涉及脑膜炎球菌外膜囊泡的改进的制作方法
专利名称：涉及脑膜炎球菌外膜囊泡的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于免疫目的的脑膜炎球菌外膜囊泡领域。
技术背景赋予抗脑膜炎奈瑟球菌(A^;wen'a mem77g/f/cfc)(脑膜炎球菌)感染的免疫力的各种 方法之一是使用外膜囊泡(OMV)。挪威国立公众健康研究所(Norwegian National Institute of Public Health)已经制造了抗血清群B的有效OMV疫苗['MenBvac ，； 例如，参考文献l]，尽管这种疫苗是安全的并能预防MenB疾病，但其功效仅限于 用来制备疫苗的同源血清型。'RIVM，疫苗基于含有六种不同PorA亚型的OMV。它已在II期临床试验中在 儿童中显示出免疫原性[2]。参考文献3公开了抗血清群B脑膜炎球菌不同致病血清型的疫苗，该疫苗基于保 留了 65kDa蛋白复合体的OMV。参考文献4公开了含有遗传工程改造的脑膜炎球菌 菌株OMV的疫苗，所述OMV包含至少一种1类外膜蛋白(OMP)但不含2/3类OMP。 参考文献5公开了含有在其表面环中有突变的OMP的OMV以及含有脑膜炎球菌脂 多糖(LPS)衍生物的OMV。参考文献6公开了制备基于OMV的血清群A脑膜炎球 菌疫苗的方法。已有多种提高OMV功效的建议。参考文献7公开了添加有运铁蛋白结合蛋白(例 如，TbpA和TbpB)和/或Cu，Zn-超氧化物歧化酶的含有OMV的组合物。参考文献8 公开了添加有各种蛋白质的含有OMV的组合物。参考文献9公开了从具有修饰的/w 基因的脑膜炎奈瑟球菌(A^.wem7^/^fo)获得的膜囊泡制品。参考文献26称，同时敲 除戸"和Qtw可上调似;x4的表达。为制备OMV的脑膜炎奈瑟球菌的其它敲除突变 体公开于参考文献26-28。与这些通过改变表达模式而改进OMV的尝试不同，参考 文献29将注意力集中在改变OMV的制备方法，并称，通过避免使用诸如脱氧胆酸 盐之类的去污剂可以在提取囊泡时保留诸如NspA的抗原。脑膜炎球菌OMV不能引起抗非同源血清型的交叉保护限制了它们作为通用疫苗 的用途，但它们对于己经基本上克隆出致病菌株的流行性疾病非常有效。因此，Finlay Institute的疫苗(VA-MENGOC-BCTM)已经被用于拉丁美洲，该处的血清群B疾病主 要是Pl.19,15血清型，但这种疫苗在其它地方无效[IO]。类似地，Chiron的MeNZBTM 疫苗的耙标是自1991年以来在新西兰流行的流行性菌株(P1.7b,4，最新的命名法又称 为P 1.7-2,4)。参考文献11公开了含有多价脑膜炎球菌细胞泡(bleb)组合物的疫苗，包括衍生自 脑膜炎球菌菌株的第一细胞泡，该菌株具有在使用国流行的血清亚型和衍生自脑膜 炎球菌菌株的第二细胞泡，该菌株无需具有在使用国流行的血清亚型。本发明的目的是提供其它和改进的脑膜炎球菌OMV制品。发明内容使用MeNZBTM的经验显示，抗特定流行性菌株的OMV对于控制疾病地方性爆 发非常有效。联用大规模并可再现的制备技术可在疾病爆发后迅速制备疫苗。因此， 本发明提供了制造脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗的方法，该方法包括以下步骤(i) 鉴定与脑膜炎球菌性脑膜炎爆发有关的脑膜炎球菌菌株的血清亚型；(ii)从具有步骤 (i)中鉴定的血清亚型的脑膜炎球菌菌株制备OMV用于制备疫苗。该方法可包括以下 一个或两个额外步骤(iii)将所述OMV配制成疫苗；禾t1(iv)在被或者可能被所述疾 病爆发影响的地理区域分销所述疫苗。就已经鉴定出相关血清亚型的情况而言，本 发明还提供了相同但省略了步骤(i)的方法。所述脑膜炎球菌菌株将通常为血清群B， 当也可以是血清群A、 C、 W135、 Y等。使用MeNZBTM的经验还提示发明人，OMV可单独或组合用于赋予抗脑膜炎球菌 血清群A、 C、 W135和Y的免疫力，因此其制备成本可能低于目前的缀合(conjugate) 疫苗。因此，本发明提供了 (a)含有脑膜炎球菌血清群C菌株的外膜囊泡的组合物； (b)含有脑膜炎球菌血清群W135菌株的外膜囊泡的组合物；(c)含有脑膜炎球菌血 清群Y菌株的外膜囊泡的组合物；和(d)含有脑膜炎球菌血清群A、 B、 C、 W135 和Y中两种或多种的外膜囊泡的组合物。在(d)中，优选的组合物包含以下血清群的混合物A+B; A+C; A+W135; A+Y; B+C; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y;W135+Y; A+B+C; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y; C+W135+Y; A+B+C+W135; A+B+C+Y; B+C+W135+Y;禾口 A+B+C+W135+Y。由于血清群间共有亚荚膜(sub-capsular)抗原，因此OMV(和OMV混合物)能保护 抵抗除制备它们的血清群之外的血清群。例如，在萨哈拉沙漠以南非洲发现的血清 群A和W135菌株与在世界其它地方发现的血清群C和Y菌株共有亚荚膜抗原。因 此，本发明提供了第一血清群脑膜炎球菌菌株的OMV在保护抵抗一种或多种第二血 清群脑膜炎球菌菌株中的应用，其中所述第一和第二血清群不同。即便所述菌株具 有不同血清型，但它们可能共有亚荚膜抗原，并且可能具有相同亚型、血清亚型和/ 或免疫型。优选血清群A和W135的OMV混合物，也优选血清群C和Y的OMV 混合物。使用MeNZBTM的经验还提示发明人，新西兰OMV、挪威OMV和古巴OMV所 用菌株的OMV混合物有效。因此，本发明提供了含有以下两种或三种外膜囊泡的组 合物(i)血清亚型P1.7b,4脑膜炎球菌；(ii)血清亚型P1.7,16脑膜炎球菌；和(iii)血 清亚型P1.9,15脑膜炎球菌。优选掺合不同的OMV，但也可以装在试剂盒内的不同容器内。发明人发现通过混合不同血清亚型的OMV可降低各种血清亚型的剂量而不会降 低功效。以总蛋白质计，VA-MENGOC-Btm含有50吗OMV(0.5 ml体积)、HexaMen 含有约1 mg OMV(0.3 ml体积)，而MenBVac"tm和MeNZBTM含有25吗OMV(0.5 ml 体积)，因此发明人发现使用混合物可以降低各OMV的剂量而不会降低各自的功效。 因此，本发明提供了含有第一脑膜炎球菌血清亚型和第二脑膜炎球菌血清亚型的外 膜囊泡的组合物，其中，第一血清亚型的OMV的浓度小于45pg/ml，第二血清亚型 的OMV的浓度小于45 pg/ml。本发明还提供了含有至少两种脑膜炎球菌血清亚型的 外膜囊泡的组合物，其中所述OMV的组合浓度小于90pg/ml。本发明还提供了含有 n种不同脑膜炎球菌血清亚型的外膜囊泡的组合物，其中，n种血清亚型中各自的 OMV浓度小于45吗/ml (即OMV的总剂量小于45n吗/ml)。 n的值可以是1、 2、 3、 4、 5、 6等。本发明还提供了含有从n种不同血清亚型制备的OMV的试剂盒。所述囊泡可单 独保存或储存在试剂盒中直到需要同时使用，例如作为掺合物，或者以供同时单独 或依次使用。类似地，本发明提供了一种方法，该方法包括制备n组OMV，每一 组来自n种不同血清亚型的每一种；和混合所述n组囊泡。所述不同的组可混合入 试剂盒中或为掺合物。本发明还提供了含有从具有P1.7b,4血清亚型的血清群B脑膜炎球菌菌株制备的OMV的组合物，其中，所述组合物中OMV的浓度约为50 pg/ml。所述组合物优选 含有氢氧化铝佐剂和组氨酸缓冲剂。所述组合物的剂量体积约为0.5 ml。 鹏本发明基于从脑膜炎奈瑟球菌制备的外膜囊泡(OMV)。术语"OMV"包括通过 破裂细菌外膜从而形成含有外膜蛋白质组分的外膜囊泡而获得的任何脂蛋白体囊 泡。OMV从细菌人工制备(例如，通过去污剂处理或者通过非去污剂方法[29])。该 术语也包括细胞泡、微泡(MV， [12])和'天然OMV' ( 'NOMV，， [13])，天然OMV 是在细菌生长过程中自发形成并释放到培养基中的天然形成的膜囊泡。可在肉汤培 养基中培养奈瑟菌属，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如通过过滤或低 速离心以便仅沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从除去细胞的培养基中收集MV(例 如通过过滤、通过差速沉降或聚集MV、通过高速离心以沉淀MV)，从而获得MV。 通常根据基于培养中MV的产量来选择用于制备MV的菌株，例如，参考文献14和 15公开了具有高MV产量的奈瑟菌属。OMV可用各种方法制备。适合制备的方法描述于，例如，这里引用的参考文献。 形成OMV的技术包括在足够高而不沉淀去污剂的pH下用胆酸盐去污剂(例如，石胆 酸盐、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、熊胆酸(ursocholicacid)等，优选 用脱氧胆酸钠[16和n]处理奈瑟菌属)处理细菌[6]。也可在基本上不含去污剂时采用 其它技术[29]，使用诸如超声、均质化(homogenisation)、微流体化、空泡形成、渗透 压休克、研磨、弗氏破碎、混合等。优选的制备OMV的方法包括超滤[18]而不是对粗制OMV进行高速离心。这样 可以在更短的时间内处理更大量的含OMV的上清液(通常4小时后内处理15升以 上，而高速离心10小时内只能处理不到1.5升)，并且无需在离心后再分散OMV。 超速离心能够更加方便地制备大量OMV，并能够从选择的菌株迅速制备OMV以用 于疫苗制备。舒欽吝资難雄絲歸樣可采用标准技术根据I类孔蛋白外膜蛋白(PorA)鉴定感兴趣的脑膜炎球菌的血清 亚型。 一旦测定了血清亚型则可常规寻找具有相同血清亚型的其它已知菌株。所述 其它菌株可共有第一菌株的血清群和/或血清型(PorB)，但这不是必需的。然而通常
优选血清群和血清亚型均匹配。用于本发明的脑膜炎球菌菌株通常是以下血清群之一A、 B、 C、 W135或Y。 用于本发明的脑膜炎球菌菌株通常不是表达多种血清亚型(即多PorA等位基因)的菌株。因此，优选的用于本发明的菌株将表达单一PorA序列，即它们将具有一种血清亚型。也能使用PorA已经下调的菌株，例如，与野生型的水平相比(例如，如参考文献 ll所述，与菌株H44/76相比)，已将PorA的量降低至少20%(例如，》30%、》40%、 >50%、》60%、》70%、》80°/。、 >卯％、 >95%等)，或者甚至敲除。用于本发明的脑膜炎球菌可以是任何血清型(例如，l、 2a、 2b、 4、 14、 15、 16 等)和/或任何免疫型(例如，Ll; L3,3，7; L10等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适 的谱系，包括超侵袭性(hyperinvasive)和超毒性(hypervimlent)谱系，例如，以下7种超毒性谱系中的任何一种亚群I;亚群III;亚群IV-I; ET-5复合体；ET-37复合体；A4群体(cluster);谱系3。这些谱系已通过多基因座酶电泳法(MLEE)鉴定，但也可 用多基因座序列分型(MLST)来分类脑膜炎球菌[参考文献19]，例如，通过MLST鉴 定ET-37复合体是ST-ll复合体，ET-5复合体是ST-32(ET-5)、谱系3是ST-41/44等。脑膜炎球菌可以具有一种或多种基因敲除突变。为降低热原(pyrogenic)活性，例 如，细菌可具有低内毒素(LPS)水平，这可通过敲除参与LPS生物合成的酶实现。合 适的突变型细菌已知，例如突变型奈瑟菌属[20,21]和突变型哈比特属 (i7e//cO^cto0[22]。从革兰阴性菌制备LPS耗尽型外膜的方法描述于参考文献23。除了下调特定蛋白质的表达，细菌可超量表达(相对于相应的野生型菌株)诸如 NspA、蛋白287[8]、蛋白741[30]、 TbpA[7]、 TbpB[7]、超氧化物歧化酶[7]等的免疫 原。除了已经敲除了特定内源基因，细菌可表达一种或多种非内源基因。例如，本发 明可使用相对于相应的野生型菌株能表达新基因的重组菌株。可通过各种技术实现 次种方式的非内源基因表达，例如，染色体插入(如用于引入多个PorA基因[24])、 敲入突变、从染色体外的载体(如从质粒)表达，等等。所述细菌也可包含一种或多种参考文献25-30中所述的敲除突变和/或超量表达 突变。优选的用于下调和/或敲除的基因包括(a) Cps、 CtrA、 CtrB、 CtrC、 CtrD、 FrpB、 GalE、 HtrB/MsbB、 LbpA、 LbpB、 LpxK、 Opa、 Opc、 PilC、 PorB、 SiaA、 SiaB、 SiaC、 SiaD、 TbpA禾口/或TbpB[25]; (b) CtrA、 CtrB、 CtrC、 CtrD、 FrpB、 GalE、 HtrB/MsbB、 LbpA、 LbpB、 LpxK、 Opa、 Opc、 PhoP、 PilC、 PmrE、 PmrF、 SiaA、 SiaB、 SiaC、 SiaD、 TbpA禾口/或TbpB[26]; (c) ExbB、 ExbD、 rmpM、 CtrA、 CtrB、 CtrD、 GalE、 LbpA、 LpbB、 Opa、 Opc、 PilC、 PorB、 SiaA、 SiaB、 SiaC、 SiaD、 TbpA 和/或TbpB[27];和(d)CtrA、 CtrB、 CtrD、 FrpB、 OpA、 OpC、 PilC、 PorB、 SiaD、 SynA、 SynB禾口/或SynC[28]。除了根据不同血清亚型混合OMV，也可按照其它标准进行混合。所述标准的例 子包括血清型(PorB， 2或3类OMP);免疫型(脂多糖或脂寡糖)；菌株的地理来源； 临床菌株的区域流行；超毒性谱系，例如亚群I、 III和IV-I、 ET-5复合体、ET-37复 合体、A4群体和谱系3中的两种或多种；多基因座序列分型(MLST)[19];三种不同 NMB1870变体中的一种以上[31]。现有脑膜炎球菌OMV疫苗为实施本发明提供了药物、剂量和配方指导。例如， VA-MENGOC-BCtm是0.5ml的可注射悬浮液，含有50吗吸收到2 mg氢氧化铝凝胶 上的菌株Cu-385-83的OMV和50吗血清群C荚膜多糖，并添加了 0.01%硫柳汞和 磷酸盐缓冲液。MeNZBTM也是0.5 ml的悬浮液，含有25吗吸收到1.65 mg氢氧化 铝佐剂上的菌株NZ98/254的OMV，并含有组氨酸缓冲液和氯化钠。MenBvac类似 于MeNZBTM，但从菌株44/76制备。各种亚型OMV的浓度应足够高以在给予患者之后提供保护性免疫力。本发明组 合物中OMV的浓度将通常为10-500 |ag/ml，优选25-200 ng/ml，更优选约50吗/ml 或约100 )ag/ml(以OMV中的总蛋白表示)。然而发明人发现，当组合物含有多种脑膜炎球菌血清亚型的OMV时，可降低各 血清亚型的剂量而不会影响功效。具体地说，新西兰和挪威亚型的剂量在0.5 ml剂 量中可从25昭减半至12.5吗而不会损失免疫原性。因此，含有多种脑膜炎球菌亚 型的外膜囊泡的本发明组合物的浓度可低于根据MenBvacTM和MeNZBTM简单混合 推理预测的100 |ig/ml，也低于根据VA-MENGOC-BCtm与MenBvacTM或MeNZB丁m 简单混合推理预测的150吗/ml。因此，本发明的这种组合物所含混合OMV的浓度 不超过90吗/m(例如，不超过80吗/ml、 70 |ig/ml、 60吗/ml、 50吗/ml、 40叱/ml、 30pg/ml，或者甚至更低)。更通常地，当组合物含有n种不同脑膜炎球菌亚型的外膜囊泡时，各种亚型的 OMV浓度小于45 lag/ml(例如，小于40 jag/ml、35 (ig/ml、30 (ig/ml、25 pg/ml、20 )ig/ml，
