抗人il-4受体的高亲和性人抗体的制作方法
专利名称：抗人il-4受体的高亲和性人抗体的制作方法
抗人IL-4受体的高亲和性人抗体
背景技术：
白细胞介素-4(IL-4，又称为B细胞刺激因子或BSF-1)起初是以其响应低浓度抗表面免疫球蛋白抗体而刺激B细胞增殖的能力而得到表征。IL-4已被证明具有广泛的生物活性，包括对T细胞、肥大细胞、粒细胞、巨核细胞和红细胞的生长刺激。IL-4诱导II类主要组织相容性复合物分子在静息B细胞中的表达，并通过受激B细胞增强IgE和IgGl同种型的分泌。IL-4的生物活性是由特定的细胞表面IL-4受体介导的。人IL_4受体α (hIL_4R) (SEQ ID NO 274)在例如美国专利 5，599，905,5, 767，065和 5，840，869 中均有描述。hIL_4R 抗体在美国专利5，717，072和7，186，809中均有描述。生产可作为人治疗剂抗体的方法包括产生嵌合抗体和人源化抗体(参阅如美国专利6，949，245)。参阅，如WO 94/02602和美国专利6，596，541，其中描述了产生能生成人抗体的非人转基因小鼠的一些方法。美国专禾Ij5，714，146,5, 985，280 和 6，716，587 描述了使用 hIL_4R 抗体的一些方法。发明概述在第一个方面，本发明提供了与人白细胞介素-4受体(hIL_4R)特异性结合的人抗体，首选的是重组人抗体。这些人抗体的特征是以高亲和性与hIL_4R结合，并能够中和 hIL-4的活性。在一些具体的实施方案中，这些人抗体能够阻断与hIL-4R结合的hIL-13/ hIL-13Rl复合物，从而抑制hIL-13的信号发送。这些抗体可以是全长抗体(如IgGl或 IgG4抗体)或者可能仅包含抗原结合部分(如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可被修饰而实现其功能，如消除残余效应子功能(Reddy等人Q000) J. Immunol. 164 :1925-1933)。在一个一般的实施方案中，本发明提供了一种与hIL_4R(SEQ ID NO :274)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，经单体和二聚体表面等离振子共振分析，Kd为约300pM或以下。在一个更具体的实施方案中，此抗体或其抗原结合部分显示的Kd为约200pM或以下、 约150pM或以下、约IOOpM或以下，或约50pM。在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段阻断了 hIL-4活性，经萤光素酶生物分析测定，IC5tl为约IOOpM或以下。在一些更具体的实施方案中，经STAT6萤光素酶生物分析测定，抗体或抗原结合片段显示出IC5tl为约50pM或以下，约30pM或以下，或约25pM或以下。在各种实施方案中，此抗体或抗原结合片段阻断了 hIL-13活性，经STAT6萤光素酶生物分析测定，IC50为约IOOpM或以下，约90pM或以下，约 50pM或以下，或约20pM或以下。在第二个方面，本发明的抗体包含选自以下一组序列的重链可变区(HCVR)序列 SEQ ID NO :2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、 166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258 和 262，或与其基本上相似的序列。在第三个方面，本发明的抗体包含选自以下一组序列的轻链可变区(LCVR)序列 SEQ ID NO :10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、 164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260 和 264，或与其基本上相似的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含选自以下一组序列的HCVR和 LCVR 序列对(HCVR/LCVR) :SEQ ID NO :2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58, 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、 218/226、234/236、238/240、242/250、258/260 以及沈2/^64。在一个优选的实施方案中，此抗体或抗体片段包含HCVR/LCVR序列对SEQ ID NO :162/164、210/212或18/20。含有这些 HCVR/LCVR序列对的代表性抗体包括被命名为H4H098P(SEQ ID NO 162/164)、H4H083P (SEQ ID NO :210/212)以及 H4H095P (SEQ ID NO 18/20)的抗体。在第四个方面，本发明提供了编码HCVR的核酸分子，其中该核酸分子是一个选自以下序列的核苷酸序列:SEQ ID NO :1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、 121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257 和 261，或
其至少具有95 %同源性的基本上相同的序列。在第五个方面，本发明提供了编码LCVR的核酸分子，其中该核酸分子是选自以下序列的序列:SEQ ID NO :9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、 143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259 和 263，或其至少具
有95 %同源性的基本上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含由选自以下序列的核苷酸序列对所编码的 HCVR和 LCVR=SEQ ID NO :1/9、17/19、21/22、25/33、41/43、45/47、49/57、65/67、69/71、 73/81、89/91、93/95、97/105、113/115、117/119、121/129、137/139、141/143、145/153、 161/163、165/167、169/177、185/187、189/191、193/201、209/211、213/215、217/225、 233/235、237/239、Μ1/Μ9、257/259和沈1/^63。在一个优选的实施方案中，此抗体或抗体片段包含由选自以下序列的核酸序列编码的HCVR/LCVR序列SEQ IDNO :161/163,209/211 和17/19。在一个更优选的实施方案中，此抗体或抗体片段包含由核酸序列SEQ ID NO 161/163 编码的 HCVR/LCVR。在第六个方面，本发明提供了一种包含HCDR3和LCDR3的抗体或抗原结合片段， 其中 HCDR3 结构域选自以下一组序列=SEQ ID NO :8、32、56、80、104、128、152、176、200、224 和 248 ；LCDR3 结构域选自以下一组序列:SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、160、184、208、 232和256。在一个优选的实施方案中，HCDR3/LCDR3序列为SEQ IDNO :152/160,8/16或 200/208。在一个更优选的实施方案中，HCDR3和LCDR3序列为SEQ ID NO :152和160。在另一个实施方案中，此抗体或抗体片段进一步包含选自以下一组序列的HCDRl 序列=SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、148、172、196、220 和 244，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的 HCDR2 序列=SEQ ID NO :6、30、54、78、102、126、150、174、198、 222和M6，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的HCDR3序列SEQID NO :8、32、 56、80、104、128、152、176、200、224和248，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的 LCDRl 序列=SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228 和 252，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的 LCDR2 序列=SEQ ID NO :14、38、62、86、110、134、158、182、 206,230和252，或与其基本上相似的序列，以及选自以下一组序列的IXDR3序列SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、160、184、208、232和256，或与其基本上相似的序列。在一个优选的实施方案中，此抗体或抗原结合片段包含HCDR序列SEQ IDNO :148、150和152以及 LCDR 序歹Ij SEQ ID NO 156、158 禾口 160 ；HCDR 序列 SEQ ID NO :4、6 和 8 和 LCDR 序列 SEQ ID NO 12、14 和 16 ；以及 HCDR 序列 SEQ ID NO 196、198 和 200 和 LCDR 序列 SEQID NO :204、 206 和 208。根据某些实施方案，本发明提供了抗hIL_4R抗体或其抗原结合片段，它们含有选自以下一组序列的 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 序列SEQ ID NO 148/150/152/156/158/160 ；4/6/8/12/14/16 ；以及 196/198/200/204/206/208。含有这些 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 序列的代表性抗体包括被命名为 H4H098P (SEQ ID NO :148/150/152/156/158/160)、H4H083P (SEQ ID NO 196/198/200/204/206/208)，以及 H4H095P(SEQ ID NO :4/6/8/12/14/16)的抗体。在第七个方面，本发明的特点是包含HCDR3和IXDR3的人抗体或抗体片段，其中 HCDR3由选自以下一组序列的核苷酸序列编码:SEQ IDNO :7、31、55、79、103、127、151、175、 199、223和M7，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；且IXDR3由选自以下一组序列的核苷酸序列编码:SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、231 和 255，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列。在另一个实施方案中，本发明的特点是人抗体或抗体片段，其包含由选自以下序列的核苷酸序列编码的 HCDRl 结构域=SEQ ID NO :3、27、51、75、99、123、147、171、195、219 和M3，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由选自以下序列的核苷酸序列编码的HCDR2 结构域=SEQ ID NO :5、29、53、77、101、125、149、173、197、221 和 245，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由选自以下序列的核苷酸序列编码的HCDR3结构域 SEQ ID NO :7、31、55、79、103、127、151、175、199、223 和 247，或其至少具有 95 % 同源性的基本上相同的序列；由选自以下序列的核苷酸序列编码的IXDRl结构域SEQ IDNO :11,35, 59、83、107、131、155、179、203、227和251，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列； 由选自以下序列的核苷酸序列编码的LCDR2结构域=SEQ ID NO :13、37、61、85、109、133、 157、181、205、2四和253，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；以及由选自以下序列的核苷酸序列编码的 LCDR3 结构域=SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、 231和255，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列。在一个优选的实施方案中，抗体或抗原结合片段包含由核苷酸序列SEQ ID NO 147、149、151、155、157和159 ； 195、197、 199、203、205 和 207 ；以及 3、5、7、11、13 和 15 编码的 HCDR 和 LCDR 序列。在一个具体的实施方案中，本发明的抗hIL_4R抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO :162所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO :164所示氨基酸序列的LCVR，且其特征为在25°C和37°C时，Kd值分别为约IOOpM或以下(单体底物)或70pM或以下(二聚体底物)；Kd值分别为约160pM或以下(单体底物)或40pM或以下(二聚体底物)；以及 IC5tl值为约IOpM或以下(25pM 二聚体底物)或约IOOpM或以下QOOpM单体底物)，它既能阻断hIL-4也能阻断hIL-13的活性，其IC5tl为约30pM或以下(由生物分析法获得)并可与猴IL-4R交叉反应。 在一个具体的实施方案中，本发明的抗hIL_4R抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO 20所示氨基酸序列的LCVR，其特征为KD值为约450pM或以下(单体或二聚体底物)，IC5tl为约或40pM或以下(25pM 二聚体底物)或约IOOpM或以下QOOpM单体底物)，它既能阻断hIL-4也能阻断hIL-13的活性， 其IC5tl为约IOOpM或以下(由生物分析法获得)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗hIL_4R抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO :210所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO :212所示氨基酸序列的LCVR，其特征为分别在25°C和37°C时，Kd值为约50pM或以下(单体底物)或30pM或以下(二聚体底物)；Kd值为约200pM或以下(单体底物)或40pM或以下(二聚体底物)；以及IC5tl值为约 IOpM或以下(25pM 二聚体底物)或约90pM或以下QOOpM单体底物)，它既能阻断hIL_4 也能阻断hIL-13的活性，其IC5tl为约25pM或以下(由生物分析法获得)且不与猴IL-4R 交叉反应。