适用于结核病初级预防的免疫治疗剂的制作方法
专利名称：适用于结核病初级预防的免疫治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于结核分枝杆菌-复合群(Mycobacterium tuberculosis-complex)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。现有技术状态结核病是由结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)引起的慢性感染性疾病，其在现阶段包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌。根据世界卫生组织2008年的报告，每年在全世界范围内记录有9000000例新发病例，约2000000人死亡。认为全世界有2500000000以上的人感染，每年产生超过90-100
百万个新的感染者。目前用于预防治疗结核病的疫苗是基于称为BCG (卡介苗)的菌株，其是牛分枝杆菌的减毒变体。专利申请W0-A-2008/053055披露了包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株的细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备用于预防治疗结核病和预防由结核分枝杆菌引起的感染的药物中的用途。所述免疫治疗剂通常要足够早地在感染前施用。该专利申请还描述了上述免疫治疗剂较现有的基于BCG减毒株的疫苗更为有效。—旦感染开始，现有技术中已公开了不同的治疗以控制感染患者，即潜在结核感染患者中活动性结核的发展。例如，专利申请W0-A-03/004520披露，为在感染人群(包括尚未发展成结核病或已发展成结核病的人)中控制结核病，要在长达数月的时间内施用包括异烟胼在内的多种药物。专利申请ES-A-2231037披露了包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株的细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备和诸如异烟胼和利福平的其他药物联合治疗感染者结核病的药物中用途。所述组合提高了药物的效力，因为其产生了对不在活性代谢期的杆菌的免疫应答，其进一步降低了产生耐药性的风险。由 Unidad de Investigacion en Tuberculosis de Barcelona(UITB)的 Grupo de Estudio de Contactos在Med. Clin. (Bare)，1999，112，151-156发表的题为“Documento de consenso sobre el estudio de Ios contactos en Ios pacientes tuberculosos，，的论文披露了结核病控制程序必须首要保证患者的诊断和早期治疗，保证对治疗的正确依从性，并且当达到适当的依从性比率时，必须进一步研究接触者。与结核病患者有过关系的个体被认为是“接触者”。因此，通过吸入结核分枝杆菌感染的气溶胶的潜在结核感染的传播机制表明，与结核病患者，尤其是肺结核或排菌结核(bacilliferous tuberculosis)患者一起生活或经常在其周围的“接触者”，是必须检查的风险群体。因此，控制结核病患者的“接触者”是获得社区地方病控制的最有效方式之一。该方法可将接触者分为三组
I.已暴露但未感染的个体。结核菌素皮肤测试(TST)是阴性的。该个体属于美国胸科学会(ATQ分类的I组。初级预防试图预防暴露于接触传染物(contagion)的个体感染，并且在很多情况下其帮助避免感染。II.具有潜在结核病感染但未发病的个体。换句话说是ATS分类的II组。其可能是结核菌素反应(TST)的转化者(converter)，具有发病的高风险。次级预防，具体是二级化学预防能显著降低该风险。III.已发病的个体，属于ATS分类的III组，其通常表现疾病的初级形式，因此是几乎或完全不传染的。化学治疗将防止他们成为接触传染源。目前，通常施用于ATS I组的感染初级预防实际上是初级化学预防，其基于以 5mg/kg的量施用异烟胼，不超过300mg/天，每天给药。所述治疗可用于任何年龄的TST阴性，与肺结核患者一起生活或密切接触的个体。此时，初级化学预防必须在暂停接触感染源后或所述感染源停止传染后维持3个月。Generalitat de Catalunya ^t 1983 ^Ξ 胃 @ 的 || ^ "La Tuberculosi a Catalunya :informe"的文章指出初级化学预防是为了保护暴露于接触传染物的未感染个体，其目的是预防“接触者”的感染。