荧光乳液的制作方法
专利名称：荧光乳液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光乳液、其用途以及含有所述乳液的标记试剂。
背景技术：
人们不断地开发出基于利用被探测信号中散射成分的光学成像技术，因为该技术允许散射物体、更具体地说是较厚的散射物体被探测到。在生物医学成像领域，这些技术例如通过扩散光学层析成像，而为如下常规技术用于例如癌症肿瘤提供了选择放射线照相术和X射线断层照相术、正电子发射断层显像、 以及用于探测和定位的磁共振成像。这些常规 技术，在非电离辐射的可见范围内的波长、更准确地说是生物组织具有最小吸光度(absorption)的红光或近红外波长范围内，用于监测异常吸收和/或散射区域。近年来，归功于特异性荧光标记的应用，人们不断开发荧光分子光学成像技术 (optical fluorescence molecular imaging techniques)。这些特异性焚光标记优选被附接于所关注的靶细胞例如癌细胞，并且提供比非特异性标记更好的监测对比度。这些技术的目的不仅在于在空间中定位荧光标记，而且还在于测定其浓度，由此能够间接定位肿瘤， 并获得有关其形状以及其生物活性的信息。取决于所使用的光源，可以将利用光传播进入散射介质的设备划分为三个分类 连续式；频率调制式；和时间调制式。在历史上，首先研发出的是使用连续光源的设备。然而，它们其中具有不能提供有关组织的散射性能的缺陷，因此必须提供先验(a priori)。时间调制方法和频率调制方法与傅里叶变换法有关，并且两者皆具有更丰富的信息。使用成对源/探测器的单一获得物的设备例如可以测定均勻介质的光学吸收和各自表示为μ a和 μ s 的各向同性散身寸性能(isotropic scattering properties) 在荧光分子光学成像技术中，将荧光标记或者荧光造影剂(contrast agents)注入被研究的被散射组织中，并特异性或非特异性地定位在所研究区域中。然后，所述组织用准单色光源、或者激光束来照亮，所述准单色光是通过使用带通滤波器或低通滤波器所获得的。来自光源的光在组织中散射，并且通过向红光滑移的波长的荧光发射，一些光子到达了荧光标记或荧光分子，所述荧光标记或荧光分子再发射(re-emit)出由它们所吸收的光源提供的能量。直到到达组织边缘并由此显现(emerging)为止，所述光通过荧光本身的传播来发出进入所研究的散射组织中。预先过滤由成像设备例如照相机、红外照相机、光纤或其它成像设备所收集的输出光，由此除去激发信号(excitation signal)并且仅收集荧光光子。通过光源所发射的光和通过荧光团(fluorophore)再发射的荧光所发出的光位于红光或近红外区，称为治疗窗区域，所述光的波长可用于人体和动物组织，因为在这些波长处人体和动物组织吸收最少。更具体地说，血液代表较短波长的光吸收，水代表较长波长的光吸收。因此，选择荧光分子或荧光团在这些波长内即640nm至900nm之间吸收并发射。
目前，荧光分子不是这样注入所研究的组织中，而是以光学探针的方式注入。一般而言，该光学探针是由荧光分子组成的分子集合，所述荧光分子例如可以是有机荧光团、稀土络合物、或者发光半导体纳米晶体(luminescent semiconductive nanocrystal，“量子点，，，例如 CdSe, CdTe, InP、Si 等)。 这些光学探针可以包含一种以上的如下组分a)生物配体，其使特异性生物过程(biological process)有可能成像。这种配体可以是i)生物靶向配体所述配体是生物实体(抗体、肽、糖类等)或者化学实体(例如，叶酸)，其能够进行特定器官中特定细胞(例如，肿瘤细胞，例如，如以下文章中所述 S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment，2004，3，393-408)的特异性识别；ii)作为用于给定生物活性例如酶活性的标记的生物配体。例如，这些生物配体将会是能够被给定蛋白酶裂解的肽，标记荧光抑制剂将会被接枝到所述肽的末端上。该类型的配体可使蛋白酶的酶活性能够特异性地成像(specifically image)，如以下文章中所述C. H. Tung,Biopolymers, 2004，76，391-403。另一个例子由生物配体组成，所述配体包含将标记和所述标记荧光抑制剂分开的二硫桥键。然后，该生物配体使得细胞中光学探针的内在化(internalization)可以特异性地成像，例如，如公布编号为FR 2 888 938的法国专利申请中所述的那样；b)隐形剂(stealth agent)这是加入到光学探针的实体，从而使其相对于免疫系统隐形、增加其在生物体中的循环时间、并降低其消除(elimination)；c) “组装载体(assembly vector) ”这是可以组合荧光标记和/或生物靶向标记和/或隐形剂和/或一种以上其它功能特性(例如，药物释放、其它成像模式、治疗作用) 的实体。荧光分子可以被包括在乳液中。然而，没有荧光标记的人体或动物组织具有固有荧光(称为内源荧光或自体荧光)，所述固有荧光可增加寄生信号(spurious signal) 0非弹性散射的激发或过滤不良的激发也可以是寄生信号的来源。此外，通过荧光分子再发射的荧光具有较宽的光谱。因此，难以具有来自不同荧光分子(在下文中也称为供体荧光标记)的信号，这意味着可能没有或者几乎没有任何复用 (multiplexing)。最终，目前，当荧光分子(荧光标记)被传送入生物体中时，现有的光学探针不能进行测定。光学荧光成像应用的另一领域是用于监测在基底媒质(host medium)中所关注的物质的释药(delivery)、形状或大小或状态的差异。例如，可以监测如下项目在人体或动物中药物释药；或者在植物中、或者在细胞或组织或者人体、动物、或植物的特定器官或者这些细胞、组织、或器官的合成介质代表中的农药释药。然而，所述基底媒质也可以是含有有机体或者特定物质的合成或天然媒质，需要监测所述基底媒质的路径(path)。然而，光学荧光成像也可以用于研究纳米乳液，从而监测纳米颗粒的尺寸评估、或者知道何时这些颗粒会爆裂(burst)、或者测定标记的释放速度。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种荧光乳液，其能够用于所有这些应用，并且能抑制甚至阻止由于基底媒质的自体荧光引起的寄生信号，所述乳液注入基底媒质中并且/或者允许数个荧光标记同时使用、并且/或者监测基底媒质中所关注的药物或物质的释药、 形状或尺寸的改变等。为此目的，本发明提供了一种水包油型荧光乳液，其包含水连续相，其中分散有油相的液滴，所述油相液滴通过表面活性剂层来稳定，其特征在于，所述乳液包含至少一对由供体荧光标记和受体标记形成的且彼此不同的标记，所述供体荧光标记以波长X1吸收、以不同于X1的波长λ 2发射，所述受体标记以供体荧光标记发射的波长λ 2吸收；所述供体荧光标记和所述受体标记通过如下方式来保持靠近一起将它们中的一个包裹在油相液滴中，并且要么将它们中的另一个连接到油相液滴/水相界面相连上、要么将它们中的另一个包裹在油相液滴中；并且所述乳液包含至少一种两亲表面活性剂的分子和至少一种增溶性脂质的分子。在本发明荧光溶液的第一优选具体实施方式