或者甚至更低)。优选的浓度约为25 pg/ml。当组合物含有n种不同脑膜炎球菌亚型的外膜囊泡时，各种亚型的OMV的量优 选彼此相差±10%以内，即该组合物含有基本上等量的各种OMV。然而， 一些情况 下， 一种亚型的量可能是另一种亚型的量的约x倍，其中的x是2、 3或4，例如该 组合物中一种亚型的剂量可以是组合物中其它亚型的两倍。 麟激资#欽本发明组合物可以是含有药学上可接受的载体的药物组合物。可采用包括掺合 OMV和药学上可接受载体的步骤的方法制备这种组合物。典型的'药学上可接受的载体'包括本身不诱导有害于接受组合物的个体的抗体 产生的任何载体。合适的载体一般是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、 多乳酸、多乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这 种载体是本领域普通技术人员所熟知的。疫苗也可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、蔗糖等。无菌 无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体(例如，基于注射用水)。药学上可接受的 赋形剂的详尽讨论见参考文献32。本发明的组合物通常为含水形式(例如，溶液或悬浮液)而不是干燥的形式(例如， 冻干的)。含水组合物也适合从冻干形式(例如，冻干的Hib缀合疫苗、冻干的脑膜炎 球菌缀合疫苗等)重建其它疫苗。在本发明组合物用于这种临时重建的情况中，本发 明提供了一种试剂盒，其中可包含两个药瓶或者可包含一个已经装好的注射器和一 个药瓶，注射器内的含水成分用于在注射之前复活药瓶内的干燥内容物。本发明组合物可装在药瓶内，或者可装在装好的注射器内。注射器可以配备或不 配备针头。所述组合物可以单位剂量形式或多剂量形式包装。注射器通常含有单剂 量组合物，而药瓶可含有单剂量或多剂量。因此，对多剂量形式而言，药瓶优于预 装的注射器。可常规建立有效剂量体积，但该组合物的典型人类剂量体积约为0.5ml，例如供 肌肉内注射。RIVM OMV疫苗以0.5 ml的体积[33]通过肌肉内注射给予大腿或上臂。 MeNZBTM以0.5 mi的体积通过肌肉内注射给予大腿前外侧或手臂的三角肌区域。类 似的剂量可用于其它给药途径，例如，OMV的雾化的鼻内疫苗每次喷射的体积约为 100或约130 p1[13]，四次喷射可给予约0.5 ml的总剂量。所述组合物的pH优选6和8之间，更优选6.5和7.5之间(例如，约7)。RIVM OMV
疫苗的pH为7.4[34]，本发明组合物的pH优选〈7.5。可采用缓冲液，如Tris缓冲液、 磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液以维持稳定的pH。本发明组合物通常包含缓冲液。如 果组合物含有氢氧化铝盐，则优选使用例如约1-10 mM、优选约5 mM的组氨酸缓 冲液[35]。 RIVMOMV疫苗用10mMTris/HCl缓冲液维持pH。所述组合物可以是无 菌和/或无热原的。本发明组合物相对于人来说可以是等渗透压的。本发明组合物是免疫原性的，更优选是疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即 用来防止感染)或治疗性(即用来治疗感染)的，但通常是预防性的。用作疫苗的免疫 原性组合物包含免疫学有效量的抗原以及所需要的任何其它组分。'免疫学有效量' 指给予个体该用量(单一剂量或作为系列剂量的一部分)对于治疗或预防有效。该用量 取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学分组(例如非人灵 长类、灵长类等等)、该个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗剂型、 主治医生对身体状况的评估以及其他相关因素而不同。估计该用量应处于可通过常 规试验确定的相对较宽的范围内。本发明组合物的抗原含量通常表示为每剂中蛋白 质的含量。OMV的鼻内疫苗的典型剂量是每毫升约0.9毫克蛋白质[13]。脑膜炎球菌影响身体的各个部位，因此本发明组合物可以以各种形式制备。例如， 该组合物可以制备成可注射的(液体溶液或悬浮液)。该组合物可以制备为肺部给药， 例如使用细微粉末或喷雾的吸入器的形式。该组合物可以制备为栓剂或阴道栓剂。 该组合物可以为鼻、耳或眼睛给药而制备成，例如制成喷雾、滴剂、凝胶或粉末[例 如，参考文献36和37]。通常通过肌肉内注射给予。本发明的组合物可包含抗微生物剂，尤其是当包装成多剂量形式时。疫苗中通常 可含有抗微生物剂如硫柳汞和2-苯氧乙醇，但优选使用不含汞的防腐剂或根本不使 用防腐剂。本发明的组合物可含有吐温(聚山梨醇酯)等去污剂，如吐温80。去污剂通常处于 例如<0.01%的低水平。本发明的组合物可含有OMV制备过程中残留的去污剂(例如，脱氧胆酸盐)。残 留去污剂的量优选小于每毫克蛋白质0.4 pg(更优选小于0.2 pg)。本发明的组合物可含有脑膜炎球菌的LPS。 LPS的量优选小于每毫克蛋白质0.12 吗(更优选小于0.05吗)。本发明组合物可含有钠盐(例如，氯化钠)以得到一定张力。NaCl的浓度通常为10 ±2 mg/ml。氯化钠的浓度优选约9 mg/ml。
本发明组合物通常联合其它免疫调节剂给予。具体地说，该组合物通常含有一种 或多种佐剂，同时，本发明提供了制备本发明组合物的方法，包括例如在药学上可 接受的载体中掺合本发明囊泡与佐剂的步骤。合适的佐剂包括但不限于A絲,激湖资^激适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如过氧化物(oxyhydroxide))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、 正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献38的第8和9章]，或不同矿物质化合物的混 合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸 附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒[39]。典型磷酸铝佐剂是P04/A1摩尔比在0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，包含 0.6mg Al3+/ml。可用低剂量磷酸铝吸附，例如每剂50-100吗Al3+。当使用磷酸铝， 由于溶液中含有游离的磷酸根离子(例如，使用磷酸盐缓冲液)，无需将抗原吸附到佐 剂上。测试了吸附到磷酸铝或氢氧化铝佐剂的RIVM疫苗，发现用磷酸铝佐剂能得到更 好结果[34]。 MeNZBTM、 MenBvacTM和VA-MENINGOC-BCTM产品都含有氢氧化铝佐剂。铝佐剂的典型剂量约为3.3 mg/ml(以A产的浓度表示)。 及适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献 38的第10章；也可参见参考文献40](利用微流化剂配制成亚微米颗粒的5%角鲨烯、 0.5%吐温80和0.5%司盘85)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。C.舒層厂参考擅JS麟"煮7皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、 甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。皂树 (^//toh印o"an'"MoUna)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜 (Sm//"x orwato)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹((^y;wop/H7/a/^m'cw/ata)(婚纱花 (brides veil))和肥皂草CS^o"an'fl q^c/朋afo)(皂根(soap root))。皁苷佐剂制剂包括纯 化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。 QS21的商品名为Stimulon 。也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术特别纯化 的部分，包括QS7、 QS17、 QS18、 QS21、 QH-A、 QH-B禾B QH-C。皂苷优选QS21。 参考文献41公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[42]。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫剌激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献 38的第23章]。ISCOM—般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已 知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、 QHA和QHC。参 考文献42-44进一步描述了 ISCOM。 ISCOM任选不含其它去污剂[45]。 皂苷佐剂开发的综述见参考文献46和47。 D.嫁毒银赫毒#微病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多 种任选与磷脂联用或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常是非病原性、非复制性， 通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于 病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙 肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口 蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、 RNA-噬菌体、Q(3-噬菌 体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty (例如逆转录转座子 Ty蛋白pl)。参考文献48-53进一步讨论了 VLP。例如，参考文献54进一步讨论了 病毒体。E 一智蘑或徵f激好主激适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒 衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。 3dMPL是具有4、 5或6条酰化链的3脱-0-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文 献55公开了 3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选"小颗粒"形式。3dMPL的这种"小 颗粒"足够小从而可经0.22 nm膜无菌过滤[55]。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰 基脂质A模拟物，例如氨基垸基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[56、 57]。脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174 描述于参考文献58和59。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键 与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序 列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。 CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可以是双链或单链的。参考文献60、 61和62公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取 代鸟苷。参考文献63-68进一步讨论了 CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[69]。 CpG序列，例如 CpG-AODN特异地诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-B ODN更特异地诱导B细 胞应答。参考文献70-72讨论了 CpG-A和CpG-B ODN。 CpG优选是CpG-AODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5'端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选 在它们的3'端相连以形成"免疫聚物"(immunomer)。参见，例如参考文献69和73-75。细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自 大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素"LT，、霍乱(病毒)("CT")或百日咳(病毒)("PT，〕。 参考文献76描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献77描 述了其作为胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。 A亚基优选含有解毒性突变；B亚基优选未突变。佐剂优选是解毒的LT突变体，例 如LT-K63、 LT-R72和LT-G192. ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63 和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献78-85。氨基酸取代的数字基准优选以参考文 献86所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础，该文献专门全文纳入本 文作为参考。F 乂免资源，;^适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-12[87]等)网、干扰素(如，干扰素-y)、巨噬细胞集落刺 激因子和肿瘤坏死因子。生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合 适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[89]，或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)的 交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生 物也可用作本发明的佐剂[90]。及微微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(a-羟酸)、 聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒 (即，直径约100 nm到150 pm，优选约200 nm到约30 |um，最优选约500 nm到约10 pm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表 面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。/.應质#/参考文就^游第",/7〃着)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献91-93。J -fr■^乙义煮^g^f 奢乙;^##煮y^/适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[94]。这种制剂还包括联用辛 苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[95]以及联用至少一种其它非离子表面活 性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[96]。优选的聚氧乙烯醚选自: 聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂 酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基 醚。K覆錄獻尸C尸尸)PCPP制剂描述于，例如参考文献97和98中。 丄.鹏縱适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异 谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺 (nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰 基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。M银赠#麼诺屏众^激适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献99和100中进一步描 述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")。本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物 可用于本发明(l)皂苷和水包油乳剂[101]; (2)皂苷(例如(^821)+无毒的LPS衍生 物(例如3dMPL)[102];(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) +胆 固醇；(4)皂苷(例如QS21) + 3dMPL + IL-12 (任选+固醇)[103]; (5)联用3dMPL 与例如QS21和/或水包油乳剂[104]; (6)含有10%角鲨烯、0.4%吐温80頂、5%普朗 尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或搅拌(vortex)产生 较大粒度的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)， (Ribi Immunochem)，其中含有2%角鲨 烯、0,2%吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(monophosphorylipid A) (MPL)、海 藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL + CWS (DetoxTM)组成的细
