抗-cMET抗体的制作方法
专利名称：抗-cMET抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的能够特异性结合人C-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的二价抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。更特别地，根据本发明的抗体能够抑制c-Met 二聚化。本发明同样包括所述抗体作为癌症或与所述受体的超表达相关的任何病状的预防和/或治疗处理的药物的用途，以及用于与c-Met超表达相关疾病的诊断的方法或试剂盒中的用途。本发明最后涉及包含这些抗体以及针对涉及肿瘤进展或转移的其他生长因子的其他抗体和/或化合物和/或化合物和/或抗癌剂或与毒素偶联的药剂的产品和/或组合物，及其用于特定癌症的预防和/或治疗的用途。
背景技术：
受体酪氨酸激酶(RTK)靶向药剂，如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、伊马替尼和吉非替尼抑制剂已经说明了将该蛋白类别用于选定癌症治疗的兴趣。c-Met是还包括RON和SEA的RTK亚家族的原型成员。c_Met RTK家族在结构上不同于其他RTK家族，并且是唯一已知的肝细胞生长因子(HGF)(也称为散射因子(SF)) 的高亲和性受体[D. P. Bottaro 等，Science 1991,251 :802-804 ；L. Naldini 等，Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991,10 :2867-2878] c_Met和HGF在各种组织中广泛表达，并且它们的表达通常分别限于上皮和间叶来源的细胞[M. F. Di Renzo等，Oncogene 1991，6 :1997-2003 ； E. Sonnenberg等，J. Cell. Biol. 1993,123 :223-235]。它们都是正常的哺乳动物发育所需的，并且已经显示出在细胞迁移、形态分化和三维管构造的组织以及生长和血管生成中特别重要[F. Baldt 等，Nature 1995,376 :768-771 ；C. Schmidt 等，Nature. 1995 :373 699-702 ；Tsarfaty 等，Science 1994，263 :98-101]。c_Met 和 HGF 的受控调节已经显示出在哺乳动物发育、组织维持和修复中是重要的[Nagayama T.，Nagayama M.，Kohara S.， Kamiguchi H. , Shibuya M.，Katoh Y.，Itoh J. , Shinohara Y.，Brain Res. 2004,5 ；999 (2) 155-66 ；Tahara Y. , Ido A. , Yamamoto S. , Miyata Y. , Uto H. , Hori Τ. , Hayashi K., Tsubouchi H.，J Pharmacol Exp Ther. 2003,307(1) :146-51]，它们的调节异常涉及癌症的进展。由c-Met的不当激活驱动的异常信号是在人癌症中观察到的最常见的变化之一并且在肿瘤发生和转移中起着关键作用[Birchmeier等，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003,4 915-925 ;L.Trusolino 禾口 Comoglio P. Μ. , Nat Rev. Cancer. 2002,2(4) :289-300]。不当的c-Met激活可能由配体-依赖性和无关性机制引起，其包括c-Met的超表达和/或旁分泌或自分泌激活，或通过功能突变获得[J. G. Christensen, Burrows J.和 Salgia R.，Cancer Latters. 2005,226 :1-26]。然而，在配体的存在或不存在下，c-Met 受体的低聚是调节激酶对ATP和含酪氨酸的肽底物的结合亲和性和结合动力学所需的[Hays JL, Watowich SJ，Biochemistry，2004 年 8 月 17 日，43 10570-8]。激活的 c-Met 募集信号效应物至其位于细胞质结构域中的多坞(multidocking)位点，导致几个关键信号途径的激活，包括 Ras-MAPK、PI3K、Src 和 Mat3[Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005,15(1)49-51 ；Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF, Oncogene. 2000,19(49) :5582-9]。这些途径对于肿瘤细胞增殖、入侵和血管生成以及对于避免凋亡是必需的[Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF,Oncogene,2000,19(49) :5582-9,Gu H. ,Neel BG,Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3) :122-30, Fan S.，Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q.，Cao Y.，Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM，Oncogene. 2000 年 4 月 27 日，19 (18) :2212-23]。此外，c_Met 信号相对于其他RTK的独特方面是所报道的与焦点粘连复合物和非激酶结合伴侣的相互作用， 非酶结合伴侣如 α6β4 整联蛋白[Trusolino L. ,Bertotti A. ,Comoglio PM，Cell. 2001， 107 :643-54]> CD44v6[Van der Voort R. , Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren Μ. , Prevo R. , Smit L. , David G. , Hartmann G. , Gherardi Ε. , Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274 (10) 6499-506]、丛蛋白 Bl 或 semaphorin[Giordano S. , Corso S. , Conrotto P. , Artigiani S. , Gilestro G. , Barberis D. , Tamagnone L. , Comoglio PM, Nat Cell Biol.2002,4(9) 720-4 ；Conrotto P. , Valdembri D. , Corso S. , Serini G. , Tamagnone L. , Comoglio PM, Bussolino F. , Giordano S. , Blood. 2005,105 (11) :4321-9 ；Conrotto P. , Corso S., Gamberini S.，Comoglio PM, Giordano S.，Oncogene. 2004,23 :5131-7]，其可以进一步增加这种受体对细胞功能调节的复杂性。最后，近期的数据证明c-Met可能涉及对吉非替尼或埃罗替尼的肿瘤抗性，表明同时靶向EGFR和c-Met的化合物的组合可能是非常令人感兴趣的[Engelman JA 等，Science, 2007，316 1039-43]。在过去的一些年中，已经研发了许多不同策略来削弱癌细胞系中的c-Met信号。 这些策略包括 i)中和对抗 c-Met 或HGF/SF 的抗体[Cao B. ,Su Y.，Oskarsson M.，Zhao P.， Kort EJ,Fisher RJ,ffang LM,Vande Woude GF,Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，98 (13) 7443-8 ；Martens Τ. ,Schmidt NO,Eckerich C,Fillbrandt R. ,Merchant Μ. ,Schwall R.， Westphal Μ.，Lamszus K.，Clin Cancer Res. 2006,12(20) :6144-52]或使用 HGF/SF 拮抗剂 NK4,以防止配体结合 c-Met [Kuba K.，Matsumoto K.，Date K.，Shimura H.，Tanaka M.， Nakamura T.