Dye结合测定法，用BSA作为标准测定微粒体中蛋白质的浓度。
2.2、鼠肝脏微粒体的分离(R.Martini & M.Murray，“Participation ofp450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-hydroxylation”，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993))。
将6g冷冻鼠肝脏(由Accurate Chemical and Scientific Corp.的Harlan Sprague Dawley鼠获得)在3体积的0.1M tris/0.1M KCl/1mMEDTA/0.25M蔗糖，pH7.4缓冲液中用Brinkmann Polytron搅拌均匀。所得到的组织悬浮液进一步在上述马达驱动的聚四氟乙烯均化器中搅拌均匀。将所得到的均化物相继在10,000g下离心30分钟，在20,000g下离心30分钟和在30,000g下离心15分钟，所得到的上清液在105,000g下超速离心80分钟。所得到的沉降物在上述～5ml 0.1M PO4/0.1mMEDTA/5mM MgCl2，pH7.4缓冲液中进行声处理并在-70℃下以等份试样贮存。如上测定蛋白质浓度。
2.3、测定ARAT和LRAT活性(用于识别B1)下列方法是改良的J.C.Saari & D.L.Bredberg，“ARAT&LRATActivities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes”，MethodsEnzymol.190，156-163(1990)方法。制备下列缓冲液并在4℃下贮存0.1M PO4/5mM二硫苏糖醇，pH7.0(PO4/DTT)。在测定的当天，每ml缓冲液加入2mg BSA得到PO4/DTT/BSA工作缓冲液。在乙腈中制备1mM视黄醇底物并在-20℃和氮气下贮存在琥珀色瓶子中。制备4mM棕榈酰基-CoA在工作缓冲液中的溶液(以等份试样贮存)和4mM二月桂酰基磷脂酰胆碱的乙醇溶液并在-20℃下贮存。制备10mM抑制剂的H2O、乙醇、乙腈或DMSO储备液。利用含有50μg/ml丁化羟基甲苯(BHT)的纯乙醇制备淬火溶液并利用含有50μg/ml BHT的己烷溶液来提取。
向2英钱玻璃小瓶中按顺序加入下列组分500μl总体积的PO4/DTT/BSA缓冲液、5μl酰基供体(4mM棕榈酰基CoA和/或二月桂酰基磷脂酰胆碱)、5μl抑制剂或溶剂空白(10mM原料或其他稀释剂)，然后加入大约15μg RPE微粒体蛋白质(大约15μl、～1mg/ml的微粒体蛋白质等份试样)。在37℃下培养5分钟至与反应温度平衡，然后加入5μl1mM视黄醇。给小瓶盖上盖子，涡流搅拌5秒钟并在37℃下培养30-90分钟。通过加入0.5ml乙醇/BHT淬灭反应。通过加入3ml己烷/BHT提取类维生素A，涡流搅拌提取管几次，每次数秒钟，并在低转速下将提取管离心5分钟至迅速分层。将上层的己烷层转移到干净的小瓶中，并如上所述用另外3ml己烷/BHT再提取水层。合并己烷层并通过在37℃和氮气流下，在加热的铝块上干燥蒸发己烷。干燥的残渣在-20℃下贮存直至HPLC分析。通过如下所述对HPLC信号积分，分别就ARAT和LRAT活性对棕榈酸视黄酯和月桂酸视黄酯的量进行定量。
注意，所述培养溶液中包含40μM乙酰基供体、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄醇、大约30μg/ml微粒体蛋白质和接近0.1M PO4、pH7/5mM DTT/2mg/ml BSA。加入视黄醇后的所有步骤都在暗光线或琥珀色光线下进行。
2.4、测定视黄醇脱氢酶的活性(用于识别B2)制备下列浓储备液50mM KH2PO4、pH7.4缓冲液，无菌过滤过。
10mM全反式视黄醇(Sigma R7632)的DMSO溶液。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP)(Sigma N0505)的无菌水溶液。
40mM试验化合物在适宜的溶剂(水、缓冲液、乙醇、氯仿或DMSO)中的溶液。
1∶10稀释的鼠肝脏微粒体的50mM KH2PO4、pH7.4缓冲液(4ug/ul)。
在具有螺帽的2英钱玻璃小瓶中按顺序加入下列物质缓冲液，至终体积为400μl25μl稀微粒体(最终量＝100μg)-利用煮过的微粒体作对照和常规的微粒体作为试验样品。
4μl200mM NADP(最终量＝2mM)1μl40mM试验化合物(最终量＝100μM)8μl10mM视黄醇(最终量＝200μM)将小瓶在37℃振荡水浴中培养45分钟。向各小瓶中加入500μl冰冷却的乙醇使得反应淬灭。用冰冷却的己烷(每次2.7ml)提取类维生素A两次。在第一次提取过程中，向各小瓶中加入乙酸视黄酯(5μl900μM的储备液)作为监测各样品提取功效的手段。将样品涡流搅拌10秒钟，然后在5℃的Beckman GS-6R离心机上，在1000rpm转速下轻轻地离心5分钟。每次提取后，将上层含有类维生素A的己烷从水层中转移到干净的2英钱小瓶中。在微弱的氮气流下蒸发除去己烷。干燥的残渣在-20℃下贮存直至HPLC分析。
2.5、测定视黄醛还原酶的活性(用于识别B3)如上所述，用下列物质代替上述物质制备所有储备液l0mM全反式视黄醛(Sigma R2500)的DMSO溶液-代替视黄醇。
200mM，还原型(reduced form)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐(NADPH)(Sigma N7505)的无菌水溶液-代替NADP。
在具有螺帽的2英钱玻璃小瓶中按顺序加入下列物质缓冲液，至终体积为400μl25μl稀微粒体(最终量＝100μg)-利用煮过的微粒体作对照和常规的微粒体作为试验样品。
4μl200mM NADPH(最终量＝2mM)1μl40mM试验化合物(最终量＝100μM)3μl10mM视黄醛(最终量＝75μM)如上所述进行相同的培养和提取过程。
2.6、测定CRABPII拮抗剂(用于识别B4)2.6.1、CRABPII的合成
a.表达系统在pET29a-c(+)质体(Novagen)中克隆基因CRABPII。克隆的基因处于强噬菌体T7转录和翻译信号的控制下。T7聚合酶源是由宿主细胞E.Coli BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供的。后者具有在lacUV5控制下由所存在的IPTG诱导的染色体复制的T7聚合酶。按照制造商(Novagen)教导的方法，通过转换将质体转移到E.Coli BLR(DE3)pLysS细胞中。
b.诱导将过夜培养的转化细胞按照1∶100的比例在含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2×YT中稀释。细胞生长同时在37℃下振摇直至在600nm下OD达到0.6-0.8。然后加入IPTG至终浓度为1mM并将培养基再培养2小时。通过在5000g转速下在室温下离心10分钟捕获细胞。沉积物在-20℃下贮存。
2.6.2、纯化按照Norris和Li，1997中所描述的方法进行纯化。
a.溶胞作用将冷冻的沉积物在RT下解冻并再悬浮在1-2体沉积物体积的新制备溶胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8、10％(w/v)蔗糖、1mMEDTA、0.05％(w/v)叠氮化钠、0.5mM DTT、10mM MnCl2、2.5mM苯甲基磺酰氟、2.5mM苯甲脒、6μg/mL DNase)中。溶胞产物在室温下再培养30分钟。通过声处理(在10,000psi压力下脉冲6个30-秒与在冰上延迟5个30-秒交替进行)进一步溶胞。溶胞产物不溶性部分通过在4℃15000rpm下离心1小时除去并且将上清液在-20℃下贮存。
b.在Sephacryl S300上进行凝胶过滤将步骤a.得到的上清液在室温下装载到sephacryl S-300(Pharmacia)的2.5×100cm柱子。洗脱缓冲液为20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％叠氮化钠(缓冲液A)。流速为2mL/min。所收集的2-mL馏分在280nm下检查紫外吸收。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查代表峰值的馏分中CRABPII的存在。