所述治疗因此代表真正的感染预防，可以确认其已被公开接受。然而，现有技术中已经公开了基于延长施用异烟胼的初级化学预防产生的副作用。Martinez 等人的文章，Primary prevention and treatment of latent tuberculosis infection with isoniazid :efficacy of a control program,1997-2002, Arch. Bronconeumo 1.，2005，41 (1)27-33公开了与持续初级化学预防有关的肝毒性问题。初级化学预防的另一个缺点是治疗的时间，其可以长达12个月。这表明接受所述治疗的个体依从性程度经常是不令人满意的。因此需要具有更少副作用和更容易依从的结核病初级预防。发明目的本发明的目的是包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。用于结核病初级预防的包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂也是本发明目的的一部分。发明详述专利申请ES2231037-A1披露了一种制备包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的方法。其还披露了含有该治疗剂的组合物及其治疗应用， 用于和其他药物组合治疗结核病。本发明的发明人发现，所述免疫治疗剂适于制备用于结核病初级预防的药物。因此本发明的目的是包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备用于结核病初级预防的药物中的用途，其中所述免疫治疗剂通过包括下列步骤的方法获得-培养MTB-C强毒株3周或以上，随后-在存在非离子表面活性剂的情况下使细胞培养物均质化。用于结核病初级预防的包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂也是本发明目的的一部分，其中所述免疫治疗剂通过包括下列步骤的方法获得-培养MTB-C强毒株3周或以上，随后-在存在非离子表面活性剂的情况下使细胞培养物均质化。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括下列步骤-通过离心分开未碎片化的细胞和溶解的组分，-对细胞壁碎片部分进行化学或物理处理，以灭活其最终含有的可能的强毒株细胞，和-通过冻干法干燥获得的免疫治疗剂。初级免疫本发明中，结核病的初级预防应当理解为在暴露于接触感染物并且结核菌素皮肤测试阴性的个体中预防结核感染的处理。针对结核病的预防性疫苗，或者是基于卡介苗的疫苗，或者是专利申请 W0-A-2008/053055中描述的预防性疫苗，都是足够早地施用于未感染个体以预防结核分枝杆菌引起的感染。本发明的目的是包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途，所述药物施用给通过接触感染个体而处于患上感染的风险并且结核菌素皮肤试验阴性的个体。 所述个体可以接种过或未接种过任何上述疫苗。在所述个体已接种疫苗的情况下，初级预防可作为预防感染的增强剂。强毒株培养本方法中使用MTB-C的强毒株获得免疫治疗剂。所述强毒株可以是MTB-C的任意强毒株。本领域研究人员使用最多的一种菌株称为H37Rv,其，例如，可以从英国伦敦国立标准菌种保藏所(NCTC)自由获取(保藏号为 NC007416)。所述强毒株可通过接种在本领域技术人员公知的培养基中进行培养，所述培养基例如为 Middlebrook 7H10 或 7H11 琼脂，Sauton' s 培养基或 Proskauer-Berck 培养基。
所述强毒株培养3周或以上，优选3-4周之间。培养温度优选维持在34°C至38°C 之间。一旦培养结束，使用诸如专利申请ES-A-2231037中描述的那些技术分离细胞。细胞培养物的均质化将活细胞在存在非离子表面活性剂的情况下进行均质化。均质化过程中使用的非离子表面活性剂种类优选自由乙氧基化烷基酚、乙氧基化山梨坦酯及其混合物组成的组。非离子表面活性剂更优选自乙氧基化辛基酚。更优选使用具有7-8摩尔的环氧乙烷含量的乙氧基化辛基酚，其可由市场获得，商品名为TRIT0N X-114。均质化步骤的非离子表面活性剂优选占均质总重量的_10%，更优选为以重量计3% -6%。所述均质化优选在中性pH缓冲介质中进行，例如在PH6-8进行，例如PBS缓冲液 (磷酸盐缓冲液)。均质化可通过超声处理方式，或通过使用直径约Imm的小珠，例如硅或硅-锆珠的