，Cancer Res. ,2000,60 :6737-43]，ii)阻断激酶活性的 c_Met 的小 ATP结合位点抑制剂[Christensen JG, Schreck R. , Burrows J. , Kuruganti P. , Chan Ε, Le P. , Chen J. , Wang Χ. , Ruslim L. , Blake R. , Lipson KE, Ramphal J. , Do S. , Cui JJ, Cherrington JM,Mendel DB,Cancer Res. 2003，63 :7345-55]，iii)干扰接近多坞位点的工程化 SH2 结构域多肽和降低受体或配体表达的RNAi或核酶。这些方法中的大部分显示出c-Met的选择性抑制，这导致肿瘤抑制，并显示出c-Met对于癌症中的治疗干预是令人感兴趣的。在对于c-Met靶向产生的分子内，一些是抗体。最广泛描述的是由Genentech产生的抗-c-Met 5D5抗体[W096/38557]，其在各种模型中单独加入时，表现为有效的激动剂， 并且用作Fab片段时，表现为拮抗剂。描述为一臂5D5(0A5D5)并作为重组蛋白在大肠杆菌中产生的该抗体的单价工程化形式也是Genentech专利申请的主题[W02006/015371]。然而，因为其特别的支架而不能认为是抗体的这种分子也展示出在人体中可能是免疫原性的突变。就活性而言，这种未糖基化的分子缺乏效应物功能，并且最后，没有明显的数据证明 0A5D5抑制c-Met的二聚化。此外，在体内模型中在G55中测试时，G55是表达c-Met但不表达HGF mRNA和蛋白并且与配体无关地生长的成胶质细胞瘤细胞系，一臂抗-c_Met对G55 肿瘤生长没有明显作用，表明0A5D5主要通过阻断HGF结合起作用，并且不能够靶向与HGF 无关的被激活的肿瘤[Martens Τ.等，Clin. Cancer Res. ,2006,12(20) :6144-6152]。
另一种靶向c-Met的抗体由Pfizer描述为“主要作为c_Met拮抗剂作用的抗体， 并且在一些情况中，作为c-Met激动剂” [W02005/016382]。在该申请中没有描述显示出 Pfizer抗体在c-Met 二聚化中的任何作用的数据。
发明内容
本发明的创造性方面之一是生产没有内在激动剂活性并抑制c-Met 二聚化的嵌合和/或人源化单克隆抗体。更特别地，本发明的一个创造性方面是生产具有拮抗剂活性并抑制c-Met 二聚化的嵌合和/或人源化单克隆抗体。除了靶向配体-依赖性肿瘤，该方法还将削弱C-Met的配体无关性激活，这种激活是由于胞内结构域的超表达或突变引起的，该胞内结构域对于信号仍然依赖于低聚化。该抗体活性的另一个方面立体地阻碍c-Met与其伴侣相互作用，从而导致c-Met功能削弱。将抗体优选但不限于人源化和工程化为人IgGl，以获得除与c-Met受体的特定阻断相关的功能以外的效应物功能，如ADCC和⑶C。令人^C讶地，第一次，发明人设法生成了能够结合C-Met而且还能够抑制C-Met 二聚化的嵌合和/或人源化单克隆拮抗剂抗体，所述单克隆抗体是二价的，这与现有的针对 c-Met的拮抗剂抗体相反。在现有技术中，如果是真实的，有时候表明能够抑制c-Met与其伴侣二聚化的抗体是令人感兴趣的，但从未公开过，或清楚地表明能够进行这些的抗体。此外，关于抗体特异性，根本没有证据成功地产生了这样的活性二价抗体。如之前所解释的，c-Met 二聚化的抑制是本发明的重要方面，因为这些抗体将呈现出真实的对较大患者群的兴趣。通过本发明的方法产生的抗体不仅可以治疗配体依赖性激活的c-Met癌症，因为其是直至本发明的情况，而且还可以治疗配体无关性激活的c-Met癌症。通过对同时表达c-Met-RLuc/c-Met-YFP的细胞的BRET分析来评价抗体，并选择它们抑制至少40 %，优选45 %、50 %、55 %和最优选60 %的BRET信号的能力。BRET技术已知为代表性的蛋白二聚化[Angers等，PNAS，2000，97 :3684-89]。BRET技术是本领域技术人员公知的，并将在一些实施例中详述。更特别地， BRET(生物发光共振能量转移)是在生物发光供体(Renilla荧光酶(Rluc))和荧光受体 (GFP(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白)的突变体)之间发生的非放射性能量转移。 在本发明的情况中，使用了 EYFP(增强的黄色荧光蛋白)。转移的效率取决于方向以及供体和受体之间的距离。然后，只有两个分子非常近(I-IOnm)，才会发生能量转移。将这种特性用于产生蛋白-蛋白相互作用试验。实际上，为了研究两个伴侣之间的相互作用，通常将第一个与Renilla荧光酶融合，而将第二个于GFP的黄色突变体融合。融合蛋白通常但不必须在哺乳动物细胞中表达。在其膜渗透性底物(coelenterazine)存在下，IUuc发射出蓝光。如果GFP突变体离开IUuc近于lOnm，将发生能量转移，并且可检测到另外的黄色信号。作为受体发射的光和供体发射的光之间的比例来测量BRET信号。因此，随着两个融合蛋白变近，或如果构象变化使得mUC和GFP突变体更近，BRET信号将增加。如果BRET分析存在于优选的实施方案中，本领域技术人员已知的任何方法可以用来测量c-Met 二聚化。没有限制，可以提及以下的技术FRET(荧光共振能量转移)、 HTRF(均相时间分辨荧光)、FLIM(荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS单波长荧光交叉相关
也可以使用其他传统技术，如共同免疫沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和性色谱、ELISA或Far蛋白印迹。术语“一种抗体”、“多种抗体”或“免疫球蛋白，，以最宽意思互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们呈现出所需的生物活性)。更特别地，这样的分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由重链可变区(或结构域)(在此缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CHI、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变性区，称为互补性决定区(CDR)，散布更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端排列至羧基端FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重链可以分成三个功能区Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。 Fd区包含VH和CHl结构域，并且结合轻链，形成Fab-抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应物功能，其包括，例如，补体固定和结合效应物细胞的同源Fc受体。在IgG、IgA和 IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区作为柔性间隔物，使Fab部分在相对于Fc区的空间中自由移动。铰链结构域在结构上是多变的，在免疫球蛋白类别和亚类中的序列和长度都有变化。根据结晶研究，免疫球蛋白铰链区可以在结构和功能上进一步细分成三个区上铰链、核心和下铰链(Shin等，Immunological Reviews 130:87,1992)。上铰链包括从CHl 羧基端至限制运动的铰链中第一个残基的氨基酸，通常为两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥键。下铰链区连接CH2结构域的氨基端，并包括CH2结构域中的残基。人IgGl的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通过二硫键形成二聚化时，形成环八肽，认为这作为枢轴，由此给予柔性。由免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性产生的构象变化可能影响抗体Fc部分的效应物功能。术语“单克隆抗体”根据其通常的意思来使用，并且表示从基本上同源的抗体群获得的抗体，即，构成群的单独抗体是相同的，除了可能少量存在的天然产生的突变。换句话说，单克隆抗体是从单个细胞克隆(例如，杂交瘤细胞、用编码同源抗体的DNA转染的真核宿主细胞、用编码同源抗体的DNA转化的原核宿主细胞等)的增殖产生的同源抗体组成，并且通常特征在于单个类别和亚类的重链以及单种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的，针对单种抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。