在第八个方面，本发明的特点是与hIL_4R特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含三个重链和三个轻链互补决定区(HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDRl、LCDR2、LCDR3)，其中 HCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO 265) 的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp 或 Ser ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 266)的氨基酸序列，其中 X1 = Ile 或 Leu, X2 = Ser，X3 = Gly, Tyr 或 Arg，X4 = Ser、Asp 或 Thr，X5 = Gly 或 kr，X6 = Gly、Ser 或 Val，X7 = Ser 或 Asn，且 X8 = Thr、Lys 或 Ile ； HCDR3 包含结构式为 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-Xi2-X13-X14-X15-XW-X17-X18 (SEQ ID NO 267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = Lys，X3 = Asp、Glu 或 Trp，X4 = Gly 或 Arg， X5 = Leu、Thr 或 Arg, X6 = Gly、Arg 或 Ser, X7 = Ile 或 Gly，X8 = Thr、Phe 或 Tyr, X9 = Ile，Asp 或 Phe，X10 = Arg、Tyr 或 Asp，X11 = Pro,Tyr 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr 或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 = Val 或缺失；LCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11 (SEQ ID NO :268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp, Ser 或 Val，X3 = Ile 或 Leu，X4 = Ser, Leu 或 Asn，X5 =Asn、Tyr 或 Ile，X6 = Trp、Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10 = Asn 或缺失；且 X11 = Tyr 或缺失；LCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3 (SEQ ID NO 269) 的氨基酸序列，其中X1 = Leu、Ala或Val，X2 =Ala或Gly，且X3 = Ser ；且LCDR3包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met，X2 = Gin, X3 = Ala 或 Tyr，X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 kr，X6 = Thr、Phe 或 His, X7 = Pro, X8 =Tyr, lie 或 Trp,且 X9 = Thr0在一个更具体的实施方案中，HCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Arg ；X6 = Asp 或 kr ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 266)的氨基酸序列，其中 X1 = lie, X2 = Ser, X3 = Gly 或 Tyr, X4 = Ser 或 Thr，X5 = Gly, X6 = Gly 或 kr，X7 = Asn,且 X8 = Thr 或 Lys ；HCDR3 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6 -X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO 267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala， X2 = Lys, X3 = Asp 或 Glu，X4 = Gly 或 Arg，X5 = Leu 或 Arg，X6 = Gly 或 kr，X7 = Ile 或 Gly, X8 = Thr 或 Phe，X9 = Ile 或 Asp，X10 = Arg 或 Tyr，X11 = Pro 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X^ = Leu或缺失，X17 = Asp 或缺失，且 X18 = Val 或缺失；LCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQID NO 268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Ser 或 Val，X3 = Ile 或 Leu，X4 = Leu 或 Asn, X5 = Asn 或 Tyr，X6 = Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10 = Asn 或缺失；且 X11 = Tyr 或缺失；LCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3 (SEQ ID NO 269) 的氨基酸序列，其中X1 = Leu或Ala，X2 = Ala或Gly和X3 = kr ；且IXDR3包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met，X2 = Gln, X3 = Ala 或 Tyr, X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 Ser, X6 = Thr 或 His, X7 = Pro, X8 = Tyr 或 Trp，且 X9 = Thr0在另一个更具体的实施方案中，HCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO 265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ； X6 = Asp ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 266)的氨基酸序列，其中 X1 = Ile 或 Leu, X2 = Ser，X3 = Gly 或 Arg，X4 = Ser 或 Thr，X5 =Gly 或 Ser，X6 = Gly 或 Val，X7 = Ser 或 Asn，且 X8 = Thr 或 Ile ；HCDR3 包含结构式为 X ^X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18(SEQ IDNO :267)的氨基酸序列， 其中 X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Asp 或 ρ，X4 = Gly 或 Arg，X5 = Leu 或 Thr，X6 = Arg 或 Ser,X7 = Ile 或 Gly，X8 = Thr ^ Tyr,X9 = Ile 或 Phe，X10 = Arg 或 Asp,X11 = Pro、Tyr 或缺失，X12 = Arg或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu 或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 = Val或缺失；LCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO :268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp 或 Ser，X3 = Ile 或 Leu,X4 = Ser 或 Leu，X5 = Tyr 或 Ile，X6 = Trp 或 kr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失； X9 = Tyr或缺失；Xiq = Asn或缺失；且X11 = Tyr或缺失；LCDR2包含结构式为X1-X2-X3GEQ ID NO 269)的氨基酸序列，其中 X1 = Leu 或 Val，X2 = Ala 或 Gly，且 X3 = Ser ；且 LCDR3 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或 Met, X2 = Gin, X3 = Ala, X4 = Leu 或 Asn，X5 = Gln 或 kr，X6 = Thr 或 Phe，X7 = Pro, X8 =Tyr 或 lie，且 X9 = Thr0在第九个方面，本发明提供了含有得自HCVR和LCVR对的HCDR1/HCDR2/HCDR3/ IXDR1/IXDR2/IXDR3序列的抗体或抗原结合片段，其中HCVR/LCVR序列选自以下一组序列 SEQ ID NO :162/164、21(V212和18Λ0。在一个更具体的实施方案中，重链和轻链CDR序列为包含在HCVR SEQ ID NO :162和LCVR SEQ ID NO :164中的序列。在另一个更具体的实施方案中，重链和轻链⑶R序列为包含在HCVR SEQID NO: 18和LCVR SEQ ID NO :20中的序列。在另一个具体的实施方案中，重链和轻链⑶R序列为包含在HCVR SEQ ID NO :210和 LCVRSEQ ID NO 212 中的序列。本发明涵盖了具有经修饰的糖基化模式的抗hIL_4R抗体。在某些应用中，进行修饰以除去不需要的糖基化位点可能是很有用的，例如在寡糖链上缺少岩藻糖基元的抗体， 可以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参阅Siield等人000 JBC 277 26733)。在其它一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。在第十个方面，本发明提供了带有本发明核酸分子的重组表达载体以及包含这些载体的宿主细胞，以及通过培养本发明的宿主细胞而制备本发明的抗体或抗原结合片段的方法。此宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，优选的宿主细胞为大肠杆菌细胞或哺乳动物细胞，如CHO细胞。
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在第十一个方面，本发明的特点是组合物，其包含与hIL_4R特异性结合的重组人抗体和可接受的载体。在第十二个方面，本发明的特点是利用本发明的抗体或其抗原结合部分抑制 hIL-4活性的方法。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体还能阻断与hIL-4R结合的 hIL-13/hIL-13Rl复合物。在一个实施方案中，本发明的方法包括使本发明的抗体或其抗原结合部分与hIL-4R接触，从而抑制hIL-4或hIL-4/hIL-13的活性。在另一个实施方案中， 本发明的方法包括给患有可通过抑制hIL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到改善的疾病的人类受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。所治疗的疾病是可通过消除、抑制或降低 hIL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到改善、好转、抑制或预防的任何疾病或病症。用本发明的抗体或抗体片段治疗的IL-4相关疾病包括例如关节炎(包括脓毒性关节炎)、疱疹(herpetiformis)、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病 (Whipple' s Disease)、良性前列腺增生、肺病，如轻度、中度和重度哮喘、炎症性疾病，如炎症性肠病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生综合征、自体免疫溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核(病)和肾病。在阅读下面的详细说明后，本发明的其它目标和优势将变得明显。详细说明在描述本发明的方法之前，应当理解，本发明并不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应当理解，本文所用的术语只是出于描述具体实施方案的目的，并非意在加以限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文所用的一切技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通专业人员通常理解的同样的含义。尽管任何与本文所述的方法和材料类似或相当的方法和材料均可采用，但下面描述的是优选的方法和材料。定义本文所用的术语“人IL4R” (hIL-4R)意指与白细胞介素-4(IL_4)、IL-4Ra (SEQ ID NO :274)特异性结合的人细胞因子受体。术语“人白细胞介素-13”(hIL-13)意指与 IL-13受体特异性结合的细胞因子，“hIL-13/hIL-13Rl复合物”意指由hIL_13与hIL_13Rl 复合物结合而形成的复合物，该复合物与hIL-4受体结合以启动生物活性。本文所用的术语“抗体”指由四条多肽链即由二硫键互联的两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。 重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CLl)。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个 ⑶R和四个FR组成，从氨基酸末端到羧基末端按下列次序排列FR1、⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、 CDR3、FR4。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”或“抗体片段”)指抗体中保留了与抗原(如hIL-4R)特异性结合能力的一个或多个片段。业已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段来实现。抗体的“抗原结合部分”这一术语所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL1和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，即由铰链区的二硫键连接的两个F(ab)’片段组成的二价片段；(iii)由VH 和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(ν)由VH 结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989) NatureMl :544-546)；以及(vi)CDR。