菌细胞壁组分；和(8) —种或多种矿物盐(例如铝盐)+ LPS的无毒衍生物(例如 3dMPL)。参考文献38的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。特别优选使用铝盐佐剂，且抗原通常吸附到这种盐上。对本发明的组合物而言， 可以将一些抗原吸附到氢氧化铝上而使其它抗原与磷酸铝结合。然而通常，优选仅 使用一种盐，例如氢氧化物或磷酸盐，而不使用两种。不需要吸附所有囊泡，即一 些或所有囊泡可游离在溶液中。本发明还提供了在哺乳动物内引起免疫反应的方法，所述方法包括给予所述哺乳 动物本发明药物组合物。所述免疫反应优选是保护性的并优选涉及抗体。该方法可在已经针对脑膜炎奈瑟球菌进行致敏免疫的患者内引起加强反应。OMV的皮下和鼻 内致敏/加强免疫方法描述于参考文献105。所述哺乳动物优选人。当所述疫苗用于预防用途时，所述人优选儿童(例如，学 步童或婴儿)或青少年；当所述疫苗用于治疗用途时，所述人优选是成人。用于儿童 的疫苗也可给予成人，例如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。本发明还提供了可用作药物的本发明OMV组合物和混合物。所述药物优选能在 哺乳动物中引起免疫反应(即是免疫原性组合物)并且更优选疫苗。本发明还提供了本发明OMV组合物和混合物在制备用于在哺乳动物中引起免疫 反应的药物中的应用。这些应用和方法优选用于预防和/或治疗由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病，例如细菌 性(或者，尤其是脑膜炎球菌性)脑膜炎或败血症。检测治疗效果的一种方法包括在给予本发明组合物后监测奈瑟菌感染。检测预防 效果的一种方法包括在给予组合物后监测针对OMV抗原的免疫反应。可以通过将本 发明组合物给予测试对象(例如12-16月大的儿童或动物模型[106])，然后测定包括血 清杀菌抗体(SBA)和ELISA滴度(GMT)的标准参数来测定其免疫原性。这些免疫反应 通常应在组合物给药约4周后测定，并与该组合物给药前测定的数值进行比较。优 选SBA提高至少4倍或8倍。在给予多剂组合物的情况下，可以进行多次给药后测 定。本发明优选的组合物在患者体内赋予的抗体滴度优于每种抗原性成分对于可接 受百分比的人对象的血清保护标准。具有相关抗体滴度(高于该滴度则宿主被认为对
该抗原是血清转化的)的抗原是熟知的，这种滴度由诸如WHO等组织发布。优选大于80%的对象的统计学显著样本是血清转化的，更优选大于90%，还更优选大于93%， 最优选％-100%。本发明的组合物通常应对患者直接给药。直接递送可以经胃肠外注射实现(例如 皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)，或通过直肠、口服、阴道、局部、 透皮、鼻内、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜给药实现。优选大腿或上臂肌肉内给药。 注射可以通过注射针(例如皮下注射用针)，但或者可使用无针注射。典型的肌内注射 剂量是0.5ml。剂量疗法可以是单一剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫进度和/ 或加强免疫方案。初次剂量方案之后可以是加强剂量方案。致敏剂量之间(例如4-16 周之间)以及致敏和加强之间的适当时间安排可以按常规确定。用3或4次初次剂量 方案测试了基于OMV的RIVM疫苗，在第0.2和8个月或第0、 1、2和8个月接种 疫苗。以6周的间隔给予三次MeNZBTM剂量。如上所述，本发明可包括单独地或以掺合物的形式给予多种脑膜炎奈瑟球菌血清 亚型的囊泡。本发明可以用于引起全身和/或粘膜免疫力。通常，本发明组合物能够在给予对象之后诱导血清杀菌抗体反应。这些反应可在 小鼠内方便地测得并且是疫苗效能的标准指标[例如，见参考文献166的尾注14]。 血清杀菌活性(SBA)检测补体介导的细菌杀伤，并能用人或兔婴补体测定。WHO的 标准要求疫苗能在卯％以上受者中诱导SBA升高至少4倍。MeNZBTM在给予第三次 剂量4-6周后使SBA升高4倍。通过混合不同血清亚型的OMV，本发明组合物能够诱导针对多种脑膜炎球菌超 毒性谱系的杀菌抗体反应。具体地说，它们优选诱导抗以下三种超毒性偶系中的两种的杀菌反应(i)A4群体;(ii)ET5复合体；和(iii)谱系3。它们也可诱导抗超毒性谱系亚群I、亚群III、亚群IV-I或ET-37复合体中一种或多种以及抗其它谱系(例如 超侵袭性谱系)的杀菌抗体反应。这不一定意味着该组合物可诱导抗这些超毒性谱系 中每一种脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体，而且，对于特定超毒性普系中的四种或多种 脑膜炎球菌菌株的任何给定组而言，由该组合物诱导的抗体对该组中的至少50%(例 如，60%、 70%、 80%， 90%或更高)的菌株具有杀菌作用。优选的菌株组将包括在以 下国家中至少4个国家中分离的菌株GB、 AU、 CA、 NO、 IT、 US、 NZ、 NL、 BR
和CU。血清的杀菌效价优选至少为1024(例如，210、 2"、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218或更高，优选至少214)，例如，如参考文献166所述，所述血清经1024倍稀 释时能够杀灭至少50%的特定菌株的测试细菌。优选的组合物可诱导抗以下血清群B脑膜炎球菌菌株的杀菌反应(i)来自A4 群体，菌株961-5945(B:2b:P1.21,16)和/或菌株G2136(B:-); (ii)来自ET-5复合体，菌 株MC58(B:15:P1.7,16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7,16); (iii)来自谱系3，菌株394/98 (B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)。更优选的组合物可诱导抗菌株961-5945、 44/76 和394/98的杀菌反应。菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌属MLST参考菌株[参考文献107中的编号 638和1002]。菌株MC58可广泛获得(例如，ATCC BAA-335)，是参考文献108中测 序的菌株。菌株44/76已被广泛使用和特征鉴定(例如，参考文献109)，是奈瑟菌属 MLST参考菌株中的一种[参考文献107中的编号237;参考文献19表2的第32行]。 菌株394/98最初于1998年在新西兰分离，己经公开了一些用这种菌株进行的研究(例 如，参考文献110和111)。菌株BZ198是另一种MLST参考菌株[参考文献107中的 编号409;参考文献19表2的第41行]。微拔微分除了含有OMV，本发明的组合物可含有其它非囊泡抗原。例如，该组合物可包 含以下其它抗原中的一种或多种-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、 C、 W135和/或Y的糖类抗原，如参考文献112所 述的血清群C的寡糖或参考文献113的寡糖。VA-MENINGOC-BCTM产品含有血清群 C多糖。-肺炎链球菌OS^卬tococcwp朋"wom'ae)的糖类抗原[例如，参考文献114-116;参考文献123的第22和23章]。-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[例如，117、 118;参考文献123的第15章]。-乙肝病毒抗原，诸如表面和/或核心抗原[例如，118、 119;参考文献123的第16章]。-丙肝病毒抗原[例如，120]。-百日咳博德特菌(^^&&//" ^W^^)抗原，诸如百日咳博德特菌的百日咳全毒 素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可以与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3 组合使用[例如，参考文献121和122;参考文献123的第21章]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献123的第13章]。-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献123的第27章]。 -B型流感嗜血杆菌(//。6^0/^//"""/7"^^^8)的糖类抗原[例如，参考文献123的 第14章]-淋病奈瑟菌(A^o"o/r/zoe。e)的抗原[例如，参考文献124]。 -肺炎衣原体(Oz/a/n;^a;meMmom'ae)的抗原[例如，125-131]。 -砂眼衣原体(C/2/am;^/a/rac/2om油:y)的抗原[例如，132]。 -牙龈卟啉单胞菌(尸o^/z;wwomwg/f7g/vafo)的抗原[例如，133]。 -脊髓灰质炎抗原[例如，134、 135;参考文献123的第24章]，如IPV。 -狂犬病抗原[例如，136]，如冻干的灭活病毒[例如，137， RabAvertTM]。 -麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原[例如，参考文献123的第19、 20和26章]。 -流感抗原[例如，参考文献123的第17和18章]，如血球凝集素和/或神经氨酸 酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxe〃flcator/2afo)抗原[例如，138]。-无乳链球菌CSfr印tococc^aga/fl"/^)(B型链球菌)蛋白抗原[例如，139、 140]。 -化脓性链球菌OS^印tococcw外ogewe力(A型链球菌)抗原[例如，140、 141、 142]。当使用糖类或碳水化合物抗原时，优选与载体缀合以增强免疫原性。B型流感嗜 血杆菌(/f./,Wwe^fle)、脑膜炎球菌和肺炎球菌糖类抗原的缀合是熟知的。在需要的情况下可以对有毒的蛋白抗原进行解毒处理(例如通过化学和/或遗传手 段对百日咳毒素的解毒处理[122])。在所述组合物包含白喉抗原的情况下，优选同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。 类似地，在组合物包含破伤风抗原的情况下，优选也包含白喉和百日咳抗原。类似 地，在组合物包含百日咳抗原的情况下，优选也包含白喉和破伤风抗原。因此优选 DTP组合。糖类抗原优选为缀合物形式。缀合物的优选载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白 喉类毒素或破伤风类毒素。白喉毒素的CRM197突变体[143-145]是特别优选的载体， 同样优选的还有白喉类毒素。其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[146]、合 成肽[147，M8]、热激蛋白[149,150]、百日咳蛋白[151,152]、细胞因子[153]、淋巴因子 [153]、激素[153]、生长因子[153]、含有各种病原体衍生抗原的多种人004+ T细胞 表位的人工蛋白[154]、流感嗜血杆菌的D蛋白[155,156]、肺炎球菌表面蛋白PspA[157]、肺炎球菌溶血素[158]、铁摄取蛋白(iron-uptake protein)[159]、艰难梭菌 (C^骄"7e)的毒素A或B [160]等。组合物中各抗原的浓度通常至少为1 pg/ml。通常，任何给定抗原的浓度足以引 起抗该抗原的免疫反应。除了在本发明组合物中使用蛋白质抗原，也可使用编码抗原的核酸。因此，本发 明组合物的蛋白质组分可用编码该蛋白质的核酸(优选DNA，例如以质粒的形式)代 替。优选的组合物含有上述脑膜炎球菌OMV和脑膜炎球菌血清群A、 C、 W135和Y 中一种或多种(即l、 2、 3或4种)的缀合(conjugated)荚膜糖。当OMV来自血清群B 时该方法包括以下血清群B+A; B+C; B+W135; B+Y; B+C+W135; B+C+Y; B+W135+Y ; B+A+C+W135 ; B+A+C+Y ; B+A+W135+Y ; B+C+W135+Y ; 和 B+A+C+W135+Y。两种优选组合使用血清群B OMV和血清群A+W135+Y或血清群 A+C+W135+Y中任一的缀合抗原。通常，通过选择x种血清群的OMV和其余5-x 种血清群的缀合糖类可以覆盖血清群A、 B、 C、 W135和Y中所有5种。可加入特定的脑膜炎球菌蛋白抗原(优选血清群B的)以补充OMV组合物，具体 说，可加入参考文献30和161-169中所述的蛋白抗原。也可加入少量规定的抗原(IO 种或更少(例如，9， 8， 7、 6、 5、 4、 3、 2)纯化抗原的混合物)。本发明所用的其它 优选免疫原性多肽是参考文献169中所述的那些(1) 'NadA'蛋白；(2) '741， 蛋白；(3) '936'蛋白；(4) '953，蛋白；和(5) '287，蛋白。其它可能的补充性 脑膜炎球菌抗原包括运铁蛋白结合蛋白(例如，TbpA和TbpB)和/或Cu,Zn-超氧化物 歧化酶[7]。其它可能的补充性脑膜炎球菌抗原包括含有以下氨基酸序列之一的蛋白 质参考文献161的SEQ ID NO:650;参考文献161的SEQ ID NO.878;参考文献 161的SEQ ID NO:884;参考文献162的SEQ ID NO:4;参考文献163的SEQ ID NO:598;参考文献163的SEQ ID NO:818;参考文献163的SEQ ID NO:864;参考 文献163的SEQ IDNO:866;参考文献163的SEQ ID NO:1196;参考文献163的SEQ IDNO:1272;参考文献163的SEQ ID NO:1274;参考文献163的SEQ ID NO:1640; 参考文献163的SEQIDNO:1788;参考文献163的SEQ ID NO:2288;参考文献163 的SEQ ID NO:2466;参考文献163的SEQ ID NO:2554;参考文献163的SEQ ID NO:2576;参考文献163的SEQ ID NO:2606;参考文献163的SEQ ID NO:2608;参 考文献163的SEQ ID NO:2616;参考文献163的SEQ ID NO:2668;参考文献163 的SEQ ID NO:2780;参考文献163的SEQ ID NO:2932;参考文献163的SEQ ID NO:2958;参考文献163的SEQ ID NO:2970;参考文献163的SEQ ID NO:2988，或者含有下述氨基酸序列的多肽(a)与所述序列有50%或者更高相同性(例如，60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或更高)；和/或(b)包含所述序列至少n个连续氨基酸 的片段，其中，n是7或更大(例如，8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 25、 30、 35、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 150、 200、 250或更大)。优选的(b)的片段包含有关序列 的表位。可包含这些多肽中的多个(例如，2、 3、 4、 5、 6)。也可加入脑膜炎球菌抗 原运铁蛋白结合蛋白和/或Hsf蛋白[170]。当OMV来自血清亚型P1.7b，4脑膜炎球菌或血清亚型Pl.7,16脑膜炎球菌时以此 方式用规定的脑膜炎球菌抗原补充OMV特别有效。优选用这两种血清亚型的OMV 的混合物补充。錄定i淳週本发明提供了含有从具有以下亚型之一的脑膜炎球菌制备的OMV的组合物 P1.2; P1.2，5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5，C; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7，16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9，15; PU2，13; P1.13; P1.14; P1.21,16; P1.22，14。所述脑膜炎球菌优选为血清群B。 如上所述，这些OMV适用于本发明。 謝F券齊方案本发明提供了给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中，第一剂量在0时刻 给予，第二和第三剂量在下两个月之后给予，第四剂量在0时刻之后的第11-13个月 之间给予。本发明还提供了给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中，第一剂量在0时 刻给予，第二和第三剂量在下两个月之后给予，第四剂量在0时刻之后的第11-13 个月之间给予，且其中，(a)第一、第二和第三剂量含有彼此具有相同血清亚型的 OMV，和(b)第四剂量含有具有与前三种剂量不同血清亚型的OMV。第四剂量可含 有只具有与前三剂量不同血清亚型的OMV，或者它可含有两种类型的OMV， 一种 具有与前三剂量不同的血清亚型， 一种具有与前三剂量相同的亚型。第一、第二和第三剂量优选间隔6-8周给予。第四剂量优选在0时刻后约1年给予。患者优选在四次给药中各接受相同量的疫苗。
