用于合成(Aib<sup>8,35</sup>)hGLP-1(7-36)-NH<sub>2</sub>的方法
专利名称：用于合成(Aib<sup>8,35</sup>)hGLP-1(7-36)-NH<sub>2</sub>的方法
技术领域：
本发明涉及用于大规模合成(Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)(即 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-I Ie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2 (SEQ ID NO :2))的新方法，其包含固相 Fmoc 化学合成(Fmoc-chemi stry)。
背景技术：
胰高血糖素样肽1(7-36)酰胺(GLP-I) (SEQ ID NO 1)通过组织特异性翻译后加工胰高血糖素前体——前胰高血糖素原在小肠L细胞中合成并响应于膳食释放到循环中。有观察显示GLP-I的治疗潜力，单次皮下剂量的GLP-I能完全正常化患有非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)病人的餐后葡萄糖水平(Gutniak，M. K.等，1994，Diabetes Care, 14 1039-44)。此效果被认为由胰岛素释放增加和胰高血糖素分泌降低来介导。然而，GLP-I代谢不稳定，体内具有仅1到2分钟的血浆半衰期。外部施加的GLP-I也很快被降解(Deacon， C. F.等，1995，Diabetes,44 :1126-1131).在PCT 公开编号 WO 00/34331 中公布了 (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2)，其比天然GLP-I更有活性和/或代谢上更稳定，所述公开的内容在此以其整体引入。然而，在 WO 00/34331 的 18-19 页提供的(Aib8'35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的合成描述不适用于肽的商业规模生产，因为在此使用的MBHM4-甲基二苯甲基胺)树脂需要用氢氟酸除去肽。除了对这种极端腐蚀性材料大规模使用的安全考虑之外，还需要特殊装置来保证其使用。一般基于氢氟酸裂解的方案需要大量投资来保证其对于工业化规模是安全和可放大的。因此，需要发展有效的大规模方法用于生产(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)。
发明内容
本发明提供了用于合成(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的新方法，其包括逐步固相Fmoc化学合成。一方面，本发明提供了用于合成(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO : 的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8’35) hGLP-1 (8-35)-NH2 (SEQ ID NO :8)的 C 末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团， 来产生侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-G In-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 4)；(b)偶联侧链保护的 Boc-His-OH 与侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-A sp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO :4)来产生侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-S er-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-VaI-Lys-Aib-Arg 树月旨(SEQ ID NO :5)。(c)用裂解混合物处理侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 5)并从其中去除侧链保护基团和N末端保护基团，由此产生粗制的(Aib8'35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)；及(d)分离并纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)来产生纯化的 (Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案还包括步骤(a-D去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护树脂来从树脂去除Fmoc基团；(a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上来产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；及(a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂；这些步骤在步骤(a)之前。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (Pbf) -OH ；所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (Pbf)树脂；所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的Arg (Pbf)树脂；所述通式(Aib8’35)hGLP-1 (8-35)-NH2 (SEQ ID NO :8)自 C 末端到 N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp (Boc) -0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-0H， Fmoc-Ser(tBu)-0H， Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH,和 Fmoc-Aib-OH ；所述侧链保护的Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 4) 是 Aib-Glu (OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-IIe-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ IDNO :6)；所述侧链保护的 Boc-Hi s-OH 是 Boc-Hi s (Trt) -OH ；所述侧链保护的Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树月旨(SEQ ID NO 5)是 Boc-His CTrt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys ( Boc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp (Boc)-Leu-Val-Lys (Boc)-Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 7)；及所述裂解混合物是选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、 TFA/苯酚/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、 TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能产生肽的树脂选自 Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂和 Sieber酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/ 水混合物；及所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM 树脂、基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能够产生肽酰胺的树脂是 Fmoc-Rink 酰胺-MBHA 树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于步骤(d)包括步骤(d-Ι)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(d-2)浓缩(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)/ 裂解混合物滤出液；(d-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(d-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2) 来进行N-O转化逆转(shift reversal)；(d-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8’35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ IDNO :2)溶液 ’及(d-6)分离和纯化(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在弱碱介质里、然后把pH调低回到大约自3 到3. 7来完成。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述自树脂中去除Fmoc基团使用 DMF中的哌啶来完成。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述DMF中的哌啶浓度是约25% (ν/ν)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用选自TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/ DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA 和 HCTU/HOBt/DIEA 的偶联试剂组合偶联(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQID NO :2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于 使用或者TBTU/HOBt或者TBTU/HBTU/DIEA的偶联试剂组合偶联(Aib8’35)
hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前四个氨基酸残基；和使用选自 HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HBTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合偶联N末端组氨酸。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述用于偶联(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)自C末端前四个氨基酸残基的偶联试剂组合是TBTU/HOBt ；和所述用于偶联N末端组氨酸的偶联试剂组合是HATU/DIEA。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于(Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前四个氨基酸残基用大约 3. 0当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的DIEA(在大约5倍过量体积的DMF中)偶联；和使用大约3. 4当量的Boc-His (Trt) _0H、大约4. 08当量的HATU和大约9. O当量的 DIEA (在大约5倍过量体积DMF中)偶联N末端组氨酸。另一方面，本发明提供了根据权利要求1合成(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8’35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQID NO :9)的 C末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团， 来产生侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-G Iy-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 3)；