中，所述受体标记可以以波长λ3的光能形式来再发射由所述供体荧光标记发射的光能，所述波长λ3与波长入工和λ2不同。 在本发明荧光溶液的第二优选具体实施方式
中，所述受体标记不或几乎不以光能的形式再发射由所述供体标记所提供的光能。在本发明荧光溶液的所有具体实施方式
中，波长λ ρ λ 2和λ 3在640nm至900nm 之间，包含端点。而优选的是，在根据本发明的荧光溶液的所有具体实施方式
中，油相液滴的平均直径在IOnm至200nm之间、包含端点。在本发明荧光乳液的所有具体实施方式
的第一变体中，供体荧光标记和受体标记各自独立地是亲油的或两亲的，并且通过被包裹在油相液滴中来保持靠近一起。在第一变体中和第一优选具体实施方式
中，供体荧光标记是1，Γ -双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(DiD)，并且受体标记是1，Γ -双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘(DiR)。在该第一变体的另一优选具体实施方式
中，供体荧光标记是1，Γ -双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘，并且受体是吲哚青绿(ICG)。在本发明荧光乳液的所有具体实施方式
的第二变体中，供体标记和受体标记中的一个是两亲性的，并且通过直接与油相液滴的膜连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面，另一个被包裹在油相液滴中。在本发明荧光乳液的所有具体实施方式
的第三变体中，供体标记和受体标记中的一个通过直接与油相液滴的膜相连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面，另一个被包裹在油相液滴中。在该变体中和第一具体实施方式
中，与所述表面活性剂分子相连的标记通过共价键与这些表面活性剂分子相连。在该变体的第二具体实施方式
中，与表面活性剂分子相连的标记通过二硫桥键或肽桥键或腙键与这些表面活性剂分子相连。本发明还提供根据本发明的荧光乳液的用途，用于制造监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂。本发明还提供一种用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释药的标记试剂， 其包含根据本发明的乳液、以及包裹在油相液滴中的基底媒质中所关注的药物或物质。本发明还提供一种用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂， 其包含根据本发明的荧光乳液以及与供体荧光标记或受体标记中一个相连接的所关注的药物或者物质。最后，本发明的目的还在于提供根据本发明的乳液的用途，用于制造用于光学荧光成像的标记试剂。
具体实施例方式本发明将得到更好地说明，并且本发明的其它特征优势在阅读以下说明后将更加显而易见。乳液是两种不能混溶的液体物质的混合物，由连续相和分散相组成。一种物质以液滴(分散相)的形式分散于第二种物质(连续相)中。混合物依靠两亲分子(所谓的乳化剂或表面活性剂)的作用来保持稳定，所述两亲分子位于两相之间的界面。乳液是亚稳态超分子结构。这些结构区别于聚合物泡囊(polmersomes)和胶束。聚合物泡囊(包含脂质体的家族)是直径几十至几千纳米的囊泡。这些泡囊由一层以上表面活性剂的双层膜组成，所述表面活性剂可分开外部媒质和内媒质 (intravesicular medium)，两种媒质是相同的(水)性质。胶束由直径数纳米的自组装(self-assembled)表面活性剂团聚体组成。所述表面活性剂以这样的方式组成使得亲水部分向着外侧(溶剂)并且疏水链向着胶束的核心。乳液已经被用于造影剂的制造。在所有这些乳液中，引入标记以便允许经由所需技术来显现。因此，专利申请US 2005/00079131公开了水包油型乳液，其中油液滴具有在IOnm至200nm之间的平均直径，这对应于通常所接受的术语纳米乳液或微型乳液 (miniemulsion)或超细乳液或亚微型乳液(submicron emulsion)的定义，其中荧光团存在于围绕油液滴并使乳液稳定的表面活性剂层中。在此专利申请中除了荧光团之外还有辅助显像剂，主显像剂是具有高原子序数(Z)的元素，该荧光团不与可吸收荧光团所发射光能的另一标记组合使用。目前，为了解决由于人体或动物组织的自体荧光引起的寄生荧光信号的问题、允许各种荧光标记的同时使用、或者为了可以确定何时以及是否将制品例如药物在基底媒质中释放，本发明不仅使用荧光团(在下文中，也称为供体荧 光标记)，而且也使用受体标记。 所述供体标记将其光能传递给所述受体标记，所述受体标记将会以荧光的形式、但是在与供体荧光标记的荧光发射波长不同的波长下重建该能量，或者以非光能的形式例如以热能的形式恢复该能量。更确切地说，为了解决上述问题，本发明基于荧光共振能量转移的现象，该现象称为FRET或RET。该能量转移是非辐射过程，其中激发态的供体荧光标记将其荧光能量传递至位于紧邻区域(距离其几纳米)的受体标记。当受体标记本身是荧光团时，它通过供体荧光标记所发射的能量同样会以荧光的形式再发射。在此情况下，特别是FRET具有降低供体荧光标记的荧光并增加受体标记的荧光的效果、以及改变荧光波长用于光学荧光成像读取的效果。FRET也具有改变荧光寿命的效果。供体荧光标记的荧光波长的改变是应当考虑的，特别是在人体或动物组织的光学荧光成像中。具体来说，如上所述，在人体和动物组织的情况中，荧光必须在红光或近红外中发生，在该波长范围内没有供体荧光标记的组织也具有内源荧光。归功于受体标记的使用，荧光向红光区偏移。此外，可以过滤偏移至波长范围内(也在红光或近红外区内)的荧光，其中组织的寄生荧光大幅下降或者甚至不存在。然后，受体标记的荧光用带通滤波器和 /或高通滤波器过滤，并偏移至组织的寄生荧光信号非常弱的区域内。因此，增加了预期的信号/寄生信号比例。然而，受体标记也可以是所谓的“猝灭剂”，即，可吸收被供体荧光标记所传递的传输光能、但是不会以荧光光能形式再发射该能量的受体标记。事实上，所述受体标记可吸收光能并以其它能量形式例如热能恢复该能量。在此情况下，如果不完全停止，那么供体荧光标记的荧光在任何情况下都会被大大抑制，并且将会被检测出的是供体荧光标记的荧光再现。 当满足如下两种情况时，会发生用于本发明中的能量转移现象1)当受体标记在被供体荧光标记发射的波长范围内吸收时；以及2)当供体荧光标记和受体标记相互接近、但是没有直接连接在一起时。通过在乳液中引入供体荧光标记和受体标记，有可能满足了第二个条件，因为在第一具体实施方式