OMV优选为血清亚型P1.7b,4和/或P1.7,16。本发明还提供了给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中(a)所述疫苗含 有具有第一血清亚型的脑膜炎球菌OMV; (b)所述患者以前已接受过具有第二血清 亚型的不同OMV疫苗，该不同OMV疫苗的第一剂量在实施该方法前11个月以上 给予。本发明还提供了具有第一血清亚型的脑膜炎球菌OMV在制造能赋予抗脑膜炎球 菌性脑膜炎免疫力的药物中的应用，其中，所述药物给予已用具有第二血清亚型的 OMV预先免疫过的患者。也可先用脑膜炎球菌缀合疫苗免疫再给予OMV。因此，本发明提供了第一脑膜 炎球菌血清群的脑膜炎球菌OMV在制造能赋予抗至少脑膜炎球菌性脑膜炎免疫力 的药物中的应用，其中，所述药物给予已用第二脑膜炎球菌血清亚型的缀合荚膜糖 预先免疫过的患者。类似地，提供了给予患者脑膜炎球菌疫苗的方法，其中(a)所 述疫苗含有具有第一血清群的脑膜炎球菌OMV; (b)所述患者以前己接受过第二脑 膜炎球菌血清群的缀合荚膜糖。可在给予OMV之前6个月以上(例如，11个月以上)实施预先免疫 (pre-immunisation)。因此，例如，患者可在0时刻接受缀合糖类，然后在11个月之 后接受OMV。用于预先免疫的脑膜炎球菌糖类优选至少具有血清群C，但也可具有多种血清 群，例如，具有A+C、具有A+C+Y、具有A+C+W135+Y等。 所述第一血清群优选是血清群B。OMV可与脑膜炎球菌缀合物同时给予，即患者在接受OMV的同时还接受脑膜 炎球菌缀合物剂量。患者可用或可不用第一血清群的OMV预先免疫。 患者可以用B型流感嗜血菌荚膜糖缀合物预先免疫。 患者可用白喉类毒素和破伤风类毒素预先免疫。术语"含有"包括"包含"以及"由……构成"，例如"含有"X的组合物可仅 由X构成或可包含其它的物质，例如X+Y。与数值x相关的术语"约"表示，例如^±10%。"基本上"不排除"完全"，例如"基本上无"Y的组合物可完全无Y。"基本上" 可视需要从本发明定义中省去。 本发明实施方式对健康成人进行MeNZBTM产品的剂量研究。通过25 mm的23号针头给予成人 三次25pg或50mg的OMV剂量，每次间隔6周。在第三次免疫4-6周后检测到抗 疫苗菌株的SBA效价升高4倍，接受25吗剂量的患者100%都是这样，但奇怪的是， 接受较高剂量的患者只有87°/。出现这种情况。第二次给药后接受较低剂量的患者中 产生反应的比例也较高(87%比78%)。因此选择较低剂量继续使用，对多数患者而言， 疫苗原液(stock)可免疫两次。證F鄉一多微斧藤樣已经描述过从挪威菌株H44/76制备的OMV，并在I、 II和III期临床试验中给予 人类患者。它们形成了 MenBvacTM产品的基础。类似地，从新西兰菌株HZ98/254制 备的OMV形成了 MeNZBTM产品的基础。已证实它们是安全和有效的。MeNZBTM和MenBvacTM在0.5 ml剂量中都含有50吗/ml浓度的OMV(以蛋白质 的量测量)。当在人类中测试这两种OMV的组合时，为维持对两种不同血清亚型的 功效，最直接的比较(方法)是将各OMV的浓度维持在50pg/ml。但是，发明人选择 了维持OMV的总剂量与两种单价产品中的相同(50 (ig/ml)，将各OMV的量减半， 即使用25吗/ml各血清亚型。将组合疫苗给予以前已接受过MeNZBTM或MenBvacTM的患者。先给予单价 OMV， l年后给予组合疫苗。应当理解，以上仅通过举例描述了本发明，可对其作出改进而不超越本发明的范 围和精神。参考文献(其内容在此全文并入以供参考) [1] Bjune等，(1991) Lancet 338(8775):1093-1096. 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权利要求
1.一种含有脑膜炎球菌血清群A、B、C、W135和Y中两种或多种的外膜囊泡(OMV)的组合物。
2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，其包含以下血清群组合的OMV:A+B; A+C; A+W135; A+Y; B+C; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y; W135+Y;A+B+C; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y ; C+W135+Y ; A+B+C+W135 ; A+B+C+Y ; B+C+W135+Y ;禾口 A+B+C+W135+Y。
3. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自超侵袭性谱系的脑膜炎球菌菌株。
4. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自超毒性谱系的脑膜炎球菌菌株。
5. 如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述菌株来源选自以下7种超毒性谱系亚群I;亚群III;亚群IV 1; ET 5复合体；ET 37复合体；A4群体；谱系3。
6. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自己经敲除了一种或多种参与LPS生物合成的酶的脑膜炎球菌。
7. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自超量表达NspA的脑膜炎球菌。
8. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述各亚型OMV的浓 度为10-500吗/ml。
9. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，含有少于每微克蛋白质 0.4微克脱氧胆酸盐。
10. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，含有少于每微克蛋白 质0.12微克脑膜炎球菌LPS。
11. 一种含有脑膜炎球菌菌株的外膜囊泡的组合物，其中，所述菌株为血清群C、 W135或Y。
12. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，还包含缀合的脑膜炎球菌血清群A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
13. —种给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗(例如，权利要求1所述的疫苗)的方法，其特征在于，第一剂量在0时刻给予，第二和第三剂量在后两个月给予，第四剂量 在0时刻之后的第11-13个月之间给予。
14. 一种给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其特征在于，第一剂量在0时 刻给予，第二和第三剂量在后两个月给予，第四剂量在0时刻之后的第11-13个月之 间给予，且其中，(a)第一、第二和第三剂量含有相同血清亚型的OMV，和(b)第四 剂量含有与前三剂量不同血清亚型的OMV。
15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第四剂量含有仅血清亚型不同 于前三剂量的OMV。
16. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第四剂量含有两种类型的 OMV， 一种具有与前三剂量不同的血清亚型， 一种具有与前三剂量相同的亚型。
17. 如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述OMV为血清亚 型Pl,7b，4的OMV。
18. 如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述OMV为血清亚 型P1.7，16的OMV。
19. 一种给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中(a)所述疫苗含有具有第 一血清亚型的脑膜炎球菌OMV; (b)所述患者以前曾接受过具有第二血清亚型的不 同OMV疫苗，该不同OMV疫苗的第一剂量的给予早于实施本方法11个月以上。
20. 具有第一血清亚型的脑膜炎球菌OMV在制造赋予抗脑膜炎球菌性脑膜炎免 疫力的药物中的应用，其中，所述药物给予已用具有第二血清亚型的OMV预先免疫 过的患者。
21. 如权利要求19所述的方法或如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述 第二血清亚型是P1.7b,4。
22. 如权利要求19所述的方法或如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述 第二血清亚型是P1.7,16。
23. 如权利要求19所述的方法或如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述 第二血清亚型是PU9，15。
24. 如权利要求19-22中任一项所述的应用，其特征在于，所述预先免疫早于给 予所述药物ll个月以上。
25. —种制造脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗的方法，所述方法包括以下步骤 (i)鉴定与脑膜炎球菌性脑膜炎爆发有关的脑膜炎球菌菌株的血清亚型；和(ii)从具 有步骤(i)所鉴定的血清亚型的脑膜炎球菌菌株制备OMV以用于制备疫苗。
26. 如权利要求25所述的方法，其包括以下一个或两个额外步骤(iii)将所述 OMV配制成疫苗；和(iv)在被被所述疾病爆发影响或者可能被所述疾病爆发影响的地区投放所述疫苗。
27. 如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌菌株为血清 群B。
28. 第一血清群脑膜炎球菌菌株的OMV用于保护抗第二血清群的一种或多种脑 膜炎球菌菌株的应用，其特征在于，所述第一和第二血清群不同。
29. —种组合物，含有第一脑膜炎球菌血清亚型和第二脑膜炎球菌血清亚型的外 膜囊泡，其中，第一血清亚型的OMV的浓度小于45 |ag/nil，第二血清亚型的OMV 的浓度小于45昭/ml。
30. —种组合物，含有第一脑膜炎球菌血清亚型和第二脑膜炎球菌血清亚型的外 膜囊泡，其中，第一血清亚型的OMV的浓度约25吗/ml，第二血清亚型的OMV的 浓度约25吗/ml。
31. 如权利要求30所述的组合物，所述组合物包含浓度约25吗/ml的第三脑膜 炎球菌血清亚型的外膜囊泡。
32. —种组合物，含有至少两种脑膜炎球菌血清亚型的外膜囊泡，其中，所述OMV 的组合浓度小于90叱/ml。
33. —种组合物，含有n种不同脑膜炎球菌血清亚型的外膜囊泡，其中任一血清 亚型OMV浓度小于45昭/ml，且其中n为l、.2、 3、 4、 5或6。
34. 如权利要求29-33中任一项所述的组合物，还含有缀合的脑膜炎球菌血清群 A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
35. —种试剂盒，含有从n种不同血清亚型制备的OMV，其中，n为2、 3、 4、 5或6。
36. —种方法，所述方法包括制备"组OMV，每一组来自"种不同血清亚型 中的任一种；和将所述"组囊泡组合为试剂盒中或混合物，其中，n为2、 3、 4、 5 或6。
37. —种组合物，含有从具有P1.7b,4血清亚型的血清群B脑膜炎球菌菌株制备 的OMV，其中，所述组合物中OMV的浓度约为50吗/ml。
38. 如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有氢氧化铝佐剂和 组氨酸缓冲剂。
39. 如权利要求37或38所述的组合物，其剂量体积约为0.5ml。
40. —种组合物，含有"种不同脑膜炎球菌超毒性谱系的外膜囊泡，其中，"为2、 3、 4、 5或6。
41. 如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述超毒性谱系包括亚群I、亚 群III、亚群IV1、 ET5复合体、ET37复合体、A4群体和谱系3。
42. —种组合物，含有n种不同脑膜炎球菌NMB 1870变体的外膜囊泡，其中，" 为2或3。
43. —种组合物，含有从具有以下亚型之一的脑膜炎球菌制备的OMV: P1.2;P1.2，5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5,C; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; PU4; P1.21，16;禾口P1.22，14。
44. 一种组合物，含有以下两种或三种的外膜囊泡的混合物(i)血清亚型P1.7b,4 脑膜炎球菌；(ii)血清亚型P1.7,16脑膜炎球菌；和(iii)血清亚型Pl.19,15脑膜炎球 菌。
45. 如权利要求37-44中任一项所述的组合物，还包含缀合的脑膜炎球菌血清群 A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
46. —种试剂盒，包括分别装有以下两种或三种的外膜囊泡的容器(i)血清亚型 P1.7b,4脑膜炎球菌；(ii)血清亚型P1.7,16脑膜炎球菌；和(iii)血清亚型Pl,19,15脑 膜炎球菌。
47. 如权利要求35或46所述的试剂盒，还包含缀合的脑膜炎球菌血清群A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
48. 第一脑膜炎球菌血清群的脑膜炎球菌OMV在制造赋予抗至少脑膜炎球菌性 脑膜炎免疫力的药物中的应用，其中，所述药物给予已用第二脑膜炎球菌血清亚型 的缀合荚膜糖预先免疫过的患者。
全文摘要
靶向抗特定流行性菌株的OMV对于控制疾病地方性爆发高度有效。联用大规模并可再现的制备技术可在疾病爆发后迅速制备疫苗。本发明提供了制备脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗的方法，该方法包括以下步骤(i)鉴定与脑膜炎球菌性脑膜炎爆发有关的脑膜炎球菌菌株的血清亚型；(ii)从具有步骤(i)所鉴定的血清亚型的脑膜炎球菌菌株制备OMV以用于制备疫苗。该方法可包括以下一个或两个额外步骤(iii)将所述OMV配制成疫苗；和(iv)在被或者可能被所述疾病爆发影响的地理区域分销所述疫苗。所述脑膜炎球菌菌株通常为血清群B，但也可以是血清群A、C、W135、Y等。
文档编号A61K39/095GK101115501SQ200580029469
公开日2008年1月30日 申请日期2005年9月5日 优先权日2004年9月3日
