具有无细胞百日咳的联合疫苗的制作方法
专利名称：具有无细胞百日咳的联合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含用于针对疾病例如白喉、破伤风、百日咳和由流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护作用的抗原混合物的联合疫苗。本发明还涉及包含抗原，用于针对由肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。
背景技术：
疫苗的抗原白喉和破伤风抗原白喉和破伤风是分别由白喉棒状杆菌(Cornyebacterium diphtheriae)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起的急性感染。这些细菌的毒素是相应疾病的主要病因。 针对这些细菌提供保护作用的疫苗包含被弱毒化的失去其侵染性的类毒素。毒素使用化学物质例如甲醛或戊二醛进行处理以制造类毒素[白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)]。 一种突变的白喉毒素CRM 197，也用于某些疫苗中。百日咳抗原百日咳病或百日咳由百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起。这是使人虚弱的严重疾病，甚至可能导致死亡。对抗该疾病的最初疫苗是基于用化学物质例如甲醛处理以杀死细胞并使有毒物质失活后的完整细胞。虽然高度有效，这样的称作“全细胞疫苗”的疫苗与包括发热和局部反应的副作用相关。认识到了对更明确定义的疫苗的需要，并且研究者将焦点改变为开发含有较少数量的高度纯化的抗原的疫苗，称作“组分疫苗”。很多与毒力相关的因子，诸如百日咳毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素 (PRN或P69)，菌毛蛋白(FIM1，2和幻，腺苷酸环化酶，脂多糖以及其他外膜蛋白已经被建议包含在“无细胞疫苗”中，所述“无细胞疫苗”与组分疫苗相比更不明确定义。很多工作已经集中于基于PT的疫苗，其仅仅具有部分的保护性。PT/FHA的联合更有效，但是比基于wP的疫苗免疫原性更低。另一种潜在的候选物，PRN或P69被发现使得百日咳疫苗与PT和FHA 联合更有效。某些百日咳疫苗也具有FIM作为第四种成分赋予针对百日咳的免疫原性。脊髓灰质炎抗原有两种不同类型的疫苗可用 活的减毒(弱化)口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)，其由Dr. Albert Sabin在1961 年开发。包含Sabin毒株的OPV通过口服给药。 失活的(杀死的)脊髓灰质炎疫苗(IPV)，其由Dr. Jonas Mlk在1955年开发。 包含Mlk毒株的IPV作为注射剂给药。活的减毒(OPV)和失活的(IPV)脊髓灰质炎疫苗两者在控制世界范围内的脊髓灰质炎疾病中都发挥了效力。脊髓灰质炎疫苗可以包含&ilk或Sabin毒株。Mahoney 1型、 MEF 2型和Saukett 3型是已经在对抗脊髓灰质炎疾病的疫苗中使用的Mlk毒株。Sabin 毒株包括Sabin 1和Sabin 2株。
流感嗜血杆菌(Hib)抗原流感嗜血杆菌是一种革兰氏阴性球杆菌，其是上呼吸道菌群的正常组成部分。B型流感嗜血杆菌(Hib b)在幼儿中是侵入性血液传播感染的主要病因，并且在生命的前两年中是脑膜炎的主要病因。针对流感嗜血杆菌的免疫接种始于1987年在加拿大使用的多糖疫苗[聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP) ]。Hib的聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)荚膜是生物体的主要毒力因子。针对PRP的抗体是血清杀菌活性的首要促成者，并且抗体水平的增加与侵入性疾病的风险降低相关。PRP是不依赖于T-细胞的抗原，因此其具有下列特征a)在小于18个月的婴儿和儿童中诱导不良的抗体应答，b)与使用T-细胞依赖性抗原相比具有可变和较小量的抗体应答，c)产生较高比例的免疫球蛋白M(IgM)，以及d)不能诱导加强应答。最初的只基于PRP组分的疫苗被证明在婴儿中无效。进一步的尝试针对 PRP结合疫苗，其中将PRP与被称为载体蛋白的蛋白质例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM 197相结合。肝炎Ofep)抗原存在各种不同的肝炎病毒毒株。乙型肝炎是由感染人科动物包括人类的肝脏并引起被称为肝炎的炎症的乙肝病毒(HBV)所引起的疾病。其严重性范围从持续数周(急性) 的轻度疾病到严重的能够导致肝脏疾病或肝癌的长期(慢性)疾病。针对该疾病的疫苗包含病毒包膜蛋白，乙肝表面抗原(HBsAg)。FDA批准的含有H印B的疫苗是由Merck生产的 Recombivax HB 禾口 Comvax ，由 GlaxoSmithKline Biologicals 生产的 Engerix—B 禾口 Pediarix 。其他抗原人类所关心的其他抗原包括流感嗜血杆菌(a、C、d、e、f血清型和无包膜的菌株)、 肝炎(A、C、D、E、F和G毒株)、脑膜炎A、B或C、流感、肺炎球菌、链球菌、炭疽、登革热、疟疾、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、BCG、日本脑炎、轮状病毒、天花、黄热病、伤寒、Singles、水痘寸。联合疫苗尽管在疫苗领域进行了几十年的长期研究，但传染病仍然威胁人类。针对各种疾病进行保护的联合疫苗是非常合乎需要的，因为它减少了进行注射次数、降低了给药和生产成本，并且也提高了患者的顺从性。这样的联合疫苗一般更容易被接受。然而，大量记载的抗原竞争现象使多价疫苗的开发变得复杂并受到阻碍。这种现象是指下述观察，即将多种抗原一起给药导致对某些抗原的应答与单独给药时针对这些抗原的免疫应答相比降低。较早的研究聚焦于开发具有针对不同疾病和感染的多价的疫苗。这种熟知的疫苗组合之一是提供针对白喉、破伤风和无细胞百日咳的保护。无细胞百日咳(aP)成分通常含有2种或者所有的3种去毒性的PT (百日咳毒素)，FHA (丝状血细胞凝集素)，PRN或P69 (百日咳杆菌粘附素)。在有些情况下，其他百日咳抗原，诸如菌毛抗原(Fim 1，2或3)也可以存在。Infanrix (GlaxoSmithKline Biologicals), Tripedia 禾口 Daptacel (Sanof i Pasteur)是FDA批准的DTaP联合疫苗。希望向这种联合疫苗添加将针对由肝炎病毒Ofep)、流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)引起的疾病提供保护的其他抗原。还希望将针对其他疾病提供保护的抗原添加到上面所述的联合疫苗中。最近FDA 批准的 GlaxoSmithKline Biologicals 的疫苗 Kinrix 是具有 IPV 连同 DTaP(Infanrix )抗原的联合疫苗。hfanrix-Hib 是由 GlaxoSmithKline Biologicals 提供的另一种联合疫苗，其中DTaP抗原以液体形式存在，并且Hib抗原为冻干的，并且提供在分隔的小管中。GlaxoSmithKline Biologicals 的 Pediarix * hfanrix penta 包含单个小管剂量的联合疫苗，所述疫苗包含DTaP连H印B和IPV成分。Sanofi Pasteur的 Pentacel 是以液体形式的DTaP-IPV提供的5种疫苗成分和干燥形式的Hib成分的联合。 Infanrix hexa 是GlaxoSmithKline Biologicals的6种成分的联合疫苗，其针对诸如白喉，破伤风，百日咳，脊髓灰质炎的疾病，以及由H印B病毒和b型流感嗜血杆菌引起的感染提供保护。甚至在这样的组合中，所有除了 Hib成分外的成分以液体形式存在，Hib成分以冻干形式存在。因此，上述给出的联合疫苗不作为全液体制剂销售，而且也不在单个小管中包含诸如Hib和Hep的抗原连同针对白喉，破伤风，百日咳和脊髓灰质炎提供保护的抗原。美国专利6756040陈述了疫苗成分的简单混合由于抗原性干扰引起多糖成分抗体滴度的降低。美国专利’040涉及用于预防b型流感嗜血杆菌感染的疫苗制剂，其中需要 Hib b偶联物吸附到磷酸铝上从而抑制抗多糖抗体的降低。另外，Hib b抗原是冻干的，在给药前不超过一小时与其他液体形式存在的抗原混合。因此，美国专利’040没有教导以全液体制剂存在并且包含针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗。SmithKline Beecham Biologicals的美国专利6013洸4涉及包含吸附到磷酸铝上的HBsAg(乙型肝炎抗原)的多价疫苗。其中宣称当氢氧化铝吸附的HBsAg用于联合疫苗中时，针对HBsAg成分的免疫应答显著降低引起疫苗接种后不充分的血清型转化。进一步陈述了需要在多价疫苗中避免使用氢氧化铝作为佐剂用于吸附HBsAg。说明书陈述了 Hib b成分可以临时添加在本发明的疫苗中。因此美国专利’264中没有教导以全液体制剂存在并且包含针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗。而且，美国专利’ 264的疫苗具体需要H印B抗原吸附到磷酸铝上而不吸附到氢氧化铝上。Novartis Vaccines and Diagnostics 的 PCT 申请 W02007054820 涉及疫苗组合物，其中D和T抗原特异性吸附到氢氧化铝上，而且Hib b和H印B抗原吸附到磷酸铝上。 然而，该申请没有教导制备全液体稳定的联合疫苗，其中D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上， Hep抗原吸附到氢氧化铝上。Connaught Lab的PCT申请W01998000167A1提供了多价免疫原性组合物，其在宿主中针对由百日咳博德特氏菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、脊髓灰质炎病毒和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病提供保护作用。根据说明书，疫苗的Hib b组分是冻干组分，在与疫苗的其他组分混合之前必须加水重构。因此，在说明书中没有涉及包含所有所述抗原的全液体联合疫苗的教导。冻干、也称为冷冻干燥，是高成本的过程，还引起对蛋白质的强烈胁迫。在疫苗的任何组分被冻干的情况下，在疫苗给药时，需要将冻干物与另一种液体或联合疫苗的液体组分混合。这代表了对从业人员的补充限制，并提供了其不能良好执行的风险。此外它提出了具有多个区室的注射器，其中冻干组分在一个区室中，疫苗的液体组分在另一个区室中。然而，这种可以在疫苗给药时将内含物混合的注射器，在降低生产成本的层面以及由从业人员执行的操作的层面上，表现不令人满意。因此，希望避免该冷冻干燥步骤，并提供所有组分提供在一起并处于全液体形式的联合疫苗。这将便于疫苗的给药、使患者顺从并且也降低生产成本。因此，希望将Hib抗原添加到疫苗的液体组分中并因此获得全液体多价疫苗。Glaxo SmithKline Biologicals 公司的 PCT 申请 W02004110480 涉及包含 Hib b 多糖的疫苗。该申请陈述道，联合疫苗组分的简单混合由于不是所有抗原都能有效混合在一起这一事实而复杂化。它陈述道，在DTP疫苗的氢氧化铝与PRP之间存在干扰。W0，480 中的发明的目的是在即时制备的联合疫苗中将这种干扰降到最低，其中将PRP预先吸附在磷酸铝上。该发明还提供了包含PRP的免疫原性组合物、疫苗和联合疫苗，所述PRP在某种程度上受到保护而免于免疫干扰。发明人发现，通过将聚阴离子聚合物赋形剂与包含PRP 的疫苗掺合在一起，可以实现上述目标。然而，在疫苗剂型中使用聚阴离子聚合物可能不是理想的，因为它可能增加配制疫苗的成本。此外，因为疫苗最终打算用于人类，因此理想情况下它应该具有尽可能最少的组分。使用附加的成分意味着向制剂添加身体可能与之反应并产生抗体的物质。