中，可以使供体荧光标记和受体标记包裹在油(油相)液滴中，由此使得它们保持所限定的彼此间的距离。然而，可以仅包裹标记中的一个，而另一个标记则直接或间接地与其中包裹另一标记的油液滴的膜相连。此外，在两标记之间保持合适的距离。为了使两种标记都包裹在油液滴中，该两种标记必须是亲油的，或者通过接枝例如脂肪链而具有亲油性；或者它们必须在组成液滴的油相中具有高溶解度的两亲性。为了使标记直接与所述膜相连，上述标记必须是两亲性的，或者取决于其初始的亲油性或亲水性、通过接枝亲油链或亲水链而被赋予两亲性，并且其在油相中的溶解度必须不足以保持其被包裹在油相液滴中。然而，标记可以经由本来本身就是两亲性的表面活性剂分子而与油液滴的膜相连。为了稳定乳液，所述表面活性剂分子存在于乳液的表面活性剂层中。当标记为亲水性时，这是特别有优势。表面活性剂分子可以经由共价键或者经由例如二硫桥键、腙键(hydrazone bond) 或可裂解桥键(cleavable bridge)连接。这种可裂解桥键可以是已经通过氧化还原电势变化而被打断或裂解的二硫桥键。所述可裂解桥键也可以是腙键，所述腙键对于PH的变化较敏感，当期望显示出通常具有比正常细胞更低PH的肿瘤细胞时，其更具有优势。当受体标记是本身无荧光的标记，供体荧光标记的荧光然后被恢复时；或者当受体标记本身可发射荧光时，细胞的癌症特征由此通过监测供体荧光标记的荧光、以及不再有受体标记的荧光而被表现出来。可裂解桥键也可以是肽桥键，例如可被蛋白酶例如金属蛋白酶裂解的肽桥键，或者被可以在特定肿瘤模型中过度表达的蛋白酶裂解的肽桥键。
总而 言之，假定受体标记以供体荧光标记的发射波长λ 2吸收，所述供体标记本身以与波长λ2不同的波长入工吸收，那么任何成对的供体荧光标记/受体标记可用于本发明的乳液，并且这些标记可以是两者皆位于油液滴中、或者所述标记中的一个直接或间接地与位于油液滴外表面的膜相连而另一个则位于油液滴的内部。受体标记本身可以是荧光团，并且在此情况下，该受体标记必须发射不同于波长入工和λ2的波长λ3。这意味着所述成对的标记彼此不同。更具体地说，因为本发明的乳液旨在将供体荧光标记注入到人体或动物组织的基底媒质中，该供体荧光标记必须在近红外波长范围内即640nm至900nm之间的波长范围内有吸收并发射。因此，在受体标记本身也必须在此相同的波长范围内有吸收，并且当其本身是荧光性时，其必须在相同的波长范围内可再发射。优选的是，用于本发明的乳液是纳米乳液，即具有IOnm至200nm、并且更优选IOnm 至SOnm之间(包含端点)尺寸的油液滴，以便允许乳液在人体或动物组织中内在化。在本发明的上下文中，术语“液滴”可同时包括真实油液滴以及由水包油型乳液所获得的固体颗粒，其中所用的油是可结晶的油。在此情况下，这种乳液被称为固态乳液。可用的油是选自植物来源或动物来源的生物相容性油、合成油及其混合物。在乳液形成之前，这些油可以不经化学改性或物理改性而使用。在这些油中，特别优选所述的油是植物来源的油、动物来源的油、合成油组成，在所述植物来源的油中特别优选豆油、棕榈油、花生油、橄榄油、亚麻油、葡萄籽油、和葵花籽油；在所述动物来源的油中特别优选鱼油；在所述合成油中特别优选甘油三酯、甘油二酯、 和单甘酯；所述油可以单独使用或组合使用。这些油可以是第一道油(first expression oil)、精制油、或者交酯化油 (interesterified oil)。根据本发明的特别优选具体实施方式
，这些油选自水溶性并非很好的油，即那些亲水亲油平衡值(HLB)通常低于8、更优选3至6的油例如豆油。根据优选具体实施方式
，油相由至少10重量％的油组成，所述油的粘度在20°C下大于或等于IOOcP (粘度值，列于例如《化学和物理手册》中，CRC出版社，第88版，2007)。 在乳液中配制的标记上，在油相中这种油的存在可以使荧光寿命特别适用于体内时间分辨焚光成像(in vivo time-resolved fluorescence imaging)。为了在乳液内部形成用于稳定油液滴的表面活性剂层，所述乳液包含表面活性齐U，并且特别是至少一种两亲表面活性剂。这些两亲表面活性剂(包含固体部分)通常选自如下化合物化合物的亲油部分包含含有8至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和链。所述表面活性剂可以选自下组天然来源的或合成的磷脂、胆固醇、脱脂脂质(lysolipids)、鞘磷脂、生育酚、糖脂、硬脂酰胺、心磷脂；由通过醚或酯官能团与亲水基团相连的脂肪酸所组成的分子，例如脱水山梨糖醇酯，例如Sigma公司的商品名为Span 的单油酸脱水山梨糖醇酯和单月桂酸脱水山梨糖醇酯；聚合脂质体(polymerized lipids)；偶联到聚氧化乙烯(PEG)短链上的脂例如 ICI Americas Inc.公司的商品名为Tween 的非离子表面活性剂固体，和Union Carbide Corp.公司的商品名为Triton, 的非离子表面活性剂固体；糖酯，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯和蔗糖二棕榈酸酯、以及蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯。所述表面活性剂可单独使用或组合使用。根据本发明，两亲表面活性剂优选来自天然并且可被同化(生物相容性)的表面活性剂，例如大豆卵磷脂、磷脂、和胆固醇。在本发明中，优 选的两亲表面活性剂是卵磷脂。本发明的乳液可包含增溶性脂质(solubilizing lipid)，所述增溶性脂质与两亲表面活性剂一起使用。增溶性脂质允许大量表面活性剂特别是两亲表面活性剂被溶解。因此，一方面，当需要时，制备的乳液中分散相具有较小尺寸，即纳米乳液，并且另一方面，最特别的是，当标记是亲油的或两亲的并且大量标记分子接枝在表面活性剂特别是两亲表面活性剂上时，为使更好地溶解的这些标记可以更大量地存在，大量标记溶解于本发明的乳液中。因此，改进了乳液的光学性能。