5方式和机械均质器进行。可使用的机械均质器，例如，可以是Biospec Beadbeater 型号。通过该均质过程破裂MTB-C细胞，获得小细胞壁碎片。细胞壁碎片的分离在一个优选的实施方案中，所述方法包括分离细胞壁碎片的步骤。常规处理含有细胞壁碎片的均质物，分开并除去未碎片化的细胞和溶解成分。可以如专利申请ES-A-2231027中描述的那样，在不同的速率下离心，使用缓冲溶液清洗。完成上述纯化过程后，获得了含有细胞壁碎片的沉淀物，其用于制备适用于初级预防的药物。细胞壁碎片的灭活在一个优选的实施方案中，上述步骤中获得的沉淀物分散于PBS缓冲液中，进行常规处理以保证片段化和纯化过程后仍然存活的MTB-C细胞的完全灭活。灭活处理可以是化学方法，例如用甲醛溶液处理，或物理处理，例如高压灭菌或巴斯德灭菌处理。优选使用巴斯德灭菌处理，温度在60°C至90°C之间，更优选在60°C至70°C之间， 再更优选为约65°C的温度。细胞壁碎片的冻干在一个优选的实施方案中，将灭活处理后获得的PBS缓冲液中的细胞壁碎片分散物(dispersion)冻干以便于保存。为了实现该目的，可以将所述分散物用小瓶分装， 在-15°C至_25°C的温度下，在0. 1-0. 5mbar真空下通过常规方法冻干。冻干过程后的小瓶含有包含MTB-C细胞壁碎片的免疫治疗剂，其通常储存在极低的温度下，例如_70°C。用于结核病初级预防的药物如上文所述，本发明的目的是包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。用于结核病初级预防治疗的药物包含所述基于细胞壁碎片的免疫治疗剂以及任选地，药物学上可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。所述药物可以是磷酸盐缓冲盐水溶液、水溶液、乳剂的形式或也可以是脂质体形式。 所述药物优选为脂质体形式。脂质体可使用常规辅助脂质和本领域技术人员公知的技术形成，例如专利申请 ES-A-2231037 中所述。脂质体通常包括具有中性和/或负净电荷的磷脂，以及固醇。使用的磷脂可以是，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。脂质体的主要成分通常是磷脂酰胆碱，其可以合成或分离自天然来源。通常使用的商品是大豆卵磷脂，其是包括磷脂酰胆碱的磷脂复杂混合物。制备脂质体中所用的固醇可以是，除了别的之外，胆固醇和胆汁酸盐。脂质体优选使用大豆卵磷脂和胆酸钠的混合物形成。任选地，脂质体含有改善其稳定性的赋形剂，例如甘氨酸。获得的脂质体通常具有99%小于1微米的尺寸分布。
脂质体可进行常规冻干，从而获得冻干的脂质体形式的免疫治疗剂。药物施用药物可以以单剂量或以预定的时间间隔重复多剂量的形式施用，所述药物优选以单剂量形式施用。在使用多剂时，优选以1-5周、更优选1-3周、再更优选1-2周的时间间隔施用两个剂量。药物可通过粘膜施用，例如眼、鼻内、口服、胃，肠道、阴道或尿道施用，或通过非肠道途径施用，例如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内途径。优选通过非肠道途径施用。合适的剂量依赖于若干因素，包括施用途径以及所治疗的对象。但所述剂量优选为1 μ g-1000 μ g细胞壁碎片，更优选约5 μ g_700 μ g，再更优选为5 μ g_300 μ g。本发明的免疫治疗剂可以与其他适用于结核病初级预防的药物同时或交替组合施用。所述药物包括异烟胼、利福平或其他结核病治疗剂。在组合施用时，本发明的免疫治疗剂与异烟胼一起施用。令人惊讶地发现，施用包含含有MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的药物作为新近感染的小鼠的结核病初级预防是合适的，因为其在所述小鼠中诱导了比常规BCG疫苗更为有效的保护性应答。该结果令人惊讶之处在于，根据专利申请W0-A-2008/053055中所披露，当作为预防性疫苗足够早地在感染前施用时，常规的BCG疫苗和含有细胞壁碎片的免疫治疗剂具有基本相同的免疫保护行为。但是，本说明书中的实验结果显示了用于结核病初级预防时两种药物间的差异， 所述结核病初级预防是为了防止未感染但已经暴露于接触感染物的个体由于接触引起的感染。正如实施例中所述，四组小鼠用强毒株H37Rv感染。感染后数天，一组施用一个剂量的所述免疫治疗剂，第二组以一周间隔施用两个剂量的相同治疗剂，第三组施用一个剂量的常规BCG疫苗。第四组是对照组，未施用药物。感染后3周，处死动物，测定小鼠肺和脾中存在的存活杆菌的数量。观察到施用所述免疫治疗剂的小鼠肺中的存活杆菌数低于对照小鼠组和接种常规BCG疫苗的小鼠。