发明者M·皮扎, P·奥斯特, R·拉普奥里 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司
技术领域：
本发明涉及用于免疫目的的脑膜炎球菌外膜囊泡领域。
技术背景赋予抗脑膜炎奈瑟球菌(A^;wen'a mem77g/f/cfc)(脑膜炎球菌)感染的免疫力的各种 方法之一是使用外膜囊泡(OMV)。挪威国立公众健康研究所(Norwegian National Institute of Public Health)已经制造了抗血清群B的有效OMV疫苗['MenBvac ，； 例如，参考文献l]，尽管这种疫苗是安全的并能预防MenB疾病，但其功效仅限于 用来制备疫苗的同源血清型。'RIVM，疫苗基于含有六种不同PorA亚型的OMV。它已在II期临床试验中在 儿童中显示出免疫原性[2]。参考文献3公开了抗血清群B脑膜炎球菌不同致病血清型的疫苗，该疫苗基于保 留了 65kDa蛋白复合体的OMV。参考文献4公开了含有遗传工程改造的脑膜炎球菌 菌株OMV的疫苗，所述OMV包含至少一种1类外膜蛋白(OMP)但不含2/3类OMP。 参考文献5公开了含有在其表面环中有突变的OMP的OMV以及含有脑膜炎球菌脂 多糖(LPS)衍生物的OMV。参考文献6公开了制备基于OMV的血清群A脑膜炎球 菌疫苗的方法。已有多种提高OMV功效的建议。参考文献7公开了添加有运铁蛋白结合蛋白(例 如，TbpA和TbpB)和/或Cu，Zn-超氧化物歧化酶的含有OMV的组合物。参考文献8 公开了添加有各种蛋白质的含有OMV的组合物。参考文献9公开了从具有修饰的/w 基因的脑膜炎奈瑟球菌(A^.wem7^/^fo)获得的膜囊泡制品。参考文献26称，同时敲 除戸"和Qtw可上调似;x4的表达。为制备OMV的脑膜炎奈瑟球菌的其它敲除突变 体公开于参考文献26-28。与这些通过改变表达模式而改进OMV的尝试不同，参考 文献29将注意力集中在改变OMV的制备方法，并称，通过避免使用诸如脱氧胆酸 盐之类的去污剂可以在提取囊泡时保留诸如NspA的抗原。脑膜炎球菌OMV不能引起抗非同源血清型的交叉保护限制了它们作为通用疫苗 的用途，但它们对于己经基本上克隆出致病菌株的流行性疾病非常有效。因此，Finlay Institute的疫苗(VA-MENGOC-BCTM)已经被用于拉丁美洲，该处的血清群B疾病主 要是Pl.19,15血清型，但这种疫苗在其它地方无效[IO]。类似地，Chiron的MeNZBTM 疫苗的耙标是自1991年以来在新西兰流行的流行性菌株(P1.7b,4，最新的命名法又称 为P 1.7-2,4)。参考文献11公开了含有多价脑膜炎球菌细胞泡(bleb)组合物的疫苗，包括衍生自 脑膜炎球菌菌株的第一细胞泡，该菌株具有在使用国流行的血清亚型和衍生自脑膜 炎球菌菌株的第二细胞泡，该菌株无需具有在使用国流行的血清亚型。本发明的目的是提供其它和改进的脑膜炎球菌OMV制品。发明内容使用MeNZBTM的经验显示，抗特定流行性菌株的OMV对于控制疾病地方性爆 发非常有效。联用大规模并可再现的制备技术可在疾病爆发后迅速制备疫苗。因此， 本发明提供了制造脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗的方法，该方法包括以下步骤(i) 鉴定与脑膜炎球菌性脑膜炎爆发有关的脑膜炎球菌菌株的血清亚型；(ii)从具有步骤 (i)中鉴定的血清亚型的脑膜炎球菌菌株制备OMV用于制备疫苗。该方法可包括以下 一个或两个额外步骤(iii)将所述OMV配制成疫苗；禾t1(iv)在被或者可能被所述疾 病爆发影响的地理区域分销所述疫苗。就已经鉴定出相关血清亚型的情况而言，本 发明还提供了相同但省略了步骤(i)的方法。所述脑膜炎球菌菌株将通常为血清群B， 当也可以是血清群A、 C、 W135、 Y等。使用MeNZBTM的经验还提示发明人，OMV可单独或组合用于赋予抗脑膜炎球菌 血清群A、 C、 W135和Y的免疫力，因此其制备成本可能低于目前的缀合(conjugate) 疫苗。因此，本发明提供了 (a)含有脑膜炎球菌血清群C菌株的外膜囊泡的组合物； (b)含有脑膜炎球菌血清群W135菌株的外膜囊泡的组合物；(c)含有脑膜炎球菌血 清群Y菌株的外膜囊泡的组合物；和(d)含有脑膜炎球菌血清群A、 B、 C、 W135 和Y中两种或多种的外膜囊泡的组合物。在(d)中，优选的组合物包含以下血清群的混合物A+B; A+C; A+W135; A+Y; B+C; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y;W135+Y; A+B+C; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y; C+W135+Y; A+B+C+W135; A+B+C+Y; B+C+W135+Y;禾口 A+B+C+W135+Y。由于血清群间共有亚荚膜(sub-capsular)抗原，因此OMV(和OMV混合物)能保护 抵抗除制备它们的血清群之外的血清群。例如，在萨哈拉沙漠以南非洲发现的血清 群A和W135菌株与在世界其它地方发现的血清群C和Y菌株共有亚荚膜抗原。因 此，本发明提供了第一血清群脑膜炎球菌菌株的OMV在保护抵抗一种或多种第二血 清群脑膜炎球菌菌株中的应用，其中所述第一和第二血清群不同。即便所述菌株具 有不同血清型，但它们可能共有亚荚膜抗原，并且可能具有相同亚型、血清亚型和/ 或免疫型。优选血清群A和W135的OMV混合物，也优选血清群C和Y的OMV 混合物。使用MeNZBTM的经验还提示发明人，新西兰OMV、挪威OMV和古巴OMV所 用菌株的OMV混合物有效。因此，本发明提供了含有以下两种或三种外膜囊泡的组 合物(i)血清亚型P1.7b,4脑膜炎球菌；(ii)血清亚型P1.7,16脑膜炎球菌；和(iii)血 清亚型P1.9,15脑膜炎球菌。优选掺合不同的OMV，但也可以装在试剂盒内的不同容器内。发明人发现通过混合不同血清亚型的OMV可降低各种血清亚型的剂量而不会降 低功效。以总蛋白质计，VA-MENGOC-Btm含有50吗OMV(0.5 ml体积)、HexaMen 含有约1 mg OMV(0.3 ml体积)，而MenBVac"tm和MeNZBTM含有25吗OMV(0.5 ml 体积)，因此发明人发现使用混合物可以降低各OMV的剂量而不会降低各自的功效。 因此，本发明提供了含有第一脑膜炎球菌血清亚型和第二脑膜炎球菌血清亚型的外 膜囊泡的组合物，其中，第一血清亚型的OMV的浓度小于45pg/ml，第二血清亚型 的OMV的浓度小于45 pg/ml。本发明还提供了含有至少两种脑膜炎球菌血清亚型的 外膜囊泡的组合物，其中所述OMV的组合浓度小于90pg/ml。本发明还提供了含有 n种不同脑膜炎球菌血清亚型的外膜囊泡的组合物，其中，n种血清亚型中各自的 OMV浓度小于45吗/ml (即OMV的总剂量小于45n吗/ml)。 n的值可以是1、 2、 3、 4、 5、 6等。本发明还提供了含有从n种不同血清亚型制备的OMV的试剂盒。所述囊泡可单 独保存或储存在试剂盒中直到需要同时使用，例如作为掺合物，或者以供同时单独 或依次使用。类似地，本发明提供了一种方法，该方法包括制备n组OMV，每一 组来自n种不同血清亚型的每一种；和混合所述n组囊泡。所述不同的组可混合入 试剂盒中或为掺合物。本发明还提供了含有从具有P1.7b,4血清亚型的血清群B脑膜炎球菌菌株制备的OMV的组合物，其中，所述组合物中OMV的浓度约为50 pg/ml。所述组合物优选 含有氢氧化铝佐剂和组氨酸缓冲剂。所述组合物的剂量体积约为0.5 ml。 鹏本发明基于从脑膜炎奈瑟球菌制备的外膜囊泡(OMV)。术语"OMV"包括通过 破裂细菌外膜从而形成含有外膜蛋白质组分的外膜囊泡而获得的任何脂蛋白体囊 泡。OMV从细菌人工制备(例如，通过去污剂处理或者通过非去污剂方法[29])。该 术语也包括细胞泡、微泡(MV， [12])和'天然OMV' ( 'NOMV，， [13])，天然OMV 是在细菌生长过程中自发形成并释放到培养基中的天然形成的膜囊泡。可在肉汤培 养基中培养奈瑟菌属，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如通过过滤或低 速离心以便仅沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从除去细胞的培养基中收集MV(例 如通过过滤、通过差速沉降或聚集MV、通过高速离心以沉淀MV)，从而获得MV。 通常根据基于培养中MV的产量来选择用于制备MV的菌株，例如，参考文献14和 15公开了具有高MV产量的奈瑟菌属。OMV可用各种方法制备。适合制备的方法描述于，例如，这里引用的参考文献。 形成OMV的技术包括在足够高而不沉淀去污剂的pH下用胆酸盐去污剂(例如，石胆 酸盐、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、熊胆酸(ursocholicacid)等，优选 用脱氧胆酸钠[16和n]处理奈瑟菌属)处理细菌[6]。也可在基本上不含去污剂时采用 其它技术[29]，使用诸如超声、均质化(homogenisation)、微流体化、空泡形成、渗透 压休克、研磨、弗氏破碎、混合等。优选的制备OMV的方法包括超滤[18]而不是对粗制OMV进行高速离心。这样 可以在更短的时间内处理更大量的含OMV的上清液(通常4小时后内处理15升以 上，而高速离心10小时内只能处理不到1.5升)，并且无需在离心后再分散OMV。 超速离心能够更加方便地制备大量OMV，并能够从选择的菌株迅速制备OMV以用 于疫苗制备。舒欽吝资難雄絲歸樣可采用标准技术根据I类孔蛋白外膜蛋白(PorA)鉴定感兴趣的脑膜炎球菌的血清 亚型。 一旦测定了血清亚型则可常规寻找具有相同血清亚型的其它已知菌株。所述 其它菌株可共有第一菌株的血清群和/或血清型(PorB)，但这不是必需的。然而通常
优选血清群和血清亚型均匹配。用于本发明的脑膜炎球菌菌株通常是以下血清群之一A、 B、 C、 W135或Y。 用于本发明的脑膜炎球菌菌株通常不是表达多种血清亚型(即多PorA等位基因)的菌株。因此，优选的用于本发明的菌株将表达单一PorA序列，即它们将具有一种血清亚型。也能使用PorA已经下调的菌株，例如，与野生型的水平相比(例如，如参考文献 ll所述，与菌株H44/76相比)，已将PorA的量降低至少20%(例如，》30%、》40%、 >50%、》60%、》70%、》80°/。、 >卯％、 >95%等)，或者甚至敲除。用于本发明的脑膜炎球菌可以是任何血清型(例如，l、 2a、 2b、 4、 14、 15、 16 等)和/或任何免疫型(例如，Ll; L3,3，7; L10等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适 的谱系，包括超侵袭性(hyperinvasive)和超毒性(hypervimlent)谱系，例如，以下7种超毒性谱系中的任何一种亚群I;亚群III;亚群IV-I; ET-5复合体；ET-37复合体；A4群体(cluster);谱系3。这些谱系已通过多基因座酶电泳法(MLEE)鉴定，但也可 用多基因座序列分型(MLST)来分类脑膜炎球菌[参考文献19]，例如，通过MLST鉴 定ET-37复合体是ST-ll复合体，ET-5复合体是ST-32(ET-5)、谱系3是ST-41/44等。脑膜炎球菌可以具有一种或多种基因敲除突变。为降低热原(pyrogenic)活性，例 如，细菌可具有低内毒素(LPS)水平，这可通过敲除参与LPS生物合成的酶实现。合 适的突变型细菌已知，例如突变型奈瑟菌属[20,21]和突变型哈比特属 (i7e//cO^cto0[22]。从革兰阴性菌制备LPS耗尽型外膜的方法描述于参考文献23。除了下调特定蛋白质的表达，细菌可超量表达(相对于相应的野生型菌株)诸如 NspA、蛋白287[8]、蛋白741[30]、 TbpA[7]、 TbpB[7]、超氧化物歧化酶[7]等的免疫 原。除了已经敲除了特定内源基因，细菌可表达一种或多种非内源基因。例如，本发 明可使用相对于相应的野生型菌株能表达新基因的重组菌株。可通过各种技术实现 次种方式的非内源基因表达，例如，染色体插入(如用于引入多个PorA基因[24])、 敲入突变、从染色体外的载体(如从质粒)表达，等等。所述细菌也可包含一种或多种参考文献25-30中所述的敲除突变和/或超量表达 突变。优选的用于下调和/或敲除的基因包括(a) Cps、 CtrA、 CtrB、 CtrC、 CtrD、 FrpB、 GalE、 HtrB/MsbB、 LbpA、 LbpB、 LpxK、 Opa、 Opc、 PilC、 PorB、 SiaA、 SiaB、 SiaC、 SiaD、 TbpA禾口/或TbpB[25]; (b) CtrA、 CtrB、 CtrC、 CtrD、 FrpB、 GalE、 HtrB/MsbB、 LbpA、 LbpB、 LpxK、 Opa、 Opc、 PhoP、 PilC、 PmrE、 PmrF、 SiaA、 SiaB、 SiaC、 SiaD、 TbpA禾口/或TbpB[26]; (c) ExbB、 ExbD、 rmpM、 CtrA、 CtrB、 CtrD、 GalE、 LbpA、 LpbB、 Opa、 Opc、 PilC、 PorB、 SiaA、 SiaB、 SiaC、 SiaD、 TbpA 和/或TbpB[27];和(d)CtrA、 CtrB、 CtrD、 FrpB、 OpA、 OpC、 PilC、 PorB、 SiaD、 SynA、 SynB禾口/或SynC[28]。除了根据不同血清亚型混合OMV，也可按照其它标准进行混合。所述标准的例 子包括血清型(PorB， 2或3类OMP);免疫型(脂多糖或脂寡糖)；菌株的地理来源； 临床菌株的区域流行；超毒性谱系，例如亚群I、 III和IV-I、 ET-5复合体、ET-37复 合体、A4群体和谱系3中的两种或多种；多基因座序列分型(MLST)[19];三种不同 NMB1870变体中的一种以上[31]。现有脑膜炎球菌OMV疫苗为实施本发明提供了药物、剂量和配方指导。例如， VA-MENGOC-BCtm是0.5ml的可注射悬浮液，含有50吗吸收到2 mg氢氧化铝凝胶 上的菌株Cu-385-83的OMV和50吗血清群C荚膜多糖，并添加了 0.01%硫柳汞和 磷酸盐缓冲液。MeNZBTM也是0.5 ml的悬浮液，含有25吗吸收到1.65 mg氢氧化 铝佐剂上的菌株NZ98/254的OMV，并含有组氨酸缓冲液和氯化钠。MenBvac类似 于MeNZBTM，但从菌株44/76制备。各种亚型OMV的浓度应足够高以在给予患者之后提供保护性免疫力。本发明组 合物中OMV的浓度将通常为10-500 |ag/ml，优选25-200 ng/ml，更优选约50吗/ml 或约100 )ag/ml(以OMV中的总蛋白表示)。然而发明人发现，当组合物含有多种脑膜炎球菌血清亚型的OMV时，可降低各 血清亚型的剂量而不会影响功效。具体地说，新西兰和挪威亚型的剂量在0.5 ml剂 量中可从25昭减半至12.5吗而不会损失免疫原性。因此，含有多种脑膜炎球菌亚 型的外膜囊泡的本发明组合物的浓度可低于根据MenBvacTM和MeNZBTM简单混合 推理预测的100 |ig/ml，也低于根据VA-MENGOC-BCtm与MenBvacTM或MeNZB丁m 简单混合推理预测的150吗/ml。因此，本发明的这种组合物所含混合OMV的浓度 不超过90吗/m(例如，不超过80吗/ml、 70 |ig/ml、 60吗/ml、 50吗/ml、 40叱/ml、 30pg/ml，或者甚至更低)。更通常地，当组合物含有n种不同脑膜炎球菌亚型的外膜囊泡时，各种亚型的 OMV浓度小于45 lag/ml(例如，小于40 jag/ml、35 (ig/ml、30 (ig/ml、25 pg/ml、20 )ig/ml，
