抗TGF-β受体II抗体的制作方法
专利名称：抗TGF-β受体II抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，具体来说涉及结合人转化生长因子β受体II(TGFiiRII) 的抗体、包含该抗体的药物组合物、以及使用该抗体的方法，例如用于治疗癌症、纤维化和纤维化疾病。
背景技术：
TGF^是调节细胞生长和分化、运动、胞外基质产生和免疫功能的多效细胞因子。 TGF β具有3种哺乳动物同种型TGF β -1、TGF β -2和TGF β -3，每种具有不同的体内功能。 所有3种TGFii都使用相同的受体信号传导系统。TGFii与TGFi3 RII的结合是起始激活 TGF β信号传导途径的关键步骤，该途径导致Smad2的磷酸化、以及活化的Smad2/Smad4复合物移位至细胞核以调节基因表达。JP 2004/121001A 公开了以高亲和性(8. 06X 1(Γ10 禾口 1. 91 X ICT9M 的 KD)结合人 TGFPRII以治疗肾脏疾病和组织纤维化的人单克隆抗体(mAb)。该申请也公开了该mAb抑制TGF β诱导的角质形成细胞生长(IC5tl平均值为2. 17-3. 89,3. 17-4. 95和3. 21-5. 07 μ g/ ml)。据报道，使用TGFiiRII的完全人单克隆抗体可有效降低大鼠抗-Thy-I肾炎中胞外基质的沉积。(Kasuga, H.等人，Kidney Int，1，第 60 卷(2001) 1745-1755)。迄今为止，尚未公开具有以下特性的高特异性、高亲和性抗-TGFi3 RII抗体，这样的抗体因此是需要的以极高亲和性特异性结合人TGFi3 RII的胞外结构域，阻断人 TGF^ 1、TGFii 2和TGFβ 3与人TGFβ RII的结合、抑制血管发生、抑制肿瘤细胞生长、抑制癌细胞的迁移和侵袭、降低胶原沉着和肝功能、抑制配体诱导的T细胞调节、或联合细胞毒性剂抑制肿瘤生长。发明概述本发明寻求提供满足这些需求的新的分离的抗-TGFi3RII mAb。TGFi3RII是哺乳动物的，且优选是人的。本发明的抗体能够具有一种或多种以下活性1)呈现对人TGFi3 RII的胞外结构域的高亲和性结合；2)阻断TGFi3 RII配体(TGFβ 1、TGFβ 2和 TGF β 3)与TGF β RII的结合，由此抑制TGF β诱导的Smad2磷酸化；3)内在化TGF3RII，其可独立于配体_受体相互作用充当信号传导下调机制；4)抑制配体诱导的TGFi3 RII信号传导途径；5)抑制TGFi3 RII介导的细胞活性；6)体外和体内抑制肿瘤生长；且另外更优选地还可具有一种或多种以下活性7)通过降低TGFii诱导的血管内皮生长因子A(VEGF-A) 分泌而抑制血管发生；8)抑制癌细胞的迁移和侵袭，9)降低胶原沉着和肝功能异常；10)抑制配体诱导的T细胞调节以形成具有免疫抑制作用的Treg细胞；或11)联合细胞毒剂抑制肿瘤生长。与TGF β RII特异性结合并中和TGF β RII介导的活性的高亲和性单克隆抗体特别可用作治疗性生物剂用于治疗由TGF3信号传导介导的疾病。根据本发明的第一方面，提供了分离的抗体，其在室温(20_25°C)以小于IOOpM的 Kd与人TGFi3 RII的胞外结构域特异性结合。
一方面，本发明的抗体 通过ELISA测定以小于LOnM的IC5tl阻断人TGFi3 UTGF^ 2 或TGF β 3与人TGF β RII的结合。另一方面，本发明的抗体以小于30ηΜ的IC5tl抑制TGF β诱导的Smad2磷酸化。又一方面，本发明的抗体包含与TGFi3 RII特异性结合的抗体，该抗体包含i)具有序列 GGSISNSYF(SEQ ID NO 1)的 CDRH1、具有序列 SFYYGEKTYYNPSLKS (SEQ ID NO 2)的 CDRH2、具有序列 GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO 3)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSYLA (SEQ IDNO 10)的 CDRL1、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO: 11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3 ；ii)具有序列 GSGYRFTSY(SEQ ID NO 4)的 CDRH1、具有序列 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)的 CDRH2、具有序列 HGRGYNGYEG(SEQ ID NO:6)的 CDRH3、具有序列 RASQGISSWLA(SEQID NO 13)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS (SEQ ID NO 14) 的 CDRL2 和具有序列 QQYNSYPWT (SEQ ID NO 15)的 CDRL3 ；或iii)具有序列 GGSISSSSY(SEQ ID NO 7)的 CDRH1、具有序列 SFYYSGITYYSPSLKS(SEQ ID NO 8)的 CDRH2、具有序列 GFTMIRGALDY(SEQ ID NO 9)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSFLA(SEQID NO 16)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO 11) 的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3。另一方面，本发明的抗体包含i) HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRA TISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)禾口LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 27)ii) HCVR氨基酸序列 QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVT ISAGKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 29)和LCVR氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTTTCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 31)；或iii) HCVR氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRI 11SEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDVffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :33)，和LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :35)。另一方面，本发明的抗体包含HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)禾口LCVR氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :27)。另一方面，本发明的抗体包含i)SEQ ID NO 37 的重链和 SEQ ID NO 39 的轻链；ii)SEQ ID NO 41 的重链和 SEQ ID NO 43 的轻链；或iii)SEQ ID NO 45 的重链和 SEQ ID NO 47 的轻链。另一方面，本发明的抗体包含两条SEQ ID NO :37的重链和两条SEQID N0:39的轻链。另一方面，本发明包含人TGFi3 RII结合片段。预期可向有需要的受试者施用任何本发明的抗体。因此，本发明的一方面提供药物组合物，其包含本发明的抗体或片段和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。另一方面，本发明包含与人TGFi3 RII的胞外结构域特异性结合并且含有SEQ ID NO 41的重链和SEQ ID NO 43的轻链的分离的抗体。另一方面，本发明的抗体与人TGF3受体II(TGFiBRII)的胞外结构域特异性结合，所述抗体包含具有序列GSGYRFTSY (SEQ ID NO 4)的CDRHl、具有序列 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)的 CDRH2、具有序列 HGRGYNGYEG(SEQ ID NO:6)的 CDRH3、具有序列 RASQGISSWLA(SEQ ID NO 13)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS(SEQ ID NO 14) 的 CDRL2 和具有序列 QQYNSYPWT(SEQ ID NO: 15)的 CDRL3。在本发明的另一方面，所述抗体包含HCVR氨基酸序列QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYP⑶SDTRYSPSFQGQVT ISAGKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 29)禾口LCVR氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :31)。在本发明的优选方面，抗体或其功能片段在竞争ELISA测定中与竞争性抗体竞争结合TGFi3 RII的胞外结构域，其中所述竞争性抗体在室温(20-25°C )以小于IOOpM的Kd 结合 TGF β RII。在本发明的另一优选方面，本发明的抗体以在ELISA中所测定的小于LOnM的IC5tl 阻断人 TGF β U TGF β 2 ^ TGF β 3 TGF β RII 的结合。还考虑本发明的mAb可以用于治疗肺、肝脏和肾脏的纤维化或纤维化疾病。一方面，提供了用于治疗肺、肝脏和肾脏的纤维化或纤维化疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的本发明的mAb。本发明的一方面提供了用作药物的本发明的抗体。本发明的一方面提供了用于治疗癌症的本发明的抗体。本发明的另一方面提供了用于治疗乳腺癌、肺癌或胰腺癌的抗体。 本发明的抗体可与抗癌剂一起用于治疗癌症。本发明的另一方面提供了产品，其含有抗体或片段和另外的抗癌剂，用于在治疗中同时、分开或相继使用的联合疗法中。本发明的优选方面提供了与hTGFβ RII的胞外结构域特异性结合的分离的抗体，其包含具有序列GGSISXiSXA (SEQ ID NO :17)的CDRH1，其中&是N或S，&是Y或S，且 X3 是 F 或 Y ；具有序歹|J SFYYXiX2X3TYYX4PSLKS (SEQ ID NO :18)的 CDRH2，其中 X1 是 G 或 S， X2 是 E 或 G，& 是 K 或 I，& 是 N 或 S ；具有序歹Ij GXiTMIRGX2X3DX4 (SEQ ID NO 53)的 CDRH3, 其中&是Ρ或F，&是ν或A，&是ι或L，&是s或γ ；具有序列RASQSVRSX1LA(SEQiD NO 54)的CDRL1，其中X1是Y或F ；具有序列DASNRAT(SEQ IDNO 11)的CDRL2 ；和具有序列 QQRSNWPPT(SEQ ID NO: 12)的 CDRL3。