c.阴离子-交换色谱法将2mL含有CRABPII的凝胶过滤馏分装载到FPLC(快速蛋白质液体色谱法)monoQ型(Pharmacia)的季铵阴离子交换柱上。CRABPII在室温下用100％缓冲液A-30％缓冲液B的梯度缓冲液(100％缓冲液B＝缓冲液A+250mM NaCl)洗脱20分钟。每分钟收集1mL-馏分。再次通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来检查CRABPII的存在。将CRABPII在4℃下贮存，然后用具有安放小瓶平台附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards High Vacuum International)冷冻干燥。将干燥的样品在室温下贮存直至结合测定时使用。
d.检测CRABPII的存在利用变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析，在7-15％聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)上进行CRABPII的表达和纯化。将10μL样品与10μL 2X填充缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通过加热变性(在80℃下加热2min)。将样品装载到浸在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)中的凝胶上并在室温下施加恒电流(25mA)1小时。考马斯蓝染色后，按照用Benchmark预染色蛋白梯(Gibco BRL)测定的蛋白质分子量来识别所述蛋白质。
利用蛋白质印迹来确定CRABPII的存在。利用Biorad暗盒将SDS-PAGE分离到的蛋白质转移到Immobilon-P转移膜(Millipore)上。所述转移在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)+10％甲醇中进行。施加3小时电流(60mA)以便让蛋白质通过膜迁移。然后，该膜在室温下用5％干奶的1X TBS溶液阻断1小时并在4℃下用具有初级抗体的探针探测在相同缓冲液中的CRABPII(1/1000稀释的鼠抗克隆5-CRA-B3)过夜。接下来，将膜用PBS洗涤(3×5分钟)，然后与1∶2000稀释的二级抗体、轭合过氧化物酶的抗鼠抗体(ECLTM，Amersham)一起在室温下培养1小时。将膜用1×PBS洗涤(3×5分钟)并如生产商说明书(Amersham)中所述，利用ECL检测工具包检测蛋白质。
利用BSA工具包(Pierce)测定纯CRABPII的浓度。
2.6.3、放射性结合测定将220pmol CRABPII在总体积为70uL的20mM Tris-HCl缓冲液pH7.4和15pmol放射性全反式视黄酸(NEN)中一起培养。为了进行竞争性测定，将另一过量的配体(6670∶1、670∶1或70∶1)加到该混合物中。反应在室温下和暗处下进行1小时。为了将未结合的全反式视黄酸与结合的全反式视黄酸分离，使用6kD断流微型色谱柱(Biorad)。如生产商说明书(Pharmacia)中所述，利用Microplex多支管弃去储备缓冲液。将样品装载到柱子上并通过重力作用分离30分钟。滤液中出现与CRABPII结合的视黄酸(″RA″)，而游离的RA保留在柱子上。通过闪烁计数器测定滤液的放射性。
2.7、测定NADPH依赖性视黄酸氧化作用(用于识别B5)下列方法是R.Martini & M.Murray，″Participation of P450 3AEnzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-hydroxylation″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)中所述方法的改良。制备下列测定缓冲液并在4℃下贮存0.1M PO4/0.lmM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。在测定当天，制备60mM NADPH在缓冲液中的溶液。如上所述制备抑制剂储备液、酸化乙醇/BHT淬灭液和己烷/BHT。通过用乙醇稀释15mM储备液(在DMSO中)制备1mM视黄酸工作液。
向2英钱小瓶中按顺序加入物质测定缓冲液至终体积500μL，20μL 60mM NADPH，5μL抑制剂或溶剂空白，然后大约2mg鼠肝脏微粒体蛋白质。在37℃下培养5分钟，然后加入5μL 1mM视黄酸工作液。在37℃下连续培养60分钟-不要给小瓶加盖，因为该氧化过程除需要NADPH外需要分子O2。如上所述用酸化乙醇/BHT淬灭并用己烷/BHT提取。通过如下所述对HPLC信号整合来确定快速洗脱的极性视黄酸代谢物(推测为4-氧代视黄酸)的量。
注意，加入视黄酸后的所有步骤都在暗光线或琥珀色光线下进行。最终的培养液中包含2.4mM NADPH、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄酸、大约4mg/mL鼠肝脏微粒体蛋白质和接近0.1M PO4/0.lmMEDTA/5mM MgCl2。
各种类维生素A的HPLC分析通过在各小瓶中用100μL甲醇溶解残渣来制备通过HPLC确定类维生素A量的样品。将该溶液转移到在lmL外壳小瓶内的150μL玻璃锥形管中，盖紧并放在Waters 715自动进样器中。立即注射60μL等份试样量并分析类维生素A的含量。
色谱分析设备包括Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光电二极管阵列检测器和Waters 474扫描荧光检测器。两组HPLC记录用于类维生素A的分析。在ARAT和LRAT分析中，用Waters3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保护柱进行视黄醇和视黄酯的分离，用调至流速为lmL/分钟的80∶20(v/v)甲醇/THF无梯度流动相洗脱10分钟。洗脱液在325nm下监测吸收度并在325ex/480em下监测荧光。在利用A.B.Barua，″Analysisof Water-Soluble CompoundsGlucuronides″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)中所描述的改良梯度系统进行视黄醇和视黄酸氧化分析时，利用较短的Waters 3.9×l50mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保护柱来分离视黄酸和醇。该系统包括从含有10mM乙酸胺的68∶32(v/v)甲醇/水开始至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷结束的20分钟线性洗脱和在lmL/min的流速下保持5分钟。在300nm-400nm下监测该柱洗脱液。
这些分析方法可根据其在各测定中清楚地解析有关视黄酸、视黄醇、视黄醛和/或视黄酯的能力和相对分离速度来选择。通过HPLC识别各类维生素A是基于未知峰与可获得的可信的类维生素A标准品滞留时间的准确匹配和未知峰与可获得的可信的类维生素A的UV光谱分析(300-400nm)进行的。
适用于谷氨酰胺转移酶测定中进一步测试的增强剂包括但不限制于下文表B1-B5中所列出的增强剂。
ARAT/LRAT抑制剂(B1)
视黄醇脱氢酶活化剂(B2)
视黄醛还原酶抑制剂(B3)
CRABPII拮抗剂(B4)
视黄酸氧化抑制剂(B5)
在下文所描述的谷氨酰胺转移酶测定中，增强剂或其组合物在10mM浓度下抑制谷氨酰胺转移酶(以下称“Tgase”)至至少50％。
Tgase测定
谷氨酰胺转移酶的测定和角质化细胞的分化在表皮末端分化过程中，在细胞外周的内表面形成15nm厚的蛋白质层，已知为角质化膜(CE)。CE由许多已通过形成Nε-(Y-谷氨酰)赖氨酸异二肽键交联在一起的不同的蛋白质构成，所述交联作用是由至少两种不同的谷氨酰胺转移酶(TGases)在表皮上的表达作用催化的。Tgase I大量地在表皮分化层特别是在粒层中表达，但不存在于未分化的基底表皮。因此Tgase I是有用的表皮角质化细胞分化标志，高TGaseI水平表示一种更分化状态。利用Tgase I抗体进行基于ELISA的Tgase I测定以评定下列实施例中所培养角质化细胞的分化状态。