特别地，施用两个剂量脂质体形式免疫治疗剂的小鼠在所有组中存活杆菌数最低。尽管关于脾的各组小鼠间没有显著的统计学差异，应当指出，脂质体形式免疫治疗剂的施用降低杆菌浓度到这样的程度，即在使用两个剂量的治疗组中，14例中有4例完全根除了杆菌群(CFU = 0)，因此检测到高标准差。因此，使用基于MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的初级预防使个体免于由结核分枝杆菌引起的近期感染，因为其产生了保护性应答，与实际上显示较差效果的常规 BCG疫苗形成对比。提供以下实施例用于向本领域技术人员详细说明本发明的具体实施方案。实施例1-免疫治疗剂作为针对结核分枝杆菌引起的感染的初级预防的效果该实施例中使用的免疫治疗剂根据专利申请ES-A-2231037中实施例2描述的方法制备。在6-8周龄，无特异病原体感染的C57BL/6雌性小鼠中测定基于MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的效果。所述小鼠分成4组，每组14只，采用以下疫苗接种方案1)无接种(对照组)，2)小鼠气溶胶感染后4天使用一个260yg剂量的专利申请ES-A-2231037实施例 2中获得的脂质体形式的细胞壁碎片皮下接种。3)小鼠气溶胶感染后4天和11天使用两个260yg剂量的专利申请ES-A-2231037 实施例2中获得的脂质体形式的细胞壁碎片皮下接种。4)小鼠气溶胶感染后4天使用一个2 X IO6集落形成单位剂量的BCG Danish菌株 (Statens Serum Institute, Denmark)皮下接禾中。在Proskauer-Beck培养基中培养至对数中期的结核分枝杆菌强毒株(H37Rv Pasteur)被用于感染，其在使用前以Iml等分储存在_70°C下。在实验开始时，用所述强毒株气溶胶感染小鼠，其方式是将小鼠放置在 Middlebrook气溶胶感染装置，所述装置向小鼠肺中提供了约10-50存活杆菌的接种物。在动物气溶胶感染后21天(实验第3周)测定肺和脾中存活的杆菌数。37°C下将系列稀释的肺和脾均质物在Middlebrook 7H11琼脂中培养4周。肺和脾在Iml双蒸水存在下均质化。表I的结果为肺中确定的每ml菌落形成单位(CFU)的对数表I
权利要求
1.包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备用于结核病初级预防的药物中的用途，其中所述免疫治疗剂可以通过包含以下步骤的方法获得-培养MTB-C强毒株3周或以上，随后-在存在非离子表面活性剂的情况下使细胞培养物均质化。
2.权利要求1的用途，其特征在于培养时间为3-4周。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于所述非离子表面活性剂选自由乙氧基化烷基酚、 乙氧基化山梨坦酯及其混合物组成的组。
4.权利要求3的用途，其特征在于所述非离子表面活性剂选自乙氧基化辛基酚。
5.权利要求4的用途，其特征在于所述非离子表面活性剂选自具有7-8摩尔的环氧乙烷含量的乙氧基化辛基酚。
6.权利要求1-5任一项的用途，其特征在于所述均质化在中性pH缓冲介质中进行。
7.权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述方法还包括下列步骤 -通过离心分开未片段化的细胞和溶解的组分，-对细胞壁碎片部分进行化学或物理处理，以灭活其最终含有的可能的强毒株细胞，和 -通过冻干法干燥获得的免疫治疗剂。
8.权利要求1-7任一项的用途，其特征在于所述药物是脂质体形式。
9.权利要求1-8任一项的用途，其特征在于所述药物以单剂量或多剂量形式施用。
10.权利要求9的用途，其特征在于所述药物以两个剂量施用。
11.权利要求10的用途，其特征在于所述剂量以1-5周的时间间隔分开施用。
12.权利要求1-11任一项的用途，其特征在于所述药物与其他适用于结核病初级预防的药物组合施用。
13.权利要求12的用途，其特征在于所述药物与异烟胼组合施用。
全文摘要
本发明涉及包含结核分枝杆菌强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。所述免疫治疗剂能够诱导比常规BCG疫苗更有效的保护性应答，减少新近感染结核分枝杆菌的个体肺和脾中存活杆菌的数目。
文档编号A61K39/04GK102264389SQ200980140992
公开日2011年11月30日 申请日期2009年9月3日 优先权日2008年9月19日
发明者I·阿马特列拉, P·J·卡多纳伊格莱西亚斯 申请人:阿尔西维尔法尔玛公司