所述增溶性脂质是对于两亲表面活性剂具有亲合性的脂质，以允许两亲表面活性剂溶解。当两亲表面活性剂是磷脂时，一种优选的增溶性脂质是甘油衍生物，特别是通过甘油与脂肪酸的酯化作用而获得的甘油酯。有利的是，所用的增溶性脂质根据所用的两亲表面活性剂来选择。一般来说，所用的增溶性脂质具有相似的化学结构以便保证所期望的增溶效果。其可以是油或蜡。特别是就磷脂而言，优选的增溶性脂质是脂肪酸的甘油酯，特别是饱和脂肪酸、特别是含有8至18个碳原子、优选12至18个碳原子的饱和脂肪酸的甘油酯。优选饱和脂肪酸的甘油酯包含0重量％至20重量％的C8脂肪酸、0重量％至20 重量％的ClO脂肪酸、10重量％至70重量％的C12脂肪酸、5重量％至30重量％的C14脂肪酸、5重量％至30重量％的C16脂肪酸、5重量％至30重量％的C18脂肪酸。特别优选的是以Gattef0SS6公司的商标名Suppocire 出售的半合成甘油酯的混合物，所述混合物在室温下是固体。N-型Suppocire 制品通过脂肪酸和甘油的直接酯化作用来获得。它们是半合成的C8至C18饱和脂肪酸甘油酯，其定性定量组分 (quail-quantitative composition)如下表所不。表Gattefoss6SuppocireNC 的脂肪酸组分
权利要求
1.水包油型荧光乳液，其包含至少一个水连续相，其中分散有至少一个油相的液滴，所述油相液滴通过表面活性剂层来稳定，其特征在于-所述乳液包含至少一对由供体荧光标记和受体标记形成的且彼此不同的标记，所述供体荧光标记以波长X1吸收、以不同于X1的波长λ 2发射，所述受体标记以所述供体荧光标记的发射波长λ2吸收；-所述供体荧光标记和所述受体标记通过下述方式保持靠近一起将它们中的一个包裹在油相液滴中，并且要么将它们中的另一个连接到油相液滴/水相界面上、要么将它们中的另一个包裹在油相液滴中；以及-所述乳液包含至少一种两亲表面活性剂的分子和至少一种增溶性脂质的分子。
2.如权利要求1所述的荧光乳液，其特征在于，所述受体标记可以以波长λ3的光能形式来再发射由所述供体荧光标记发射的光能，所述波长λ3与波长入工和λ2不同。
3.如权利要求1所述的荧光乳液，其特征在于，所述受体标记不或几乎不以光能的形式再发射由所述供体标记所提供的光能。
4.如前述权利要求中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述波长λ”入2和入3在 640nm至900nm之间，包含端点。
5.如前述权利要求中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述油相液滴的平均直径在IOnm至200nm之间，包含端点。
6.如前述权利要求中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体荧光标记和所述受体标记各自独立地是亲油性的或两亲性的，它们通过被包裹在油相液滴中来保持靠近一起。
7.如权利要求1至5中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体标记和所述受体标记中的一个是两亲性的，其通过直接与所述油相液滴的膜相连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面上。
8.如权利要求1至5中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体标记和所述受体标记中的一个通过与两亲性表面活性剂分子相连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面上。
9.如权利要求8所述的乳液的用途，其特征在于，与所述表面活性剂分子相连的标记通过共价键与这些表面活性剂分子相连。
10.如权利要求8所述的荧光乳液，其特征在于，与所述两亲性表面活性剂分子相连的标记通过二硫桥键或肽桥键或腙键与这些表面活性剂分子相连。
11.如权利要求6所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体荧光标记是1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(DiD)，所述受体标记是1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘(DiR)。
12.如权利要求6所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体荧光标记是1，1'-双十八烷基-3，3，3' ,3'-四甲基吲哚三碳菁碘，所述受体标记是吲哚青绿(ICG)。
13.如权利要求1至11中任一项所述的乳液的用途，用于制造一种用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂。
14.用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1至12中任一项所述的乳液、以及包裹在油相液滴中的所关注的药物或物质。
15.用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1至12中任一项所述的乳液、以及与所述供体荧光标记或所述受体荧光标记相连接的被关注药物或物质。
16.如权利要求1至12中任一项所述的乳液的用途，用于制造用于光学荧光成像的标记试齐Ll。
全文摘要
本发明涉及一种荧光乳液、其用途以及包含其的标记试剂。本发明的荧光乳液是水包油型的，其包含至少一个水连续相，至少一个油相的液滴分散在所述水连续相中，所述液滴通过表面活性剂层来稳定，其特征在于，所述乳液包含至少一对由供体荧光标记和受体标记形成的彼此不同的标记，所述供体荧光标记以波长λ1吸收、以不同于与λ1的波长λ2发射，所述受体标记以供体荧光标记发射的波长λ2吸收；供体荧光标记和受体标记通过如下方式来保持靠近一起将它们中的一个包裹在油相液滴中，并且要么将它们中的另一个与油相液滴/水相界面相连、要么将它们中的另一个包裹在油相液滴中；并且所述乳液包含至少一种两亲表面活性剂分子和至少一种增溶性脂质的分子。本发明的荧光乳液可应用于光学荧光成像领域，特别是可应用于生物光学荧光成像。
文档编号A61K49/00GK102170913SQ200980139595
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月14日
发明者伊莎贝尔·谢克尔-诺盖斯, 法布里斯·纳瓦罗塔·Y·加西亚, 洛朗·居尤, 马蒂厄·古塔耶 申请人:法国原子能与替代能源委员会