本发明的另一方面提供了治疗患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的抗体。该癌症可以是乳腺癌、肺癌或胰腺癌。可向所述患者同时、分开或相继施用有效量的抗体或其它抗癌剂。所述抗癌剂可以是环磷酰胺。本发明的另一方面提供了与人TGFii受体II (TGFiiRII)的胞外结构域特异性结合的分离的抗体或该抗体的TGFi3 RII结合片段，所述抗体包含具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO 1)的 CDRHl、具有序列 SFYYGEKTYYNPSLKS (SEQ ID NO 2)的 CDRH2、具有序列 GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO 3)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSYLA (SEQ ID NO 10)的 CDRL1、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO :11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO :12)的 CDRL3 ； 或具有序列 GGSISSSSY(SEQ ID NO :7)的 CDRH1、具有序列 SFYYSGITYYSPSLKS (SEQ IDNO 8) 的 CDRH2、具有序列 GFTMIRGALDY (SEQ ID NO 9)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSFLA (SEQ ID NO: 16)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO :11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ IDNO 12)的 CDRL3。本发明的另一方面包含本发明的抗体或该抗体的TGFiiRII结合片段，所述抗体包含HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRA TISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)和 LCVR 氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :27)；或 HCVR 氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRI 11SEDTSKNQFSLKLSSVTMDTAVYYCASGFTMIRGALDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :33)，和 LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :3 。本发明的另一方面包含本发明的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO 37的重链和SEQ ID NO 39的轻链；或SEQ ID NO 45的重链和SEQID NO 47的轻链。“分离的抗体”是指这样的抗体其(1)已从组分混合物中部分地、基本上或完全地纯化；(2)已被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或回收；(3)是单克隆抗体；(4) 不含来自同一物种的其它蛋白；( 由来自不同物种的细胞表达；或(6)天然不存在。其天然环境中的污染性组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，这可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。分离的抗体的例子包括已进行过亲和纯化的抗体、已通过杂交瘤或其它细胞系体外制备的抗体、以及源于转基因小鼠的人抗体。如本文所使用的，“抗体”是指包含通过二硫键互联的4条多肽链，即两条重链(H)和两条轻链(L)，的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(在本文简称为HCVR或VH) 和重链恒定区组成。重链恒定区含有3个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区 (在本文简称为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而归为两种截然不同的类型(称为kappa(K) 和IambdaU))中之一种。κ轻链的可变区在本文被称为VK。如本文所用的措辞VL旨在涵盖来自κ型轻链的可变区(VK)和来自λ型轻链的可变区两者。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH和VL区域包括高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有更保守的区域 (称为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。“⑶RHl ”是指抗体重链中的第一⑶R区，“⑶RH2”是指抗体重链中的第二⑶R区，以及“⑶RH3”是指抗体重链中的第三⑶R区。“⑶RLl”是指抗体轻链中的第一⑶R区，“⑶RL2” 是指抗体轻链中的第二⑶R区，以及“⑶RL3”是指抗体轻链中的第三⑶R区。术语“抗原结合片段”是指完整抗体的部分或片段，其包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体，例如Fab片段、F(ab’)2或单链可变片段 (scFv)。本发明也包括由本发明的抗原结合片段形成的或部分地形成的双抗体(diabody)、 线性抗体、单链抗体、融合蛋白、重组蛋白和多价或多特异性抗体。如本文所用的术语“TGF-β受体II”或“TGFi3RII”是指结合配体(包括但不限于TGFii 1、TGFβ 2和TGFii 3)、并且由此引发细胞内的信号转导途径的细胞表面受体。人 TGF β RII是567个氨基酸(SEQ ID NO 20)的跨膜蛋白氨基酸残基1_22 信号肽；氨基酸残基23-166 (143aa) (SEQ IDNO :52)胞外域；氨基酸残基167-187 (21aa)跨膜；氨基酸残基 188-567 (380aa)胞质域。本发明的抗体结合人TGFi3 RII，更特异性结合人TGF β RII的胞外结构域，并且阻断人 TGF β 1、TGF β 2 禾口 TGF β 3 与人 TGF β RII 的结合。本发明的抗体还包括已通过定向突变、亲和力成熟、噬菌体展示或链改组以本领域已知的方法改良了结合特征的那些抗体。本发明的抗体包括来自本发明抗体(称为 TGF1、TGF2和TGF3)的重链和轻链(全长或其部分)的任何组合。本发明的抗体可以用作模板或亲本抗体，以使用多种技术制备本发明其它抗体， 所述技术包括⑶R移植、镶饰(veneering)或重表面化(resurfacing)、和链改组(例如，美国专利5，565，332中公开)。本发明的人抗体，例如在CDR中，可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由随机或位点特异性体外诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。人抗体可具有至少一个位置被非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如活性增强性氨基酸残基)置换，并且由此产生衍生自本文所提供的序列的其它可变区氨基酸序列。在一种方法中，将亲本抗体CDR移植到与亲本抗体构架具有高序列同一性的人构架中。新构架与亲本抗体中的相应构架的序列同一性通常为至少80%、至少85%或至少 90%。与亲本抗体相比，这种移植可能造成结合亲和力降低。假如这样的话，可以基于由 Queen 公布的特定标准(Queen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88，沘69 (1991))，将构架在某些位置回复突变为亲本构架。可以使用的其它方法包括，例如，Jones等人，NatUre，321 522(1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332 :323-327(1988)；禾口 Verhoeyen 等人，Science,239 :1534(1988)。可以将多达所有20种可选天然氨基酸弓I入特定置换位置。然后，可适宜地使用本文定义的体外选择方法，以从这些额外可变区氨基酸序列筛选具有所要求的体外交叉反应性的Fab片段。以这种方法可鉴定适用于制备根据本发明的人源化抗体的其它Fab片段。 优选，构架内的氨基酸置换局限于一个或每个本文所公开的构架序列内1、2或3个位置。优选，⑶R内的氨基酸置换局限于一个或每个⑶R内1至3个位置，更优选一个或每个⑶R内 1或2个氨基酸位置的取代。进一步优选，在重链可变区的⑶R内，在1或2个氨基酸位置进行氨基酸置换。在mi等人，J. Mol. Biol.，294 :151-162中提供了用于组合⑶R和构架置换的适宜方法，通过该方法，使用本文所述的抗体作为亲本抗体，可以制备根据本发明的替代抗体。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常熟。它由式k。ff/k。n = Kd来计算。术语“k。n”是指正向反应或复合物形成反应的缔合或结合速率常数或比反应速率，度量单位为=M-1秒Λ术语“k。ff”是指抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数或离解速率常数或比反应速率，度量单位为1/秒。本发明的抗体的结合亲和力常与更低k。ff而非更高的k。n相关，但是不受理论束缚，改进的k。ff和k。n均包括在实施方案中。在一个优选的方面，本发明的抗体是通常表现出低k。ff值的高效抗体或其片段。在某些方面，本发明的抗体具有约IpM至约200pM、约5pM至约IOOpM或约IOpM至约 80pM 的 KD。如本文所用的，术语“阻断结合”和“抑制结合”可互换使用，是指阻断/抑制细胞因子与其受体的结合，导致完全或部分抑制或降低细胞因子/受体信号途径的生物功能。 阻断/抑制TGFii与TGFβ RII的结合可以通过测量TGFβ活性的一个或多个体外或体内指标的完全或部分抑制或降低(例如受体结合，对细胞生长、趋化性、细胞凋亡、胞内蛋白质磷酸化或信号转导的抑制效应)来评价。阻断TGFii与TGFi3 RII的结合的能力可通过本文所述的ELISA来测量。抑制TGFii活性的能力可通过测量细胞(例如本文所述的人 MDA-MB-231细胞)中对Smad2磷酸化的抑制来评价。本发明的抗体以约0. 05nM至约1. OnM、约0. 08nM至约0. 75nM或约0. IOnM至约 0. 60nM 的 IC50 阻断人 TGF β 1、TGF β 2 或 TGF β 3 与人 TGF β RII 的结合。本发明的抗体在体外阻断测定试验中，例如在本文所述的体外MDA-MB-231细胞阻断测定试验中，以小于或等于约2. OnM至约30ηΜ、约3. OnM至约15. OnM或约4. OnM至约 7. 5ηΜ的IC50抑制TGF β诱导的Smad2磷酸化。抗体可具有与在天然物种中发现的相比不同或有所变化的糖基化模式。