技术领域：
本发明涉及基于结核分枝杆菌-复合群(Mycobacterium tuberculosis-complex)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。现有技术状态结核病是由结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)引起的慢性感染性疾病，其在现阶段包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌。根据世界卫生组织2008年的报告，每年在全世界范围内记录有9000000例新发病例，约2000000人死亡。认为全世界有2500000000以上的人感染，每年产生超过90-100
百万个新的感染者。目前用于预防治疗结核病的疫苗是基于称为BCG (卡介苗)的菌株，其是牛分枝杆菌的减毒变体。专利申请W0-A-2008/053055披露了包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株的细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备用于预防治疗结核病和预防由结核分枝杆菌引起的感染的药物中的用途。所述免疫治疗剂通常要足够早地在感染前施用。该专利申请还描述了上述免疫治疗剂较现有的基于BCG减毒株的疫苗更为有效。—旦感染开始，现有技术中已公开了不同的治疗以控制感染患者，即潜在结核感染患者中活动性结核的发展。例如，专利申请W0-A-03/004520披露，为在感染人群(包括尚未发展成结核病或已发展成结核病的人)中控制结核病，要在长达数月的时间内施用包括异烟胼在内的多种药物。专利申请ES-A-2231037披露了包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株的细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备和诸如异烟胼和利福平的其他药物联合治疗感染者结核病的药物中用途。所述组合提高了药物的效力，因为其产生了对不在活性代谢期的杆菌的免疫应答，其进一步降低了产生耐药性的风险。由 Unidad de Investigacion en Tuberculosis de Barcelona(UITB)的 Grupo de Estudio de Contactos在Med. Clin. (Bare)，1999，112，151-156发表的题为“Documento de consenso sobre el estudio de Ios contactos en Ios pacientes tuberculosos，，的论文披露了结核病控制程序必须首要保证患者的诊断和早期治疗，保证对治疗的正确依从性，并且当达到适当的依从性比率时，必须进一步研究接触者。与结核病患者有过关系的个体被认为是“接触者”。因此，通过吸入结核分枝杆菌感染的气溶胶的潜在结核感染的传播机制表明，与结核病患者，尤其是肺结核或排菌结核(bacilliferous tuberculosis)患者一起生活或经常在其周围的“接触者”，是必须检查的风险群体。因此，控制结核病患者的“接触者”是获得社区地方病控制的最有效方式之一。该方法可将接触者分为三组
I.已暴露但未感染的个体。结核菌素皮肤测试(TST)是阴性的。该个体属于美国胸科学会(ATQ分类的I组。初级预防试图预防暴露于接触传染物(contagion)的个体感染，并且在很多情况下其帮助避免感染。II.具有潜在结核病感染但未发病的个体。换句话说是ATS分类的II组。其可能是结核菌素反应(TST)的转化者(converter)，具有发病的高风险。次级预防，具体是二级化学预防能显著降低该风险。III.已发病的个体，属于ATS分类的III组，其通常表现疾病的初级形式，因此是几乎或完全不传染的。化学治疗将防止他们成为接触传染源。目前，通常施用于ATS I组的感染初级预防实际上是初级化学预防，其基于以 5mg/kg的量施用异烟胼，不超过300mg/天，每天给药。所述治疗可用于任何年龄的TST阴性，与肺结核患者一起生活或密切接触的个体。此时，初级化学预防必须在暂停接触感染源后或所述感染源停止传染后维持3个月。Generalitat de Catalunya ^t 1983 ^Ξ 胃 @ 的 || ^ "La Tuberculosi a Catalunya :informe"的文章指出初级化学预防是为了保护暴露于接触传染物的未感染个体，其目的是预防“接触者”的感染。所述治疗因此代表真正的感染预防，可以确认其已被公开接受。