将角质化细胞(如上所述培养的)以每孔200μl培养基中4,000-5,000个细胞的密度放在96孔平板中。培养2-3天或者直至～50％的细胞融合后，将培养基改换未含试验化合物的培养基(每次试验平行测定5次)。将该细胞再培养96小时，然后吸出培养基并将平板在-70℃下贮存。从冷冻器中取出平板，用200μl lx PBS洗涤细胞两次。该细胞在室温(R/T)下与TBS/5％BSA(洗涤缓冲液，牛血清白蛋白)一起再培养1小时。接下来加入Tgase初级抗体50μl单克隆抗-Tgase I Ab B.C.，在洗涤缓冲液中稀释1∶2000倍。初级抗体在37℃下培养2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗6x。将该细胞与50μl在洗涤缓冲液中稀释1∶4,000倍的二级抗体(由Amersham获得的Fab片段，轭合过氧化物酶的抗鼠IgG)一起在37℃下培养2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗3次。用洗涤缓冲液冲洗后，该细胞用PBS冲洗3x。为了比色显色，将细胞与100ul底物溶液(在10ml 0.1M pH5.0的枸橼酸缓冲液中含4mg邻苯二胺和3.3μl 30％H2O2)一起在R/T下，在暗处(在铝箔遮盖下)精确培养5分钟。通过加入50μl4NH2SO4终止反应。在492nm下，在96孔平板UV分光光度计中测定样品的吸收度。在5份平行测定的样品中，4份用两种抗体处理，第5份用作Tgase背景对照。测定Tgase水平并以对照的百分数表示。
测定谷氨酰胺水平并如上表B1-B5表示为(i)％(增强剂+视黄醇抑制/对照抑制)-％(ROH抑制/对照抑制)，它测定了与单独的视黄醇相比，所加入的增强剂+视黄醇诱导的Tgase抑制作用，或(ii)在测定多个浓度增强剂的抑制作用时所得到的IC50值-它提供与10-7M恒定浓度的视黄醇合用抑制Tgase达50％时所需要增强剂的浓度。
IC50值用作本发明中的基准。
用于谷氨酰胺转移酶测定试验的最佳增强剂组B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
可渗透最小量氧的包装如上所讨论的，包含类维生素A的组合物通常是不稳定的并且可发生化学降解。而且，意外地发现，增强剂，尽管有利于增强类维生素A的益处，但也导致类维生素A的化学不稳定性。增强剂诱导的视黄醇的不稳定作用急剧地降低了当两种组分同时包含在一种制剂中时激活的类维生素A系统的总功效。因此，与只含有类维生素A的组合物相比，更需要保护含有增强剂的制剂中的类维生素A组合物以避免破坏至较高程度。具体地说，需要制备稳定的含有类维生素A和类维生素A增强剂的组合物以便提供类维生素A增强剂有益的激活作用，同时防止类维生素A在激活作用前可能发生降解。因此，本发明提供一种包装，它可最少地渗透氧以便稳定类维生素A和增强剂的组合物，因此使得增强剂诱导的类维生素A降解最小。
可渗透最少量氧的包装可通过本领域普通技术人员已知的各种方法制造。具体地说，本发明组合物不应该直接与氧或空气接触，并且应该防止氧通过包装的外壁渗透。可使用不透光和不渗透氧的包装。例如可使用铝作为包装的壁或包装的内衬。
可化妆用载体本发明产品也包含化妆品可用载体作为第一种或第二种组合物中或两种组合物中活性组分的稀释剂、分散剂或载体，以便于当所述组合物应用于皮肤时促进其分配。
非水的或除水以外的载体还可包括液体或固体润肤剂、溶剂、润湿剂、增稠剂和粉剂。特别优选的非水载体是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本发明聚硅氧烷可以是那些在25℃下粘度范围大约为10-10,000,000厘沲的聚硅氧烷。特别可取的是低粘度和高粘度的聚硅氧烷的混合物。这些聚硅氧烷以Vicasil，SE和SF为商标购于通用电气公司和以200和550Series为商标购于Dow Corning公司。可在本发明组合物中使用的聚硅氧烷的量为组合物重量的5-95％，优选25-90％范围。
任选的益肤材料和化妆用辅助物油或油性材料可以与乳化剂一起存在以便提供油包水或水包油乳剂，这主要依赖于所使用的乳化剂的平均亲水亲油平衡值(HLB)。
本发明化妆组合物中可存在各种活性组分并描述于下文中。活性剂定义为除润肤剂和仅仅改善组合物物理特性的组分外的益肤剂或益发剂。尽管不限制于该种类，但一般的实例包括防晒剂、皮肤光亮剂、晒黑剂。
防晒剂包括那些常用于阻断紫外光的材料。例举的化合物是PABA、肉桂酸酯(盐)和水杨酸酯(盐)的衍生物。例如，可使用辛基甲氧基肉桂酸酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮(也称作oxybenzone)。辛基甲氧基肉桂酸酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮可分别以Parsol MCX和二苯酮-3为商标购得。
乳剂中所使用的防晒剂的确切量取决于对太阳紫外照射所需防护的程度。
另一种优选的任选组分选自必需脂肪酸(EFAs)，即，所有细胞质膜形成所必需的那些脂肪酸，在角质化细胞中EFA缺乏导致细胞过度增殖。补充EFA可矫正这种过度增殖。EFA也增强表皮的磷脂生物合成并为表皮屏障形成提供磷脂。这些必需脂肪酸优选选自亚油酸、Y-亚麻酸、高-Y-亚麻酸、columbinic acid、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、己烯酸及其混合物。
通常将润肤剂混合到本发明化妆组合物中。所述润肤剂的含量可以为总组合物重量的大约0.5％-大约50％，优选大约5％-大约30％。按照这样的一般化学种类，润肤剂可以分类为酯、脂肪酸和醇、多元醇和烃。
酯可以是一酯或二酯。公认的脂肪酸二酯的实例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、diisopropyl dimerate和琥珀酸二辛酯。公认的支链脂肪酸酯包括肉豆蔻酸2-乙基-己基酯、硬脂酸异丙酯和异硬脂醇棕榈酸酯。公认的三元酸酯包括三亚油酸三异丙酯和枸橼酸三月桂酯。公认的直链脂肪酸酯包括棕榈酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、oleyl eurcate和硬脂醇油酸酯。优选的酯包括可可辛酸酯/可可癸酸酯(可可辛酸酯和可可癸酸酯的混合物)、丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯、己二酸二异丙酯和鲸蜡醇辛酸酯。
适宜的脂肪醇和脂肪酸包括那些具有10-20个碳原子的化合物。特别优选的是这样的化合物如鲸蜡醇、肉豆蔻醇、棕榈醇和硬脂醇及其相应的酸。
可用作润肤剂的多元醇是直链或支链烷基多羟基化合物。例如丙二醇、山梨糖醇和甘油是优选的。也可以使用聚多元醇如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也是特别优选的渗透增强剂。
可用作润肤剂的烃的实例是那些具有12-30个碳原子的烃链的烃。具体的实例包括矿物油、凡士林、角鲨烯和异链烷烃。
本发明化妆组合物中的另一类功能性组分是增稠剂。增稠剂通常以所述组合物重量的大约0.1-大约20％，优选大约0.5％-大约10％的量存在。增稠剂的实例是以Carbopol为商标购于B.F.Goodrich公司的交联聚丙烯酸酯材料。可使用树胶如黄原胶、角叉菜胶、明胶、梧桐胶、果胶和槐树豆胶。在某些情况下，可通过一种也可以作为硅氧烷或润肤剂的材料实现增稠功能。例如，过量10厘沲的硅树胶和酯如硬脂酸甘油酯具有双重功能性。
粉剂可以混合到本发明的化妆组合物中。这些粉剂包括白垩、滑石粉、漂白土、高岭土、淀粉、绿土粘土、化学改变的硅酸镁铝、有机改性的蒙脱石粘土、水合硅酸铝、烧制二氧化硅、淀粉辛烯基琥珀酸铝及其混合物。
本发明组合物中也可以混合其他辅助性少量成分。这些组分可包括着色剂、遮光剂和香料。这些组分的量的范围可以为组合物重量的0.001％-20％。
本发明的组合物主要作为局部用于人皮肤的产品，特别是作为调理和光滑皮肤的以及防止或减少外部皱纹或老化皮肤的试剂。
在使用中，从合适的容器或者涂覆器中取少量的组合物，例如1到5ml，施用于皮肤暴露的区域，然后如果需要，用手或者手或指或者合适的器具在皮肤上铺展和/或摩擦进入皮肤。
产品形式和包装本发明的局部皮肤治疗组合物可被配制成化妆水、流体霜、乳油或凝胶。
实施例1方法将视黄醇(50％的吐温80溶液)溶于大约50％乙醇水溶液中得到360nm处OD大约为0.6的溶液，所述OD值是使用标准96孔分光光度计在200μl体积的96孔板中测定的。
以大约0.1％的浓度加入增强剂分子并如上立即和在室温下暗处放置60小时后测定OD360。对60小时后的OD进行矫正(除以0.85)用来计算视黄醇因溶剂从板孔中蒸发而增加的浓度。
结果
试验的增强剂引起的视黄醇不稳定性明显增加。
这使得有必要使用制剂/包装选择以便在使用增强剂时提供比单独使用视黄醇更好的视黄醇稳定性。