如本领域已知的，糖基化模式可取决于抗体的序列(例如存在或不存在特定的糖基化氨基酸残基) 或宿主细胞或产生该蛋白质的生物体。可以想到，本发明的抗体包括本文所公开的抗体以及其糖基化变体。本发明还包括包含任何本文所述的多核苷酸的表达载体。示例性载体包括质粒、 噬菌粒、粘粒、病毒和噬菌体核酸或其它能够在原核或真核宿主(例如细胞，如哺乳动物细胞)中复制的核酸分子。载体可以是表达载体，其中编码抗体的多核苷酸与表达控制元件可操作地连接。典型表达载体含有可以用于调节本发明核酸分子的表达的转录和翻译终止子、起始序列及启动子。载体还可包含含有独立终止子序列的基因表达盒、容许载体在真核生物和原核生物两者中复制的序列(即穿梭载体)、和用于原核和真核系统的选择标记。载体通常含有标记以提供用于选择转化宿主的表型性状，例如赋予对诸如氨苄青霉素或新霉素等抗生素的抗性。适宜的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。代表性启动子包括衍生自人巨细胞病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子和多角体蛋白启动子。本发明还包括含有本发明的核酸分子或表达载体的重组细胞。“重组细胞”是指非人多细胞生物体或“宿主细胞”，其是指向其中引入本发明的核酸分子或载体的细胞或细胞群。本发明的宿主细胞可以是真核细胞或细胞系，例如植物、动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿类动物、小鼠、灵长类动物或人细胞或细胞系。—方面，本发明的宿主可以是原核或真核宿主。适合的原核宿主包括例如，大肠杆菌(Escherichia coli)，例如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2^2、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCl ；假单胞菌属(I^seudomonas)； 芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；和链霉菌属 (Streptomyces)。适合的真核细胞包括酵母和其它真菌、昆虫细胞、植物细胞、人细胞和动物细胞，该动物细胞包括哺乳动物细胞，例如杂交瘤细胞系、COS细胞、NSO细胞和CHO细胞。本发明包括产生抗体的方法，其通过培养表达一种或多种编码本发明抗体的核酸序列的重组细胞并从培养基中回收该抗体来实施。如此表达的抗体通常在表达后加以纯化或分离。可以用多种本领域技术人员已知的方法分离或纯化抗体。标准纯化方法包括层析技术、电泳技术、免疫技术、沉淀技术、透析技术、过滤技术、浓缩技术和色谱聚焦技术。如本领域众所周知的，多种天然蛋白可以结合抗体，例如细菌蛋白A、G和L，并且这些蛋白质在本发明中可以用于纯化。常可通过特定融合伴侣实施纯化。例如，如果采用GST融合，则可以使用谷胱甘肽树脂纯化蛋白；如果采用His-Tag，则使用亲合层析来纯化蛋白，或如果采用His-Tag，则使用固定的抗-Flag抗体来纯化蛋白。可通过将抗体从培养基中分离而将其纯化。包含一条以上链的抗体可通过使各链在同一宿主中一起表达而产生，或作为分开的链表达并在从培养基中回收之前或之后组装。可使用多种方法筛选抗体，所述方法包括但不限于体外测定试验，基于细胞的体外测定试验，体内测定试验和选择技术。可筛选的抗体性质包括但不限于生物活性、稳定性、溶解性和对靶的结合亲和性。可同时或单个地筛选多种性质。取决于测定试验的需要， 蛋白可加以纯化或不加以纯化。一方面，筛选可以是检测抗体与已知的或据认为结合抗体的蛋白或非蛋白分子的结合的定性或定量结合试验。一方面，筛选可以是用于测量与靶抗原的结合的结合测定试验。在筛选程序中可利用自动化和高通量筛选技术。筛选可采用融合蛋白或经标记的蛋白。可使用多种本领域已知的方法进行结合测定试验，所述方法包括但不限于ELISA。如本文所用的，“竞争结合”是指，如通过本领域可用的技术(例如竞争ELISA或使用BIAcore的Kd测量法)测定的，抗体使结合或信号传导降低至少约20%、 30 %、50 %、70 %或90 %的情形，但是不旨在完全消除结合。一种为本领域众所周知的用于测量结合相互作用的装置是BIAcore 2000仪器， 其可以从 Pharmacia Biosensor (Uppsala, Sweden)商购得至丨J。本发明包括药物组合物，其包含本文所述的本发明抗体和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。该药物组合物可任选含有其它治疗性成分。如本文所用的，“可药用的载体”包括在生理上相容的容剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。可药用的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及其组合。可药用的载体还可包括少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂 (其可增强抗体的保存期或效力)，以及等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)以及氯化钠。本发明的药物组合物可以以多种方法配制，包括例如液体、半固体及固体剂型，例如液体溶液(例如可注射及可输注溶液)、分散体或混悬液、粉末、脂质体及栓剂。优选，组合物是可注射或可输注溶液形式。优选的施用方式是胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)施用。特别优选的方式是静脉内输注或注射、肌内注射和皮下注射。可以根据如例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 编辑，Mack Publishing Co. , Easton, PA 1995中的常规技术，设计所述组合物，该出版物提供了通常为从业人员已知的制剂技术的纲要。用于治疗本文所述的疾病或病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用手段、靶位点、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、所施用的其它药剂、以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定以使安全性和功效最优化。术语“治疗”是指治疗性处理，其中目的在于减缓(减小)与疾病或病症相关的不期望的生理变化。有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病或病症程度的降低、疾病或病症的稳定(即，疾病或病症不恶化)、延缓或减缓疾病或病症的进展，以及疾病或病症的消除(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指存活期较若不接受治疗的预期存活期而言延长。那些需要治疗者包括那些已患有该疾病或病症者以及那些易于患该疾病或病症者。本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”的本发明的抗-TGFi3 RII抗体。“治疗有效量”意指以所需剂量及在所需时期内有效实现期望治疗结果的量。抗体的治疗有效量可根据以下因素而变化例如疾病状态、年龄、性别、个体体重、及抗体或抗体部分在该个体内引发期望反应的能力。治疗有效量也为抗体或抗体部分的治疗有益作用超过其任何毒性或有害作用的量。可以调整剂量方案以提供最佳期望反应。例如，可以施用单次推注剂，可随着时间进程施用若干分剂量，或者可依照治疗情形的紧急程度所指示的，按比例减少或增加剂量。 以单位剂量形式来配制胃肠外组合物特别有利于方便施用及达成剂量一致性。单位剂量形式意指含有经计算可以产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药用载体的剂量。本发明的单位剂量形式的规格取决于且直接依赖于以下因素(a)活性化合物的独特特性以及欲实现的特定治疗或预防效果，和(b)在本领域中固有的配制此类活性化合物用于治疗时个体敏感性的局限性。本发明抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0. l_50mg/kg。在另一方面， 抗体的有效量为3-35mg/kg。在另一方面，有效量为10-25mg/kg。在另一方面，有效量为 5-20mg/kg。在另一方面，有效量为3-15mg/kg。在另一方面，有效量为2-lOmg/kg。在另一方面，有效量为5-10mg/kg。在另一方面，抗体的有效量为l-10mg/kg。应注意的是，剂量值可随欲缓解病况的类型和严重程度而变化。还应进一步理解，对于任一特定受试者而言，应根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人的专业判断而随时间调整具体剂量方案，且本文所述的剂量范围仅为示例性的，而非意欲限制所主张的组合物的范围或实践。本发明的抗体可用于治疗癌症。癌症被认为是一大群疾病，其按起源组织和肿瘤进展程度分类。癌症也可分类为原发性肿瘤和转移型肿瘤，以及顽固性肿瘤或复发性肿瘤。 顽固性肿瘤是对使用单独化学治疗剂、单独抗体、单独辐射或其组合的治疗不起反应或产生抵抗的肿瘤。复发型肿瘤是看上去受到此类药剂治疗的抑制、但在中断治疗后不超过5 年、有时不超过10年或更长时间出现复发的肿瘤。可治疗的癌症也包括未血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可为非实体肿瘤或实体肿瘤。本发明的抗-TGFi3 RII抗体也可用来治疗TGFi^ RII相关的病症、疾病或病况，包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患该病症的病理性病况。本文待治疗的病症包括由动脉损伤、感染、类风湿性关节炎、糖尿病或糖尿病病况、或恶性肿瘤所造成的纤维化；特征在于细胞外基质累积的疾病、由TGFiiRII信号传导所造成的疾病、由TGFiiRII介导的活性所致的免疫系统抑制造成的病况、由严重损伤、烧伤及疾患(例如病毒或细菌感染)所致的急性免疫缺陷；以及由TGFi3 RII介导的活性所致的多器官全身性疾患。TGF^在造血干细胞的自我更新、增殖和分化中起重要作用。本发明的抗体可用于干细胞的富集及再生，及促进心肌梗塞后、神经元病症以及各种类型的组织再生中基于干细胞的治疗。本发明的抗体可单独施用、或与抗人TGFi3 RII抗体之外的抗肿瘤剂 (anti-neoplastic agent)联合施用，所述抗肿瘤剂包括化学治疗剂、辐射、其它TGFi^RII 拮抗剂、TGFii拮抗剂、抗血管发生剂、其它靶的抗体及小分子。抗-TGFi3 RII抗体尤其可用于治疗抗VEGF-A抵抗性肿瘤。该抗体和其它抗体和/或治疗的施用可在相同或不同的时间经由相同或不同的途径同时或分开进行。本文所述的治疗方法可用于治疗任何适宜的哺乳动物，包括诸如猴和人等的灵长类动物、马、牛、猫、狗、兔和诸如大鼠及小鼠等的啮齿类动物。仅出于示例性目的提供以下实施例，并且并非意欲以任何方式限制本发明的范围。