此外，尽管 Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的，但它们可通过重组方法，由一种合成的接头连接在一起而成为单独的相连的链，其中VL和VH区配对而形成单价分子(称为单链 Fv(scFv)；参阅例如 Bird 等人(1988)kience 242 :423-426 ；以及 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合部分”的术语范围内。其它形式的单链抗体，如双特异抗体也涵盖在内(参阅如Holliger等人(1993)Proc. Natl. Acad Sci. USA 90 :6444-6448)。本文所用的“中和”或“阻断”抗体意指其与hIL_4R的结合造成对hIL-4和/或 hIL-13生物活性抑制的抗体。这种hIL-4和/或IL-13生物活性的抑制可通过测量本领域众所周知的一个或多个hIL-4/或hIL-13生物活性指标，如hIL-4/或hIL_13诱导的细胞活化和hIL-4与hIL-4R的结合等指标来评估(参阅下面的实施例)。“CDR”或互补决定区是散布在较保守的被称为框架区(FR)的区域内的超变区。在本发明的抗hIL-4R抗体或片段的不同实施方案中，FR可能与人种系序列相同，或者可能经过天然或人工修饰。本文所用的术语“表面等离振子共振”指的是一种光学现象，它使得可通过检测一种生物传感器基质中蛋白质浓度的改变来进行实时互动分析，例如使用BIAC0RE 系统 (Pharmacia Biosensor AB)进行分析。术语“表位”是与抗体分子中称为互补位的可变区之特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可能有一个以上表位。表位可为构象的，也可为线性的。构象表位是由线性多肽链不同片段上空间并列排布的氨基酸产生的。线性的表位是由多肽链上相邻的氨基酸残基形成的。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基，或磺酰基部分。术语“基本同一性”或“基本上相同”当其指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，用下述任何著名的序列同一性计算程序如FASTA、BLAST或Gap计算，在至少约95%，更优选在至少约96%、97%、98% 或99%的核苷酸碱基中具有核苷酸序列同一性。当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意为当以GAP或BESTFIT等程序用默认空位权重进行最佳比对时，两个肽序列至少具有95%的序列同一性，更优选的是至少具有98%或99%的序列同一性。更优选的是，不相同的残基位置的区别在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样的取代，其中氨基酸残基被另一个含有具有类似化学性质(如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会从实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或两个以上氨基酸序列由于保守的取代而彼此不同的情况下，可向上调节序列同一性百分数或类似程度，以修正取代的保守性。进行这种调节的方法为本领域的专业人员所熟知。参阅如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24 :307-331。含有具有类似化学性质侧链的氨基酸群的实例包括(1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；( 脂族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；C3)含酰胺侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；( 碱性侧链 赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守的氨基酸取代群为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代可以是在Gonnet等人(199》kience 256 :1443-1445所披露的PAM250对数-似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守的”取代是PAM250对数-似然矩阵中具有非负值的任何变化。多肽的序列相似性也称为序列同一性，通常是由序列分析软件测量的。蛋白质分析软件利用各种取代、删除和其它修饰，包括保守的氨基酸取代的相似性测量值来对相似的序列进行匹配。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit等程序，可用默认参数来确定密切相关的多肽例如来自不同生物种的同源多肽的序列同源性或序列同一性，或确定野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性，参阅如GCG 6.1版。还可以用GCG 6. 1版中的FASTA程序，用默认或建议的参数来比较多肽序列。FASTA(如FASTA2 和FASTA3)提供了查询的和搜索到的序列之间最佳迭合区域的比对和序列同一性百分数 (Pearson (2000)，如上)。当对本发明的序列和包含大量源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一种优选的计算程序是计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，在比较时采用默认参数。参阅如 Altschul 等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 和 Altschul 等人 (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389_402。人抗体的制备产生人抗体的方法包括美国专利6，596，541, Green等人(1994)NatureGenetics 7 :13-21)，以及美国专利5，545，807和6，787，637中描述的方法。可采用本领域已知的任何方法对啮齿类动物进行免疫(参阅如Harlow and Lane (1988)Antibodies:A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory ； Malik and Lillehoj (1994) Antibody Techniques, Academic Press，CA)。本发明抗体的优选制备方法是采用VEL0CIMMUNE 技术(美国专利6，596，541)。利用所研究抗原激发其中内源免疫球蛋白重链和轻链可变区被对应的人可变区取代的转基因小鼠，并从表达抗体的小鼠收获淋巴细胞(如B-细胞)。淋巴细胞可与骨髓瘤细胞系融合来制备永生杂交瘤细胞系，然后对这种杂交瘤细胞系进行筛选，以识别能产生对所研究抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来并与所需的重链和轻链同种型恒定区连接。这样的抗体蛋白质可在细胞，如CHO细胞中形成。或者，编码抗原特异的嵌合抗体或轻链和重链可变区的DNA可直接从抗原特异的淋巴细胞中分离出来。编码抗体的重链和轻链可变区的DNA可被分离出来并有效连接到编码人重链和轻链恒定区的DNA上。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达该DNA。在一个具体的实施方案中，该细胞为CHO细胞。抗体可能具有治疗作用，这种作用是通过阻断配体-受体相互作用或抑制受体组成部分的相互作用来实现的，而不是通过补体固定(补体依赖性细胞毒性)(CDC)和参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而杀死细胞来实现的。抗体的恒定区对抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是很重要的。因此，可根据是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同种型。人免疫球蛋白可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约为150-160kDa的稳定四链结构，其中二聚体通过链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，二聚体不是通过链间二硫键连接的，而是形成了由共价连接的轻链和重链组成的约为75-80kDa的分子(半抗体)。这些形式极难分离，甚至在亲和提纯后也是如此。第二种形式在各种完整的IgG同种型中出现的频度是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差别。事实上，人IgG4铰链的铰链区的单个氨基酸取代可将第二种形式 (Angal等人(1993)Molecular Immunology 30 :105)的出现频度显著地降低到利用人IgGl 铰链通常所观察到的水平。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体。这类抗体可能是可取的，例如，可在生产中提高所需抗体形式的产率。优先，分离出具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和嵌合抗体。如下所述，鉴定抗体的特征并选择所需的特征，包括与hIL-4R结合亲和性、阻断hIL-4与hIL-4R结合的能力， 和/或对人蛋白质的选择性。用所需的人恒定区取代小鼠恒定区以产生本发明的完全人抗体，如野生型或经修饰的IgG4或IgGl (如SEQ ID NO :271、272、273)。尽管所选择的恒定区可依具体用途而改变，但高亲和性抗原结合和靶标特异性特征则在于可变区。表位作图和相关技术为了筛选与某特定表位结合的抗体，可进行常规交叉阻断分析，例如如上Harlow 和Lane所述的。其它方法包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(Reineke^KM)Methods Mol Biol 248 :443-63)或肽裂解分析。此外，还可采用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰等方法(Tomer (2000)Protein Science :9 :487-496)。修饰协助分类法(MAP)，又称为基于抗原结构的抗体分类法(ASAP)是一种将大量针对相同的抗原的单克隆抗体(mAb)按照每种抗体对化学或酶学修饰的抗原表面的结合特性的相似性进行分类的方法(美国专利申请公开书2004/0101920)。每一类别可能反映了独特的表位，它可能与另一类别所代表的表位显著不同或与之部分重迭。这一技术使得能快速过滤遗传上相同的抗体，从而使对特征的鉴定着重于遗传上显著不同的抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可促进带有所需特征的稀少杂交瘤克隆的识别。MAP可用来将本发明的hIL-4R抗体分成可与不同表位结合的抗体组。对改变固定化抗原的结构有用的试剂有酶如蛋白水解酶和化学试剂。抗原蛋白可固定在生物传感器芯片表面或聚苯乙烯珠上。后者可用例如分析法来处理，如多重 LUMINEX 检测分析(Luminex Corp. , TX)。由于LUMINEX 有能力处理多达100种不同聚苯乙烯珠的多重分析，该方法提供了几乎无限的具有各种修饰的抗原表面，结果在抗体表位特性分析方面比生物传感器分析有更高的分辨率。双特异性本发明的抗体可以是单特异、双特异或多特异抗体。多特异抗体可对靶标肽的不同表位显示特异性，或也可包含对一个以上靶标肽显示特异性的抗原结合域。参阅如Tutt 等人(1991) J. Immunol. 147 :60_69。人抗IL-4R抗体可被连接到另一个功能分子如另一个肽或蛋白质上，或与之共表达。例如，抗体或其片段可功能性地(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)与一个或多个其它分子如另一个抗体或抗体片段连接，以产生带有第二结合特异性的双特异或多特异抗体。治疗给药方式和配方本发明提供了包含本发明的抗IL-4R抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本发明的治疗组合物将与适当的载体、赋形剂以及其它制剂一起施用。这些制剂纳入配方是为了改善传送、递送和耐受性等。在所有药剂化学家熟知的药典雷氏药学大全 (Remington' s Pharmaceutical Sciences， Mack Publishing Company, Easton， PA)中可找到大量适当的配方。这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂(阳离子或阴离子)的液囊(如LIPOFECTIN )、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有碳蜡的半固体状混合物。另请参阅 Powell 等人“Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)JPharm Sci Technol 52:238-311。剂量随受药的受试者年龄和体型大小、目标疾病、症状、施用途径等不同而可以改变。当本发明的抗体用来治疗成人的各种与IL-4R相关的病症和疾病时，有利的是采用静脉给药本发明抗体，通常单剂按每公斤体重计约0. 01至约20mg/kg给药，更优选的是约 0. 02至约7、约0. 03至约5，或约0. 05至约;3mg/kg体重。根据病症的严重性，可对治疗的频度和持续时间进行调整。已知有各种药物递送系统可用来施用本发明的药物组合物，例如包在脂质体、微颗粒、微胶囊中的胶囊化，能够表达变异病毒的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参阅如mi 等人(1987),J.Biol. Chem. 262 :4429-4432)。引入药物的方法包括但不限于皮内、肌肉内、 腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜，和口腔等途径。该药物组合物可采用任何方便的途径施用，如通过灌注或静脉团注、上皮和粘膜层(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收，并可与其它生物活性药剂一起施用。施用方式可为全身性或局部性施用。该药物组合物也可通过液囊递送，尤其是通过脂质体液囊递送(参阅 Langer (1990) Science 249 :1527-1533 ;Treat 等人(1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (编著)，Liss, New York，第 353-365 页；Lopez-Berestein,同上，第 317-327 页；一般参阅如上。在某些情况下，该药物组合物可以受控释放系统递送。在一个实施方案中，可使用泵(参阅 Langer，如上 Jefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 :201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料(参阅Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise (编著)，CRC Pres. , Boca Raton，Florida (1974)。