(b)用裂解混合物处理侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO⑶和从中去除侧链保护基团由此产生粗制的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；禾口(c)分离和纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)来产生纯化的 (Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案还包括步骤(a-Ι)去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护的树脂来从树脂去除Fmoc基团；(a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上来产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；和(a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂；这些步骤在步骤(a)之前。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (Pbf) -OH ；所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (Pbf) -OH和Fmoc-Arg (Pbf)树脂；
所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的Arg (Pbf)树脂；所述通式(Aib8'35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO :9)自 C 末端至Ij N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-0H、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (Boc) _0H、 Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Leu-0H、 Fmoc—Tyr(tBu)-OH、 Fmoc—Ser(tBu)-OH、 Fmoc—Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-0H> Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-0H、 Fmoc-Phe-0H> Fmoc—Thr (tBu)-OH、Fmoc-Gly-0H> Fmoc—Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH 禾口 Fmoc-His(Trt)-OH ；所述侧链保护的His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Le u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 3)是 His (Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-V al-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu (OtBu)-Gly-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)树月旨(SEQ ID NO :10)； 和所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、TFA/ 苯酚/水/TIPS裂解混合物，TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水 /苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、TFA/ TES裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能产生肽的树脂选自 Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂和 Sieber酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/ 水混合物；和所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM 树脂和基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能够产生肽酰胺的树脂是 Fmoc-Rink 酰胺-MBHA 树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于步骤(C)包括步骤(c-1)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(c-2)浓缩(Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液；(c-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(c-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2) 来完成N-O转化逆转；(c-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2)溶液；禾口(c-6)分离和纯化(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于步骤(c-4)中所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在弱碱介质里、然后把pH调低回到大约自3到3. 7来完成。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述自树脂中去除Fmoc基团使用 DMF中的哌啶来完成。
本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述DMF中的哌啶浓度是约25% (ν/ν)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用选自TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/ DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA 和 HCTU/HOBt/DIEA 的偶联试剂组合偶联(Aib8’35) hGLP_l (7-36)-NH2 (SEQID NO :2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用或者TBTU/HOBt或者TBTU/ HBTU/DIEA 的偶联试剂组合偶联(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用TBTU/HOBt偶联试剂组合偶联(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)的氨基酸残基用大约3. 0当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约 2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的DIEA (在大约5倍过量体积的DMF中)偶联。详细描述申请书使用下列缩写
ACN 乙腈
AM氨甲基
Boc叔丁 IuSJ^
DCM 二氯曱烷
DICN,N' -二异丙二亚胺
DIEA N, N-二异丙基乙胺
DMF 二甲基曱醜腰
12DTT二疏苏糖醇
EDT乙烷二硫醇
Fmoc芴曱氧
HATU0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲镥六氟磷酸盐
HBTU2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲镥六氟磷酸盐
HOAt1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt1-羟基笨并三唑
HPLC高压液相层析
LOD干燥失重
MBHA 4-曱基二苯曱胺
MTBE甲基叔丁醚
OtBu叔丁酯
Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氢笨并呋喃-5-磺醜基
PEG聚乙二醇
TBTU2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四曱基脲镥四氟硼酸酯，
tBu叔丁醚
TES三乙烷
TFA三氟乙酸
TIPS三异丙基娃燒
Trt三苯曱基基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂是带有Fmoc-Rink酰胺连接的树脂，其中树脂的构成珠包括PEG成分。基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂的一些非唯一示例是NovaPeg、 NovaGel 和 AM SURE。在此使用的术语“裂解混合物”是指用于从树脂去除或裂解经组装的肽的试剂混合物。此外，裂解混合物还用于去除所有侧链保护基团和N末端保护基团。在此使用的关于参数或数量的术语“大约”，意指参数或数量在所述参数或数量的士5%以内。下面的实施例描述用于说明本发明方法的目的，并不解释为以任何方式限制本发明。合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在装备有压缩空气发动机和 PTFE 搅拌器的35升玻璃反应器(Quark，Vineland, NJ，美国)中合成。使用具有0. 63毫摩尔/克掺入量的Fmoc Rink酰胺MBHA树脂(Merck Biosciences，Darmstadt，德国)。使用的 Fmoc 氨基酸(Synthetech Inc.，Albany，0R，美国)带有下列侧链保护Rnoc-Arg (Pbf)-OH、 Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Gln (Trt)-OH、Boc-His (Trt)-0H、 Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH 禾口 Fmoc-Tyr (tBu) -0H。下列 Rnoc 氨基酸不需要侧链保护Rnoc-Aib-OH、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH、Fmoc-I Ie-OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH 禾口 Fmoc-Val-OH。合成以0. 63摩尔规模进行(投入1千克树脂)。前四个氨基酸(除了 N末端组氨酸以外的全部)在4. 5升DMF中用3. O当量的氨基酸偶联并用2. 94当量TBTU(Fluka， kelze，德国)、2· 94 当量 HOBt (Fluka，Seelze，德国)和 4· 5 当量 DIEA(Sigma_Aldrich， Gillingham，英国)预活化。偶联时间是60分钟。Boc-His CTrt)-OH用4. 5升DMF中的3. 4 当量氨基酸、4. 08 当量 HATU(AppliedBiosystems，Framingham, MA，美国)和 9 当量 DIEA 偶联。在最初偶联之前和后来每一偶联之后用DMF中的hlO升25% (ν/ν)哌啶(BASF，德国)进行树脂去保护。在树脂上完成肽组装时，用10升甲醇(Labscan，Dublin,爱尔兰)洗涤树脂两次并在真空炉(Mason Technology，Dublin，爱尔兰)中干燥至LOD (干燥失重)小于1%。最初用反应器中的氮干燥树脂，最后干燥在真空炉内以环境温度大约22°C、小于50mbar来进行。完全的干燥过程用了 3天。得到4200克肽基树脂。对每一亚份，使用8. 