亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊的制作方法
专利名称：亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊的制作方法
亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊本发明涉及特别适用于递送亲脂性或两亲性治疗剂的纳米乳剂类型的组合物、其制备方法和将其用于治疗和诊断疾病、特别是癌症的方法。
背景技术：
纳米药物构成了融合纳米技术和药物产生的新领域并且目前是用于研发有效靶向疗法、特别是肿瘤学的最富有希望的途径之一。就此而言，荷载治疗剂的纳米粒构成通过促成靶向癌组织、被动和/或主动靶向克服药物、特别是抗癌药的低选择性的理想解决方案，并且这是减少严重副作用的方式。为了治疗和成像应用，已经测试了大量纳米粒，既有无机物(例如半导体、二氧化硅或氧化物)，又有有机物(天然或合成聚合物、脂质体、纳米球、纳米囊、微球)。已经发现聚合物纳米粒具有特别与有机溶剂残留物相关的潜在细胞毒性和大规模生产难以再现和贮存期限问题。脂质体在稳定性和亲脂性化合物包囊度方面受限并且其生产方法复杂。作为聚合物纳米粒的可替代选择，自从1990以来注意力集中于脂质纳米粒，其包含更通常地基于可生物降解的甘油三酯类的脂质芯，其被聚合物壳包围。生物相容性脂质的选择及其不使用溶剂生产的可能性使得显著降低其毒性成为可能(Muller，R. H.，Eur J PharmBiopharm 2000，50，161-177 ；Mehnert, W.等人，Advanced DrugDelivery Reviews 2001，47，165-196)。更常见的是，它们由固体脂质颗粒组成(SLN，“固体脂质纳米粒”的简称)，其中脂质芯在室温下是固体。它们还可以由乳剂组成，其中纳米粒由分散于水溶液并且被表面活性剂稳定的脂质相形成。然而，SLN的技术仍然不能控制生长且存在胶凝意外的趋向和无法预料的动态多晶态转变。此夕卜，SLN具有有限的被掺入固体脂质晶体结构的能力(Mehnert，W.等人， Advanced Drug Delivery Reviews2001,47,165-196 ；ffestesen, K.等人 International Journal ofPharmaceutics 1997,151,3545 ；ffestesen, K.等人，Journal ofControlled Release 1997,48,223-236)。文件WO 01/64328描述了由液体或半固体芯组成的脂质纳米胶囊，所述液体或半固体芯上包围有固体壳，其具有几个纳米的厚度，可以包囊活性药物成分。通过热法得到纳米胶囊，其中油性和水性成分的混合物在形成乳剂的相转变温度(PIT)周围进行温度循环 (60-85°C )。然后通过加入冷水将得到的微乳剂猝灭。该方法需要特殊设备，以便检测乳剂的倒相并且由于达到高温而与许多治疗剂不相容。此外，固体表面壳形成使得随后的生物靶向配体的锚定复杂化。此外，猝灭要求添加大量冷水(3-10倍稀释)，且由此明显降低了纳米胶囊的收率。此外，脂肪酸甘油三酯类的化学性质对相转移温度具有显著性影响，从而限制了其选择。文件US 2006/0292186描述了用于给予难溶于水的活性成分(例如紫杉醇)的无水自动纳米乳化制剂。这些制剂包含高比例的泰洛沙泊和TPGS即合成聚合物表面活性剂。文件WO 2008/0似841描述了包含阴离子型磷脂的紫杉醇乳剂的预浓缩物。由于分散于水相，所以该制剂形成水包油型乳剂，其中液滴携带负电荷。然而，这些乳剂不稳定， 由此必须恰好在给药前制备。此外，Tarr等人(1987)在Pharm. Res. 4 :162-165中报道紫杉醇在英脱利匹特中的制剂，即胃肠外应用的乳剂，但紫杉醇在大豆油中的低溶解度(0. 3mg/ml)使得这种赋形剂不适合。光敏剂类型的治疗剂的有效给药还构成光动力疗法中的重要挑战，这是治疗各种癌症的富有希望的技术。该技术的原理基于将光敏剂导入肿瘤组织并且借助于适合波长的光辐射将该治疗剂转换成高度细胞毒性的化合物。推断光敏剂的细胞毒性效应是因光辐射后形成单态氧所致。这种方法的选择依赖于光敏剂相对于健康组织选择性地蓄积在肿瘤组织内，且更具体地是蓄积在实际的肿瘤细胞内。目前，活性剂全身注射后的低肿瘤选择性对患者而言产生了至少6-8周的延长期限的皮肤光敏度。用于光敏剂的完美给药系统由此还构成了用于研发光动力疗法的重要挑战。文件WO 00/28971描述了用于包含纳米乳剂的5_氨基酮戊酸(5-ALA)局部给药的制剂，其用于光疗法和诊断。最后，为了减少皮肤光敏度期限，文件US 2005/0215524中提出了在用光敏剂进行光疗法治疗前、过程中或之后给予磷脂类乳剂。在这些实例中，将光敏剂直接溶于注射的磷脂类，从而促进了其在血浆和皮肤中快速清除。[技术问题]能够有效地靶向递送的稳定纳米乳剂中高剂量亲脂性和两亲性治疗剂的制剂由此仍然是一个挑战。在本发明中，我们提出一种制剂，其中将治疗剂包囊在具有特定组成的油相的纳米乳剂中。[发明概述]本发明描述了将治疗剂包囊在水包油型纳米乳剂中的新制剂。通过特定的制剂，本发明的纳米乳剂是稳定的并且能够实现高度的治疗剂包囊。 这种纳米乳剂还能够在与分散相小平均直径相关的细胞中实现高度摄入。其制剂支持在连续相中的高浓度表面活性剂并且令人意外地稳定，因为它保持了稳定并且显示不依赖于组成的治疗剂的生物分布。最终，因为可以将其配制成分散相表面具有低、甚至零的ζ电位， 所以具有价值。ζ电位是影响纳米乳剂生物分布的关键参数。在接触细胞后，正ζ电位由此促进了胞吞作用。特别地，纳米乳剂有利地显示在贮存过程中的极佳胶体稳定性(> 3个月)和良好的包囊治疗剂的能力和分散相中增加的浓度。在施用过程中，在将纳米粒静脉内注入生物体后还观察到长血浆寿命(隐身特性)。因此，本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂。