降低循环氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1复合物以治疗动脉粥样硬化的方法
专利名称：降低循环氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1复合物以治疗动脉粥样硬化的方法
降低循环氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1复合物以治疗
动脉粥样硬化的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2008年11月14日提交的美国临时专利申请号61/114，823的权益。领域本发明的实施方案涉及用于动脉粥样硬化的预防和治疗的降低循环氧化低密度脂蛋白-β_2-糖蛋白1复合物的含有天然多不饱和脂肪酸(PUFA)的烹饪油组合物。背景升高的循环胆固醇在动脉粥样硬化的发展中是已被证实的风险因子。动脉粥样硬化可被描述为这些血管中动脉壁变弱和血流变窄的过程。这一系列的事件在冠状动脉中频繁发生，引起至心脏的血流的阻塞并导致心肌梗死(心脏损害)；其常被称作冠心病(CHD)。治疗剂，比如他汀类药物，其控制血清胆固醇的浓度，在冠心病的治疗中已显示了一些有效性。这些剂通过抑制胆固醇自身合成来调节胆固醇运输脂蛋白的循环水平，但对诸如胆固醇吸收或氧化的下游事件没有影响，胆固醇吸收或氧化是启动动脉粥样硬化的必要步骤。然而，由于动物脂肪的高膳食摄入，并考虑到当饮食供给被认为不足时在肝和其它组织中胆固醇的人体的合成，胆固醇水平时常在向上压力下。脂蛋白的四种主要类别是已知的，其全部共有相似的由磷脂和载脂蛋白的两亲性表层所包围的脂质核的基本结构。脂质核越大，脂蛋白颗粒的密度越小。按照它们的尺寸的递增顺序高密度脂蛋白(HDL)，其通过从外周组织中清除胆固醇而形成脂质核，并因此常被称为“有益胆固醇”;低密度脂蛋白(LDL)，其在肝中由极低密度脂蛋白(VLDL)残余物形成；极低密度脂蛋白(VLDL)，其也在肝中生成并主要含有在小肠中形成的甘油三酯和乳糜微粒，且由甘油三酯和膳食脂肪组成。许多专利公开了作为有用的抗动脉粥样硬化剂的化合物。例如，美国专利第 4，681，893 号，其公开 7 "Method of Inhibiting cholesterol biosynthesis in a patient (在患者中抑制胆固醇生物合成的方法)”和美国专利第5，846，966号，其公开了 "Combinations of hydroxy-substituted azetidinone compounds and HMG CoA Reductase Inhibitors (羟基取代的氮杂环丁酮化合物和HMG辅酶A还原酶抑制剂的组合)”。此专利(US 4681893)和本申请中提到的所有其它专利和专利申请在此通过引用并入。更新证据支持了以下观点，即在动脉粥样硬化发病之前LDL需要经历一系列的转化和复合。推断的早期步骤是氧化LDL(oxLDL)的形成，其在动脉粥样硬化的发病中起关键作用。LDL的氧化修饰改变了其生物学性质，导致除从内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞产生的生长因子和细胞因子的调节外，单核细胞或T淋巴细胞的趋化性(chemotaxis)。已清楚地证明来自培养的内皮细胞的oxLDL的细胞毒性是致动脉粥样硬化的。这些研究清楚地显示了动脉壁中LDL的氧化的致动脉粥样硬化的机制，但后来的研究将更多重点放在患有冠心病的患者中的循环oxLDL水平的临床重要性上。利用针对丙二醛修饰的LDL (MDA-LDL) 和针对铜oxLDL制备的小鼠单克隆抗体使用免疫测定来测量循环oxLDL。新试验也显示了患有冠心病的患者中存在增高的OXLDL的血浆水平。升高的血浆oxLDL水平已被建立为CHD的生物化学风险标志物。oxLDL水平与诸如高血压、高脂血症或吸烟的其它风险因子缺乏关联表明提高的oxLDL水平是CHD的独立风险因子，且当与诸如总胆固醇、甘油三酯、apoB或HDL水平的其它生物化学标志物相比时，oxLDL水平和CHD 之间的关联是CHD的显著高级风险指标。通过内皮细胞的oxLDL的摄入也已被证明是动脉粥样硬化的启动和发展的关键步骤。粘附分子是炎性标志物，其通过oxLDL上调并在动脉粥样硬化形成中具有关键作用。 可能显示oxLDL影响CHD的另一个方式是通过促进动脉粥样硬化斑块中凋亡细胞的累积。已显示鱼油且更具体地鱼油的二十碳五烯酸(Eicosa Pentaenoic Acid) (EPA)、 二十二碳五炼酸(Docosa Pentaenoic Acid) (DPA)禾口二十二碳六炼酸(Docosa Hexaenoic Acid) (DHA)多不饱和脂肪酸(PUFA)成分具有作为强心兴奋剂的潜在用途。一些在人冠状动脉内皮细胞中进行的体外研究已表明EPA和DHA可减弱粘附分子的表达，这可能是鱼和鱼油的抗动脉粥样硬化作用的一个途径。在另一个实例中，已在大鼠模型中研究了膳食鱼油对主动脉血栓形成、血小板聚集和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，并显示了可能通过减少血小板聚集和氧化应激相关的动脉损伤来延迟动脉血栓形成。在单相化学系统中也已证实高度不饱和的EPA和DHA应该比含有较少双键的脂肪酸更易于氧化。