技术领域：
本发明涉及一种荧光乳液、其用途以及含有所述乳液的标记试剂。
背景技术：
人们不断地开发出基于利用被探测信号中散射成分的光学成像技术，因为该技术允许散射物体、更具体地说是较厚的散射物体被探测到。在生物医学成像领域，这些技术例如通过扩散光学层析成像，而为如下常规技术用于例如癌症肿瘤提供了选择放射线照相术和X射线断层照相术、正电子发射断层显像、 以及用于探测和定位的磁共振成像。这些常规 技术，在非电离辐射的可见范围内的波长、更准确地说是生物组织具有最小吸光度(absorption)的红光或近红外波长范围内，用于监测异常吸收和/或散射区域。近年来，归功于特异性荧光标记的应用，人们不断开发荧光分子光学成像技术 (optical fluorescence molecular imaging techniques)。这些特异性焚光标记优选被附接于所关注的靶细胞例如癌细胞，并且提供比非特异性标记更好的监测对比度。这些技术的目的不仅在于在空间中定位荧光标记，而且还在于测定其浓度，由此能够间接定位肿瘤， 并获得有关其形状以及其生物活性的信息。取决于所使用的光源，可以将利用光传播进入散射介质的设备划分为三个分类 连续式；频率调制式；和时间调制式。在历史上，首先研发出的是使用连续光源的设备。然而，它们其中具有不能提供有关组织的散射性能的缺陷，因此必须提供先验(a priori)。时间调制方法和频率调制方法与傅里叶变换法有关，并且两者皆具有更丰富的信息。使用成对源/探测器的单一获得物的设备例如可以测定均勻介质的光学吸收和各自表示为μ a和 μ s 的各向同性散身寸性能(isotropic scattering properties) 在荧光分子光学成像技术中，将荧光标记或者荧光造影剂(contrast agents)注入被研究的被散射组织中，并特异性或非特异性地定位在所研究区域中。然后，所述组织用准单色光源、或者激光束来照亮，所述准单色光是通过使用带通滤波器或低通滤波器所获得的。来自光源的光在组织中散射，并且通过向红光滑移的波长的荧光发射，一些光子到达了荧光标记或荧光分子，所述荧光标记或荧光分子再发射(re-emit)出由它们所吸收的光源提供的能量。直到到达组织边缘并由此显现(emerging)为止，所述光通过荧光本身的传播来发出进入所研究的散射组织中。预先过滤由成像设备例如照相机、红外照相机、光纤或其它成像设备所收集的输出光，由此除去激发信号(excitation signal)并且仅收集荧光光子。通过光源所发射的光和通过荧光团(fluorophore)再发射的荧光所发出的光位于红光或近红外区，称为治疗窗区域，所述光的波长可用于人体和动物组织，因为在这些波长处人体和动物组织吸收最少。更具体地说，血液代表较短波长的光吸收，水代表较长波长的光吸收。因此，选择荧光分子或荧光团在这些波长内即640nm至900nm之间吸收并发射。
目前，荧光分子不是这样注入所研究的组织中，而是以光学探针的方式注入。一般而言，该光学探针是由荧光分子组成的分子集合，所述荧光分子例如可以是有机荧光团、稀土络合物、或者发光半导体纳米晶体(luminescent semiconductive nanocrystal，“量子点，，，例如 CdSe, CdTe, InP、Si 等)。 这些光学探针可以包含一种以上的如下组分a)生物配体，其使特异性生物过程(biological process)有可能成像。这种配体可以是i)生物靶向配体所述配体是生物实体(抗体、肽、糖类等)或者化学实体(例如，叶酸)，其能够进行特定器官中特定细胞(例如，肿瘤细胞，例如，如以下文章中所述 S. Achilefu, Technology in Cancer Research & Treatment，2004，3，393-408)的特异性识别；ii)作为用于给定生物活性例如酶活性的标记的生物配体。例如，这些生物配体将会是能够被给定蛋白酶裂解的肽，标记荧光抑制剂将会被接枝到所述肽的末端上。该类型的配体可使蛋白酶的酶活性能够特异性地成像(specifically image)，如以下文章中所述C. H. Tung,Biopolymers, 2004，76，391-403。另一个例子由生物配体组成，所述配体包含将标记和所述标记荧光抑制剂分开的二硫桥键。然后，该生物配体使得细胞中光学探针的内在化(internalization)可以特异性地成像，例如，如公布编号为FR 2 888 938的法国专利申请中所述的那样；b)隐形剂(stealth agent)这是加入到光学探针的实体，从而使其相对于免疫系统隐形、增加其在生物体中的循环时间、并降低其消除(elimination)；c) “组装载体(assembly vector) ”这是可以组合荧光标记和/或生物靶向标记和/或隐形剂和/或一种以上其它功能特性(例如，药物释放、其它成像模式、治疗作用) 的实体。荧光分子可以被包括在乳液中。然而，没有荧光标记的人体或动物组织具有固有荧光(称为内源荧光或自体荧光)，所述固有荧光可增加寄生信号(spurious signal) 0非弹性散射的激发或过滤不良的激发也可以是寄生信号的来源。此外，通过荧光分子再发射的荧光具有较宽的光谱。因此，难以具有来自不同荧光分子(在下文中也称为供体荧光标记)的信号，这意味着可能没有或者几乎没有任何复用 (multiplexing)。最终，目前，当荧光分子(荧光标记)被传送入生物体中时，现有的光学探针不能进行测定。光学荧光成像应用的另一领域是用于监测在基底媒质(host medium)中所关注的物质的释药(delivery)、形状或大小或状态的差异。例如，可以监测如下项目在人体或动物中药物释药；或者在植物中、或者在细胞或组织或者人体、动物、或植物的特定器官或者这些细胞、组织、或器官的合成介质代表中的农药释药。然而，所述基底媒质也可以是含有有机体或者特定物质的合成或天然媒质，需要监测所述基底媒质的路径(path)。然而，光学荧光成像也可以用于研究纳米乳液，从而监测纳米颗粒的尺寸评估、或者知道何时这些颗粒会爆裂(burst)、或者测定标记的释放速度。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种荧光乳液，其能够用于所有这些应用，并且能抑制甚至阻止由于基底媒质的自体荧光引起的寄生信号，所述乳液注入基底媒质中并且/或者允许数个荧光标记同时使用、并且/或者监测基底媒质中所关注的药物或物质的释药、 形状或尺寸的改变等。为此目的，本发明提供了一种水包油型荧光乳液，其包含水连续相，其中分散有油相的液滴，所述油相液滴通过表面活性剂层来稳定，其特征在于，所述乳液包含至少一对由供体荧光标记和受体标记形成的且彼此不同的标记，所述供体荧光标记以波长X1吸收、以不同于X1的波长λ 2发射，所述受体标记以供体荧光标记发射的波长λ 2吸收；所述供体荧光标记和所述受体标记通过如下方式来保持靠近一起将它们中的一个包裹在油相液滴中，并且要么将它们中的另一个连接到油相液滴/水相界面相连上、要么将它们中的另一个包裹在油相液滴中；并且所述乳液包含至少一种两亲表面活性剂的分子和至少一种增溶性脂质的分子。在本发明荧光溶液的第一优选具体实施方式