在又一个实施方案中，可在该药物组合物的目标附近放置受控释放系统，因此仅需要使用全身剂量的一部分(参阅如 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,同上，第 2卷，第 115-138页， 1984)。关于其它受控释放系统的讨论见Langer (1990) Science 249:1527-1533。注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些注射制剂可用已公开的方法制备。例如，注射制剂可通过将抗体或其盐溶于、悬浮于或乳化于惯常用于注射的无菌水介质或油介质的方式来制备。用于注射的水性介质有，例如生理盐水、 含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等。它们可与适当的增溶剂如醇(如乙醇)、多元醇 (如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[如聚山梨醇酯80、HC0-50 (氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加成物)等结合使用。所用的油介质有，如芝麻油、大豆油等。它们可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等结合使用。这样制备的注射剂最好封装在适当的安瓿瓶中。有利的是，上述用于口服或非经肠施用的药物组合物可制备成能容纳活性成分剂量的单位剂量形式。这样的单位剂量形式包括，如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。每个单位剂量所包含的上述抗体的量一般为约5到500毫克，尤其是在注射剂中，所包含的上述抗体的量最好为约5到100毫克；对于其它剂量形式，最好为约10到250毫克。单一治疗和联合治疗本发明的抗体和抗体片段对于治疗可通过降低IL-4活性而得到改善、抑制或者好转的疾病和紊乱很有用。这些疾病包括那些以IL-4异常表达或过度表达或宿主对IL-4生成的异常反应为特征的疾病。用本发明的抗体或抗体片段治疗的与 IL-4相关的疾病包括例如关节炎(包括脓毒性关节炎)、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、 肥大性瘢痕、Whipple病、良性前列腺增生、肺病，如哮喘(轻度、中度和重度)、炎症性疾病， 如炎症性肠病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合症、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生综合征、自体免疫溶血性贫血、巴雷特食管、 自体免疫葡萄膜炎、结核(病)、遗传过敏性皮炎、溃疡性结肠炎、纤维症和肾病(参阅美国专利 7，186，809)。本发明涵盖联合治疗，其中抗IL-4R抗体或抗体片段与第二种治疗药剂联合施用。共同给药和联合治疗并不限于同时给药，而是还包括在涉及给予患者至少一种其它治疗药剂的疗程中至少给予一次抗IL-4R抗体或抗体片段的治疗方案。第二种治疗药剂可能为另一种IL-4拮抗剂，如另一种抗体/抗体片段，或可溶的细胞因子受体、IgE拮抗剂、可通过吸入或其它适当方式给药的抗哮喘药物(皮质类固醇、非类固醇药剂、β激动剂、白三烯、拮抗剂、黄嘌呤类、氟替卡松、沙美特罗、舒喘宁)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗IL-4R抗体或抗体片段可与IL-I拮抗剂，如利纳西普(rilonac印t)或IL-13拮抗剂一起施用。第二种药剂可能包括一种或多种白三烯受体拮抗剂，以治疗诸如变应性发炎疾病， 如哮喘和过敏症。白三烯受体拮抗剂的实例包括但不限于孟鲁司特、普仑司特和扎鲁司特。 第二种药剂可包括细胞因子抑制剂，如一种或多种TNF (依那西普，ENBREL )、IL-9、IL-5或 IL-17拮抗剂。本发明还包括本文所述的任何抗IL-4R抗体或抗原结合片段在制备治疗疾病或症状的药物中的应用，其中的疾病或症状是通过消除、抑制或降低人白细胞介素-4(hIL-4) 活性而得到改善、好转或抑制的。这类疾病或症状的实例包括，例如，关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Wiipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核(病)、肾病、遗传过敏性皮炎以及哮喘。
实施例我们提供以下实施例以便向本领域普通技术人员就如何制备本发明的组合物和如何使用本发明的方法提供完整的披露和说明，它们并非意在限制本发明之发明人所认为的发明的范围。已经作出努力以保证所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但是，也应考虑到会有一些实验误差和偏差。除非另外注明，份数为重量份数，分子量为平均分子量， 温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。实施例1.人IL-4受体人抗体的生成将VEL0CIMMUNE 小鼠(Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ；US 6，596，541) 用人 IL-4R(hIL-4R，SEQ ID NO :274)或 hIL_4R 和食蟹猴(Macaca fascicularis) IL-4R(mfIL-4R,SEQ ID NO 275)蛋白质或DNA的组合进行免疫。为了获得最佳免疫反应，随后每3-4周对动物进行加强免疫并在每次加强免疫后10天获得血样以评估抗抗原反应的进展。当小鼠达到最大免疫反应时，收获表达抗体的B细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。或者，不与骨髓瘤细胞融合而直接从B细胞分离抗原特异的抗体，如美国专利公开书2007/(^80945Α1所述，该公开书特别通过引用而以其整体纳入本文。从分离的适当重组细胞建立了稳定的表达抗体的重组CHO细胞系。通过筛查杂交瘤或转染细胞的条件培养基的特异性、抗原结合亲和性以及阻断hIL-4与hIL-4R结合的效能(如下所述)，选择了具有所需功能的单克隆抗体。通过前述方法获得了几种抗hIL-4R抗体，包括被命名为H4H083P、H4H094P和 H4H095P、H4H098P和H4H099P的代表性抗体。这些代表性抗hIL_4R抗体以及它们的生物特性将在以下实施例中更为详细地叙述。实施例2.抗原结合亲和性测定利用实时生物传感器表面等离振子共振分析(BIAC0RE 2000)，于25°C或37°C测定了所选择抗体相对于hIL-4R的结合亲和性(Kd)。简言之，将抗体捕获到通过与BIAC0RE 芯片直接偶联而产生的山羊抗hFc多克隆抗体的表面上，以形成抗体得到捕获的表面。在 25°C或37°，将各种不同浓度(范围从50nM到12. 5nM)的单体hIL_4R(R&DSystems)或二聚体hIL-4R-mFc注射到抗体得到捕获的表面，注射速率为10 μ Ι/min，注射时间为2. 5分钟。对抗原与抗体的结合以及所结合复合物的离解进行实时监控。利用BIA评估软件进行动力学分析确定了平衡解离常数(Kd)和解离速率常数。还利用BIA评估软件计算了抗原/ 抗体复合物解离的半衰期(T1/2)。其结果如表1所示。NB 在实验条件下未观察到抗体-抗原结合。对照完整的人抗IL-4R抗体(美国专利7，186，809 ；SEQID NO 10和12)。表 权利要求
1.一种与人白细胞介素-4受体(hIL-4R) (SEQ ID NO :274)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVI )和轻链可变区(LCVI )，其中抗体或抗原结合片段包含(a)含有如SEQID NO :162所示氨基酸序列的HCVR和含有如SEQID NO :164所示氨基酸序列的LCVR，其特征为与hIL-4R的亲和性(Kd)为约IOOpM或以下；(b)含有如SEQID NO 18所示氨基酸序列的HCVR和含有如SEQID N0:20所示氨基酸序列的LCVR，其特征为与hIL-4R的亲和性(Kd)为约300pM或以下；或(c)含有如SEQID NO :210所示氨基酸序列的HCVR和含有如SEQID NO :212所示氨基酸序列的LCVR，其特征为与hIL-4R的亲和性(Kd)为约50pM或以下。
2.一种与人白细胞介素-4受体(hIL-4R) (SEQ ID NO :274)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区3 (HCDR3)和轻链互补决定区3(LCDR3)，其中抗体或抗原结合片段包含(a)含有如SEQID NO :152所示氨基酸序列的HCDR3和如SEQ IDNO 160所示氨基酸序列的IXDR3 ；(b)含有如SEQID NO 8所示氨基酸序列的HCDR3和如SEQ IDNO 16所示氨基酸序列的LCDR3 ；或(c)含有如SEQID NO :200所示氨基酸序列的HCDR3和如SEQ IDNO :208所示氨基酸序列的IXDR3。
3.一种与人IL-4R特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含重链互补决定区 1 (HCDRl)、重链互补决定区12(HCDR2)、重链互补决定区13(HCDR3)以及轻链互补决定区 1 (IXDRl)、轻链互补决定区2 0XDR2)、轻链互补决定区3 (IXDR3)，其中HCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ IDNO :265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp 或 Ser ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO :266)的氨基酸序列，其中 X1 =Ile 或 Leu，X2 = Ser, X3 = Gly, Tyr 或 Arg，X4 = Ser,Asp 或 Thr，X5 = Gly 或 kr，X6 = Gly、Ser 或 Val，X7 = Ser 或 Asn，且 X8 = Thr、Lys 或 Ile ；HCDR3 包含结构式为 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Xw (SE Q ID NO 267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = Lys，X3 = Asp、Glu 或 Trp，X4 = Gly 或 Arg, X5 = Leu、Thr 或 Arg，X6 = Gly、Arg 或 kr，X7 = Ile 或 Gly，X8 = Thr、Phe 或 Tyr，X9 =lie、Asp 或 Phe，X10 = Arg、Tyr 或 Asp，X11 = Pro, Tyr 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 =Val或缺失；LCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11 (SEQ ID NO :268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp、Ser 或 Val，X3 = Ile 或 Leu，X4 = kr、Leu 或 Asn，X5 = Asn、 Tyr 或 lie，X6 = Trp, Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；Xiq =Asn或缺失；且X11 = Tyr或缺失；LCDR2包含结构式为X1-X2-X3(SEQ ID NO :269)的氨基酸序列，其中X1 = Leu、Ala或 Val，X2 = Ala 或 Gly，且 X3 = Ser ；且LCDR3 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或 Met，X2 = Gin, X3 = Ala 或 Tyr，X4 = Leu 或 Asn，X5 = Gln 或 kr，X6 = Thr, Phe 或 His, X7 = Pro, X8 = Tyr、lie 或 Trp,且 X9 = Thr。
4.如权利要求3所述之抗体或抗体片段，其中重链和轻链CDR氨基酸序列(HCDR1、 HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2、LCDR3)选自以下一组序列(a)SEQID NO :148、150、152、156、158、160 ；(b)SEQID NO :4、6、8、12、14、16 ；以及(c)SEQID NO :196、198、200、204、206、208。
5.一种核酸序列，其编码如权利要求1至4中任何一项所述之抗体或抗原结合片段的 HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 以及 LCDR3 序列。
6.一种含有如权利要求5所述之核酸序列的载体。
7.一种用于生产抗体或抗体的抗原结合片段且包含如权利要求6所述之载体的宿主-载体系统。
8.—种生产与人白细胞介素-4受体α (hIL-4R)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在表达抗体或片段的条件下培养如权利要求7所述之宿主-载体系统的细胞，并收获所表达的抗hIL-4抗体。
9.如权利要求8所述之方法，其中宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
10.如权利要求9所述之方法，其中宿主细胞为大肠杆菌细胞或CHO细胞。
11.如权利要求1、2、3或4所定义之抗体或抗原结合片段在制备用于治疗疾病或症状的药物中的应用，其中所述的疾病或症状通过消除、抑制或降低人白细胞介素-4(hIL-4) 活性而得到改善、好转或抑制。
12.如权利要求11所述之应用，其中的疾病或症状选自以下一组疾病或症状关节炎、 疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Wiipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、 自体免疫葡萄膜炎、结核(病)和肾病。
13.如权利要求11所定义之应用，其中的疾病或症状是哮喘或遗传过敏性皮炎。
14.一种治疗疾病或症状的方法，其中所述的疾病或症状通过消除、抑制或降低人白细胞介素_4(hIL-4)活性而得到改善、好转或抑制，所述方法包括向需要的患者施用如权利要求1、2、3或4中任何一项所述之抗体或抗原结合片段。
15.如权利要求14所述之方法，其中的疾病或症状选自以下一组疾病或症状关节炎、 疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Wiipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、 自体免疫葡萄膜炎、结核(病)和肾病。
16.如权利要求14所述之方法，其中的疾病或症状是哮喘或遗传过敏性皮炎。
全文摘要
一种分离的人抗体或其抗体片段，其以高亲和性(KD)与人白细胞介素-4受体α(hIL-4Rα)结合，能够阻断hIL-4和hIL-13的活性。
文档编号A61P37/08GK102197052SQ200980143007
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月27日 优先权日2008年10月29日
发明者J·H·马丁, J·L·费尔赫斯特, N·J·帕帕多普洛斯, T·T·黄 申请人:瑞泽恩制药公司