或者甚至更低)。优选的浓度约为25 pg/ml。当组合物含有n种不同脑膜炎球菌亚型的外膜囊泡时，各种亚型的OMV的量优 选彼此相差±10%以内，即该组合物含有基本上等量的各种OMV。然而， 一些情况 下， 一种亚型的量可能是另一种亚型的量的约x倍，其中的x是2、 3或4，例如该 组合物中一种亚型的剂量可以是组合物中其它亚型的两倍。 麟激资#欽本发明组合物可以是含有药学上可接受的载体的药物组合物。可采用包括掺合 OMV和药学上可接受载体的步骤的方法制备这种组合物。典型的'药学上可接受的载体'包括本身不诱导有害于接受组合物的个体的抗体 产生的任何载体。合适的载体一般是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、 多乳酸、多乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这 种载体是本领域普通技术人员所熟知的。疫苗也可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、蔗糖等。无菌 无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体(例如，基于注射用水)。药学上可接受的 赋形剂的详尽讨论见参考文献32。本发明的组合物通常为含水形式(例如，溶液或悬浮液)而不是干燥的形式(例如， 冻干的)。含水组合物也适合从冻干形式(例如，冻干的Hib缀合疫苗、冻干的脑膜炎 球菌缀合疫苗等)重建其它疫苗。在本发明组合物用于这种临时重建的情况中，本发 明提供了一种试剂盒，其中可包含两个药瓶或者可包含一个已经装好的注射器和一 个药瓶，注射器内的含水成分用于在注射之前复活药瓶内的干燥内容物。本发明组合物可装在药瓶内，或者可装在装好的注射器内。注射器可以配备或不 配备针头。所述组合物可以单位剂量形式或多剂量形式包装。注射器通常含有单剂 量组合物，而药瓶可含有单剂量或多剂量。因此，对多剂量形式而言，药瓶优于预 装的注射器。可常规建立有效剂量体积，但该组合物的典型人类剂量体积约为0.5ml，例如供 肌肉内注射。RIVM OMV疫苗以0.5 ml的体积[33]通过肌肉内注射给予大腿或上臂。 MeNZBTM以0.5 mi的体积通过肌肉内注射给予大腿前外侧或手臂的三角肌区域。类 似的剂量可用于其它给药途径，例如，OMV的雾化的鼻内疫苗每次喷射的体积约为 100或约130 p1[13]，四次喷射可给予约0.5 ml的总剂量。所述组合物的pH优选6和8之间，更优选6.5和7.5之间(例如，约7)。RIVM OMV
疫苗的pH为7.4[34]，本发明组合物的pH优选〈7.5。可采用缓冲液，如Tris缓冲液、 磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液以维持稳定的pH。本发明组合物通常包含缓冲液。如 果组合物含有氢氧化铝盐，则优选使用例如约1-10 mM、优选约5 mM的组氨酸缓 冲液[35]。 RIVMOMV疫苗用10mMTris/HCl缓冲液维持pH。所述组合物可以是无 菌和/或无热原的。本发明组合物相对于人来说可以是等渗透压的。本发明组合物是免疫原性的，更优选是疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即 用来防止感染)或治疗性(即用来治疗感染)的，但通常是预防性的。用作疫苗的免疫 原性组合物包含免疫学有效量的抗原以及所需要的任何其它组分。'免疫学有效量' 指给予个体该用量(单一剂量或作为系列剂量的一部分)对于治疗或预防有效。该用量 取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学分组(例如非人灵 长类、灵长类等等)、该个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗剂型、 主治医生对身体状况的评估以及其他相关因素而不同。估计该用量应处于可通过常 规试验确定的相对较宽的范围内。本发明组合物的抗原含量通常表示为每剂中蛋白 质的含量。OMV的鼻内疫苗的典型剂量是每毫升约0.9毫克蛋白质[13]。脑膜炎球菌影响身体的各个部位，因此本发明组合物可以以各种形式制备。例如， 该组合物可以制备成可注射的(液体溶液或悬浮液)。该组合物可以制备为肺部给药， 例如使用细微粉末或喷雾的吸入器的形式。该组合物可以制备为栓剂或阴道栓剂。 该组合物可以为鼻、耳或眼睛给药而制备成，例如制成喷雾、滴剂、凝胶或粉末[例 如，参考文献36和37]。通常通过肌肉内注射给予。本发明的组合物可包含抗微生物剂，尤其是当包装成多剂量形式时。疫苗中通常 可含有抗微生物剂如硫柳汞和2-苯氧乙醇，但优选使用不含汞的防腐剂或根本不使 用防腐剂。本发明的组合物可含有吐温(聚山梨醇酯)等去污剂，如吐温80。去污剂通常处于 例如<0.01%的低水平。本发明的组合物可含有OMV制备过程中残留的去污剂(例如，脱氧胆酸盐)。残 留去污剂的量优选小于每毫克蛋白质0.4 pg(更优选小于0.2 pg)。本发明的组合物可含有脑膜炎球菌的LPS。 LPS的量优选小于每毫克蛋白质0.12 吗(更优选小于0.05吗)。本发明组合物可含有钠盐(例如，氯化钠)以得到一定张力。NaCl的浓度通常为10 ±2 mg/ml。氯化钠的浓度优选约9 mg/ml。
本发明组合物通常联合其它免疫调节剂给予。具体地说，该组合物通常含有一种 或多种佐剂，同时，本发明提供了制备本发明组合物的方法，包括例如在药学上可 接受的载体中掺合本发明囊泡与佐剂的步骤。合适的佐剂包括但不限于A絲,激湖资^激适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如过氧化物(oxyhydroxide))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、 正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献38的第8和9章]，或不同矿物质化合物的混 合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸 附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒[39]。典型磷酸铝佐剂是P04/A1摩尔比在0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，包含 0.6mg Al3+/ml。可用低剂量磷酸铝吸附，例如每剂50-100吗Al3+。当使用磷酸铝， 由于溶液中含有游离的磷酸根离子(例如，使用磷酸盐缓冲液)，无需将抗原吸附到佐 剂上。测试了吸附到磷酸铝或氢氧化铝佐剂的RIVM疫苗，发现用磷酸铝佐剂能得到更 好结果[34]。 MeNZBTM、 MenBvacTM和VA-MENINGOC-BCTM产品都含有氢氧化铝佐剂。铝佐剂的典型剂量约为3.3 mg/ml(以A产的浓度表示)。 及适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献 38的第10章；也可参见参考文献40](利用微流化剂配制成亚微米颗粒的5%角鲨烯、 0.5%吐温80和0.5%司盘85)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。C.舒層厂参考擅JS麟"煮7皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、 甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。皂树 (^//toh印o"an'"MoUna)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜 (Sm//"x orwato)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹((^y;wop/H7/a/^m'cw/ata)(婚纱花 (brides veil))和肥皂草CS^o"an'fl q^c/朋afo)(皂根(soap root))。皁苷佐剂制剂包括纯 化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。 QS21的商品名为Stimulon 。也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术特别纯化 的部分，包括QS7、 QS17、 QS18、 QS21、 QH-A、 QH-B禾B QH-C。皂苷优选QS21。 参考文献41公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[42]。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫剌激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献 38的第23章]。ISCOM—般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已 知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、 QHA和QHC。参 考文献42-44进一步描述了 ISCOM。 ISCOM任选不含其它去污剂[45]。 皂苷佐剂开发的综述见参考文献46和47。 D.嫁毒银赫毒#微病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多 种任选与磷脂联用或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常是非病原性、非复制性， 通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于 病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙 肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口 蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、 RNA-噬菌体、Q(3-噬菌 体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty (例如逆转录转座子 Ty蛋白pl)。参考文献48-53进一步讨论了 VLP。例如，参考文献54进一步讨论了 病毒体。E 一智蘑或徵f激好主激适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒 衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。 3dMPL是具有4、 5或6条酰化链的3脱-0-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文 献55公开了 3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选"小颗粒"形式。3dMPL的这种"小 颗粒"足够小从而可经0.22 nm膜无菌过滤[55]。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰 基脂质A模拟物，例如氨基垸基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[56、 57]。脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174 描述于参考文献58和59。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键 与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序 列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。 CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可以是双链或单链的。参考文献60、 61和62公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取 代鸟苷。参考文献63-68进一步讨论了 CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[69]。 CpG序列，例如 CpG-AODN特异地诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-B ODN更特异地诱导B细 胞应答。参考文献70-72讨论了 CpG-A和CpG-B ODN。 CpG优选是CpG-AODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5'端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选 在它们的3'端相连以形成"免疫聚物"(immunomer)。参见，例如参考文献69和73-75。细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自 大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素"LT，、霍乱(病毒)("CT")或百日咳(病毒)("PT，〕。 参考文献76描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献77描 述了其作为胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。 A亚基优选含有解毒性突变；B亚基优选未突变。佐剂优选是解毒的LT突变体，例 如LT-K63、 LT-R72和LT-G192. ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63 和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献78-85。氨基酸取代的数字基准优选以参考文 献86所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础，该文献专门全文纳入本 文作为参考。F 乂免资源，;^适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-12[87]等)网、干扰素(如，干扰素-y)、巨噬细胞集落刺 激因子和肿瘤坏死因子。生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合 适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[89]，或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)的 交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生 物也可用作本发明的佐剂[90]。及微微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(a-羟酸)、 聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒 (即，直径约100 nm到150 pm，优选约200 nm到约30 |um，最优选约500 nm到约10 pm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表 面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。/.應质#/参考文就^游第",/7〃着)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献91-93。J -fr■^乙义煮^g^f 奢乙;^##煮y^/适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[94]。这种制剂还包括联用辛 苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[95]以及联用至少一种其它非离子表面活 性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[96]。优选的聚氧乙烯醚选自: 聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂 酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基 醚。K覆錄獻尸C尸尸)PCPP制剂描述于，例如参考文献97和98中。 丄.鹏縱适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异 谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺 (nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰 基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。M银赠#麼诺屏众^激适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献99和100中进一步描 述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")。本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物 可用于本发明(l)皂苷和水包油乳剂[101]; (2)皂苷(例如(^821)+无毒的LPS衍生 物(例如3dMPL)[102];(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) +胆 固醇；(4)皂苷(例如QS21) + 3dMPL + IL-12 (任选+固醇)[103]; (5)联用3dMPL 与例如QS21和/或水包油乳剂[104]; (6)含有10%角鲨烯、0.4%吐温80頂、5%普朗 尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或搅拌(vortex)产生 较大粒度的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)， (Ribi Immunochem)，其中含有2%角鲨 烯、0,2%吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(monophosphorylipid A) (MPL)、海 藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL + CWS (DetoxTM)组成的细