4升TFA/TIPS/水(80/14. 3/5. 7% ν/ν)裂解混合物170分钟在6x700g的亚份中从树脂上裂解肽并去除肽的侧链保护基团。用0. 7升TFA洗涤树脂和合并滤出液。用旋转蒸发器(Buchi，Flawil，Switzerland)浓缩裂解混合物到其最初重量的14%到32%并在13. 6至17. 5升搅动MTBE (Labscan，Dublin，爱尔兰)中沉淀粗肽。 粗肽进一步以1. 5至7. 5升MTBE洗涤。N-O转化的逆转通过在乙酸铵缓冲液(10克肽/100毫升，10% w/v,即，10克肽 /100毫升缓冲液，PH 8-9)中浆化粗沉淀肽60分钟来完成。用14至18升冰乙酸调pH至 3. 3-3. 7以产生清澈粗肽溶液，其HPLC纯度大约是50%。在纯化前通过0. 45微米滤器 (Pall Gelman SciencesInc.，New York, NY，美国)过滤肽溶液。使用装载Cw稳定相(EKA Chemicals AB, Bohus，瑞典)的反相制备型HPLC柱 (Novas印，Pompey，法国)纯化肽。在使用水和乙腈中的0. 1% TFA的梯度洗脱条件下进行纯化。使用乙酸铵和乙酸缓冲液进行盐交换层析步骤来产生乙酸盐。具体地，装填肽到 HPLC柱。在柱上用乙酸铵缓冲液洗涤肽1小时，然后用乙酸/乙腈梯度从柱上洗脱肽。基于HPLC分析纯化肽的纯度大于99%。具体地，在旋转蒸发仪(最大温度40°C ) 上浓缩肽溶液，和通过0.45微米滤器(Pall GelmanSciences Inc.，New York, NY，美国) 过滤产生的溶液并且冻干。用于最终组氨酸偶联的HATU/DIEA 系统，与 TBTU/HBTU/DIEA、TBTU/HOBt/ DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt 或 HATU/HOBt/DIEA 系统相比，导致四摩尔向(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)更好的转换，并因此增加了产量。 此外，使用Boc保护的组氨酸，和Fmoc保护的组氨酸相比，给出更好产量并允许加工时间的少量缩短，因为在裂解前不需要去除Fmoc。如下表所显示，在组氨酸偶联和从树脂
14上裂解方面进行实验性研究的统计设计，来选择试剂比例和反应时间的最适组合以增高产量。本领域众所周知，N-O转化是酰基的转化，其形成于含有苏氨酸或丝氨酸残基的肽暴露于酸性条件期间。它们产生了异构体杂质，其降低产量并且难于纯化。通过保持肽于弱碱性介质(如，PH8-9)和其后调节pH回至大约3逆转这些N-O转化。前述过程允许N-O 转化逆转以浆的方式进行，其相较完全基于溶液的逆转过程有规模上的优势。表1 针对最优化(Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2) N 末端组氨酸残基偶
联的实验研究(和其产量/纯度结果)的小规模设计
权利要求
1.用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36) -NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，其包括逐步固相 Fmoc-化学合成。
2.根据权利要求1用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8'35)hGLP-1 (8-35) -NH2 (SEQID NO 8)的C末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团，来产生侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 4)；(b)偶联侧链保护的Boc-His-OH 于侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-V al-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b-Arg 树脂(SEQ ID NO :4)来产生侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-A sp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg 树月旨(SEQ ID NO :5)；(c)用裂解混合物处理侧链保护的Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val -Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 5)并从中去除侧链保护基团和N末端保护基团，产生粗制的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)；及(d)分离并纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)来产生纯化的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)。
3.根据权利要求2用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，还包括步骤(a-1)去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护的树脂来从树脂上去除Fmoc基团； (a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上来产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；及 (a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂； 这些步骤在步骤(a)之前。
4.根据权利要求3用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)的方法，其中 在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (I^bf)-OH ；所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (I^bf)树脂； 所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的ArgO^bf)树脂；所述通式(Aib8'35) hGLP-1 (8-35) -NH2 (SEQ ID NO :8)自 C 末端到 N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (Boc) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-0H> Fmoc-Thr(tBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH 和 Fmoc-Aib-OH ；所述侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly -Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树月旨(SEQ ID NO :4)是A ib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBU)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Phe-IIe-Ala -Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 6)； 所述侧链保护的 Boc-His-OH 是 Boc-His (Trt) -OH ；所述侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Le u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 5)是 Boc-His (iTrt) -Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (O tBu)-Val-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu (OtBu)-Gly-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys (B oc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp (Boc)-Leu-Val-Lys (Boc)-Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 7)；及所述裂解混合物是选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、TFA/苯酚/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水/ 苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、TFA/TES 裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。
5.根据权利要求4用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，其中所述能产生肽的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG 的Fmoc-Rink酰胺树脂和Sieber酰胺树脂。
6.根据权利要求5用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的方法，其中 所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/水混合物；和所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂和基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。
7.根据权利要求6用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，其中所述能够产生肽酰胺的树脂是Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂。
8.根据权利要求7用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，其中步骤(d)包括步骤(d-Ι)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(d-2)浓缩(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液; (d-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) /裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(d-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)来进行N-O转化逆转；(d-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)溶液；及 (d-6)分离和纯化(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。
9.根据权利要求8用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，其中所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在弱碱介质里、和其后把PH调低回到大约自3到3. 7来完成。
10.根据权利要求9用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述从树脂去除Fmoc基团使用DMF中的哌啶来完成。
11.根据权利要求10用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO 2)的方法，其中所述DMF中的哌啶浓度是大约25% (ν/ν)。