先前的研究已显示具有不连续的极性相和非极性相的LDL与这些脂肪酸的富集并不增加氧化。Wander的研究(Lipids，第37卷，第8期，第789页，(2002))也已显示在U937细胞中由富含EPA/DHA的oxLDL引起的凋亡的程度与非富含EPA/DHA的oxLDL诱导的凋亡的程度相比显著较低，因此产生了以下结论，即，在PUFA补充后，富含EPA/DHA的oxLDL诱导的细胞凋亡减少且该减少与过氧化氢脂质的浓度无关。这结果表明EPA/DHA通过动脉壁中细胞凋亡的下降而并非通过氧化损伤的任何减少，提供对动脉粥样硬化的保护性作用。动脉粥样硬化还以由于脂质的过度累积，动脉壁逐渐增厚为特征。如Steinberg D.，J. Biol. Chem. ·第 272(34)卷，第 20963 页，(1997)和 Steinberg D.，Nature Med. 第8卷，第1211页，000 中所描述，促炎因子和血脂障碍是其发展的主要贡献者。低密度脂蛋白(LDL)是在动脉粥样硬化损伤或动脉粥样硬化斑块中累积的胆固醇的主要形式，但LDL必须首先被修饰成氧化的结构(oxLDL)以开始该过程，且如McMurray H.等人.J. Clinical. Med.，第92卷.第1004页.(1993)中所描述，修饰LDL成为oxLDL的最重要的促动脉粥样硬化机制是氧化应激。与天然LDL不同，oxLDL结合β 2GPI_糖蛋白以最终形成稳定的不可解离的复合物。(oxLDL-i32GPI复合物，氧化低密度脂蛋白-β_2_糖蛋白1复合物)。这些稳定的复合物被认为是病原性的且是临床上高度相关的，并作为促动脉粥样硬化抗原被涉及，且代表动脉粥样硬化血栓形成的血清学风险因子。MPO的作用髓过氧化物酶(MPO)是在嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达的血红素过氧化物酶-环氧合酶。MPO通过形成杀微生物活性氧化剂而参与先天免疫防御系统，所述杀微生物活性氧化剂比如有效的抗微生物剂次氯酸。但是，已报道次氯酸与核碱基反应导致5-氯尿嘧啶的形成，5-氯尿嘧啶是炎症过程中DNA损伤的标志物，其在人类动脉粥样硬化
组织中富集。最近已出现证据，即MPO来源的氧化剂促进组织损伤以及急性和慢性血管炎症疾病的启动和扩张。已显示MPO的循环水平是主要有害心脏事件的预测风险，且MPO来源的氯化化合物的特定水平是动脉粥样硬化疾病进程的已知的生物标志物。(Takeshita J，Byim J, Nhan TQ, Pritchard DK, Pennathur S, Schwartz SM 等人(2006)。 Myeloperoxidase generates 5-chlorouracil in human atherosclerotic tissue -.a potential pathway for somatic mutagenesis by macrophages (在人类动脉粥样硬化组织中髓过氧化物酶生成5-氯尿嘧啶通过巨噬细胞的体细胞突变发生的潜在途径).J.Biol. Chem.，281 3096-3104)。用于MPO催化的脂质蛋白的氧化的另一个指标是由次氯酸攻击和3-氯酪氨酸的形成所观察到，3-氯代酪氨酸已在人类动脉粥样硬化损伤和从这些损伤中提取的月旨蛋白中被鉴另lj (Hazen SL, Heinecke JW, 3-Chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidase-catalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima(髓过氧化物酶催化的氧化的特定标志物3-氯酪氨酸在由人类动脉粥样硬化内膜中分离的低密度脂蛋白中显著增高).J Clin Invest 99:2075-2081 (1997) ；Thukkani AK，McHowat J，Hsu FF， Brennan ML,Hazen SL,Ford DA,Identification of alpha—chloro fatty aldehydes and unsaturated lysophosphatidylcholine molecular species in human atherosclerotic lesions (人类动脉粥样硬化损伤中α -氯脂肪醛和不饱和溶血卵磷脂胆碱分子种类的鉴定)。Circulation 108:3128-3133(2003))。令人惊奇地，本发明人已发现在他们的日常饮食中使用含有富含混合PUFA的鱼油和/或海藻油的烹饪油制品一段持续的时间的患者显示了循环oxLDL-β 2GPI复合物的显著降低。从已知的和所描述的文献中不能得到烹饪油制品的积极作用。此外令人惊奇地，本发明人利用每天一次剂量的含PUFA混合物的鱼油胶囊的第二个试验追踪该非预期的结果，显示出与在烹饪油试验中所观察到的相同的循环 OXLDL-^2GPI复合物水平的令人惊奇的降低。在该结果的进一步扩展中，本发明人在主要含单一 PUFA(DHA)的油和含PUFA混合物(DHA、EPA、DPA)的油之间进行了对比试验，并显示了与主要含单一 PUFA的油相比混合的PUFA的令人惊奇的统计学上显著的OxLDL- β 2GPI 复合物水平的额外降低。在第四个试验中，本发明人发现，服用混合的PUFA的口服剂的患者与未治疗的对照组相比，循环MPO水平的令人惊奇的，统计学上显著的降低。