两亲脂质优选是磷脂。增溶脂质有利地包含至少一种脂肪酸甘油酯，例如包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。油相还可以包含至少一种油，优选具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)的油，特别是选自大豆油和亚麻籽油的油。助表面活性剂优选包含由环氧乙烷单元或环氧乙烷或环氧丙烷单元形成的至少一种链。助表面活性剂可以特别地选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类、和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。治疗剂可以特别地是活性药物成分或光敏剂。本发明的第二个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤(i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和治疗剂的油相；(ii)制备包含聚烷氧基化助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力效应下将油相分散于水相以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。剪力效应优选通过超声处理产生。通过将全部或一些成分置于适合溶剂中形成溶液且然后蒸发溶剂有利地制备油相。本发明的第三个方面涉及本发明的制剂在对人或动物给予治疗剂以治疗疾病或病患中的应用。本发明的生产方法能够以简便、快速和低廉的方式生产包含极小分散相的纳米乳剂。该方法还是稳定的并且易于工业化生产。此外，它不使用或仅使用极少的有机溶剂并且可以用经批准可应用于人体注射的产品实现。最后，仅需要适度加热且由此生产方法甚至对不稳定的活性成分而言也可使用。[本发明的公开内容][定义]在本文件的含义中，术语“纳米乳剂”意指具有至少两相的组合物，一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是20-100nm，且最优选 20_70nm(参见文章 C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar 禾口 Μ· J. Garcia-CeIma, Curr Opin Colloid In，2005，10，102-110)。术语“治疗剂”意指可以用于治疗疾病并且以化学方式(例如活性药物成分)、以物理或生物方式起作用的任意化合物，但不包括诊断试剂。术语“液滴”包括液体油这样的液滴和来自水包油型乳剂的固体颗粒，其中所述油相是固体。在后面的情况中，通常还使用术语“固体乳剂”。在本文件的含义中，术语“脂质”表示包含存在于动物脂肪和植物油中的脂肪酸的全部脂肪和油或物质。它们是主要由碳、氢和氧形成并且具有低于水的密度的疏水或两亲分子。脂质在室温(25°C)可以是固态、为蜡或作为油的液体形式。术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。最常见的是，磷脂类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。具体的磷脂类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。术语“卵磷脂”意指磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸、甘油和两种脂肪酸形成的脂质。 更广泛地说，它包括从生命来源、植物或动物来源提取的磷脂类，条件是它们主要由磷脂酰胆碱组成。这些卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物组成。术语“脂肪酸”意指具有至少4个碳原子的碳链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有418 个碳原子的碳链(一般是偶数)。长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且极长链脂肪酸是具有22个以上碳原子的那些。术语“表面活性剂”意指具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型和水/油-型界面具有特异性亲和力，使得它们降低这些界面的自由能并且稳定分散的系统。术语“助表面活性剂”意指与另一种表面活性剂一起起作用以进一步降低界面能量的表面活性剂。术语“生物配体”意指以特异性方式识别一般排列在细胞表面上的受体的任意分子。[乳剂]本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含至少一种连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含聚烷氧基化助表面活性剂。乳剂由此是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相或多相的，特别是通过在分散相中包含第二水相。本发明能够被包囊在纳米乳剂中的治疗剂特别地包含以化学、生物或物理方式起作用的活性成分。因此，它们可以是活性药物成分或生物制剂(例如DNA、蛋白质、肽类或抗体)和用于物理疗法的活性剂例如用于热疗法的化合物、在被光激发时释放单态氧的化合物(用于光疗法)和放射性试剂。优选它们是通过注射给药的活性成分。治疗剂根据其亲脂性和两亲性亲和力被分散相包囊或位于两相之间的界面上。对包囊在纳米乳剂中的治疗剂的性质没有具体限定。然而，纳米乳剂对难以配制在用于常规给药系统中的难溶性化合物和用于光疗法的发光活性成分具有特别的价值，其中必须保持量子收率。