由于与免疫制剂的这些组分接触而产生的这种身体应答，可能是不想要的。Pasteur Merieux Serums的美国专利6333036涉及包含与破伤风变性毒素偶联的 b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖或高分子量聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)以及基于铝的佐剂的疫苗组合物。在该发明中使用的基于铝的佐剂具有低于约7. 2的零电荷点。但是，该专利没有具体教导联合疫苗的制备，所述联合疫苗包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗，其中Hib抗原可以基本上不吸附在任何佐剂上。该专利也没有教导制备全液体的稳定的联合疫苗，所述疫苗包含针对和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原， 其中白喉，破伤风和百日咳抗原吸附到磷酸铝上，肝炎抗原吸附到氢氧化铝上。Sanofi Pasteur MSD的欧洲专利1028750涉及针对由百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、脊髓灰质炎病毒乙型肝炎病毒和流感嗜血杆菌感染引起的疾病提供保护作用的多价疫苗。然而，该专利没有具体教导联合疫苗的制备，所述联合疫苗包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗，其中D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上，Hep抗原未吸附到氢氧化铝上。Aventis Pasteur MSD的Hexavac 是全液体疫苗，被批准用于保护由所述生物体引起的疾病。然而，该疫苗被中止全世界范围的使用，因为鉴于生产过程中疫苗的乙肝病毒成分能够导致针对乙肝病毒的长期保护下降的市场销售以后的问题。尽管对于制造包含各种抗原、能够针对大量疾病提供保护作用的多价疫苗的研究一直在进行，但是它们不致力于提供包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的稳定的联合疫苗的需求，其中 Hib抗原可以基本上不吸附在任何佐剂上。而且，也没有公开稳定的联合疫苗的制备，所述联合疫苗包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原，其中D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上，Hep抗原吸附到氢氧化铝上。关于在用分离的和共给药的联合疫苗和PRP疫苗进行免疫的儿童中针对特定抗原的抗体应答，存在着可用的相反的报告。这种结果可能存在各种原因，包括疫苗在其抗原含量上不一致、制造类毒素的方法、添加佐剂的方法或使用的防腐剂。目前已知并可用的联合疫苗，可能不包含采用适合的免疫原性形式的适合抗原的适合制剂，其在一次注射中就能在易感人群中获得对大量疾病的所需水平的效能和免疫原性。对于针对各种感染提供保护作用并采取液体形式以便提供给药的便捷性和适合的成本效益比的多组分疫苗，存在着需求。提供针对由白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、百日咳博德特氏菌、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒和流感嗜血杆菌以及其他引起的感染所导致的疾病的稳定和有效的多价疫苗，将是合乎需要的。为了使疫苗有效，对于疫苗的每种抗原来说需要满足血清保护作用的标准。为此，需要克服由抗原竞争和干扰所提出的障碍和挑战。本发明通过提供针对多种疾病提供保护的多价疫苗制剂，克服了现有技术的限制并解决了相关问题。发明概述本发明涉及包含针对诸如白喉、破伤风、百日咳的疾病和由流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原混合物。本发明还涉及包含抗原用于针对由肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。本发明还涉及五价疫苗，其中Hib抗原基本上未吸附在任何佐剂上。本发明还涉及全液体稳定的六价疫苗，其中包含对多种疾病提供保护作用的抗原，其中白喉，破伤风和无细胞百日咳抗原吸附在磷酸铝上，肝炎抗原吸附在氢氧化铝上。本发明还涉及联合疫苗，其包含适合于预防、改善和治疗多种疾病状态的多种疫苗组分，其满足每种所述疫苗组分的血清保护作用标准。发明详述本发明涉及全液体的稳定的联合疫苗，其包含适合于预防、改善和治疗多种疾病状态的多种疫苗组分，其满足每种所述疫苗组分的血清保护作用标准。本发明的优点包括能够以安全有效的方式提供针对广范围疾病和感染的保护作用的多价疫苗。本发明的疫苗提供针对各种疾病和感染的免疫原性，并且对疫苗中存在的任何抗原没有任何干扰。因此，单次注射即可提供针对各种疾病和感染的免疫原性，使疫苗的患者顺从性更高。由于单次注射即可提供针对多种感染和疾病的免疫，因此疫苗接种的成本将会降低。本发明的疫苗，在其减少为多种不同疾病和感染而前往预防接种中心的次数以及进行注射的次数的意义上说，将是有益的。本发明的这种特点使其特别是对于需要预防接种以提供针对大量感染和疾病的免疫的较年轻群体来说，更加有用和有利。因此，本发明提供了更易被接受的疫苗。定义当在本文中用于描述本发明的疫苗时，术语“全液体”是指这样的疫苗状态，即其中疫苗的所有组分都处于液体状态，并且疫苗的任何组分都不提供成在将疫苗给药于对象之前必须与疫苗的其他组分混合的冻干或任何其他形式。
当在本文中使用时，术语“载体蛋白”用于描述与疫苗中使用的荚膜多糖(Hib)偶联、以便将T-细胞不依赖性多糖转变成T-细胞依赖性抗原的蛋白质组分。当在本文中使用时，术语“佐剂”用于描述疫苗的非抗原性组分，其通过促进抗原与免疫系统之间的接触，通过影响针对抗原而产生的免疫应答的类型和质量，来增强疫苗抗原的免疫应答。佐剂引起针对抗原的延长的免疫应答，并且也可用于降低某些抗原的毒性或为某些抗原提供溶解性。当在本文中用于描述本发明的疫苗时，术语“稳定的”是指将疫苗在5士3°C下温育至少1、优选12、最优选对个月后，疫苗组合物的每种抗原具有超过设定为正常验收限度的效价/免疫原性。当在本文中用于描述Hib在佐剂上吸附或结合的量时，在表述“Hib基本上不吸附到任何佐剂上”中，术语“基本上”是指Hib在任何佐剂上的吸附小于15%、优选小于10%。 没有对Hib抗原执行任何故意将其吸附到任何佐剂上的步骤；可能发生的吸附的量可能是由于抗原与佐剂之间的接触，而不是有意为之的。当在本文中用于描述本发明的疫苗中存在的每种组分的量时，术语“约”是指存在的所述疫苗组分的量，在量上为该特定组分的宣称量的优选士20%、更优选士 10%、最优选士5%的范围内。当在本文中用于描述本发明疫苗的制备方法过程中混合物的组分搅拌时间时，术语“约”是指在宣称值的优选士20%、更优选士 10%、最优选士5%的范围内。当在本文中用于指称本发明的联合疫苗时，术语“免疫活性”是指疫苗在给药于对象时能够引发针对所述组合的每种抗原的抗体，从而保护接种者抵抗相应的疾病或感染。当在本文中用于指称本发明的联合疫苗的抗原时，术语“结合或吸附”是指抗原与佐剂之间的任何形式的物理结合。本发明的疫苗本发明提供了稳定的联合疫苗组合物，其中疫苗的所有成分都一起以液体形式存在于单个小管中。本发明的一个方面提供了全液体的稳定的五价疫苗，其包含白喉(D)，破伤风 (T)，无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原，其中Hib基本上未吸附在任何佐剂上。本发明另一个方面涉及全液体的稳定的六价疫苗，其包含白喉(D)，破伤风(T)， 无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)，肝炎Ofep)和脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原，其中 D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上而Ifep抗原吸附在氢氧化铝上。本发明还提供了仅仅吸附在磷酸铝上而不吸附在氢氧化铝上的白喉(D)，破伤风 (T)和无细胞百日咳(aP)抗原。 根据本发明的一方面，Hib抗原与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自破伤风类毒素 (TT)、白喉类毒素(DT)、CRM 197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白或其任何等价物，或任何其他已知载体。根据本发明的另一方面，Hib抗原基本上不吸附到任何佐剂上。根据本发明的另一方面，本发明疫苗中的Hib抗原源自于Hib b株的荚膜多糖。一方面，本发明提供了吸附到氢氧化铝上而不吸附在磷酸铝上的Hep抗原。
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另一方面，本发明涉及源自于乙肝病毒表面抗原(HBsAg)JPifep B毒株的表面抗原的Ifep抗原。根据本发明的另一方面，IPV毒株是一种或多种可以选自Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型的Salk毒株，或一种或多种选自Sabin 1型和2型的Sabin毒株。另一方面，本发明提供了在制剂中包含2-苯氧乙醇作为防腐剂的本发明的疫苗。此外，本发明的另一方面涉及制造本发明的联合疫苗的方法。本发明的另一方面涉及本发明的联合疫苗的组成，使得疫苗中存在的每种抗原的量弓I发针对所述抗原的保护性免疫应答。本发明的疫苗的抗原白喉由白喉棒状杆菌、一种革兰氏阳性、不产芽胞的好氧细菌引起。该生物体表达原噬菌体编码的ADP-核糖基化外毒素(“白喉毒素”)，可以对其进行处理(例如使用甲醛)以产生类毒素。该类毒素不再具有毒性，但是仍保留抗原性，并能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。在本发明的疫苗中使用的白喉抗原制备物优选包含白喉类毒素。破伤风由破伤风梭菌、一种革兰氏阳性、形成芽胞的杆菌引起。该生物体表达内肽酶(“破伤风毒素”)，可以对其进行处理以产生不再具有毒性的类毒素。但是它仍保留抗原性，并能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。在本发明的疫苗中使用的破伤风抗原制备物优选包含破伤风类毒素。百日咳病或百日咳由百日咳博德特氏菌引起。无细胞百日咳(aP)抗原可以从任何已知的百日咳博德特氏菌菌株制备。为了本发明的目的，aP抗原可以优选获自百日咳博德特氏菌Tohama菌株。任何合适的介质可用于分离，培养，扩增和发酵培养物。为了本发明的目的，可以使用修饰的Mainer-kholte。本发明的疫苗中使用的无细胞百日咳(aP) 抗原包含至少一种或者多种选自百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)，FIM(菌毛抗原FIM1，2或3)的抗原。然而，根据本发明的优选实施方案，本发明的疫苗中使用的aP抗原制备物包含PT，FHA和PRN(P69)抗原。流感嗜血杆菌是革兰氏阴性球杆菌，其引起侵入性血液传播的感染和脑膜炎。根据本发明的一个实施方案，源自于荚膜多糖的Hib抗原可以偶联或结合到载体蛋白上。用于偶联Hib抗原的载体蛋白可以选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、CRM 197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白或其任何等价物。其他适合的载体蛋白包括但不限于合成的肽、热休克蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自于各种病原体衍生的抗原例如N19的多种人类CD4+T细胞表位的人造蛋白、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、摄铁蛋白、来自艰难梭菌(C. difficile)和无乳链球菌(S. agalactiae)蛋白的毒素A或B。在本发明的疫苗中使用的Hib抗原制备物包含优选与破伤风类毒素偶联或连接的Hib抗原。多糖偶联物可以通过任何已知的连接技术来制备。例如，多糖可以通过硫醚键连接。这种偶联方法依靠使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。因此活化的多糖可以直接或经连接基团与载体蛋白上的氨基连接。偶联物也可以通过直接还原胺化方法来制备。另一种方法包括将溴化氰(CNBr)活化的多糖经己二酸酰胼 (ADH)衍生后通过碳二亚胺缩合与蛋白载体相连。可以使用任何其他已知方法来制备本发明的疫苗中使用的多糖偶联物。