概述本发明的实施方案包括通过供日治疗有效剂量的配制成烹饪油组合物的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多不饱和脂肪酸(PUFA)中的至少一种来减少循环oxLDL-β 2GPI复合物和髓过氧化物酶(MPO)的新方法提，其中将 EPA、DPA和DHA中的至少一种作为鱼油和/或海藻油的成分添加，并与一种或多种已知的烹饪油混合成稳定的烹饪油组合物，所述已知烹饪油诸如落花生油(groundnut oil)、米糠油、大豆油、玉米油、芝麻油、低芥酸菜子油、红花油、橄榄油、花生油(peanut oil)和/或其它植物油。本发明的一个实施方案包括通过每日向患者提供鱼油和或海藻油的胶囊来递送日治疗有效剂量的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多不饱和脂肪酸(PUFA)中的至少一种以降低循环OxLDL和MPO的方法。详述动脉粥样硬化以由于脂质的过度累积，动脉壁逐渐增厚为特征。促炎因子和血脂障碍是其发展的主要贡献者。低密度脂蛋白(LDL)是在动脉粥样硬化损伤或动脉粥样硬化斑块中累积的胆固醇的主要形式，但LDL必须首先被修饰成氧化的结构(oxLDL)以开始该过程，并且修饰LDL成为oxLDL的最重要的促动脉粥样硬化机制是氧化应激。与天然LDL不同，oxLDL结合i32GPI-糖蛋白1，以最终形成稳定的不可解离的复合物(oxLDL-i32GPI复合物)。起始反应是可逆的，且随后形成被认为(Inoue K.等人， Oxidized LDL/-i32GPI complexes. New aspects in atherosclerosis (氧化 LDL/-β 2GPI 复合物。动脉粥样硬化中的新方面).Lupus 14,736(2005))是病原性的且临床上高度相关的稳定的不可解离复合物。巨噬细胞的oxLDL的摄入由清除受体CD36所调节，其导致了动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞的形成。(Podrez Ε. A.等人，Macrophage scavenger receptor CD36 is the major receptor for LDL modified by monocyte-generated reactive nitrogen species (巨噬细胞清除受体⑶36是被单核细胞生成的活性氮物质修饰的LDL的主要受体)· J. Clin. Invest. 105 (8)，1085 (2000))。因为oxLDL- β 2GPI的摄入在抗β 2GPI抗体存在时显著增高，这种机制在解释动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞的发展时是生理学上相关的。因此oxLDL-i32GPI复合物已作为促动脉粥样硬化抗原被涉及，且代表血清学风险因子，和动脉粥样硬化血栓形成的贡献者。因此降低循环oxLDL-β 2GPI复合物是治疗动脉粥样化血栓形成的重要的药理学目标，并且是本发明的目的。利用在人类血浆中检测循环oxLDL-i32GPI复合物的基于双抗体“夹心”技术 (ELISA)的免疫测定，可准确测量循环oxLDL-β 2GPI复合物。用抗人β 2GPI的单克隆抗体涂布96孔板的孔，所述单克隆抗体将与导入到孔中的任何i32GPI结合。利用针对人apoBlOO 的辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体检测结合的oxLDL-β 2GPI。利用发色团试剂四甲基联苯胺(TMB)通过测量HRP的酶活性，测定oxLDL-β 2GPI复合物的浓度，所述四甲基联苯胺(TMB)形成在450nm处测得的独特的黄色。利用分光光度计测量所产生的颜色的强度，其与结合oxLDL-β 2GPI复合物的量成正比。依据利用已知的复合物溶液制备的标准曲线标绘结果，以实现在测试的血浆中循环oxLDL-β 2GPI复合物的准确测量。可通过将标准烹饪油与7. 5% w/w海藻油混合而制备本发明的烹饪油，其含有混合的最少的35% EPA(20% )和DHA(80% )。试验所选择的标准烹饪油通常使用落花生油 (groundnut oil)和葵花籽油。混合过程在封闭系统中在氮气下(以阻止氧化)进行，且温度在20-40摄氏度之间。已进行了开放式标记随机研究，以评估这种烹饪油与健康的蔬菜烹饪油(即落花生油和葵花籽油)相比，对患有血脂障碍的患者中的循环oxLDL-i32GPI复合物的作用。选择年龄在18-60岁之间的、任意性别的、血清LDL胆固醇水平在130_250mg/DL 且血清甘油三酯水平在150-500mg/DL的患者。患有已知冠心病的患者，接受血脂障碍的饮食治疗的患者，接受他汀类(statins)/贝特类(fibrates)或其它降低脂质药物的患者， 患有严重肝病或肾脏损伤的患者或妊娠期/泌乳期女性，均从本研究的潜在库(potential pool)中排除。每位患者都受到起始、中间(每月)和最终(三个月)的全面身体检查，以能够在试验期间评估效力和副作用，所述全面身体检查由测量血小板的RBC、心电图、12小时空腹血脂特征、空腹血糖、甲状腺特征、肝功能测验和肾功能测验组成。按照男性和女性的大致相等的比例募集了 48位健康患者，利用SAS 8. 