12.根据前述权利要求任何一项用于合成(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2)的方法，其中(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的氨基酸残基使用选自TBTU/ HOBt, TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合来偶联。
13.根据权利要求12用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中使用或者TBTU/HOBt或者TBTU/HBTU/DIEA的偶联试剂组合偶联(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前四个氨基酸残基；和使用选自 HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HBTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/ HOAt、HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合偶联N末端组氨酸。
14.根据权利要求13用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述用于偶联(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端前四个氨基酸残基的偶联试剂组合是TBTU/HOBt ；和所述用于偶联N末端组氨酸的偶联试剂组合是HATU/DIEA。
15.根据权利要求14用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中(Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前29个氨基酸残基用大约3. O 当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的 DIEA，在大约5倍过量体积的DMF中偶联；和使用大约3. 4当量的Boc-His (Trt) -0H、大约4. 08当量的HATU和大约9. O当量的 DIEA，在大约5倍过量体积DMF中偶联N末端组氨酸。
16.根据权利要求1用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8'35)hGLP-1 (7-35)-NH2 (SEQID NO :9)的C末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团，来产生侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly -Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 3)；(b)用裂解混合物处理侧链保护的His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-V al-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-GIu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 3)和从中去除侧链保护基团来产生粗制的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；禾口(c)分离和纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)来产生纯化的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)。
17.根据权利要求16用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，还包括步骤(a-Ι)去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护的树脂以从树脂去除Fmoc基团； (a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上以产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；和 (a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂； 这些步骤在步骤(a)之前。
18.根据权利要求17用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO 2)的方法，其中在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (I^bf)-OH ； 所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (Pbf) -OH和Fmoc-Arg (Pbf)树脂； 所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的ArgO^bf)树脂；所述通式(Aib8'35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO :9)自 C 末端到 N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (Boc) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-0H> Fmoc-Ser (tBu)-0H> Fmoc-Thr (tBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc—Gly—OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Aib-OH 禾口 Fmoc-His(Trt)-OH ；所述侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树月旨(SEQ ID NO 3) 是 His (Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Phe-Ile-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 10)；和所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、TFA/苯酚 /水/TIPS裂解混合物，TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。
19.根据权利要求18用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述能产生肽的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG 的Fmoc-Rink酰胺树脂和Sieber酰胺树脂。
20.根据权利要求19用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/水混合物；和所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂和基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。
21.根据权利要求20用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述能够产生肽酰胺的树脂是Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂。
22.根据权利要求21用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中步骤(C)包括步骤(c-1)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(c-2)浓缩(Aib8'35)hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液;(c-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) /裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(c-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8'35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)来完成N-O转化逆转；(c-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)溶液；和(c-6)分离和纯化(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。
23.根据权利要求22用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中步骤(c-4)中所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) 在弱碱介质里、然后把PH调低回到大约自3到3. 7来完成。
24.根据权利要求23用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述自树脂中去除Fmoc基团使用DMF中的哌啶来完成。
25.根据权利要求M用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述DMF中的哌啶浓度是约25% (ν/ν)。
26.根据权利要求16-25 中任意一项用于合成(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2)的方法，其中(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)的氨基酸残基使用选自TBTU/ HOBt, TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合来偶联。
27.根据权利要求沈用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中 (Aib8'35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的氨基酸残基使用或者 TBTU/HOBt 或者 TBTU/ HBTU/DIEA的偶联试剂组合来偶联。
28.根据权利要求27用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中 (Aib8'35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的氨基酸残基使用TBTU/HOBt偶联试剂组合偶联。
29.根据权利要求观用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中 (Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的氨基酸残基用大约3. O当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的DIEA，在大约5倍过量体积的DMF中偶联。
全文摘要
本发明涉及用于大规模合成(Aib8，35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO2)(即His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2(SEQ ID NO2))的方法，其包括固相Fmoc化学合成。
文档编号A61K38/00GK102223890SQ200980146319
公开日2011年10月19日 申请日期2009年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者F·赫利, S·R·约翰逊, T·C·拉夫曼, 董正欣 申请人:益普生制造爱尔兰有限公司
技术领域：
本发明涉及用于大规模合成(Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)(即 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-I Ie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2 (SEQ ID NO :2))的新方法，其包含固相 Fmoc 化学合成(Fmoc-chemi stry)。