实施例2为了确定是否协同抑制因B1和B5活性化合物与视黄醇组合发生的谷氨酰胺转移酶表达，有必要确定当各自在视黄醇存在下测定时活性化合物的剂量-反应曲线(包括IC50值)。该数据用于确定各活性化合物适宜的次最大抑制浓度，以可以确定在视黄醇存在下，活性化合物混合物的协同作用。为了证明两种化合物的协同作用，必需选择至多为IC20的测试浓度，换句话说，各自激活视黄醇20％抑制谷氨酰胺转移酶表达时化合物浓度。两种所述化合物应该具有40％的相加抑制作用。利用该方案来确定浓度为发现两种化合物在检测条件下对谷氨酰胺转移酶其他抑制作用的协同性留下40-100％的窗口。更具有挑战性的浓度标准是选择单独使用未显示激活视黄醇抑制谷氨酰胺转移酶抑制作用的化合物浓度。然而，在该研究中，甚至选择更具有挑战性的标准。选择比最小有效谷氨酰胺转移酶抑制浓度低10倍和100倍的化合物浓度。利用所述非常低的浓度来确定协同组合意味着所确定的协同组合是最有效的。
下表中的数据表示比化合物最小抑制浓度低2个对数的化合物的浓度。这些是B1/B5组合研究中所使用的浓度。
表1
为了研究B1和B5活性化合物与视黄醇组合对谷氨酰胺转移酶表达的协同抑制作用，在上表提供的浓度下测试所选择的化合物组合。得到下列数据表2
B1/B5组合的功效分为两类-特别有效的组合(上表下划线部分，即最先的14个组合)和几乎无效的组合(非下划线部分，即最后的6个组合)。意外地发现，某些B1/B5组合比其他组合作用更好。那些几乎无效的组合是(i)脂肪酸酰胺+唑类、(ii)羟基脂肪酸酰胺+唑类和(iii)柑桔素/槲皮黄酮+唑类。有效的组合包含B1增强剂与下列类的B5增强剂的组合脂肪羟乙基咪唑啉表面活性剂、环状脂肪族不饱和化合物、多环状三萜、n-取代脂肪酸酰胺。
尽管本文就某些特性和参考某些优选的具体实例描述了本发明，但本领域那些普通技术人员公认，可以进行已描述过的许多改变、修饰和取代并且它们都包含在本发明范围和精神内。也就是说所有这些修饰和改变都包含在本文所描述和要求保护的范围内，本发明仅受下文权利要求的范围限制，所述权利要求尽可能以合理宽的范围解释。在本说明书全文中，引用了各种出版物和书籍。这些出版物和书籍各全文引入供参考。
权利要求
1.一种稳定的护肤组合物，它包含大约0.0001％-大约50％至少一种类维生素A增强剂；大约0.001％-大约10％类维生素A；和可化妆用载体，其中所述稳定的护肤组合物包在包装中使得所述组合物不与氧接触。
2.权利要求1的稳定的护肤组合物，其中所述组合物含有至少两种大约0.0001％-大约50％量的增强剂。
3.权利要求1的稳定的护肤组合物，其中所述包装包含铝层。
4.权利要求3的稳定的护肤组合物，其中所述包装是由铝制造的。
5.一种调理皮肤的方法，该方法包括将权利要求1的组合物局部应用到皮肤。
6.一种模拟视黄酸对皮肤作用的方法，该方法包括将权利要求1的组合物应用到皮肤。
7.权利要求1的稳定的护肤组合物在制备调理皮肤的药物中的应用。
8.用于调理皮肤的权利要求1的稳定的护肤组合物。
全文摘要
一种稳定的护肤组合物，它包含大约0.0001％－大约50％至少一种类维生素A增强剂，大约0.001％－大约10％类维生素A，和可化妆用载体，其中所述稳定的护肤组合物包在包装中使得所述组合物不与氧接触。
文档编号A61K8/63GK1575161SQ01822921
公开日2005年2月2日 申请日期2001年12月6日 优先权日2000年12月28日
发明者S·P·格兰格尔, P·钱达, I·R·斯科特 申请人:荷兰联合利华有限公司
技术领域：
本发明涉及一种稳定的护肤组合物，它含有类维生素A和类维生素A增强剂系统(booster system)，被装在包装中，以便使得所述组合物不与氧接触。
类维生素A(例如视黄醇和视黄醇酯)是化妆品中常用的组分。视黄醇(维生素A)是内源性化合物，它天然地存在于人体中并且是正常上皮细胞分化必需的。天然的和合成的维生素A衍生物已广泛地用于治疗各种皮肤病并且已用作皮肤修复剂和再生剂。视黄酸已用于治疗各种皮肤病，例如痤疮、皱纹、银屑病、老年斑和脱色。例如参见Vahlquist，A.等人，J.Invest.Dermatol.，94卷，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，496-498页；Ellis，C.N.等人，“Pharmacology of Retinols inSkin，”Basel，Karger，3卷，(1989)，249-252页；和PCT专利申请WO93/19743。
然而，在化妆品制剂中，视黄醇特别不稳定，因为视黄醇受多种因素的影响而发生化学降解，包括氧化、热不稳定性和UV诱导降解。视黄酯也具有这些不稳定性，尽管其程度比视黄醇小。类维生素A对皮肤的好处可通过合用类维生素A增强剂分子得以提高。然而，虽然不是全部，但很多类维生素A增强剂分子也增加视黄醇的不稳定性。因此，与只含有视黄醇的制剂需求相比，更需要保护含有类维生素A增强剂的视黄醇制剂。
在某些参考文献中试图创造稳定的含有视黄醇的组合物。例如，Johnson&Johnson受让的美国专利5,976,555中公开了护肤组合物，它们包括其中含有类维生素A、乳化剂系统和助乳化剂的水包油乳剂。该专利描述了一种用于保存组合物的容器的使用以便组合物不与氧接触。该容器被描述为用于只含有乳化剂系统和助乳化剂的类维生素A组合物而不能防止由于与类维生素A增强剂接触所引起的类维生素A降解。
L’Oreal受让的美国专利5,800,596中公开了一种在分配装置中含有视黄醇的油包水乳剂，所述分配装置具有不透氧和UV光的壁和捕氧装置。该专利中没有教导和建议增强剂的使用和在增强剂存在下与类维生素A稳定性有关的问题。
以上所引用的参考文献中无一教导和建议在类维生素A增强剂存在下稳定类维生素A组合物的系统。因此，仍然需要这样的稳定的含有类维生素A和类维生素A增强剂的化妆品组合物。
本发明提供了一种稳定的护肤组合物，它含有大约0.0001％-大约50％的至少一种类维生素A增强剂；大约0.001％-大约10％的类维生素A；和可化妆用载体，其中将稳定的护肤组合物装在一个包装中以便使所述组合物不与氧接触。
作为优选的组分，本发明组合物包含类维生素A，它选自视黄酯、视黄醇、视黄醛和视黄酸，优选视黄醇和视黄酯。术语“视黄醇”包括下列的视黄醇异构体全反式-视黄醇、13-顺式-视黄醇、11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇、3，4-二脱氢-13-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-11-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-9-顺式-视黄醇。优选的异构体是全反式-视黄醇、13-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇、9-顺式-视黄醇。由于具有广泛的商业可获得性，最优选的是全反式-视黄醇。
视黄酯是视黄醇的酯。术语“视黄醇” 定义同上。适用于本发明的视黄酯是视黄醇的C1-C30酯，优选C2-C20酯，并且最优选C2、C3和C16酯，因为它们更容易通过商业渠道获得。视黄酯的实例包括但不限制于棕榈酸视黄酯、甲酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、丁酸视黄酯、戊酸视黄酯、异戊酸视黄酯、己酸视黄酯、庚酸视黄酯、辛酸视黄酯、壬酸视黄酯、癸酸视黄酯、十一烷酸视黄酯、月桂酸视黄酯、十三烷酸视黄酯、十四烷酸视黄酯、十五烷酸视黄酯、十七烷酸视黄酯、硬脂酸视黄酯、异硬脂酸视黄酯、十九烷酸视黄酯、花生四烯酸视黄酯、山萮酸视黄酯、亚油酸视黄酯、油酸视黄酯。
优选的用于本发明的酯选自棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯和丙酸视黄酯，因为这些酯最容易通过商业渠道获得并因此是最便宜的。亚油酸视黄酯和油酸视黄酯因其功效也是优选的。
在本发明组合物中所使用的视黄醇和视黄酯的量大约为0.001％-大约10％，优选的量大约为0.01％-大约1％，最优选的量大约为0.01％-大约0.5％。
已确信，类维生素A在皮肤中按照流程1的机理通过酶转化为视黄酸。
视黄醇在表皮中的代谢酶的名称 ARAT/LRAT＝乙酰辅酶A(CoA)视黄醇乙酰基转移酶/卵磷脂视黄醇乙酰基转移酶CRABPII＝细胞视黄酸结合蛋白II意外地发现，某些化合物抑制ARAT/LRAT、视黄醛还原酶、CRABPII和视黄酸氧化(后者通过细胞色素(cytochrome)P450系统催化)，而某些其他化合物增强视黄醇脱氢酶的作用。所述化合物在本文统称为“增强剂”并且编码为B1-B5组，如上文流程1所示。增强剂单独或彼此联合应用通过增加可转化成视黄酸的视黄醇的量和抑制视黄酸的降解来增强类维生素A的作用。增强剂与类维生素A(例如视黄醇、视黄酯、视黄醛、视黄酸)联合起作用，后者是皮肤中内源性存在的。然而，为了达到最佳性能，优选的组分包括在所述组合物中的类维生素A和共同存在的增强剂。