在本发明的描述中，术语与抗体化合物或其序列相连的多肽、多肽序列、氨基酸序列、肽和蛋白质可互换。本发明涉及能够抑制C-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3或与序列SEQ IDN0. 1、2和3最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3 ；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或与序列SEQ ID NO. 5、6和7最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 56。更特别地，本发明涉及如上所述的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。换句话说，本发明涉及能够抑制C-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No.l、2和3或与序列SEQ ID NO. 1、2和3最佳比对后具有至少80%同一性的序列的CDR-HU CDR-H2和 CDR-H3 ；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或与序列SEQ ID NO. 5、6和7 最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。更特别地，本发明涉及如上所述的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。换句话说，本发明涉及能够抑制C-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No.l、2和3或与序列SEQ ID NO. 1、2和3最佳比对后具有至少80%同一性的序列的CDR-HU CDR-H2和 CDR-H3 ；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或与序列SEQ ID NO. 5、6和7 最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。如本领域技术人员将清楚的，共有序列(consensus sequence) SEQ ID No. 57和21 包含在共有序列SEQ ID No. 56中。表 1
#01#02#03#04#05#06#07#08#09#10#11#12#13#14SEQID NO 56XlX2X3CX5X6X7X8X9CXllX12CX14SEQ ID NO 57XlX2X3CX5X6X7X8X9CPPCPSEQID NO 21XlX2X3CX5-CX8X9CXllX12CX14对于 SEQ ID No. 56 Xl:P，R，C，-X5:D, C，G，-X8 :H, V, K,-X12 :P,-
X2:K，C，R，-X6:K, C，-X9 :T, C, E, P,-X14 :P,T
X3:S，C，D，-X7:T, C，-Xll :P, I表述“功能性片段和衍生物”将在之后的本发明说明书中详细限定。如通过IMGT限定的，⑶R区或⑶R，用来表示免疫球蛋白的重链和轻链的超变区。无论哪一种抗原受体、链类型或物种，已经限定IMGT独特的编号来比较可变结构域[Lefranc M. -P., Immunology Today 18,509(1997) ；Lefranc Μ. -P., The Immunologist,7,132-136 (1999) ；Lefranc, Μ. -P. , Pommie, C, Ruiz, Μ. , Giudicelli, V., Foulquier, Ε. , Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc, Dev. Comp. Immunol,27,55-77 (2003)]。在IMGT独特的编号中，保守氨基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸 23 (第一 -CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二 -CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118CJ-PHE或J-TRP)。IMGT独特的编号提供了框架区的标准化划界(FR1-IMGT 位置 1 至洸，FR2-IMGT :39 至 55，FR3-IMGT :66 至 104 和 FR4-IMGT :118 至 128)和互补决定区的标准化划界CDR1_IMGT :27 至 38，CDR2-IMGT :56 至 65 和 CDR3-IMGT :105 至 117。因为缺口表示未占据的位置，⑶R-IMGT长度(显示于括号中并由点分开，例如，[8.8. 13])成为关键信息。将IMGT独特的编号用于2D绘图表示中，称为IMGT Colliers de Perles [Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ. -P.，Immunogenetics，53，857—883 (2002) ；Kaas, Q.禾口 Lefranc，Μ. -P.， Current Bioinformatics，2，21_3(K2007)]，和用于 IMGT/3D 结构-DB 的 3D 结构中[Kaas， Q. , Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ·-P.，T cell receptor and MHC structural data(T 细胞受体和 MHC 结构数据)，Nucl. Acids. Res.，32，D208-D210 (2004)]。存在三个重链⑶R和3个轻链⑶R。在此使用术语⑶R或⑶Rs为了根据情况来表示这些区域中的一个或这些区域中的几个或甚至全部，其含有负责通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和性而结合的大部分氨基酸残基。在本发明的意思中，两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”用来表示最佳比对(最优比对)后获得的待比较的两个序列之间的核苷酸或相同的氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学的并且两个序列之间的差异是随机分布的并在其整个长度中。传统上，通过以最优方式比对后比较这些序列来进行两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较，所述比较能够通过片段或通过“比较窗口 ”来进行。除了人工地，可以通过 Smith 和 Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 :482]的局部同源性算法、通过 Neddleman 和 Wunsch(1970) [J. Mol. Biol. 48 :443]的局部同源性算法、通过 Pearson 和 Lipman(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444]的相似性研究方法、通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI，或通过 BLAST N 或 BLAST P 比较软件)来进行用于比较的序列最优比对。通过比较以最优方式比对的这两个序列来测定两个核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比，并且其中相对于这两个序列之间的最优比对的参照序列，待比较的核酸或氨基酸序列可以包含添加或删除。通过测定两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的相同位置的数量，将该相同位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将所获得的结果乘以100， 来计算同一性百分比，以获得这两个序列之间的同一性百分比。