实施例材料和细胞系ATGF^ 1、TGF0 2和TGF0 3可以利用重组方式产生并纯化或可购自例如R&D Systems。可在稳定转染的细胞中表达重组TGFβ RII Fc融合蛋白(TGFβ RII-Fc)和可溶重组TGF β RII碱性磷酸酶(TGFiiRII-AP)蛋白，并依照本领域技术人员已知的程序自细胞培养上清液纯化(Tessler, J. Biol. Chem.，269 12456-12461 (1994))。人癌细胞系BXPC-3、PANC-U MDA-MB-231 和小鼠肿瘤细胞系 EMT6、4T1、CT26、 B16-F10和骨髓瘤细胞系P3-X63-Ag8. 653可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Culture Collection) (Manassas，VA)。MDA-MB-231 萤光素酶转染细胞系可得自Sunnybrook Health Sciences Centre。可将细胞维持在含有10%胎牛血清(FCS， Hyclone, Logan, UT)白勺 RPMI1640 IMDM(Invitrogen/Life Technologies, Inc.，
Rockville, MD)中。可于37°C在5% CO2增湿气氛中维持所有细胞。抗-TGFβ RII mAbs 的产生抗-TGFi3 RII mAb可以通过使用产生人免疫球蛋白、重链和κ轻链的人免疫球蛋白转基因小鼠(Medarex, San Jose, CA)或 Lewis 大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ),基本上按照标准杂交瘤技术(Harlow&Lane编辑，Antibodies :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor，第 211-213 页(1998))生成。简言之，用经完全弗氏佐剂乳化的重组人或小鼠TGFi3 RII-Fc蛋白经皮下(s. c.)免疫小鼠或大鼠。用存在于不完全弗氏佐剂中的相同TGFi3 RII-Fc经腹膜内(i. p.)对动物加强3次。使动物休息一个月，之后使其接受最后一次存于磷酸盐缓冲溶液(PBQ中的50微克(μ g) TGF β RII-Fc 蛋白的经腹膜内加强。从免疫小鼠收集脾细胞并使用聚乙二醇(PEG，丽1450KD)与 P3-X63-Ag8.653浆细胞瘤细胞融合。融合后，将细胞再悬浮于补充有10%胎牛血清(FBS) 的HAT (次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)培养基中并以200微升每孔的密度分配至96孔板以建立杂交瘤细胞。在融合后第10天至12天，在基于ELISA的结合和阻断测定试验中，针对抗体产生及培养上清液与TGF β RII蛋白的特异性结合活性，筛选杂交瘤。具体而言，首先通过使用山羊抗人κ轻链或抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体，依照以下程序，检测 TGF β RII结合抗体，以鉴定产生抗-TGF β RII mAb的杂交瘤。以IOOng/孔用人TGF β RII-Fc 或小鼠TGFiiRII-Fc在96微量滴定板中于4°C包被过夜。在室温下用封闭缓冲液(含有 5%干奶的PBS 0.05%T\VEE1V 20)封闭该包被后的板2小时。在具有2%牛血清白蛋白(BSA)和0. 05%T\VEEN 20的PBS (ELISA缓冲液)中稀释杂交瘤上清液或纯化的抗体，并将其在TGF β RII包被的96孔微量滴定板中孵育30分钟。用ELISA缓冲液洗涤板， 并将其与山羊抗-人κ轻链或抗-小鼠IgG-HRP缀合物一起孵育30分钟。依照制造商说明书使用ΤΜΒ(3，3'，5，5’ -四甲基联苯胺)底物以进行显色。读取450纳米(nm)下的吸光度以定量抗体的结合活性。为了鉴定产生中和性抗-TGFi3 RII mAb的杂交瘤，依照以下程序进行基于ELISA的阻断测定试验。以200ng每孔用TGF β UTGF β 2或TGF β 3包被96 孔板，并随后用封闭缓冲液封闭各孔。在TGF β包被的96孔微量滴定板中将杂交瘤上清液与含有TGFiiRII-AP的ELISA缓冲液一起温育1小时。洗涤后，依照制造商说明书向各孔添加AP的对硝基苯基磷酸酯(PNPP)底物以显色。读取405ηΜ的吸光度以定量TGFi3 RII 与TGF β 1、TGF β 2和TGF β 3的结合。在微量滴定板读数器(Molecular Devices Corp.， Sunnyvale, CA)上读取光密度(OD)值。通过极限稀释培养物，对阳性杂交瘤进行3次亚克隆，以建立单克隆杂交瘤细胞系。表1显示mAb TGF1、TGF2和TGF3的轻链和重链⑶R的氨基酸序列。表1 抗人TGF β RII mAb的轻链和重链⑶R的氨基酸序列
权利要求
1.一种分离的抗体，其在室温(20-25 °C )以小于IOOpM的Kd与人TGFi3受体 II(TGF^RII)的胞外结构域特异性结合。
2.权利要求1的抗体，其以在ELISA测定中小于1.OnM的IC50阻断人TGFβ U TGFβ 2 或TGF β 3与人TGF β RII的结合。
3.权利要求1或2的抗体，其以小于30ηΜ的IC5tl抑制TGFβ诱导的Smad2磷酸化。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，其与人TGFi3RII特异性结合，所述抗体包含i)具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO 1)的 CDRH1、具有序列 SFYYGEKTYYNPSLKS (SEQ ID NO 2)的CDRH2、具有序列GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO 3)的CDRH3、具有序列RASQSVRSYLA(SEQ ID NO 10)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO 11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNffPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3 ；ii)具有序列GSGYRFTSY(SEQ ID NO 4)的 CDRH1、具有序列 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)的 CDRH2、具有序列 HGRGYNGYEG(SEQ ID NO:6)的 CDRH3、具有序列 RASQGISSffLA (SEQ ID NO 13)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS (SEQ ID NO 14)的 CDRL2 和具有序歹丨J QQYNSYPffT (SEQ ID NO 15)的 CDRL3 ；或iii)具有序列GGSISSSSY(SEQ ID NO 7)的 CDRH1、具有序列 SFYYSGITYYSPSLKS(SEQ ID NO 8)的 CDRH2、具有序列 GFTMIRGALDY (SEQ ID NO 9)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSFLA (SEQ ID NO: 16)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO 11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3。
5.权利要求1-4中任一项的抗体，其包含i)HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISI DTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQID NO 25)禾口LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 27)；ii)HCVR氨基酸序列QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYP⑶SDTRYSPSFQGQVTISAG KSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 29)禾口LCVR氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTTTCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQYNSYPffTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 31)；或iii)HCVR氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRIIISE DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO :33)，和LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :35)。
6.权利要求5的抗体，其包含i)SEQ ID NO 37 的重链和 SEQ ID NO 39 的轻链；ii)SEQID NO 41的重链和SEQ ID NO 43的轻链；或iii)SEQID NO 45 的重链和 SEQ ID NO 47 的轻链。
7.权利要求5的抗体，其包含i) HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISI DTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQID NO 25)和LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :27)。
8.权利要求7的抗体，其包含两条SEQID NO :37的重链和两条SEQ ID N0:39的轻链。
9.权利要求1-8中任一项的抗体的人TGFi3RII结合片段。
10.一种分离的抗体或其功能片段，其中所述抗体在竞争ELISA试验中与权利要求 4-9中任一项的竞争性抗体竞争结合TGFi3 RII的胞外结构域，其中所述竞争性抗体在室温 (20-250C )以小于 IOOpM 的 Kd 结合 TGF β RII。
11.权利要求10的分离的抗体，其中所述抗体以在ELISA测定中小于1.OnM的IC5tl阻断人 TGF β U TGF β 2 ^ TGF β 3 TGF β RII 的结合。
12.—种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或片段和可药用的载体、 稀释剂或赋形剂。
13.—种产品，其含有在治疗中同时、分开或相继使用的、用于联合治疗的权利要求 1-11中任一项所述的抗体或片段和另外的抗癌剂。
14.权利要求1-11中任一项的抗体或片段，其用作药物。
15.权利要求1-11中任一项的抗体或片段，其用于治疗癌症。
16.如权利要求15所述的抗体或片段，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌或胰腺癌。
17.如权利要求16所述的抗体或片段，其组合抗癌剂。
18.权利要求17的抗体，其中所述抗癌剂是环磷酰胺。
全文摘要
本发明涉及抗人转化生长因子β受体II(TGFβRII)的抗体、包含该抗体的药物组合物以及单独或组合使用该抗体的方法，例如用于治疗癌症和纤维化。
文档编号A61P35/00GK102209727SQ200980144391
公开日2011年10月5日 申请日期2009年10月29日 优先权日2008年11月7日
发明者吴嫣 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司
技术领域：