菌细胞壁组分；和(8) —种或多种矿物盐(例如铝盐)+ LPS的无毒衍生物(例如 3dMPL)。参考文献38的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。特别优选使用铝盐佐剂，且抗原通常吸附到这种盐上。对本发明的组合物而言， 可以将一些抗原吸附到氢氧化铝上而使其它抗原与磷酸铝结合。然而通常，优选仅 使用一种盐，例如氢氧化物或磷酸盐，而不使用两种。不需要吸附所有囊泡，即一 些或所有囊泡可游离在溶液中。本发明还提供了在哺乳动物内引起免疫反应的方法，所述方法包括给予所述哺乳 动物本发明药物组合物。所述免疫反应优选是保护性的并优选涉及抗体。该方法可在已经针对脑膜炎奈瑟球菌进行致敏免疫的患者内引起加强反应。OMV的皮下和鼻 内致敏/加强免疫方法描述于参考文献105。所述哺乳动物优选人。当所述疫苗用于预防用途时，所述人优选儿童(例如，学 步童或婴儿)或青少年；当所述疫苗用于治疗用途时，所述人优选是成人。用于儿童 的疫苗也可给予成人，例如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。本发明还提供了可用作药物的本发明OMV组合物和混合物。所述药物优选能在 哺乳动物中引起免疫反应(即是免疫原性组合物)并且更优选疫苗。本发明还提供了本发明OMV组合物和混合物在制备用于在哺乳动物中引起免疫 反应的药物中的应用。这些应用和方法优选用于预防和/或治疗由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病，例如细菌 性(或者，尤其是脑膜炎球菌性)脑膜炎或败血症。检测治疗效果的一种方法包括在给予本发明组合物后监测奈瑟菌感染。检测预防 效果的一种方法包括在给予组合物后监测针对OMV抗原的免疫反应。可以通过将本 发明组合物给予测试对象(例如12-16月大的儿童或动物模型[106])，然后测定包括血 清杀菌抗体(SBA)和ELISA滴度(GMT)的标准参数来测定其免疫原性。这些免疫反应 通常应在组合物给药约4周后测定，并与该组合物给药前测定的数值进行比较。优 选SBA提高至少4倍或8倍。在给予多剂组合物的情况下，可以进行多次给药后测 定。本发明优选的组合物在患者体内赋予的抗体滴度优于每种抗原性成分对于可接 受百分比的人对象的血清保护标准。具有相关抗体滴度(高于该滴度则宿主被认为对
该抗原是血清转化的)的抗原是熟知的，这种滴度由诸如WHO等组织发布。优选大于80%的对象的统计学显著样本是血清转化的，更优选大于90%，还更优选大于93%， 最优选％-100%。本发明的组合物通常应对患者直接给药。直接递送可以经胃肠外注射实现(例如 皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)，或通过直肠、口服、阴道、局部、 透皮、鼻内、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜给药实现。优选大腿或上臂肌肉内给药。 注射可以通过注射针(例如皮下注射用针)，但或者可使用无针注射。典型的肌内注射 剂量是0.5ml。剂量疗法可以是单一剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫进度和/ 或加强免疫方案。初次剂量方案之后可以是加强剂量方案。致敏剂量之间(例如4-16 周之间)以及致敏和加强之间的适当时间安排可以按常规确定。用3或4次初次剂量 方案测试了基于OMV的RIVM疫苗，在第0.2和8个月或第0、 1、2和8个月接种 疫苗。以6周的间隔给予三次MeNZBTM剂量。如上所述，本发明可包括单独地或以掺合物的形式给予多种脑膜炎奈瑟球菌血清 亚型的囊泡。本发明可以用于引起全身和/或粘膜免疫力。通常，本发明组合物能够在给予对象之后诱导血清杀菌抗体反应。这些反应可在 小鼠内方便地测得并且是疫苗效能的标准指标[例如，见参考文献166的尾注14]。 血清杀菌活性(SBA)检测补体介导的细菌杀伤，并能用人或兔婴补体测定。WHO的 标准要求疫苗能在卯％以上受者中诱导SBA升高至少4倍。MeNZBTM在给予第三次 剂量4-6周后使SBA升高4倍。通过混合不同血清亚型的OMV，本发明组合物能够诱导针对多种脑膜炎球菌超 毒性谱系的杀菌抗体反应。具体地说，它们优选诱导抗以下三种超毒性偶系中的两种的杀菌反应(i)A4群体;(ii)ET5复合体；和(iii)谱系3。它们也可诱导抗超毒性谱系亚群I、亚群III、亚群IV-I或ET-37复合体中一种或多种以及抗其它谱系(例如 超侵袭性谱系)的杀菌抗体反应。这不一定意味着该组合物可诱导抗这些超毒性谱系 中每一种脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体，而且，对于特定超毒性普系中的四种或多种 脑膜炎球菌菌株的任何给定组而言，由该组合物诱导的抗体对该组中的至少50%(例 如，60%、 70%、 80%， 90%或更高)的菌株具有杀菌作用。优选的菌株组将包括在以 下国家中至少4个国家中分离的菌株GB、 AU、 CA、 NO、 IT、 US、 NZ、 NL、 BR
和CU。血清的杀菌效价优选至少为1024(例如，210、 2"、 212、 213、 214、 215、 216、 217、 218或更高，优选至少214)，例如，如参考文献166所述，所述血清经1024倍稀 释时能够杀灭至少50%的特定菌株的测试细菌。优选的组合物可诱导抗以下血清群B脑膜炎球菌菌株的杀菌反应(i)来自A4 群体，菌株961-5945(B:2b:P1.21,16)和/或菌株G2136(B:-); (ii)来自ET-5复合体，菌 株MC58(B:15:P1.7,16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7,16); (iii)来自谱系3，菌株394/98 (B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)。更优选的组合物可诱导抗菌株961-5945、 44/76 和394/98的杀菌反应。菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌属MLST参考菌株[参考文献107中的编号 638和1002]。菌株MC58可广泛获得(例如，ATCC BAA-335)，是参考文献108中测 序的菌株。菌株44/76已被广泛使用和特征鉴定(例如，参考文献109)，是奈瑟菌属 MLST参考菌株中的一种[参考文献107中的编号237;参考文献19表2的第32行]。 菌株394/98最初于1998年在新西兰分离，己经公开了一些用这种菌株进行的研究(例 如，参考文献110和111)。菌株BZ198是另一种MLST参考菌株[参考文献107中的 编号409;参考文献19表2的第41行]。微拔微分除了含有OMV，本发明的组合物可含有其它非囊泡抗原。例如，该组合物可包 含以下其它抗原中的一种或多种-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、 C、 W135和/或Y的糖类抗原，如参考文献112所 述的血清群C的寡糖或参考文献113的寡糖。VA-MENINGOC-BCTM产品含有血清群 C多糖。-肺炎链球菌OS^卬tococcwp朋"wom'ae)的糖类抗原[例如，参考文献114-116;参考文献123的第22和23章]。-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[例如，117、 118;参考文献123的第15章]。-乙肝病毒抗原，诸如表面和/或核心抗原[例如，118、 119;参考文献123的第16章]。-丙肝病毒抗原[例如，120]。-百日咳博德特菌(^^&&//" ^W^^)抗原，诸如百日咳博德特菌的百日咳全毒 素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可以与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3 组合使用[例如，参考文献121和122;参考文献123的第21章]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献123的第13章]。-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献123的第27章]。 -B型流感嗜血杆菌(//。6^0/^//"""/7"^^^8)的糖类抗原[例如，参考文献123的 第14章]-淋病奈瑟菌(A^o"o/r/zoe。e)的抗原[例如，参考文献124]。 -肺炎衣原体(Oz/a/n;^a;meMmom'ae)的抗原[例如，125-131]。 -砂眼衣原体(C/2/am;^/a/rac/2om油:y)的抗原[例如，132]。 -牙龈卟啉单胞菌(尸o^/z;wwomwg/f7g/vafo)的抗原[例如，133]。 -脊髓灰质炎抗原[例如，134、 135;参考文献123的第24章]，如IPV。 -狂犬病抗原[例如，136]，如冻干的灭活病毒[例如，137， RabAvertTM]。 -麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原[例如，参考文献123的第19、 20和26章]。 -流感抗原[例如，参考文献123的第17和18章]，如血球凝集素和/或神经氨酸 酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxe〃flcator/2afo)抗原[例如，138]。-无乳链球菌CSfr印tococc^aga/fl"/^)(B型链球菌)蛋白抗原[例如，139、 140]。 -化脓性链球菌OS^印tococcw外ogewe力(A型链球菌)抗原[例如，140、 141、 142]。当使用糖类或碳水化合物抗原时，优选与载体缀合以增强免疫原性。B型流感嗜 血杆菌(/f./,Wwe^fle)、脑膜炎球菌和肺炎球菌糖类抗原的缀合是熟知的。在需要的情况下可以对有毒的蛋白抗原进行解毒处理(例如通过化学和/或遗传手 段对百日咳毒素的解毒处理[122])。在所述组合物包含白喉抗原的情况下，优选同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。 类似地，在组合物包含破伤风抗原的情况下，优选也包含白喉和百日咳抗原。类似 地，在组合物包含百日咳抗原的情况下，优选也包含白喉和破伤风抗原。因此优选 DTP组合。糖类抗原优选为缀合物形式。缀合物的优选载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白 喉类毒素或破伤风类毒素。白喉毒素的CRM197突变体[143-145]是特别优选的载体， 同样优选的还有白喉类毒素。其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[146]、合 成肽[147，M8]、热激蛋白[149,150]、百日咳蛋白[151,152]、细胞因子[153]、淋巴因子 [153]、激素[153]、生长因子[153]、含有各种病原体衍生抗原的多种人004+ T细胞 表位的人工蛋白[154]、流感嗜血杆菌的D蛋白[155,156]、肺炎球菌表面蛋白PspA[157]、肺炎球菌溶血素[158]、铁摄取蛋白(iron-uptake protein)[159]、艰难梭菌 (C^骄"7e)的毒素A或B [160]等。组合物中各抗原的浓度通常至少为1 pg/ml。通常，任何给定抗原的浓度足以引 起抗该抗原的免疫反应。除了在本发明组合物中使用蛋白质抗原，也可使用编码抗原的核酸。因此，本发 明组合物的蛋白质组分可用编码该蛋白质的核酸(优选DNA，例如以质粒的形式)代 替。优选的组合物含有上述脑膜炎球菌OMV和脑膜炎球菌血清群A、 C、 W135和Y 中一种或多种(即l、 2、 3或4种)的缀合(conjugated)荚膜糖。当OMV来自血清群B 时该方法包括以下血清群B+A; B+C; B+W135; B+Y; B+C+W135; B+C+Y; B+W135+Y ; B+A+C+W135 ; B+A+C+Y ; B+A+W135+Y ; B+C+W135+Y ; 和 B+A+C+W135+Y。两种优选组合使用血清群B OMV和血清群A+W135+Y或血清群 A+C+W135+Y中任一的缀合抗原。通常，通过选择x种血清群的OMV和其余5-x 种血清群的缀合糖类可以覆盖血清群A、 B、 C、 W135和Y中所有5种。可加入特定的脑膜炎球菌蛋白抗原(优选血清群B的)以补充OMV组合物，具体 说，可加入参考文献30和161-169中所述的蛋白抗原。也可加入少量规定的抗原(IO 种或更少(例如，9， 8， 7、 6、 5、 4、 3、 2)纯化抗原的混合物)。本发明所用的其它 优选免疫原性多肽是参考文献169中所述的那些(1) 'NadA'蛋白；(2) '741， 蛋白；(3) '936'蛋白；(4) '953，蛋白；和(5) '287，蛋白。其它可能的补充性 脑膜炎球菌抗原包括运铁蛋白结合蛋白(例如，TbpA和TbpB)和/或Cu,Zn-超氧化物 歧化酶[7]。其它可能的补充性脑膜炎球菌抗原包括含有以下氨基酸序列之一的蛋白 质参考文献161的SEQ ID NO:650;参考文献161的SEQ ID NO.878;参考文献 161的SEQ ID NO:884;参考文献162的SEQ ID NO:4;参考文献163的SEQ ID NO:598;参考文献163的SEQ ID NO:818;参考文献163的SEQ ID NO:864;参考 文献163的SEQ IDNO:866;参考文献163的SEQ ID NO:1196;参考文献163的SEQ IDNO:1272;参考文献163的SEQ ID NO:1274;参考文献163的SEQ ID NO:1640; 参考文献163的SEQIDNO:1788;参考文献163的SEQ ID NO:2288;参考文献163 的SEQ ID NO:2466;参考文献163的SEQ ID NO:2554;参考文献163的SEQ ID NO:2576;参考文献163的SEQ ID NO:2606;参考文献163的SEQ ID NO:2608;参 考文献163的SEQ ID NO:2616;参考文献163的SEQ ID NO:2668;参考文献163 的SEQ ID NO:2780;参考文献163的SEQ ID NO:2932;参考文献163的SEQ ID NO:2958;参考文献163的SEQ ID NO:2970;参考文献163的SEQ ID NO:2988，或者含有下述氨基酸序列的多肽(a)与所述序列有50%或者更高相同性(例如，60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或更高)；和/或(b)包含所述序列至少n个连续氨基酸 的片段，其中，n是7或更大(例如，8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 25、 30、 35、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 150、 200、 250或更大)。优选的(b)的片段包含有关序列 的表位。可包含这些多肽中的多个(例如，2、 3、 4、 5、 6)。也可加入脑膜炎球菌抗 原运铁蛋白结合蛋白和/或Hsf蛋白[170]。当OMV来自血清亚型P1.7b，4脑膜炎球菌或血清亚型Pl.7,16脑膜炎球菌时以此 方式用规定的脑膜炎球菌抗原补充OMV特别有效。优选用这两种血清亚型的OMV 的混合物补充。錄定i淳週本发明提供了含有从具有以下亚型之一的脑膜炎球菌制备的OMV的组合物 P1.2; P1.2，5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5，C; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7，16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9，15; PU2，13; P1.13; P1.14; P1.21,16; P1.22，14。所述脑膜炎球菌优选为血清群B。 如上所述，这些OMV适用于本发明。 謝F券齊方案本发明提供了给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中，第一剂量在0时刻 给予，第二和第三剂量在下两个月之后给予，第四剂量在0时刻之后的第11-13个月 之间给予。本发明还提供了给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中，第一剂量在0时 刻给予，第二和第三剂量在下两个月之后给予，第四剂量在0时刻之后的第11-13 个月之间给予，且其中，(a)第一、第二和第三剂量含有彼此具有相同血清亚型的 OMV，和(b)第四剂量含有具有与前三种剂量不同血清亚型的OMV。第四剂量可含 有只具有与前三剂量不同血清亚型的OMV，或者它可含有两种类型的OMV， 一种 具有与前三剂量不同的血清亚型， 一种具有与前三剂量相同的亚型。第一、第二和第三剂量优选间隔6-8周给予。第四剂量优选在0时刻后约1年给予。患者优选在四次给药中各接受相同量的疫苗。