例如，可以使用BLAST 程序，"BLAST 2 序列”(Tatusova 等，"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences，，(Blast 2 序列-用于比较蛋白和核苷酸序列的新工具)，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250)，可在站点http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html获得，所用的参数是默认给出的那些(特别是对于参数“开放缺口惩罚” 5，和“延伸缺口惩罚” 2;所选的基质是，例如，由程序提出的基质 "BL0SUM 62”)，通过程序直接计算待比较的两个序列之间的同一性百分比。与参照氨基酸序列具有至少80 %，优选85 %、90 %、95 %和98 %同一性的氨基酸序列，优选对于参照序列具有特定修饰的那些，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换，平截或延伸。在一个或多个连续或非连续氨基酸置换的情况中，优选其中置换的氨基酸由“等价”氨基酸替代的置换。表述“等价氨基酸”在此针对描述能够用一个基础结构的氨基酸置换的任何氨基酸，然而没有实质性地改变相应抗体的生物活性，并且这将在此后限定，尤其是在实施例中。可以通过依赖于与它们替代的氨基酸的结构同源性或能够进行的不同抗体之间的生物活性的比较试验结果来确定这些等价氨基酸。例如，提及能够进行的置换的可能性，而没有导致相应修饰的抗体的生物活性的明显改变。作为非限制性实例，以下的表2给出了能想到的置换可能性，保持了修饰抗体的生物活性。当然，在相同的条件下，反过来的置换也是可能的。表权利要求
1.一种能够抑制c-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，所述抗体包含重链和轻链，重链包含分别具有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3的⑶R-H1、⑶R-H2和 ⑶R-H3，轻链包含分别具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3， 所述抗体进一步的特征在于包含铰链区，其包含氨基酸序列SEQ ID No. 56。
2.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。
3.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。
4.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含选自SEQ ID No. 22至沘和SEQID No. 72至86的氨基酸序列。
5.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由嵌合抗体组成。
6.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由人抗体组成。
7.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由人源化抗体组成。
8.如权利要求7的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 8、9或10的序列的轻链可变结构域。
9.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的铰链区。
10.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 9的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的铰链区。
11.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的铰链区。
12.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的铰链区。
13.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 9的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的铰链区。
14.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的铰链区。
15.一种分离的核酸，其特征在于选自以下的核酸a)编码权利要求1至14之一中所要求的抗体，或其二价功能性片段或衍生物的核酸、 DNA 或 RNA ；b)包括含有序列SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13 和序列 SEQ ID No. 15、 SEQ ID No. 16 和 SEQ ID No. 17 的 DNA 序列的核酸；c)包括含有序列SEQID No. 14和SEQ ID No. 18、19或20的DNA序列的核酸；d)b)或c)中限定的核酸的相应RNA核酸；e)a)、b)和c)中限定的核酸的互补核酸；f)能够在高严谨条件下与序列SEQID No. 11至13和15至17的⑶R中的至少一个杂交的至少18个核苷酸的核酸。
16.一种分离的核酸，其特征在于选自以下的核酸-编码根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一的核酸、DNA或RNA，并且其中编码所述抗体铰链区的核酸序列包含或具有选自序列SEQ ID No.四至35和SEQ ID No. 73 至87的序列。
17.一种包含权利要求15或16中所要求的核酸的载体。
18.—种包含权利要求17中所要求的载体的宿主细胞。
19.一种除了人以外的转基因动物，其包含至少一个通过权利要求17中所要求的载体转化的细胞。
20.一种生产权利要求1至14之一中要求的抗体，或其二价功能性片段或衍生物的方法，其特征在于包括以下阶段a)在培养基和合适的培养条件下培养权利要求18中所要求的细胞；和b)收集由培养基或所述培养的细胞开始生产的所述抗体，或其二价功能性片段或衍生物。
21.一种能够通过权利要求20中所要求的方法获得的抗体，或其二价功能性片段或衍生物。
22.权利要求1至14和21的抗体，作为药物。
23.一种组合物，其包作为活性成分的含权利要求1至14、21或22之一中所要求的抗体，或其二价功能性片段或衍生物组成的化合物。
24.如权利要求23的组合物，其特征在于另外包含作为组合产品，用于同时、分开或按序使用的抗肿瘤抗体。
25.如权利要求23的组合物，其特征在于另外包含作为组合物产品，用于同时、分开或按序使用的细胞毒性/细胞抑制剂。
26.如权利要求23的组合物，其特征在于所述抗体，或其二价功能性片段或衍生物中的至少一个与细胞毒素和/或放射性元素偶联。
27.如权利要求25或沈的组合物，其特征在于所述细胞毒性/细胞抑制剂或所述毒素和/或放射性元素与用于同时使用的所述组合物的至少一种元素在化学上偶联。
28.如权利要求23至27之一中所要求的组合物，作为药物。
29.如权利要求1至14、21或22的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，或权利要求 23至观的组合物在用于制备旨在抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖的药物中的应用。
30.如权利要求1至14、21或22的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，或权利要求23 至观的组合物，或权利要求四的用途在用于制备旨在防止或治疗癌症的药物中的应用。
31.如权利要求30的用途，其特征在于所述癌症是选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤或结肠癌的癌症。
32.如权利要求30或31的用途，其特征在于所述的癌症是HGF依赖性和无关性Met-激活相关的癌症。
33.一种体外诊断由起源于怀疑其中异常存在c-Met受体的生物样品的c-Met受体的超表达或低表达诱导的疾病的方法，其特征在于所述方法包括将所述生物样品与权利要求 1至14，21或22的抗体接触的步骤，如果需要，可以将所述抗体标记。
全文摘要
能够特异性结合人c-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的抗体，所述抗体具有提高的拮抗活性，所述抗体包含修饰的铰链区。包含这样的c-Met的抗体拮抗剂的组合物及其作为用于治疗癌症的药物的用途。
文档编号A61P35/00GK102227446SQ200980148150
公开日2011年10月26日 申请日期2009年12月2日 优先权日2008年12月2日
发明者C·贝斯, L·格奇, T·沃琴 申请人:皮埃尔法布雷医药公司
技术领域：