基于制备方法的适度条件，所述制剂对包囊在高温下降解的治疗剂具有特别的价值。具有作为治疗剂价值的活性药物成分的实例特别地是用于治疗AIDS的活性剂、 用于治疗心脏病的活性剂、镇痛药、麻醉剂、减食欲药(anorexigens)、抗蠕虫药、抗过敏药、 抗心绞痛药、抗心律不齐药、抗胆碱能药、抗凝血药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗利尿药、止吐药、抗惊厥药、抗真菌药、抗组胺药、抗高血压药、抗炎药、抗偏头痛药、抗毒蕈碱药、抗分支杆菌药、抗癌药、包括抗震颤麻痹药、抗甲状腺药、抗病毒药、收敛药、阻断剂、血液制品、血液代用品、心肌收缩药、心血管药物、用于中枢神经系统的活性剂、螯合剂、化疗药物、造血生长因子、皮质类固醇、镇咳药、皮肤病药、利尿药、多巴胺能药、弹性蛋白酶抑制剂、内分泌药、麦角生物碱类、祛痰药、胃肠病用药、泌尿生殖用药、生长激素因子引发剂、生长激素、血液病用药、造血剂、止血剂、激素、免疫用药、免疫抑制剂、白细胞介素、白细胞介素类似物、 脂质调节剂、促性腺素释放素、肌肉松弛剂、麻醉品拮抗药、滋养药、营养滋补药、肿瘤治疗剂、有机硝酸酯类、拟迷走神经药(vagomimetics)、前列腺素类、抗生素类、肾脏用药、呼吸用药、镇静药、性激素、兴奋剂、拟交感神经药、全身抗感染药、他克莫司、血栓溶解剂、甲状腺用药、注意力困难治疗药、疫苗、血管扩张剂、黄嘌呤类和胆固醇减少药。特别关注抗癌药，例如泰素(紫杉醇)、多柔比星和顺钼。物理试剂的实例特别是放射性同位素和光敏剂。光敏剂的实例特别是属于四吡咯类的那些化合物，例如卟啉类、菌绿素、酞菁、 氯、荔枝螺毒素、P卜啉烯类(porphycenes)、脱镁叶绿甲酯酸或那些属于德卟啉或金丝桃素类的化合物。第一代光敏剂的实例是血卟啉和血卟啉衍生物混合物(HpD)(在商品名 Photofrin 下由Axcan Wiarma销售)。第二代光敏剂的实例是间-四-羟苯基氯(mTHPC ； 商品名Foscan , Biolitec AG)和苯并卟啉的A环的一元酸衍生物(BPD-MA，在商品名 Visudyne 下由QLT和Novartis Opthalmics销售)。与这些光敏剂相关的作为转运蛋白起作用并且允许其选择性进入肿瘤组织的分子(脂质、肽、糖等)的第二代光敏剂的制剂称作第三代光敏剂。生物制剂的实例是寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、肽类和蛋白质。当然，可以以其活性形式或前体药物形式直接配制治疗剂。此外，对多种治疗剂而言能够将其结合纳米乳剂配制。治疗剂的量取决于指定的关注的应用和活性剂的性质。然而，一般尝试配制具有最大浓度的治疗剂的纳米乳剂，特别是在使用难溶性治疗剂时，以便限制对患者给药的体积和/或期限。目前，已经发现，在油相中存在增溶脂质能够掺入大量化合物，甚至是疏水性或两亲性化合物。本发明的制剂更常见的是包含0. 001-30%重量、优选0. 01-20%重量、或乃至更优选0. 1-10%重量的用量的治疗剂。有利地，将治疗剂掺入溶液形式的乳剂，然后例如通过蒸发分离溶剂。该溶液包含可以达到其溶解度极限的可变量的治疗剂。溶剂的选择依赖于每种治疗剂的溶解度。所用溶剂可以是例如甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、DMSO、DMF乃至甲苯。优选使用挥发性溶剂，优选对人是无毒性的。根据本发明，纳米乳剂的油相还包含至少一种两亲性脂质和至少一种增溶脂质。为了形成稳定的纳米乳剂，一般在组合物中必需要包括至少一种两亲脂质作为表面活性剂。表面活性剂的两亲性使得油滴在水性连续相中稳定。两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自亲脂部分包含具有8-30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的化合物。它们可以选自磷脂类、胆固醇类、溶脂质类 (lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂质类，并且可以具有天然或合成来源；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类，例如在Span 商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；与聚氧化乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在Tween 商品名下由ICl Americas, Inc.销售的和在Triton 下由Union Carbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯和蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯；能够使用单独或混合物形式的所述表面活性剂。卵磷脂是优选的两亲脂质。