本发明涉及医学领域，具体来说涉及结合人转化生长因子β受体II(TGFiiRII) 的抗体、包含该抗体的药物组合物、以及使用该抗体的方法，例如用于治疗癌症、纤维化和纤维化疾病。
背景技术：
TGF^是调节细胞生长和分化、运动、胞外基质产生和免疫功能的多效细胞因子。 TGF β具有3种哺乳动物同种型TGF β -1、TGF β -2和TGF β -3，每种具有不同的体内功能。 所有3种TGFii都使用相同的受体信号传导系统。TGFii与TGFi3 RII的结合是起始激活 TGF β信号传导途径的关键步骤，该途径导致Smad2的磷酸化、以及活化的Smad2/Smad4复合物移位至细胞核以调节基因表达。JP 2004/121001A 公开了以高亲和性(8. 06X 1(Γ10 禾口 1. 91 X ICT9M 的 KD)结合人 TGFPRII以治疗肾脏疾病和组织纤维化的人单克隆抗体(mAb)。该申请也公开了该mAb抑制TGF β诱导的角质形成细胞生长(IC5tl平均值为2. 17-3. 89,3. 17-4. 95和3. 21-5. 07 μ g/ ml)。据报道，使用TGFiiRII的完全人单克隆抗体可有效降低大鼠抗-Thy-I肾炎中胞外基质的沉积。(Kasuga, H.等人，Kidney Int，1，第 60 卷(2001) 1745-1755)。迄今为止，尚未公开具有以下特性的高特异性、高亲和性抗-TGFi3 RII抗体，这样的抗体因此是需要的以极高亲和性特异性结合人TGFi3 RII的胞外结构域，阻断人 TGF^ 1、TGFii 2和TGFβ 3与人TGFβ RII的结合、抑制血管发生、抑制肿瘤细胞生长、抑制癌细胞的迁移和侵袭、降低胶原沉着和肝功能、抑制配体诱导的T细胞调节、或联合细胞毒性剂抑制肿瘤生长。发明概述本发明寻求提供满足这些需求的新的分离的抗-TGFi3RII mAb。TGFi3RII是哺乳动物的，且优选是人的。本发明的抗体能够具有一种或多种以下活性1)呈现对人TGFi3 RII的胞外结构域的高亲和性结合；2)阻断TGFi3 RII配体(TGFβ 1、TGFβ 2和 TGF β 3)与TGF β RII的结合，由此抑制TGF β诱导的Smad2磷酸化；3)内在化TGF3RII，其可独立于配体_受体相互作用充当信号传导下调机制；4)抑制配体诱导的TGFi3 RII信号传导途径；5)抑制TGFi3 RII介导的细胞活性；6)体外和体内抑制肿瘤生长；且另外更优选地还可具有一种或多种以下活性7)通过降低TGFii诱导的血管内皮生长因子A(VEGF-A) 分泌而抑制血管发生；8)抑制癌细胞的迁移和侵袭，9)降低胶原沉着和肝功能异常；10)抑制配体诱导的T细胞调节以形成具有免疫抑制作用的Treg细胞；或11)联合细胞毒剂抑制肿瘤生长。与TGF β RII特异性结合并中和TGF β RII介导的活性的高亲和性单克隆抗体特别可用作治疗性生物剂用于治疗由TGF3信号传导介导的疾病。根据本发明的第一方面，提供了分离的抗体，其在室温(20_25°C)以小于IOOpM的 Kd与人TGFi3 RII的胞外结构域特异性结合。
一方面，本发明的抗体 通过ELISA测定以小于LOnM的IC5tl阻断人TGFi3 UTGF^ 2 或TGF β 3与人TGF β RII的结合。另一方面，本发明的抗体以小于30ηΜ的IC5tl抑制TGF β诱导的Smad2磷酸化。又一方面，本发明的抗体包含与TGFi3 RII特异性结合的抗体，该抗体包含i)具有序列 GGSISNSYF(SEQ ID NO 1)的 CDRH1、具有序列 SFYYGEKTYYNPSLKS (SEQ ID NO 2)的 CDRH2、具有序列 GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO 3)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSYLA (SEQ IDNO 10)的 CDRL1、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO: 11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3 ；ii)具有序列 GSGYRFTSY(SEQ ID NO 4)的 CDRH1、具有序列 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)的 CDRH2、具有序列 HGRGYNGYEG(SEQ ID NO:6)的 CDRH3、具有序列 RASQGISSWLA(SEQID NO 13)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS (SEQ ID NO 14) 的 CDRL2 和具有序列 QQYNSYPWT (SEQ ID NO 15)的 CDRL3 ；或iii)具有序列 GGSISSSSY(SEQ ID NO 7)的 CDRH1、具有序列 SFYYSGITYYSPSLKS(SEQ ID NO 8)的 CDRH2、具有序列 GFTMIRGALDY(SEQ ID NO 9)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSFLA(SEQID NO 16)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO 11) 的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3。另一方面，本发明的抗体包含i) HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRA TISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)禾口LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 27)ii) HCVR氨基酸序列 QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVT ISAGKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 29)和LCVR氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTTTCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 31)；或iii) HCVR氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRI 11SEDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDVffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :33)，和LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :35)。另一方面，本发明的抗体包含HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)禾口LCVR氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :27)。另一方面，本发明的抗体包含i)SEQ ID NO 37 的重链和 SEQ ID NO 39 的轻链；ii)SEQ ID NO 41 的重链和 SEQ ID NO 43 的轻链；或iii)SEQ ID NO 45 的重链和 SEQ ID NO 47 的轻链。另一方面，本发明的抗体包含两条SEQ ID NO :37的重链和两条SEQID N0:39的轻链。另一方面，本发明包含人TGFi3 RII结合片段。预期可向有需要的受试者施用任何本发明的抗体。因此，本发明的一方面提供药物组合物，其包含本发明的抗体或片段和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。另一方面，本发明包含与人TGFi3 RII的胞外结构域特异性结合并且含有SEQ ID NO 41的重链和SEQ ID NO 43的轻链的分离的抗体。另一方面，本发明的抗体与人TGF3受体II(TGFiBRII)的胞外结构域特异性结合，所述抗体包含具有序列GSGYRFTSY (SEQ ID NO 4)的CDRHl、具有序列 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)的 CDRH2、具有序列 HGRGYNGYEG(SEQ ID NO:6)的 CDRH3、具有序列 RASQGISSWLA(SEQ ID NO 13)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS(SEQ ID NO 14) 的 CDRL2 和具有序列 QQYNSYPWT(SEQ ID NO: 15)的 CDRL3。在本发明的另一方面，所述抗体包含HCVR氨基酸序列QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYP⑶SDTRYSPSFQGQVT ISAGKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 29)禾口LCVR氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :31)。在本发明的优选方面，抗体或其功能片段在竞争ELISA测定中与竞争性抗体竞争结合TGFi3 RII的胞外结构域，其中所述竞争性抗体在室温(20-25°C )以小于IOOpM的Kd 结合 TGF β RII。在本发明的另一优选方面，本发明的抗体以在ELISA中所测定的小于LOnM的IC5tl 阻断人 TGF β U TGF β 2 ^ TGF β 3 TGF β RII 的结合。还考虑本发明的mAb可以用于治疗肺、肝脏和肾脏的纤维化或纤维化疾病。一方面，提供了用于治疗肺、肝脏和肾脏的纤维化或纤维化疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的本发明的mAb。本发明的一方面提供了用作药物的本发明的抗体。本发明的一方面提供了用于治疗癌症的本发明的抗体。本发明的另一方面提供了用于治疗乳腺癌、肺癌或胰腺癌的抗体。 本发明的抗体可与抗癌剂一起用于治疗癌症。本发明的另一方面提供了产品，其含有抗体或片段和另外的抗癌剂，用于在治疗中同时、分开或相继使用的联合疗法中。本发明的优选方面提供了与hTGFβ RII的胞外结构域特异性结合的分离的抗体，其包含具有序列GGSISXiSXA (SEQ ID NO :17)的CDRH1，其中&是N或S，&是Y或S，且 X3 是 F 或 Y ；具有序歹|J SFYYXiX2X3TYYX4PSLKS (SEQ ID NO :18)的 CDRH2，其中 X1 是 G 或 S， X2 是 E 或 G，& 是 K 或 I，& 是 N 或 S ；具有序歹Ij GXiTMIRGX2X3DX4 (SEQ ID NO 53)的 CDRH3, 其中&是Ρ或F，&是ν或A，&是ι或L，&是s或γ ；具有序列RASQSVRSX1LA(SEQiD NO 54)的CDRL1，其中X1是Y或F ；具有序列DASNRAT(SEQ IDNO 11)的CDRL2 ；和具有序列 QQRSNWPPT(SEQ ID NO: 12)的 CDRL3。本发明的另一方面提供了治疗患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的抗体。