根据本发明的实施方案，Hib抗原基本上不吸附在任何佐剂上；优选情况下，Hib 抗原与佐剂的吸附程度不超过15% ；更优选情况下，Hib抗原与佐剂的吸附程度不超过 10%。根据另一个实施方案，本发明涉及没有进行在任何佐剂上的故意或有意吸附的 Hib抗原。根据本发明的另一个优选实施方案，Hib抗原制备物包含源自于Hib b菌株的荚膜多糖的抗原。肝炎由各种肝炎毒株例如A、B、C、D、E、F或G引起。乙肝病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要因子。HBV病毒粒子包含由外部蛋白质外壳或衣壳包围的内部核心。衣壳的主要组分是被称为HBV表面抗原或更通常称为“HBsAg”的蛋白质。当该抗原给药于接种者时，它刺激抗HBsAg抗体的产生，其针对HBV感染提供保护。根据本发明的一个优选方面， 在本发明的疫苗中使用的肝炎病毒OfeP)抗原制备物包含源自于乙型肝炎毒株表面抗原 (HBsAg)的H印抗原。对于疫苗制造来说，HBsAg的制备可以通过以颗粒形式从慢性乙肝病毒携带者的血浆中纯化，因为在HBV感染期间大量HBsiVg在肝脏中合成并释放到血流中，或者通过使用重组DNA方法表达蛋白。在本发明的疫苗中使用的HBsAg可以任一种方式制备。脊髓灰质炎由脊髓灰质炎病毒引起。本发明的疫苗可以包含脊髓灰质炎病毒的 Sabin (Sabin 1和/或Sabin 2)或Mlk株。根据本发明的一个优选实施方案，本发明的疫苗包含&ilk毒株。存在三种类型的能够引起脊髓灰质炎的&ilk毒株。这三种类型相似并引起一致的症状，但是它们的抗原性非常不同，并且由一种类型引起的感染不能提供保护以对抗其他类型引起的感染。Mlk脊髓灰质炎病毒包括3种毒株——1型(例如Mahoney 株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-I株)和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett株)。 根据本发明的优选实施方案，本发明的疫苗可以包含一种或多种所述&ilk毒株。脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长。Vero细胞系，一种源自于猴肾的连续细胞系，可用于生长脊髓灰质炎病毒。生长后，可以使用已知技术纯化病毒粒子。可以进行病毒的失活。脊髓灰质炎病毒的量典型地用“DU”单位(“D-抗原单位”)表示。在制造本发明的疫苗中使用的IPV抗原制备物，优选被制备成包含在疫苗制造中使用的一种或多种毒株。然后将该批量制备物用于配制本发明的疫苗。疫苗的非抗原性组分除了抗原性组分之外，疫苗可以包含大量非抗原性组分，它们是可药用赋形剂。它们包括但不限于PH调节剂、缓冲剂、佐剂、防腐剂、载体和渗涨度调节剂。佐剂最终制剂的抗原可以吸附或可以不吸附到佐剂上。佐剂的功能是刺激针对疫苗成分的免疫的产生，使疫苗更加有效。佐剂可用于 使抗原与免疫系统接触并影响所产生的免疫的类型以及免疫应答的质量(幅度或持续时间)； 降低某些抗原的毒性；以及 为某些疫苗组分提供溶解性。
研究显示，许多含铝疫苗与不含佐剂的对比疫苗相比，引起更高和更长时间的抗体应答。通常在初始免疫系列而不是使用加强剂的过程中观察到佐剂的益处。基于铝的佐剂是最常用的佐剂。这些佐剂已被FDA批准用于疫苗。存在三种通用类型的含铝佐剂 氢氧化铝 磷酸铝 硫酸钾铝(通常称为“明矾”)本发明的一个实施方案涉及将疫苗的某些抗原吸附到磷酸铝上，并将疫苗的某些抗原吸附到氢氧化铝上。某些抗原可能仅仅吸附在磷酸铝上而不吸附在氢氧化铝上，反之亦然。本发明的某些抗原可能根本不吸附或基本上不吸附到任何佐剂上。佐剂对所述抗原吸附的优选性提供了本发明的疫苗的特征。吸附的优选性在下面的“本发明疫苗的制造方法” 一节中更详细描述。防腐剂疫苗易于被细菌污染。因此，为了避免可能在意外污染事件中掺入而引入疫苗中的有害微生物的潜在的威胁生命的污染，在配制疫苗时可以将防腐剂包含在疫苗的组成中。已经使用的防腐剂包括苯索氯铵(Wiemerol)、乙基汞硫代水杨酸钠、苯酚和2-苯氧乙醇(2-P0E)。乙基汞硫代水杨酸钠是含汞的有机化合物(有机汞化合物)，其已经在许多疫苗中用作防腐剂。有报道述及针对乙基汞硫代水杨酸钠的某些过敏反应，其主要采取迟发型局部超敏反应的形式，包括注射位点处的发红和肿胀。关于孤独症与汞的关联，也存在冲突的报道。2-苯氧乙醇O-P0E)也称为“1-羟基-2-苯氧基乙烷”、“2-羟基乙基苯基醚”、“乙二醇苯基醚”等。2-苯氧乙醇的安全性概况好于汞化合物防腐剂(例如乙基汞硫代水杨酸钠)。因此，在疫苗中需要避免乙基汞硫代水杨酸钠并使用2-苯氧乙醇。因此，本发明的另一个优选实施方案涉及在疫苗组合物中使用2-苯氧乙醇作为防腐剂。根据本发明的另一个优选实施方案，2-苯氧乙醇的浓度为5mg/ml疫苗。渗涨度调节剂为了控制疫苗组合物的渗涨度，优选在疫苗配方中包含渗涨度调节剂。这些调节剂包括但不限于盐类(例如NaCl, MgCl2, KC1、CaC12)、糖类(例如葡萄糖、甘露糖醇、乳糖)、氨基酸(例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸)和多元醇(例如蔗糖、甘油、山梨糖醇)。在更优选实施方案中，在疫苗配方中使用生理盐例如钠盐。最优选情况下将氯化钠(NaCl)包含在本发明的疫苗组合物中。pH调节剂和/或缓冲剂如果需要，本技术领域的专业人员已知的各种pH调节剂可用于调节疫苗组合物的pH，例如氢氧化钠或盐酸。各种缓冲剂例如磷酸钠、磷酸钾和柠檬酸盐缓冲液，可用于疫苗配方中。本发明疫苗的组成本发明疫苗的组合物，使得利用包含在疫苗中的每种抗原的量赋予本发明疫苗以免疫原性。本发明疫苗中每种抗原的量，优选使联合疫苗在给药于对象时，在对象中引发针对组合物的所述抗原的免疫应答。根据本发明的一个实施方案，全液体五价疫苗包含0、1\冲( 1\ 撤冲1^)!1让b和 IPV(Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型)，其中D的存在量约为l_40Lf，T的存在量约为l-25Lf，PT的存在量为每0. 5ml约l_40ug，FHA的存在量为每0. 5ml约l_40ug，PRN的存在量为每0. 5ml约l-15ug, Hib b的存在量为每0. 5ml约l_20ug，并且Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约1-50DU、1-15DU和1-50DU，以形成稳定的、免疫原性的联合疫苗。根据本发明的一个优选实施方案，本发明的全液体五价疫苗包含D、T、aP(PT，FHA， PRN)、Hib b和IPV，其中D的存在量约为25Lf，T的存在量约为IOLf，PT的存在量为每0. 5ml 约25ug，FHA的存在量为每0. 5ml约25ug，PRN的存在量为每0. 5ml约8ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约10ug，并且Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每 0. 5ml约40DU、8DU和32DU，使得所述疫苗给药于对象时是稳定的组合物并且有免疫原性。根据本发明的另一个实施方案，提供了全液体六价疫苗，其包含D、T、aP(PT，FHA， PRN)、Hib b、H印B和IPV (Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型)，其中D的存在量约为 l-40Lf，T的存在量约为l_25Lf，PT的存在量为每0. 5ml约l_40ug，FHA的存在量为每0. 5ml 约l-40ug, PRN的存在量为每0. 5ml约l_15ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约l_20ug，Hep B的存在量为每0. 5ml约l-25ug，并且Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约1-50DU、1-15DU和1-50DU，使得所述联合疫苗给药于对象时是稳定的并且有免疫原性的。根据本发明的另一个优选实施方案，提供了全液体六价疫苗，其包含D、T、aP(PT, FHA, PRN)、Hib b，Hep B和IPV，其中D的存在量约为25Lf，T的存在量约为IOLf，PT的存在量为每0. 5ml约25ug，FHA的存在量为每0. 5ml约25ug，PRN的存在量为每0. 5ml约8ug， Hib b的存在量为每0. 5ml约10ug，H印B的存在量为每0. 5ml约IOug并且Mahoney 1型、 MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约40DU、8DU和32DU。这样的疫苗将是在给药于对象时能够引发针对组合物的所有抗原的保护性免疫应答的稳定的疫苗。本发明还涉及诱导针对选自D、T、P、Hib、Hep或IPV的任何抗原的免疫应答的方法，所述方法包含给药免疫活性量的本发明的疫苗。根据本发明的另一方面，本发明的疫苗中的铝含量(Al+3)优选不超过每0.5ml ang、更优选不超过每0. 5ml lmg、最优选不超过每0. 5ml 0. 6mg。根据本发明的另一方面，本发明的联合疫苗中2-苯氧乙醇的优选量可以为5mg/ ml ο本发明疫苗的制造方法本发明的一个方面涉及本发明疫苗的制造方法。免疫原性组合物中抗原的免疫原性、稳定性和正确形式的维持，可能取决于配制组合物的方式。这可以包括添加抗原的顺序、用于某些抗原的特定佐剂的使用、各种参数包括搅拌、温度和PH的使用。本发明的实施方案之一涉及全液体稳定的五价疫苗的制造方法，所述五价疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、无细胞百日咳(aP)、流感嗜血杆菌(Hib)和IPV抗原，所述制造方法包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)无细胞百日咳(aP)抗