中，所述受体标记可以以波长λ3的光能形式来再发射由所述供体荧光标记发射的光能，所述波长λ3与波长入工和λ2不同。 在本发明荧光溶液的第二优选具体实施方式
中，所述受体标记不或几乎不以光能的形式再发射由所述供体标记所提供的光能。在本发明荧光溶液的所有具体实施方式
中，波长λ ρ λ 2和λ 3在640nm至900nm 之间，包含端点。而优选的是，在根据本发明的荧光溶液的所有具体实施方式
中，油相液滴的平均直径在IOnm至200nm之间、包含端点。在本发明荧光乳液的所有具体实施方式
的第一变体中，供体荧光标记和受体标记各自独立地是亲油的或两亲的，并且通过被包裹在油相液滴中来保持靠近一起。在第一变体中和第一优选具体实施方式
中，供体荧光标记是1，Γ -双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(DiD)，并且受体标记是1，Γ -双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘(DiR)。在该第一变体的另一优选具体实施方式
中，供体荧光标记是1，Γ -双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘，并且受体是吲哚青绿(ICG)。在本发明荧光乳液的所有具体实施方式
的第二变体中，供体标记和受体标记中的一个是两亲性的，并且通过直接与油相液滴的膜连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面，另一个被包裹在油相液滴中。在本发明荧光乳液的所有具体实施方式
的第三变体中，供体标记和受体标记中的一个通过直接与油相液滴的膜相连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面，另一个被包裹在油相液滴中。在该变体中和第一具体实施方式
中，与所述表面活性剂分子相连的标记通过共价键与这些表面活性剂分子相连。在该变体的第二具体实施方式
中，与表面活性剂分子相连的标记通过二硫桥键或肽桥键或腙键与这些表面活性剂分子相连。本发明还提供根据本发明的荧光乳液的用途，用于制造监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂。本发明还提供一种用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释药的标记试剂， 其包含根据本发明的乳液、以及包裹在油相液滴中的基底媒质中所关注的药物或物质。本发明还提供一种用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂， 其包含根据本发明的荧光乳液以及与供体荧光标记或受体标记中一个相连接的所关注的药物或者物质。最后，本发明的目的还在于提供根据本发明的乳液的用途，用于制造用于光学荧光成像的标记试剂。
具体实施例方式本发明将得到更好地说明，并且本发明的其它特征优势在阅读以下说明后将更加显而易见。乳液是两种不能混溶的液体物质的混合物，由连续相和分散相组成。一种物质以液滴(分散相)的形式分散于第二种物质(连续相)中。混合物依靠两亲分子(所谓的乳化剂或表面活性剂)的作用来保持稳定，所述两亲分子位于两相之间的界面。乳液是亚稳态超分子结构。这些结构区别于聚合物泡囊(polmersomes)和胶束。聚合物泡囊(包含脂质体的家族)是直径几十至几千纳米的囊泡。这些泡囊由一层以上表面活性剂的双层膜组成，所述表面活性剂可分开外部媒质和内媒质 (intravesicular medium)，两种媒质是相同的(水)性质。胶束由直径数纳米的自组装(self-assembled)表面活性剂团聚体组成。所述表面活性剂以这样的方式组成使得亲水部分向着外侧(溶剂)并且疏水链向着胶束的核心。乳液已经被用于造影剂的制造。在所有这些乳液中，引入标记以便允许经由所需技术来显现。因此，专利申请US 2005/00079131公开了水包油型乳液，其中油液滴具有在IOnm至200nm之间的平均直径，这对应于通常所接受的术语纳米乳液或微型乳液 (miniemulsion)或超细乳液或亚微型乳液(submicron emulsion)的定义，其中荧光团存在于围绕油液滴并使乳液稳定的表面活性剂层中。在此专利申请中除了荧光团之外还有辅助显像剂，主显像剂是具有高原子序数(Z)的元素，该荧光团不与可吸收荧光团所发射光能的另一标记组合使用。目前，为了解决由于人体或动物组织的自体荧光引起的寄生荧光信号的问题、允许各种荧光标记的同时使用、或者为了可以确定何时以及是否将制品例如药物在基底媒质中释放，本发明不仅使用荧光团(在下文中，也称为供体荧 光标记)，而且也使用受体标记。 所述供体标记将其光能传递给所述受体标记，所述受体标记将会以荧光的形式、但是在与供体荧光标记的荧光发射波长不同的波长下重建该能量，或者以非光能的形式例如以热能的形式恢复该能量。更确切地说，为了解决上述问题，本发明基于荧光共振能量转移的现象，该现象称为FRET或RET。该能量转移是非辐射过程，其中激发态的供体荧光标记将其荧光能量传递至位于紧邻区域(距离其几纳米)的受体标记。当受体标记本身是荧光团时，它通过供体荧光标记所发射的能量同样会以荧光的形式再发射。在此情况下，特别是FRET具有降低供体荧光标记的荧光并增加受体标记的荧光的效果、以及改变荧光波长用于光学荧光成像读取的效果。FRET也具有改变荧光寿命的效果。供体荧光标记的荧光波长的改变是应当考虑的，特别是在人体或动物组织的光学荧光成像中。具体来说，如上所述，在人体和动物组织的情况中，荧光必须在红光或近红外中发生，在该波长范围内没有供体荧光标记的组织也具有内源荧光。归功于受体标记的使用，荧光向红光区偏移。此外，可以过滤偏移至波长范围内(也在红光或近红外区内)的荧光，其中组织的寄生荧光大幅下降或者甚至不存在。然后，受体标记的荧光用带通滤波器和 /或高通滤波器过滤，并偏移至组织的寄生荧光信号非常弱的区域内。因此，增加了预期的信号/寄生信号比例。然而，受体标记也可以是所谓的“猝灭剂”，即，可吸收被供体荧光标记所传递的传输光能、但是不会以荧光光能形式再发射该能量的受体标记。事实上，所述受体标记可吸收光能并以其它能量形式例如热能恢复该能量。在此情况下，如果不完全停止，那么供体荧光标记的荧光在任何情况下都会被大大抑制，并且将会被检测出的是供体荧光标记的荧光再现。 当满足如下两种情况时，会发生用于本发明中的能量转移现象1)当受体标记在被供体荧光标记发射的波长范围内吸收时；以及2)当供体荧光标记和受体标记相互接近、但是没有直接连接在一起时。通过在乳液中引入供体荧光标记和受体标记，有可能满足了第二个条件，因为在第一具体实施方式