OMV优选为血清亚型P1.7b,4和/或P1.7,16。本发明还提供了给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中(a)所述疫苗含 有具有第一血清亚型的脑膜炎球菌OMV; (b)所述患者以前已接受过具有第二血清 亚型的不同OMV疫苗，该不同OMV疫苗的第一剂量在实施该方法前11个月以上 给予。本发明还提供了具有第一血清亚型的脑膜炎球菌OMV在制造能赋予抗脑膜炎球 菌性脑膜炎免疫力的药物中的应用，其中，所述药物给予已用具有第二血清亚型的 OMV预先免疫过的患者。也可先用脑膜炎球菌缀合疫苗免疫再给予OMV。因此，本发明提供了第一脑膜 炎球菌血清群的脑膜炎球菌OMV在制造能赋予抗至少脑膜炎球菌性脑膜炎免疫力 的药物中的应用，其中，所述药物给予已用第二脑膜炎球菌血清亚型的缀合荚膜糖 预先免疫过的患者。类似地，提供了给予患者脑膜炎球菌疫苗的方法，其中(a)所 述疫苗含有具有第一血清群的脑膜炎球菌OMV; (b)所述患者以前己接受过第二脑 膜炎球菌血清群的缀合荚膜糖。可在给予OMV之前6个月以上(例如，11个月以上)实施预先免疫 (pre-immunisation)。因此，例如，患者可在0时刻接受缀合糖类，然后在11个月之 后接受OMV。用于预先免疫的脑膜炎球菌糖类优选至少具有血清群C，但也可具有多种血清 群，例如，具有A+C、具有A+C+Y、具有A+C+W135+Y等。 所述第一血清群优选是血清群B。OMV可与脑膜炎球菌缀合物同时给予，即患者在接受OMV的同时还接受脑膜 炎球菌缀合物剂量。患者可用或可不用第一血清群的OMV预先免疫。 患者可以用B型流感嗜血菌荚膜糖缀合物预先免疫。 患者可用白喉类毒素和破伤风类毒素预先免疫。术语"含有"包括"包含"以及"由……构成"，例如"含有"X的组合物可仅 由X构成或可包含其它的物质，例如X+Y。与数值x相关的术语"约"表示，例如^±10%。"基本上"不排除"完全"，例如"基本上无"Y的组合物可完全无Y。"基本上" 可视需要从本发明定义中省去。 本发明实施方式对健康成人进行MeNZBTM产品的剂量研究。通过25 mm的23号针头给予成人 三次25pg或50mg的OMV剂量，每次间隔6周。在第三次免疫4-6周后检测到抗 疫苗菌株的SBA效价升高4倍，接受25吗剂量的患者100%都是这样，但奇怪的是， 接受较高剂量的患者只有87°/。出现这种情况。第二次给药后接受较低剂量的患者中 产生反应的比例也较高(87%比78%)。因此选择较低剂量继续使用，对多数患者而言， 疫苗原液(stock)可免疫两次。證F鄉一多微斧藤樣已经描述过从挪威菌株H44/76制备的OMV，并在I、 II和III期临床试验中给予 人类患者。它们形成了 MenBvacTM产品的基础。类似地，从新西兰菌株HZ98/254制 备的OMV形成了 MeNZBTM产品的基础。已证实它们是安全和有效的。MeNZBTM和MenBvacTM在0.5 ml剂量中都含有50吗/ml浓度的OMV(以蛋白质 的量测量)。当在人类中测试这两种OMV的组合时，为维持对两种不同血清亚型的 功效，最直接的比较(方法)是将各OMV的浓度维持在50pg/ml。但是，发明人选择 了维持OMV的总剂量与两种单价产品中的相同(50 (ig/ml)，将各OMV的量减半， 即使用25吗/ml各血清亚型。将组合疫苗给予以前已接受过MeNZBTM或MenBvacTM的患者。先给予单价 OMV， l年后给予组合疫苗。应当理解，以上仅通过举例描述了本发明，可对其作出改进而不超越本发明的范 围和精神。参考文献(其内容在此全文并入以供参考) [1] Bjune等，(1991) Lancet 338(8775):1093-1096. 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权利要求
1.一种含有脑膜炎球菌血清群A、B、C、W135和Y中两种或多种的外膜囊泡(OMV)的组合物。
2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，其包含以下血清群组合的OMV:A+B; A+C; A+W135; A+Y; B+C; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y; W135+Y;A+B+C; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y ; C+W135+Y ; A+B+C+W135 ; A+B+C+Y ; B+C+W135+Y ;禾口 A+B+C+W135+Y。
3. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自超侵袭性谱系的脑膜炎球菌菌株。
4. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自超毒性谱系的脑膜炎球菌菌株。
5. 如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述菌株来源选自以下7种超毒性谱系亚群I;亚群III;亚群IV 1; ET 5复合体；ET 37复合体；A4群体；谱系3。
6. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自己经敲除了一种或多种参与LPS生物合成的酶的脑膜炎球菌。
7. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物所含的OMV 来自超量表达NspA的脑膜炎球菌。
8. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述各亚型OMV的浓 度为10-500吗/ml。
9. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，含有少于每微克蛋白质 0.4微克脱氧胆酸盐。
10. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，含有少于每微克蛋白 质0.12微克脑膜炎球菌LPS。
11. 一种含有脑膜炎球菌菌株的外膜囊泡的组合物，其中，所述菌株为血清群C、 W135或Y。
12. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，还包含缀合的脑膜炎球菌血清群A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
13. —种给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗(例如，权利要求1所述的疫苗)的方法，其特征在于，第一剂量在0时刻给予，第二和第三剂量在后两个月给予，第四剂量 在0时刻之后的第11-13个月之间给予。
14. 一种给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其特征在于，第一剂量在0时 刻给予，第二和第三剂量在后两个月给予，第四剂量在0时刻之后的第11-13个月之 间给予，且其中，(a)第一、第二和第三剂量含有相同血清亚型的OMV，和(b)第四 剂量含有与前三剂量不同血清亚型的OMV。
15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第四剂量含有仅血清亚型不同 于前三剂量的OMV。
16. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第四剂量含有两种类型的 OMV， 一种具有与前三剂量不同的血清亚型， 一种具有与前三剂量相同的亚型。
17. 如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述OMV为血清亚 型Pl,7b，4的OMV。
18. 如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述OMV为血清亚 型P1.7，16的OMV。
19. 一种给予患者脑膜炎球菌OMV疫苗的方法，其中(a)所述疫苗含有具有第 一血清亚型的脑膜炎球菌OMV; (b)所述患者以前曾接受过具有第二血清亚型的不 同OMV疫苗，该不同OMV疫苗的第一剂量的给予早于实施本方法11个月以上。
20. 具有第一血清亚型的脑膜炎球菌OMV在制造赋予抗脑膜炎球菌性脑膜炎免 疫力的药物中的应用，其中，所述药物给予已用具有第二血清亚型的OMV预先免疫 过的患者。
21. 如权利要求19所述的方法或如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述 第二血清亚型是P1.7b,4。
22. 如权利要求19所述的方法或如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述 第二血清亚型是P1.7,16。
23. 如权利要求19所述的方法或如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述 第二血清亚型是PU9，15。
24. 如权利要求19-22中任一项所述的应用，其特征在于，所述预先免疫早于给 予所述药物ll个月以上。
25. —种制造脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗的方法，所述方法包括以下步骤 (i)鉴定与脑膜炎球菌性脑膜炎爆发有关的脑膜炎球菌菌株的血清亚型；和(ii)从具 有步骤(i)所鉴定的血清亚型的脑膜炎球菌菌株制备OMV以用于制备疫苗。
26. 如权利要求25所述的方法，其包括以下一个或两个额外步骤(iii)将所述 OMV配制成疫苗；和(iv)在被被所述疾病爆发影响或者可能被所述疾病爆发影响的地区投放所述疫苗。
27. 如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌菌株为血清 群B。
28. 第一血清群脑膜炎球菌菌株的OMV用于保护抗第二血清群的一种或多种脑 膜炎球菌菌株的应用，其特征在于，所述第一和第二血清群不同。
29. —种组合物，含有第一脑膜炎球菌血清亚型和第二脑膜炎球菌血清亚型的外 膜囊泡，其中，第一血清亚型的OMV的浓度小于45 |ag/nil，第二血清亚型的OMV 的浓度小于45昭/ml。
30. —种组合物，含有第一脑膜炎球菌血清亚型和第二脑膜炎球菌血清亚型的外 膜囊泡，其中，第一血清亚型的OMV的浓度约25吗/ml，第二血清亚型的OMV的 浓度约25吗/ml。
31. 如权利要求30所述的组合物，所述组合物包含浓度约25吗/ml的第三脑膜 炎球菌血清亚型的外膜囊泡。
32. —种组合物，含有至少两种脑膜炎球菌血清亚型的外膜囊泡，其中，所述OMV 的组合浓度小于90叱/ml。
33. —种组合物，含有n种不同脑膜炎球菌血清亚型的外膜囊泡，其中任一血清 亚型OMV浓度小于45昭/ml，且其中n为l、.2、 3、 4、 5或6。
34. 如权利要求29-33中任一项所述的组合物，还含有缀合的脑膜炎球菌血清群 A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
35. —种试剂盒，含有从n种不同血清亚型制备的OMV，其中，n为2、 3、 4、 5或6。
36. —种方法，所述方法包括制备"组OMV，每一组来自"种不同血清亚型 中的任一种；和将所述"组囊泡组合为试剂盒中或混合物，其中，n为2、 3、 4、 5 或6。
37. —种组合物，含有从具有P1.7b,4血清亚型的血清群B脑膜炎球菌菌株制备 的OMV，其中，所述组合物中OMV的浓度约为50吗/ml。
38. 如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有氢氧化铝佐剂和 组氨酸缓冲剂。
39. 如权利要求37或38所述的组合物，其剂量体积约为0.5ml。
40. —种组合物，含有"种不同脑膜炎球菌超毒性谱系的外膜囊泡，其中，"为2、 3、 4、 5或6。
41. 如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述超毒性谱系包括亚群I、亚 群III、亚群IV1、 ET5复合体、ET37复合体、A4群体和谱系3。
42. —种组合物，含有n种不同脑膜炎球菌NMB 1870变体的外膜囊泡，其中，" 为2或3。
43. —种组合物，含有从具有以下亚型之一的脑膜炎球菌制备的OMV: P1.2;P1.2，5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5,C; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; PU4; P1.21，16;禾口P1.22，14。
44. 一种组合物，含有以下两种或三种的外膜囊泡的混合物(i)血清亚型P1.7b,4 脑膜炎球菌；(ii)血清亚型P1.7,16脑膜炎球菌；和(iii)血清亚型Pl.19,15脑膜炎球 菌。
45. 如权利要求37-44中任一项所述的组合物，还包含缀合的脑膜炎球菌血清群 A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
46. —种试剂盒，包括分别装有以下两种或三种的外膜囊泡的容器(i)血清亚型 P1.7b,4脑膜炎球菌；(ii)血清亚型P1.7,16脑膜炎球菌；和(iii)血清亚型Pl,19,15脑 膜炎球菌。
47. 如权利要求35或46所述的试剂盒，还包含缀合的脑膜炎球菌血清群A、 C、 W135和Y中一种或多种的荚膜糖。
48. 第一脑膜炎球菌血清群的脑膜炎球菌OMV在制造赋予抗至少脑膜炎球菌性 脑膜炎免疫力的药物中的应用，其中，所述药物给予已用第二脑膜炎球菌血清亚型 的缀合荚膜糖预先免疫过的患者。
全文摘要
靶向抗特定流行性菌株的OMV对于控制疾病地方性爆发高度有效。联用大规模并可再现的制备技术可在疾病爆发后迅速制备疫苗。本发明提供了制备脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗的方法，该方法包括以下步骤(i)鉴定与脑膜炎球菌性脑膜炎爆发有关的脑膜炎球菌菌株的血清亚型；(ii)从具有步骤(i)所鉴定的血清亚型的脑膜炎球菌菌株制备OMV以用于制备疫苗。该方法可包括以下一个或两个额外步骤(iii)将所述OMV配制成疫苗；和(iv)在被或者可能被所述疾病爆发影响的地理区域分销所述疫苗。所述脑膜炎球菌菌株通常为血清群B，但也可以是血清群A、C、W135、Y等。
文档编号A61K39/095GK101115501SQ200580029469
公开日2008年1月30日 申请日期2005年9月5日 优先权日2004年9月3日
发明者M·皮扎, P·奥斯特, R·拉普奥里 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司
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