14原，b)将组分I添加到流感嗜血杆菌(Hib)抗原制备物中以获得混合物，c)向脊髓灰质炎(IPV)抗原添加上述混合物前提是Hib基本上未吸附在任何佐剂上。根据本发明的一个优选实施方案，D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上。本发明的一个优选实施方案涉及组分I的制备，所述制备包含下述步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-苯氧乙醇Q-P0E) 转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物在搅拌下转移到所述容器中获得混合物，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中，检查上述混合物的pH并将其调整到 6. 0-7. 0的范围内。本方法还涉及将Hib和IPV抗原与本发明的疫苗的组分I混合，所述混合包括将上述包含D，T和aP抗原的混合物转移到Hib抗原制备物获得另一种混合物，然后将该混合物与IPV抗原制备物混合，检查pH，并将其调整到6. 0-7.0的范围内的步骤。本发明还涉及本发明的另一个优选的实施方案，其提供了全液体稳定的六价疫苗的制造方法，所述六价疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、无细胞百日咳(aP)、流感嗜血杆菌 (Hib)，肝炎病毒和IPV，所述制造方法包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)无细胞百日咳(aP)抗原，b)制备包含肝炎病毒Ofep)抗原的组分II，c)将组分I与II组合以形成混合物，d)向Hib和IPV抗原添加上述混合物，前提是D，T和aP抗原已经吸附在磷酸铝上，并且Ifep抗原吸附在氢氧化铝上。根据本发明的另一个优选方面，组分I的制备包含下述步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-苯氧乙醇Q-P0E) 转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物在搅拌下转移到所述容器中，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中，检查pH并将其调整到6. 0-7. 0的范围内。方法还包含本发明的疫苗的组分II的制备，所述制备包含下列步骤a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，b)将Hep抗原制备物转移到上述容器中，c)在搅拌下添加盐水和2-P0E，检查pH并将其调整到6. 0-7. 0的范围内。方法还包括将本发明的疫苗的组分I与组分II混合，其包含将组分II的内含物转移到组分I以获得混合物的步骤。方法还包含将Hib和IPV抗原与上述获得的混合物混合，其包含将上述混合物与 Hib抗原制备物混合以获得另一种混合物，以及将该混合物与IPV抗原制备物混合，检查pH 并将其调整到6. 0-7.0的范围内。根据本发明的一个优选实施方案，在上述任何步骤中提到的搅拌在25士2°C下以 150rpm进行约30分钟至2小时。
下面的实施例用于进一步说明本发明及其优点。提供下面的具体实施例时应该理解，它们打算用于说明而不是用于限制本发明的范围。实施例I本实施例给出了根据本发明的一种情况的五价疫苗的组成和制造方法A、本发明的五价疫苗的组成如下每0. 5ml疫苗包含下列组分表1:
权利要求
1.全液体稳定的联合疫苗，其包含白喉(D)，破伤风(T)，无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原，其中Hib基本上不吸附到任何佐剂上。
2.权利要求1的疫苗，其中Hib结合到选自如下的载体蛋白上破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM 197和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白或其任何等价物， 或任何其他已知载体。
3.权利要求1的疫苗，其中Hib抗原来源于Hibb毒株的荚膜多糖。
4.权利要求1的疫苗，其中IPV抗原是选自Mahoney1型、MEF 2型和Saukett 3型的 Salk毒株，或选自Sabin 1型或2型的Sabin毒株。
5.权利要求1的疫苗，其中D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上。
6.权利要求1的疫苗，其中aP包含至少一种或者多种来自百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)以及菌毛蛋白(FIM 1，2和3)的抗原。
7.权利要求1 的疫苗，其包含 D, T, aP (PT, FHA, PRN)，Hib b 和 IPV (Mahoney 1 型，MEF 2型和Saukett 3型)，其中D的存在量为约l_40Lf，T的存在量为约l_25Lf，PT的存在量为约l-40ug，FHA的存在量为约l_40ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约l_15ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约l-20ug，以及Mahoneyl型，MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每 0. 5ml 约 1-50DU, 1-15DU 和 1-50DU。
8.权利要求7的疫苗，其包含D，T，aP(PT，FHA, PRN)，Hib b和IPV，其中D的存在量为约25Lf，T的存在量为约IOLf，PT的存在量为约25ug，FHA的存在量为约25ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约8ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约10ug，以及Mahoneyl型，MEF2型以及Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约40DU，8DU和32DU。
9.全液体稳定的联合疫苗，其包含白喉(D)，破伤风(T)，无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)和肝炎病毒Ofep)和脊髓灰质炎病毒(IPV)，其中D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上以及H印抗原吸附在氢氧化铝上。
10.权利要求9的疫苗，其中Hib结合在选自如下的载体蛋白上破伤风类毒素(TT)， 白喉类毒素(DT)，CRM 197以及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白或其任何等价物，或任何其他已知载体。
11.权利要求9的疫苗，其中Hib抗原基本上不吸附在任何佐剂上。
12.权利要求9的疫苗，其中Hib抗原来源于Hibb毒株的荚膜多糖。
13.权利要求9的疫苗，其中Ifep抗原来源于H印B毒株的表面抗原。
14.权利要求9的疫苗，其中IPV抗原为选自Mahoney1型、MEF 2型和Saukett 3型的&ilk毒株，或选自Sabin 1型或2型的Sabin毒株。
15.权利要求9的疫苗，其中aP包含至少一种选自百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)以及菌毛蛋白(FIM 1，2和3)的抗原。
16.权利要求9 的疫苗，其包含 D, T, aP (PT, FHA, PRN)，Hib b, Hep B 和 IPV (Mahoneyl 型，MEF2型和Saukett3型)，其中D的存在量为约l_40Lf，T的存在量为约l_25Lf，PT的存在量为约l_40ug，FHA的存在量为约l_40ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约l_15ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约l-20ug，H印B的存在量为每0. 5ml约l_25ug，以及Mahoneyl型， MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约1-50DU，1-15DU和1-50DU。
17.权利要求16的疫苗，其包含0，1\3 ( 1\ 撤，？1^)，!1让b，H印B和IPV，其中D的存在量为约25Lf，T的存在量为约IOLf，PT的存在量为约25ug，FHA的存在量为约25ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约8ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约IOug以及H印B的存在量为每0. 5ml约10ug，以及Mahoneyl型，MEF2型以及Saukett 3型毒株的存在量分别为每 0. 5ml 约 40DU，8DU 和 32DU。
18.诱导针对选自D，T，aP，Hib，!fep或IPV的任一抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给对象给药免疫活性量的权利要求1或9的联合疫苗。
19.全液体稳定联合疫苗的制造方法，所述方法包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉⑶、ii)破伤风⑴和iii)无细胞百日咳(aP)抗原，b)向流感嗜血杆菌(Hib)抗原制备物添加组分I获得混合物，c)向脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原制备物添加上述混合物，前提是Hib基本上不吸附在任何佐剂上。
20.权利要求19的方法，其中D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上。
21.权利要求19的方法，其中该方法还包含向制剂添加作为防腐剂的2-苯氧乙醇 (2-P0E)的步骤。
22.权利要求19的方法，其中组分I的制备包含下列步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-P0E转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物转移到所述容器中，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中获得混合物，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
23.权利要求22的方法，还包含下列步骤a)将上述混合物转移到Hib抗原制备物中获得另一种混合物，b)将步骤a)中获得的混合物混入IPV抗原制备物，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
24.全液体稳定的联合疫苗的制造方法，其包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉⑶、ii)破伤风⑴和iii)无细胞百日咳(aP)抗原，b)制备包含肝炎病毒(Hep)抗原的组分II，c)将组分I和II组合形成混合物，d)向Hib和IPV抗原制备物添加上述混合物，前提是D，T和aP抗原已经吸附在磷酸铝上，并且H印抗原吸附在氢氧化铝上。
25.权利要求M的方法，其中所述方法还包括向制剂添加作为防腐剂的2-苯氧乙醇 (2-P0E)的步骤。
26.权利要求M的方法，其中组分I的制备还包括下列步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-P0E转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物转移到所述容器中，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
27.权利要求M的方法，其中组分II的制备包括下列步骤a)将氢氧化铝凝胶转移到容器中，b)将Hep抗原制备物转移到上述容器中，c)添加盐水和2-P0E，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
28.权利要求M的方法，其中组分I和II的组合包括将组分II的内含物转移到组分 I获得混合物的步骤。
29.权利要求28的方法，还包括下列步骤a)向Hib抗原制备物转移包含组分I和组分II的混合物获得另一种混合物，检查PH 并将其调整到6. 0-7. 0的范围内，b)向IPV抗原制备物转移步骤a)中获得的混合物。
全文摘要
本发明涉及包含用于针对疾病例如白喉、破伤风、无细胞百日咳和由流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脊髓灰质炎病毒的感染提供保护作用的抗原混合物的联合疫苗。本发明还涉及包含抗原，用于针对由肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。
文档编号A61K39/102GK102196818SQ200980142461