中，可以使供体荧光标记和受体标记包裹在油(油相)液滴中，由此使得它们保持所限定的彼此间的距离。然而，可以仅包裹标记中的一个，而另一个标记则直接或间接地与其中包裹另一标记的油液滴的膜相连。此外，在两标记之间保持合适的距离。为了使两种标记都包裹在油液滴中，该两种标记必须是亲油的，或者通过接枝例如脂肪链而具有亲油性；或者它们必须在组成液滴的油相中具有高溶解度的两亲性。为了使标记直接与所述膜相连，上述标记必须是两亲性的，或者取决于其初始的亲油性或亲水性、通过接枝亲油链或亲水链而被赋予两亲性，并且其在油相中的溶解度必须不足以保持其被包裹在油相液滴中。然而，标记可以经由本来本身就是两亲性的表面活性剂分子而与油液滴的膜相连。为了稳定乳液，所述表面活性剂分子存在于乳液的表面活性剂层中。当标记为亲水性时，这是特别有优势。表面活性剂分子可以经由共价键或者经由例如二硫桥键、腙键(hydrazone bond) 或可裂解桥键(cleavable bridge)连接。这种可裂解桥键可以是已经通过氧化还原电势变化而被打断或裂解的二硫桥键。所述可裂解桥键也可以是腙键，所述腙键对于PH的变化较敏感，当期望显示出通常具有比正常细胞更低PH的肿瘤细胞时，其更具有优势。当受体标记是本身无荧光的标记，供体荧光标记的荧光然后被恢复时；或者当受体标记本身可发射荧光时，细胞的癌症特征由此通过监测供体荧光标记的荧光、以及不再有受体标记的荧光而被表现出来。可裂解桥键也可以是肽桥键，例如可被蛋白酶例如金属蛋白酶裂解的肽桥键，或者被可以在特定肿瘤模型中过度表达的蛋白酶裂解的肽桥键。
总而 言之，假定受体标记以供体荧光标记的发射波长λ 2吸收，所述供体标记本身以与波长λ2不同的波长入工吸收，那么任何成对的供体荧光标记/受体标记可用于本发明的乳液，并且这些标记可以是两者皆位于油液滴中、或者所述标记中的一个直接或间接地与位于油液滴外表面的膜相连而另一个则位于油液滴的内部。受体标记本身可以是荧光团，并且在此情况下，该受体标记必须发射不同于波长入工和λ2的波长λ3。这意味着所述成对的标记彼此不同。更具体地说，因为本发明的乳液旨在将供体荧光标记注入到人体或动物组织的基底媒质中，该供体荧光标记必须在近红外波长范围内即640nm至900nm之间的波长范围内有吸收并发射。因此，在受体标记本身也必须在此相同的波长范围内有吸收，并且当其本身是荧光性时，其必须在相同的波长范围内可再发射。优选的是，用于本发明的乳液是纳米乳液，即具有IOnm至200nm、并且更优选IOnm 至SOnm之间(包含端点)尺寸的油液滴，以便允许乳液在人体或动物组织中内在化。在本发明的上下文中，术语“液滴”可同时包括真实油液滴以及由水包油型乳液所获得的固体颗粒，其中所用的油是可结晶的油。在此情况下，这种乳液被称为固态乳液。可用的油是选自植物来源或动物来源的生物相容性油、合成油及其混合物。在乳液形成之前，这些油可以不经化学改性或物理改性而使用。在这些油中，特别优选所述的油是植物来源的油、动物来源的油、合成油组成，在所述植物来源的油中特别优选豆油、棕榈油、花生油、橄榄油、亚麻油、葡萄籽油、和葵花籽油；在所述动物来源的油中特别优选鱼油；在所述合成油中特别优选甘油三酯、甘油二酯、 和单甘酯；所述油可以单独使用或组合使用。这些油可以是第一道油(first expression oil)、精制油、或者交酯化油 (interesterified oil)。根据本发明的特别优选具体实施方式
，这些油选自水溶性并非很好的油，即那些亲水亲油平衡值(HLB)通常低于8、更优选3至6的油例如豆油。根据优选具体实施方式
，油相由至少10重量％的油组成，所述油的粘度在20°C下大于或等于IOOcP (粘度值，列于例如《化学和物理手册》中，CRC出版社，第88版，2007)。 在乳液中配制的标记上，在油相中这种油的存在可以使荧光寿命特别适用于体内时间分辨焚光成像(in vivo time-resolved fluorescence imaging)。为了在乳液内部形成用于稳定油液滴的表面活性剂层，所述乳液包含表面活性齐U，并且特别是至少一种两亲表面活性剂。这些两亲表面活性剂(包含固体部分)通常选自如下化合物化合物的亲油部分包含含有8至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和链。所述表面活性剂可以选自下组天然来源的或合成的磷脂、胆固醇、脱脂脂质(lysolipids)、鞘磷脂、生育酚、糖脂、硬脂酰胺、心磷脂；由通过醚或酯官能团与亲水基团相连的脂肪酸所组成的分子，例如脱水山梨糖醇酯，例如Sigma公司的商品名为Span 的单油酸脱水山梨糖醇酯和单月桂酸脱水山梨糖醇酯；聚合脂质体(polymerized lipids)；偶联到聚氧化乙烯(PEG)短链上的脂例如 ICI Americas Inc.公司的商品名为Tween 的非离子表面活性剂固体，和Union Carbide Corp.公司的商品名为Triton, 的非离子表面活性剂固体；糖酯，例如蔗糖单月桂酸酯和蔗糖二月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯和蔗糖二棕榈酸酯、以及蔗糖单硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯。所述表面活性剂可单独使用或组合使用。根据本发明，两亲表面活性剂优选来自天然并且可被同化(生物相容性)的表面活性剂，例如大豆卵磷脂、磷脂、和胆固醇。在本发明中，优 选的两亲表面活性剂是卵磷脂。本发明的乳液可包含增溶性脂质(solubilizing lipid)，所述增溶性脂质与两亲表面活性剂一起使用。增溶性脂质允许大量表面活性剂特别是两亲表面活性剂被溶解。因此，一方面，当需要时，制备的乳液中分散相具有较小尺寸，即纳米乳液，并且另一方面，最特别的是，当标记是亲油的或两亲的并且大量标记分子接枝在表面活性剂特别是两亲表面活性剂上时，为使更好地溶解的这些标记可以更大量地存在，大量标记溶解于本发明的乳液中。因此，改进了乳液的光学性能。所述增溶性脂质是对于两亲表面活性剂具有亲合性的脂质，以允许两亲表面活性剂溶解。