2版随机分成A、B和C三组，按如下开始治疗A组-3x500ml用于普通烹饪目的的含有7. 5% w/w海藻油的烹饪油，经三个月时间。B组-3x500ml用于普通烹饪目的的标准落花生油，经三个月时间。C组-3x500ml用于普通烹饪目的的标准葵花籽油，经三个月时间。在第二个试验中，将按如上新随机选择并筛选的48位健康患者分成两组，A组为未治疗的，且第二组B组每天一次被给予商业上可获得的鱼油胶囊(h500mg)，每天早晨与早餐一起服食，持续1个月。利用与以上第一个试验相同的方法在第1天和第30天测量循环oxLDL-β 2GPI复合物的水平。在第三个试验中，本发明人用补充量的主要为单独PUFA和混合的PUFA对比喂养 24只豚鼠4周，以测定每一种在降低循环oxLDL- β -2糖蛋白复合物中的效力。使用了 80% DHA,20 % EPA (AO)的 PUFA 组合对比其中 PUFA 浓度为；35 % DHA,35 % EPA 和 30 % DPA (SO) 的组合，且利用与以上第一个试验所描述的相似的方法测量循环OxLDL-i32GPI。在第4个试验中，将新随机选择并筛选的M位人类患者分成两组，C组为未治疗的，且第二组FO组每天一次被给予商业上可获得的鱼油胶囊(h500mg)，每天早晨与早餐一起服食，持续1个月。在第1天和尽可能接近第30天时测量循环MPO水平。利用检测人血浆中循环MPO的基于双抗体“夹心”技术(ELISA)的免疫测定准确测量循环ΜΡ0。实验结果在第一个试验中，其中患者使用含有7. 5% w/w海藻油的烹饪油对比葵花籽烹饪油和落花生烹饪油，采集血浆并测量循环oxLDL-i32GPI复合物，得到本文中所描述的结果。首先绘制oxLDL- β 2GPI复合物浓度曲线，系列稀释对照标准溶液，对于每个浓度测量吸光度(在450nm处)并绘制校准曲线，同时重复两次测量M个未知的血浆样品，以测量这些样品的oxLDL-i32GPI复合物的未知浓度，如下表1中所示。A1-F2孔中显示的是标准溶液，而A3-H8孔中显示的是重复两次进行的患者血浆样品。患者血浆样品孔中的编号代表患者数码，且字母I =起始血浆样品，1M、2M= 1个月或2个月中间血浆样品，且F =最终血浆样品。然后将由表1所得的校准标准吸光度标绘成校准曲线，并从曲线中推导出二阶多项式方程。y = 3. 6382x2+89. 54χ_0· 1227R2 = 0. 9999表 权利要求
1.作为动脉粥样硬化的预防和治疗的手段的减少人血清中循环oxLDL-β-2-糖蛋白1 复合物和循环髓过氧化物酶的方法，所述方法包括向人施用有效量的含有l-99wt%多不饱和脂肪酸(PUFA)的膳食油组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述膳食油组合物还包括可食用烹饪油； 所述组合物包括以下的脂肪酸分布⑴饱和脂肪酸(SFA) 15-55wt% ；(ii)单不饱和脂肪酸(MUFA)40-80wt%；禾口(iii)多不饱和脂肪酸(PUFA)5-45wt%。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述膳食油组合物通过胶囊施用，所述胶囊含有包括以下的脂肪酸分布的膳食油组合物⑴饱和脂肪酸(SFA) 5-10wt% ；(ii)单不饱和脂肪酸(MUFA)5-10wt% ；和(iii)多不饱和脂肪酸(PUFA)20-90wt%。
4.如权利要求1所述的方法，其中优选的多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳五烯酸(DPA)以分别为0. 5-1,0. 1-1,0. 1-0. 5的比例的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述PUFA组分包括至少一种选自由海油和海藻油组成的组的油，其中所述海油包括EPA、DHA, DPA和天然抗氧化剂的混合物。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述可食用烹饪油包括植物油。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述可食用烹饪油包括选自由落花生油、米糠油、大豆油、玉米油、芝麻油、低芥酸菜子油、红花油、橄榄油和花生油组成的组的油。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述可食用烹饪油还包括维生素A、维生素D、维生素 E或抗氧化剂植物提取物中的至少一种。
9.一种用于生产权利要求2的膳食油组合物的方法，所述方法包括a)将可食用的烹饪油装入容器中；b)将至少一种选自由海油和海藻油组成的组的油添加到所述容器中；并c)搅拌所述油直到混合。
全文摘要
通过向受试者施用有效量的包括多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的膳食油组合物来减少循环氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白I复合物和循环髓过氧化物酶水平以治疗动脉粥样硬化的方法。
文档编号A61P9/10GK102202661SQ200980144263
公开日2011年9月28日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月14日