背景技术：
胰高血糖素样肽1(7-36)酰胺(GLP-I) (SEQ ID NO 1)通过组织特异性翻译后加工胰高血糖素前体——前胰高血糖素原在小肠L细胞中合成并响应于膳食释放到循环中。有观察显示GLP-I的治疗潜力，单次皮下剂量的GLP-I能完全正常化患有非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)病人的餐后葡萄糖水平(Gutniak，M. K.等，1994，Diabetes Care, 14 1039-44)。此效果被认为由胰岛素释放增加和胰高血糖素分泌降低来介导。然而，GLP-I代谢不稳定，体内具有仅1到2分钟的血浆半衰期。外部施加的GLP-I也很快被降解(Deacon， C. F.等，1995，Diabetes,44 :1126-1131).在PCT 公开编号 WO 00/34331 中公布了 (Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO: 2)，其比天然GLP-I更有活性和/或代谢上更稳定，所述公开的内容在此以其整体引入。然而，在 WO 00/34331 的 18-19 页提供的(Aib8'35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的合成描述不适用于肽的商业规模生产，因为在此使用的MBHM4-甲基二苯甲基胺)树脂需要用氢氟酸除去肽。除了对这种极端腐蚀性材料大规模使用的安全考虑之外，还需要特殊装置来保证其使用。一般基于氢氟酸裂解的方案需要大量投资来保证其对于工业化规模是安全和可放大的。因此，需要发展有效的大规模方法用于生产(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)。
发明内容
本发明提供了用于合成(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的新方法，其包括逐步固相Fmoc化学合成。一方面，本发明提供了用于合成(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO : 的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8’35) hGLP-1 (8-35)-NH2 (SEQ ID NO :8)的 C 末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团， 来产生侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-G In-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 4)；(b)偶联侧链保护的 Boc-His-OH 与侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-A sp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO :4)来产生侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-S er-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-VaI-Lys-Aib-Arg 树月旨(SEQ ID NO :5)。(c)用裂解混合物处理侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 5)并从其中去除侧链保护基团和N末端保护基团，由此产生粗制的(Aib8'35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)；及(d)分离并纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)来产生纯化的 (Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案还包括步骤(a-D去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护树脂来从树脂去除Fmoc基团；(a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上来产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；及(a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂；这些步骤在步骤(a)之前。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (Pbf) -OH ；所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (Pbf)树脂；所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的Arg (Pbf)树脂；所述通式(Aib8’35)hGLP-1 (8-35)-NH2 (SEQ ID NO :8)自 C 末端到 N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp (Boc) -0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-0H， Fmoc-Ser(tBu)-0H， Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH， Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH,和 Fmoc-Aib-OH ；所述侧链保护的Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 4) 是 Aib-Glu (OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-IIe-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ IDNO :6)；所述侧链保护的 Boc-Hi s-OH 是 Boc-Hi s (Trt) -OH ；所述侧链保护的Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树月旨(SEQ ID NO 5)是 Boc-His CTrt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys ( Boc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp (Boc)-Leu-Val-Lys (Boc)-Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 7)；及所述裂解混合物是选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、 TFA/苯酚/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、 TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能产生肽的树脂选自 Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂和 Sieber酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/ 水混合物；及所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM 树脂、基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能够产生肽酰胺的树脂是 Fmoc-Rink 酰胺-MBHA 树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于步骤(d)包括步骤(d-Ι)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(d-2)浓缩(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)/ 裂解混合物滤出液；(d-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(d-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2) 来进行N-O转化逆转(shift reversal)；(d-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8’35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ IDNO :2)溶液 ’及(d-6)分离和纯化(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在弱碱介质里、然后把pH调低回到大约自3 到3. 7来完成。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述自树脂中去除Fmoc基团使用 DMF中的哌啶来完成。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述DMF中的哌啶浓度是约25% (ν/ν)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用选自TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/ DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA 和 HCTU/HOBt/DIEA 的偶联试剂组合偶联(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQID NO :2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于 使用或者TBTU/HOBt或者TBTU/HBTU/DIEA的偶联试剂组合偶联(Aib8’35)
hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前四个氨基酸残基；和使用选自 HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HBTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合偶联N末端组氨酸。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述用于偶联(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)自C末端前四个氨基酸残基的偶联试剂组合是TBTU/HOBt ；和所述用于偶联N末端组氨酸的偶联试剂组合是HATU/DIEA。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于(Aib8'35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前四个氨基酸残基用大约 3. 0当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的DIEA(在大约5倍过量体积的DMF中)偶联；和使用大约3. 4当量的Boc-His (Trt) _0H、大约4. 08当量的HATU和大约9. O当量的 DIEA (在大约5倍过量体积DMF中)偶联N末端组氨酸。另一方面，本发明提供了根据权利要求1合成(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8’35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQID NO :9)的 C末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团， 来产生侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-G Iy-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 3)；