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月24日
发明者拉杰什·贾殷, 拉维特·让比, 苏克吉特·辛格 申请人:万能药生物有限公司
技术领域：
本发明涉及包含用于针对疾病例如白喉、破伤风、百日咳和由流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护作用的抗原混合物的联合疫苗。本发明还涉及包含抗原，用于针对由肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。
背景技术：
疫苗的抗原白喉和破伤风抗原白喉和破伤风是分别由白喉棒状杆菌(Cornyebacterium diphtheriae)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起的急性感染。这些细菌的毒素是相应疾病的主要病因。 针对这些细菌提供保护作用的疫苗包含被弱毒化的失去其侵染性的类毒素。毒素使用化学物质例如甲醛或戊二醛进行处理以制造类毒素[白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)]。 一种突变的白喉毒素CRM 197，也用于某些疫苗中。百日咳抗原百日咳病或百日咳由百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起。这是使人虚弱的严重疾病，甚至可能导致死亡。对抗该疾病的最初疫苗是基于用化学物质例如甲醛处理以杀死细胞并使有毒物质失活后的完整细胞。虽然高度有效，这样的称作“全细胞疫苗”的疫苗与包括发热和局部反应的副作用相关。认识到了对更明确定义的疫苗的需要，并且研究者将焦点改变为开发含有较少数量的高度纯化的抗原的疫苗，称作“组分疫苗”。很多与毒力相关的因子，诸如百日咳毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素 (PRN或P69)，菌毛蛋白(FIM1，2和幻，腺苷酸环化酶，脂多糖以及其他外膜蛋白已经被建议包含在“无细胞疫苗”中，所述“无细胞疫苗”与组分疫苗相比更不明确定义。很多工作已经集中于基于PT的疫苗，其仅仅具有部分的保护性。PT/FHA的联合更有效，但是比基于wP的疫苗免疫原性更低。另一种潜在的候选物，PRN或P69被发现使得百日咳疫苗与PT和FHA 联合更有效。某些百日咳疫苗也具有FIM作为第四种成分赋予针对百日咳的免疫原性。脊髓灰质炎抗原有两种不同类型的疫苗可用 活的减毒(弱化)口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)，其由Dr. Albert Sabin在1961 年开发。包含Sabin毒株的OPV通过口服给药。 失活的(杀死的)脊髓灰质炎疫苗(IPV)，其由Dr. Jonas Mlk在1955年开发。 包含Mlk毒株的IPV作为注射剂给药。活的减毒(OPV)和失活的(IPV)脊髓灰质炎疫苗两者在控制世界范围内的脊髓灰质炎疾病中都发挥了效力。脊髓灰质炎疫苗可以包含&ilk或Sabin毒株。Mahoney 1型、 MEF 2型和Saukett 3型是已经在对抗脊髓灰质炎疾病的疫苗中使用的Mlk毒株。Sabin 毒株包括Sabin 1和Sabin 2株。
流感嗜血杆菌(Hib)抗原流感嗜血杆菌是一种革兰氏阴性球杆菌，其是上呼吸道菌群的正常组成部分。B型流感嗜血杆菌(Hib b)在幼儿中是侵入性血液传播感染的主要病因，并且在生命的前两年中是脑膜炎的主要病因。针对流感嗜血杆菌的免疫接种始于1987年在加拿大使用的多糖疫苗[聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP) ]。Hib的聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)荚膜是生物体的主要毒力因子。针对PRP的抗体是血清杀菌活性的首要促成者，并且抗体水平的增加与侵入性疾病的风险降低相关。PRP是不依赖于T-细胞的抗原，因此其具有下列特征a)在小于18个月的婴儿和儿童中诱导不良的抗体应答，b)与使用T-细胞依赖性抗原相比具有可变和较小量的抗体应答，c)产生较高比例的免疫球蛋白M(IgM)，以及d)不能诱导加强应答。最初的只基于PRP组分的疫苗被证明在婴儿中无效。进一步的尝试针对 PRP结合疫苗，其中将PRP与被称为载体蛋白的蛋白质例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM 197相结合。肝炎Ofep)抗原存在各种不同的肝炎病毒毒株。乙型肝炎是由感染人科动物包括人类的肝脏并引起被称为肝炎的炎症的乙肝病毒(HBV)所引起的疾病。其严重性范围从持续数周(急性) 的轻度疾病到严重的能够导致肝脏疾病或肝癌的长期(慢性)疾病。针对该疾病的疫苗包含病毒包膜蛋白，乙肝表面抗原(HBsAg)。FDA批准的含有H印B的疫苗是由Merck生产的 Recombivax HB 禾口 Comvax ，由 GlaxoSmithKline Biologicals 生产的 Engerix—B 禾口 Pediarix 。其他抗原人类所关心的其他抗原包括流感嗜血杆菌(a、C、d、e、f血清型和无包膜的菌株)、 肝炎(A、C、D、E、F和G毒株)、脑膜炎A、B或C、流感、肺炎球菌、链球菌、炭疽、登革热、疟疾、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、BCG、日本脑炎、轮状病毒、天花、黄热病、伤寒、Singles、水痘寸。联合疫苗尽管在疫苗领域进行了几十年的长期研究，但传染病仍然威胁人类。针对各种疾病进行保护的联合疫苗是非常合乎需要的，因为它减少了进行注射次数、降低了给药和生产成本，并且也提高了患者的顺从性。这样的联合疫苗一般更容易被接受。然而，大量记载的抗原竞争现象使多价疫苗的开发变得复杂并受到阻碍。这种现象是指下述观察，即将多种抗原一起给药导致对某些抗原的应答与单独给药时针对这些抗原的免疫应答相比降低。较早的研究聚焦于开发具有针对不同疾病和感染的多价的疫苗。这种熟知的疫苗组合之一是提供针对白喉、破伤风和无细胞百日咳的保护。无细胞百日咳(aP)成分通常含有2种或者所有的3种去毒性的PT (百日咳毒素)，FHA (丝状血细胞凝集素)，PRN或P69 (百日咳杆菌粘附素)。在有些情况下，其他百日咳抗原，诸如菌毛抗原(Fim 1，2或3)也可以存在。Infanrix (GlaxoSmithKline Biologicals), Tripedia 禾口 Daptacel (Sanof i Pasteur)是FDA批准的DTaP联合疫苗。希望向这种联合疫苗添加将针对由肝炎病毒Ofep)、流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)引起的疾病提供保护的其他抗原。还希望将针对其他疾病提供保护的抗原添加到上面所述的联合疫苗中。最近FDA 批准的 GlaxoSmithKline Biologicals 的疫苗 Kinrix 是具有 IPV 连同 DTaP(Infanrix )抗原的联合疫苗。hfanrix-Hib 是由 GlaxoSmithKline Biologicals 提供的另一种联合疫苗，其中DTaP抗原以液体形式存在，并且Hib抗原为冻干的，并且提供在分隔的小管中。GlaxoSmithKline Biologicals 的 Pediarix * hfanrix penta 包含单个小管剂量的联合疫苗，所述疫苗包含DTaP连H印B和IPV成分。Sanofi Pasteur的 Pentacel 是以液体形式的DTaP-IPV提供的5种疫苗成分和干燥形式的Hib成分的联合。 Infanrix hexa 是GlaxoSmithKline Biologicals的6种成分的联合疫苗，其针对诸如白喉，破伤风，百日咳，脊髓灰质炎的疾病，以及由H印B病毒和b型流感嗜血杆菌引起的感染提供保护。甚至在这样的组合中，所有除了 Hib成分外的成分以液体形式存在，Hib成分以冻干形式存在。因此，上述给出的联合疫苗不作为全液体制剂销售，而且也不在单个小管中包含诸如Hib和Hep的抗原连同针对白喉，破伤风，百日咳和脊髓灰质炎提供保护的抗原。美国专利6756040陈述了疫苗成分的简单混合由于抗原性干扰引起多糖成分抗体滴度的降低。美国专利’040涉及用于预防b型流感嗜血杆菌感染的疫苗制剂，其中需要 Hib b偶联物吸附到磷酸铝上从而抑制抗多糖抗体的降低。另外，Hib b抗原是冻干的，在给药前不超过一小时与其他液体形式存在的抗原混合。因此，美国专利’040没有教导以全液体制剂存在并且包含针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗。SmithKline Beecham Biologicals的美国专利6013洸4涉及包含吸附到磷酸铝上的HBsAg(乙型肝炎抗原)的多价疫苗。其中宣称当氢氧化铝吸附的HBsAg用于联合疫苗中时，针对HBsAg成分的免疫应答显著降低引起疫苗接种后不充分的血清型转化。进一步陈述了需要在多价疫苗中避免使用氢氧化铝作为佐剂用于吸附HBsAg。说明书陈述了 Hib b成分可以临时添加在本发明的疫苗中。因此美国专利’264中没有教导以全液体制剂存在并且包含针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗。而且，美国专利’ 264的疫苗具体需要H印B抗原吸附到磷酸铝上而不吸附到氢氧化铝上。Novartis Vaccines and Diagnostics 的 PCT 申请 W02007054820 涉及疫苗组合物，其中D和T抗原特异性吸附到氢氧化铝上，而且Hib b和H印B抗原吸附到磷酸铝上。 然而，该申请没有教导制备全液体稳定的联合疫苗，其中D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上， Hep抗原吸附到氢氧化铝上。Connaught Lab的PCT申请W01998000167A1提供了多价免疫原性组合物，其在宿主中针对由百日咳博德特氏菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、脊髓灰质炎病毒和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病提供保护作用。根据说明书，疫苗的Hib b组分是冻干组分，在与疫苗的其他组分混合之前必须加水重构。因此，在说明书中没有涉及包含所有所述抗原的全液体联合疫苗的教导。冻干、也称为冷冻干燥，是高成本的过程，还引起对蛋白质的强烈胁迫。在疫苗的任何组分被冻干的情况下，在疫苗给药时，需要将冻干物与另一种液体或联合疫苗的液体组分混合。这代表了对从业人员的补充限制，并提供了其不能良好执行的风险。此外它提出了具有多个区室的注射器，其中冻干组分在一个区室中，疫苗的液体组分在另一个区室中。然而，这种可以在疫苗给药时将内含物混合的注射器，在降低生产成本的层面以及由从业人员执行的操作的层面上，表现不令人满意。因此，希望避免该冷冻干燥步骤，并提供所有组分提供在一起并处于全液体形式的联合疫苗。这将便于疫苗的给药、使患者顺从并且也降低生产成本。因此，希望将Hib抗原添加到疫苗的液体组分中并因此获得全液体多价疫苗。Glaxo SmithKline Biologicals 公司的 PCT 申请 W02004110480 涉及包含 Hib b 多糖的疫苗。该申请陈述道，联合疫苗组分的简单混合由于不是所有抗原都能有效混合在一起这一事实而复杂化。它陈述道，在DTP疫苗的氢氧化铝与PRP之间存在干扰。W0，480 中的发明的目的是在即时制备的联合疫苗中将这种干扰降到最低，其中将PRP预先吸附在磷酸铝上。该发明还提供了包含PRP的免疫原性组合物、疫苗和联合疫苗，所述PRP在某种程度上受到保护而免于免疫干扰。发明人发现，通过将聚阴离子聚合物赋形剂与包含PRP 的疫苗掺合在一起，可以实现上述目标。然而，在疫苗剂型中使用聚阴离子聚合物可能不是理想的，因为它可能增加配制疫苗的成本。此外，因为疫苗最终打算用于人类，因此理想情况下它应该具有尽可能最少的组分。