该癌症可以是乳腺癌、肺癌或胰腺癌。可向所述患者同时、分开或相继施用有效量的抗体或其它抗癌剂。所述抗癌剂可以是环磷酰胺。本发明的另一方面提供了与人TGFii受体II (TGFiiRII)的胞外结构域特异性结合的分离的抗体或该抗体的TGFi3 RII结合片段，所述抗体包含具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO 1)的 CDRHl、具有序列 SFYYGEKTYYNPSLKS (SEQ ID NO 2)的 CDRH2、具有序列 GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO 3)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSYLA (SEQ ID NO 10)的 CDRL1、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO :11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO :12)的 CDRL3 ； 或具有序列 GGSISSSSY(SEQ ID NO :7)的 CDRH1、具有序列 SFYYSGITYYSPSLKS (SEQ IDNO 8) 的 CDRH2、具有序列 GFTMIRGALDY (SEQ ID NO 9)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSFLA (SEQ ID NO: 16)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO :11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ IDNO 12)的 CDRL3。本发明的另一方面包含本发明的抗体或该抗体的TGFiiRII结合片段，所述抗体包含HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRA TISIDTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 25)和 LCVR 氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :27)；或 HCVR 氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRI 11SEDTSKNQFSLKLSSVTMDTAVYYCASGFTMIRGALDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :33)，和 LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :3 。本发明的另一方面包含本发明的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO 37的重链和SEQ ID NO 39的轻链；或SEQ ID NO 45的重链和SEQID NO 47的轻链。“分离的抗体”是指这样的抗体其(1)已从组分混合物中部分地、基本上或完全地纯化；(2)已被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或回收；(3)是单克隆抗体；(4) 不含来自同一物种的其它蛋白；( 由来自不同物种的细胞表达；或(6)天然不存在。其天然环境中的污染性组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，这可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。分离的抗体的例子包括已进行过亲和纯化的抗体、已通过杂交瘤或其它细胞系体外制备的抗体、以及源于转基因小鼠的人抗体。如本文所使用的，“抗体”是指包含通过二硫键互联的4条多肽链，即两条重链(H)和两条轻链(L)，的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(在本文简称为HCVR或VH) 和重链恒定区组成。重链恒定区含有3个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区 (在本文简称为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而归为两种截然不同的类型(称为kappa(K) 和IambdaU))中之一种。κ轻链的可变区在本文被称为VK。如本文所用的措辞VL旨在涵盖来自κ型轻链的可变区(VK)和来自λ型轻链的可变区两者。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH和VL区域包括高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有更保守的区域 (称为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。“⑶RHl ”是指抗体重链中的第一⑶R区，“⑶RH2”是指抗体重链中的第二⑶R区，以及“⑶RH3”是指抗体重链中的第三⑶R区。“⑶RLl”是指抗体轻链中的第一⑶R区，“⑶RL2” 是指抗体轻链中的第二⑶R区，以及“⑶RL3”是指抗体轻链中的第三⑶R区。术语“抗原结合片段”是指完整抗体的部分或片段，其包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体，例如Fab片段、F(ab’)2或单链可变片段 (scFv)。本发明也包括由本发明的抗原结合片段形成的或部分地形成的双抗体(diabody)、 线性抗体、单链抗体、融合蛋白、重组蛋白和多价或多特异性抗体。如本文所用的术语“TGF-β受体II”或“TGFi3RII”是指结合配体(包括但不限于TGFii 1、TGFβ 2和TGFii 3)、并且由此引发细胞内的信号转导途径的细胞表面受体。人 TGF β RII是567个氨基酸(SEQ ID NO 20)的跨膜蛋白氨基酸残基1_22 信号肽；氨基酸残基23-166 (143aa) (SEQ IDNO :52)胞外域；氨基酸残基167-187 (21aa)跨膜；氨基酸残基 188-567 (380aa)胞质域。本发明的抗体结合人TGFi3 RII，更特异性结合人TGF β RII的胞外结构域，并且阻断人 TGF β 1、TGF β 2 禾口 TGF β 3 与人 TGF β RII 的结合。本发明的抗体还包括已通过定向突变、亲和力成熟、噬菌体展示或链改组以本领域已知的方法改良了结合特征的那些抗体。本发明的抗体包括来自本发明抗体(称为 TGF1、TGF2和TGF3)的重链和轻链(全长或其部分)的任何组合。本发明的抗体可以用作模板或亲本抗体，以使用多种技术制备本发明其它抗体， 所述技术包括⑶R移植、镶饰(veneering)或重表面化(resurfacing)、和链改组(例如，美国专利5，565，332中公开)。本发明的人抗体，例如在CDR中，可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由随机或位点特异性体外诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。人抗体可具有至少一个位置被非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如活性增强性氨基酸残基)置换，并且由此产生衍生自本文所提供的序列的其它可变区氨基酸序列。在一种方法中，将亲本抗体CDR移植到与亲本抗体构架具有高序列同一性的人构架中。新构架与亲本抗体中的相应构架的序列同一性通常为至少80%、至少85%或至少 90%。与亲本抗体相比，这种移植可能造成结合亲和力降低。假如这样的话，可以基于由 Queen 公布的特定标准(Queen 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88，沘69 (1991))，将构架在某些位置回复突变为亲本构架。可以使用的其它方法包括，例如，Jones等人，NatUre，321 522(1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332 :323-327(1988)；禾口 Verhoeyen 等人，Science,239 :1534(1988)。可以将多达所有20种可选天然氨基酸弓I入特定置换位置。然后，可适宜地使用本文定义的体外选择方法，以从这些额外可变区氨基酸序列筛选具有所要求的体外交叉反应性的Fab片段。以这种方法可鉴定适用于制备根据本发明的人源化抗体的其它Fab片段。 优选，构架内的氨基酸置换局限于一个或每个本文所公开的构架序列内1、2或3个位置。优选，⑶R内的氨基酸置换局限于一个或每个⑶R内1至3个位置，更优选一个或每个⑶R内 1或2个氨基酸位置的取代。进一步优选，在重链可变区的⑶R内，在1或2个氨基酸位置进行氨基酸置换。在mi等人，J. Mol. Biol.，294 :151-162中提供了用于组合⑶R和构架置换的适宜方法，通过该方法，使用本文所述的抗体作为亲本抗体，可以制备根据本发明的替代抗体。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常熟。它由式k。ff/k。n = Kd来计算。术语“k。n”是指正向反应或复合物形成反应的缔合或结合速率常数或比反应速率，度量单位为=M-1秒Λ术语“k。ff”是指抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数或离解速率常数或比反应速率，度量单位为1/秒。本发明的抗体的结合亲和力常与更低k。ff而非更高的k。n相关，但是不受理论束缚，改进的k。ff和k。n均包括在实施方案中。在一个优选的方面，本发明的抗体是通常表现出低k。ff值的高效抗体或其片段。在某些方面，本发明的抗体具有约IpM至约200pM、约5pM至约IOOpM或约IOpM至约 80pM 的 KD。如本文所用的，术语“阻断结合”和“抑制结合”可互换使用，是指阻断/抑制细胞因子与其受体的结合，导致完全或部分抑制或降低细胞因子/受体信号途径的生物功能。 阻断/抑制TGFii与TGFβ RII的结合可以通过测量TGFβ活性的一个或多个体外或体内指标的完全或部分抑制或降低(例如受体结合，对细胞生长、趋化性、细胞凋亡、胞内蛋白质磷酸化或信号转导的抑制效应)来评价。阻断TGFii与TGFi3 RII的结合的能力可通过本文所述的ELISA来测量。抑制TGFii活性的能力可通过测量细胞(例如本文所述的人 MDA-MB-231细胞)中对Smad2磷酸化的抑制来评价。本发明的抗体以约0. 05nM至约1. OnM、约0. 08nM至约0. 75nM或约0. IOnM至约 0. 60nM 的 IC50 阻断人 TGF β 1、TGF β 2 或 TGF β 3 与人 TGF β RII 的结合。本发明的抗体在体外阻断测定试验中，例如在本文所述的体外MDA-MB-231细胞阻断测定试验中，以小于或等于约2. OnM至约30ηΜ、约3. OnM至约15. OnM或约4. OnM至约 7. 5ηΜ的IC50抑制TGF β诱导的Smad2磷酸化。抗体可具有与在天然物种中发现的相比不同或有所变化的糖基化模式。如本领域已知的，糖基化模式可取决于抗体的序列(例如存在或不存在特定的糖基化氨基酸残基) 或宿主细胞或产生该蛋白质的生物体。可以想到，本发明的抗体包括本文所公开的抗体以及其糖基化变体。