抗人IL-4受体的高亲和性人抗体
背景技术：
白细胞介素-4(IL-4，又称为B细胞刺激因子或BSF-1)起初是以其响应低浓度抗表面免疫球蛋白抗体而刺激B细胞增殖的能力而得到表征。IL-4已被证明具有广泛的生物活性，包括对T细胞、肥大细胞、粒细胞、巨核细胞和红细胞的生长刺激。IL-4诱导II类主要组织相容性复合物分子在静息B细胞中的表达，并通过受激B细胞增强IgE和IgGl同种型的分泌。IL-4的生物活性是由特定的细胞表面IL-4受体介导的。人IL_4受体α (hIL_4R) (SEQ ID NO 274)在例如美国专利 5，599，905,5, 767，065和 5，840，869 中均有描述。hIL_4R 抗体在美国专利5，717，072和7，186，809中均有描述。生产可作为人治疗剂抗体的方法包括产生嵌合抗体和人源化抗体(参阅如美国专利6，949，245)。参阅，如WO 94/02602和美国专利6，596，541，其中描述了产生能生成人抗体的非人转基因小鼠的一些方法。美国专禾Ij5，714，146,5, 985，280 和 6，716，587 描述了使用 hIL_4R 抗体的一些方法。发明概述在第一个方面，本发明提供了与人白细胞介素-4受体(hIL_4R)特异性结合的人抗体，首选的是重组人抗体。这些人抗体的特征是以高亲和性与hIL_4R结合，并能够中和 hIL-4的活性。在一些具体的实施方案中，这些人抗体能够阻断与hIL-4R结合的hIL-13/ hIL-13Rl复合物，从而抑制hIL-13的信号发送。这些抗体可以是全长抗体(如IgGl或 IgG4抗体)或者可能仅包含抗原结合部分(如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可被修饰而实现其功能，如消除残余效应子功能(Reddy等人Q000) J. Immunol. 164 :1925-1933)。在一个一般的实施方案中，本发明提供了一种与hIL_4R(SEQ ID NO :274)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，经单体和二聚体表面等离振子共振分析，Kd为约300pM或以下。在一个更具体的实施方案中，此抗体或其抗原结合部分显示的Kd为约200pM或以下、 约150pM或以下、约IOOpM或以下，或约50pM。在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段阻断了 hIL-4活性，经萤光素酶生物分析测定，IC5tl为约IOOpM或以下。在一些更具体的实施方案中，经STAT6萤光素酶生物分析测定，抗体或抗原结合片段显示出IC5tl为约50pM或以下，约30pM或以下，或约25pM或以下。在各种实施方案中，此抗体或抗原结合片段阻断了 hIL-13活性，经STAT6萤光素酶生物分析测定，IC50为约IOOpM或以下，约90pM或以下，约 50pM或以下，或约20pM或以下。在第二个方面，本发明的抗体包含选自以下一组序列的重链可变区(HCVR)序列 SEQ ID NO :2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、 166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258 和 262，或与其基本上相似的序列。在第三个方面，本发明的抗体包含选自以下一组序列的轻链可变区(LCVR)序列 SEQ ID NO :10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、 164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260 和 264，或与其基本上相似的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含选自以下一组序列的HCVR和 LCVR 序列对(HCVR/LCVR) :SEQ ID NO :2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58, 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、 218/226、234/236、238/240、242/250、258/260 以及沈2/^64。在一个优选的实施方案中，此抗体或抗体片段包含HCVR/LCVR序列对SEQ ID NO :162/164、210/212或18/20。含有这些 HCVR/LCVR序列对的代表性抗体包括被命名为H4H098P(SEQ ID NO 162/164)、H4H083P (SEQ ID NO :210/212)以及 H4H095P (SEQ ID NO 18/20)的抗体。在第四个方面，本发明提供了编码HCVR的核酸分子，其中该核酸分子是一个选自以下序列的核苷酸序列:SEQ ID NO :1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、 121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257 和 261，或
其至少具有95 %同源性的基本上相同的序列。在第五个方面，本发明提供了编码LCVR的核酸分子，其中该核酸分子是选自以下序列的序列:SEQ ID NO :9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、 143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259 和 263，或其至少具
有95 %同源性的基本上相同的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含由选自以下序列的核苷酸序列对所编码的 HCVR和 LCVR=SEQ ID NO :1/9、17/19、21/22、25/33、41/43、45/47、49/57、65/67、69/71、 73/81、89/91、93/95、97/105、113/115、117/119、121/129、137/139、141/143、145/153、 161/163、165/167、169/177、185/187、189/191、193/201、209/211、213/215、217/225、 233/235、237/239、Μ1/Μ9、257/259和沈1/^63。在一个优选的实施方案中，此抗体或抗体片段包含由选自以下序列的核酸序列编码的HCVR/LCVR序列SEQ IDNO :161/163,209/211 和17/19。在一个更优选的实施方案中，此抗体或抗体片段包含由核酸序列SEQ ID NO 161/163 编码的 HCVR/LCVR。在第六个方面，本发明提供了一种包含HCDR3和LCDR3的抗体或抗原结合片段， 其中 HCDR3 结构域选自以下一组序列=SEQ ID NO :8、32、56、80、104、128、152、176、200、224 和 248 ；LCDR3 结构域选自以下一组序列:SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、160、184、208、 232和256。在一个优选的实施方案中，HCDR3/LCDR3序列为SEQ IDNO :152/160,8/16或 200/208。在一个更优选的实施方案中，HCDR3和LCDR3序列为SEQ ID NO :152和160。在另一个实施方案中，此抗体或抗体片段进一步包含选自以下一组序列的HCDRl 序列=SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、148、172、196、220 和 244，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的 HCDR2 序列=SEQ ID NO :6、30、54、78、102、126、150、174、198、 222和M6，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的HCDR3序列SEQID NO :8、32、 56、80、104、128、152、176、200、224和248，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的 LCDRl 序列=SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228 和 252，或与其基本上相似的序列；选自以下一组序列的 LCDR2 序列=SEQ ID NO :14、38、62、86、110、134、158、182、 206,230和252，或与其基本上相似的序列，以及选自以下一组序列的IXDR3序列SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、160、184、208、232和256，或与其基本上相似的序列。在一个优选的实施方案中，此抗体或抗原结合片段包含HCDR序列SEQ IDNO :148、150和152以及 LCDR 序歹Ij SEQ ID NO 156、158 禾口 160 ；HCDR 序列 SEQ ID NO :4、6 和 8 和 LCDR 序列 SEQ ID NO 12、14 和 16 ；以及 HCDR 序列 SEQ ID NO 196、198 和 200 和 LCDR 序列 SEQID NO :204、 206 和 208。根据某些实施方案，本发明提供了抗hIL_4R抗体或其抗原结合片段，它们含有选自以下一组序列的 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 序列SEQ ID NO 148/150/152/156/158/160 ；4/6/8/12/14/16 ；以及 196/198/200/204/206/208。含有这些 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 序列的代表性抗体包括被命名为 H4H098P (SEQ ID NO :148/150/152/156/158/160)、H4H083P (SEQ ID NO 196/198/200/204/206/208)，以及 H4H095P(SEQ ID NO :4/6/8/12/14/16)的抗体。在第七个方面，本发明的特点是包含HCDR3和IXDR3的人抗体或抗体片段，其中 HCDR3由选自以下一组序列的核苷酸序列编码:SEQ IDNO :7、31、55、79、103、127、151、175、 199、223和M7，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；且IXDR3由选自以下一组序列的核苷酸序列编码:SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、231 和 255，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列。在另一个实施方案中，本发明的特点是人抗体或抗体片段，其包含由选自以下序列的核苷酸序列编码的 HCDRl 结构域=SEQ ID NO :3、27、51、75、99、123、147、171、195、219 和M3，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由选自以下序列的核苷酸序列编码的HCDR2 结构域=SEQ ID NO :5、29、53、77、101、125、149、173、197、221 和 245，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；由选自以下序列的核苷酸序列编码的HCDR3结构域 SEQ ID NO :7、31、55、79、103、127、151、175、199、223 和 247，或其至少具有 95 % 同源性的基本上相同的序列；由选自以下序列的核苷酸序列编码的IXDRl结构域SEQ IDNO :11,35, 59、83、107、131、155、179、203、227和251，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列； 由选自以下序列的核苷酸序列编码的LCDR2结构域=SEQ ID NO :13、37、61、85、109、133、 157、181、205、2四和253，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列；以及由选自以下序列的核苷酸序列编码的 LCDR3 结构域=SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、 231和255，或其至少具有95%同源性的基本上相同的序列。在一个优选的实施方案中，抗体或抗原结合片段包含由核苷酸序列SEQ ID NO 147、149、151、155、157和159 ； 195、197、 199、203、205 和 207 ；以及 3、5、7、11、13 和 15 编码的 HCDR 和 LCDR 序列。在一个具体的实施方案中，本发明的抗hIL_4R抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO :162所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO :164所示氨基酸序列的LCVR，且其特征为在25°C和37°C时，Kd值分别为约IOOpM或以下(单体底物)或70pM或以下(二聚体底物)；Kd值分别为约160pM或以下(单体底物)或40pM或以下(二聚体底物)；以及 IC5tl值为约IOpM或以下(25pM 二聚体底物)或约IOOpM或以下QOOpM单体底物)，它既能阻断hIL-4也能阻断hIL-13的活性，其IC5tl为约30pM或以下(由生物分析法获得)并可与猴IL-4R交叉反应。 在一个具体的实施方案中，本发明的抗hIL_4R抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO 20所示氨基酸序列的LCVR，其特征为KD值为约450pM或以下(单体或二聚体底物)，IC5tl为约或40pM或以下(25pM 二聚体底物)或约IOOpM或以下QOOpM单体底物)，它既能阻断hIL-4也能阻断hIL-13的活性， 其IC5tl为约IOOpM或以下(由生物分析法获得)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗hIL_4R抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO :210所示氨基酸序列的HCVR和含有SEQ ID NO :212所示氨基酸序列的LCVR，其特征为分别在25°C和37°C时，Kd值为约50pM或以下(单体底物)或30pM或以下(二聚体底物)；Kd值为约200pM或以下(单体底物)或40pM或以下(二聚体底物)；以及IC5tl值为约 IOpM或以下(25pM 二聚体底物)或约90pM或以下QOOpM单体底物)，它既能阻断hIL_4 也能阻断hIL-13的活性，其IC5tl为约25pM或以下(由生物分析法获得)且不与猴IL-4R 交叉反应。