然而，现有技术中已经公开了基于延长施用异烟胼的初级化学预防产生的副作用。Martinez 等人的文章，Primary prevention and treatment of latent tuberculosis infection with isoniazid :efficacy of a control program,1997-2002, Arch. Bronconeumo 1.，2005，41 (1)27-33公开了与持续初级化学预防有关的肝毒性问题。初级化学预防的另一个缺点是治疗的时间，其可以长达12个月。这表明接受所述治疗的个体依从性程度经常是不令人满意的。因此需要具有更少副作用和更容易依从的结核病初级预防。发明目的本发明的目的是包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。用于结核病初级预防的包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂也是本发明目的的一部分。发明详述专利申请ES2231037-A1披露了一种制备包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的方法。其还披露了含有该治疗剂的组合物及其治疗应用， 用于和其他药物组合治疗结核病。本发明的发明人发现，所述免疫治疗剂适于制备用于结核病初级预防的药物。因此本发明的目的是包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备用于结核病初级预防的药物中的用途，其中所述免疫治疗剂通过包括下列步骤的方法获得-培养MTB-C强毒株3周或以上，随后-在存在非离子表面活性剂的情况下使细胞培养物均质化。用于结核病初级预防的包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂也是本发明目的的一部分，其中所述免疫治疗剂通过包括下列步骤的方法获得-培养MTB-C强毒株3周或以上，随后-在存在非离子表面活性剂的情况下使细胞培养物均质化。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括下列步骤-通过离心分开未碎片化的细胞和溶解的组分，-对细胞壁碎片部分进行化学或物理处理，以灭活其最终含有的可能的强毒株细胞，和-通过冻干法干燥获得的免疫治疗剂。初级免疫本发明中，结核病的初级预防应当理解为在暴露于接触感染物并且结核菌素皮肤测试阴性的个体中预防结核感染的处理。针对结核病的预防性疫苗，或者是基于卡介苗的疫苗，或者是专利申请 W0-A-2008/053055中描述的预防性疫苗，都是足够早地施用于未感染个体以预防结核分枝杆菌引起的感染。本发明的目的是包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途，所述药物施用给通过接触感染个体而处于患上感染的风险并且结核菌素皮肤试验阴性的个体。 所述个体可以接种过或未接种过任何上述疫苗。在所述个体已接种疫苗的情况下，初级预防可作为预防感染的增强剂。强毒株培养本方法中使用MTB-C的强毒株获得免疫治疗剂。所述强毒株可以是MTB-C的任意强毒株。本领域研究人员使用最多的一种菌株称为H37Rv,其，例如，可以从英国伦敦国立标准菌种保藏所(NCTC)自由获取(保藏号为 NC007416)。所述强毒株可通过接种在本领域技术人员公知的培养基中进行培养，所述培养基例如为 Middlebrook 7H10 或 7H11 琼脂，Sauton' s 培养基或 Proskauer-Berck 培养基。
所述强毒株培养3周或以上，优选3-4周之间。培养温度优选维持在34°C至38°C 之间。一旦培养结束，使用诸如专利申请ES-A-2231037中描述的那些技术分离细胞。细胞培养物的均质化将活细胞在存在非离子表面活性剂的情况下进行均质化。均质化过程中使用的非离子表面活性剂种类优选自由乙氧基化烷基酚、乙氧基化山梨坦酯及其混合物组成的组。非离子表面活性剂更优选自乙氧基化辛基酚。更优选使用具有7-8摩尔的环氧乙烷含量的乙氧基化辛基酚，其可由市场获得，商品名为TRIT0N X-114。均质化步骤的非离子表面活性剂优选占均质总重量的_10%，更优选为以重量计3% -6%。所述均质化优选在中性pH缓冲介质中进行，例如在PH6-8进行，例如PBS缓冲液 (磷酸盐缓冲液)。均质化可通过超声处理方式，或通过使用直径约Imm的小珠，例如硅或硅-锆珠的