本发明涉及新的能够特异性结合人C-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的二价抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。更特别地，根据本发明的抗体能够抑制c-Met 二聚化。本发明同样包括所述抗体作为癌症或与所述受体的超表达相关的任何病状的预防和/或治疗处理的药物的用途，以及用于与c-Met超表达相关疾病的诊断的方法或试剂盒中的用途。本发明最后涉及包含这些抗体以及针对涉及肿瘤进展或转移的其他生长因子的其他抗体和/或化合物和/或化合物和/或抗癌剂或与毒素偶联的药剂的产品和/或组合物，及其用于特定癌症的预防和/或治疗的用途。
背景技术：
受体酪氨酸激酶(RTK)靶向药剂，如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、伊马替尼和吉非替尼抑制剂已经说明了将该蛋白类别用于选定癌症治疗的兴趣。c-Met是还包括RON和SEA的RTK亚家族的原型成员。c_Met RTK家族在结构上不同于其他RTK家族，并且是唯一已知的肝细胞生长因子(HGF)(也称为散射因子(SF)) 的高亲和性受体[D. P. Bottaro 等，Science 1991,251 :802-804 ；L. Naldini 等，Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991,10 :2867-2878] c_Met和HGF在各种组织中广泛表达，并且它们的表达通常分别限于上皮和间叶来源的细胞[M. F. Di Renzo等，Oncogene 1991，6 :1997-2003 ； E. Sonnenberg等，J. Cell. Biol. 1993,123 :223-235]。它们都是正常的哺乳动物发育所需的，并且已经显示出在细胞迁移、形态分化和三维管构造的组织以及生长和血管生成中特别重要[F. Baldt 等，Nature 1995,376 :768-771 ；C. Schmidt 等，Nature. 1995 :373 699-702 ；Tsarfaty 等，Science 1994，263 :98-101]。c_Met 和 HGF 的受控调节已经显示出在哺乳动物发育、组织维持和修复中是重要的[Nagayama T.，Nagayama M.，Kohara S.， Kamiguchi H. , Shibuya M.，Katoh Y.，Itoh J. , Shinohara Y.，Brain Res. 2004,5 ；999 (2) 155-66 ；Tahara Y. , Ido A. , Yamamoto S. , Miyata Y. , Uto H. , Hori Τ. , Hayashi K., Tsubouchi H.，J Pharmacol Exp Ther. 2003,307(1) :146-51]，它们的调节异常涉及癌症的进展。由c-Met的不当激活驱动的异常信号是在人癌症中观察到的最常见的变化之一并且在肿瘤发生和转移中起着关键作用[Birchmeier等，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003,4 915-925 ;L.Trusolino 禾口 Comoglio P. Μ. , Nat Rev. Cancer. 2002,2(4) :289-300]。不当的c-Met激活可能由配体-依赖性和无关性机制引起，其包括c-Met的超表达和/或旁分泌或自分泌激活，或通过功能突变获得[J. G. Christensen, Burrows J.和 Salgia R.，Cancer Latters. 2005,226 :1-26]。然而，在配体的存在或不存在下，c-Met 受体的低聚是调节激酶对ATP和含酪氨酸的肽底物的结合亲和性和结合动力学所需的[Hays JL, Watowich SJ，Biochemistry，2004 年 8 月 17 日，43 10570-8]。激活的 c-Met 募集信号效应物至其位于细胞质结构域中的多坞(multidocking)位点，导致几个关键信号途径的激活，包括 Ras-MAPK、PI3K、Src 和 Mat3[Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005,15(1)49-51 ；Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF, Oncogene. 2000,19(49) :5582-9]。这些途径对于肿瘤细胞增殖、入侵和血管生成以及对于避免凋亡是必需的[Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF,Oncogene,2000,19(49) :5582-9,Gu H. ,Neel BG,Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3) :122-30, Fan S.，Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q.，Cao Y.，Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM，Oncogene. 2000 年 4 月 27 日，19 (18) :2212-23]。此外，c_Met 信号相对于其他RTK的独特方面是所报道的与焦点粘连复合物和非激酶结合伴侣的相互作用， 非酶结合伴侣如 α6β4 整联蛋白[Trusolino L. ,Bertotti A. ,Comoglio PM，Cell. 2001， 107 :643-54]> CD44v6[Van der Voort R. , Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren Μ. , Prevo R. , Smit L. , David G. , Hartmann G. , Gherardi Ε. , Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274 (10) 6499-506]、丛蛋白 Bl 或 semaphorin[Giordano S. , Corso S. , Conrotto P. , Artigiani S. , Gilestro G. , Barberis D. , Tamagnone L. , Comoglio PM, Nat Cell Biol.2002,4(9) 720-4 ；Conrotto P. , Valdembri D. , Corso S. , Serini G. , Tamagnone L. , Comoglio PM, Bussolino F. , Giordano S. , Blood. 2005,105 (11) :4321-9 ；Conrotto P. , Corso S., Gamberini S.，Comoglio PM, Giordano S.，Oncogene. 2004,23 :5131-7]，其可以进一步增加这种受体对细胞功能调节的复杂性。最后，近期的数据证明c-Met可能涉及对吉非替尼或埃罗替尼的肿瘤抗性，表明同时靶向EGFR和c-Met的化合物的组合可能是非常令人感兴趣的[Engelman JA 等，Science, 2007，316 1039-43]。在过去的一些年中，已经研发了许多不同策略来削弱癌细胞系中的c-Met信号。 这些策略包括 i)中和对抗 c-Met 或HGF/SF 的抗体[Cao B. ,Su Y.，Oskarsson M.，Zhao P.， Kort EJ,Fisher RJ,ffang LM,Vande Woude GF,Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，98 (13) 7443-8 ；Martens Τ. ,Schmidt NO,Eckerich C,Fillbrandt R. ,Merchant Μ. ,Schwall R.， Westphal Μ.，Lamszus K.，Clin Cancer Res. 2006,12(20) :6144-52]或使用 HGF/SF 拮抗剂 NK4,以防止配体结合 c-Met [Kuba K.，Matsumoto K.，Date K.，Shimura H.，Tanaka M.， Nakamura T.