本发明部分包括第二种组合物，它包含占所述组合物重量的大约0.0001％-大约50％，优选大约0.001％-大约10％，最优选大约0.001％-大约5％的至少一种增强剂化合物和可化妆用载体，其中所述化合物单独或以10mM的组合浓度在体内谷氨酰胺转移酶测定中抑制谷氨酰胺转移酶至50％以上。
本发明组合物中所包含的增强剂选自(a)、两种增强剂，其中二者都选自由B2、B3和B4组成的相同组中；(b)、增强剂的二元组合，选自B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3；B2/B4；B2/B5；B3/B4；B3/B5；B4/B5(c)、增强剂的三元组合，选自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5(d)、增强剂的四元组合，选自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和(e)、五组增强剂的组合B1/B2/B3/B4/B5。
优选的组合物包括至少一种来自不同组(即上述(b)-(e)组)的增强剂。然而，在本发明组合物中，也可以使用选自不同组的增强剂的任何组合来提供所需要的激活作用。
如下2.1-2.7节所述，首先根据化合物以表A中所列出的某浓度通过特定酶体外微粒体测定的能力来选择在本发明中用作增强剂的该化合物。然后，如下所述，将化合物(单独或与另一增强剂一起)以10mM的单一或组合浓度进行体外谷氨酰胺转移酶测定。如果所述组合抑制谷氨酰胺转移酶至50％以上，那么它适用于本发明。如果对增强剂进行单独的测试并且该增强剂通过了谷氨酰胺转移酶测定，那么它可以与另一通过谷氨酰胺转移酶测定的增强剂或组合物联合使用。
优选的本发明组合物包括至少以10mM的各自浓度抑制谷氨酰胺转移酶至50％以上的增强剂的组合物。
本文所使用的术语“调理”是指预防和治疗干燥皮肤、痤疮、光损伤性皮肤、皱纹、老年斑、皮肤老化，增加角质层柔韧性、使皮肤的颜色变明亮、控制皮脂排泄和一般性地增加皮肤的质量。该组合物可用于改善皮肤脱屑和表皮分化。
增强剂是通过下文2.1-2.7节所描述的体外微粒体测定的化合物。适用于本发明的化合物在表A所列出的浓度下将酶至少抑制或增加到表A所列出的宽范围百分数。
表A增强剂试验浓度和抑制/增加百分数(％)ARAT/LRAT的测定 (用于识别B1增强剂)
视黄醇脱氢酶的测定 (用于识别B2增强剂)
视黄醛还原酶的测定 (用于识别B3增强剂)
CRABPII拮抗剂的测定 (用于识别B4增强剂)
视黄酸氧化的测定 (用于识别B5增强剂)
下面是用于确定本发明组合物中化合物包合(inclusion)的适应性的体外微粒体测定法1、材料全反式-视黄醇、全反式-视黄酸、棕榈酰基-CoA、二月桂酰基磷脂酰胆碱、NAD和NADPH购于Sigma化学公司。用HPLC级乙腈配制用于微粒体测定的类维生素A贮备液。所有用于HPLC分析的类维生素A的标准贮备液都用乙醇配制，在-70℃、N2环境下贮存并且当离开贮存条件时，在琥珀色光照下保存在冰上。其他化学品和抑制剂通过商业渠道购于化妆材料供应商或化学品公司如Aldrich或InternationalFlavors and Fragrances。
2、方法2.1、RPE微粒体的分离(改良的J.C.Saari & D.L.Bredberg，“CoAand Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal PigmentEpithelium”，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988))。
从W.L.Lawson Co.，Lincoln，NE，USA获得50个除去视网膜和水状液的冷冻对切牛眼杯。将眼解冻过夜并通过用镊子剥皮除去有色的彩虹膜。各眼用2×0.5ml冷缓冲液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)洗涤并用艺术家的刷子或橡胶膜擦去黑色素沉着的细胞。将细胞悬浮液加到彩虹膜中并将该悬浮液在烧杯中用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌几分钟。悬浮液通过粗滤器(Spectra/Por 925μ孔径聚乙烯筛)过滤以便除去大颗粒，所得到的深色悬浮液用Glas-Col和马达驱动的聚四氟乙烯均化器搅拌均匀，将细胞均化物在20,000g下(Sorvaal RC-5B型离心机，具有SS34马达，2.5×10cm离心管，14,000RPM转速)离心30分钟。所得到的上清液在150,000g下(Becman L80型超速离心机，具有SW50.1马达，13×51mm离心管，40,000RPM转速)进一步离心60分钟。将所得到的沉降物利用Heat Systems Ultrasonics，Inc.的W185D型Sonifier Cell Disruptor分散到～5ml 0.1M PO4/5mM DTT，pH7缓冲液中，并将所得到的微粒体分散液等分到小管子中并在-70℃下贮存。利用BioRad Dye结合测定法，用BSA作为标准测定微粒体中蛋白质的浓度。
2.2、鼠肝脏微粒体的分离(R.Martini & M.Murray，“Participation ofp450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-hydroxylation”，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993))。
将6g冷冻鼠肝脏(由Accurate Chemical and Scientific Corp.的Harlan Sprague Dawley鼠获得)在3体积的0.1M tris/0.1M KCl/1mMEDTA/0.25M蔗糖，pH7.4缓冲液中用Brinkmann Polytron搅拌均匀。所得到的组织悬浮液进一步在上述马达驱动的聚四氟乙烯均化器中搅拌均匀。将所得到的均化物相继在10,000g下离心30分钟，在20,000g下离心30分钟和在30,000g下离心15分钟，所得到的上清液在105,000g下超速离心80分钟。所得到的沉降物在上述～5ml 0.1M PO4/0.1mMEDTA/5mM MgCl2，pH7.4缓冲液中进行声处理并在-70℃下以等份试样贮存。如上测定蛋白质浓度。
2.3、测定ARAT和LRAT活性(用于识别B1)下列方法是改良的J.C.Saari & D.L.Bredberg，“ARAT&LRATActivities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes”，MethodsEnzymol.190，156-163(1990)方法。制备下列缓冲液并在4℃下贮存0.1M PO4/5mM二硫苏糖醇，pH7.0(PO4/DTT)。在测定的当天，每ml缓冲液加入2mg BSA得到PO4/DTT/BSA工作缓冲液。在乙腈中制备1mM视黄醇底物并在-20℃和氮气下贮存在琥珀色瓶子中。制备4mM棕榈酰基-CoA在工作缓冲液中的溶液(以等份试样贮存)和4mM二月桂酰基磷脂酰胆碱的乙醇溶液并在-20℃下贮存。制备10mM抑制剂的H2O、乙醇、乙腈或DMSO储备液。利用含有50μg/ml丁化羟基甲苯(BHT)的纯乙醇制备淬火溶液并利用含有50μg/ml BHT的己烷溶液来提取。
向2英钱玻璃小瓶中按顺序加入下列组分500μl总体积的PO4/DTT/BSA缓冲液、5μl酰基供体(4mM棕榈酰基CoA和/或二月桂酰基磷脂酰胆碱)、5μl抑制剂或溶剂空白(10mM原料或其他稀释剂)，然后加入大约15μg RPE微粒体蛋白质(大约15μl、～1mg/ml的微粒体蛋白质等份试样)。在37℃下培养5分钟至与反应温度平衡，然后加入5μl1mM视黄醇。给小瓶盖上盖子，涡流搅拌5秒钟并在37℃下培养30-90分钟。通过加入0.5ml乙醇/BHT淬灭反应。通过加入3ml己烷/BHT提取类维生素A，涡流搅拌提取管几次，每次数秒钟，并在低转速下将提取管离心5分钟至迅速分层。将上层的己烷层转移到干净的小瓶中，并如上所述用另外3ml己烷/BHT再提取水层。合并己烷层并通过在37℃和氮气流下，在加热的铝块上干燥蒸发己烷。干燥的残渣在-20℃下贮存直至HPLC分析。通过如下所述对HPLC信号积分，分别就ARAT和LRAT活性对棕榈酸视黄酯和月桂酸视黄酯的量进行定量。