5方式和机械均质器进行。可使用的机械均质器，例如，可以是Biospec Beadbeater 型号。通过该均质过程破裂MTB-C细胞，获得小细胞壁碎片。细胞壁碎片的分离在一个优选的实施方案中，所述方法包括分离细胞壁碎片的步骤。常规处理含有细胞壁碎片的均质物，分开并除去未碎片化的细胞和溶解成分。可以如专利申请ES-A-2231027中描述的那样，在不同的速率下离心，使用缓冲溶液清洗。完成上述纯化过程后，获得了含有细胞壁碎片的沉淀物，其用于制备适用于初级预防的药物。细胞壁碎片的灭活在一个优选的实施方案中，上述步骤中获得的沉淀物分散于PBS缓冲液中，进行常规处理以保证片段化和纯化过程后仍然存活的MTB-C细胞的完全灭活。灭活处理可以是化学方法，例如用甲醛溶液处理，或物理处理，例如高压灭菌或巴斯德灭菌处理。优选使用巴斯德灭菌处理，温度在60°C至90°C之间，更优选在60°C至70°C之间， 再更优选为约65°C的温度。细胞壁碎片的冻干在一个优选的实施方案中，将灭活处理后获得的PBS缓冲液中的细胞壁碎片分散物(dispersion)冻干以便于保存。为了实现该目的，可以将所述分散物用小瓶分装， 在-15°C至_25°C的温度下，在0. 1-0. 5mbar真空下通过常规方法冻干。冻干过程后的小瓶含有包含MTB-C细胞壁碎片的免疫治疗剂，其通常储存在极低的温度下，例如_70°C。用于结核病初级预防的药物如上文所述，本发明的目的是包含MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。用于结核病初级预防治疗的药物包含所述基于细胞壁碎片的免疫治疗剂以及任选地，药物学上可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。所述药物可以是磷酸盐缓冲盐水溶液、水溶液、乳剂的形式或也可以是脂质体形式。 所述药物优选为脂质体形式。脂质体可使用常规辅助脂质和本领域技术人员公知的技术形成，例如专利申请 ES-A-2231037 中所述。脂质体通常包括具有中性和/或负净电荷的磷脂，以及固醇。使用的磷脂可以是，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。脂质体的主要成分通常是磷脂酰胆碱，其可以合成或分离自天然来源。通常使用的商品是大豆卵磷脂，其是包括磷脂酰胆碱的磷脂复杂混合物。制备脂质体中所用的固醇可以是，除了别的之外，胆固醇和胆汁酸盐。脂质体优选使用大豆卵磷脂和胆酸钠的混合物形成。任选地，脂质体含有改善其稳定性的赋形剂，例如甘氨酸。获得的脂质体通常具有99%小于1微米的尺寸分布。
脂质体可进行常规冻干，从而获得冻干的脂质体形式的免疫治疗剂。药物施用药物可以以单剂量或以预定的时间间隔重复多剂量的形式施用，所述药物优选以单剂量形式施用。在使用多剂时，优选以1-5周、更优选1-3周、再更优选1-2周的时间间隔施用两个剂量。药物可通过粘膜施用，例如眼、鼻内、口服、胃，肠道、阴道或尿道施用，或通过非肠道途径施用，例如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内途径。优选通过非肠道途径施用。合适的剂量依赖于若干因素，包括施用途径以及所治疗的对象。但所述剂量优选为1 μ g-1000 μ g细胞壁碎片，更优选约5 μ g_700 μ g，再更优选为5 μ g_300 μ g。本发明的免疫治疗剂可以与其他适用于结核病初级预防的药物同时或交替组合施用。所述药物包括异烟胼、利福平或其他结核病治疗剂。在组合施用时，本发明的免疫治疗剂与异烟胼一起施用。令人惊讶地发现，施用包含含有MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的药物作为新近感染的小鼠的结核病初级预防是合适的，因为其在所述小鼠中诱导了比常规BCG疫苗更为有效的保护性应答。该结果令人惊讶之处在于，根据专利申请W0-A-2008/053055中所披露，当作为预防性疫苗足够早地在感染前施用时，常规的BCG疫苗和含有细胞壁碎片的免疫治疗剂具有基本相同的免疫保护行为。但是，本说明书中的实验结果显示了用于结核病初级预防时两种药物间的差异， 所述结核病初级预防是为了防止未感染但已经暴露于接触感染物的个体由于接触引起的感染。正如实施例中所述，四组小鼠用强毒株H37Rv感染。感染后数天，一组施用一个剂量的所述免疫治疗剂，第二组以一周间隔施用两个剂量的相同治疗剂，第三组施用一个剂量的常规BCG疫苗。第四组是对照组，未施用药物。感染后3周，处死动物，测定小鼠肺和脾中存在的存活杆菌的数量。观察到施用所述免疫治疗剂的小鼠肺中的存活杆菌数低于对照小鼠组和接种常规BCG疫苗的小鼠。特别地，施用两个剂量脂质体形式免疫治疗剂的小鼠在所有组中存活杆菌数最低。