在一个具体的实施方案中，全部或部分两亲脂质可以具有反应官能团，例如马来酰亚胺、硫醇、胺、酯、羟基胺或醛基。反应官能团的存在使得官能化合物在界面上接枝。将反应性两亲脂质掺入界面上形成的层，稳定分散相，其中它易于偶合存在于例如水相中的反应性化合物。一般而言，油相包含0. 01-99%重量、优选5-75%重量、特别是20_60%重量且最具体的是33-45%重量的两亲脂质。两亲脂质的量有利地有助于控制得到的纳米乳剂的分散相的大小。本发明的乳剂还包含增溶脂质。该化合物的主要任务在于增溶在纳米乳剂油相中难溶的两亲脂质。增溶脂质是对两亲脂质具有足够亲和力以使其增溶的脂质。增溶脂质优选在室温下是固体。就两亲脂质是磷脂的情况而言，可能的增溶脂质特别是甘油衍生物，尤其是通过用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。所用的增溶脂质有利地依赖于所用两亲脂质而被选择。它一般具有类似的化学结构以便带来期望的增溶。它可以是油或蜡。增溶脂质优选在室温(20°C)下是固体，而在体温(37 °C )下是液体。优选的增溶脂质，特别是磷脂类，是脂肪酸甘油酯类，特别是饱和脂肪酸甘油酯类，且特别是包含8-18个碳原子、甚至更优选12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。有利的是包括不同甘油酯的混合物。优选包括包含至少10%重量的C12脂肪酸、至少5%重量的C14脂肪酸、至少5% 重量的C16脂肪酸和至少5%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。优选包括包含0% -20%重量的C8脂肪酸、0% -20%重量的ClO脂肪酸、 10% -70%重量的C12脂肪酸、5% -30%重量的C14脂肪酸、5% -30%重量的C16脂肪酸和 5% -30%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。特别优选由fettef0SS6在商品名Suppodre NC下销售的半合成甘油酯混合物，其在室温下是固体并且被批准应用于人体注射。NSuppocire 型甘油酯类通过直接酯化脂肪酸和甘油得到。它们是C8-C18饱和脂肪酸的半合成甘油酯类，其中定性-定量组成如下表所示。上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应依赖于具体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得到的芯具有增加的内部粘度，未显示结晶性。结晶对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为它一般导致液滴聚集和/或导致包囊分子从液滴中排出。这些特性由此提高了随时间推移的纳米乳剂物理稳定性和治疗剂的包囊稳定性。增溶脂质的量随存在于油相中的两亲脂质的类型和量而广泛改变。一般而言，油相包含1-99%重量、优选5-80%重量且特别是40-75%重量的增溶脂质。表1 来自feittefoss6的Suppocire NC 的脂肪酸组成
Hl重量]
权利要求
1.纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含连续水相和至少一种分散的油相，其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂，且其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含-至少重量的Q2脂肪酸； -至少重量的Q4脂肪酸； -至少5%重量的C16脂肪酸；和 -至少重量的Q8脂肪酸。
2.权利要求1的治疗剂制剂，其中增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含-0% -20%重量的C8脂肪酸； -0% -20%重量的ClO脂肪酸； -10% -70%重量的C12脂肪酸； -5% -30%重量的C14脂肪酸； -5% -30%重量的C16脂肪酸；和 -5% -30%重量的C18脂肪酸。
3.权利要求1或权利要求2的治疗剂制剂，其中两亲性脂质是磷脂。
4.权利要求1-3任一项的治疗剂制剂，其中所述油相还包含至少一种油。
5.权利要求4的治疗剂制剂，其中所述油具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)。
6.权利要求1-5任一项的治疗剂制剂，其中助表面活性剂包含至少一种由环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。
7.权利要求6的治疗剂制剂，其中助表面活性剂选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类、和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
8.权利要求1-7任一项的治疗剂制剂，其中治疗剂是药物成分。
9.权利要求1-7任一项的治疗剂制剂，其中治疗剂是光敏剂。
10.权利要求1-9任一项的治疗剂制剂，其特征在于它被官能化。
11.权利要求1-10任一项的纳米乳剂形式的治疗剂制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤⑴制备包含治疗剂、两亲脂质和至少一种增溶脂质的油相，所述增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含 -至少重量的Q2脂肪酸； -至少重量的Q4脂肪酸； -至少5%重量的C16脂肪酸；和 -至少重量的Q8脂肪酸； ( )制备包含聚烷氧基化助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力效应下将油相分散于水相以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
12.权利要求11的制备方法，其中增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含 -0% -20%重量的C8脂肪酸； -0% -20%重量的ClO脂肪酸； -10% -70%重量的C12脂肪酸； -5% -30%重量的C14脂肪酸； -5% -30%重量的C16脂肪酸；和 -5% -30%重量的C18脂肪酸。
13.权利要求11或权利要求12的制备方法，其中剪力效应通过超声处理产生。
14.权利要求11-13任一项的制备方法，其中如下制备油相通过将全部或一些成分放入适合的溶剂形成溶液，且然后蒸发溶剂。