发明者博米·P·弗莱姆罗兹 申请人:博米·P·弗莱姆罗兹
降低循环氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1复合物以治疗
动脉粥样硬化的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2008年11月14日提交的美国临时专利申请号61/114，823的权益。领域本发明的实施方案涉及用于动脉粥样硬化的预防和治疗的降低循环氧化低密度脂蛋白-β_2-糖蛋白1复合物的含有天然多不饱和脂肪酸(PUFA)的烹饪油组合物。背景升高的循环胆固醇在动脉粥样硬化的发展中是已被证实的风险因子。动脉粥样硬化可被描述为这些血管中动脉壁变弱和血流变窄的过程。这一系列的事件在冠状动脉中频繁发生，引起至心脏的血流的阻塞并导致心肌梗死(心脏损害)；其常被称作冠心病(CHD)。治疗剂，比如他汀类药物，其控制血清胆固醇的浓度，在冠心病的治疗中已显示了一些有效性。这些剂通过抑制胆固醇自身合成来调节胆固醇运输脂蛋白的循环水平，但对诸如胆固醇吸收或氧化的下游事件没有影响，胆固醇吸收或氧化是启动动脉粥样硬化的必要步骤。然而，由于动物脂肪的高膳食摄入，并考虑到当饮食供给被认为不足时在肝和其它组织中胆固醇的人体的合成，胆固醇水平时常在向上压力下。脂蛋白的四种主要类别是已知的，其全部共有相似的由磷脂和载脂蛋白的两亲性表层所包围的脂质核的基本结构。脂质核越大，脂蛋白颗粒的密度越小。按照它们的尺寸的递增顺序高密度脂蛋白(HDL)，其通过从外周组织中清除胆固醇而形成脂质核，并因此常被称为“有益胆固醇”;低密度脂蛋白(LDL)，其在肝中由极低密度脂蛋白(VLDL)残余物形成；极低密度脂蛋白(VLDL)，其也在肝中生成并主要含有在小肠中形成的甘油三酯和乳糜微粒，且由甘油三酯和膳食脂肪组成。许多专利公开了作为有用的抗动脉粥样硬化剂的化合物。例如，美国专利第 4，681，893 号，其公开 7 "Method of Inhibiting cholesterol biosynthesis in a patient (在患者中抑制胆固醇生物合成的方法)”和美国专利第5，846，966号，其公开了 "Combinations of hydroxy-substituted azetidinone compounds and HMG CoA Reductase Inhibitors (羟基取代的氮杂环丁酮化合物和HMG辅酶A还原酶抑制剂的组合)”。此专利(US 4681893)和本申请中提到的所有其它专利和专利申请在此通过引用并入。更新证据支持了以下观点，即在动脉粥样硬化发病之前LDL需要经历一系列的转化和复合。推断的早期步骤是氧化LDL(oxLDL)的形成，其在动脉粥样硬化的发病中起关键作用。LDL的氧化修饰改变了其生物学性质，导致除从内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞产生的生长因子和细胞因子的调节外，单核细胞或T淋巴细胞的趋化性(chemotaxis)。已清楚地证明来自培养的内皮细胞的oxLDL的细胞毒性是致动脉粥样硬化的。这些研究清楚地显示了动脉壁中LDL的氧化的致动脉粥样硬化的机制，但后来的研究将更多重点放在患有冠心病的患者中的循环oxLDL水平的临床重要性上。利用针对丙二醛修饰的LDL (MDA-LDL) 和针对铜oxLDL制备的小鼠单克隆抗体使用免疫测定来测量循环oxLDL。新试验也显示了患有冠心病的患者中存在增高的OXLDL的血浆水平。升高的血浆oxLDL水平已被建立为CHD的生物化学风险标志物。oxLDL水平与诸如高血压、高脂血症或吸烟的其它风险因子缺乏关联表明提高的oxLDL水平是CHD的独立风险因子，且当与诸如总胆固醇、甘油三酯、apoB或HDL水平的其它生物化学标志物相比时，oxLDL水平和CHD 之间的关联是CHD的显著高级风险指标。通过内皮细胞的oxLDL的摄入也已被证明是动脉粥样硬化的启动和发展的关键步骤。粘附分子是炎性标志物，其通过oxLDL上调并在动脉粥样硬化形成中具有关键作用。 可能显示oxLDL影响CHD的另一个方式是通过促进动脉粥样硬化斑块中凋亡细胞的累积。已显示鱼油且更具体地鱼油的二十碳五烯酸(Eicosa Pentaenoic Acid) (EPA)、 二十二碳五炼酸(Docosa Pentaenoic Acid) (DPA)禾口二十二碳六炼酸(Docosa Hexaenoic Acid) (DHA)多不饱和脂肪酸(PUFA)成分具有作为强心兴奋剂的潜在用途。一些在人冠状动脉内皮细胞中进行的体外研究已表明EPA和DHA可减弱粘附分子的表达，这可能是鱼和鱼油的抗动脉粥样硬化作用的一个途径。在另一个实例中，已在大鼠模型中研究了膳食鱼油对主动脉血栓形成、血小板聚集和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，并显示了可能通过减少血小板聚集和氧化应激相关的动脉损伤来延迟动脉血栓形成。在单相化学系统中也已证实高度不饱和的EPA和DHA应该比含有较少双键的脂肪酸更易于氧化。先前的研究已显示具有不连续的极性相和非极性相的LDL与这些脂肪酸的富集并不增加氧化。