在第八个方面，本发明的特点是与hIL_4R特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含三个重链和三个轻链互补决定区(HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDRl、LCDR2、LCDR3)，其中 HCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO 265) 的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp 或 Ser ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 266)的氨基酸序列，其中 X1 = Ile 或 Leu, X2 = Ser，X3 = Gly, Tyr 或 Arg，X4 = Ser、Asp 或 Thr，X5 = Gly 或 kr，X6 = Gly、Ser 或 Val，X7 = Ser 或 Asn，且 X8 = Thr、Lys 或 Ile ； HCDR3 包含结构式为 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-Xi2-X13-X14-X15-XW-X17-X18 (SEQ ID NO 267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = Lys，X3 = Asp、Glu 或 Trp，X4 = Gly 或 Arg， X5 = Leu、Thr 或 Arg, X6 = Gly、Arg 或 Ser, X7 = Ile 或 Gly，X8 = Thr、Phe 或 Tyr, X9 = Ile，Asp 或 Phe，X10 = Arg、Tyr 或 Asp，X11 = Pro,Tyr 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr 或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 = Val 或缺失；LCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11 (SEQ ID NO :268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp, Ser 或 Val，X3 = Ile 或 Leu，X4 = Ser, Leu 或 Asn，X5 =Asn、Tyr 或 Ile，X6 = Trp、Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10 = Asn 或缺失；且 X11 = Tyr 或缺失；LCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3 (SEQ ID NO 269) 的氨基酸序列，其中X1 = Leu、Ala或Val，X2 =Ala或Gly，且X3 = Ser ；且LCDR3包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met，X2 = Gin, X3 = Ala 或 Tyr，X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 kr，X6 = Thr、Phe 或 His, X7 = Pro, X8 =Tyr, lie 或 Trp,且 X9 = Thr0在一个更具体的实施方案中，HCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Arg ；X6 = Asp 或 kr ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 266)的氨基酸序列，其中 X1 = lie, X2 = Ser, X3 = Gly 或 Tyr, X4 = Ser 或 Thr，X5 = Gly, X6 = Gly 或 kr，X7 = Asn,且 X8 = Thr 或 Lys ；HCDR3 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6 -X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18 (SEQ ID NO 267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala， X2 = Lys, X3 = Asp 或 Glu，X4 = Gly 或 Arg，X5 = Leu 或 Arg，X6 = Gly 或 kr，X7 = Ile 或 Gly, X8 = Thr 或 Phe，X9 = Ile 或 Asp，X10 = Arg 或 Tyr，X11 = Pro 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X^ = Leu或缺失，X17 = Asp 或缺失，且 X18 = Val 或缺失；LCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQID NO 268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Ser 或 Val，X3 = Ile 或 Leu，X4 = Leu 或 Asn, X5 = Asn 或 Tyr，X6 = Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；X10 = Asn 或缺失；且 X11 = Tyr 或缺失；LCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3 (SEQ ID NO 269) 的氨基酸序列，其中X1 = Leu或Ala，X2 = Ala或Gly和X3 = kr ；且IXDR3包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或Met，X2 = Gln, X3 = Ala 或 Tyr, X4 = Leu 或 Asn, X5 = Gln 或 Ser, X6 = Thr 或 His, X7 = Pro, X8 = Tyr 或 Trp，且 X9 = Thr0在另一个更具体的实施方案中，HCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO 265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ； X6 = Asp ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO 266)的氨基酸序列，其中 X1 = Ile 或 Leu, X2 = Ser，X3 = Gly 或 Arg，X4 = Ser 或 Thr，X5 =Gly 或 Ser，X6 = Gly 或 Val，X7 = Ser 或 Asn，且 X8 = Thr 或 Ile ；HCDR3 包含结构式为 X ^X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18(SEQ IDNO :267)的氨基酸序列， 其中 X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Asp 或 ρ，X4 = Gly 或 Arg，X5 = Leu 或 Thr，X6 = Arg 或 Ser,X7 = Ile 或 Gly，X8 = Thr ^ Tyr,X9 = Ile 或 Phe，X10 = Arg 或 Asp,X11 = Pro、Tyr 或缺失，X12 = Arg或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu 或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 = Val或缺失；LCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (SEQ ID NO :268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp 或 Ser，X3 = Ile 或 Leu,X4 = Ser 或 Leu，X5 = Tyr 或 Ile，X6 = Trp 或 kr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失； X9 = Tyr或缺失；Xiq = Asn或缺失；且X11 = Tyr或缺失；LCDR2包含结构式为X1-X2-X3GEQ ID NO 269)的氨基酸序列，其中 X1 = Leu 或 Val，X2 = Ala 或 Gly，且 X3 = Ser ；且 LCDR3 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或 Met, X2 = Gin, X3 = Ala, X4 = Leu 或 Asn，X5 = Gln 或 kr，X6 = Thr 或 Phe，X7 = Pro, X8 =Tyr 或 lie，且 X9 = Thr0在第九个方面，本发明提供了含有得自HCVR和LCVR对的HCDR1/HCDR2/HCDR3/ IXDR1/IXDR2/IXDR3序列的抗体或抗原结合片段，其中HCVR/LCVR序列选自以下一组序列 SEQ ID NO :162/164、21(V212和18Λ0。在一个更具体的实施方案中，重链和轻链CDR序列为包含在HCVR SEQ ID NO :162和LCVR SEQ ID NO :164中的序列。在另一个更具体的实施方案中，重链和轻链⑶R序列为包含在HCVR SEQID NO: 18和LCVR SEQ ID NO :20中的序列。在另一个具体的实施方案中，重链和轻链⑶R序列为包含在HCVR SEQ ID NO :210和 LCVRSEQ ID NO 212 中的序列。本发明涵盖了具有经修饰的糖基化模式的抗hIL_4R抗体。在某些应用中，进行修饰以除去不需要的糖基化位点可能是很有用的，例如在寡糖链上缺少岩藻糖基元的抗体， 可以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参阅Siield等人000 JBC 277 26733)。在其它一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。在第十个方面，本发明提供了带有本发明核酸分子的重组表达载体以及包含这些载体的宿主细胞，以及通过培养本发明的宿主细胞而制备本发明的抗体或抗原结合片段的方法。此宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，优选的宿主细胞为大肠杆菌细胞或哺乳动物细胞，如CHO细胞。
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在第十一个方面，本发明的特点是组合物，其包含与hIL_4R特异性结合的重组人抗体和可接受的载体。在第十二个方面，本发明的特点是利用本发明的抗体或其抗原结合部分抑制 hIL-4活性的方法。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体还能阻断与hIL-4R结合的 hIL-13/hIL-13Rl复合物。在一个实施方案中，本发明的方法包括使本发明的抗体或其抗原结合部分与hIL-4R接触，从而抑制hIL-4或hIL-4/hIL-13的活性。在另一个实施方案中， 本发明的方法包括给患有可通过抑制hIL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到改善的疾病的人类受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。所治疗的疾病是可通过消除、抑制或降低 hIL-4或hIL-4/hIL-13活性而得到改善、好转、抑制或预防的任何疾病或病症。用本发明的抗体或抗体片段治疗的IL-4相关疾病包括例如关节炎(包括脓毒性关节炎)、疱疹(herpetiformis)、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病 (Whipple' s Disease)、良性前列腺增生、肺病，如轻度、中度和重度哮喘、炎症性疾病，如炎症性肠病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生综合征、自体免疫溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核(病)和肾病。在阅读下面的详细说明后，本发明的其它目标和优势将变得明显。详细说明在描述本发明的方法之前，应当理解，本发明并不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应当理解，本文所用的术语只是出于描述具体实施方案的目的，并非意在加以限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文所用的一切技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通专业人员通常理解的同样的含义。尽管任何与本文所述的方法和材料类似或相当的方法和材料均可采用，但下面描述的是优选的方法和材料。定义本文所用的术语“人IL4R” (hIL-4R)意指与白细胞介素-4(IL_4)、IL-4Ra (SEQ ID NO :274)特异性结合的人细胞因子受体。术语“人白细胞介素-13”(hIL-13)意指与 IL-13受体特异性结合的细胞因子，“hIL-13/hIL-13Rl复合物”意指由hIL_13与hIL_13Rl 复合物结合而形成的复合物，该复合物与hIL-4受体结合以启动生物活性。本文所用的术语“抗体”指由四条多肽链即由二硫键互联的两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。 重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CLl)。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个 ⑶R和四个FR组成，从氨基酸末端到羧基末端按下列次序排列FR1、⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、 CDR3、FR4。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”或“抗体片段”)指抗体中保留了与抗原(如hIL-4R)特异性结合能力的一个或多个片段。业已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段来实现。抗体的“抗原结合部分”这一术语所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL1和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，即由铰链区的二硫键连接的两个F(ab)’片段组成的二价片段；(iii)由VH 和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(ν)由VH 结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989) NatureMl :544-546)；以及(vi)CDR。此外，尽管 Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的，但它们可通过重组方法，由一种合成的接头连接在一起而成为单独的相连的链，其中VL和VH区配对而形成单价分子(称为单链 Fv(scFv)；参阅例如 Bird 等人(1988)kience 242 :423-426 ；以及 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合部分”的术语范围内。