15.权利要求1-10任一项的制剂，用于对人或动物给予治疗剂以治疗疾病或病患。
16.治疗方法，包含对有此需要的哺乳动物给予有效治疗量的权利要求1-10任一项的制剂。
全文摘要
本发明涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，其包含连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂。本发明还涉及该制剂的制备方法和应用。
文档编号A61K41/00GK102170866SQ200980138629
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月14日 优先权日2008年8月14日
发明者F·纳瓦罗依加尔恰, I·泰克希尔-诺盖斯, J·比贝特, M·古泰耶, V·穆莱尔-罗伯特 申请人:原子能及能源替代委员会
亲脂性或两亲性治疗剂在纳米乳剂中的包囊本发明涉及特别适用于递送亲脂性或两亲性治疗剂的纳米乳剂类型的组合物、其制备方法和将其用于治疗和诊断疾病、特别是癌症的方法。
背景技术：
纳米药物构成了融合纳米技术和药物产生的新领域并且目前是用于研发有效靶向疗法、特别是肿瘤学的最富有希望的途径之一。就此而言，荷载治疗剂的纳米粒构成通过促成靶向癌组织、被动和/或主动靶向克服药物、特别是抗癌药的低选择性的理想解决方案，并且这是减少严重副作用的方式。为了治疗和成像应用，已经测试了大量纳米粒，既有无机物(例如半导体、二氧化硅或氧化物)，又有有机物(天然或合成聚合物、脂质体、纳米球、纳米囊、微球)。已经发现聚合物纳米粒具有特别与有机溶剂残留物相关的潜在细胞毒性和大规模生产难以再现和贮存期限问题。脂质体在稳定性和亲脂性化合物包囊度方面受限并且其生产方法复杂。作为聚合物纳米粒的可替代选择，自从1990以来注意力集中于脂质纳米粒，其包含更通常地基于可生物降解的甘油三酯类的脂质芯，其被聚合物壳包围。生物相容性脂质的选择及其不使用溶剂生产的可能性使得显著降低其毒性成为可能(Muller，R. H.，Eur J PharmBiopharm 2000，50，161-177 ；Mehnert, W.等人，Advanced DrugDelivery Reviews 2001，47，165-196)。更常见的是，它们由固体脂质颗粒组成(SLN，“固体脂质纳米粒”的简称)，其中脂质芯在室温下是固体。它们还可以由乳剂组成，其中纳米粒由分散于水溶液并且被表面活性剂稳定的脂质相形成。然而，SLN的技术仍然不能控制生长且存在胶凝意外的趋向和无法预料的动态多晶态转变。此夕卜，SLN具有有限的被掺入固体脂质晶体结构的能力(Mehnert，W.等人， Advanced Drug Delivery Reviews2001,47,165-196 ；ffestesen, K.等人 International Journal ofPharmaceutics 1997,151,3545 ；ffestesen, K.等人，Journal ofControlled Release 1997,48,223-236)。文件WO 01/64328描述了由液体或半固体芯组成的脂质纳米胶囊，所述液体或半固体芯上包围有固体壳，其具有几个纳米的厚度，可以包囊活性药物成分。通过热法得到纳米胶囊，其中油性和水性成分的混合物在形成乳剂的相转变温度(PIT)周围进行温度循环 (60-85°C )。然后通过加入冷水将得到的微乳剂猝灭。该方法需要特殊设备，以便检测乳剂的倒相并且由于达到高温而与许多治疗剂不相容。此外，固体表面壳形成使得随后的生物靶向配体的锚定复杂化。此外，猝灭要求添加大量冷水(3-10倍稀释)，且由此明显降低了纳米胶囊的收率。此外，脂肪酸甘油三酯类的化学性质对相转移温度具有显著性影响，从而限制了其选择。文件US 2006/0292186描述了用于给予难溶于水的活性成分(例如紫杉醇)的无水自动纳米乳化制剂。这些制剂包含高比例的泰洛沙泊和TPGS即合成聚合物表面活性剂。文件WO 2008/0似841描述了包含阴离子型磷脂的紫杉醇乳剂的预浓缩物。由于分散于水相，所以该制剂形成水包油型乳剂，其中液滴携带负电荷。然而，这些乳剂不稳定， 由此必须恰好在给药前制备。此外，Tarr等人(1987)在Pharm. Res. 4 :162-165中报道紫杉醇在英脱利匹特中的制剂，即胃肠外应用的乳剂，但紫杉醇在大豆油中的低溶解度(0. 3mg/ml)使得这种赋形剂不适合。光敏剂类型的治疗剂的有效给药还构成光动力疗法中的重要挑战，这是治疗各种癌症的富有希望的技术。该技术的原理基于将光敏剂导入肿瘤组织并且借助于适合波长的光辐射将该治疗剂转换成高度细胞毒性的化合物。推断光敏剂的细胞毒性效应是因光辐射后形成单态氧所致。这种方法的选择依赖于光敏剂相对于健康组织选择性地蓄积在肿瘤组织内，且更具体地是蓄积在实际的肿瘤细胞内。目前，活性剂全身注射后的低肿瘤选择性对患者而言产生了至少6-8周的延长期限的皮肤光敏度。用于光敏剂的完美给药系统由此还构成了用于研发光动力疗法的重要挑战。文件WO 00/28971描述了用于包含纳米乳剂的5_氨基酮戊酸(5-ALA)局部给药的制剂，其用于光疗法和诊断。最后，为了减少皮肤光敏度期限，文件US 2005/0215524中提出了在用光敏剂进行光疗法治疗前、过程中或之后给予磷脂类乳剂。在这些实例中，将光敏剂直接溶于注射的磷脂类，从而促进了其在血浆和皮肤中快速清除。[技术问题]能够有效地靶向递送的稳定纳米乳剂中高剂量亲脂性和两亲性治疗剂的制剂由此仍然是一个挑战。在本发明中，我们提出一种制剂，其中将治疗剂包囊在具有特定组成的油相的纳米乳剂中。[发明概述]本发明描述了将治疗剂包囊在水包油型纳米乳剂中的新制剂。通过特定的制剂，本发明的纳米乳剂是稳定的并且能够实现高度的治疗剂包囊。 这种纳米乳剂还能够在与分散相小平均直径相关的细胞中实现高度摄入。其制剂支持在连续相中的高浓度表面活性剂并且令人意外地稳定，因为它保持了稳定并且显示不依赖于组成的治疗剂的生物分布。