Wander的研究(Lipids，第37卷，第8期，第789页，(2002))也已显示在U937细胞中由富含EPA/DHA的oxLDL引起的凋亡的程度与非富含EPA/DHA的oxLDL诱导的凋亡的程度相比显著较低，因此产生了以下结论，即，在PUFA补充后，富含EPA/DHA的oxLDL诱导的细胞凋亡减少且该减少与过氧化氢脂质的浓度无关。这结果表明EPA/DHA通过动脉壁中细胞凋亡的下降而并非通过氧化损伤的任何减少，提供对动脉粥样硬化的保护性作用。动脉粥样硬化还以由于脂质的过度累积，动脉壁逐渐增厚为特征。如Steinberg D.，J. Biol. Chem. ·第 272(34)卷，第 20963 页，(1997)和 Steinberg D.，Nature Med. 第8卷，第1211页，000 中所描述，促炎因子和血脂障碍是其发展的主要贡献者。低密度脂蛋白(LDL)是在动脉粥样硬化损伤或动脉粥样硬化斑块中累积的胆固醇的主要形式，但LDL必须首先被修饰成氧化的结构(oxLDL)以开始该过程，且如McMurray H.等人.J. Clinical. Med.，第92卷.第1004页.(1993)中所描述，修饰LDL成为oxLDL的最重要的促动脉粥样硬化机制是氧化应激。与天然LDL不同，oxLDL结合β 2GPI_糖蛋白以最终形成稳定的不可解离的复合物。(oxLDL-i32GPI复合物，氧化低密度脂蛋白-β_2_糖蛋白1复合物)。这些稳定的复合物被认为是病原性的且是临床上高度相关的，并作为促动脉粥样硬化抗原被涉及，且代表动脉粥样硬化血栓形成的血清学风险因子。MPO的作用髓过氧化物酶(MPO)是在嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达的血红素过氧化物酶-环氧合酶。MPO通过形成杀微生物活性氧化剂而参与先天免疫防御系统，所述杀微生物活性氧化剂比如有效的抗微生物剂次氯酸。但是，已报道次氯酸与核碱基反应导致5-氯尿嘧啶的形成，5-氯尿嘧啶是炎症过程中DNA损伤的标志物，其在人类动脉粥样硬化
组织中富集。最近已出现证据，即MPO来源的氧化剂促进组织损伤以及急性和慢性血管炎症疾病的启动和扩张。已显示MPO的循环水平是主要有害心脏事件的预测风险，且MPO来源的氯化化合物的特定水平是动脉粥样硬化疾病进程的已知的生物标志物。(Takeshita J，Byim J, Nhan TQ, Pritchard DK, Pennathur S, Schwartz SM 等人(2006)。 Myeloperoxidase generates 5-chlorouracil in human atherosclerotic tissue -.a potential pathway for somatic mutagenesis by macrophages (在人类动脉粥样硬化组织中髓过氧化物酶生成5-氯尿嘧啶通过巨噬细胞的体细胞突变发生的潜在途径).J.Biol. Chem.，281 3096-3104)。用于MPO催化的脂质蛋白的氧化的另一个指标是由次氯酸攻击和3-氯酪氨酸的形成所观察到，3-氯代酪氨酸已在人类动脉粥样硬化损伤和从这些损伤中提取的月旨蛋白中被鉴另lj (Hazen SL, Heinecke JW, 3-Chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidase-catalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima(髓过氧化物酶催化的氧化的特定标志物3-氯酪氨酸在由人类动脉粥样硬化内膜中分离的低密度脂蛋白中显著增高).J Clin Invest 99:2075-2081 (1997) ；Thukkani AK，McHowat J，Hsu FF， Brennan ML,Hazen SL,Ford DA,Identification of alpha—chloro fatty aldehydes and unsaturated lysophosphatidylcholine molecular species in human atherosclerotic lesions (人类动脉粥样硬化损伤中α -氯脂肪醛和不饱和溶血卵磷脂胆碱分子种类的鉴定)。Circulation 108:3128-3133(2003))。令人惊奇地，本发明人已发现在他们的日常饮食中使用含有富含混合PUFA的鱼油和/或海藻油的烹饪油制品一段持续的时间的患者显示了循环oxLDL-β 2GPI复合物的显著降低。从已知的和所描述的文献中不能得到烹饪油制品的积极作用。此外令人惊奇地，本发明人利用每天一次剂量的含PUFA混合物的鱼油胶囊的第二个试验追踪该非预期的结果，显示出与在烹饪油试验中所观察到的相同的循环 OXLDL-^2GPI复合物水平的令人惊奇的降低。在该结果的进一步扩展中，本发明人在主要含单一 PUFA(DHA)的油和含PUFA混合物(DHA、EPA、DPA)的油之间进行了对比试验，并显示了与主要含单一 PUFA的油相比混合的PUFA的令人惊奇的统计学上显著的OxLDL- β 2GPI 复合物水平的额外降低。在第四个试验中，本发明人发现，服用混合的PUFA的口服剂的患者与未治疗的对照组相比，循环MPO水平的令人惊奇的，统计学上显著的降低。