(b)用裂解混合物处理侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO⑶和从中去除侧链保护基团由此产生粗制的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；禾口(c)分离和纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)来产生纯化的 (Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案还包括步骤(a-Ι)去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护的树脂来从树脂去除Fmoc基团；(a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上来产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；和(a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂；这些步骤在步骤(a)之前。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (Pbf) -OH ；所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (Pbf) -OH和Fmoc-Arg (Pbf)树脂；
所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的Arg (Pbf)树脂；所述通式(Aib8'35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO :9)自 C 末端至Ij N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-0H、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (Boc) _0H、 Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Leu-0H、 Fmoc—Tyr(tBu)-OH、 Fmoc—Ser(tBu)-OH、 Fmoc—Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-0H> Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-0H、 Fmoc-Phe-0H> Fmoc—Thr (tBu)-OH、Fmoc-Gly-0H> Fmoc—Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH 禾口 Fmoc-His(Trt)-OH ；所述侧链保护的His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Le u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 3)是 His (Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-V al-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu (OtBu)-Gly-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pbf)树月旨(SEQ ID NO :10)； 和所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、TFA/ 苯酚/水/TIPS裂解混合物，TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水 /苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、TFA/ TES裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能产生肽的树脂选自 Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂和 Sieber酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/ 水混合物；和所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM 树脂和基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述能够产生肽酰胺的树脂是 Fmoc-Rink 酰胺-MBHA 树脂。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于步骤(C)包括步骤(c-1)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(c-2)浓缩(Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液；(c-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(c-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2) 来完成N-O转化逆转；(c-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2)溶液；禾口(c-6)分离和纯化(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于步骤(c-4)中所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在弱碱介质里、然后把pH调低回到大约自3到3. 7来完成。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述自树脂中去除Fmoc基团使用 DMF中的哌啶来完成。
本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于所述DMF中的哌啶浓度是约25% (ν/ν)。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用选自TBTU/HOBt、TBTU/HBTU/ DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HATU/HOBt/DIEA 和 HCTU/HOBt/DIEA 的偶联试剂组合偶联(Aib8’35) hGLP_l (7-36)-NH2 (SEQID NO :2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用或者TBTU/HOBt或者TBTU/ HBTU/DIEA 的偶联试剂组合偶联(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于使用TBTU/HOBt偶联试剂组合偶联(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的氨基酸残基。本发明的前述方面的优选实施方案其特征在于(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)的氨基酸残基用大约3. 0当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约 2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的DIEA (在大约5倍过量体积的DMF中)偶联。详细描述申请书使用下列缩写
ACN 乙腈
AM氨甲基
Boc叔丁 IuSJ^
DCM 二氯曱烷
DICN,N' -二异丙二亚胺
DIEA N, N-二异丙基乙胺
DMF 二甲基曱醜腰
12DTT二疏苏糖醇
EDT乙烷二硫醇
Fmoc芴曱氧
HATU0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲镥六氟磷酸盐
HBTU2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲镥六氟磷酸盐
HOAt1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt1-羟基笨并三唑
HPLC高压液相层析
LOD干燥失重
MBHA 4-曱基二苯曱胺
MTBE甲基叔丁醚
OtBu叔丁酯
Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氢笨并呋喃-5-磺醜基
PEG聚乙二醇
TBTU2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四曱基脲镥四氟硼酸酯，
tBu叔丁醚
TES三乙烷
TFA三氟乙酸
TIPS三异丙基娃燒
Trt三苯曱基基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂是带有Fmoc-Rink酰胺连接的树脂，其中树脂的构成珠包括PEG成分。基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂的一些非唯一示例是NovaPeg、 NovaGel 和 AM SURE。在此使用的术语“裂解混合物”是指用于从树脂去除或裂解经组装的肽的试剂混合物。此外，裂解混合物还用于去除所有侧链保护基团和N末端保护基团。在此使用的关于参数或数量的术语“大约”，意指参数或数量在所述参数或数量的士5%以内。下面的实施例描述用于说明本发明方法的目的，并不解释为以任何方式限制本发明。合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在装备有压缩空气发动机和 PTFE 搅拌器的35升玻璃反应器(Quark，Vineland, NJ，美国)中合成。使用具有0. 63毫摩尔/克掺入量的Fmoc Rink酰胺MBHA树脂(Merck Biosciences，Darmstadt，德国)。使用的 Fmoc 氨基酸(Synthetech Inc.，Albany，0R，美国)带有下列侧链保护Rnoc-Arg (Pbf)-OH、 Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Gln (Trt)-OH、Boc-His (Trt)-0H、 Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH 禾口 Fmoc-Tyr (tBu) -0H。下列 Rnoc 氨基酸不需要侧链保护Rnoc-Aib-OH、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH、Fmoc-I Ie-OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH 禾口 Fmoc-Val-OH。合成以0. 63摩尔规模进行(投入1千克树脂)。前四个氨基酸(除了 N末端组氨酸以外的全部)在4. 5升DMF中用3. O当量的氨基酸偶联并用2. 94当量TBTU(Fluka， kelze，德国)、2· 94 当量 HOBt (Fluka，Seelze，德国)和 4· 5 当量 DIEA(Sigma_Aldrich， Gillingham，英国)预活化。偶联时间是60分钟。Boc-His CTrt)-OH用4. 5升DMF中的3. 4 当量氨基酸、4. 08 当量 HATU(AppliedBiosystems，Framingham, MA，美国)和 9 当量 DIEA 偶联。在最初偶联之前和后来每一偶联之后用DMF中的hlO升25% (ν/ν)哌啶(BASF，德国)进行树脂去保护。在树脂上完成肽组装时，用10升甲醇(Labscan，Dublin,爱尔兰)洗涤树脂两次并在真空炉(Mason Technology，Dublin，爱尔兰)中干燥至LOD (干燥失重)小于1%。最初用反应器中的氮干燥树脂，最后干燥在真空炉内以环境温度大约22°C、小于50mbar来进行。完全的干燥过程用了 3天。得到4200克肽基树脂。对每一亚份，使用8. 4升TFA/TIPS/水(80/14. 3/5. 7% ν/ν)裂解混合物170分钟在6x700g的亚份中从树脂上裂解肽并去除肽的侧链保护基团。用0. 7升TFA洗涤树脂和合并滤出液。用旋转蒸发器(Buchi，Flawil，Switzerland)浓缩裂解混合物到其最初重量的14%到32%并在13. 6至17. 5升搅动MTBE (Labscan，Dublin，爱尔兰)中沉淀粗肽。 粗肽进一步以1. 5至7. 5升MTBE洗涤。N-O转化的逆转通过在乙酸铵缓冲液(10克肽/100毫升，10% w/v,即，10克肽 /100毫升缓冲液，PH 8-9)中浆化粗沉淀肽60分钟来完成。用14至18升冰乙酸调pH至 3. 3-3. 7以产生清澈粗肽溶液，其HPLC纯度大约是50%。在纯化前通过0. 45微米滤器 (Pall Gelman SciencesInc.，New York, NY，美国)过滤肽溶液。使用装载Cw稳定相(EKA Chemicals AB, Bohus，瑞典)的反相制备型HPLC柱 (Novas印，Pompey，法国)纯化肽。在使用水和乙腈中的0. 1% TFA的梯度洗脱条件下进行纯化。使用乙酸铵和乙酸缓冲液进行盐交换层析步骤来产生乙酸盐。具体地，装填肽到 HPLC柱。在柱上用乙酸铵缓冲液洗涤肽1小时，然后用乙酸/乙腈梯度从柱上洗脱肽。基于HPLC分析纯化肽的纯度大于99%。具体地，在旋转蒸发仪(最大温度40°C ) 上浓缩肽溶液，和通过0.45微米滤器(Pall GelmanSciences Inc.，New York, NY，美国) 过滤产生的溶液并且冻干。用于最终组氨酸偶联的HATU/DIEA 系统，与 TBTU/HBTU/DIEA、TBTU/HOBt/ DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt 或 HATU/HOBt/DIEA 系统相比，导致四摩尔向(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)更好的转换，并因此增加了产量。 此外，使用Boc保护的组氨酸，和Fmoc保护的组氨酸相比，给出更好产量并允许加工时间的少量缩短，因为在裂解前不需要去除Fmoc。如下表所显示，在组氨酸偶联和从树脂