尽管关于脾的各组小鼠间没有显著的统计学差异，应当指出，脂质体形式免疫治疗剂的施用降低杆菌浓度到这样的程度，即在使用两个剂量的治疗组中，14例中有4例完全根除了杆菌群(CFU = 0)，因此检测到高标准差。因此，使用基于MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的初级预防使个体免于由结核分枝杆菌引起的近期感染，因为其产生了保护性应答，与实际上显示较差效果的常规 BCG疫苗形成对比。提供以下实施例用于向本领域技术人员详细说明本发明的具体实施方案。实施例1-免疫治疗剂作为针对结核分枝杆菌引起的感染的初级预防的效果该实施例中使用的免疫治疗剂根据专利申请ES-A-2231037中实施例2描述的方法制备。在6-8周龄，无特异病原体感染的C57BL/6雌性小鼠中测定基于MTB-C强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂的效果。所述小鼠分成4组，每组14只，采用以下疫苗接种方案1)无接种(对照组)，2)小鼠气溶胶感染后4天使用一个260yg剂量的专利申请ES-A-2231037实施例 2中获得的脂质体形式的细胞壁碎片皮下接种。3)小鼠气溶胶感染后4天和11天使用两个260yg剂量的专利申请ES-A-2231037 实施例2中获得的脂质体形式的细胞壁碎片皮下接种。4)小鼠气溶胶感染后4天使用一个2 X IO6集落形成单位剂量的BCG Danish菌株 (Statens Serum Institute, Denmark)皮下接禾中。在Proskauer-Beck培养基中培养至对数中期的结核分枝杆菌强毒株(H37Rv Pasteur)被用于感染，其在使用前以Iml等分储存在_70°C下。在实验开始时，用所述强毒株气溶胶感染小鼠，其方式是将小鼠放置在 Middlebrook气溶胶感染装置，所述装置向小鼠肺中提供了约10-50存活杆菌的接种物。在动物气溶胶感染后21天(实验第3周)测定肺和脾中存活的杆菌数。37°C下将系列稀释的肺和脾均质物在Middlebrook 7H11琼脂中培养4周。肺和脾在Iml双蒸水存在下均质化。表I的结果为肺中确定的每ml菌落形成单位(CFU)的对数表I
权利要求
1.包含结核分枝杆菌-复合群(MTB-C)强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备用于结核病初级预防的药物中的用途，其中所述免疫治疗剂可以通过包含以下步骤的方法获得-培养MTB-C强毒株3周或以上，随后-在存在非离子表面活性剂的情况下使细胞培养物均质化。
2.权利要求1的用途，其特征在于培养时间为3-4周。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于所述非离子表面活性剂选自由乙氧基化烷基酚、 乙氧基化山梨坦酯及其混合物组成的组。
4.权利要求3的用途，其特征在于所述非离子表面活性剂选自乙氧基化辛基酚。
5.权利要求4的用途，其特征在于所述非离子表面活性剂选自具有7-8摩尔的环氧乙烷含量的乙氧基化辛基酚。
6.权利要求1-5任一项的用途，其特征在于所述均质化在中性pH缓冲介质中进行。
7.权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述方法还包括下列步骤 -通过离心分开未片段化的细胞和溶解的组分，-对细胞壁碎片部分进行化学或物理处理，以灭活其最终含有的可能的强毒株细胞，和 -通过冻干法干燥获得的免疫治疗剂。
8.权利要求1-7任一项的用途，其特征在于所述药物是脂质体形式。
9.权利要求1-8任一项的用途，其特征在于所述药物以单剂量或多剂量形式施用。
10.权利要求9的用途，其特征在于所述药物以两个剂量施用。
11.权利要求10的用途，其特征在于所述剂量以1-5周的时间间隔分开施用。
12.权利要求1-11任一项的用途，其特征在于所述药物与其他适用于结核病初级预防的药物组合施用。
13.权利要求12的用途，其特征在于所述药物与异烟胼组合施用。
全文摘要
本发明涉及包含结核分枝杆菌强毒株细胞壁碎片的免疫治疗剂在制备适用于结核病初级预防的药物中的用途。所述免疫治疗剂能够诱导比常规BCG疫苗更有效的保护性应答，减少新近感染结核分枝杆菌的个体肺和脾中存活杆菌的数目。
文档编号A61K39/04GK102264389SQ200980140992
公开日2011年11月30日 申请日期2009年9月3日 优先权日2008年9月19日
发明者I·阿马特列拉, P·J·卡多纳伊格莱西亚斯 申请人:阿尔西维尔法尔玛公司
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