注意，所述培养溶液中包含40μM乙酰基供体、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄醇、大约30μg/ml微粒体蛋白质和接近0.1M PO4、pH7/5mM DTT/2mg/ml BSA。加入视黄醇后的所有步骤都在暗光线或琥珀色光线下进行。
2.4、测定视黄醇脱氢酶的活性(用于识别B2)制备下列浓储备液50mM KH2PO4、pH7.4缓冲液，无菌过滤过。
10mM全反式视黄醇(Sigma R7632)的DMSO溶液。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP)(Sigma N0505)的无菌水溶液。
40mM试验化合物在适宜的溶剂(水、缓冲液、乙醇、氯仿或DMSO)中的溶液。
1∶10稀释的鼠肝脏微粒体的50mM KH2PO4、pH7.4缓冲液(4ug/ul)。
在具有螺帽的2英钱玻璃小瓶中按顺序加入下列物质缓冲液，至终体积为400μl25μl稀微粒体(最终量＝100μg)-利用煮过的微粒体作对照和常规的微粒体作为试验样品。
4μl200mM NADP(最终量＝2mM)1μl40mM试验化合物(最终量＝100μM)8μl10mM视黄醇(最终量＝200μM)将小瓶在37℃振荡水浴中培养45分钟。向各小瓶中加入500μl冰冷却的乙醇使得反应淬灭。用冰冷却的己烷(每次2.7ml)提取类维生素A两次。在第一次提取过程中，向各小瓶中加入乙酸视黄酯(5μl900μM的储备液)作为监测各样品提取功效的手段。将样品涡流搅拌10秒钟，然后在5℃的Beckman GS-6R离心机上，在1000rpm转速下轻轻地离心5分钟。每次提取后，将上层含有类维生素A的己烷从水层中转移到干净的2英钱小瓶中。在微弱的氮气流下蒸发除去己烷。干燥的残渣在-20℃下贮存直至HPLC分析。
2.5、测定视黄醛还原酶的活性(用于识别B3)如上所述，用下列物质代替上述物质制备所有储备液l0mM全反式视黄醛(Sigma R2500)的DMSO溶液-代替视黄醇。
200mM，还原型(reduced form)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐(NADPH)(Sigma N7505)的无菌水溶液-代替NADP。
在具有螺帽的2英钱玻璃小瓶中按顺序加入下列物质缓冲液，至终体积为400μl25μl稀微粒体(最终量＝100μg)-利用煮过的微粒体作对照和常规的微粒体作为试验样品。
4μl200mM NADPH(最终量＝2mM)1μl40mM试验化合物(最终量＝100μM)3μl10mM视黄醛(最终量＝75μM)如上所述进行相同的培养和提取过程。
2.6、测定CRABPII拮抗剂(用于识别B4)2.6.1、CRABPII的合成
a.表达系统在pET29a-c(+)质体(Novagen)中克隆基因CRABPII。克隆的基因处于强噬菌体T7转录和翻译信号的控制下。T7聚合酶源是由宿主细胞E.Coli BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供的。后者具有在lacUV5控制下由所存在的IPTG诱导的染色体复制的T7聚合酶。按照制造商(Novagen)教导的方法，通过转换将质体转移到E.Coli BLR(DE3)pLysS细胞中。
b.诱导将过夜培养的转化细胞按照1∶100的比例在含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2×YT中稀释。细胞生长同时在37℃下振摇直至在600nm下OD达到0.6-0.8。然后加入IPTG至终浓度为1mM并将培养基再培养2小时。通过在5000g转速下在室温下离心10分钟捕获细胞。沉积物在-20℃下贮存。
2.6.2、纯化按照Norris和Li，1997中所描述的方法进行纯化。
a.溶胞作用将冷冻的沉积物在RT下解冻并再悬浮在1-2体沉积物体积的新制备溶胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8、10％(w/v)蔗糖、1mMEDTA、0.05％(w/v)叠氮化钠、0.5mM DTT、10mM MnCl2、2.5mM苯甲基磺酰氟、2.5mM苯甲脒、6μg/mL DNase)中。溶胞产物在室温下再培养30分钟。通过声处理(在10,000psi压力下脉冲6个30-秒与在冰上延迟5个30-秒交替进行)进一步溶胞。溶胞产物不溶性部分通过在4℃15000rpm下离心1小时除去并且将上清液在-20℃下贮存。
b.在Sephacryl S300上进行凝胶过滤将步骤a.得到的上清液在室温下装载到sephacryl S-300(Pharmacia)的2.5×100cm柱子。洗脱缓冲液为20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％叠氮化钠(缓冲液A)。流速为2mL/min。所收集的2-mL馏分在280nm下检查紫外吸收。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查代表峰值的馏分中CRABPII的存在。
c.阴离子-交换色谱法将2mL含有CRABPII的凝胶过滤馏分装载到FPLC(快速蛋白质液体色谱法)monoQ型(Pharmacia)的季铵阴离子交换柱上。CRABPII在室温下用100％缓冲液A-30％缓冲液B的梯度缓冲液(100％缓冲液B＝缓冲液A+250mM NaCl)洗脱20分钟。每分钟收集1mL-馏分。再次通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来检查CRABPII的存在。将CRABPII在4℃下贮存，然后用具有安放小瓶平台附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards High Vacuum International)冷冻干燥。将干燥的样品在室温下贮存直至结合测定时使用。
d.检测CRABPII的存在利用变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析，在7-15％聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)上进行CRABPII的表达和纯化。将10μL样品与10μL 2X填充缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通过加热变性(在80℃下加热2min)。将样品装载到浸在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)中的凝胶上并在室温下施加恒电流(25mA)1小时。考马斯蓝染色后，按照用Benchmark预染色蛋白梯(Gibco BRL)测定的蛋白质分子量来识别所述蛋白质。
利用蛋白质印迹来确定CRABPII的存在。利用Biorad暗盒将SDS-PAGE分离到的蛋白质转移到Immobilon-P转移膜(Millipore)上。所述转移在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)+10％甲醇中进行。施加3小时电流(60mA)以便让蛋白质通过膜迁移。然后，该膜在室温下用5％干奶的1X TBS溶液阻断1小时并在4℃下用具有初级抗体的探针探测在相同缓冲液中的CRABPII(1/1000稀释的鼠抗克隆5-CRA-B3)过夜。接下来，将膜用PBS洗涤(3×5分钟)，然后与1∶2000稀释的二级抗体、轭合过氧化物酶的抗鼠抗体(ECLTM，Amersham)一起在室温下培养1小时。将膜用1×PBS洗涤(3×5分钟)并如生产商说明书(Amersham)中所述，利用ECL检测工具包检测蛋白质。
利用BSA工具包(Pierce)测定纯CRABPII的浓度。
2.6.3、放射性结合测定将220pmol CRABPII在总体积为70uL的20mM Tris-HCl缓冲液pH7.4和15pmol放射性全反式视黄酸(NEN)中一起培养。为了进行竞争性测定，将另一过量的配体(6670∶1、670∶1或70∶1)加到该混合物中。反应在室温下和暗处下进行1小时。为了将未结合的全反式视黄酸与结合的全反式视黄酸分离，使用6kD断流微型色谱柱(Biorad)。如生产商说明书(Pharmacia)中所述，利用Microplex多支管弃去储备缓冲液。将样品装载到柱子上并通过重力作用分离30分钟。滤液中出现与CRABPII结合的视黄酸(″RA″)，而游离的RA保留在柱子上。通过闪烁计数器测定滤液的放射性。