14上裂解方面进行实验性研究的统计设计，来选择试剂比例和反应时间的最适组合以增高产量。本领域众所周知，N-O转化是酰基的转化，其形成于含有苏氨酸或丝氨酸残基的肽暴露于酸性条件期间。它们产生了异构体杂质，其降低产量并且难于纯化。通过保持肽于弱碱性介质(如，PH8-9)和其后调节pH回至大约3逆转这些N-O转化。前述过程允许N-O 转化逆转以浆的方式进行，其相较完全基于溶液的逆转过程有规模上的优势。表1 针对最优化(Aib8’35)hGLP-l(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2) N 末端组氨酸残基偶
联的实验研究(和其产量/纯度结果)的小规模设计
权利要求
1.用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36) -NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，其包括逐步固相 Fmoc-化学合成。
2.根据权利要求1用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8'35)hGLP-1 (8-35) -NH2 (SEQID NO 8)的C末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团，来产生侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 4)；(b)偶联侧链保护的Boc-His-OH 于侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-V al-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Ai b-Arg 树脂(SEQ ID NO :4)来产生侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-A sp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Ly s-Aib-Arg 树月旨(SEQ ID NO :5)；(c)用裂解混合物处理侧链保护的Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val -Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 5)并从中去除侧链保护基团和N末端保护基团，产生粗制的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)；及(d)分离并纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)来产生纯化的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)。
3.根据权利要求2用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，还包括步骤(a-1)去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护的树脂来从树脂上去除Fmoc基团； (a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上来产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；及 (a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂； 这些步骤在步骤(a)之前。
4.根据权利要求3用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO 2)的方法，其中 在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (I^bf)-OH ；所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (I^bf)树脂； 所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的ArgO^bf)树脂；所述通式(Aib8'35) hGLP-1 (8-35) -NH2 (SEQ ID NO :8)自 C 末端到 N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (Boc) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser (tBu)-0H> Fmoc-Thr(tBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH 和 Fmoc-Aib-OH ；所述侧链保护的 Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly -Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树月旨(SEQ ID NO :4)是A ib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBU)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Phe-IIe-Ala -Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 6)； 所述侧链保护的 Boc-His-OH 是 Boc-His (Trt) -OH ；所述侧链保护的 Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Le u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 5)是 Boc-His (iTrt) -Aib-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (O tBu)-Val-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Tyr (tBu)-Leu-Glu (OtBu)-Gly-Gln (Trt)-Ala-Ala-Lys (B oc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp (Boc)-Leu-Val-Lys (Boc)-Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 7)；及所述裂解混合物是选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、TFA/苯酚/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水/ 苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、TFA/TES 裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。
5.根据权利要求4用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，其中所述能产生肽的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG 的Fmoc-Rink酰胺树脂和Sieber酰胺树脂。
6.根据权利要求5用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的方法，其中 所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/水混合物；和所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂和基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。
7.根据权利要求6用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，其中所述能够产生肽酰胺的树脂是Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂。
8.根据权利要求7用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的方法，其中步骤(d)包括步骤(d-Ι)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(d-2)浓缩(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液; (d-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) /裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(d-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)来进行N-O转化逆转；(d-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)溶液；及 (d-6)分离和纯化(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。
9.根据权利要求8用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的方法，其中所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)在弱碱介质里、和其后把PH调低回到大约自3到3. 7来完成。
10.根据权利要求9用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述从树脂去除Fmoc基团使用DMF中的哌啶来完成。
11.根据权利要求10用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO 2)的方法，其中所述DMF中的哌啶浓度是大约25% (ν/ν)。
12.根据前述权利要求任何一项用于合成(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2)的方法，其中(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)的氨基酸残基使用选自TBTU/ HOBt, TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合来偶联。