概述本发明的实施方案包括通过供日治疗有效剂量的配制成烹饪油组合物的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多不饱和脂肪酸(PUFA)中的至少一种来减少循环oxLDL-β 2GPI复合物和髓过氧化物酶(MPO)的新方法提，其中将 EPA、DPA和DHA中的至少一种作为鱼油和/或海藻油的成分添加，并与一种或多种已知的烹饪油混合成稳定的烹饪油组合物，所述已知烹饪油诸如落花生油(groundnut oil)、米糠油、大豆油、玉米油、芝麻油、低芥酸菜子油、红花油、橄榄油、花生油(peanut oil)和/或其它植物油。本发明的一个实施方案包括通过每日向患者提供鱼油和或海藻油的胶囊来递送日治疗有效剂量的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多不饱和脂肪酸(PUFA)中的至少一种以降低循环OxLDL和MPO的方法。详述动脉粥样硬化以由于脂质的过度累积，动脉壁逐渐增厚为特征。促炎因子和血脂障碍是其发展的主要贡献者。低密度脂蛋白(LDL)是在动脉粥样硬化损伤或动脉粥样硬化斑块中累积的胆固醇的主要形式，但LDL必须首先被修饰成氧化的结构(oxLDL)以开始该过程，并且修饰LDL成为oxLDL的最重要的促动脉粥样硬化机制是氧化应激。与天然LDL不同，oxLDL结合i32GPI-糖蛋白1，以最终形成稳定的不可解离的复合物(oxLDL-i32GPI复合物)。起始反应是可逆的，且随后形成被认为(Inoue K.等人， Oxidized LDL/-i32GPI complexes. New aspects in atherosclerosis (氧化 LDL/-β 2GPI 复合物。动脉粥样硬化中的新方面).Lupus 14,736(2005))是病原性的且临床上高度相关的稳定的不可解离复合物。巨噬细胞的oxLDL的摄入由清除受体CD36所调节，其导致了动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞的形成。(Podrez Ε. A.等人，Macrophage scavenger receptor CD36 is the major receptor for LDL modified by monocyte-generated reactive nitrogen species (巨噬细胞清除受体⑶36是被单核细胞生成的活性氮物质修饰的LDL的主要受体)· J. Clin. Invest. 105 (8)，1085 (2000))。因为oxLDL- β 2GPI的摄入在抗β 2GPI抗体存在时显著增高，这种机制在解释动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞的发展时是生理学上相关的。因此oxLDL-i32GPI复合物已作为促动脉粥样硬化抗原被涉及，且代表血清学风险因子，和动脉粥样硬化血栓形成的贡献者。因此降低循环oxLDL-β 2GPI复合物是治疗动脉粥样化血栓形成的重要的药理学目标，并且是本发明的目的。利用在人类血浆中检测循环oxLDL-i32GPI复合物的基于双抗体“夹心”技术 (ELISA)的免疫测定，可准确测量循环oxLDL-β 2GPI复合物。用抗人β 2GPI的单克隆抗体涂布96孔板的孔，所述单克隆抗体将与导入到孔中的任何i32GPI结合。利用针对人apoBlOO 的辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体检测结合的oxLDL-β 2GPI。利用发色团试剂四甲基联苯胺(TMB)通过测量HRP的酶活性，测定oxLDL-β 2GPI复合物的浓度，所述四甲基联苯胺(TMB)形成在450nm处测得的独特的黄色。利用分光光度计测量所产生的颜色的强度，其与结合oxLDL-β 2GPI复合物的量成正比。依据利用已知的复合物溶液制备的标准曲线标绘结果，以实现在测试的血浆中循环oxLDL-β 2GPI复合物的准确测量。可通过将标准烹饪油与7. 5% w/w海藻油混合而制备本发明的烹饪油，其含有混合的最少的35% EPA(20% )和DHA(80% )。试验所选择的标准烹饪油通常使用落花生油 (groundnut oil)和葵花籽油。混合过程在封闭系统中在氮气下(以阻止氧化)进行，且温度在20-40摄氏度之间。已进行了开放式标记随机研究，以评估这种烹饪油与健康的蔬菜烹饪油(即落花生油和葵花籽油)相比，对患有血脂障碍的患者中的循环oxLDL-i32GPI复合物的作用。选择年龄在18-60岁之间的、任意性别的、血清LDL胆固醇水平在130_250mg/DL 且血清甘油三酯水平在150-500mg/DL的患者。患有已知冠心病的患者，接受血脂障碍的饮食治疗的患者，接受他汀类(statins)/贝特类(fibrates)或其它降低脂质药物的患者， 患有严重肝病或肾脏损伤的患者或妊娠期/泌乳期女性，均从本研究的潜在库(potential pool)中排除。每位患者都受到起始、中间(每月)和最终(三个月)的全面身体检查，以能够在试验期间评估效力和副作用，所述全面身体检查由测量血小板的RBC、心电图、12小时空腹血脂特征、空腹血糖、甲状腺特征、肝功能测验和肾功能测验组成。按照男性和女性的大致相等的比例募集了 48位健康患者，利用SAS 8. 2版随机分成A、B和C三组，按如下开始治疗A组-3x500ml用于普通烹饪目的的含有7. 5% w/w海藻油的烹饪油，经三个月时间。B组-3x500ml用于普通烹饪目的的标准落花生油，经三个月时间。