其它形式的单链抗体，如双特异抗体也涵盖在内(参阅如Holliger等人(1993)Proc. Natl. Acad Sci. USA 90 :6444-6448)。本文所用的“中和”或“阻断”抗体意指其与hIL_4R的结合造成对hIL-4和/或 hIL-13生物活性抑制的抗体。这种hIL-4和/或IL-13生物活性的抑制可通过测量本领域众所周知的一个或多个hIL-4/或hIL-13生物活性指标，如hIL-4/或hIL_13诱导的细胞活化和hIL-4与hIL-4R的结合等指标来评估(参阅下面的实施例)。“CDR”或互补决定区是散布在较保守的被称为框架区(FR)的区域内的超变区。在本发明的抗hIL-4R抗体或片段的不同实施方案中，FR可能与人种系序列相同，或者可能经过天然或人工修饰。本文所用的术语“表面等离振子共振”指的是一种光学现象，它使得可通过检测一种生物传感器基质中蛋白质浓度的改变来进行实时互动分析，例如使用BIAC0RE 系统 (Pharmacia Biosensor AB)进行分析。术语“表位”是与抗体分子中称为互补位的可变区之特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可能有一个以上表位。表位可为构象的，也可为线性的。构象表位是由线性多肽链不同片段上空间并列排布的氨基酸产生的。线性的表位是由多肽链上相邻的氨基酸残基形成的。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基，或磺酰基部分。术语“基本同一性”或“基本上相同”当其指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，用下述任何著名的序列同一性计算程序如FASTA、BLAST或Gap计算，在至少约95%，更优选在至少约96%、97%、98% 或99%的核苷酸碱基中具有核苷酸序列同一性。当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意为当以GAP或BESTFIT等程序用默认空位权重进行最佳比对时，两个肽序列至少具有95%的序列同一性，更优选的是至少具有98%或99%的序列同一性。更优选的是，不相同的残基位置的区别在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样的取代，其中氨基酸残基被另一个含有具有类似化学性质(如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会从实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或两个以上氨基酸序列由于保守的取代而彼此不同的情况下，可向上调节序列同一性百分数或类似程度，以修正取代的保守性。进行这种调节的方法为本领域的专业人员所熟知。参阅如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24 :307-331。含有具有类似化学性质侧链的氨基酸群的实例包括(1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；( 脂族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；C3)含酰胺侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；( 碱性侧链 赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守的氨基酸取代群为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代可以是在Gonnet等人(199》kience 256 :1443-1445所披露的PAM250对数-似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守的”取代是PAM250对数-似然矩阵中具有非负值的任何变化。多肽的序列相似性也称为序列同一性，通常是由序列分析软件测量的。蛋白质分析软件利用各种取代、删除和其它修饰，包括保守的氨基酸取代的相似性测量值来对相似的序列进行匹配。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit等程序，可用默认参数来确定密切相关的多肽例如来自不同生物种的同源多肽的序列同源性或序列同一性，或确定野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性，参阅如GCG 6.1版。还可以用GCG 6. 1版中的FASTA程序，用默认或建议的参数来比较多肽序列。FASTA(如FASTA2 和FASTA3)提供了查询的和搜索到的序列之间最佳迭合区域的比对和序列同一性百分数 (Pearson (2000)，如上)。当对本发明的序列和包含大量源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一种优选的计算程序是计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，在比较时采用默认参数。参阅如 Altschul 等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 和 Altschul 等人 (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389_402。人抗体的制备产生人抗体的方法包括美国专利6，596，541, Green等人(1994)NatureGenetics 7 :13-21)，以及美国专利5，545，807和6，787，637中描述的方法。可采用本领域已知的任何方法对啮齿类动物进行免疫(参阅如Harlow and Lane (1988)Antibodies:A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory ； Malik and Lillehoj (1994) Antibody Techniques, Academic Press，CA)。本发明抗体的优选制备方法是采用VEL0CIMMUNE 技术(美国专利6，596，541)。利用所研究抗原激发其中内源免疫球蛋白重链和轻链可变区被对应的人可变区取代的转基因小鼠，并从表达抗体的小鼠收获淋巴细胞(如B-细胞)。淋巴细胞可与骨髓瘤细胞系融合来制备永生杂交瘤细胞系，然后对这种杂交瘤细胞系进行筛选，以识别能产生对所研究抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来并与所需的重链和轻链同种型恒定区连接。这样的抗体蛋白质可在细胞，如CHO细胞中形成。或者，编码抗原特异的嵌合抗体或轻链和重链可变区的DNA可直接从抗原特异的淋巴细胞中分离出来。编码抗体的重链和轻链可变区的DNA可被分离出来并有效连接到编码人重链和轻链恒定区的DNA上。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达该DNA。在一个具体的实施方案中，该细胞为CHO细胞。抗体可能具有治疗作用，这种作用是通过阻断配体-受体相互作用或抑制受体组成部分的相互作用来实现的，而不是通过补体固定(补体依赖性细胞毒性)(CDC)和参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而杀死细胞来实现的。抗体的恒定区对抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是很重要的。因此，可根据是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同种型。人免疫球蛋白可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约为150-160kDa的稳定四链结构，其中二聚体通过链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，二聚体不是通过链间二硫键连接的，而是形成了由共价连接的轻链和重链组成的约为75-80kDa的分子(半抗体)。这些形式极难分离，甚至在亲和提纯后也是如此。第二种形式在各种完整的IgG同种型中出现的频度是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差别。事实上，人IgG4铰链的铰链区的单个氨基酸取代可将第二种形式 (Angal等人(1993)Molecular Immunology 30 :105)的出现频度显著地降低到利用人IgGl 铰链通常所观察到的水平。本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体。这类抗体可能是可取的，例如，可在生产中提高所需抗体形式的产率。优先，分离出具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和嵌合抗体。如下所述，鉴定抗体的特征并选择所需的特征，包括与hIL-4R结合亲和性、阻断hIL-4与hIL-4R结合的能力， 和/或对人蛋白质的选择性。用所需的人恒定区取代小鼠恒定区以产生本发明的完全人抗体，如野生型或经修饰的IgG4或IgGl (如SEQ ID NO :271、272、273)。尽管所选择的恒定区可依具体用途而改变，但高亲和性抗原结合和靶标特异性特征则在于可变区。表位作图和相关技术为了筛选与某特定表位结合的抗体，可进行常规交叉阻断分析，例如如上Harlow 和Lane所述的。其它方法包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(Reineke^KM)Methods Mol Biol 248 :443-63)或肽裂解分析。此外，还可采用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰等方法(Tomer (2000)Protein Science :9 :487-496)。修饰协助分类法(MAP)，又称为基于抗原结构的抗体分类法(ASAP)是一种将大量针对相同的抗原的单克隆抗体(mAb)按照每种抗体对化学或酶学修饰的抗原表面的结合特性的相似性进行分类的方法(美国专利申请公开书2004/0101920)。每一类别可能反映了独特的表位，它可能与另一类别所代表的表位显著不同或与之部分重迭。这一技术使得能快速过滤遗传上相同的抗体，从而使对特征的鉴定着重于遗传上显著不同的抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可促进带有所需特征的稀少杂交瘤克隆的识别。MAP可用来将本发明的hIL-4R抗体分成可与不同表位结合的抗体组。对改变固定化抗原的结构有用的试剂有酶如蛋白水解酶和化学试剂。抗原蛋白可固定在生物传感器芯片表面或聚苯乙烯珠上。后者可用例如分析法来处理，如多重 LUMINEX 检测分析(Luminex Corp. , TX)。由于LUMINEX 有能力处理多达100种不同聚苯乙烯珠的多重分析，该方法提供了几乎无限的具有各种修饰的抗原表面，结果在抗体表位特性分析方面比生物传感器分析有更高的分辨率。双特异性本发明的抗体可以是单特异、双特异或多特异抗体。多特异抗体可对靶标肽的不同表位显示特异性，或也可包含对一个以上靶标肽显示特异性的抗原结合域。参阅如Tutt 等人(1991) J. Immunol. 147 :60_69。人抗IL-4R抗体可被连接到另一个功能分子如另一个肽或蛋白质上，或与之共表达。例如，抗体或其片段可功能性地(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)与一个或多个其它分子如另一个抗体或抗体片段连接，以产生带有第二结合特异性的双特异或多特异抗体。治疗给药方式和配方本发明提供了包含本发明的抗IL-4R抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本发明的治疗组合物将与适当的载体、赋形剂以及其它制剂一起施用。这些制剂纳入配方是为了改善传送、递送和耐受性等。在所有药剂化学家熟知的药典雷氏药学大全 (Remington' s Pharmaceutical Sciences， Mack Publishing Company, Easton， PA)中可找到大量适当的配方。这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂(阳离子或阴离子)的液囊(如LIPOFECTIN )、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有碳蜡的半固体状混合物。另请参阅 Powell 等人“Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)JPharm Sci Technol 52:238-311。剂量随受药的受试者年龄和体型大小、目标疾病、症状、施用途径等不同而可以改变。当本发明的抗体用来治疗成人的各种与IL-4R相关的病症和疾病时，有利的是采用静脉给药本发明抗体，通常单剂按每公斤体重计约0. 01至约20mg/kg给药，更优选的是约 0. 02至约7、约0. 03至约5，或约0. 05至约;3mg/kg体重。根据病症的严重性，可对治疗的频度和持续时间进行调整。已知有各种药物递送系统可用来施用本发明的药物组合物，例如包在脂质体、微颗粒、微胶囊中的胶囊化，能够表达变异病毒的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参阅如mi 等人(1987),J.Biol. Chem. 262 :4429-4432)。引入药物的方法包括但不限于皮内、肌肉内、 腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜，和口腔等途径。该药物组合物可采用任何方便的途径施用，如通过灌注或静脉团注、上皮和粘膜层(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收，并可与其它生物活性药剂一起施用。施用方式可为全身性或局部性施用。该药物组合物也可通过液囊递送，尤其是通过脂质体液囊递送(参阅 Langer (1990) Science 249 :1527-1533 ;Treat 等人(1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (编著)，Liss, New York，第 353-365 页；Lopez-Berestein,同上，第 317-327 页；一般参阅如上。在某些情况下，该药物组合物可以受控释放系统递送。在一个实施方案中，可使用泵(参阅 Langer，如上 Jefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 :201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料(参阅Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise (编著)，CRC Pres. , Boca Raton，Florida (1974)。在又一个实施方案中，可在该药物组合物的目标附近放置受控释放系统，因此仅需要使用全身剂量的一部分(参阅如 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,同上，第 2卷，第 115-138页， 1984)。关于其它受控释放系统的讨论见Langer (1990) Science 249:1527-1533。