本发明还包括包含任何本文所述的多核苷酸的表达载体。示例性载体包括质粒、 噬菌粒、粘粒、病毒和噬菌体核酸或其它能够在原核或真核宿主(例如细胞，如哺乳动物细胞)中复制的核酸分子。载体可以是表达载体，其中编码抗体的多核苷酸与表达控制元件可操作地连接。典型表达载体含有可以用于调节本发明核酸分子的表达的转录和翻译终止子、起始序列及启动子。载体还可包含含有独立终止子序列的基因表达盒、容许载体在真核生物和原核生物两者中复制的序列(即穿梭载体)、和用于原核和真核系统的选择标记。载体通常含有标记以提供用于选择转化宿主的表型性状，例如赋予对诸如氨苄青霉素或新霉素等抗生素的抗性。适宜的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。代表性启动子包括衍生自人巨细胞病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子和多角体蛋白启动子。本发明还包括含有本发明的核酸分子或表达载体的重组细胞。“重组细胞”是指非人多细胞生物体或“宿主细胞”，其是指向其中引入本发明的核酸分子或载体的细胞或细胞群。本发明的宿主细胞可以是真核细胞或细胞系，例如植物、动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿类动物、小鼠、灵长类动物或人细胞或细胞系。—方面，本发明的宿主可以是原核或真核宿主。适合的原核宿主包括例如，大肠杆菌(Escherichia coli)，例如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2^2、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCl ；假单胞菌属(I^seudomonas)； 芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；和链霉菌属 (Streptomyces)。适合的真核细胞包括酵母和其它真菌、昆虫细胞、植物细胞、人细胞和动物细胞，该动物细胞包括哺乳动物细胞，例如杂交瘤细胞系、COS细胞、NSO细胞和CHO细胞。本发明包括产生抗体的方法，其通过培养表达一种或多种编码本发明抗体的核酸序列的重组细胞并从培养基中回收该抗体来实施。如此表达的抗体通常在表达后加以纯化或分离。可以用多种本领域技术人员已知的方法分离或纯化抗体。标准纯化方法包括层析技术、电泳技术、免疫技术、沉淀技术、透析技术、过滤技术、浓缩技术和色谱聚焦技术。如本领域众所周知的，多种天然蛋白可以结合抗体，例如细菌蛋白A、G和L，并且这些蛋白质在本发明中可以用于纯化。常可通过特定融合伴侣实施纯化。例如，如果采用GST融合，则可以使用谷胱甘肽树脂纯化蛋白；如果采用His-Tag，则使用亲合层析来纯化蛋白，或如果采用His-Tag，则使用固定的抗-Flag抗体来纯化蛋白。可通过将抗体从培养基中分离而将其纯化。包含一条以上链的抗体可通过使各链在同一宿主中一起表达而产生，或作为分开的链表达并在从培养基中回收之前或之后组装。可使用多种方法筛选抗体，所述方法包括但不限于体外测定试验，基于细胞的体外测定试验，体内测定试验和选择技术。可筛选的抗体性质包括但不限于生物活性、稳定性、溶解性和对靶的结合亲和性。可同时或单个地筛选多种性质。取决于测定试验的需要， 蛋白可加以纯化或不加以纯化。一方面，筛选可以是检测抗体与已知的或据认为结合抗体的蛋白或非蛋白分子的结合的定性或定量结合试验。一方面，筛选可以是用于测量与靶抗原的结合的结合测定试验。在筛选程序中可利用自动化和高通量筛选技术。筛选可采用融合蛋白或经标记的蛋白。可使用多种本领域已知的方法进行结合测定试验，所述方法包括但不限于ELISA。如本文所用的，“竞争结合”是指，如通过本领域可用的技术(例如竞争ELISA或使用BIAcore的Kd测量法)测定的，抗体使结合或信号传导降低至少约20%、 30 %、50 %、70 %或90 %的情形，但是不旨在完全消除结合。一种为本领域众所周知的用于测量结合相互作用的装置是BIAcore 2000仪器， 其可以从 Pharmacia Biosensor (Uppsala, Sweden)商购得至丨J。本发明包括药物组合物，其包含本文所述的本发明抗体和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。该药物组合物可任选含有其它治疗性成分。如本文所用的，“可药用的载体”包括在生理上相容的容剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。可药用的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及其组合。可药用的载体还可包括少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂 (其可增强抗体的保存期或效力)，以及等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)以及氯化钠。本发明的药物组合物可以以多种方法配制，包括例如液体、半固体及固体剂型，例如液体溶液(例如可注射及可输注溶液)、分散体或混悬液、粉末、脂质体及栓剂。优选，组合物是可注射或可输注溶液形式。优选的施用方式是胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)施用。特别优选的方式是静脉内输注或注射、肌内注射和皮下注射。可以根据如例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 编辑，Mack Publishing Co. , Easton, PA 1995中的常规技术，设计所述组合物，该出版物提供了通常为从业人员已知的制剂技术的纲要。用于治疗本文所述的疾病或病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用手段、靶位点、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、所施用的其它药剂、以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定以使安全性和功效最优化。术语“治疗”是指治疗性处理，其中目的在于减缓(减小)与疾病或病症相关的不期望的生理变化。有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病或病症程度的降低、疾病或病症的稳定(即，疾病或病症不恶化)、延缓或减缓疾病或病症的进展，以及疾病或病症的消除(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指存活期较若不接受治疗的预期存活期而言延长。那些需要治疗者包括那些已患有该疾病或病症者以及那些易于患该疾病或病症者。本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”的本发明的抗-TGFi3 RII抗体。“治疗有效量”意指以所需剂量及在所需时期内有效实现期望治疗结果的量。抗体的治疗有效量可根据以下因素而变化例如疾病状态、年龄、性别、个体体重、及抗体或抗体部分在该个体内引发期望反应的能力。治疗有效量也为抗体或抗体部分的治疗有益作用超过其任何毒性或有害作用的量。可以调整剂量方案以提供最佳期望反应。例如，可以施用单次推注剂，可随着时间进程施用若干分剂量，或者可依照治疗情形的紧急程度所指示的，按比例减少或增加剂量。 以单位剂量形式来配制胃肠外组合物特别有利于方便施用及达成剂量一致性。单位剂量形式意指含有经计算可以产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药用载体的剂量。本发明的单位剂量形式的规格取决于且直接依赖于以下因素(a)活性化合物的独特特性以及欲实现的特定治疗或预防效果，和(b)在本领域中固有的配制此类活性化合物用于治疗时个体敏感性的局限性。本发明抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0. l_50mg/kg。在另一方面， 抗体的有效量为3-35mg/kg。在另一方面，有效量为10-25mg/kg。在另一方面，有效量为 5-20mg/kg。在另一方面，有效量为3-15mg/kg。在另一方面，有效量为2-lOmg/kg。在另一方面，有效量为5-10mg/kg。在另一方面，抗体的有效量为l-10mg/kg。应注意的是，剂量值可随欲缓解病况的类型和严重程度而变化。还应进一步理解，对于任一特定受试者而言，应根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人的专业判断而随时间调整具体剂量方案，且本文所述的剂量范围仅为示例性的，而非意欲限制所主张的组合物的范围或实践。本发明的抗体可用于治疗癌症。癌症被认为是一大群疾病，其按起源组织和肿瘤进展程度分类。癌症也可分类为原发性肿瘤和转移型肿瘤，以及顽固性肿瘤或复发性肿瘤。 顽固性肿瘤是对使用单独化学治疗剂、单独抗体、单独辐射或其组合的治疗不起反应或产生抵抗的肿瘤。复发型肿瘤是看上去受到此类药剂治疗的抑制、但在中断治疗后不超过5 年、有时不超过10年或更长时间出现复发的肿瘤。可治疗的癌症也包括未血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可为非实体肿瘤或实体肿瘤。本发明的抗-TGFi3 RII抗体也可用来治疗TGFi^ RII相关的病症、疾病或病况，包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患该病症的病理性病况。本文待治疗的病症包括由动脉损伤、感染、类风湿性关节炎、糖尿病或糖尿病病况、或恶性肿瘤所造成的纤维化；特征在于细胞外基质累积的疾病、由TGFiiRII信号传导所造成的疾病、由TGFiiRII介导的活性所致的免疫系统抑制造成的病况、由严重损伤、烧伤及疾患(例如病毒或细菌感染)所致的急性免疫缺陷；以及由TGFi3 RII介导的活性所致的多器官全身性疾患。TGF^在造血干细胞的自我更新、增殖和分化中起重要作用。本发明的抗体可用于干细胞的富集及再生，及促进心肌梗塞后、神经元病症以及各种类型的组织再生中基于干细胞的治疗。本发明的抗体可单独施用、或与抗人TGFi3 RII抗体之外的抗肿瘤剂 (anti-neoplastic agent)联合施用，所述抗肿瘤剂包括化学治疗剂、辐射、其它TGFi^RII 拮抗剂、TGFii拮抗剂、抗血管发生剂、其它靶的抗体及小分子。抗-TGFi3 RII抗体尤其可用于治疗抗VEGF-A抵抗性肿瘤。该抗体和其它抗体和/或治疗的施用可在相同或不同的时间经由相同或不同的途径同时或分开进行。本文所述的治疗方法可用于治疗任何适宜的哺乳动物，包括诸如猴和人等的灵长类动物、马、牛、猫、狗、兔和诸如大鼠及小鼠等的啮齿类动物。仅出于示例性目的提供以下实施例，并且并非意欲以任何方式限制本发明的范围。
实施例材料和细胞系ATGF^ 1、TGF0 2和TGF0 3可以利用重组方式产生并纯化或可购自例如R&D Systems。可在稳定转染的细胞中表达重组TGFβ RII Fc融合蛋白(TGFβ RII-Fc)和可溶重组TGF β RII碱性磷酸酶(TGFiiRII-AP)蛋白，并依照本领域技术人员已知的程序自细胞培养上清液纯化(Tessler, J. Biol. Chem.，269 12456-12461 (1994))。人癌细胞系BXPC-3、PANC-U MDA-MB-231 和小鼠肿瘤细胞系 EMT6、4T1、CT26、 B16-F10和骨髓瘤细胞系P3-X63-Ag8. 653可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Culture Collection) (Manassas，VA)。MDA-MB-231 萤光素酶转染细胞系可得自Sunnybrook Health Sciences Centre。可将细胞维持在含有10%胎牛血清(FCS， Hyclone, Logan, UT)白勺 RPMI1640 IMDM(Invitrogen/Life Technologies, Inc.，