最终，因为可以将其配制成分散相表面具有低、甚至零的ζ电位， 所以具有价值。ζ电位是影响纳米乳剂生物分布的关键参数。在接触细胞后，正ζ电位由此促进了胞吞作用。特别地，纳米乳剂有利地显示在贮存过程中的极佳胶体稳定性(> 3个月)和良好的包囊治疗剂的能力和分散相中增加的浓度。在施用过程中，在将纳米粒静脉内注入生物体后还观察到长血浆寿命(隐身特性)。因此，本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂。两亲脂质优选是磷脂。增溶脂质有利地包含至少一种脂肪酸甘油酯，例如包含12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯。油相还可以包含至少一种油，优选具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)的油，特别是选自大豆油和亚麻籽油的油。助表面活性剂优选包含由环氧乙烷单元或环氧乙烷或环氧丙烷单元形成的至少一种链。助表面活性剂可以特别地选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG/PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类、和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。治疗剂可以特别地是活性药物成分或光敏剂。本发明的第二个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤(i)制备包含至少一种增溶脂质、两亲脂质和治疗剂的油相；(ii)制备包含聚烷氧基化助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力效应下将油相分散于水相以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。剪力效应优选通过超声处理产生。通过将全部或一些成分置于适合溶剂中形成溶液且然后蒸发溶剂有利地制备油相。本发明的第三个方面涉及本发明的制剂在对人或动物给予治疗剂以治疗疾病或病患中的应用。本发明的生产方法能够以简便、快速和低廉的方式生产包含极小分散相的纳米乳剂。该方法还是稳定的并且易于工业化生产。此外，它不使用或仅使用极少的有机溶剂并且可以用经批准可应用于人体注射的产品实现。最后，仅需要适度加热且由此生产方法甚至对不稳定的活性成分而言也可使用。[本发明的公开内容][定义]在本文件的含义中，术语“纳米乳剂”意指具有至少两相的组合物，一般是油相和水相，其中分散相的平均大小小于1微米，优选10-500nm，且特别是20-100nm，且最优选 20_70nm(参见文章 C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar 禾口 Μ· J. Garcia-CeIma, Curr Opin Colloid In，2005，10，102-110)。术语“治疗剂”意指可以用于治疗疾病并且以化学方式(例如活性药物成分)、以物理或生物方式起作用的任意化合物，但不包括诊断试剂。术语“液滴”包括液体油这样的液滴和来自水包油型乳剂的固体颗粒，其中所述油相是固体。在后面的情况中，通常还使用术语“固体乳剂”。在本文件的含义中，术语“脂质”表示包含存在于动物脂肪和植物油中的脂肪酸的全部脂肪和油或物质。它们是主要由碳、氢和氧形成并且具有低于水的密度的疏水或两亲分子。脂质在室温(25°C)可以是固态、为蜡或作为油的液体形式。术语“磷脂”意指具有磷酸酯基的脂质，特别是磷酸甘油脂类。最常见的是，磷脂类包含由任选取代的磷酸酯基形成的亲水端和由脂肪酸链形成的两个疏水端。具体的磷脂类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。术语“卵磷脂”意指磷脂酰胆碱，即由胆碱、磷酸、甘油和两种脂肪酸形成的脂质。 更广泛地说，它包括从生命来源、植物或动物来源提取的磷脂类，条件是它们主要由磷脂酰胆碱组成。这些卵磷脂一般由携带不同脂肪酸的卵磷脂混合物组成。术语“脂肪酸”意指具有至少4个碳原子的碳链的脂族羧酸。天然脂肪酸具有418 个碳原子的碳链(一般是偶数)。长链脂肪酸是14-22个碳原子长的那些且极长链脂肪酸是具有22个以上碳原子的那些。术语“表面活性剂”意指具有两亲结构的化合物，这种结构使得它们对油/水-型和水/油-型界面具有特异性亲和力，使得它们降低这些界面的自由能并且稳定分散的系统。术语“助表面活性剂”意指与另一种表面活性剂一起起作用以进一步降低界面能量的表面活性剂。术语“生物配体”意指以特异性方式识别一般排列在细胞表面上的受体的任意分子。[乳剂]本发明的第一个方面涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含至少一种连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含聚烷氧基化助表面活性剂。乳剂由此是水包油型乳剂。该乳剂可以是单相或多相的，特别是通过在分散相中包含第二水相。本发明能够被包囊在纳米乳剂中的治疗剂特别地包含以化学、生物或物理方式起作用的活性成分。因此，它们可以是活性药物成分或生物制剂(例如DNA、蛋白质、肽类或抗体)和用于物理疗法的活性剂例如用于热疗法的化合物、在被光激发时释放单态氧的化合物(用于光疗法)和放射性试剂。优选它们是通过注射给药的活性成分。治疗剂根据其亲脂性和两亲性亲和力被分散相包囊或位于两相之间的界面上。对包囊在纳米乳剂中的治疗剂的性质没有具体限定。然而，纳米乳剂对难以配制在用于常规给药系统中的难溶性化合物和用于光疗法的发光活性成分具有特别的价值，其中必须保持量子收率。基于制备方法的适度条件，所述制剂对包囊在高温下降解的治疗剂具有特别的价值。