使用附加的成分意味着向制剂添加身体可能与之反应并产生抗体的物质。由于与免疫制剂的这些组分接触而产生的这种身体应答，可能是不想要的。Pasteur Merieux Serums的美国专利6333036涉及包含与破伤风变性毒素偶联的 b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖或高分子量聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)以及基于铝的佐剂的疫苗组合物。在该发明中使用的基于铝的佐剂具有低于约7. 2的零电荷点。但是，该专利没有具体教导联合疫苗的制备，所述联合疫苗包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗，其中Hib抗原可以基本上不吸附在任何佐剂上。该专利也没有教导制备全液体的稳定的联合疫苗，所述疫苗包含针对和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原， 其中白喉，破伤风和百日咳抗原吸附到磷酸铝上，肝炎抗原吸附到氢氧化铝上。Sanofi Pasteur MSD的欧洲专利1028750涉及针对由百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、脊髓灰质炎病毒乙型肝炎病毒和流感嗜血杆菌感染引起的疾病提供保护作用的多价疫苗。然而，该专利没有具体教导联合疫苗的制备，所述联合疫苗包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的联合疫苗，其中D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上，Hep抗原未吸附到氢氧化铝上。Aventis Pasteur MSD的Hexavac 是全液体疫苗，被批准用于保护由所述生物体引起的疾病。然而，该疫苗被中止全世界范围的使用，因为鉴于生产过程中疫苗的乙肝病毒成分能够导致针对乙肝病毒的长期保护下降的市场销售以后的问题。尽管对于制造包含各种抗原、能够针对大量疾病提供保护作用的多价疫苗的研究一直在进行，但是它们不致力于提供包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原的稳定的联合疫苗的需求，其中 Hib抗原可以基本上不吸附在任何佐剂上。而且，也没有公开稳定的联合疫苗的制备，所述联合疫苗包含全液体形式的针对白喉，破伤风，百日咳和由流感嗜血杆菌，肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原，其中D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上，Hep抗原吸附到氢氧化铝上。关于在用分离的和共给药的联合疫苗和PRP疫苗进行免疫的儿童中针对特定抗原的抗体应答，存在着可用的相反的报告。这种结果可能存在各种原因，包括疫苗在其抗原含量上不一致、制造类毒素的方法、添加佐剂的方法或使用的防腐剂。目前已知并可用的联合疫苗，可能不包含采用适合的免疫原性形式的适合抗原的适合制剂，其在一次注射中就能在易感人群中获得对大量疾病的所需水平的效能和免疫原性。对于针对各种感染提供保护作用并采取液体形式以便提供给药的便捷性和适合的成本效益比的多组分疫苗，存在着需求。提供针对由白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、百日咳博德特氏菌、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒和流感嗜血杆菌以及其他引起的感染所导致的疾病的稳定和有效的多价疫苗，将是合乎需要的。为了使疫苗有效，对于疫苗的每种抗原来说需要满足血清保护作用的标准。为此，需要克服由抗原竞争和干扰所提出的障碍和挑战。本发明通过提供针对多种疾病提供保护的多价疫苗制剂，克服了现有技术的限制并解决了相关问题。发明概述本发明涉及包含针对诸如白喉、破伤风、百日咳的疾病和由流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒引起的感染提供保护的抗原混合物。本发明还涉及包含抗原用于针对由肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。本发明还涉及五价疫苗，其中Hib抗原基本上未吸附在任何佐剂上。本发明还涉及全液体稳定的六价疫苗，其中包含对多种疾病提供保护作用的抗原，其中白喉，破伤风和无细胞百日咳抗原吸附在磷酸铝上，肝炎抗原吸附在氢氧化铝上。本发明还涉及联合疫苗，其包含适合于预防、改善和治疗多种疾病状态的多种疫苗组分，其满足每种所述疫苗组分的血清保护作用标准。发明详述本发明涉及全液体的稳定的联合疫苗，其包含适合于预防、改善和治疗多种疾病状态的多种疫苗组分，其满足每种所述疫苗组分的血清保护作用标准。本发明的优点包括能够以安全有效的方式提供针对广范围疾病和感染的保护作用的多价疫苗。本发明的疫苗提供针对各种疾病和感染的免疫原性，并且对疫苗中存在的任何抗原没有任何干扰。因此，单次注射即可提供针对各种疾病和感染的免疫原性，使疫苗的患者顺从性更高。由于单次注射即可提供针对多种感染和疾病的免疫，因此疫苗接种的成本将会降低。本发明的疫苗，在其减少为多种不同疾病和感染而前往预防接种中心的次数以及进行注射的次数的意义上说，将是有益的。本发明的这种特点使其特别是对于需要预防接种以提供针对大量感染和疾病的免疫的较年轻群体来说，更加有用和有利。因此，本发明提供了更易被接受的疫苗。定义当在本文中用于描述本发明的疫苗时，术语“全液体”是指这样的疫苗状态，即其中疫苗的所有组分都处于液体状态，并且疫苗的任何组分都不提供成在将疫苗给药于对象之前必须与疫苗的其他组分混合的冻干或任何其他形式。
当在本文中使用时，术语“载体蛋白”用于描述与疫苗中使用的荚膜多糖(Hib)偶联、以便将T-细胞不依赖性多糖转变成T-细胞依赖性抗原的蛋白质组分。当在本文中使用时，术语“佐剂”用于描述疫苗的非抗原性组分，其通过促进抗原与免疫系统之间的接触，通过影响针对抗原而产生的免疫应答的类型和质量，来增强疫苗抗原的免疫应答。佐剂引起针对抗原的延长的免疫应答，并且也可用于降低某些抗原的毒性或为某些抗原提供溶解性。当在本文中用于描述本发明的疫苗时，术语“稳定的”是指将疫苗在5士3°C下温育至少1、优选12、最优选对个月后，疫苗组合物的每种抗原具有超过设定为正常验收限度的效价/免疫原性。当在本文中用于描述Hib在佐剂上吸附或结合的量时，在表述“Hib基本上不吸附到任何佐剂上”中，术语“基本上”是指Hib在任何佐剂上的吸附小于15%、优选小于10%。 没有对Hib抗原执行任何故意将其吸附到任何佐剂上的步骤；可能发生的吸附的量可能是由于抗原与佐剂之间的接触，而不是有意为之的。当在本文中用于描述本发明的疫苗中存在的每种组分的量时，术语“约”是指存在的所述疫苗组分的量，在量上为该特定组分的宣称量的优选士20%、更优选士 10%、最优选士5%的范围内。当在本文中用于描述本发明疫苗的制备方法过程中混合物的组分搅拌时间时，术语“约”是指在宣称值的优选士20%、更优选士 10%、最优选士5%的范围内。当在本文中用于指称本发明的联合疫苗时，术语“免疫活性”是指疫苗在给药于对象时能够引发针对所述组合的每种抗原的抗体，从而保护接种者抵抗相应的疾病或感染。当在本文中用于指称本发明的联合疫苗的抗原时，术语“结合或吸附”是指抗原与佐剂之间的任何形式的物理结合。本发明的疫苗本发明提供了稳定的联合疫苗组合物，其中疫苗的所有成分都一起以液体形式存在于单个小管中。本发明的一个方面提供了全液体的稳定的五价疫苗，其包含白喉(D)，破伤风 (T)，无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原，其中Hib基本上未吸附在任何佐剂上。本发明另一个方面涉及全液体的稳定的六价疫苗，其包含白喉(D)，破伤风(T)， 无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)，肝炎Ofep)和脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原，其中 D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上而Ifep抗原吸附在氢氧化铝上。本发明还提供了仅仅吸附在磷酸铝上而不吸附在氢氧化铝上的白喉(D)，破伤风 (T)和无细胞百日咳(aP)抗原。 根据本发明的一方面，Hib抗原与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自破伤风类毒素 (TT)、白喉类毒素(DT)、CRM 197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白或其任何等价物，或任何其他已知载体。根据本发明的另一方面，Hib抗原基本上不吸附到任何佐剂上。根据本发明的另一方面，本发明疫苗中的Hib抗原源自于Hib b株的荚膜多糖。一方面，本发明提供了吸附到氢氧化铝上而不吸附在磷酸铝上的Hep抗原。
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另一方面，本发明涉及源自于乙肝病毒表面抗原(HBsAg)JPifep B毒株的表面抗原的Ifep抗原。根据本发明的另一方面，IPV毒株是一种或多种可以选自Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型的Salk毒株，或一种或多种选自Sabin 1型和2型的Sabin毒株。另一方面，本发明提供了在制剂中包含2-苯氧乙醇作为防腐剂的本发明的疫苗。此外，本发明的另一方面涉及制造本发明的联合疫苗的方法。本发明的另一方面涉及本发明的联合疫苗的组成，使得疫苗中存在的每种抗原的量弓I发针对所述抗原的保护性免疫应答。本发明的疫苗的抗原白喉由白喉棒状杆菌、一种革兰氏阳性、不产芽胞的好氧细菌引起。该生物体表达原噬菌体编码的ADP-核糖基化外毒素(“白喉毒素”)，可以对其进行处理(例如使用甲醛)以产生类毒素。该类毒素不再具有毒性，但是仍保留抗原性，并能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。在本发明的疫苗中使用的白喉抗原制备物优选包含白喉类毒素。破伤风由破伤风梭菌、一种革兰氏阳性、形成芽胞的杆菌引起。该生物体表达内肽酶(“破伤风毒素”)，可以对其进行处理以产生不再具有毒性的类毒素。但是它仍保留抗原性，并能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。在本发明的疫苗中使用的破伤风抗原制备物优选包含破伤风类毒素。百日咳病或百日咳由百日咳博德特氏菌引起。无细胞百日咳(aP)抗原可以从任何已知的百日咳博德特氏菌菌株制备。为了本发明的目的，aP抗原可以优选获自百日咳博德特氏菌Tohama菌株。任何合适的介质可用于分离，培养，扩增和发酵培养物。为了本发明的目的，可以使用修饰的Mainer-kholte。本发明的疫苗中使用的无细胞百日咳(aP) 抗原包含至少一种或者多种选自百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)，FIM(菌毛抗原FIM1，2或3)的抗原。然而，根据本发明的优选实施方案，本发明的疫苗中使用的aP抗原制备物包含PT，FHA和PRN(P69)抗原。流感嗜血杆菌是革兰氏阴性球杆菌，其引起侵入性血液传播的感染和脑膜炎。根据本发明的一个实施方案，源自于荚膜多糖的Hib抗原可以偶联或结合到载体蛋白上。用于偶联Hib抗原的载体蛋白可以选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、CRM 197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白或其任何等价物。其他适合的载体蛋白包括但不限于合成的肽、热休克蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自于各种病原体衍生的抗原例如N19的多种人类CD4+T细胞表位的人造蛋白、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、摄铁蛋白、来自艰难梭菌(C. difficile)和无乳链球菌(S. agalactiae)蛋白的毒素A或B。在本发明的疫苗中使用的Hib抗原制备物包含优选与破伤风类毒素偶联或连接的Hib抗原。多糖偶联物可以通过任何已知的连接技术来制备。例如，多糖可以通过硫醚键连接。这种偶联方法依靠使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。因此活化的多糖可以直接或经连接基团与载体蛋白上的氨基连接。偶联物也可以通过直接还原胺化方法来制备。另一种方法包括将溴化氰(CNBr)活化的多糖经己二酸酰胼 (ADH)衍生后通过碳二亚胺缩合与蛋白载体相连。可以使用任何其他已知方法来制备本发明的疫苗中使用的多糖偶联物。