当两亲表面活性剂是磷脂时，一种优选的增溶性脂质是甘油衍生物，特别是通过甘油与脂肪酸的酯化作用而获得的甘油酯。有利的是，所用的增溶性脂质根据所用的两亲表面活性剂来选择。一般来说，所用的增溶性脂质具有相似的化学结构以便保证所期望的增溶效果。其可以是油或蜡。特别是就磷脂而言，优选的增溶性脂质是脂肪酸的甘油酯，特别是饱和脂肪酸、特别是含有8至18个碳原子、优选12至18个碳原子的饱和脂肪酸的甘油酯。优选饱和脂肪酸的甘油酯包含0重量％至20重量％的C8脂肪酸、0重量％至20 重量％的ClO脂肪酸、10重量％至70重量％的C12脂肪酸、5重量％至30重量％的C14脂肪酸、5重量％至30重量％的C16脂肪酸、5重量％至30重量％的C18脂肪酸。特别优选的是以Gattef0SS6公司的商标名Suppocire 出售的半合成甘油酯的混合物，所述混合物在室温下是固体。N-型Suppocire 制品通过脂肪酸和甘油的直接酯化作用来获得。它们是半合成的C8至C18饱和脂肪酸甘油酯，其定性定量组分 (quail-quantitative composition)如下表所不。表Gattefoss6SuppocireNC 的脂肪酸组分
权利要求
1.水包油型荧光乳液，其包含至少一个水连续相，其中分散有至少一个油相的液滴，所述油相液滴通过表面活性剂层来稳定，其特征在于-所述乳液包含至少一对由供体荧光标记和受体标记形成的且彼此不同的标记，所述供体荧光标记以波长X1吸收、以不同于X1的波长λ 2发射，所述受体标记以所述供体荧光标记的发射波长λ2吸收；-所述供体荧光标记和所述受体标记通过下述方式保持靠近一起将它们中的一个包裹在油相液滴中，并且要么将它们中的另一个连接到油相液滴/水相界面上、要么将它们中的另一个包裹在油相液滴中；以及-所述乳液包含至少一种两亲表面活性剂的分子和至少一种增溶性脂质的分子。
2.如权利要求1所述的荧光乳液，其特征在于，所述受体标记可以以波长λ3的光能形式来再发射由所述供体荧光标记发射的光能，所述波长λ3与波长入工和λ2不同。
3.如权利要求1所述的荧光乳液，其特征在于，所述受体标记不或几乎不以光能的形式再发射由所述供体标记所提供的光能。
4.如前述权利要求中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述波长λ”入2和入3在 640nm至900nm之间，包含端点。
5.如前述权利要求中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述油相液滴的平均直径在IOnm至200nm之间，包含端点。
6.如前述权利要求中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体荧光标记和所述受体标记各自独立地是亲油性的或两亲性的，它们通过被包裹在油相液滴中来保持靠近一起。
7.如权利要求1至5中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体标记和所述受体标记中的一个是两亲性的，其通过直接与所述油相液滴的膜相连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面上。
8.如权利要求1至5中任一项所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体标记和所述受体标记中的一个通过与两亲性表面活性剂分子相连接而被束缚在所述油相液滴/水相界面上。
9.如权利要求8所述的乳液的用途，其特征在于，与所述表面活性剂分子相连的标记通过共价键与这些表面活性剂分子相连。
10.如权利要求8所述的荧光乳液，其特征在于，与所述两亲性表面活性剂分子相连的标记通过二硫桥键或肽桥键或腙键与这些表面活性剂分子相连。
11.如权利要求6所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体荧光标记是1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(DiD)，所述受体标记是1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚三碳菁碘(DiR)。
12.如权利要求6所述的荧光乳液，其特征在于，所述供体荧光标记是1，1'-双十八烷基-3，3，3' ,3'-四甲基吲哚三碳菁碘，所述受体标记是吲哚青绿(ICG)。
13.如权利要求1至11中任一项所述的乳液的用途，用于制造一种用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂。
14.用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1至12中任一项所述的乳液、以及包裹在油相液滴中的所关注的药物或物质。
15.用于监测基底媒质中所关注的药物或物质的释放的标记试剂，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1至12中任一项所述的乳液、以及与所述供体荧光标记或所述受体荧光标记相连接的被关注药物或物质。
16.如权利要求1至12中任一项所述的乳液的用途，用于制造用于光学荧光成像的标记试齐Ll。
全文摘要
本发明涉及一种荧光乳液、其用途以及包含其的标记试剂。本发明的荧光乳液是水包油型的，其包含至少一个水连续相，至少一个油相的液滴分散在所述水连续相中，所述液滴通过表面活性剂层来稳定，其特征在于，所述乳液包含至少一对由供体荧光标记和受体标记形成的彼此不同的标记，所述供体荧光标记以波长λ1吸收、以不同于与λ1的波长λ2发射，所述受体标记以供体荧光标记发射的波长λ2吸收；供体荧光标记和受体标记通过如下方式来保持靠近一起将它们中的一个包裹在油相液滴中，并且要么将它们中的另一个与油相液滴/水相界面相连、要么将它们中的另一个包裹在油相液滴中；并且所述乳液包含至少一种两亲表面活性剂分子和至少一种增溶性脂质的分子。本发明的荧光乳液可应用于光学荧光成像领域，特别是可应用于生物光学荧光成像。
文档编号A61K49/00GK102170913SQ200980139595
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月11日 优先权日2008年8月14日
发明者伊莎贝尔·谢克尔-诺盖斯, 法布里斯·纳瓦罗塔·Y·加西亚, 洛朗·居尤, 马蒂厄·古塔耶 申请人:法国原子能与替代能源委员会
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