，Cancer Res. ,2000,60 :6737-43]，ii)阻断激酶活性的 c_Met 的小 ATP结合位点抑制剂[Christensen JG, Schreck R. , Burrows J. , Kuruganti P. , Chan Ε, Le P. , Chen J. , Wang Χ. , Ruslim L. , Blake R. , Lipson KE, Ramphal J. , Do S. , Cui JJ, Cherrington JM,Mendel DB,Cancer Res. 2003，63 :7345-55]，iii)干扰接近多坞位点的工程化 SH2 结构域多肽和降低受体或配体表达的RNAi或核酶。这些方法中的大部分显示出c-Met的选择性抑制，这导致肿瘤抑制，并显示出c-Met对于癌症中的治疗干预是令人感兴趣的。在对于c-Met靶向产生的分子内，一些是抗体。最广泛描述的是由Genentech产生的抗-c-Met 5D5抗体[W096/38557]，其在各种模型中单独加入时，表现为有效的激动剂， 并且用作Fab片段时，表现为拮抗剂。描述为一臂5D5(0A5D5)并作为重组蛋白在大肠杆菌中产生的该抗体的单价工程化形式也是Genentech专利申请的主题[W02006/015371]。然而，因为其特别的支架而不能认为是抗体的这种分子也展示出在人体中可能是免疫原性的突变。就活性而言，这种未糖基化的分子缺乏效应物功能，并且最后，没有明显的数据证明 0A5D5抑制c-Met的二聚化。此外，在体内模型中在G55中测试时，G55是表达c-Met但不表达HGF mRNA和蛋白并且与配体无关地生长的成胶质细胞瘤细胞系，一臂抗-c_Met对G55 肿瘤生长没有明显作用，表明0A5D5主要通过阻断HGF结合起作用，并且不能够靶向与HGF 无关的被激活的肿瘤[Martens Τ.等，Clin. Cancer Res. ,2006,12(20) :6144-6152]。
另一种靶向c-Met的抗体由Pfizer描述为“主要作为c_Met拮抗剂作用的抗体， 并且在一些情况中，作为c-Met激动剂” [W02005/016382]。在该申请中没有描述显示出 Pfizer抗体在c-Met 二聚化中的任何作用的数据。
发明内容
本发明的创造性方面之一是生产没有内在激动剂活性并抑制c-Met 二聚化的嵌合和/或人源化单克隆抗体。更特别地，本发明的一个创造性方面是生产具有拮抗剂活性并抑制c-Met 二聚化的嵌合和/或人源化单克隆抗体。除了靶向配体-依赖性肿瘤，该方法还将削弱C-Met的配体无关性激活，这种激活是由于胞内结构域的超表达或突变引起的，该胞内结构域对于信号仍然依赖于低聚化。该抗体活性的另一个方面立体地阻碍c-Met与其伴侣相互作用，从而导致c-Met功能削弱。将抗体优选但不限于人源化和工程化为人IgGl，以获得除与c-Met受体的特定阻断相关的功能以外的效应物功能，如ADCC和⑶C。令人^C讶地，第一次，发明人设法生成了能够结合C-Met而且还能够抑制C-Met 二聚化的嵌合和/或人源化单克隆拮抗剂抗体，所述单克隆抗体是二价的，这与现有的针对 c-Met的拮抗剂抗体相反。在现有技术中，如果是真实的，有时候表明能够抑制c-Met与其伴侣二聚化的抗体是令人感兴趣的，但从未公开过，或清楚地表明能够进行这些的抗体。此外，关于抗体特异性，根本没有证据成功地产生了这样的活性二价抗体。如之前所解释的，c-Met 二聚化的抑制是本发明的重要方面，因为这些抗体将呈现出真实的对较大患者群的兴趣。通过本发明的方法产生的抗体不仅可以治疗配体依赖性激活的c-Met癌症，因为其是直至本发明的情况，而且还可以治疗配体无关性激活的c-Met癌症。通过对同时表达c-Met-RLuc/c-Met-YFP的细胞的BRET分析来评价抗体，并选择它们抑制至少40 %，优选45 %、50 %、55 %和最优选60 %的BRET信号的能力。BRET技术已知为代表性的蛋白二聚化[Angers等，PNAS，2000，97 :3684-89]。BRET技术是本领域技术人员公知的，并将在一些实施例中详述。更特别地， BRET(生物发光共振能量转移)是在生物发光供体(Renilla荧光酶(Rluc))和荧光受体 (GFP(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白)的突变体)之间发生的非放射性能量转移。 在本发明的情况中，使用了 EYFP(增强的黄色荧光蛋白)。转移的效率取决于方向以及供体和受体之间的距离。然后，只有两个分子非常近(I-IOnm)，才会发生能量转移。将这种特性用于产生蛋白-蛋白相互作用试验。实际上，为了研究两个伴侣之间的相互作用，通常将第一个与Renilla荧光酶融合，而将第二个于GFP的黄色突变体融合。融合蛋白通常但不必须在哺乳动物细胞中表达。在其膜渗透性底物(coelenterazine)存在下，IUuc发射出蓝光。如果GFP突变体离开IUuc近于lOnm，将发生能量转移，并且可检测到另外的黄色信号。作为受体发射的光和供体发射的光之间的比例来测量BRET信号。因此，随着两个融合蛋白变近，或如果构象变化使得mUC和GFP突变体更近，BRET信号将增加。如果BRET分析存在于优选的实施方案中，本领域技术人员已知的任何方法可以用来测量c-Met 二聚化。没有限制，可以提及以下的技术FRET(荧光共振能量转移)、 HTRF(均相时间分辨荧光)、FLIM(荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS单波长荧光交叉相关
也可以使用其他传统技术，如共同免疫沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和性色谱、ELISA或Far蛋白印迹。术语“一种抗体”、“多种抗体”或“免疫球蛋白，，以最宽意思互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们呈现出所需的生物活性)。更特别地，这样的分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由重链可变区(或结构域)(在此缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CHI、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变性区，称为互补性决定区(CDR)，散布更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端排列至羧基端FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重链可以分成三个功能区Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。 Fd区包含VH和CHl结构域，并且结合轻链，形成Fab-抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应物功能，其包括，例如，补体固定和结合效应物细胞的同源Fc受体。在IgG、IgA和 IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区作为柔性间隔物，使Fab部分在相对于Fc区的空间中自由移动。铰链结构域在结构上是多变的，在免疫球蛋白类别和亚类中的序列和长度都有变化。根据结晶研究，免疫球蛋白铰链区可以在结构和功能上进一步细分成三个区上铰链、核心和下铰链(Shin等，Immunological Reviews 130:87,1992)。上铰链包括从CHl 羧基端至限制运动的铰链中第一个残基的氨基酸，通常为两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥键。下铰链区连接CH2结构域的氨基端，并包括CH2结构域中的残基。人IgGl的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通过二硫键形成二聚化时，形成环八肽，认为这作为枢轴，由此给予柔性。由免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性产生的构象变化可能影响抗体Fc部分的效应物功能。术语“单克隆抗体”根据其通常的意思来使用，并且表示从基本上同源的抗体群获得的抗体，即，构成群的单独抗体是相同的，除了可能少量存在的天然产生的突变。换句话说，单克隆抗体是从单个细胞克隆(例如，杂交瘤细胞、用编码同源抗体的DNA转染的真核宿主细胞、用编码同源抗体的DNA转化的原核宿主细胞等)的增殖产生的同源抗体组成，并且通常特征在于单个类别和亚类的重链以及单种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的，针对单种抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。