2.7、测定NADPH依赖性视黄酸氧化作用(用于识别B5)下列方法是R.Martini & M.Murray，″Participation of P450 3AEnzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-hydroxylation″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)中所述方法的改良。制备下列测定缓冲液并在4℃下贮存0.1M PO4/0.lmM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。在测定当天，制备60mM NADPH在缓冲液中的溶液。如上所述制备抑制剂储备液、酸化乙醇/BHT淬灭液和己烷/BHT。通过用乙醇稀释15mM储备液(在DMSO中)制备1mM视黄酸工作液。
向2英钱小瓶中按顺序加入物质测定缓冲液至终体积500μL，20μL 60mM NADPH，5μL抑制剂或溶剂空白，然后大约2mg鼠肝脏微粒体蛋白质。在37℃下培养5分钟，然后加入5μL 1mM视黄酸工作液。在37℃下连续培养60分钟-不要给小瓶加盖，因为该氧化过程除需要NADPH外需要分子O2。如上所述用酸化乙醇/BHT淬灭并用己烷/BHT提取。通过如下所述对HPLC信号整合来确定快速洗脱的极性视黄酸代谢物(推测为4-氧代视黄酸)的量。
注意，加入视黄酸后的所有步骤都在暗光线或琥珀色光线下进行。最终的培养液中包含2.4mM NADPH、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄酸、大约4mg/mL鼠肝脏微粒体蛋白质和接近0.1M PO4/0.lmMEDTA/5mM MgCl2。
各种类维生素A的HPLC分析通过在各小瓶中用100μL甲醇溶解残渣来制备通过HPLC确定类维生素A量的样品。将该溶液转移到在lmL外壳小瓶内的150μL玻璃锥形管中，盖紧并放在Waters 715自动进样器中。立即注射60μL等份试样量并分析类维生素A的含量。
色谱分析设备包括Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光电二极管阵列检测器和Waters 474扫描荧光检测器。两组HPLC记录用于类维生素A的分析。在ARAT和LRAT分析中，用Waters3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保护柱进行视黄醇和视黄酯的分离，用调至流速为lmL/分钟的80∶20(v/v)甲醇/THF无梯度流动相洗脱10分钟。洗脱液在325nm下监测吸收度并在325ex/480em下监测荧光。在利用A.B.Barua，″Analysisof Water-Soluble CompoundsGlucuronides″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)中所描述的改良梯度系统进行视黄醇和视黄酸氧化分析时，利用较短的Waters 3.9×l50mm C18 Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保护柱来分离视黄酸和醇。该系统包括从含有10mM乙酸胺的68∶32(v/v)甲醇/水开始至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷结束的20分钟线性洗脱和在lmL/min的流速下保持5分钟。在300nm-400nm下监测该柱洗脱液。
这些分析方法可根据其在各测定中清楚地解析有关视黄酸、视黄醇、视黄醛和/或视黄酯的能力和相对分离速度来选择。通过HPLC识别各类维生素A是基于未知峰与可获得的可信的类维生素A标准品滞留时间的准确匹配和未知峰与可获得的可信的类维生素A的UV光谱分析(300-400nm)进行的。
适用于谷氨酰胺转移酶测定中进一步测试的增强剂包括但不限制于下文表B1-B5中所列出的增强剂。
ARAT/LRAT抑制剂(B1)
视黄醇脱氢酶活化剂(B2)
视黄醛还原酶抑制剂(B3)
CRABPII拮抗剂(B4)
视黄酸氧化抑制剂(B5)
在下文所描述的谷氨酰胺转移酶测定中，增强剂或其组合物在10mM浓度下抑制谷氨酰胺转移酶(以下称“Tgase”)至至少50％。
Tgase测定
谷氨酰胺转移酶的测定和角质化细胞的分化在表皮末端分化过程中，在细胞外周的内表面形成15nm厚的蛋白质层，已知为角质化膜(CE)。CE由许多已通过形成Nε-(Y-谷氨酰)赖氨酸异二肽键交联在一起的不同的蛋白质构成，所述交联作用是由至少两种不同的谷氨酰胺转移酶(TGases)在表皮上的表达作用催化的。Tgase I大量地在表皮分化层特别是在粒层中表达，但不存在于未分化的基底表皮。因此Tgase I是有用的表皮角质化细胞分化标志，高TGaseI水平表示一种更分化状态。利用Tgase I抗体进行基于ELISA的Tgase I测定以评定下列实施例中所培养角质化细胞的分化状态。
将角质化细胞(如上所述培养的)以每孔200μl培养基中4,000-5,000个细胞的密度放在96孔平板中。培养2-3天或者直至～50％的细胞融合后，将培养基改换未含试验化合物的培养基(每次试验平行测定5次)。将该细胞再培养96小时，然后吸出培养基并将平板在-70℃下贮存。从冷冻器中取出平板，用200μl lx PBS洗涤细胞两次。该细胞在室温(R/T)下与TBS/5％BSA(洗涤缓冲液，牛血清白蛋白)一起再培养1小时。接下来加入Tgase初级抗体50μl单克隆抗-Tgase I Ab B.C.，在洗涤缓冲液中稀释1∶2000倍。初级抗体在37℃下培养2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗6x。将该细胞与50μl在洗涤缓冲液中稀释1∶4,000倍的二级抗体(由Amersham获得的Fab片段，轭合过氧化物酶的抗鼠IgG)一起在37℃下培养2小时，然后用洗涤缓冲液冲洗3次。用洗涤缓冲液冲洗后，该细胞用PBS冲洗3x。为了比色显色，将细胞与100ul底物溶液(在10ml 0.1M pH5.0的枸橼酸缓冲液中含4mg邻苯二胺和3.3μl 30％H2O2)一起在R/T下，在暗处(在铝箔遮盖下)精确培养5分钟。通过加入50μl4NH2SO4终止反应。在492nm下，在96孔平板UV分光光度计中测定样品的吸收度。在5份平行测定的样品中，4份用两种抗体处理，第5份用作Tgase背景对照。测定Tgase水平并以对照的百分数表示。
测定谷氨酰胺水平并如上表B1-B5表示为(i)％(增强剂+视黄醇抑制/对照抑制)-％(ROH抑制/对照抑制)，它测定了与单独的视黄醇相比，所加入的增强剂+视黄醇诱导的Tgase抑制作用，或(ii)在测定多个浓度增强剂的抑制作用时所得到的IC50值-它提供与10-7M恒定浓度的视黄醇合用抑制Tgase达50％时所需要增强剂的浓度。
IC50值用作本发明中的基准。
用于谷氨酰胺转移酶测定试验的最佳增强剂组B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
可渗透最小量氧的包装如上所讨论的，包含类维生素A的组合物通常是不稳定的并且可发生化学降解。而且，意外地发现，增强剂，尽管有利于增强类维生素A的益处，但也导致类维生素A的化学不稳定性。增强剂诱导的视黄醇的不稳定作用急剧地降低了当两种组分同时包含在一种制剂中时激活的类维生素A系统的总功效。因此，与只含有类维生素A的组合物相比，更需要保护含有增强剂的制剂中的类维生素A组合物以避免破坏至较高程度。具体地说，需要制备稳定的含有类维生素A和类维生素A增强剂的组合物以便提供类维生素A增强剂有益的激活作用，同时防止类维生素A在激活作用前可能发生降解。因此，本发明提供一种包装，它可最少地渗透氧以便稳定类维生素A和增强剂的组合物，因此使得增强剂诱导的类维生素A降解最小。
可渗透最少量氧的包装可通过本领域普通技术人员已知的各种方法制造。具体地说，本发明组合物不应该直接与氧或空气接触，并且应该防止氧通过包装的外壁渗透。可使用不透光和不渗透氧的包装。例如可使用铝作为包装的壁或包装的内衬。
可化妆用载体本发明产品也包含化妆品可用载体作为第一种或第二种组合物中或两种组合物中活性组分的稀释剂、分散剂或载体，以便于当所述组合物应用于皮肤时促进其分配。
非水的或除水以外的载体还可包括液体或固体润肤剂、溶剂、润湿剂、增稠剂和粉剂。特别优选的非水载体是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本发明聚硅氧烷可以是那些在25℃下粘度范围大约为10-10,000,000厘沲的聚硅氧烷。特别可取的是低粘度和高粘度的聚硅氧烷的混合物。这些聚硅氧烷以Vicasil，SE和SF为商标购于通用电气公司和以200和550Series为商标购于Dow Corning公司。可在本发明组合物中使用的聚硅氧烷的量为组合物重量的5-95％，优选25-90％范围。