具有作为治疗剂价值的活性药物成分的实例特别地是用于治疗AIDS的活性剂、 用于治疗心脏病的活性剂、镇痛药、麻醉剂、减食欲药(anorexigens)、抗蠕虫药、抗过敏药、 抗心绞痛药、抗心律不齐药、抗胆碱能药、抗凝血药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗利尿药、止吐药、抗惊厥药、抗真菌药、抗组胺药、抗高血压药、抗炎药、抗偏头痛药、抗毒蕈碱药、抗分支杆菌药、抗癌药、包括抗震颤麻痹药、抗甲状腺药、抗病毒药、收敛药、阻断剂、血液制品、血液代用品、心肌收缩药、心血管药物、用于中枢神经系统的活性剂、螯合剂、化疗药物、造血生长因子、皮质类固醇、镇咳药、皮肤病药、利尿药、多巴胺能药、弹性蛋白酶抑制剂、内分泌药、麦角生物碱类、祛痰药、胃肠病用药、泌尿生殖用药、生长激素因子引发剂、生长激素、血液病用药、造血剂、止血剂、激素、免疫用药、免疫抑制剂、白细胞介素、白细胞介素类似物、 脂质调节剂、促性腺素释放素、肌肉松弛剂、麻醉品拮抗药、滋养药、营养滋补药、肿瘤治疗剂、有机硝酸酯类、拟迷走神经药(vagomimetics)、前列腺素类、抗生素类、肾脏用药、呼吸用药、镇静药、性激素、兴奋剂、拟交感神经药、全身抗感染药、他克莫司、血栓溶解剂、甲状腺用药、注意力困难治疗药、疫苗、血管扩张剂、黄嘌呤类和胆固醇减少药。特别关注抗癌药，例如泰素(紫杉醇)、多柔比星和顺钼。物理试剂的实例特别是放射性同位素和光敏剂。光敏剂的实例特别是属于四吡咯类的那些化合物，例如卟啉类、菌绿素、酞菁、 氯、荔枝螺毒素、P卜啉烯类(porphycenes)、脱镁叶绿甲酯酸或那些属于德卟啉或金丝桃素类的化合物。第一代光敏剂的实例是血卟啉和血卟啉衍生物混合物(HpD)(在商品名 Photofrin 下由Axcan Wiarma销售)。第二代光敏剂的实例是间-四-羟苯基氯(mTHPC ； 商品名Foscan , Biolitec AG)和苯并卟啉的A环的一元酸衍生物(BPD-MA，在商品名 Visudyne 下由QLT和Novartis Opthalmics销售)。与这些光敏剂相关的作为转运蛋白起作用并且允许其选择性进入肿瘤组织的分子(脂质、肽、糖等)的第二代光敏剂的制剂称作第三代光敏剂。生物制剂的实例是寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、肽类和蛋白质。当然，可以以其活性形式或前体药物形式直接配制治疗剂。此外，对多种治疗剂而言能够将其结合纳米乳剂配制。治疗剂的量取决于指定的关注的应用和活性剂的性质。然而，一般尝试配制具有最大浓度的治疗剂的纳米乳剂，特别是在使用难溶性治疗剂时，以便限制对患者给药的体积和/或期限。目前，已经发现，在油相中存在增溶脂质能够掺入大量化合物，甚至是疏水性或两亲性化合物。本发明的制剂更常见的是包含0. 001-30%重量、优选0. 01-20%重量、或乃至更优选0. 1-10%重量的用量的治疗剂。有利地，将治疗剂掺入溶液形式的乳剂，然后例如通过蒸发分离溶剂。该溶液包含可以达到其溶解度极限的可变量的治疗剂。溶剂的选择依赖于每种治疗剂的溶解度。所用溶剂可以是例如甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、DMSO、DMF乃至甲苯。优选使用挥发性溶剂，优选对人是无毒性的。根据本发明，纳米乳剂的油相还包含至少一种两亲性脂质和至少一种增溶脂质。为了形成稳定的纳米乳剂，一般在组合物中必需要包括至少一种两亲脂质作为表面活性剂。表面活性剂的两亲性使得油滴在水性连续相中稳定。两亲脂质包含亲水部分和亲脂部分。它们一般选自亲脂部分包含具有8-30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的化合物。它们可以选自磷脂类、胆固醇类、溶脂质类 (lysolipids)、鞘磷脂类、生育酚类、糖脂类、硬脂酰胺类和心磷脂质类，并且可以具有天然或合成来源；由与亲水性基团通过醚或酯官能团偶合的脂肪酸形成的分子，例如山梨坦酯类，例如在Span 商品名下由Sigma销售的失水山梨糖醇单油酸酯和月桂山梨坦；与聚氧化乙烯(PEG)短链共轭的脂质，例如在Tween 商品名下由ICl Americas, Inc.销售的和在Triton 下由Union Carbide Corp.销售的非离子型表面活性剂；糖酯类，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯和蔗糖二棕榈酸酯、蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯；能够使用单独或混合物形式的所述表面活性剂。卵磷脂是优选的两亲脂质。
在一个具体的实施方案中，全部或部分两亲脂质可以具有反应官能团，例如马来酰亚胺、硫醇、胺、酯、羟基胺或醛基。反应官能团的存在使得官能化合物在界面上接枝。将反应性两亲脂质掺入界面上形成的层，稳定分散相，其中它易于偶合存在于例如水相中的反应性化合物。一般而言，油相包含0. 01-99%重量、优选5-75%重量、特别是20_60%重量且最具体的是33-45%重量的两亲脂质。两亲脂质的量有利地有助于控制得到的纳米乳剂的分散相的大小。本发明的乳剂还包含增溶脂质。该化合物的主要任务在于增溶在纳米乳剂油相中难溶的两亲脂质。增溶脂质是对两亲脂质具有足够亲和力以使其增溶的脂质。增溶脂质优选在室温下是固体。就两亲脂质是磷脂的情况而言，可能的增溶脂质特别是甘油衍生物，尤其是通过用脂肪酸酯化甘油得到的甘油酯类。所用的增溶脂质有利地依赖于所用两亲脂质而被选择。它一般具有类似的化学结构以便带来期望的增溶。它可以是油或蜡。增溶脂质优选在室温(20°C)下是固体，而在体温(37 °C )下是液体。优选的增溶脂质，特别是磷脂类，是脂肪酸甘油酯类，特别是饱和脂肪酸甘油酯类，且特别是包含8-18个碳原子、甚至更优选12-18个碳原子的饱和脂肪酸甘油酯类。