根据本发明的实施方案，Hib抗原基本上不吸附在任何佐剂上；优选情况下，Hib 抗原与佐剂的吸附程度不超过15% ；更优选情况下，Hib抗原与佐剂的吸附程度不超过 10%。根据另一个实施方案，本发明涉及没有进行在任何佐剂上的故意或有意吸附的 Hib抗原。根据本发明的另一个优选实施方案，Hib抗原制备物包含源自于Hib b菌株的荚膜多糖的抗原。肝炎由各种肝炎毒株例如A、B、C、D、E、F或G引起。乙肝病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要因子。HBV病毒粒子包含由外部蛋白质外壳或衣壳包围的内部核心。衣壳的主要组分是被称为HBV表面抗原或更通常称为“HBsAg”的蛋白质。当该抗原给药于接种者时，它刺激抗HBsAg抗体的产生，其针对HBV感染提供保护。根据本发明的一个优选方面， 在本发明的疫苗中使用的肝炎病毒OfeP)抗原制备物包含源自于乙型肝炎毒株表面抗原 (HBsAg)的H印抗原。对于疫苗制造来说，HBsAg的制备可以通过以颗粒形式从慢性乙肝病毒携带者的血浆中纯化，因为在HBV感染期间大量HBsiVg在肝脏中合成并释放到血流中，或者通过使用重组DNA方法表达蛋白。在本发明的疫苗中使用的HBsAg可以任一种方式制备。脊髓灰质炎由脊髓灰质炎病毒引起。本发明的疫苗可以包含脊髓灰质炎病毒的 Sabin (Sabin 1和/或Sabin 2)或Mlk株。根据本发明的一个优选实施方案，本发明的疫苗包含&ilk毒株。存在三种类型的能够引起脊髓灰质炎的&ilk毒株。这三种类型相似并引起一致的症状，但是它们的抗原性非常不同，并且由一种类型引起的感染不能提供保护以对抗其他类型引起的感染。Mlk脊髓灰质炎病毒包括3种毒株——1型(例如Mahoney 株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-I株)和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett株)。 根据本发明的优选实施方案，本发明的疫苗可以包含一种或多种所述&ilk毒株。脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长。Vero细胞系，一种源自于猴肾的连续细胞系，可用于生长脊髓灰质炎病毒。生长后，可以使用已知技术纯化病毒粒子。可以进行病毒的失活。脊髓灰质炎病毒的量典型地用“DU”单位(“D-抗原单位”)表示。在制造本发明的疫苗中使用的IPV抗原制备物，优选被制备成包含在疫苗制造中使用的一种或多种毒株。然后将该批量制备物用于配制本发明的疫苗。疫苗的非抗原性组分除了抗原性组分之外，疫苗可以包含大量非抗原性组分，它们是可药用赋形剂。它们包括但不限于PH调节剂、缓冲剂、佐剂、防腐剂、载体和渗涨度调节剂。佐剂最终制剂的抗原可以吸附或可以不吸附到佐剂上。佐剂的功能是刺激针对疫苗成分的免疫的产生，使疫苗更加有效。佐剂可用于 使抗原与免疫系统接触并影响所产生的免疫的类型以及免疫应答的质量(幅度或持续时间)； 降低某些抗原的毒性；以及 为某些疫苗组分提供溶解性。
研究显示，许多含铝疫苗与不含佐剂的对比疫苗相比，引起更高和更长时间的抗体应答。通常在初始免疫系列而不是使用加强剂的过程中观察到佐剂的益处。基于铝的佐剂是最常用的佐剂。这些佐剂已被FDA批准用于疫苗。存在三种通用类型的含铝佐剂 氢氧化铝 磷酸铝 硫酸钾铝(通常称为“明矾”)本发明的一个实施方案涉及将疫苗的某些抗原吸附到磷酸铝上，并将疫苗的某些抗原吸附到氢氧化铝上。某些抗原可能仅仅吸附在磷酸铝上而不吸附在氢氧化铝上，反之亦然。本发明的某些抗原可能根本不吸附或基本上不吸附到任何佐剂上。佐剂对所述抗原吸附的优选性提供了本发明的疫苗的特征。吸附的优选性在下面的“本发明疫苗的制造方法” 一节中更详细描述。防腐剂疫苗易于被细菌污染。因此，为了避免可能在意外污染事件中掺入而引入疫苗中的有害微生物的潜在的威胁生命的污染，在配制疫苗时可以将防腐剂包含在疫苗的组成中。已经使用的防腐剂包括苯索氯铵(Wiemerol)、乙基汞硫代水杨酸钠、苯酚和2-苯氧乙醇(2-P0E)。乙基汞硫代水杨酸钠是含汞的有机化合物(有机汞化合物)，其已经在许多疫苗中用作防腐剂。有报道述及针对乙基汞硫代水杨酸钠的某些过敏反应，其主要采取迟发型局部超敏反应的形式，包括注射位点处的发红和肿胀。关于孤独症与汞的关联，也存在冲突的报道。2-苯氧乙醇O-P0E)也称为“1-羟基-2-苯氧基乙烷”、“2-羟基乙基苯基醚”、“乙二醇苯基醚”等。2-苯氧乙醇的安全性概况好于汞化合物防腐剂(例如乙基汞硫代水杨酸钠)。因此，在疫苗中需要避免乙基汞硫代水杨酸钠并使用2-苯氧乙醇。因此，本发明的另一个优选实施方案涉及在疫苗组合物中使用2-苯氧乙醇作为防腐剂。根据本发明的另一个优选实施方案，2-苯氧乙醇的浓度为5mg/ml疫苗。渗涨度调节剂为了控制疫苗组合物的渗涨度，优选在疫苗配方中包含渗涨度调节剂。这些调节剂包括但不限于盐类(例如NaCl, MgCl2, KC1、CaC12)、糖类(例如葡萄糖、甘露糖醇、乳糖)、氨基酸(例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸)和多元醇(例如蔗糖、甘油、山梨糖醇)。在更优选实施方案中，在疫苗配方中使用生理盐例如钠盐。最优选情况下将氯化钠(NaCl)包含在本发明的疫苗组合物中。pH调节剂和/或缓冲剂如果需要，本技术领域的专业人员已知的各种pH调节剂可用于调节疫苗组合物的pH，例如氢氧化钠或盐酸。各种缓冲剂例如磷酸钠、磷酸钾和柠檬酸盐缓冲液，可用于疫苗配方中。本发明疫苗的组成本发明疫苗的组合物，使得利用包含在疫苗中的每种抗原的量赋予本发明疫苗以免疫原性。本发明疫苗中每种抗原的量，优选使联合疫苗在给药于对象时，在对象中引发针对组合物的所述抗原的免疫应答。根据本发明的一个实施方案，全液体五价疫苗包含0、1\冲( 1\ 撤冲1^)!1让b和 IPV(Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型)，其中D的存在量约为l_40Lf，T的存在量约为l-25Lf，PT的存在量为每0. 5ml约l_40ug，FHA的存在量为每0. 5ml约l_40ug，PRN的存在量为每0. 5ml约l-15ug, Hib b的存在量为每0. 5ml约l_20ug，并且Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约1-50DU、1-15DU和1-50DU，以形成稳定的、免疫原性的联合疫苗。根据本发明的一个优选实施方案，本发明的全液体五价疫苗包含D、T、aP(PT，FHA， PRN)、Hib b和IPV，其中D的存在量约为25Lf，T的存在量约为IOLf，PT的存在量为每0. 5ml 约25ug，FHA的存在量为每0. 5ml约25ug，PRN的存在量为每0. 5ml约8ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约10ug，并且Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每 0. 5ml约40DU、8DU和32DU，使得所述疫苗给药于对象时是稳定的组合物并且有免疫原性。根据本发明的另一个实施方案，提供了全液体六价疫苗，其包含D、T、aP(PT，FHA， PRN)、Hib b、H印B和IPV (Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型)，其中D的存在量约为 l-40Lf，T的存在量约为l_25Lf，PT的存在量为每0. 5ml约l_40ug，FHA的存在量为每0. 5ml 约l-40ug, PRN的存在量为每0. 5ml约l_15ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约l_20ug，Hep B的存在量为每0. 5ml约l-25ug，并且Mahoney 1型、MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约1-50DU、1-15DU和1-50DU，使得所述联合疫苗给药于对象时是稳定的并且有免疫原性的。根据本发明的另一个优选实施方案，提供了全液体六价疫苗，其包含D、T、aP(PT, FHA, PRN)、Hib b，Hep B和IPV，其中D的存在量约为25Lf，T的存在量约为IOLf，PT的存在量为每0. 5ml约25ug，FHA的存在量为每0. 5ml约25ug，PRN的存在量为每0. 5ml约8ug， Hib b的存在量为每0. 5ml约10ug，H印B的存在量为每0. 5ml约IOug并且Mahoney 1型、 MEF 2型和Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约40DU、8DU和32DU。这样的疫苗将是在给药于对象时能够引发针对组合物的所有抗原的保护性免疫应答的稳定的疫苗。本发明还涉及诱导针对选自D、T、P、Hib、Hep或IPV的任何抗原的免疫应答的方法，所述方法包含给药免疫活性量的本发明的疫苗。根据本发明的另一方面，本发明的疫苗中的铝含量(Al+3)优选不超过每0.5ml ang、更优选不超过每0. 5ml lmg、最优选不超过每0. 5ml 0. 6mg。根据本发明的另一方面，本发明的联合疫苗中2-苯氧乙醇的优选量可以为5mg/ ml ο本发明疫苗的制造方法本发明的一个方面涉及本发明疫苗的制造方法。免疫原性组合物中抗原的免疫原性、稳定性和正确形式的维持，可能取决于配制组合物的方式。这可以包括添加抗原的顺序、用于某些抗原的特定佐剂的使用、各种参数包括搅拌、温度和PH的使用。本发明的实施方案之一涉及全液体稳定的五价疫苗的制造方法，所述五价疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、无细胞百日咳(aP)、流感嗜血杆菌(Hib)和IPV抗原，所述制造方法包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)无细胞百日咳(aP)抗