13.根据权利要求12用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中使用或者TBTU/HOBt或者TBTU/HBTU/DIEA的偶联试剂组合偶联(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前四个氨基酸残基；和使用选自 HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HBTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/ HOAt、HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合偶联N末端组氨酸。
14.根据权利要求13用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述用于偶联(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端前四个氨基酸残基的偶联试剂组合是TBTU/HOBt ；和所述用于偶联N末端组氨酸的偶联试剂组合是HATU/DIEA。
15.根据权利要求14用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中(Aib8,35) hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2)自C末端的前29个氨基酸残基用大约3. O 当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的 DIEA，在大约5倍过量体积的DMF中偶联；和使用大约3. 4当量的Boc-His (Trt) -0H、大约4. 08当量的HATU和大约9. O当量的 DIEA，在大约5倍过量体积DMF中偶联N末端组氨酸。
16.根据权利要求1用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，包括步骤(a)用侧链保护的精氨酸树脂，从(Aib8'35)hGLP-1 (7-35)-NH2 (SEQID NO :9)的C末端到N末端连续偶联Fmoc-氨基酸，其中在每一连续偶联步骤后从N末端去除Fmoc基团，来产生侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly -Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg 树脂(SEQ ID NO 3)；(b)用裂解混合物处理侧链保护的His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-V al-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-GIu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树脂(SEQ ID NO 3)和从中去除侧链保护基团来产生粗制的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；禾口(c)分离和纯化粗制(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)来产生纯化的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2(SEQ ID NO :2)。
17.根据权利要求16用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，还包括步骤(a-Ι)去保护能产生肽酰胺的Fmoc保护的树脂以从树脂去除Fmoc基团； (a-2)附着侧链保护的Fmoc-Arg-OH到树脂上以产生侧链保护的Fmoc精氨酸树脂；和 (a-3)从侧链保护的Fmoc精氨酸树脂去除Fmoc基团来产生侧链保护的精氨酸树脂； 这些步骤在步骤(a)之前。
18.根据权利要求17用于合成(Aib8'35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO 2)的方法，其中在步骤(a-2)中所述的侧链保护的Fmoc-Arg-OH是Fmoc-Arg (I^bf)-OH ； 所述侧链保护的Fmoc-精氨酸树脂是Fmoc-Arg (Pbf) -OH和Fmoc-Arg (Pbf)树脂； 所述侧链保护的精氨酸树脂是侧链保护的ArgO^bf)树脂；所述通式(Aib8'35) hGLP-1 (7-35) -NH2 (SEQ ID NO :9)自 C 末端到 N 末端的 Fmoc 氨基酸是 Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (Boc) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Lys (Boc)-0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (Trt)-0H> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-0H> Fmoc-Ser (tBu)-0H> Fmoc-Thr (tBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc—Gly—OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Aib-OH 禾口 Fmoc-His(Trt)-OH ；所述侧链保护的 His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg树月旨(SEQ ID NO 3) 是 His (Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Phe-Ile-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Lys (Boc) -Aib-Arg (Pbf)树脂(SEQ ID NO 10)；和所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物、TFA/苯酚 /水/TIPS裂解混合物，TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/EDT裂解混合物、TFA/苯酚/水/苯硫基甲烷/1-十二烷硫醇裂解混合物、TFA/DTT/水/TIPS裂解混合物、TFA/苯酚裂解混合物、TFA/苯酚/甲磺酸裂解混合物、TFA/苯硫基甲烷/EDT/苯甲醚裂解混合物、TFA/TES裂解混合物、TFA/水裂解混合物、TFA/DCM/吲哚裂解混合物和TFA/TIPS裂解混合物。
19.根据权利要求18用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述能产生肽的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂、基于PEG 的Fmoc-Rink酰胺树脂和Sieber酰胺树脂。
20.根据权利要求19用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述裂解混合物选自TFA/TIPS/水裂解混合物、TFA/TIPS/DCM裂解混合物和TFA/水混合物；和所述能够产生肽酰胺的树脂选自Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂、Fmoc-Rink酰胺-AM树脂和基于PEG的Fmoc-Rink酰胺树脂。
21.根据权利要求20用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述能够产生肽酰胺的树脂是Fmoc-Rink酰胺-MBHA树脂。
22.根据权利要求21用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中步骤(C)包括步骤(c-1)过滤以去除树脂来产生(Aib8’35)hGLP-l (7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)/裂解混合物滤出液；(c-2)浓缩(Aib8'35)hGLP-1 (7-36) -NH2 (SEQ ID NO :2) / 裂解混合物滤出液;(c-3)从浓缩的(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) /裂解混合物滤出液中沉淀粗制(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)；(c-4)在乙酸铵缓冲液中浆化粗沉淀(Aib8'35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)来完成N-O转化逆转；(c-5)调整浆液 pH 来产生(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)溶液；和(c-6)分离和纯化(Aib8’35)hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)。
23.根据权利要求22用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中步骤(c-4)中所述N-O转化逆转通过保持粗沉淀(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2) 在弱碱介质里、然后把PH调低回到大约自3到3. 7来完成。
24.根据权利要求23用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述自树脂中去除Fmoc基团使用DMF中的哌啶来完成。
25.根据权利要求M用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中所述DMF中的哌啶浓度是约25% (ν/ν)。
26.根据权利要求16-25 中任意一项用于合成(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO: 2)的方法，其中(Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ IDNO :2)的氨基酸残基使用选自TBTU/ HOBt, TBTU/HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HCTU/DIEA、TBTU/HOBt/DIEA、DIC/HOBt、DIC/HOAt、 HATU/HOBt/DIEA和HCTU/HOBt/DIEA的偶联试剂组合来偶联。
27.根据权利要求沈用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中 (Aib8'35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的氨基酸残基使用或者 TBTU/HOBt 或者 TBTU/ HBTU/DIEA的偶联试剂组合来偶联。
28.根据权利要求27用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中 (Aib8'35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO 2)的氨基酸残基使用TBTU/HOBt偶联试剂组合偶联。
29.根据权利要求观用于合成(Aib8’35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ IDNO :2)的方法，其中 (Aib8’35) hGLP-1 (7-36)-NH2 (SEQ ID NO :2)的氨基酸残基用大约3. O当量的每种Fmoc氨基酸、大约2. 94当量的TBTU、大约2. 94当量的HOBt和大约4. 5当量的DIEA，在大约5倍过量体积的DMF中偶联。
全文摘要
本发明涉及用于大规模合成(Aib8，35)hGLP-1(7-36)-NH2(SEQ ID NO2)(即His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2(SEQ ID NO2))的方法，其包括固相Fmoc化学合成。
文档编号A61K38/00GK102223890SQ200980146319
公开日2011年10月19日 申请日期2009年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者F·赫利, S·R·约翰逊, T·C·拉夫曼, 董正欣 申请人:益普生制造爱尔兰有限公司
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