注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些注射制剂可用已公开的方法制备。例如，注射制剂可通过将抗体或其盐溶于、悬浮于或乳化于惯常用于注射的无菌水介质或油介质的方式来制备。用于注射的水性介质有，例如生理盐水、 含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等。它们可与适当的增溶剂如醇(如乙醇)、多元醇 (如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[如聚山梨醇酯80、HC0-50 (氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加成物)等结合使用。所用的油介质有，如芝麻油、大豆油等。它们可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等结合使用。这样制备的注射剂最好封装在适当的安瓿瓶中。有利的是，上述用于口服或非经肠施用的药物组合物可制备成能容纳活性成分剂量的单位剂量形式。这样的单位剂量形式包括，如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。每个单位剂量所包含的上述抗体的量一般为约5到500毫克，尤其是在注射剂中，所包含的上述抗体的量最好为约5到100毫克；对于其它剂量形式，最好为约10到250毫克。单一治疗和联合治疗本发明的抗体和抗体片段对于治疗可通过降低IL-4活性而得到改善、抑制或者好转的疾病和紊乱很有用。这些疾病包括那些以IL-4异常表达或过度表达或宿主对IL-4生成的异常反应为特征的疾病。用本发明的抗体或抗体片段治疗的与 IL-4相关的疾病包括例如关节炎(包括脓毒性关节炎)、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、 肥大性瘢痕、Whipple病、良性前列腺增生、肺病，如哮喘(轻度、中度和重度)、炎症性疾病， 如炎症性肠病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合症、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生综合征、自体免疫溶血性贫血、巴雷特食管、 自体免疫葡萄膜炎、结核(病)、遗传过敏性皮炎、溃疡性结肠炎、纤维症和肾病(参阅美国专利 7，186，809)。本发明涵盖联合治疗，其中抗IL-4R抗体或抗体片段与第二种治疗药剂联合施用。共同给药和联合治疗并不限于同时给药，而是还包括在涉及给予患者至少一种其它治疗药剂的疗程中至少给予一次抗IL-4R抗体或抗体片段的治疗方案。第二种治疗药剂可能为另一种IL-4拮抗剂，如另一种抗体/抗体片段，或可溶的细胞因子受体、IgE拮抗剂、可通过吸入或其它适当方式给药的抗哮喘药物(皮质类固醇、非类固醇药剂、β激动剂、白三烯、拮抗剂、黄嘌呤类、氟替卡松、沙美特罗、舒喘宁)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗IL-4R抗体或抗体片段可与IL-I拮抗剂，如利纳西普(rilonac印t)或IL-13拮抗剂一起施用。第二种药剂可能包括一种或多种白三烯受体拮抗剂，以治疗诸如变应性发炎疾病， 如哮喘和过敏症。白三烯受体拮抗剂的实例包括但不限于孟鲁司特、普仑司特和扎鲁司特。 第二种药剂可包括细胞因子抑制剂，如一种或多种TNF (依那西普，ENBREL )、IL-9、IL-5或 IL-17拮抗剂。本发明还包括本文所述的任何抗IL-4R抗体或抗原结合片段在制备治疗疾病或症状的药物中的应用，其中的疾病或症状是通过消除、抑制或降低人白细胞介素-4(hIL-4) 活性而得到改善、好转或抑制的。这类疾病或症状的实例包括，例如，关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Wiipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核(病)、肾病、遗传过敏性皮炎以及哮喘。
实施例我们提供以下实施例以便向本领域普通技术人员就如何制备本发明的组合物和如何使用本发明的方法提供完整的披露和说明，它们并非意在限制本发明之发明人所认为的发明的范围。已经作出努力以保证所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但是，也应考虑到会有一些实验误差和偏差。除非另外注明，份数为重量份数，分子量为平均分子量， 温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。实施例1.人IL-4受体人抗体的生成将VEL0CIMMUNE 小鼠(Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ；US 6，596，541) 用人 IL-4R(hIL-4R，SEQ ID NO :274)或 hIL_4R 和食蟹猴(Macaca fascicularis) IL-4R(mfIL-4R,SEQ ID NO 275)蛋白质或DNA的组合进行免疫。为了获得最佳免疫反应，随后每3-4周对动物进行加强免疫并在每次加强免疫后10天获得血样以评估抗抗原反应的进展。当小鼠达到最大免疫反应时，收获表达抗体的B细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。或者，不与骨髓瘤细胞融合而直接从B细胞分离抗原特异的抗体，如美国专利公开书2007/(^80945Α1所述，该公开书特别通过引用而以其整体纳入本文。从分离的适当重组细胞建立了稳定的表达抗体的重组CHO细胞系。通过筛查杂交瘤或转染细胞的条件培养基的特异性、抗原结合亲和性以及阻断hIL-4与hIL-4R结合的效能(如下所述)，选择了具有所需功能的单克隆抗体。通过前述方法获得了几种抗hIL-4R抗体，包括被命名为H4H083P、H4H094P和 H4H095P、H4H098P和H4H099P的代表性抗体。这些代表性抗hIL_4R抗体以及它们的生物特性将在以下实施例中更为详细地叙述。实施例2.抗原结合亲和性测定利用实时生物传感器表面等离振子共振分析(BIAC0RE 2000)，于25°C或37°C测定了所选择抗体相对于hIL-4R的结合亲和性(Kd)。简言之，将抗体捕获到通过与BIAC0RE 芯片直接偶联而产生的山羊抗hFc多克隆抗体的表面上，以形成抗体得到捕获的表面。在 25°C或37°，将各种不同浓度(范围从50nM到12. 5nM)的单体hIL_4R(R&DSystems)或二聚体hIL-4R-mFc注射到抗体得到捕获的表面，注射速率为10 μ Ι/min，注射时间为2. 5分钟。对抗原与抗体的结合以及所结合复合物的离解进行实时监控。利用BIA评估软件进行动力学分析确定了平衡解离常数(Kd)和解离速率常数。还利用BIA评估软件计算了抗原/ 抗体复合物解离的半衰期(T1/2)。其结果如表1所示。NB 在实验条件下未观察到抗体-抗原结合。对照完整的人抗IL-4R抗体(美国专利7，186，809 ；SEQID NO 10和12)。表 权利要求
1.一种与人白细胞介素-4受体(hIL-4R) (SEQ ID NO :274)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVI )和轻链可变区(LCVI )，其中抗体或抗原结合片段包含(a)含有如SEQID NO :162所示氨基酸序列的HCVR和含有如SEQID NO :164所示氨基酸序列的LCVR，其特征为与hIL-4R的亲和性(Kd)为约IOOpM或以下；(b)含有如SEQID NO 18所示氨基酸序列的HCVR和含有如SEQID N0:20所示氨基酸序列的LCVR，其特征为与hIL-4R的亲和性(Kd)为约300pM或以下；或(c)含有如SEQID NO :210所示氨基酸序列的HCVR和含有如SEQID NO :212所示氨基酸序列的LCVR，其特征为与hIL-4R的亲和性(Kd)为约50pM或以下。
2.一种与人白细胞介素-4受体(hIL-4R) (SEQ ID NO :274)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区3 (HCDR3)和轻链互补决定区3(LCDR3)，其中抗体或抗原结合片段包含(a)含有如SEQID NO :152所示氨基酸序列的HCDR3和如SEQ IDNO 160所示氨基酸序列的IXDR3 ；(b)含有如SEQID NO 8所示氨基酸序列的HCDR3和如SEQ IDNO 16所示氨基酸序列的LCDR3 ；或(c)含有如SEQID NO :200所示氨基酸序列的HCDR3和如SEQ IDNO :208所示氨基酸序列的IXDR3。
3.一种与人IL-4R特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含重链互补决定区 1 (HCDRl)、重链互补决定区12(HCDR2)、重链互补决定区13(HCDR3)以及轻链互补决定区 1 (IXDRl)、轻链互补决定区2 0XDR2)、轻链互补决定区3 (IXDR3)，其中HCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ IDNO :265)的氨基酸序列，其中 X1 = Gly ；X2 = Phe ；X3 = Thr ；X4 = Phe ；X5 = Asp 或 Arg ；X6 = Asp 或 Ser ；X7 = Tyr ；且 X8 = Ala 或 Gly ；HCDR2 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO :266)的氨基酸序列，其中 X1 =Ile 或 Leu，X2 = Ser, X3 = Gly, Tyr 或 Arg，X4 = Ser,Asp 或 Thr，X5 = Gly 或 kr，X6 = Gly、Ser 或 Val，X7 = Ser 或 Asn，且 X8 = Thr、Lys 或 Ile ；HCDR3 包含结构式为 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Xw (SE Q ID NO 267)的氨基酸序列，其中 X1 = Ala, X2 = Lys，X3 = Asp、Glu 或 Trp，X4 = Gly 或 Arg, X5 = Leu、Thr 或 Arg，X6 = Gly、Arg 或 kr，X7 = Ile 或 Gly，X8 = Thr、Phe 或 Tyr，X9 =lie、Asp 或 Phe，X10 = Arg、Tyr 或 Asp，X11 = Pro, Tyr 或缺失，X12 = Arg 或缺失，X13 = Tyr或缺失，X14 = Tyr或缺失，X15 = Gly或缺失，X16 = Leu或缺失，X17 = Asp或缺失，且X18 =Val或缺失；LCDRl 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11 (SEQ ID NO :268)的氨基酸序列，其中 X1 = Gin, X2 = Asp、Ser 或 Val，X3 = Ile 或 Leu，X4 = kr、Leu 或 Asn，X5 = Asn、 Tyr 或 lie，X6 = Trp, Ser 或 Tyr ；X7 = Ile 或缺失；X8 = Gly 或缺失；X9 = Tyr 或缺失；Xiq =Asn或缺失；且X11 = Tyr或缺失；LCDR2包含结构式为X1-X2-X3(SEQ ID NO :269)的氨基酸序列，其中X1 = Leu、Ala或 Val，X2 = Ala 或 Gly，且 X3 = Ser ；且LCDR3 包含结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO :270)的氨基酸序列，其中 X1 = Gln 或 Met，X2 = Gin, X3 = Ala 或 Tyr，X4 = Leu 或 Asn，X5 = Gln 或 kr，X6 = Thr, Phe 或 His, X7 = Pro, X8 = Tyr、lie 或 Trp,且 X9 = Thr。
4.如权利要求3所述之抗体或抗体片段，其中重链和轻链CDR氨基酸序列(HCDR1、 HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2、LCDR3)选自以下一组序列(a)SEQID NO :148、150、152、156、158、160 ；(b)SEQID NO :4、6、8、12、14、16 ；以及(c)SEQID NO :196、198、200、204、206、208。
5.一种核酸序列，其编码如权利要求1至4中任何一项所述之抗体或抗原结合片段的 HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 以及 LCDR3 序列。
6.一种含有如权利要求5所述之核酸序列的载体。
7.一种用于生产抗体或抗体的抗原结合片段且包含如权利要求6所述之载体的宿主-载体系统。
8.—种生产与人白细胞介素-4受体α (hIL-4R)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在表达抗体或片段的条件下培养如权利要求7所述之宿主-载体系统的细胞，并收获所表达的抗hIL-4抗体。
9.如权利要求8所述之方法，其中宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
10.如权利要求9所述之方法，其中宿主细胞为大肠杆菌细胞或CHO细胞。
11.如权利要求1、2、3或4所定义之抗体或抗原结合片段在制备用于治疗疾病或症状的药物中的应用，其中所述的疾病或症状通过消除、抑制或降低人白细胞介素-4(hIL-4) 活性而得到改善、好转或抑制。
12.如权利要求11所述之应用，其中的疾病或症状选自以下一组疾病或症状关节炎、 疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Wiipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、 自体免疫葡萄膜炎、结核(病)和肾病。
13.如权利要求11所定义之应用，其中的疾病或症状是哮喘或遗传过敏性皮炎。
14.一种治疗疾病或症状的方法，其中所述的疾病或症状通过消除、抑制或降低人白细胞介素_4(hIL-4)活性而得到改善、好转或抑制，所述方法包括向需要的患者施用如权利要求1、2、3或4中任何一项所述之抗体或抗原结合片段。
15.如权利要求14所述之方法，其中的疾病或症状选自以下一组疾病或症状关节炎、 疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Wiipple病、良性前列腺增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Mrauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、 自体免疫葡萄膜炎、结核(病)和肾病。
16.如权利要求14所述之方法，其中的疾病或症状是哮喘或遗传过敏性皮炎。
全文摘要
一种分离的人抗体或其抗体片段，其以高亲和性(KD)与人白细胞介素-4受体α(hIL-4Rα)结合，能够阻断hIL-4和hIL-13的活性。
文档编号A61P37/08GK102197052SQ200980143007
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月27日 优先权日2008年10月29日
发明者J·H·马丁, J·L·费尔赫斯特, N·J·帕帕多普洛斯, T·T·黄 申请人:瑞泽恩制药公司
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