任选的益肤材料和化妆用辅助物油或油性材料可以与乳化剂一起存在以便提供油包水或水包油乳剂，这主要依赖于所使用的乳化剂的平均亲水亲油平衡值(HLB)。
本发明化妆组合物中可存在各种活性组分并描述于下文中。活性剂定义为除润肤剂和仅仅改善组合物物理特性的组分外的益肤剂或益发剂。尽管不限制于该种类，但一般的实例包括防晒剂、皮肤光亮剂、晒黑剂。
防晒剂包括那些常用于阻断紫外光的材料。例举的化合物是PABA、肉桂酸酯(盐)和水杨酸酯(盐)的衍生物。例如，可使用辛基甲氧基肉桂酸酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮(也称作oxybenzone)。辛基甲氧基肉桂酸酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮可分别以Parsol MCX和二苯酮-3为商标购得。
乳剂中所使用的防晒剂的确切量取决于对太阳紫外照射所需防护的程度。
另一种优选的任选组分选自必需脂肪酸(EFAs)，即，所有细胞质膜形成所必需的那些脂肪酸，在角质化细胞中EFA缺乏导致细胞过度增殖。补充EFA可矫正这种过度增殖。EFA也增强表皮的磷脂生物合成并为表皮屏障形成提供磷脂。这些必需脂肪酸优选选自亚油酸、Y-亚麻酸、高-Y-亚麻酸、columbinic acid、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、己烯酸及其混合物。
通常将润肤剂混合到本发明化妆组合物中。所述润肤剂的含量可以为总组合物重量的大约0.5％-大约50％，优选大约5％-大约30％。按照这样的一般化学种类，润肤剂可以分类为酯、脂肪酸和醇、多元醇和烃。
酯可以是一酯或二酯。公认的脂肪酸二酯的实例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、diisopropyl dimerate和琥珀酸二辛酯。公认的支链脂肪酸酯包括肉豆蔻酸2-乙基-己基酯、硬脂酸异丙酯和异硬脂醇棕榈酸酯。公认的三元酸酯包括三亚油酸三异丙酯和枸橼酸三月桂酯。公认的直链脂肪酸酯包括棕榈酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、oleyl eurcate和硬脂醇油酸酯。优选的酯包括可可辛酸酯/可可癸酸酯(可可辛酸酯和可可癸酸酯的混合物)、丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯、己二酸二异丙酯和鲸蜡醇辛酸酯。
适宜的脂肪醇和脂肪酸包括那些具有10-20个碳原子的化合物。特别优选的是这样的化合物如鲸蜡醇、肉豆蔻醇、棕榈醇和硬脂醇及其相应的酸。
可用作润肤剂的多元醇是直链或支链烷基多羟基化合物。例如丙二醇、山梨糖醇和甘油是优选的。也可以使用聚多元醇如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也是特别优选的渗透增强剂。
可用作润肤剂的烃的实例是那些具有12-30个碳原子的烃链的烃。具体的实例包括矿物油、凡士林、角鲨烯和异链烷烃。
本发明化妆组合物中的另一类功能性组分是增稠剂。增稠剂通常以所述组合物重量的大约0.1-大约20％，优选大约0.5％-大约10％的量存在。增稠剂的实例是以Carbopol为商标购于B.F.Goodrich公司的交联聚丙烯酸酯材料。可使用树胶如黄原胶、角叉菜胶、明胶、梧桐胶、果胶和槐树豆胶。在某些情况下，可通过一种也可以作为硅氧烷或润肤剂的材料实现增稠功能。例如，过量10厘沲的硅树胶和酯如硬脂酸甘油酯具有双重功能性。
粉剂可以混合到本发明的化妆组合物中。这些粉剂包括白垩、滑石粉、漂白土、高岭土、淀粉、绿土粘土、化学改变的硅酸镁铝、有机改性的蒙脱石粘土、水合硅酸铝、烧制二氧化硅、淀粉辛烯基琥珀酸铝及其混合物。
本发明组合物中也可以混合其他辅助性少量成分。这些组分可包括着色剂、遮光剂和香料。这些组分的量的范围可以为组合物重量的0.001％-20％。
本发明的组合物主要作为局部用于人皮肤的产品，特别是作为调理和光滑皮肤的以及防止或减少外部皱纹或老化皮肤的试剂。
在使用中，从合适的容器或者涂覆器中取少量的组合物，例如1到5ml，施用于皮肤暴露的区域，然后如果需要，用手或者手或指或者合适的器具在皮肤上铺展和/或摩擦进入皮肤。
产品形式和包装本发明的局部皮肤治疗组合物可被配制成化妆水、流体霜、乳油或凝胶。
实施例1方法将视黄醇(50％的吐温80溶液)溶于大约50％乙醇水溶液中得到360nm处OD大约为0.6的溶液，所述OD值是使用标准96孔分光光度计在200μl体积的96孔板中测定的。
以大约0.1％的浓度加入增强剂分子并如上立即和在室温下暗处放置60小时后测定OD360。对60小时后的OD进行矫正(除以0.85)用来计算视黄醇因溶剂从板孔中蒸发而增加的浓度。
结果
试验的增强剂引起的视黄醇不稳定性明显增加。
这使得有必要使用制剂/包装选择以便在使用增强剂时提供比单独使用视黄醇更好的视黄醇稳定性。
实施例2为了确定是否协同抑制因B1和B5活性化合物与视黄醇组合发生的谷氨酰胺转移酶表达，有必要确定当各自在视黄醇存在下测定时活性化合物的剂量-反应曲线(包括IC50值)。该数据用于确定各活性化合物适宜的次最大抑制浓度，以可以确定在视黄醇存在下，活性化合物混合物的协同作用。为了证明两种化合物的协同作用，必需选择至多为IC20的测试浓度，换句话说，各自激活视黄醇20％抑制谷氨酰胺转移酶表达时化合物浓度。两种所述化合物应该具有40％的相加抑制作用。利用该方案来确定浓度为发现两种化合物在检测条件下对谷氨酰胺转移酶其他抑制作用的协同性留下40-100％的窗口。更具有挑战性的浓度标准是选择单独使用未显示激活视黄醇抑制谷氨酰胺转移酶抑制作用的化合物浓度。然而，在该研究中，甚至选择更具有挑战性的标准。选择比最小有效谷氨酰胺转移酶抑制浓度低10倍和100倍的化合物浓度。利用所述非常低的浓度来确定协同组合意味着所确定的协同组合是最有效的。
下表中的数据表示比化合物最小抑制浓度低2个对数的化合物的浓度。这些是B1/B5组合研究中所使用的浓度。
表1
为了研究B1和B5活性化合物与视黄醇组合对谷氨酰胺转移酶表达的协同抑制作用，在上表提供的浓度下测试所选择的化合物组合。得到下列数据表2
B1/B5组合的功效分为两类-特别有效的组合(上表下划线部分，即最先的14个组合)和几乎无效的组合(非下划线部分，即最后的6个组合)。意外地发现，某些B1/B5组合比其他组合作用更好。那些几乎无效的组合是(i)脂肪酸酰胺+唑类、(ii)羟基脂肪酸酰胺+唑类和(iii)柑桔素/槲皮黄酮+唑类。有效的组合包含B1增强剂与下列类的B5增强剂的组合脂肪羟乙基咪唑啉表面活性剂、环状脂肪族不饱和化合物、多环状三萜、n-取代脂肪酸酰胺。
尽管本文就某些特性和参考某些优选的具体实例描述了本发明，但本领域那些普通技术人员公认，可以进行已描述过的许多改变、修饰和取代并且它们都包含在本发明范围和精神内。也就是说所有这些修饰和改变都包含在本文所描述和要求保护的范围内，本发明仅受下文权利要求的范围限制，所述权利要求尽可能以合理宽的范围解释。在本说明书全文中，引用了各种出版物和书籍。这些出版物和书籍各全文引入供参考。
权利要求
1.一种稳定的护肤组合物，它包含大约0.0001％-大约50％至少一种类维生素A增强剂；大约0.001％-大约10％类维生素A；和可化妆用载体，其中所述稳定的护肤组合物包在包装中使得所述组合物不与氧接触。
2.权利要求1的稳定的护肤组合物，其中所述组合物含有至少两种大约0.0001％-大约50％量的增强剂。
3.权利要求1的稳定的护肤组合物，其中所述包装包含铝层。
4.权利要求3的稳定的护肤组合物，其中所述包装是由铝制造的。
5.一种调理皮肤的方法，该方法包括将权利要求1的组合物局部应用到皮肤。
6.一种模拟视黄酸对皮肤作用的方法，该方法包括将权利要求1的组合物应用到皮肤。
7.权利要求1的稳定的护肤组合物在制备调理皮肤的药物中的应用。
8.用于调理皮肤的权利要求1的稳定的护肤组合物。
全文摘要
一种稳定的护肤组合物，它包含大约0.0001％－大约50％至少一种类维生素A增强剂，大约0.001％－大约10％类维生素A，和可化妆用载体，其中所述稳定的护肤组合物包在包装中使得所述组合物不与氧接触。
文档编号A61K8/63GK1575161SQ01822921
公开日2005年2月2日 申请日期2001年12月6日 优先权日2000年12月28日
发明者S·P·格兰格尔, P·钱达, I·R·斯科特 申请人:荷兰联合利华有限公司
最新回复(0)