在本发明的描述中，术语与抗体化合物或其序列相连的多肽、多肽序列、氨基酸序列、肽和蛋白质可互换。本发明涉及能够抑制C-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3或与序列SEQ IDN0. 1、2和3最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3 ；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或与序列SEQ ID NO. 5、6和7最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 56。更特别地，本发明涉及如上所述的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。换句话说，本发明涉及能够抑制C-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No.l、2和3或与序列SEQ ID NO. 1、2和3最佳比对后具有至少80%同一性的序列的CDR-HU CDR-H2和 CDR-H3 ；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或与序列SEQ ID NO. 5、6和7 最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。更特别地，本发明涉及如上所述的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。换句话说，本发明涉及能够抑制C-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No.l、2和3或与序列SEQ ID NO. 1、2和3最佳比对后具有至少80%同一性的序列的CDR-HU CDR-H2和 CDR-H3 ；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或与序列SEQ ID NO. 5、6和7 最佳比对后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。如本领域技术人员将清楚的，共有序列(consensus sequence) SEQ ID No. 57和21 包含在共有序列SEQ ID No. 56中。表 1
#01#02#03#04#05#06#07#08#09#10#11#12#13#14SEQID NO 56XlX2X3CX5X6X7X8X9CXllX12CX14SEQ ID NO 57XlX2X3CX5X6X7X8X9CPPCPSEQID NO 21XlX2X3CX5-CX8X9CXllX12CX14对于 SEQ ID No. 56 Xl:P，R，C，-X5:D, C，G，-X8 :H, V, K,-X12 :P,-
X2:K，C，R，-X6:K, C，-X9 :T, C, E, P,-X14 :P,T
X3:S，C，D，-X7:T, C，-Xll :P, I表述“功能性片段和衍生物”将在之后的本发明说明书中详细限定。如通过IMGT限定的，⑶R区或⑶R，用来表示免疫球蛋白的重链和轻链的超变区。无论哪一种抗原受体、链类型或物种，已经限定IMGT独特的编号来比较可变结构域[Lefranc M. -P., Immunology Today 18,509(1997) ；Lefranc Μ. -P., The Immunologist,7,132-136 (1999) ；Lefranc, Μ. -P. , Pommie, C, Ruiz, Μ. , Giudicelli, V., Foulquier, Ε. , Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc, Dev. Comp. Immunol,27,55-77 (2003)]。在IMGT独特的编号中，保守氨基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸 23 (第一 -CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二 -CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118CJ-PHE或J-TRP)。IMGT独特的编号提供了框架区的标准化划界(FR1-IMGT 位置 1 至洸，FR2-IMGT :39 至 55，FR3-IMGT :66 至 104 和 FR4-IMGT :118 至 128)和互补决定区的标准化划界CDR1_IMGT :27 至 38，CDR2-IMGT :56 至 65 和 CDR3-IMGT :105 至 117。因为缺口表示未占据的位置，⑶R-IMGT长度(显示于括号中并由点分开，例如，[8.8. 13])成为关键信息。将IMGT独特的编号用于2D绘图表示中，称为IMGT Colliers de Perles [Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ. -P.，Immunogenetics，53，857—883 (2002) ；Kaas, Q.禾口 Lefranc，Μ. -P.， Current Bioinformatics，2，21_3(K2007)]，和用于 IMGT/3D 结构-DB 的 3D 结构中[Kaas， Q. , Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ·-P.，T cell receptor and MHC structural data(T 细胞受体和 MHC 结构数据)，Nucl. Acids. Res.，32，D208-D210 (2004)]。存在三个重链⑶R和3个轻链⑶R。在此使用术语⑶R或⑶Rs为了根据情况来表示这些区域中的一个或这些区域中的几个或甚至全部，其含有负责通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和性而结合的大部分氨基酸残基。在本发明的意思中，两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”用来表示最佳比对(最优比对)后获得的待比较的两个序列之间的核苷酸或相同的氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学的并且两个序列之间的差异是随机分布的并在其整个长度中。传统上，通过以最优方式比对后比较这些序列来进行两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较，所述比较能够通过片段或通过“比较窗口 ”来进行。除了人工地，可以通过 Smith 和 Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 :482]的局部同源性算法、通过 Neddleman 和 Wunsch(1970) [J. Mol. Biol. 48 :443]的局部同源性算法、通过 Pearson 和 Lipman(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444]的相似性研究方法、通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI，或通过 BLAST N 或 BLAST P 比较软件)来进行用于比较的序列最优比对。通过比较以最优方式比对的这两个序列来测定两个核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比，并且其中相对于这两个序列之间的最优比对的参照序列，待比较的核酸或氨基酸序列可以包含添加或删除。通过测定两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的相同位置的数量，将该相同位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将所获得的结果乘以100， 来计算同一性百分比，以获得这两个序列之间的同一性百分比。例如，可以使用BLAST 程序，"BLAST 2 序列”(Tatusova 等，"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences，，(Blast 2 序列-用于比较蛋白和核苷酸序列的新工具)，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250)，可在站点http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html获得，所用的参数是默认给出的那些(特别是对于参数“开放缺口惩罚” 5，和“延伸缺口惩罚” 2;所选的基质是，例如，由程序提出的基质 "BL0SUM 62”)，通过程序直接计算待比较的两个序列之间的同一性百分比。与参照氨基酸序列具有至少80 %，优选85 %、90 %、95 %和98 %同一性的氨基酸序列，优选对于参照序列具有特定修饰的那些，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换，平截或延伸。在一个或多个连续或非连续氨基酸置换的情况中，优选其中置换的氨基酸由“等价”氨基酸替代的置换。表述“等价氨基酸”在此针对描述能够用一个基础结构的氨基酸置换的任何氨基酸，然而没有实质性地改变相应抗体的生物活性，并且这将在此后限定，尤其是在实施例中。可以通过依赖于与它们替代的氨基酸的结构同源性或能够进行的不同抗体之间的生物活性的比较试验结果来确定这些等价氨基酸。例如，提及能够进行的置换的可能性，而没有导致相应修饰的抗体的生物活性的明显改变。作为非限制性实例，以下的表2给出了能想到的置换可能性，保持了修饰抗体的生物活性。当然，在相同的条件下，反过来的置换也是可能的。表权利要求