Rockville, MD)中。可于37°C在5% CO2增湿气氛中维持所有细胞。抗-TGFβ RII mAbs 的产生抗-TGFi3 RII mAb可以通过使用产生人免疫球蛋白、重链和κ轻链的人免疫球蛋白转基因小鼠(Medarex, San Jose, CA)或 Lewis 大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ),基本上按照标准杂交瘤技术(Harlow&Lane编辑，Antibodies :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor，第 211-213 页(1998))生成。简言之，用经完全弗氏佐剂乳化的重组人或小鼠TGFi3 RII-Fc蛋白经皮下(s. c.)免疫小鼠或大鼠。用存在于不完全弗氏佐剂中的相同TGFi3 RII-Fc经腹膜内(i. p.)对动物加强3次。使动物休息一个月，之后使其接受最后一次存于磷酸盐缓冲溶液(PBQ中的50微克(μ g) TGF β RII-Fc 蛋白的经腹膜内加强。从免疫小鼠收集脾细胞并使用聚乙二醇(PEG，丽1450KD)与 P3-X63-Ag8.653浆细胞瘤细胞融合。融合后，将细胞再悬浮于补充有10%胎牛血清(FBS) 的HAT (次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)培养基中并以200微升每孔的密度分配至96孔板以建立杂交瘤细胞。在融合后第10天至12天，在基于ELISA的结合和阻断测定试验中，针对抗体产生及培养上清液与TGF β RII蛋白的特异性结合活性，筛选杂交瘤。具体而言，首先通过使用山羊抗人κ轻链或抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体，依照以下程序，检测 TGF β RII结合抗体，以鉴定产生抗-TGF β RII mAb的杂交瘤。以IOOng/孔用人TGF β RII-Fc 或小鼠TGFiiRII-Fc在96微量滴定板中于4°C包被过夜。在室温下用封闭缓冲液(含有 5%干奶的PBS 0.05%T\VEE1V 20)封闭该包被后的板2小时。在具有2%牛血清白蛋白(BSA)和0. 05%T\VEEN 20的PBS (ELISA缓冲液)中稀释杂交瘤上清液或纯化的抗体，并将其在TGF β RII包被的96孔微量滴定板中孵育30分钟。用ELISA缓冲液洗涤板， 并将其与山羊抗-人κ轻链或抗-小鼠IgG-HRP缀合物一起孵育30分钟。依照制造商说明书使用ΤΜΒ(3，3'，5，5’ -四甲基联苯胺)底物以进行显色。读取450纳米(nm)下的吸光度以定量抗体的结合活性。为了鉴定产生中和性抗-TGFi3 RII mAb的杂交瘤，依照以下程序进行基于ELISA的阻断测定试验。以200ng每孔用TGF β UTGF β 2或TGF β 3包被96 孔板，并随后用封闭缓冲液封闭各孔。在TGF β包被的96孔微量滴定板中将杂交瘤上清液与含有TGFiiRII-AP的ELISA缓冲液一起温育1小时。洗涤后，依照制造商说明书向各孔添加AP的对硝基苯基磷酸酯(PNPP)底物以显色。读取405ηΜ的吸光度以定量TGFi3 RII 与TGF β 1、TGF β 2和TGF β 3的结合。在微量滴定板读数器(Molecular Devices Corp.， Sunnyvale, CA)上读取光密度(OD)值。通过极限稀释培养物，对阳性杂交瘤进行3次亚克隆，以建立单克隆杂交瘤细胞系。表1显示mAb TGF1、TGF2和TGF3的轻链和重链⑶R的氨基酸序列。表1 抗人TGF β RII mAb的轻链和重链⑶R的氨基酸序列
权利要求
1.一种分离的抗体，其在室温(20-25 °C )以小于IOOpM的Kd与人TGFi3受体 II(TGF^RII)的胞外结构域特异性结合。
2.权利要求1的抗体，其以在ELISA测定中小于1.OnM的IC50阻断人TGFβ U TGFβ 2 或TGF β 3与人TGF β RII的结合。
3.权利要求1或2的抗体，其以小于30ηΜ的IC5tl抑制TGFβ诱导的Smad2磷酸化。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，其与人TGFi3RII特异性结合，所述抗体包含i)具有序列GGSISNSYF(SEQ ID NO 1)的 CDRH1、具有序列 SFYYGEKTYYNPSLKS (SEQ ID NO 2)的CDRH2、具有序列GPTMIRGVIDS(SEQ ID NO 3)的CDRH3、具有序列RASQSVRSYLA(SEQ ID NO 10)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO 11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNffPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3 ；ii)具有序列GSGYRFTSY(SEQ ID NO 4)的 CDRH1、具有序列 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:5)的 CDRH2、具有序列 HGRGYNGYEG(SEQ ID NO:6)的 CDRH3、具有序列 RASQGISSffLA (SEQ ID NO 13)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS (SEQ ID NO 14)的 CDRL2 和具有序歹丨J QQYNSYPffT (SEQ ID NO 15)的 CDRL3 ；或iii)具有序列GGSISSSSY(SEQ ID NO 7)的 CDRH1、具有序列 SFYYSGITYYSPSLKS(SEQ ID NO 8)的 CDRH2、具有序列 GFTMIRGALDY (SEQ ID NO 9)的 CDRH3、具有序列 RASQSVRSFLA (SEQ ID NO: 16)的 CDRLl、具有序列 DASNRAT (SEQ ID NO 11)的 CDRL2 和具有序列 QQRSNWPPT (SEQ ID NO 12)的 CDRL3。
5.权利要求1-4中任一项的抗体，其包含i)HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISI DTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQID NO 25)禾口LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 27)；ii)HCVR氨基酸序列QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYP⑶SDTRYSPSFQGQVTISAG KSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 29)禾口LCVR氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTTTCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQYNSYPffTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO 31)；或iii)HCVR氨基酸序列QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYSGITYYSPSLKSRIIISE DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASGFTMIRGALDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO :33)，和LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :35)。
6.权利要求5的抗体，其包含i)SEQ ID NO 37 的重链和 SEQ ID NO 39 的轻链；ii)SEQID NO 41的重链和SEQ ID NO 43的轻链；或iii)SEQID NO 45 的重链和 SEQ ID NO 47 的轻链。
7.权利要求5的抗体，其包含i) HCVR氨基酸序列QLQVQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNSYFSWGWIRQPPGKGLEWIGSFYYGEKTYYNPSLKSRATISI DTSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCPRGPTMIRGVIDSWGQGTLVTVSS(SEQID NO 25)和LCVR氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO :27)。
8.权利要求7的抗体，其包含两条SEQID NO :37的重链和两条SEQ ID N0:39的轻链。
9.权利要求1-8中任一项的抗体的人TGFi3RII结合片段。
10.一种分离的抗体或其功能片段，其中所述抗体在竞争ELISA试验中与权利要求 4-9中任一项的竞争性抗体竞争结合TGFi3 RII的胞外结构域，其中所述竞争性抗体在室温 (20-250C )以小于 IOOpM 的 Kd 结合 TGF β RII。
11.权利要求10的分离的抗体，其中所述抗体以在ELISA测定中小于1.OnM的IC5tl阻断人 TGF β U TGF β 2 ^ TGF β 3 TGF β RII 的结合。
12.—种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或片段和可药用的载体、 稀释剂或赋形剂。
13.—种产品，其含有在治疗中同时、分开或相继使用的、用于联合治疗的权利要求 1-11中任一项所述的抗体或片段和另外的抗癌剂。
14.权利要求1-11中任一项的抗体或片段，其用作药物。
15.权利要求1-11中任一项的抗体或片段，其用于治疗癌症。
16.如权利要求15所述的抗体或片段，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌或胰腺癌。
17.如权利要求16所述的抗体或片段，其组合抗癌剂。
18.权利要求17的抗体，其中所述抗癌剂是环磷酰胺。
全文摘要
本发明涉及抗人转化生长因子β受体II(TGFβRII)的抗体、包含该抗体的药物组合物以及单独或组合使用该抗体的方法，例如用于治疗癌症和纤维化。
文档编号A61P35/00GK102209727SQ200980144391
公开日2011年10月5日 申请日期2009年10月29日 优先权日2008年11月7日
发明者吴嫣 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司
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