C组-3x500ml用于普通烹饪目的的标准葵花籽油，经三个月时间。在第二个试验中，将按如上新随机选择并筛选的48位健康患者分成两组，A组为未治疗的，且第二组B组每天一次被给予商业上可获得的鱼油胶囊(h500mg)，每天早晨与早餐一起服食，持续1个月。利用与以上第一个试验相同的方法在第1天和第30天测量循环oxLDL-β 2GPI复合物的水平。在第三个试验中，本发明人用补充量的主要为单独PUFA和混合的PUFA对比喂养 24只豚鼠4周，以测定每一种在降低循环oxLDL- β -2糖蛋白复合物中的效力。使用了 80% DHA,20 % EPA (AO)的 PUFA 组合对比其中 PUFA 浓度为；35 % DHA,35 % EPA 和 30 % DPA (SO) 的组合，且利用与以上第一个试验所描述的相似的方法测量循环OxLDL-i32GPI。在第4个试验中，将新随机选择并筛选的M位人类患者分成两组，C组为未治疗的，且第二组FO组每天一次被给予商业上可获得的鱼油胶囊(h500mg)，每天早晨与早餐一起服食，持续1个月。在第1天和尽可能接近第30天时测量循环MPO水平。利用检测人血浆中循环MPO的基于双抗体“夹心”技术(ELISA)的免疫测定准确测量循环ΜΡ0。实验结果在第一个试验中，其中患者使用含有7. 5% w/w海藻油的烹饪油对比葵花籽烹饪油和落花生烹饪油，采集血浆并测量循环oxLDL-i32GPI复合物，得到本文中所描述的结果。首先绘制oxLDL- β 2GPI复合物浓度曲线，系列稀释对照标准溶液，对于每个浓度测量吸光度(在450nm处)并绘制校准曲线，同时重复两次测量M个未知的血浆样品，以测量这些样品的oxLDL-i32GPI复合物的未知浓度，如下表1中所示。A1-F2孔中显示的是标准溶液，而A3-H8孔中显示的是重复两次进行的患者血浆样品。患者血浆样品孔中的编号代表患者数码，且字母I =起始血浆样品，1M、2M= 1个月或2个月中间血浆样品，且F =最终血浆样品。然后将由表1所得的校准标准吸光度标绘成校准曲线，并从曲线中推导出二阶多项式方程。y = 3. 6382x2+89. 54χ_0· 1227R2 = 0. 9999表 权利要求
1.作为动脉粥样硬化的预防和治疗的手段的减少人血清中循环oxLDL-β-2-糖蛋白1 复合物和循环髓过氧化物酶的方法，所述方法包括向人施用有效量的含有l-99wt%多不饱和脂肪酸(PUFA)的膳食油组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述膳食油组合物还包括可食用烹饪油； 所述组合物包括以下的脂肪酸分布⑴饱和脂肪酸(SFA) 15-55wt% ；(ii)单不饱和脂肪酸(MUFA)40-80wt%；禾口(iii)多不饱和脂肪酸(PUFA)5-45wt%。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述膳食油组合物通过胶囊施用，所述胶囊含有包括以下的脂肪酸分布的膳食油组合物⑴饱和脂肪酸(SFA) 5-10wt% ；(ii)单不饱和脂肪酸(MUFA)5-10wt% ；和(iii)多不饱和脂肪酸(PUFA)20-90wt%。
4.如权利要求1所述的方法，其中优选的多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳五烯酸(DPA)以分别为0. 5-1,0. 1-1,0. 1-0. 5的比例的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述PUFA组分包括至少一种选自由海油和海藻油组成的组的油，其中所述海油包括EPA、DHA, DPA和天然抗氧化剂的混合物。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述可食用烹饪油包括植物油。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述可食用烹饪油包括选自由落花生油、米糠油、大豆油、玉米油、芝麻油、低芥酸菜子油、红花油、橄榄油和花生油组成的组的油。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述可食用烹饪油还包括维生素A、维生素D、维生素 E或抗氧化剂植物提取物中的至少一种。
9.一种用于生产权利要求2的膳食油组合物的方法，所述方法包括a)将可食用的烹饪油装入容器中；b)将至少一种选自由海油和海藻油组成的组的油添加到所述容器中；并c)搅拌所述油直到混合。
全文摘要
通过向受试者施用有效量的包括多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的膳食油组合物来减少循环氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白I复合物和循环髓过氧化物酶水平以治疗动脉粥样硬化的方法。
文档编号A61P9/10GK102202661SQ200980144263
公开日2011年9月28日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月14日
发明者博米·P·弗莱姆罗兹 申请人:博米·P·弗莱姆罗兹
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