有利的是包括不同甘油酯的混合物。优选包括包含至少10%重量的C12脂肪酸、至少5%重量的C14脂肪酸、至少5% 重量的C16脂肪酸和至少5%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。优选包括包含0% -20%重量的C8脂肪酸、0% -20%重量的ClO脂肪酸、 10% -70%重量的C12脂肪酸、5% -30%重量的C14脂肪酸、5% -30%重量的C16脂肪酸和 5% -30%重量的C18脂肪酸的饱和脂肪酸甘油酯类。特别优选由fettef0SS6在商品名Suppodre NC下销售的半合成甘油酯混合物，其在室温下是固体并且被批准应用于人体注射。NSuppocire 型甘油酯类通过直接酯化脂肪酸和甘油得到。它们是C8-C18饱和脂肪酸的半合成甘油酯类，其中定性-定量组成如下表所示。上述举出的增溶脂质能够得到有利地稳定的纳米乳剂形式的制剂。不应依赖于具体理论，推定上述举出的增溶脂质能够得到具有无定形芯的纳米乳剂形式的液滴。由此得到的芯具有增加的内部粘度，未显示结晶性。结晶对纳米乳剂的稳定性具有不良影响，因为它一般导致液滴聚集和/或导致包囊分子从液滴中排出。这些特性由此提高了随时间推移的纳米乳剂物理稳定性和治疗剂的包囊稳定性。增溶脂质的量随存在于油相中的两亲脂质的类型和量而广泛改变。一般而言，油相包含1-99%重量、优选5-80%重量且特别是40-75%重量的增溶脂质。表1 来自feittefoss6的Suppocire NC 的脂肪酸组成
Hl重量]
权利要求
1.纳米乳剂形式的治疗剂制剂，包含连续水相和至少一种分散的油相，其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂，且其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，所述增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含-至少重量的Q2脂肪酸； -至少重量的Q4脂肪酸； -至少5%重量的C16脂肪酸；和 -至少重量的Q8脂肪酸。
2.权利要求1的治疗剂制剂，其中增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含-0% -20%重量的C8脂肪酸； -0% -20%重量的ClO脂肪酸； -10% -70%重量的C12脂肪酸； -5% -30%重量的C14脂肪酸； -5% -30%重量的C16脂肪酸；和 -5% -30%重量的C18脂肪酸。
3.权利要求1或权利要求2的治疗剂制剂，其中两亲性脂质是磷脂。
4.权利要求1-3任一项的治疗剂制剂，其中所述油相还包含至少一种油。
5.权利要求4的治疗剂制剂，其中所述油具有3-6的亲水亲油平衡值(HLB)。
6.权利要求1-5任一项的治疗剂制剂，其中助表面活性剂包含至少一种由环氧乙烷单元或环氧乙烷和环氧丙烷单元组成的链。
7.权利要求6的治疗剂制剂，其中助表面活性剂选自共轭化合物聚乙二醇/磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、脂肪酸和聚乙二醇醚类、脂肪酸和聚乙二醇酯类、和环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
8.权利要求1-7任一项的治疗剂制剂，其中治疗剂是药物成分。
9.权利要求1-7任一项的治疗剂制剂，其中治疗剂是光敏剂。
10.权利要求1-9任一项的治疗剂制剂，其特征在于它被官能化。
11.权利要求1-10任一项的纳米乳剂形式的治疗剂制剂的制备方法，该制剂包含至少一种连续的水相和至少一种分散的油相，该方法包含下列步骤⑴制备包含治疗剂、两亲脂质和至少一种增溶脂质的油相，所述增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含 -至少重量的Q2脂肪酸； -至少重量的Q4脂肪酸； -至少5%重量的C16脂肪酸；和 -至少重量的Q8脂肪酸； ( )制备包含聚烷氧基化助表面活性剂的水相；(iii)在足够剪力效应下将油相分散于水相以形成纳米乳剂；和(iv)回收由此形成的纳米乳剂。
12.权利要求11的制备方法，其中增溶脂质由饱和脂肪酸甘油酯类的混合物组成，所述饱和脂肪酸甘油酯类包含 -0% -20%重量的C8脂肪酸； -0% -20%重量的ClO脂肪酸； -10% -70%重量的C12脂肪酸； -5% -30%重量的C14脂肪酸； -5% -30%重量的C16脂肪酸；和 -5% -30%重量的C18脂肪酸。
13.权利要求11或权利要求12的制备方法，其中剪力效应通过超声处理产生。
14.权利要求11-13任一项的制备方法，其中如下制备油相通过将全部或一些成分放入适合的溶剂形成溶液，且然后蒸发溶剂。
15.权利要求1-10任一项的制剂，用于对人或动物给予治疗剂以治疗疾病或病患。
16.治疗方法，包含对有此需要的哺乳动物给予有效治疗量的权利要求1-10任一项的制剂。
全文摘要
本发明涉及纳米乳剂形式的治疗剂制剂，其包含连续水相和至少一种分散的油相，其中所述油相除治疗剂外还包含至少一种两亲脂质和至少一种增溶脂质，且其中水相包含至少一种聚烷氧基化助表面活性剂。本发明还涉及该制剂的制备方法和应用。
文档编号A61K41/00GK102170866SQ200980138629
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月14日 优先权日2008年8月14日
发明者F·纳瓦罗依加尔恰, I·泰克希尔-诺盖斯, J·比贝特, M·古泰耶, V·穆莱尔-罗伯特 申请人:原子能及能源替代委员会
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