1.一种能够抑制c-Met 二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，所述抗体包含重链和轻链，重链包含分别具有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3的⑶R-H1、⑶R-H2和 ⑶R-H3，轻链包含分别具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3， 所述抗体进一步的特征在于包含铰链区，其包含氨基酸序列SEQ ID No. 56。
2.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。
3.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。
4.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含选自SEQ ID No. 22至沘和SEQID No. 72至86的氨基酸序列。
5.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由嵌合抗体组成。
6.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由人抗体组成。
7.如权利要求1的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由人源化抗体组成。
8.如权利要求7的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 8、9或10的序列的轻链可变结构域。
9.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的铰链区。
10.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 9的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的铰链区。
11.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的铰链区。
12.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的铰链区。
13.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 9的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的铰链区。
14.如权利要求8的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的铰链区。
15.一种分离的核酸，其特征在于选自以下的核酸a)编码权利要求1至14之一中所要求的抗体，或其二价功能性片段或衍生物的核酸、 DNA 或 RNA ；b)包括含有序列SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13 和序列 SEQ ID No. 15、 SEQ ID No. 16 和 SEQ ID No. 17 的 DNA 序列的核酸；c)包括含有序列SEQID No. 14和SEQ ID No. 18、19或20的DNA序列的核酸；d)b)或c)中限定的核酸的相应RNA核酸；e)a)、b)和c)中限定的核酸的互补核酸；f)能够在高严谨条件下与序列SEQID No. 11至13和15至17的⑶R中的至少一个杂交的至少18个核苷酸的核酸。
16.一种分离的核酸，其特征在于选自以下的核酸-编码根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一的核酸、DNA或RNA，并且其中编码所述抗体铰链区的核酸序列包含或具有选自序列SEQ ID No.四至35和SEQ ID No. 73 至87的序列。
17.一种包含权利要求15或16中所要求的核酸的载体。
18.—种包含权利要求17中所要求的载体的宿主细胞。
19.一种除了人以外的转基因动物，其包含至少一个通过权利要求17中所要求的载体转化的细胞。
20.一种生产权利要求1至14之一中要求的抗体，或其二价功能性片段或衍生物的方法，其特征在于包括以下阶段a)在培养基和合适的培养条件下培养权利要求18中所要求的细胞；和b)收集由培养基或所述培养的细胞开始生产的所述抗体，或其二价功能性片段或衍生物。
21.一种能够通过权利要求20中所要求的方法获得的抗体，或其二价功能性片段或衍生物。
22.权利要求1至14和21的抗体，作为药物。
23.一种组合物，其包作为活性成分的含权利要求1至14、21或22之一中所要求的抗体，或其二价功能性片段或衍生物组成的化合物。
24.如权利要求23的组合物，其特征在于另外包含作为组合产品，用于同时、分开或按序使用的抗肿瘤抗体。
25.如权利要求23的组合物，其特征在于另外包含作为组合物产品，用于同时、分开或按序使用的细胞毒性/细胞抑制剂。
26.如权利要求23的组合物，其特征在于所述抗体，或其二价功能性片段或衍生物中的至少一个与细胞毒素和/或放射性元素偶联。
27.如权利要求25或沈的组合物，其特征在于所述细胞毒性/细胞抑制剂或所述毒素和/或放射性元素与用于同时使用的所述组合物的至少一种元素在化学上偶联。
28.如权利要求23至27之一中所要求的组合物，作为药物。
29.如权利要求1至14、21或22的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，或权利要求 23至观的组合物在用于制备旨在抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖的药物中的应用。
30.如权利要求1至14、21或22的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，或权利要求23 至观的组合物，或权利要求四的用途在用于制备旨在防止或治疗癌症的药物中的应用。
31.如权利要求30的用途，其特征在于所述癌症是选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤或结肠癌的癌症。
32.如权利要求30或31的用途，其特征在于所述的癌症是HGF依赖性和无关性Met-激活相关的癌症。
33.一种体外诊断由起源于怀疑其中异常存在c-Met受体的生物样品的c-Met受体的超表达或低表达诱导的疾病的方法，其特征在于所述方法包括将所述生物样品与权利要求 1至14，21或22的抗体接触的步骤，如果需要，可以将所述抗体标记。
全文摘要
能够特异性结合人c-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的抗体，所述抗体具有提高的拮抗活性，所述抗体包含修饰的铰链区。包含这样的c-Met的抗体拮抗剂的组合物及其作为用于治疗癌症的药物的用途。
文档编号A61P35/00GK102227446SQ200980148150
公开日2011年10月26日 申请日期2009年12月2日 优先权日2008年12月2日
发明者C·贝斯, L·格奇, T·沃琴 申请人:皮埃尔法布雷医药公司
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