14原，b)将组分I添加到流感嗜血杆菌(Hib)抗原制备物中以获得混合物，c)向脊髓灰质炎(IPV)抗原添加上述混合物前提是Hib基本上未吸附在任何佐剂上。根据本发明的一个优选实施方案，D，T和aP抗原吸附到磷酸铝上。本发明的一个优选实施方案涉及组分I的制备，所述制备包含下述步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-苯氧乙醇Q-P0E) 转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物在搅拌下转移到所述容器中获得混合物，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中，检查上述混合物的pH并将其调整到 6. 0-7. 0的范围内。本方法还涉及将Hib和IPV抗原与本发明的疫苗的组分I混合，所述混合包括将上述包含D，T和aP抗原的混合物转移到Hib抗原制备物获得另一种混合物，然后将该混合物与IPV抗原制备物混合，检查pH，并将其调整到6. 0-7.0的范围内的步骤。本发明还涉及本发明的另一个优选的实施方案，其提供了全液体稳定的六价疫苗的制造方法，所述六价疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、无细胞百日咳(aP)、流感嗜血杆菌 (Hib)，肝炎病毒和IPV，所述制造方法包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)无细胞百日咳(aP)抗原，b)制备包含肝炎病毒Ofep)抗原的组分II，c)将组分I与II组合以形成混合物，d)向Hib和IPV抗原添加上述混合物，前提是D，T和aP抗原已经吸附在磷酸铝上，并且Ifep抗原吸附在氢氧化铝上。根据本发明的另一个优选方面，组分I的制备包含下述步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-苯氧乙醇Q-P0E) 转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物在搅拌下转移到所述容器中，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中，检查pH并将其调整到6. 0-7. 0的范围内。方法还包含本发明的疫苗的组分II的制备，所述制备包含下列步骤a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，b)将Hep抗原制备物转移到上述容器中，c)在搅拌下添加盐水和2-P0E，检查pH并将其调整到6. 0-7. 0的范围内。方法还包括将本发明的疫苗的组分I与组分II混合，其包含将组分II的内含物转移到组分I以获得混合物的步骤。方法还包含将Hib和IPV抗原与上述获得的混合物混合，其包含将上述混合物与 Hib抗原制备物混合以获得另一种混合物，以及将该混合物与IPV抗原制备物混合，检查pH 并将其调整到6. 0-7.0的范围内。根据本发明的一个优选实施方案，在上述任何步骤中提到的搅拌在25士2°C下以 150rpm进行约30分钟至2小时。
下面的实施例用于进一步说明本发明及其优点。提供下面的具体实施例时应该理解，它们打算用于说明而不是用于限制本发明的范围。实施例I本实施例给出了根据本发明的一种情况的五价疫苗的组成和制造方法A、本发明的五价疫苗的组成如下每0. 5ml疫苗包含下列组分表1:
权利要求
1.全液体稳定的联合疫苗，其包含白喉(D)，破伤风(T)，无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原，其中Hib基本上不吸附到任何佐剂上。
2.权利要求1的疫苗，其中Hib结合到选自如下的载体蛋白上破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM 197和脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白或其任何等价物， 或任何其他已知载体。
3.权利要求1的疫苗，其中Hib抗原来源于Hibb毒株的荚膜多糖。
4.权利要求1的疫苗，其中IPV抗原是选自Mahoney1型、MEF 2型和Saukett 3型的 Salk毒株，或选自Sabin 1型或2型的Sabin毒株。
5.权利要求1的疫苗，其中D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上。
6.权利要求1的疫苗，其中aP包含至少一种或者多种来自百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)以及菌毛蛋白(FIM 1，2和3)的抗原。
7.权利要求1 的疫苗，其包含 D, T, aP (PT, FHA, PRN)，Hib b 和 IPV (Mahoney 1 型，MEF 2型和Saukett 3型)，其中D的存在量为约l_40Lf，T的存在量为约l_25Lf，PT的存在量为约l-40ug，FHA的存在量为约l_40ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约l_15ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约l-20ug，以及Mahoneyl型，MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每 0. 5ml 约 1-50DU, 1-15DU 和 1-50DU。
8.权利要求7的疫苗，其包含D，T，aP(PT，FHA, PRN)，Hib b和IPV，其中D的存在量为约25Lf，T的存在量为约IOLf，PT的存在量为约25ug，FHA的存在量为约25ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约8ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约10ug，以及Mahoneyl型，MEF2型以及Saukett 3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约40DU，8DU和32DU。
9.全液体稳定的联合疫苗，其包含白喉(D)，破伤风(T)，无细胞百日咳(aP)，流感嗜血杆菌(Hib)和肝炎病毒Ofep)和脊髓灰质炎病毒(IPV)，其中D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上以及H印抗原吸附在氢氧化铝上。
10.权利要求9的疫苗，其中Hib结合在选自如下的载体蛋白上破伤风类毒素(TT)， 白喉类毒素(DT)，CRM 197以及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白或其任何等价物，或任何其他已知载体。
11.权利要求9的疫苗，其中Hib抗原基本上不吸附在任何佐剂上。
12.权利要求9的疫苗，其中Hib抗原来源于Hibb毒株的荚膜多糖。
13.权利要求9的疫苗，其中Ifep抗原来源于H印B毒株的表面抗原。
14.权利要求9的疫苗，其中IPV抗原为选自Mahoney1型、MEF 2型和Saukett 3型的&ilk毒株，或选自Sabin 1型或2型的Sabin毒株。
15.权利要求9的疫苗，其中aP包含至少一种选自百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(P69或PRN)以及菌毛蛋白(FIM 1，2和3)的抗原。
16.权利要求9 的疫苗，其包含 D, T, aP (PT, FHA, PRN)，Hib b, Hep B 和 IPV (Mahoneyl 型，MEF2型和Saukett3型)，其中D的存在量为约l_40Lf，T的存在量为约l_25Lf，PT的存在量为约l_40ug，FHA的存在量为约l_40ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约l_15ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约l-20ug，H印B的存在量为每0. 5ml约l_25ug，以及Mahoneyl型， MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0. 5ml约1-50DU，1-15DU和1-50DU。
17.权利要求16的疫苗，其包含0，1\3 ( 1\ 撤，？1^)，!1让b，H印B和IPV，其中D的存在量为约25Lf，T的存在量为约IOLf，PT的存在量为约25ug，FHA的存在量为约25ug以及PRN的存在量为每0. 5ml约8ug，Hib b的存在量为每0. 5ml约IOug以及H印B的存在量为每0. 5ml约10ug，以及Mahoneyl型，MEF2型以及Saukett 3型毒株的存在量分别为每 0. 5ml 约 40DU，8DU 和 32DU。
18.诱导针对选自D，T，aP，Hib，!fep或IPV的任一抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给对象给药免疫活性量的权利要求1或9的联合疫苗。
19.全液体稳定联合疫苗的制造方法，所述方法包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉⑶、ii)破伤风⑴和iii)无细胞百日咳(aP)抗原，b)向流感嗜血杆菌(Hib)抗原制备物添加组分I获得混合物，c)向脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原制备物添加上述混合物，前提是Hib基本上不吸附在任何佐剂上。
20.权利要求19的方法，其中D，T和aP抗原吸附在磷酸铝上。
21.权利要求19的方法，其中该方法还包含向制剂添加作为防腐剂的2-苯氧乙醇 (2-P0E)的步骤。
22.权利要求19的方法，其中组分I的制备包含下列步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-P0E转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物转移到所述容器中，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中获得混合物，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
23.权利要求22的方法，还包含下列步骤a)将上述混合物转移到Hib抗原制备物中获得另一种混合物，b)将步骤a)中获得的混合物混入IPV抗原制备物，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
24.全液体稳定的联合疫苗的制造方法，其包含下列步骤a)制备组分I，其包含i)白喉⑶、ii)破伤风⑴和iii)无细胞百日咳(aP)抗原，b)制备包含肝炎病毒(Hep)抗原的组分II，c)将组分I和II组合形成混合物，d)向Hib和IPV抗原制备物添加上述混合物，前提是D，T和aP抗原已经吸附在磷酸铝上，并且H印抗原吸附在氢氧化铝上。
25.权利要求M的方法，其中所述方法还包括向制剂添加作为防腐剂的2-苯氧乙醇 (2-P0E)的步骤。
26.权利要求M的方法，其中组分I的制备还包括下列步骤a)将白喉和破伤风抗原制备物连同磷酸铝凝胶，盐水溶液和2-P0E转移到容器中，b)将PT，FHA和PRN抗原制备物转移到所述容器中，c)将盐水和2-P0E添加到所述容器中，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
27.权利要求M的方法，其中组分II的制备包括下列步骤a)将氢氧化铝凝胶转移到容器中，b)将Hep抗原制备物转移到上述容器中，c)添加盐水和2-P0E，检查pH并将其调整到6.0-7. 0的范围内。
28.权利要求M的方法，其中组分I和II的组合包括将组分II的内含物转移到组分 I获得混合物的步骤。
29.权利要求28的方法，还包括下列步骤a)向Hib抗原制备物转移包含组分I和组分II的混合物获得另一种混合物，检查PH 并将其调整到6. 0-7. 0的范围内，b)向IPV抗原制备物转移步骤a)中获得的混合物。
全文摘要
本发明涉及包含用于针对疾病例如白喉、破伤风、无细胞百日咳和由流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脊髓灰质炎病毒的感染提供保护作用的抗原混合物的联合疫苗。本发明还涉及包含抗原，用于针对由肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。
文档编号A61K39/102GK102196818SQ200980142461
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月24日
发明者拉杰什·贾殷, 拉维特·让比, 苏克吉特·辛格 申请人:万能药生物有限公司
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